BR112021000637A2 - Célula cardíaca hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca, método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes, célula endotelial hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular, método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes, neurônio dopaminérgico hipoimune isolado, método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa, método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes, célula de ilhota pancreática hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de diabetes, método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes, célula de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular, e método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimunes - Google Patents

Célula cardíaca hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca, método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes, célula endotelial hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular, método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes, neurônio dopaminérgico hipoimune isolado, método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa, método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes, célula de ilhota pancreática hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de diabetes, método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes, célula de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular, e método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimunes Download PDF

Info

Publication number
BR112021000637A2
BR112021000637A2 BR112021000637-0A BR112021000637A BR112021000637A2 BR 112021000637 A2 BR112021000637 A2 BR 112021000637A2 BR 112021000637 A BR112021000637 A BR 112021000637A BR 112021000637 A2 BR112021000637 A2 BR 112021000637A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gene
cell
isolated
cells
population
Prior art date
Application number
BR112021000637-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Sonja Schrepfer
Tobias Deuse
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of BR112021000637A2 publication Critical patent/BR112021000637A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/608—Lin28
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

célula cardíaca hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca, método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes, célula endotelial hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular, método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes, neurônio dopaminérgico hipoimune isolado, método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa, método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes, célula de ilhota pancreática hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de diabetes, método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes, célula de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular, e método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimunes. a invenção fornece células pluripotentes hipoimunogênicas "de prateleira" universalmente aceitáveis e células cardíacas, endoteliais, neuronais, de ilhota ou de pigmento da retina diferenciadas das mesmas. tais células hipoimunes são usadas para tratar pacientes que precisam das mesmas. as células não têm antígenos imunes principais que ativam respostas imunológicas e são geneticamente modificadas para evitar a endocitose fagocítica.

Description

CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA AFECÇÃO OU DOENÇA CARDÍACA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS CARDÍACAS HIPOIMUNES, CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA AFECÇÃO OU DOENÇA VASCULAR, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS HIPOIMUNES, NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA DOENÇA OU AFECÇÃO NEURODEGENERATIVA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS HIPOIMUNES, CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE DIABETES, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNES, CÉLULA DE EPITÉLIO PIGMENTADO DA RETINA (RPE) HIPOIMUNE ISOLADA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA AFECÇÃO OCULAR, E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS DE EPITÉLIO PIGMENTADO DA RETINA (RPE) HIPOIMUNES I. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade dos Pedidos Provisórios no 62/698.965 depositado em 17 de julho de 2018, 62/698.973 depositado em 17 de julho de 2018, 62/698.978 depositado em 17 de julho de 2018, 62/698.981 depositado em 17 de julho de 2018 e 62/698.984 depositado em 17 de julho de 2018, todos incorporados a título de referência ao presente documento em sua totalidade. II. CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A terapia celular regenerativa é um tratamento potencial importante para regenerar órgãos e tecido lesionados. Com a baixa disponibilidade de órgãos para transplante e a espera demorada que acompanha, a possibilidade de regeneração de tecido transplantando-se linhagens celulares prontamente disponíveis em pacientes é compreensivamente atraente. A terapia celular regenerativa mostrou resultados iniciais promissores para reabilitar tecidos danificados após o transplante em modelos animais (por exemplo, após infarto do miocárdio). A propensão de o sistema imunológico do receptor de transplante rejeitar o material alogênico, entretanto, reduz significativamente a eficácia potencial de produtos terapêuticos e diminui os efeitos positivos possíveis que circundam tais tratamentos.
[0003] Assim, a invenção fornece células pluripotentes hipoimunogênicas "de prateleira" universalmente aceitáveis e células cardíacas, endoteliais, neuronais, de ilhota ou de pigmento da retina diferenciadas das mesmas. Tais células hipoimunes são usadas para tratar pacientes que precisam das mesmas. As células não têm antígenos imunes principais que ativam respostas imunológicas e são geneticamente modificadas para evitar a endocitose fagocítica. III. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] A terapia celular regenerativa é um tratamento potencial importante para regenerar órgãos e tecido lesionados. Com a baixa disponibilidade de órgãos para transplante e a espera demorada que acompanha, a possibilidade de regeneração de tecido transplantando-se linhagens celulares prontamente disponíveis em pacientes é compreensivamente atraente. A terapia celular regenerativa mostrou resultados iniciais promissores para reabilitar tecidos danificados após o transplante em modelos animais (por exemplo, após infarto do miocárdio). A propensão de o sistema imunológico do receptor de transplante rejeitar o material alogênico, entretanto,
reduz significativamente a eficácia potencial de produtos terapêuticos e diminui os efeitos positivos possíveis que circundam tais tratamentos.
[0005] Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) autólogas constituem teoricamente uma fonte de células ilimitada para estratégias de reparo de órgão baseadas em células específicas para paciente. Sua geração, entretanto, possui desafios técnicos e de fabricação e é um processo demorado que impede conceitualmente quaisquer modalidades de tratamento agudo. Terapias à base de iPSC alogênicas são mais fáceis de um ponto de vista de fabricação e permitem a geração de produtos celulares bem triados, padronizados, de alta qualidade. Por causa de sua origem alogênica, entretanto, tais produtos celulares passariam por rejeição. Com a redução ou eliminação da antigenicidade das células, produtos celulares universalmente aceitáveis poderiam ser produzidos. Como células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em qualquer tipo de célula das três camadas germinativas, a aplicação potencial da terapia de célula-tronco é de amplo alcance. A diferenciação pode ser realizada ex vivo ou in vivo transplantando-se células progenitoras que continuam a se diferenciar e amadurecer no ambiente do órgão do sítio de implantação. A diferenciação ex vivo permite que pesquisadores ou médicos monitorem de perto o procedimento e garante que a população apropriada de células seja gerada antes do transplante.
[0006] Na maioria dos casos, entretanto, células- tronco pluripotentes diferenciadas são evitadas em terapias de transplante clínico devido à sua propensão a formar teratomas. Em vez disso, tais terapias tendem a usar células diferenciadas
(por exemplo, cardiomiócitos derivados de célula-tronco transplantados no miocárdio de pacientes que sofrem de insuficiência cardíaca). Aplicações clínicas de tais células ou tecidos pluripotentes se beneficiariam de um "recurso de segurança" que controle o crescimento e a sobrevivência das células após seu transplante.
[0007] A arte busca células-tronco com a capacidade para produzir células que são usadas para regenerar ou substituir células doentes ou deficientes. Células-tronco pluripotentes (PSCs) podem ser usados devido ao fato de que as mesmas se propagam e se diferenciam rapidamente em muitos tipos de célula possíveis.
[0008] Até a presente data, o sucesso pré-clínico de abordagens à base de PSC foi apenas alcançado em modelos imunossuprimidos ou imunodeficientes, ou quando as células são encapsuladas e protegidas do sistema imunológico do hospedeiro. A imunossupressão sistêmica conforme usado no transplante de órgão alogênico, entretanto, não é justificável para abordagens regenerativas. Os fármacos imunossuppressivos têm efeitos colaterais graves e aumentam significativamente o risco de infecções e malignidades.
[0009] Há uma necessidade na técnica de células produzidas a partir de células-tronco pluripotentes hipoimunogênicas que podem ser usadas em medicamento regenerativo. IV. SUMARIO DA INVENÇÃO
[0010] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento uma célula isolada, cardíaca hipoimune geneticamente modificada, endotelial, neuronal, de ilhota ou de pigmento da retina diferenciada de células-tronco pluripotentes hipoimune (células HIP). As células HIP têm, por exemplo, uma atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena reduzida ou eliminada, atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena reduzida ou eliminada e expressão de CD47 aumentada.
[0011] Em algumas modalidades, a célula HIP é uma célula-tronco pluripotente induzida geneticamente modificada humana (iPSC geneticamente modificada humana), o gene B2M ser gene B2M humano, o gene CIITA ser gene B2M humano e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na célula de pelo menos uma cópia de um gene CD47 humano sob o controle de um promotor. Em certas modalidades, a HIP é uma célula-tronco pluripotente induzida geneticamente modificada de camundongo (iPSC geneticamente modificada de camundongo), o gene B2M ser gene B2M de camundongo, o gene CIITA ser gene B2M de camundongo e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na célula de pelo menos uma cópia de um gene CD47 de camundongo sob o controle de um promotor. Em alguns casos, a eliminação da atividade de gene B2M resulta de uma reação de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene B2M. Em alguns casos, a eliminação da atividade de gene CIITA resulta de uma reação de CRISPR/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene CIITA.
[0012] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente um gene suicida que é ativado por um agente de gatilho que induz a célula HIP a morrer. Em algumas modalidades, o gene suicida é um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk) e o agente de gatilho é ganciclovir. Em alguns casos, o gene HSV-tk codifica uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4. Em outros casos, o gene HSV-tk codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
[0013] Em outras modalidades, o gene suicida é um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli e o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC). Em alguns casos, o gene CD codifica uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5. Em outros casos, o gene CD codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.
[0014] Em outras modalidades, o gene suicida codifica uma proteína caspase 9 induzível e o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID). Em alguns casos, a proteína caspase 9 induzível compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6. Em outros casos, a proteína caspase 9 induzível compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6. Em alguns casos, o CID é o composto AP1903.
[0015] Em algumas modalidades, a célula cardíaca hipoimune isolada é selecionada a partir do grupo que consiste em um cardiomiócito, cardiomiócito nodal, cardiomiócito condutor, cardiomiócito de trabalho, precursor de cardiomiócito, célula progenitora de cardiomiócito, célula- tronco cardíaca e célula muscular cardíaca.
[0016] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca. O método compreende administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de qualquer uma das células cardíacas hipoimunes geneticamente modificadas isoladas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz.
[0017] Em algumas modalidades, a administração compreende a implantação no tecido cardíaco do paciente, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intracoronária, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intramiocardial, injeção trans- endocardial, injeção trans-epicardial ou infusão.
[0018] Em algumas modalidades, a afecção ou doença cardíaca é selecionada a partir do grupo que consiste em cardiomiopatia pediátrica, cardiomiopatia relacionada à idade, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia isquêmica crônica, cardiomiopatia periparto, cardiomiopatia inflamatória, outra cardiomiopatia, miocardite, lesão por reperfusão isquêmica do miocárdio, disfunção ventricular, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, doença da artéria coronária, doença cardíaca de estágio final, aterosclerose, isquemia, hipertensão, reestenose, angina pectoris, coração reumático, inflamação arterial ou doença cardiovascular.
[0019] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP. O método compreende: (a) cultivar uma população de células HIP em um meio de cultura que compreende um inibidor de GSK; (b) cultivar a população de células HIP em um meio de cultura que compreende um antagonista de WNT para produzir uma população de células pré-cardíacas; e (c) cultivar a população de células pré- cardíacas em um meio de cultura que compreende insulina para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes.
[0020] Em algumas modalidades, o inibidor de GSK é CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de GSK está a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o antagonista de WNT é IWR1, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o antagonista de WNT está a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM.
[0021] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente cultivar a população de células pré- cardíacas da etapa (c) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível. Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente cultivar a população de células cardíacas hipoimunes da etapa (d) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
[0022] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente isolar a população de células cardíacas hipoimunes de células não cardíacas. Em outras modalidades, o método compreende adicionalmente crioconservar a população isolada de células cardíacas hipoimunes.
[0023] Em algumas modalidades, a célula endotelial hipoimune geneticamente modificada isolada é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula endotelial capilar, célula endotelial vascular, célula endotelial aórtica, célula endotelial cerebral e célula endotelial renal.
[0024] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular. Em algumas modalidades, o método compreende administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células endoteliais hipoimunes geneticamente modificadas isoladas.
[0025] O método compreende administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de qualquer uma das células endoteliais hipoimunes geneticamente modificadas isoladas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a administração compreende a implantação no tecido cardíaco do paciente, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intracoronária, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intramiocardial, injeção trans-endocardial, injeção trans- epicardial ou infusão.
[0026] Em algumas modalidades, a afecção ou doença vascular é selecionada a partir do grupo que consiste em lesão vascular, doença cardiovascular, doença vascular, doença isquêmica, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão, lesão de tecido isquêmico, isquemia dos membros, acidente vascular cerebral, neuropatia e doença cerebrovascular.
[0027] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes a partir de uma população de células-tronco pluripotentes hipoimunogênicas (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP. O método compreende: (a) cultivar uma população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende um inibidor de GSK; (b) cultivar a população de células HIP em um segundo meio de cultura que compreende VEGF e bFGF para produzir uma população de células pré-endoteliais; e (c) cultivar a população de células pré-endoteliais em um terceiro meio de cultura que compreende um inibidor de ROCK e um inibidor de ALK para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes.
[0028] Em algumas modalidades, o inibidor de GSK é CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de GSK está a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o inibidor de ROCK é Y-27632, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ROCK está a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 20 µM. Em algumas modalidades, o inibidor de ALK é SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ALK está a uma concentração na faixa de cerca de 0,5 µM a cerca de 10 µM.
[0029] Em algumas modalidades, o primeiro meio de cultura compreende de 2 µM a cerca de 10 µM de CHIR-99021. Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura compreende 50 ng/ml de VEGF e 10 ng/ml de bFGF. Em outras modalidades, o segundo meio de cultura compreende adicionalmente Y-27632 e SB-431542. Em várias modalidades, o terceiro meio de cultura compreende 10 µM de Y-27632 e 1 µM de SB-431542. Em certas modalidades, o terceiro meio de cultura compreende adicionalmente VEGF e bFGF. Em casos particulares, o primeiro meio de cultura e/ou o segundo meio não têm insulina.
[0030] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente isolar a população de células endoteliais hipoimunes de células não endoteliais. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente crioconservar a população isolada de células endoteliais hipoimunes.
[0031] Em algumas modalidades, o neurônio dopaminérgico hipoimune isolado é selecionado a partir do grupo que consiste em uma célula-tronco neuronal, uma célula progenitora neuronal, neurônio dopaminérgico imaturo e neurônio dopaminérgico maduro.
[0032] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o método compreende administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de qualquer um dos neurônios dopaminérgicos hipoimunes isolados. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a população dos neurônios dopaminérgicos hipoimunes isolados está em um arcabouço biodegradável. A administração pode compreender transplante ou injeção. Em algumas modalidades, a doença ou afecção neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Parkinson, doença de Huntington e esclerose múltipla.
[0033] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes a partir de uma população de células-tronco pluripotentes induzidas hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP. Em algumas modalidades, o método compreende (a) cultivar a população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende um ou mais fatores selecionados a partir do grupo que consiste em sonic hedgehog (SHH), BDNF, EGF, bFGF, FGF8, WNT1, ácido retinoico, um inibidor de GSK3β, um inibidor de ALK e um inibidor de ROCK para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos imaturos; e (b) cultivar a população de neurônios dopaminérgicos imaturos em um segundo meio de cultura que é diferente do primeiro meio de cultura para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos.
[0034] Em algumas modalidades, o inibidor de GSKβ é CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de GSKβ está a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o inibidor de ALK é SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ALK está a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o primeiro meio de cultura e/ou o segundo meio de cultura não têm soro animal.
[0035] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente cultivar a população de neurônios dopaminérgicos imaturos da etapa (a) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5- FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
[0036] Em algumas modalidades, o método também compreende isolar a população de neurônios dopaminérgicos hipoimune de neurônios não dopaminérgicos.
[0037] Em algumas modalidades, a célula de ilhota pancreática hipoimune isolada é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula progenitora de ilhota pancreática, célula de ilhota pancreática imatura e célula de ilhota pancreática madura.
[0038] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para tratar um paciente que sofre de diabetes. O método compreende administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de qualquer uma das células de ilhota pancreática hipoimunes isoladas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a população das células de ilhota pancreática hipoimunes isoladas está em um arcabouço biodegradável. Em alguns casos, a administração compreende transplante ou injeção.
[0039] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP. O método compreende: (a) cultivar a população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende um ou mais fatores selecionados a partir do grupo que consiste em fator de crescimento do tipo insulina (IGF), fator de crescimento de transformação (TGF), fator de crescimento de fibroblasto (EGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), sonic hedgehog (SHH) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), superfamília de fator de crescimento de transformação β (TGFβ), proteína morfogênica óssea 2 (BMP2), proteína morfogênica óssea 7 (BMP7), um inibidor de GSK3β, um inibidor de ALK, um inibidor de receptor de BMP tipo 1 e ácido retinoico para produzir uma população de células de ilhota pancreática imaturas; e (b) cultivar a população de células de ilhota pancreática imaturas em um segundo meio de cultura que é diferente do primeiro meio de cultura para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes.
[0040] Em algumas modalidades, o inibidor de GSK é CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de GSK está a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o inibidor de ALK é SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ALK está a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o primeiro meio de cultura e/ou o segundo meio de cultura não têm soro animal.
[0041] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente cultivar a população de células de ilhota pancreática imaturas da etapa (a) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5- fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
[0042] Em modalidades particulares, o método compreende adicionalmente cultivar a população de células de ilhota pancreática da etapa (b) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5- FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
[0043] Em algumas modalidades, o método também compreende isolar a população de células de ilhota pancreática hipoimunes de células de não ilhota pancreática. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente crioconservar a população isolada de células de ilhota pancreática hipoimunes.
[0044] Em algumas modalidades, a célula de RPE hipoimune isolada é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula progenitora de RPE, célula de RPE imatura, célula de RPE madura e célula de RPE funcional.
[0045] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular. O método compreende administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de qualquer uma dentre uma população das células de RPE hipoimunes isoladas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a população das células de RPE hipoimunes isoladas está em um arcabouço biodegradável. Em algumas modalidades, administração compreende transplante ou injeção à retina do paciente. Em algumas modalidades, a afecção ocular é selecionada a partir do grupo que consiste em degeneração macular úmida, degeneração macular seca, degeneração macular juvenil, Amaurose Congênita de Leber, retinite pigmentosa e deslocamento da retina.
[0046] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP. O método compreende: (a) cultivar a população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende qualquer um dos fatores selecionados a partir do grupo que consiste em activina A, bFGF, BMP4/7, DKK1, IGF1, noggin, um inibidor de BMP, um inibidor de ALK, um inibidor de ROCK e um inibidor de VEGFR para produzir uma população de células pré-RPE; e (b) cultivar a população de células pré-RPE em um segundo meio de cultura que é diferente do primeiro meio de cultura para produzir uma população de células de RPE hipoimunes.
[0047] Em algumas modalidades, o inibidor de ALK é SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ALK está a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM. Em algumas modalidades, o inibidor de ROCK é Y‐27632, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo. Em alguns casos, o inibidor de ROCK está a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM.
[0048] Em algumas modalidades, o primeiro meio de cultura e/ou o segundo meio de cultura não têm soro animal.
[0049] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente cultivar a população de células pré-
RPE da etapa (a) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
[0050] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente cultivar a população de células de RPE da etapa (b) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
[0051] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente isolar a população de células de RPE hipoimunes de células de não RPE. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente crioconservar a população isolada de células de RPE hipoimunes. V. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0052] A Figura 1 mostra resultados de Elispot de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo incubadas com células NK de camundongo (aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos).
[0053] A Figura 2 mostra resultados de Elispot de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas incubadas com células NK humanas (aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos).
[0054] A Figura 3 mostra resultados de Elispot de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo incubadas com células NK humanas (aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos).
[0055] A Figura 4 mostra resultados de Elispot de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas incubadas com células NK de camundongo (aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos).
[0056] A Figura 5 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos humanos.
[0057] A Figura 6 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos de camundongo.
[0058] A Figura 7 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos de camundongo.
[0059] A Figura 8 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos humanos.
[0060] A Figura 9 fornece um diagrama do método de diferenciação.
[0061] A Figura 10 mostra iPSCs humanas cultivadas em Matrigel™ imediatamente antes do início da diferenciação (ampliação de 100x).
[0062] A Figura 11 mostra células no dia de diferenciação 2 antes da alteração de meio (ampliação de 100x).
[0063] A Figura 12 mostra células no dia de diferenciação 3 antes da alteração de meio (ampliação de 100x).
[0064] A Figura 13 mostra células no dia de diferenciação 5 antes da alteração de meio (ampliação de 100x).
[0065] A Figura 14 mostra células no dia de diferenciação 7 antes da alteração de meio (ampliação de 100x).
[0066] A Figura 15 mostra células no dia de diferenciação 9 antes da alteração de meio (ampliação de 100x).
[0067] Figura 16: células HIP-CM foram diferenciadas e enriquecidas conforme mostrado por rtPCR.
[0068] A Figura 17 mostra que os hiCMs não foram rejeitados e não migraram para outros órgãos 28 dias pós- transplante.
[0069] A Figura 18 mostra a histopatologia e manchamento tricrômico de corações receptores 28 dias após o infarto do miocárdio. O tamanho do infarto em receptores alogênicos de hiCMs foi significativamente reduzido, assim como o tamanho do ventrículo esquerdo.
[0070] A Figura 19A mostra a análise de alça de PV detalhada demonstrando uma melhora significativa de parâmetros do ventrículo esquerdo.
[0071] A Figura 19B mostra que os hiCMs restauraram a função cardíaca conforme medido pela fração de ejeção (EF, razão entre o volume de sangue ejetado do ventrículo por batida e o volume de sangue neste ventrículo no final da diástole) e volume de batimento (SV, o volume de sangue ejetado por um ventrículo em uma única contração).
[0072] A Figura 19C mostra que os hiCMs restauraram a função cardíaca conforme medido pelo trabalho de batimento ventricular (SW, o trabalho realizado pelo ventrículo esquerdo para ejetar o volume de batimento para a aorta) e saída cardíaca (CO, a quantidade de sangue bombeado pelo ventrículo em unidade de tempo).
[0073] A Figura 20 mostra os resultados das análises em que hiCMs do tipo selvagem ou B2M-/-CIITA-/- CD47 tg foram transplantadas intramuscularmente em camundongos humanizados alogênicos.
[0074] A Figura 21 mostra que as células hiCM hipoimunes também sobreviveram após o transplante após infarto do miocárdio.
[0075] A Figura 22 mostra colônias de hipo-IPSC de camundongo em MEFs antes da divisão (ampliação de 100x).
[0076] A Figura 23 mostra hipo-IPSC de camundongo ESC em gelatina imediatamente antes do início da diferenciação (ampliação de 100x).
[0077] A Figura 24 mostra células no dia 2 de diferenciação (ampliação de 100x) antes de o meio de diferenciação ter sido alterado de CHIR 5 µM a CHIR 2 µM.
[0078] A Figura 25 mostra células no dia 4 de diferenciação de EC (ampliação de 100x) antes de o meio ter sido alterado.
[0079] A Figura 26 mostra células de EC no dia 7 de diferenciação (ampliação de 100x).
[0080] A Figura 27 mostra células após o dia 12- dia 14 e antes da classificação MACS (ampliação de 100x).
[0081] A Figura 28 mostra rtPCR que demonstra que as células de EC tanto das miPSCs quanto das células HIP mostraram um perfil de expressão genética diferenciado, incluindo expressão de VE-caderina, em que as células progenitoras não mostraram.
[0082] A Figura 29 mostra análises de bioluminescência de células endoteliais induzidas hipoimunes e do tipo selvagem transplantadas em um modelo de isquemia dos membros posteriores (após a remoção da A. femoralis). Os valores de BLI de todos os animais foram plotados. Muitas mECs do tipo selvagem imunogênicas foram rejeitadas dentro de 15 dias mostrando sinais de BLI em declínio ao longo do tempo enquanto os enxertos de B2M-/-CIITA-/- CD47 tg sobreviveram todos.
[0083] Figura 30. O efeito inibitório da superexpressão de Cd47 no extermínio de célula NK foi avaliado. Elispots de IFN-γ com células NK foram realizados com miECs derivadas de miPSC B2m-/- Ciita-/- ou miPSC B2m-/-Ciita-/- Cd47 tg. Apenas derivados de miPSC B2m-/-Ciita-/- eram suscetíveis ao extermínio por célula NK.
[0084] A Figura 31 mostra que hiPSCs B2M-/-CIITA- /- CD47 tg foram diferenciadas de modo bem-sucedido em derivados de hiEC correspondentes. A rtPCR mostra que todos os derivados perderam a expressão de gene de pluripotência.
[0085] Figura 32. Enxertos de hiEC do tipo selvagem ou B2M-/-CIITA-/- CD47 foram injetados em camundongos NSG-SGM3 humanizados alogênicos. Elispots IFN-γ foram realizados após 5 dias. As células hipoimunes não produziram respostas de IFN-γ, mas o tipo selvagem produziu. VI. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. INTRODUÇÃO
[0086] A invenção fornece a geração de células cardíacas derivadas de (diferenciadas de) células Pluripotentes Hipoimunogênicas (HIP) e, finalmente, o transplante em pacientes que precisam do mesmo.
[0087] Conforme descrito no documento noPCT/US18/13688, células pluripotentes hipoimunogênicas (HIP) não têm antígenos imunes principais que podem ativar respostas imunológicas e são geneticamente modificadas para evitar fagocitose. Isso permite a derivação de produtos celulares “de prateleira” para gerar tecidos e órgãos específicos. O benefício de poder usar derivados de célula HIP alogênicos humanos em pacientes humanos resulta em benefícios significativos, incluindo a capacidade para evitar terapia imunossuppressiva adjunta de longo prazo e uso de fármaco geralmente visto em transplantes alogênicos. Isso também fornece economias de custo significativas na medida em que terapias celulares podem ser usadas sem exigir tratamentos individuais para cada paciente.
[0088] Foi mostrado que os produtos celulares gerados a partir de fontes de células autólogas podem se tornar sujeitos à rejeição imunológica com algumas ou até mesmo uma única mutação antigênica. Assim, produtos celulares autólogos não são inerentemente não imunogênicos. Também, um controle de qualidade e modificação genética de célula é muito trabalhoso e dispendioso, células autólogas podem não estar prontamente disponíveis para opções de tratamento agudo. Assim, há uma necessidade na técnica de uma fonte de células universal, tal como células HIP, que pode ser diferenciada em inúmeros tipos de células universalmente aceitáveis a serem usadas para tratar várias doenças humanas.
[0089] Este pedido refere-se ao Pedido Internacional no PCT/US18/13688, depositado em 14 de janeiro de 2018, e ao Pedido Provisório no U.S. 62/445.969, depositado em 13 de janeiro de 2017, as revelações em sua totalidade estão incorporadas ao presente documento a título de referência, em particular, os exemplos, figuras, descrições de figuras e descrições da produção de células-tronco pluripotentes hipoimunogênicas e diferenciação de tais células em outros tipos de célula. B. DEFINIÇÕES
[0090] O termo “células pluripotentes” refere-se a células que podem se autorrenovar e proliferar enquanto permanecem em um estado não diferenciado e que podem, sob as condições apropriadas, ser induzidas a se diferenciarem em tipos de célula especializados. O termo “células pluripotentes”, conforme usado no presente documento, abrange células-tronco e outros tipos de células-tronco, incluindo células-tronco fetais, amnióticas ou somáticas. As linhagens de células-tronco humanas exemplificativas incluem a linhagem de células-tronco embrionária humana H9. As linhagens de células-tronco exemplificativas adicionais incluem aquelas disponibilizadas através dos Institutos Nacionais de Registro de Células-tronco Embrionárias Humanas e da coleção HUES do Instituto Médico Howard Hughes (conforme descrito em Cowan, C. A. et. al, New England J. Med. 350:13. (2004), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade).
[0091] “Células-tronco pluripotentes” conforme usado no presente documento têm o potencial de se diferenciar em qualquer uma das três camadas germinativas: endoderma (por exemplo, a ligação do estômago, trato gastrointestinal,
pulmões, etc.), mesoderma (por exemplo, músculo, osso, sangue, tecido urogenital, etc.) ou ectoderma (por exemplo, tecidos epidérmicos e tecidos do sistema nervoso). O termo "células- tronco pluripotentes", conforme usado no presente documento, também abrange “células-tronco pluripotentes induzidas”, ou “iPSCs”, um tipo de célula-tronco pluripotente derivado de uma célula não pluripotente. Os exemplos de células progenitoras incluem células somáticas que foram reprogramadas para induzir um fenótipo não diferenciado pluripotente por vários meios. Tais células "iPS" ou "iPSC" podem ser criadas induzindo-se a expressão de determinados genes reguladores ou pela aplicação exógena de determinadas proteínas. Os métodos para a indução de células iPS são conhecidos na técnica e são adicionalmente descritos abaixo. (Consultar, por exemplo, Zhou et al., Stem Cells 27 (11): 2.667 a 2.674 (2009); Huangfu et al., Nature Biotechnol. 26 (7): 795 (2008); Woltjen et al., Nature 458 (7239): 766 a 770 (2009); e Zhou et al., Cell Stem Cell 8:381 a 384 (2009); cada um dos quais está incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) é representada abaixo. Conforme usado no presente documento, “hiPSCs” são células-tronco pluripotentes induzidas humanas, e “miPSCs” são células-tronco pluripotentes induzidas murinas.
[0092] “Características de célula-tronco pluripotente" referem-se a características de uma célula que distingue células-tronco pluripotentes de outras células. A capacidade para originar progênie que possa passar por diferenciação, sob as condições apropriadas, em tipos de célula que demonstram coletivamente características associadas às linhagens celulares de todas as três camadas germinativas
(endoderma, mesoderma e ectoderma) é uma característica de célula-tronco pluripotente. A expressão ou não expressão de determinadas combinações de marcadores moleculares são também características de célula-tronco pluripotente. Por exemplo, células-tronco pluripotentes humanas expressam pelo menos diversos e, em algumas modalidades, todos os marcadores da seguinte lista não limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA- 1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-caderina, UTF-1, Oct4, Rex1 e Nanog. As morfologias de célula associadas a células-tronco pluripotentes são também características de célula-tronco pluripotente. Conforme descrito no presente documento, as células não precisam passar através da pluripotência a ser reprogramada em células progenitoras endodérmicas e/ou hepatócitos.
[0093] Conforme usado no presente documento, "multipotente" ou "célula multipotente" refere-se a um tipo de célula que pode originar um número limitado de outros tipos de célula particulares. Por exemplo, as células multipotentes induzidas têm a capacidade para formar células endodérmicas. Adicionalmente, células-tronco sanguíneas multipotentes podem se diferenciar em diversos tipos de células sanguíneas, incluindo linfócitos, monócitos, neutrófilos, etc.
[0094] Conforme usado no presente documento, o termo "oligopotente" refere-se à capacidade de uma célula- tronco adulta para se diferenciar em apenas alguns tipos de célula diferentes. Por exemplo, células-tronco linfoides ou mieloides têm a capacidade para formar células das linhagens linfoide ou mieloide, respectivamente.
[0095] Conforme usado no presente documento, o termo "unipotente" significa a capacidade de uma célula para formar um único tipo de célula. Por exemplo, células-tronco espermatogoniais têm apenas a capacidade para formar espermatozoides.
[0096] Conforme usado no presente documento, o termo "totipotente" significa a capacidade de uma célula para formar um organismo inteiro. Por exemplo, em mamíferos, apenas o zigoto e os blastômeros de primeiro estágio de clivagem são totipotentes.
[0097] Conforme usado no presente documento, "células não pluripotentes" referem-se a células de mamíferos que não são células pluripotentes. Os exemplos de tais células incluem células diferenciadas assim como células progenitoras. Os exemplos de células diferenciadas incluem, porém sem limitação, células de um tecido selecionado dentre medula óssea, pele, músculo esquelético, tecido gorduroso e sangue periférico. Os tipos de célula exemplificativos incluem, porém sem limitação, fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, neurônios, osteoblastos, osteoclastos e células T. As células de partida empregadas para gerar as células multipotentes induzidas, as células progenitoras endodérmicas e os hepatócitos podem ser células não pluripotentes.
[0098] As células diferenciadas incluem, porém sem limitação, células multipotentes, células oligopotentes, células unipotentes, células progenitoras e células terminalmente diferenciadas. Em modalidades particulares, uma célula menos potente é considerada “diferenciada” em referência a uma célula mais potente.
[0099] Uma "célula somática” é uma célula que forma o corpo de um organismo. As células somáticas incluem células que constituem órgãos, pele, sangue, ossos e tecido conjuntivo em um organismo, mas não células germinativas.
[0100] As células podem ser de, por exemplo, mamíferos humanos ou não humanos. Os mamíferos não humanos exemplificativos incluem, porém sem limitação, camundongos, ratos, gatos, cães, coelhos, porquinhos da índia, hamsters, ovelhas, porcos, cavalos, bovinos e primatas não humanos. Em algumas modalidades, uma célula é de um ser humano adulto ou mamífero não humano. Em algumas modalidades, uma célula é de um ser humano neonatal, um ser humano adulto ou mamífero não humano.
[0101] Conforme usado no presente documento, os termos "sujeito" ou "paciente" refere-se a qualquer animal, tal como um animal domesticado, um animal de zoológico ou um ser humano. O "sujeito" ou "paciente" pode ser um mamífero como um cão, gato, pássaro, gado ou um ser humano. OS exemplos específicos de "sujeitos" e "pacientes" incluem, porém sem limitação, indivíduos (particularmente humanos) com uma doença ou distúrbio relacionado ao fígado, coração, pulmão, rim, pâncreas, cérebro, tecido neural, sangue, osso, medula óssea e similares.
[0102] As células de mamíferos podem ser de seres humanos ou mamíferos não humanos. Os mamíferos não humanos exemplificativos incluem, porém sem limitação, camundongos, ratos, gatos, cães, coelhos, porquinhos da índia, hamsters, ovelhas, porcos, cavalos, bovinos e primatas não humanos (por exemplo, chimpanzés, macacos e símios).
[0103] Por “célula pluripotente hipoimunogênica”, “célula pluripotente hipoimune” ou “célula HIP” no presente documento entende-se uma célula pluripotente que retém suas características pluripotentes e ainda assim origina resposta de rejeição imunológica reduzida quando transferida para um hospedeiro alogênico. Em modalidades preferenciais, as células HIP não originam uma resposta imunológica. Assim, “hipoimunogênico” ou “hipoimune” refere-se a uma resposta imunológica significativamente reduzida ou eliminada em comparação à resposta imunológica de uma célula progenitora (isto é, “do tipo selvagem” ou “wt”) antes da imunomodificação conforme representada no presente documento. Em muitos casos, as células HIP são imunologicamente silenciosas e ainda assim retêm capacidades pluripotentes. Ensaios para características HIP são representados abaixo.
[0104] O complexo de “HLA” ou “antígeno de leucócito humano” é um complexo de gene que codifica as proteínas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em seres humanos. Essas proteínas de superfície celular que constituem o complexo de HLA são responsáveis pela regulação da resposta imunológica a antígenos. Em seres humanos, há dois MHCs, classe I e classe II, “HLA-I” e “HLA-II”. HLA-I inclui três proteínas, HLA-A, HLA-B e HLA-C, que apresentam peptídeos do interior da célula, e os antígenos apresentados pelo complexo HLA-I atraem células T exterminadoras (também conhecidas como células T CD8+ ou células T citotóxicas). As proteínas de HLA-I estão associadas à β-2 microglobulina (B2M). HLA-II inclui cinco proteínas, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOB, HLA- DQ e HLA-DR, que apresentam antígenos do exterior da célula a linfócitos T. Isso estimula células CD4+ (também conhecidas como células auxiliares T). Deve ser entendido que o uso de “MHC” ou “HLA” não se destina a ser limitante, na medida em que depende de se os genes são humanos (HLA) ou murinos (MHC). Assim, como se referem a células de mamíferos, esses termos podem ser usados de forma intercambiável no presente documento.
[0105] Por “knockout de gene” no presente documento entende-se um processo que torna um gene particular inativo na célula hospedeira na qual o mesmo reside, resultando ou em nenhuma proteína de interesse sendo produzida ou uma forma inativa. Conforme será entendido por aqueles versados na técnica e adicionalmente descrito a seguir, isso pode ser alcançado de vários modos diferentes, incluindo removendo-se sequências de ácidos nucleicos de um gene ou interrompendo-se a sequência com outras sequências, alterando-se o quadro de leitura ou alterando-se os componentes reguladores do ácido nucleico. Por exemplo, toda ou parte de uma região de codificação do gene de interesse pode ser removida ou substituída por sequências “sem sentido”, toda ou parte de uma sequência reguladora, tal como um promotor, pode ser removida ou substituída, sequências de início de tradução podem ser removidas ou substituídas, etc.
[0106] Por “knockin de gene” no presente documento entende-se um processo que adiciona uma função genética a uma célula hospedeira. Isso causa níveis aumentados da proteína codificada. Conforme será entendido por aqueles na técnica, isso pode ser alcançado de diversos modos, incluindo adicionando-se uma ou mais cópias adicionais do gene à célula hospedeira ou alterando-se um componente regulador do gene endógeno que aumenta a expressão da proteína. Isso pode ser alcançado modificando-se o promotor, adicionando-se um promotor diferente, adicionando-se um intensificador ou modificando-se outras sequências de expressão.
[0107] Proteína “β-2 microglobulina” ou “β2M” ou “B2M” refere-se à proteína β2M humana que tem as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos mostradas abaixo; o gene humano tem o número de acesso NC_000015.10:44711487-44718159.
[0108] Proteína “CD47 ” refere-se à proteína CD47 humana que tem as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos mostradas abaixo; o gene humano tem o número de acesso NC_000003.12:108043094-108094200.
[0109] Proteína “CIITA” refere-se à proteína CIITA humana que tem as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos mostradas abaixo; o gene humano tem o número de acesso NC_000016.10:10866208-10941562.
[0110] Por “tipo selvagem” no contexto de uma célula entende-se uma célula encontrada na natureza. Entretanto, no contexto de uma célula-tronco pluripotente, conforme usado no presente documento, entende-se também uma iPSC que pode conter alterações de ácido nucleico resultando em pluripotência, mas que não passou pelos procedimentos de edição de gene da invenção para alcançar hipoimunogenicidade.
[0111] “Singênico” no presente documento refere- se à similaridade ou identidade genética de um organismo hospedeiro e um transplante celular em que há compatibilidade imunológica; por exemplo, nenhuma resposta imunológica é gerada.
[0112] “Alogênico” no presente documento refere- se à dissimilaridade genética de um organismo hospedeiro e um transplante celular em que uma resposta imunológica é gerada.
[0113] Por “B2M-/-” no presente documento entende-se que uma célula diploide teve o gene B2M inativado em ambos os cromossomos. Conforme descrito no presente documento, isso pode ser feito de uma variedade de modos.
[0114] Por “CIITA -/-” no presente documento entende-se que uma célula diploide teve o gene CIITA inativado em ambos os cromossomos. Conforme descrito no presente documento, isso pode ser feito de uma variedade de modos.
[0115] Por “CD47 tg” (representando “transgene”) ou “CD47+” no presente documento entende-se que a célula hospedeira expressa CD47, em alguns casos, tendo pelo menos uma cópia adicional do gene CD47.
[0116] Um “polipeptídeo Oct" refere-se a qualquer um dos membros de ocorrência natural da família de Octâmero de fatores de transcrição, ou variantes dos mesmos que mantêm atividade de fator de transcrição, similares (dentro de pelo menos 50%, 80% ou 90% de atividade) em comparação ao membro de família de ocorrência natural relacionado mais próximo, ou polipeptídeos que compreendem pelo menos o domínio de ligação de DNA do membro de família de ocorrência natural, e pode compreender adicionalmente um domínio de ativação transcricional. Os polipeptídeos Oct exemplificativos incluem Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9 e Oct-11. Oct3/4 (denominado no presente documento "Oct4") contém o domínio POU, uma sequência de 150 aminoácidos conservada dentre Pit-1, Oct-1, Oct-2 e uric-86. (Consultar Ryan, A. K. & Rosenfeld, M. G., Genes Dev. 11:1.207 a 1.225 (1997), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, as variantes têm pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência de aminoácidos através de sua sequência inteira em comparação a um membro da família de polipeptídeo Oct de ocorrência natural, tal como aqueles listados acima ou tal como listado no número de acesso ao Genbank NP-002692.2 (Oct4 humano) ou NP-038661.1 (Oct4 de camundongo). Os polipeptídeos Oct (por exemplo, Oct3/4 ou Oct
4) podem ser de ser humano, camundongo, rato, bovinos, porcinos ou de outros animais. Geralmente, a mesma espécie de proteína será usada com a espécie de células sendo manipuladas. O polipeptídeo (ou polipeptídeos) Oct pode ser um fator de pluripotência que pode ajudar a induzir a multipotência em células não pluripotentes.
[0117] Um “polipeptídeo Klf" refere-se a qualquer um dos membros de ocorrência natural da família de fatores do tipo Krüppel (Klfs), proteínas de dedo de zinco que contêm sequências de aminoácidos similares àquelas do regulador de padrão embrionário de drosófila Krüppel, ou variantes dos membros de ocorrência natural que mantêm atividade de fator de transcrição, similares (dentro de pelo menos 50%, 80% ou 90% de atividade) em comparação ao membro de família de ocorrência natural relacionado mais próximo, ou polipeptídeos que compreendem pelo menos o domínio de ligação de DNA do membro de família de ocorrência natural, e pode compreender adicionalmente um domínio de ativação transcricional. (Consultar Dang, D. T., Pevsner, J. & Yang, V. W., Cell Biol. 32:1.103 a 1.121 (2000), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). Os membros da família Klf exemplificativos incluem Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16 e Klf17. Klf2 e Klf-4 revelaram ser fatores com a capacidade para gerar células iPS em camundongos, e os genes relacionados Klf1 e Klf5 também, embora com eficiência reduzida. (Consultar Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101 a 106 (2007), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). Em algumas modalidades, as variantes têm pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência de aminoácidos através de sua sequência inteira em comparação a um membro da família de polipeptídeo Klf de ocorrência natural, tal como aqueles listados acima ou tal como listado no número de acesso ao GenBank CAX16088 (Klf4 de camundongo) ou CAX14962 (Klf4 humano). Os polipeptídeos Klf (por exemplo, Klf1, Klf4 e Klf5) podem ser de ser humano, camundongo, rato, bovinos, porcinos ou de outros animais. Geralmente, a mesma espécie de proteína será usada com a espécie de células sendo manipuladas. Os polipeptídeo (polipeptídeos) Klf podem ser um fator de pluripotência. A expressão do gene ou polipeptídeo Klf4 pode ajudar a induzir a multipotência em uma célula de partida ou uma população de células de partida.
[0118] Um “polipeptídeo Myc" refere-se a qualquer um dos membros de ocorrência natural da família Myc. (Consultar, por exemplo, Adhikary, S. & Eilers, M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:635 a 645 (2005), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). O mesmo também inclui variantes que mantêm atividade de fator de transcrição similar em comparação ao membro de família de ocorrência natural relacionado mais próximo (isto é, dentro de pelo menos 50%, 80% ou 90% de atividade). O mesmo inclui adicionalmente polipeptídeos que compreendem pelo menos o domínio de ligação de DNA de um membro de família de ocorrência natural e pode compreender adicionalmente um domínio de ativação transcricional. Os polipeptídeos Myc exemplificativos incluem, por exemplo, c-Myc, N-Myc e L-Myc. Em algumas modalidades, as variantes têm pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência de aminoácidos através de sua sequência inteira em comparação a um membro da família de polipeptídeo
Myc de ocorrência natural, tal como aqueles listados acima ou tal como listado no número de acesso ao GenBank CAA25015 (Myc humano). Os polipeptídeos Myc (por exemplo, c-Myc) podem ser de ser humano, camundongo, rato, bovinos, porcinos ou de outros animais. Geralmente, a mesma espécie de proteína será usada com a espécie de células sendo manipuladas. Os polipeptídeo (polipeptídeos) Myc podem ser um fator de pluripotência.
[0119] Um “polipeptídeo Sox" refere-se a qualquer um dos membros de ocorrência natural dos fatores de transcrição de HMG-box relacionado a SRY (Sox), caracterizado pela presença do domínio de grupo de alta mobilidade (HMG), ou variantes do mesmo que mantêm atividade de fator de transcrição similar em comparação ao membro da família de ocorrência natural relacionado mais próximo (isto é, dentro de pelo menos 50%, 80% ou 90% de atividade). O mesmo também inclui polipeptídeos que compreendem pelo menos o domínio de ligação de DNA do membro de família de ocorrência natural e pode compreender adicionalmente um domínio de ativação transcricional. (Consultar, por exemplo, Dang, D. T. et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32:1.103 a 1.121 (2000), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). Os polipeptídeos Sox exemplificativos incluem, por exemplo, Sox1, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox-21 e Sox30. Sox1 mostrou render células iPS com uma eficiência similar a Sox2, e os genes Sox3, Sox15 e Sox18 também mostraram gerar células iPS, embora com eficiência de algum modo menor do que Sox2. (Consultar Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101 a 106 (2007), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). Em algumas modalidades, as variantes têm pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência de aminoácidos através de sua sequência inteira em comparação a um membro da família de polipeptídeo Sox de ocorrência natural, tal como aqueles listados acima ou tal como listado no número de acesso ao GenBank CAA83435 (Sox2 humano). Os polipeptídeos Sox (por exemplo, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 ou Sox18) podem ser de ser humano, camundongo, rato, bovinos, porcinos ou de outros animais. Geralmente, a mesma espécie de proteína será usada com a espécie de células sendo manipuladas. Os polipeptídeo (polipeptídeos) Sox podem ser um fator de pluripotência. Conforme discutido no presente documento, as proteínas SOX2 encontram uso particular na geração de iPSCs.
[0120] Por “células pluripotentes hipoimunogênicas diferenciadas” ou “células HIP diferenciadas” ou “células dHIP” no presente documento entende-se células iPS que foram geneticamente modificadas para possuírem hipoimunogenicidade (por exemplo, pelo knockout de B2M e CIITA e pelo knockin de CD47) e, então, são diferenciadas em um tipo de célula para o transplante final em sujeitos. Assim, por exemplo, as células HIP podem ser diferenciadas em hepatócitos (“hepatócitos dHIP”), em células pancreáticas do tipo beta ou organoides de ilhota (“células beta dHIP”), em células endoteliais (“células endoteliais dHIP”), etc.
[0121] O termo “identidade” percentual no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm uma porcentagem específica de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido que são iguais, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, conforme medido com o uso de um dos algoritmos de comparação de sequência descritos abaixo (por exemplo, BLASTP e BLASTN ou outros algoritmos disponíveis para pessoas versadas) ou por inspeção visual. Dependendo da aplicação, a “identidade” percentual pode existir sobre uma região da sequência que é comparada, por exemplo, sobre um domínio funcional ou, alternativamente, existem sobre o comprimento completo das duas sequências a serem comparadas. Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula a identidade de sequência percentual para a sequência (ou sequências) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.
[0122] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2.444 (1988), por implantações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou por inspeção visual (consultar, de modo geral, Ausubel et al., infra).
[0123] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a identidade de sequência e a similaridade de sequência percentual é um algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0124] “Inibidores”, “ativadores” e “moduladores” afetam uma função ou expressão de uma molécula biologicamente relevante. O termo “modulador” inclui tanto inibidores quanto ativadores. Os mesmos podem ser identificados com o uso de ensaios in vitro e in vivo para a expressão ou atividade de uma molécula-alvo.
[0125] “Inibidores” são agentes que, por exemplo, inibem a expressão ou se ligam a molécula ou proteínas-alvo. Os mesmos podem bloquear parcial ou totalmente a estimulação ou ter atividade inibidora de protease. Os mesmos podem reduzir, diminuir, prevenir ou atrasar a ativação, incluindo a inativação, dessensitização ou regulação decrescente da atividade da proteína-alvo descrita. Os moduladores podem ser antagonistas da molécula ou proteína-alvo.
[0126] “Ativadores” são agentes que, por exemplo, induzem ou ativam a função ou a expressão de uma molécula ou proteína-alvo. Os mesmos podem se ligar, estimular, aumentar, abrir, ativar ou facilitar a atividade de molécula-alvo. Os ativadores podem ser agonistas da molécula ou proteína-alvo.
[0127] “Homólogos” são moléculas bioativas que são similares a uma molécula de referência na sequência de nucleotídeos, sequência de peptídeos, nível funcional ou estrutural. Os homólogos podem incluir derivados de sequência que compartilham uma determinada identidade percentual com a sequência de referência. Assim, em uma modalidade, sequências homólogas ou derivados compartilham pelo menos uma identidade de sequência de 70 por cento. Em uma modalidade específica, sequências homólogas ou derivados compartilham pelo menos uma identidade de sequência de 80 ou 85 por cento. Em uma modalidade específica, sequências homólogas ou derivados compartilham pelo menos uma identidade de sequência de 90 por cento. Em uma modalidade específica, sequências homólogas ou derivados compartilham pelo menos uma identidade de sequência de 95 por cento. Em uma modalidade mais específica, as sequências homólogas ou derivadas compartilham pelo menos uma identidade de sequência de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento. Sequências de ácidos nucleicos homólogas ou derivadas podem também ser definidas por sua capacidade de permanecerem ligadas a uma sequência de ácidos nucleicos de referência sob condições de hibridização estringentes. Os homólogos que têm similaridade estrutural ou funcional a uma molécula de referência podem ser derivados químicos da molécula de referência. Os métodos para detectar, gerar e triar homólogos estruturais e funcionais assim como derivados são conhecidos na técnica.
[0128] A “hibridização” geralmente depende da capacidade de o DNA desnaturado reanelar quando fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejada entre a sonda e a sequência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser usada. Como um resultado, segue que temperaturas relativas mais altas tenderiam a tornar as condições de reação mais estringentes, enquanto torna temperaturas mais baixas menos estringentes. Para detalhes adicionais e explicação da estringência de reações de hibridização, consultar Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade.
[0129] A "estringência" das reações de hibridização é prontamente determinável por uma pessoa de habilidade comum na técnica e é geralmente um cálculo empírico dependente mediante comprimento de sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas exigem temperaturas mais altas para anelamento apropriado, ao mesmo tempo que sondas mais curtas precisam de temperaturas mais baixas.
[0130] "Condições estringentes" ou "condições de alta estringência", conforme definido no presente documento, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50 °C; (2) empregam, durante a hibridização, um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (em v/v) de formamida com albumina sérica bovina 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 Mm a Ph 6,5 com cloreto de sódio 750 Mm, citrato de sódio 75 Mm a 42 °C; ou (3) hibridização de um dia para o outro em uma solução que emprega formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 Mm (Ph 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5 x, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μl/ml), SDS 0,1% e sulfato de dextrano 10% a 42 °C, com uma lavagem de 10 minutos a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) seguido por uma lavagem de alta estringência de 10 minutos que consiste em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C.
[0131] Pretende-se que toda limitação numérica máxima dada por todo este relatório descritivo inclua toda limitação numérica menor, como se tais limitações numéricas menores fossem expressamente escritas no presente documento. Toda limitação numérica mínima dada por todo este relatório descritivo incluirá toda limitação numérica maior, como se tais limitações numéricas maiores fossem expressamente escritas no presente documento. Toda faixa numérica dada por todo este relatório descritivo incluirá uma faixa numérica mais estreita que está dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas no presente documento.
[0132] Conforme usado no presente documento o termo “modificação” refere-se a uma alteração que diferencia fisicamente a molécula modificada da molécula progenitora. Em uma modalidade, uma alteração de aminoácido em um polipeptídeo variante CD47, HSVtk, EC-CD ou iCasp9 preparado de acordo com os métodos descritos no presente documento diferencia o mesmo do progenitor correspondente que não foi modificado de acordo com os métodos descritos no presente documento, tal como proteínas do tipo selvagem, uma proteína mutante de ocorrência natural ou outra proteína geneticamente modificada que não inclui as modificações de tal polipeptídeo variante. Em outra modalidade, um polipeptídeo variantes inclui uma ou mais modificações que diferenciam a função do polipeptídeo variante do polipeptídeo não modificado. Por exemplo, uma alteração de aminoácido em um polipeptídeo variante afeta seu perfil de ligação de receptor. Em outras modalidades, um polipeptídeo variante compreende modificações de substituição, deleção ou inserção ou combinações das mesmas. Em outra modalidade, um polipeptídeo variante inclui uma ou mais modificações que aumentam sua afinidade para um receptor em comparação à afinidade do polipeptídeo não modificado.
[0133] Em uma modalidade, um polipeptídeo variante inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções em relação a uma sequência nativa ou progenitora correspondente. Em certas modalidades, um polipeptídeo variante inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 a 40, 41 a 50 ou 51 ou mais modificações.
[0134] Por “vetor epissômico” no presente documento entende-se um vetor genético que pode existir e se replicar autonomamente no citoplasma de uma célula; por exemplo, o mesmo não é integrado ao DNA genômico da célula hospedeira. Vários vetores epissômicos são conhecidos na técnica e descritos abaixo.
[0135] “Knockout” no contexto de um a gene significa que a célula hospedeira que aloja o knockout não produz um produto de proteína funcional do gene. Conforme representado no presente documento, um knockout pode resultar em uma variedade de modos, da remoção de toda ou parte da sequência de codificação, incluindo mutações de deslocamento de quadro de leitura de modo que uma proteína funcional não seja produzida (sequência truncada ou sem sentido), remoção ou alteração de um componente regulador (por exemplo, um promotor) de modo que o gene não seja transcrito, impedimento da tradução através da ligação a mRNA, etc. Geralmente, o knockout é efetuado no nível de DNA genômico, de modo que a prole das células também porte o knockout permanentemente.
[0136] “Knockin” no contexto de um gene significa que a célula hospedeira que aloja o knockin tem mais proteína funcional ativa na célula. Conforme representado no presente documento, um knockin pode ser feito de uma variedade de modos, usualmente pela introdução de pelo menos uma cópia de um transgene (tg) que codifica a proteína na célula, embora isso possa também ser feito substituindo-se componentes reguladores também, por exemplo, adicionando-se um promotor constitutivo ao gene endógeno. Em geral, as tecnologias de knockin resultam na integração da cópia extra do transgene na célula hospedeira. VII. CÉLULAS PLURIPOTENTES HIPOIMUNOGÊNICAS
[0137] A invenção fornece composições e metodologias para gerar células HIP humanas e de camundongo, começando com células do tipo selvagem, tornando as mesmas pluripotentes (por exemplo, produzindo células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSCs), então, gerando células HIP a partir da população de iPSC.
[0138] É fornecido no presente documento uma célula-tronco pluripotente hipoimunogênica (HIP) que compreende: uma ou mais alterações que inativam ambos os alelos de um gene B2M endógeno; uma ou mais alterações que inativam ambos os alelos de um gene CIITA endógeno; e uma ou mais alterações que causam uma expressão aumentada de um gene CD47 na célula-tronco HIP humana; em que a célula-tronco HIP humana produz uma primeira resposta de célula Exterminadora Natural (NK) que é menor do que uma segunda resposta de célula NK produzida por uma Célula-tronco Pluripotente induzida (iPSC) que compreende as ditas alterações de B2M e CIITA, mas não compreende a dita expressão de gene CD47 aumentada, e em que a primeira e a segunda respostas de célula NK são medidas determinando-se os níveis de IFN-ү de células NK incubadas in vitro com qualquer uma das HIP ou iPSC humanas que compreendem as alterações de B2M e CIITA, mas não compreendem a expressão de gene CD47 aumentada. A célula-tronco HIP pode ser uma célula-tronco HIP murina. Em algumas modalidades, a célula- tronco HIP é uma célula-tronco HIP humana.
[0139] A célula pluripotente hipoimunogênica pode ser menos suscetível à rejeição quando transplantada para um sujeito como um resultado da função de HLA-I reduzida, da função de HLA-II reduzida e da suscetibilidade reduzida ao extermínio por células NK.
[0140] Em algumas modalidades, a célula pluripotente hipoimunogênica não tem ou tem menos expressão de proteína ß-2 microglobulina. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína ß-2 microglobulina é eliminado ou submetido a knockout. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína ß-2 microglobulina tem pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína ß-2 microglobulina tem a sequência de SEQ ID NO:1.
[0141] Em algumas modalidades, a função de HLA-I é reduzida por uma redução na expressão da proteína HLA-A. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína HLA-A é eliminado ou submetido a knockout. Em algumas modalidades, a função de HLA-I é reduzida por uma redução na expressão da proteína HLA-B. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína HLA-B é eliminado ou submetido a knockout. Em algumas modalidades, a função de HLA-I é reduzida por uma redução na expressão da proteína HLA-C. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína HLA-C é eliminado ou submetido a knockout. Em outra modalidade, as células pluripotentes hipoimunogênicas não compreendem uma função de HLA-I.
[0142] Em algumas modalidades, a célula pluripotente hipoimunogênica não tem ou tem menos expressão de proteína CIITA. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína CIITA é eliminado ou submetido a knockout. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína CIITA tem pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína CIITA tem a sequência de SEQ ID NO:2.
[0143] Em algumas modalidades, a função de HLA-II é reduzida por uma redução na expressão da proteína HLA-DP. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína HLA-DP é eliminado ou submetido a knockout. Em algumas modalidades, a função de HLA-II é reduzida por uma redução na expressão da proteína HLA-DR. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína HLA-DR é eliminado ou submetido a knockout. Em algumas modalidades, a função de HLA-II é reduzida por uma redução na expressão da proteína HLA-DQ. Em uma modalidade preferencial, um gene que codifica a proteína HLA-DQ é eliminado ou submetido a knockout. A invenção fornece células pluripotentes hipoimunogênicas que não compreendem uma função de HLA-II.
[0144] A invenção fornece células pluripotentes hipoimunogênicas com uma suscetibilidade reduzida à fagocitose de macrófagos ou extermínio por célula NK. A suscetibilidade reduzida é causada pela expressão aumentada de uma proteína CD47. Em algumas modalidades, a expressão de CD47 aumentada resulta de uma modificação para um locus de gene CD47 endógeno. Em outras modalidades, a expressão de CD47 aumentada resulta de um transgene CD47. Em uma modalidade preferencial, a proteína CD47 tem pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína CD47 tem a sequência de SEQ ID NO:3.
[0145] Em outra modalidade do método, a expressão aumentada de uma proteína que reduz a suscetibilidade da célula pluripotente à fagocitose de macrófagos resulta de uma modificação para um locus de gene endógeno. Em uma modalidade preferencial, o locus de gene endógeno codifica uma proteína CD47. Em outra modalidade, a expressão de proteína aumentada resulta da expressão de um transgene. Em uma modalidade preferencial, o transgene codifica uma proteína CD47. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína CD47 tem pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3. Em uma modalidade mais preferencial, a proteína CD47 tem a sequência de SEQ ID NO:3.
[0146] Em algumas modalidades, o nível de proteína CD47 nas células HIP é mais alto do que o nível em uma célula-tronco pluripotente correspondente, por exemplo, célula-tronco embrionária ou célula-tronco pluripotente induzida. Em alguns casos, o nível de proteína CD47 murina nas células HIP murinas é mais alto (por exemplo, pelo menos 0,5 vez mais alto, pelo menos 1,0 vez mais alto, pelo menos 1,5 vez mais alto, pelo menos 2 vezes mais alto, pelo menos 3 vezes mais alto, pelo menos 4 vezes mais alto, pelo menos 5 vezes mais alto, pelo menos 6 vezes mais alto, pelo menos 7 vezes mais alto, pelo menos 8 vezes mais alto, pelo menos 8 vezes mais alto ou mais) do que o nível em uma célula-tronco pluripotente murina correspondente. Em certos casos, o nível de proteína CD47 humana nas células HIP humanas é mais alto (por exemplo, pelo menos 0,5 vez mais alto, pelo menos 1,0 vez mais alto, pelo menos 1,5 vez mais alto, pelo menos 2 vezes mais alto, pelo menos 3 vezes mais alto, pelo menos 4 vezes mais alto, pelo menos 5 vezes mais alto, pelo menos 6 vezes mais alto, pelo menos 7 vezes mais alto, pelo menos 8 vezes mais alto, pelo menos 8 vezes mais alto ou mais) do que o nível em uma célula-tronco pluripotente humana correspondente.
[0147] Outra modalidade do método compreende adicionalmente expressar um gene suicida que é ativado por um gatilho que faz com que a célula de progênie diferenciada ou pluripotente hipoimunogênica morra. Em uma modalidade preferencial, o gene suicida é um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk) e o gatilho é ganciclovir. Em uma modalidade mais preferencial, o gene HSV-tk codifica uma proteína que tem pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4. Em uma modalidade mais preferencial, o gene HSV-tk codifica uma proteína que tem a sequência de SEQ ID NO:4.
[0148] Em outra modalidade do método, o gene suicida é um gene de citosina desaminase de Escherichia coli (EC-CD) e o gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC). Em uma modalidade preferencial, o gene EC-CD codifica uma proteína que tem pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5. Em uma modalidade mais preferencial, o gene EC-CD codifica uma proteína que tem a sequência de SEQ ID NO:5.
[0149] Em outra modalidade do método, o gene suicida codifica uma proteína Caspase induzível, e o gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) específico. Em uma modalidade preferencial do método, o gene codifica uma proteína caspase induzível que compreende pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6. Em uma modalidade mais preferencial, o gene encodes uma proteína caspase induzível que compreende a sequência de SEQ ID NO:6. Em uma modalidade mais preferencial, o CID é AP1903. A. METODOLOGIAS PARA ALTERAÇÕES GENÉTICAS
[0150] A invenção inclui métodos para modificar sequências de ácidos nucleicos dentro de células ou em condições sem células para gerar tanto células pluripotentes quanto células HIP. As tecnologias exemplificativas incluem recombinação homóloga, knockin, ZFNs (nucleases de dedo de zinco), TALENs (nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição), CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas)/Cas9 e outras tecnologias de nuclease específicas para sítio. Essas técnicas permitem quebras de DNA de fita dupla em sítios de locus desejados. Essas quebras de fita dupla controladas promovem recombinação homóloga nos sítios de locus específicos. Esse processo foca em sequências específicas para alvejamento de moléculas de ácido nucleico, tais como cromossomos, com endonucleases que reconhecem e se ligam às sequências e induzem uma quebra de fita dupla na molécula de ácido nucleico. A quebra de fita dupla é reparada ou por uma junção de extremidades não homólogas propensa a erro (NHEJ) ou por recombinação homóloga (HR).
[0151] Conforme será entendido por aqueles versados na arte, várias técnicas diferentes podem ser usadas para modificar geneticamente células pluripotentes da invenção, assim como a modificação genética das iPSCs para se tornarem hipoimunogênicas conforme representado no presente documento.
[0152] Em geral, essas técnicas podem ser usadas individualmente ou em combinação. Por exemplo, na geração das células HIP, CRISPR podem ser usadas para reduzir a expressão da proteína B2M e/ou CIITA ativa nas células geneticamente modificadas, com técnicas virais (por exemplo, lentivírus) para realizar knockin na funcionalidade de CD47. Também, conforme será entendido por aqueles versados na técnica, embora uma modalidade utilize sequencialmente uma etapa de CRISPR para realizar knockout em B2M, seguido por uma etapa de CRISPR para realizar knockout em CIITA com uma etapa final de um lentivírus para realizar knockin na funcionalidade de CD47, esses genes podem ser manipulados em diferentes ordens com o uso de diferentes tecnologias.
[0153] Conforme é discutido mais completamente abaixo, a expressão temporária de genes de reprogramação é geralmente feita para gerar/induzir células-tronco pluripotentes. A. TECNOLOGIAS DE CRISPR
[0154] Em uma modalidade, as células são manipuladas com o uso de tecnologias de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas)/Cas (“CRISPR”) conforme é conhecido na técnica. CRISPR podem ser usadas para gerar as iPSCs de partida ou para gerar as células HIP das iPSCs. Há um grande número de técnicas baseadas em CRISPR, consultar, por exemplo, Doudna e Charpentier, Science doi:10.1126/science.1258096, incorporado ao presente documento a título de referência. Os kits e técnicas de CRISPR são vendidos comercialmente. B. TECNOLOGIAS TALEN
[0155] Em algumas modalidades, as células HIP da invenção são produzidas com o uso de metodologias de Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALEN). TALEN são enzimas de restrição combinadas com uma nuclease que pode ser geneticamente modificada para se ligar a e cortar praticamente qualquer sequência de DNA desejada. Os kits de TALEN são vendidos comercialmente. C. TECNOLOGIAS DE DEDO DE ZINCO
[0156] Em uma modalidade, as células são manipuladas com o uso de tecnologias de nuclease de dedo de Zn. As nucleases de dedo de Zn são enzimas de restrição artificiais geradas fundindo-se um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. Os domínios de dedo de zinco podem ser geneticamente modificados para terem como alvo sequências de DNA desejadas específicas e isso permite que nucleases de dedo de zinco tenham como alvo sequências exclusivas dentro de genomas complexos. Beneficiando-se do maquinário de reparo de DNA endógeno, esses reagentes podem ser usados para alterar precisamente os genomas de organismos superiores, similarmente a CRISPR e TALENs. D. TECNOLOGIAS COM BASE VIRAL
[0157] Há uma ampla variedade de técnicas virais que podem ser usadas para gerar as células HIP da invenção (assim como para a geração original das iPSCs), incluindo, porém sem limitação, o uso de vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores de adenovírus e vetores virais Sendai. Os vetores epissômicos usados na geração de iPSCs são descritos a seguir. E. REGULAÇÃO DECRESCENTE DE GENES COM O USO DE RNA
INTERFERENTE
[0158] Em outras modalidades, os genes que codificam proteínas usados em moléculas de HLA são regulados decrescentemente por tecnologias de RNAi. A interferência de RNA (RNAi) é um processo em que moléculas de RNA inibem a expressão de gene frequentemente fazendo com que moléculas de mRNA específicas degradem. Dois tipos de moléculas de RNA – microRNA (miRNA) e RNA interferente pequeno (siRNA) – são centrais à interferência de RNA. As mesmas se ligam a moléculas de mRNA alvo e aumentam ou diminuem sua atividade. RNAi ajuda as células a se defenderem contra ácidos nucleicos parasíticos, tais como aquele de vírus e transpósons. O RNAi também influencia o desenvolvimento.
[0159] As moléculas de sdRNA são uma classe de siRNAs assimétricos que compreendem uma fita guia (antissenso) de 19 a 21 bases. As mesmas contêm um fosfato 5’, pirimidinas modificadas em 2’Ome ou 2’F e seis fosfotioatos nas posições 3’. As mesmas também contêm uma fita senso contendo porções químicas esterol conjugadas 3’, 2 fosfotioatos na posição 3’ e pirimidinas modificadas em 2’Ome. Ambas as fitas contêm purinas 2’ Ome com extensões contínuas de purinas não modificadas que não excedem um comprimento de 3. O sdRNA é revelado na Patente no U.S. 8.796.443, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0160] Para todas essas tecnologias, técnicas recombinantes bem conhecidas são usadas, para gerar ácidos nucléicos recombinantes conforme representado no presente documento. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes (que codificam um polipeptídeo desejado, por exemplo, CD47, ou sequências de ruptura) podem ser ligados de maneira funcional a uma ou mais sequências de nucleotídeos reguladoras em um construto de expressão. As sequências de nucleotídeos reguladoras serão geralmente apropriadas para a célula hospedeira e o sujeito a ser tratado. Inúmeros tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma variedade de célula hospedeiras. Tipicamente, a uma ou mais sequências de nucleotídeos reguladoras pode incluir, porém sem limitação, sequências promotoras, sequências líder ou sinal, sítios de ligação ribossômicos, sequências de terminação e início de transcrição, sequências de terminação e início de tradução e sequências intensificadoras ou ativadoras. Promotores constitutivos ou induzíveis como conhecidos na técnica são também contemplados. Os promotores podem ser promotores de ocorrência natural ou promotores híbridos que podem combinar elementos de mais do que um promotor. Um construto de expressão pode estar presente em uma célula ou um epissomo, tal como um plasmídeo, ou o construto de expressão pode ser inserido em um cromossomo. Em uma modalidade específica, o vetor de expressão inclui um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Certas modalidades incluem um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo variante ligada de maneira funcional a pelo menos uma sequência reguladora. As sequências reguladoras para uso no presente documento incluem promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão. Em certas modalidades, um vetor de expressão é projetado para a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o polipeptídeo variante particular que se deseja expressar, o número de cópias do vetor, a capacidade para controlar este número de cópias ou a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como marcadores antibióticos.
[0161] Os exemplos de promotores adequados incluem, por exemplo, promotores dos seguintes genes: promotor de ubiquitina/S27a do hamster (WO 97/15664), promotor precoce do vírus vacuolante símio 40 (SV40), promotor tardio principal de adenovírus, promotor de metalotioneína-I de camundongo, a região de repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV), promotor do vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), região de repetição terminal longa do vírus da leucemia murina de Moloney e o promotor precoce do Citomegalovírus humano (CMV). Os exemplos de promotores de mamíferos heterólogos são promotores de actina, imunoglobulina ou choque térmico. Em algumas modalidades, o promotor de fator de alongamento 1-alfa é usado.
[0162] Em modalidades adicionais, os promotores para uso em células hospedeiras mamíferas podem ser obtidos a partir dos genomas de vírus, tais como poliomavírus, vírus da varíola (documento no UK 2.211.504 publicado em 5 de julho de 1989), papilomavírus bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus
Símio 40 (SV40). Em modalidades adicionais, promotores de mamíferos heterólogos são usados. Os exemplos incluem promotor de actina, um promotor de imunoglobulina e promotores de choque térmico. Os promotores precoce e tardio de SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. Fiers et al., Nature 273: 113 a 120 (1978). O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Greenaway, P. J. et al., Gene 18: 355 a 360 (1982). As referências anteriormente mencionadas estão incorporadas a título de referência em sua totalidade. B. GERAÇÃO DE CÉLULAS PLURIPOTENTES
[0163] A invenção fornece métodos para produzir células pluripotentes não imunogênicas de células pluripotentes. Assim, a primeira etapa é fornecer as células- tronco pluripotentes.
[0164] A geração de células-tronco pluripotentes de camundongo e humanas (geralmente denominadas iPSCs; miPSCs para células murinas ou hiPSCs para células humanas) é geralmente conhecida na técnica. Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, há uma variedade de diferentes métodos para a geração de iPCSs. A indução original foi feita a partir de fibroblastos embrionários ou adultos de camundongo com o uso da introdução viral de quatro fatores de transcrição, Oct3/4, Sox2, c-Myc e Klf4; consultar Takahashi e Yamanaka Cell 126:663 a 676 (2006), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para as técnicas representadas no mesmo. Desde então, vários métodos foram desenvolvidos; consultar Seki et al., World J.
Stem Cells 7(1):116 a 125 (2015) para uma análise e Lakshmipathy e Vermuri, editores, Methods in Molecular Biology: Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols, Springer 2013, ambos os quais estão expressamente incorporados a título de referência em sua totalidade, e em particular para os métodos para gerar hiPSCs (consultar, por exemplo, o Capítulo 3 da última referência).
[0165] Geralmente, as iPSCs são geradas pela expressão temporária de um ou mais “fatores de reprogramação” na célula hospedeira, usualmente introduzidos com o uso de vetores epissômicos. Sob essas condições, pequenas quantidades das células são induzidas para se tornarem iPSCs (em geral, a eficiência dessa etapa é baixa, na medida em que nenhum marcador selecionável é usado). Uma vez que as células são “reprogramadas” e se tornam pluripotentes, as mesmas perdem o vetor (ou vetores) epissômico e produzem os fatores com o uso dos genes endógenos. Essa perda do vetor (ou vetores) epissômico resulta em células que são chamadas de células de “impacto zero”. Isso é desejável, pois quanto menos modificações genéticas (particularmente no genoma da célula hospedeira), melhor. Assim, é preferencial que as hiPSCs resultantes não tenham nenhuma modificação genética.
[0166] Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, o número de fatores de reprogramação que podem ser usado ou são usados pode variar. Comumente, quando menos fatores de reprogramação são usados, a eficiência da transformação das células para um estado pluripotente diminui, assim como a “pluripotência”, por exemplo, menos fatores de reprogramação podem resultar em células que não são completamente pluripotentes, mas podem apenas ter a capacidade para se diferenciar em menos tipos de célula.
[0167] Em algumas modalidades, um único fator de reprogramação, OCT4, é usado. Em outras modalidades, dois fatores de reprogramação, OCT4 e KLF4, são usados. Em outras modalidades, três fatores de reprogramação, OCT4, KLF4 e SOX2, são usados. Em outras modalidades, quatro fatores de reprogramação, OCT4, KLF4, SOX2 e c-Myc, são usados. Em outras modalidades, 5, 6 ou 7 fatores de reprogramação podem ser usados selecionados dentre SOKMNLT; SOX2, OCT4 (POU5F1), KLF4, MYC, NANOG, LIN28 e antígeno T de SV40L.
[0168] Em geral, esses genes de fator de reprogramação são fornecidos em vetores epissômicos tais como são conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis. Por exemplo, ThermoFisher/Invitrogen vendem um kit de reprogramação de vírus sendai para geração de impacto zero de hiPSCs, consultar o número de catálogo A34546. ThermoFisher também vende sistemas baseados em EBNA, consultar o número de catálogo A14703.
[0169] Adicionalmente, há várias linhagens de hiPSC comercialmente disponíveis; consultar, por exemplo, a linhagem de hiPSC epissômica Gibco®, K18945, que é uma linhagem de células iPSC humana isenta de integração viral de impacto zero (consultar também Burridge et al, 2011, supra).
[0170] Em geral, conforme é conhecido na técnica, iPSCs são produzidas a partir de células não pluripotentes, tais como células sanguíneas de cordão CD34+, fibroblastos, etc., expressando-se temporariamente os fatores de reprogramação conforme descrito no presente documento.
[0171] Por exemplo, iPSCs bem-sucedidas foram também geradas com o uso de apenas Oct3/4, Sox2 e Klf4,
enquanto omitem C-Myc, embora com eficiência de reprogramação reduzida.
[0172] Em geral, iPSCs são caracterizadas pela expressão de certos fatores que incluem KLF4, Nanog, OCT4, SOX2, ESRRB, TBX3, c-Myc e TCL1. A expressão nova ou aumentada desses fatores para propósitos da invenção pode ser por meio da indução ou modulação de um locus endógeno ou a partir da expressão de um transgene.
[0173] Por exemplo, iPSCs murinas podem ser geradas com o uso dos métodos de Diecke et al, Sci Rep. 28 de janeiro de 2015;5:8081 (doi:10.1038/srep08081), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para os métodos e reagentes para a geração das miPSCs. Consultar também, por exemplo, Burridge et al., PLoS One, 2011 6(4):18293, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para os métodos representados no mesmo.
[0174] Em alguns casos, a pluripotência das células é medida ou confirmada conforme representado no presente documento, por exemplo, analisando-se os fatores de reprogramação conforme é mostrado de modo geral no documento no PCT/US18/13688 ou conduzindo-se reações de diferenciação conforme representado no presente documento e nos Exemplos. C. GERAÇÃO DE CÉLULAS PLURIPOTENTES HIPOIMUNOGÊNICAS
[0175] A presente invenção refere-se à geração, manipulação, crescimento e transplante de células hipoimunogênicas em um paciente definido no presente documento. A geração das células HIP a partir de células pluripotentes é feita com tão pouco quanto três alterações genéticas, resultando na perturbação mínima da atividade celular, mas conferindo imunossilenciamento às células.
[0176] Conforme discutido no presente documento, uma modalidade utiliza uma redução ou eliminação na atividade de proteína de MHC I e II (HLA I e II quando as células são humanas). Isso pode ser feito alterando-se os genes que codificam seu componente. Em uma modalidade, a região de codificação ou as sequências reguladoras do gene são rompidas com o uso de CRISPR. Em outra modalidade, a tradução de gene é reduzida com o uso de tecnologias de RNA interferente. A terceira alteração é uma alteração em um gene que regula a suscetibilidade à fagocitose de macrófago, tal como CD47, e isso é geralmente um “knockin” de um gene com o uso de tecnologias virais.
[0177] Descrições adicionais de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) podem ser encontradas no Pedido Internacional no PCT/US18/13688, depositado em 14 de janeiro de 2018, e ao Pedido Provisório no U.S. 62/445.969, depositado em 13 de janeiro de 2017, as revelações em sua totalidade estão incorporadas ao presente documento a título de referência, em particular, os exemplos, figuras, descrições de figuras e descrições da produção de células-tronco pluripotentes hipoimunogênicas e diferenciação de tais células em outros tipos de célula.
[0178] Em alguns casos, quando CRISPR está sendo usada para as modificações genéticas, células hiPSC que contêm um construto Cas9 que possibilitam a edição de alta eficiência da linhagem de células podem ser usadas; consultar, por exemplo, a linhagem de células iPSC Cas9 epissômica humana, A33124, da Life Technologies.
1. REDUÇÃO DE HLA-I
[0179] As células HIP da invenção incluem uma redução na função de MHC I (HLA I quando as células são derivadas de células humanas).
[0180] Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, a redução na função pode ser alcançada de vários modos, incluindo removendo-se sequências de ácidos nucleicos de um gene, interrompendo-se a sequência com outras sequências ou alterando-se os componentes reguladores do ácido nucleico. Por exemplo, toda ou parte de uma região de codificação do gene de interesse pode ser removida ou substituída por sequências “sem sentido”, mutações de deslocamento de quadro de leitura podem ser feitas, toda ou parte de uma sequência reguladora, tal como um promotor, pode ser removida ou substituída, sequências de início de tradução podem ser removidas ou substituídas, etc.
[0181] Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, a redução bem-sucedida da função de MHC I (HLA I quando as células são derivadas de células humanas) nas células pluripotentes pode ser medida com o uso de técnicas conhecidas na arte e conforme descrito abaixo; por exemplo, técnicas FACS com o uso de anticorpos identificados que se ligam ao complexo de HLA; por exemplo, com o uso de anticorpos HLA-A,B,C comercialmente disponíveis que se ligam à cadeia alfa dos antígenos de Classe I de HLA histocompatibilidade principais humanos. ALTERAÇÃO DE Β2M
[0182] Em uma modalidade, a redução na atividade de HLA-I é feita interrompendo-se a expressão do gene de β-2 microglobulina na célula-tronco pluripotente, cuja sequência humana é revelada no presente documento. Essa alteração é geralmente denominada no presente documento um “knockout” de gene, e nas células HIP da invenção, a mesma é feita em ambos os alelos na célula hospedeira. Geralmente, as técnicas para ambas as rupturas são iguais.
[0183] Uma modalidade particularmente útil A usa a tecnologia de CRISPR para romper o gene. Em alguns casos, a tecnologia de CRISPR é usada para introduzir pequenas deleções/inserções na região de codificação do gene, de modo que nenhuma proteína funcional seja produzida, frequentemente o resultado das mutações de deslocamento de quadro de leitura que resultam na geração de códons de parada de modo que proteínas não funcionais truncadas sejam produzidas.
[0184] Consequentemente, uma técnica útil é usar sequências de CRISPR projetadas para ter como alvo a sequência de codificação do gene B2M em camundongo ou do gene B2M em ser humano. Após a edição de gene, as culturas de iPSC transfectadas são dissociadas a células únicas. As células únicas são expandidas a colônias de tamanho completo e testadas quanto à edição de CRISPR pela triagem para presença de sequência anormal do sítio de clivagem de CRISPR. Clones com deleções em ambos os alelos são escolhidos. Tais clones não expressaram B2M conforme demonstrado por PCR e não expressaram HLA-I conforme demonstrado por análise de FACS (consultar os exemplos 1 e 6, por exemplo).
[0185] Os ensaios para testar se o gene B2M foi inativado são conhecidos e descritos no presente documento. Em uma modalidade, o ensaio é um Western blot de lisados de células sondados com anticorpos à proteína B2M. Em outra modalidade, a amplificação de recombinase polimerase (RPA) ou transcriptase reversa-reações em cadeia da polimerase (RT-PCR)
confirmam a presença da alteração de inativação.
[0186] Adicionalmente, as células podem ser testadas para confirmar que o complexo de HLA I não é expresso na superfície celular. Isso pode ser avaliado por análise por FACS com o uso de anticorpos para um ou mais componentes de superfície celular de HLA conforme discutido acima.
[0187] É digno de nota que outros tiveram resultados insatisfatórios ao tentarem silenciar os genes B2M em ambos os alelos. Consultar, por exemplo, Gornalusse et al., Nature Biotech. Doi/10.1038/nbt.3860).
2. REDUÇÃO DE HLA-II
[0188] Adicionalmente a uma redução em HLA I, as células HIP da invenção também não têm função de MHC II (HLA II quando as células são derivadas de células humanas).
[0189] Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, a redução na função pode ser alcançada de vários modos, incluindo removendo-se sequências de ácidos nucleicos de um gene, adicionando-se sequências de ácidos nucleicos a um gene, rompendo-se o quadro de leitura, interrompendo-se a sequência com outras sequências ou alterando-se os componentes reguladores do ácido nucleico. Em uma modalidade, toda ou parte de uma região de codificação do gene de interesse pode ser removida ou substituída por sequências “sem sentido”. Em outra modalidade, sequências reguladoras, tais como um promotor, podem ser removidas ou substituídas, sequências de iniciação de tradução podem ser removidas ou substituídas, etc.
[0190] A redução bem-sucedida da função de MHC II (HLA II quando as células são derivadas de células humanas) nas células pluripotentes ou seus derivados pode ser medida com o uso de técnicas conhecidas na arte, tais como Western blotting, com o uso de anticorpos para a proteína, técnicas de FACS, técnicas de RPA, técnicas de RT-PCR, etc.
ALTERAÇÃO DE CIITA
[0191] Em uma modalidade, a redução na atividade de HLA-II é feita interrompendo-se a expressão do gene CIITA na célula-tronco pluripotente, cuja sequência humana é mostrada no presente documento. Essa alteração é geralmente denominada no presente documento um “knockout” de gene, e nas células HIP da invenção, a mesma é feita em ambos os alelos na célula hospedeira.
[0192] Os ensaios para testar se o gene CIITA foi inativado são conhecidos e descritos no presente documento. Em uma modalidade, o ensaio é um Western blot de lisados de células sondados com anticorpos à proteína CIITA. Em outra modalidade, a amplificação de recombinase polimerase (RPA) ou transcriptase reversa-reações em cadeia da polimerase (RT-PCR) confirmam a presença da alteração de inativação.
[0193] Adicionalmente, as células podem ser testadas para confirmar que o complexo de HLA II não é expresso na superfície celular. Novamente, esse ensaio é feito conforme é conhecido na técnica (consultar a Figura 21 do documento no PCT/US18/13688, por exemplo, PCT/US18/13688) e é geralmente feita com o uso de Western Blots ou análise por FACS com base em anticorpos comerciais que se ligam a HLA-DR de Classe II de HLA humana, DP e a maioria dos antígenos de DQ conforme representado abaixo.
[0194] Uma modalidade particularmente útil A usa a tecnologia de CRISPR para romper o gene CIITA. CRISPRs foram projetadas para terem como alvo a sequência de codificação do gene Ciita em camundongo ou do gene CIITA em ser humano, um fator de transcrição essencial para todas as moléculas de MHC II. Após a edição de gene, as culturas de iPSC transfectadas foram dissociadas em células únicas. As mesmas foram expandidas a colônias de tamanho completo e testadas quanto à edição de CRISPR bem-sucedida pela triagem para a presença de uma sequência anormal do sítio de clivagem de CRISPR. Os clones com deleções não expressaram CIITA conforme determinado por PCR e não expressaram MHC II/ HLA-II conforme determinado pela análise por FACS.
3. REDUÇÃO DE FAGOCITOSE DE MACRÓFAGOS E/OU
EXTERMÍNIO POR CÉLULA NK
[0195] Adicionalmente à redução de HLA I e II (ou MHC I e II), geralmente com o uso de knockouts de B2M e CIITA, as células HIP da invenção têm suscetibilidade reduzida à fagocitose de macrófagos e extermínio por célula NK. As células HIP resultantes “escapam” do macrófago imune e das trajetórias inatas devido a um ou mais transgenes CD47.
[0196] A capacidade de células HIP e células derivadas das células HIP evadirem ou escaparem do extermínio por célula NK e/ou fagocitose de macrófagos é mostrada nas Figuras 14A a 14C e 34A a 34C do documento noPCT/US18/13688, o conteúdo, em particular, as figuras, descrições das figuras e exemplos estão incorporados ao presente documento a título de referência. Por exemplo, as Figuras 14B a 14C mostram que células HIP de camundongo (por exemplo, iPSCs de camundongo transgênico B2m-/-Ciita-/-CD47) falharam em induzir a expressão de CD107a por células NK e, assim, não produziram uma resposta de célula NK. Adicionalmente, foi mostrado que tais células HIP de camundongo não induziram a ativação das células NK ou a liberação de IFNγ. Quando as células NK foram incubadas com células diferenciadas (tais como células endoteliais, células de músculo liso e cardiomiócitos) derivadas de células HIP, respostas de célula NK não foram induzidas (consultar, por exemplo, as Figuras 34A a 34C do documento no PCT/US18/13688). EXPRESSÃO DE CD47 AUMENTADA
[0197] Em algumas modalidades, a suscetibilidade reduzida de fagocitose de macrófagos e extermínio por célula NK resulta de CD47 aumentado na superfície de célula HIP. Isso é feito de diversos modos conforme será entendido por aqueles versados na técnica com o uso de tecnologias de “knockin” ou transgênicas. Em alguns casos, a expressão de CD47 aumentada resulta de um ou mais transgenes CD47.
[0198] Consequentemente, em algumas modalidades, uma ou mais cópias de um gene CD47 são adicionadas às células HIP sob o controle de um promotor induzível ou constitutivo, com o último sendo preferencial. Em algumas modalidades, um construto lentiviral é empregado conforme descrito no presente documento ou conhecido na técnica. Os genes CD47 pode ser integrandos no genoma da célula hospedeira sob o controle de um promotor adequado conforme é conhecido na técnica.
[0199] As linhagens de células HIP foram geradas a partir de iPSCs B2M-/- CIITA-/-. As células contendo vetores de lentivírus que expressam CD47 foram selecionadas com o uso de um marcador de blasticidina. A sequência de genes CD47 foi sintetizada, e o DNA foi clonado no Lentivírus de plasmídeo pLenti6/V5 com resistência à blasticidina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)
[0200] Em algumas modalidades, a expressão do gene CD47 pode ser aumentada alterando-se as sequências reguladoras do gene CD47 endógeno, por exemplo, trocando-se o promotor endógeno por um promotor constitutivo ou por um promotor induzível diferente. Isso pode ser geralmente feito com o uso de técnicas conhecidas, tais como CRISPR.
[0201] Uma vez alterada, a presença de expressão de CD47 suficiente pode ser avaliada com o uso de técnicas conhecidas, tais como aquelas descritas nos Exemplos, tais como Western blots, ensaios ELISA ou ensaios FACS com o uso de anticorpos anti-CD47. Em geral, “suficiência” nesse contexto significa um aumento na expressão de CD47 na superfície de célula HIP que silencia o extermínio por célula NK e/ou a fagocitose de macrófagos. Os níveis de expressão naturais em células são muito baixos para proteger as mesmas da lise de célula NK uma vez que seu MHC I é removido.
4. GENES SUICIDAS
[0202] Em algumas modalidades, a invenção fornece células pluripotentes hipoimunogênicas (células HIP) que compreendem um "gene suicida" ou “comutador suicida”. As mesmas são incorporadas para funcionarem como um "comutador de segurança" que pode causar a morte das células pluripotentes hipoimunogênicas se as mesmas crescerem e se dividirem de uma maneira indesejada. A abordagem de ablação de "gene suicida" inclui um gene suicida em um vetor de transferência de gene que codifica uma proteína que resulta no extermínio celular apenas quando ativada por um composto específico. Um gene suicida pode codificar uma enzima que converte seletivamente um composto não tóxico em metabólitos altamente tóxicos. O resultado é especificamente eliminar células que expressam a enzima. Em algumas modalidades, o gene suicida é o gene de timidina quinase do herpesvírus (HSV-tk) e o gatilho é ganciclovir. Em outras modalidades, o gene suicida é o gene de citosina desaminase de Escherichia coli (EC-CD) e o gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) (Barese et al., Mol. Therap. 20(10):1.932 a 1.943 (2012), Xu et al., Cell Res. 8:73 a 78 (1998), ambos incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade).
[0203] Em outras modalidades, o gene suicida é uma proteína Caspase induzível. Uma proteína Caspase induzível compreende pelo menos uma porção de uma proteína Caspase com a capacidade para induzir apoptose. Em uma modalidade, a porção da proteína Caspase é exemplificada na SEQ ID NO:6. Em modalidades preferenciais, a proteína Caspase induzível é iCasp9. A mesma compreende a sequência da proteína de ligação de FK506 humana, FKBP12, com uma mutação F36V, conectada através de uma série de aminoácidos ao gene que codifica caspase 9 humana. FKBP12-F36V liga-se com alta afinidade a um agente de dimerização de molécula pequena, AP1903. Assim, a função suicida de iCasp9 na presente invenção é ativada pela administração de um indutor químico de dimerização (CID). Em algumas modalidades, o CID é o fármaco de molécula pequena AP1903. A dimerização causa a indução rápida da apoptose. (Consultar o documento no WO2011146862; Stasi et al, N. Engl. J. Med 365;18 (2011); Tey et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 13:913 a 924 (2007), cada um dos quais está incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade).
5. ENSAIOS PARA FENÓTIPOS DE CÉLULA HIP E RETENÇÃO
DA PLURIPOTÊNCIA
[0204] Uma vez que as células HIP foram geradas,
as mesmas podem ser analisadas quanto à sua hipoimunogenicidade e/ou retenção de pluripotência conforme é geralmente descrito no presente documento e nos exemplos.
[0205] Por exemplo, a hipoimunogenicidade é avaliada com o uso de várias técnicas exemplificadas na Figura 13 e na Figura 15 do documento no PCT/US18/13688. Essas técnicas incluem o transplante para hospedeiros alogênicos e monitoramento do crescimento de células HIP (por exemplo, teratomas) que escapam do sistema imunológico do hospedeiro. Derivados HIP são transduzidos para expressar luciferase e podem, então, ser seguidos com o uso de imaginologia de bioluminescência. Similarmente, as respostas de célula T e/ou célula B do animal hospedeiro às células HIP são testadas para confirmar que as células HIP não causam uma reação imunológica no animal hospedeiro. A função de célula T é avaliada por Elispot, ELISA, FACS, PCR ou citometria de massa (CYTOF). A resposta de célula B ou a resposta de anticorpo é avaliada com o uso de FACS ou luminex. Adicional ou alternativamente, as células podem ser avaliadas quanto à sua capacidade para evitar respostas imunológicas inatas, por exemplo, extermínio por célula NK, conforme é geralmente mostrado nas Figuras 14A a 14C do documento noPCT/US18/13688. A atividade litolítica de célula NK é avaliada in vitro ou in vivo (conforme mostrado na Figura 15).
[0206] Similarmente, a retenção da pluripotência é testada de vários modos. Em uma modalidade, a pluripotência é avaliada pela expressão de certos fatores específicos para pluripotência conforme geralmente descrito no presente documento e mostrado na Figura 29 do documento no PCT/US18/13688. Adicional ou alternativamente, as células HIP são diferenciadas em um ou mais tipos de célula como uma indicação de pluripotência. D. MODALIDADES PREFERENCIAIS DAS CÉLULAS HIP
[0207] São fornecidas no presente documento células-tronco pluripotentes hipoimunogênicas (“células HIP”) que exibem pluripotência, mas não resultam em uma resposta imunogênica de hospedeiro quando transplantadas em um hospedeiro alogênico, tal como um paciente humano, ou como as células HIP ou como os produtos diferenciados das células HIP.
[0208] Em uma modalidade, células-tronco pluripotentes humanas (hiPSCs) são tornadas hipoimunogênicas pela a) ruptura do gene B2M em cada alelo (por exemplo, B2M - /-), b) ruptura do gene CIITA em cada alelo (por exemplo, CIITA -/-) e c) superexpressão do gene CD47 (CD47+, por exemplo, através da introdução de uma ou mais cópias adicionais do gene CD47 ou ativação do gene genômico). Isso torna a população de hiPSC B2M-/- CIITA -/- CD47tg. Em uma modalidade preferencial, as células são não imunogênicas. Em outra modalidade, as células HIP são tornadas não imunogênicas B2M-/- CIITA -/- CD47tg conforme descrito acima, mas são adicionalmente modificadas incluindo-se um gene suicida induzível que é induzido para exterminar as células in vivo quando exigido. E. MANUTENÇÃO DE CÉLULAS HIP
[0209] Uma vez geradas, as células HIP podem ser mantidas em um estado não diferenciado conforme é conhecido para manutenção de iPSCs. Por exemplo, as células HIP são cultivadas em Matrigel com o uso de meio de cultura que impede a diferenciação e mantém a pluripotência.
[0210] Em algumas modalidades, as células HIP são crioconservadas. As células podem ser crioconservadas antes da diferenciação em diferentes tipos de célula. Em outras palavras, antes da diferenciação, as células HIP descritas no presente documento são are descongeladas e cultivadas antes de serem submetidas a um método de diferenciação. Em outras modalidades, as células HIP não são crioconservadas antes da diferenciação. Em algumas modalidades, as células HIP diferenciadas são crioconservadas antes da administração a um paciente. Em outras modalidades, as células HIP diferenciadas não são crioconservadas antes da administração a um paciente. F. DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS HIP
[0211] A invenção fornece células HIP que são diferenciadas em diferentes tipos de célula para o transplante subsequente em sujeitos. Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, os métodos para a diferenciação dependem do tipo de célula desejado com o uso de técnicas conhecidas. As células são diferenciadas em suspensão e, então, colocadas em uma forma de matriz de gel, tal como formas de matrigel, gelatina ou fibrina/trombina para facilitar a sobrevivência da célula. A diferenciação é avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores específicos para célula.
[0212] Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em hepatócitos para solucionar a perda do funcionamento de hepatócitos ou cirrose do fígado. Há várias técnicas que podem ser usadas para diferenciar células HIP em hepatócitos; consultar, por exemplo, Pettinato et al., doi:10.1038/spre32888, Snykers et al., Methods Mol Biol 698:305 a 314 (2011), Si-Tayeb et al, Hepatology 51:297 a 305 (2010) e Asgari et al., Stem Cell Rev (:493 a 504 (2013), todos os quais estão expressamente incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para as metodologias reagentes para diferenciação. A diferenciação é avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores associados a e/ou específicos para hepatócitos, incluindo, porém sem limitação, albumina, alfa fetoproteína e fibrinogênio. A diferenciação pode também ser medida funcionalmente, tal como a metabolização de amônia, armazenamento e absorção de LDL, absorção e liberação de ICG e armazenamento de glicogênio.
[0213] Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em células do tipo beta ou organoides de ilhota para transplante para tratar diabetes mellitus tipo I (T1DM). Os sistemas de células são um modo promissor para abordar T1DM, consultar, por exemplo, Ellis et al., doi/10.1038/nrgastro.2017.93, incorporado ao presente documento a título de referência. Adicionalmente, Pagliuca et al. Relata a diferenciação bem-sucedida de células β de hiPSCs (consultar, doi/10.106/j.cell.2014.09.040, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e em particular para os métodos e reagentes ali representados para a produção em larga escala de células β humanas funcionais a partir de células-tronco pluripotentes humanas). Ademais, Vegas et al. Mostram a produção de células β humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas seguido pelo encapsulamento para evitar a rejeição imune pelo hospedeiro; (doi:10.1038/nm.4030, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e in particular for o métodos e reagentes ali representados para a produção em larga escala de células β humanas funcionais a partir de células-
tronco pluripotentes humanas).
[0214] A diferenciação é avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores associados a ou específicos para célula β, incluindo, porém sem limitação, insulina. A diferenciação pode também ser medida funcionalmente, tal como medindo-se o metabolismo de glicose, consultar, de modo geral, Muraro et al, doi:10.1016/j.cels.2016.09.002, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para os biomarcadores ali representados.
[0215] Uma vez que as células dHIP beta são geradas, as mesmas podem ser transplantadas (ou como uma suspensão de células ou dentro de uma matriz de gel conforme discutido no presente documento) para a veia portal/fígado, o omento, a mucosa gastrointestinal, a medula óssea, um músculo ou bolsas subcutâneas.
[0216] Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em epitélio de pigmento da retina (RPE) para tratar doenças que ameaçam a visão do olho. As células-tronco pluripotentes humanas foram diferenciadas em células RPE com o uso das técnicas representadas em Kamao et al., Stem Cell Reports 2014:2:205 a 218, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e em particular para os métodos e reagentes ali representados para os reagentes e técnicas de diferenciação; consultar também Mandai et al., doi:10.1056/NEJMoa1608368, também incorporado em sua totalidade para as técnicas para gerar folhas de células RPE e transplante em pacientes.
[0217] A diferenciação pode ser avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores associados a e/ou específicos para RPE ou medindo- se a funcionalidade. Consultar, por exemplo, Kamao et al., doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.007, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para os marcadores representados no primeiro parágrafo da seção de resultados.
[0218] Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em cardiomiócitos para tratar doenças cardiovasculares. As técnicas são conhecidas na arte para a diferenciação de hiPSCs em cardiomiócitos e discutidas nos Exemplos. A diferenciação pode ser avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores associados a ou específicos para cardiomiócitos ou medindo-se a funcionalidade; consultar, por exemplo, Loh et al., doi:10.1016/j.cell.2016.06.001, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para os métodos para diferenciar células- tronco incluindo cardiomiócitos.
[0219] Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em células formadoras de colônias endoteliais (ECFCs) para formar novos vasos sanguíneos para tratar a doença arterial periférica. As técnicas para diferenciar células endoteliais são conhecidas. Consultar, por exemplo, Prasain et al., doi:10.1038/nbt.3048, incorporado a título de referência em sua totalidade e especificamente para os métodos e reagentes para a geração de células endoteliais a partir de células- tronco humanas e também para as técnicas de transplante. A diferenciação pode ser avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores associados a ou específicos para célula endotelial ou medindo-se a funcionalidade.
[0220] Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em células progenitoras da tireoide e organoides foliculares da tireoide que podem secretar hormônios da tireoide para tratar tireoidite autoimune. As técnicas para diferenciar células da tireoide são conhecidas na arte. Consultar, por exemplo, Kurmann et al., doi:10.106/j.stem.2015.09.004, expressamente incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para os métodos e reagentes para a geração de células da tireoide a partir de células-tronco humanas e também para as técnicas de transplante. A diferenciação pode ser avaliada como é conhecido na técnica, geralmente avaliando-se a presença de marcadores associados a ou específicos para célula da tireoide ou medindo-se a funcionalidade. VIII. CÉLULAS CARDÍACAS HIPOIMUNES DERIVADAS DE
CÉLULAS HIP
[0221] Em algumas modalidades, as células cardíacas são derivadas das células HIP descritas no presente documento. Por exemplo, células cardíacas humanas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP humanas. Similarmente, células cardíacas murinas podem ser produzidas diferenciando- se células HIP murinas. Tais células cardíacas são células cardíacas hipoimunes.
[0222] Os métodos úteis para diferenciar as células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias em células cardíacas são descritos, por exemplo, nos documentos no US20170152485, US20170058263, US20170002325, US20160362661, US20160068814, US9062289, US7897389 e US7452718.
[0223] Os métodos adicionais para produzir células cardíacas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias são descritos em, por exemplo, Xu et al, Stem Cells and Development, 2006, 15(5): 631 a 639, Burridge et al., Cell Stem Cell, 2012, 10:16 a 28, e Chen et al., Stem Cell Res, 2015, 15(2):365 a 375.
[0224] Em várias modalidades, células HIP (por exemplo, células HIP de camundongo e células HIP humanas) podem ser cultivadas em meio de cultura que compreende um inibidor de trajetória de BMP, um ativador de sinalização de WNT, um inibidor de sinalização de WNT, um agonista de WNT, um antagonista de WNT, um inibidor de Src, um inibidor de EGFR, um ativador de PCK, uma citocina, um fator de crescimento, um agente cardiotrópico, um composto e similares.
[0225] O ativador de sinalização de WNT inclui, porém sem limitação, CHIR99021. O ativador de PCK inclui, porém sem limitação, PMA. O inibidor de sinalização de WNT inclui, porém sem limitação, um composto selecionado dentre KY02111, SO3031 (KY01-I), SO2031 (KY02-I) e SO3042 (KY03-I) e XAV939. O inibidor de Src inclui, porém sem limitação, A419259. O inibidor de EGFR inclui, porém sem limitação, AG1478.
[0226] Os exemplos não limitantes de um agente para gerar uma célula cardíaca a partir de uma iPSC incluem activina A, BMP-4, Wnt3a, VEGF, proteína frisada solúvel, ciclosporina A, angiotensina II, fenilefrina, ácido ascórbico, dimetilsulfóxido, 5-aza-2'-desoxicitidina e similares.
[0227] As células da presente invenção podem ser cultivadas em uma superfície, tal como uma superfície sintética para suportar e/ou promover a diferenciação de células HIP em células cardíacas. Em algumas modalidades, a superfície compreende um material polimérico incluindo, porém sem limitação, um homopolímero ou copolímero dentre um ou mais monômeros de acrilato selecionados. Os exemplos não limitantes de monômeros de acrilato e monômeros de metacrilato incluem diacrilato de tetra(etilenoglicol), dimetacrilato de glicerol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de poli(etilenoglicol), dimetacrilato de di(etilenoglicol), dimetacrilato de tetra(etilenoglicol), propoxilato diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de neopentil glicol, benzoato diacrilato de trimetilolpropano, etoxilato de trimetilolpropano (1 EO/OH) metila, diacrilato de triciclo[5.2.1.02,6]decano- dimetanol, etoxilato diacrilato de neopentil glicol e triacrilato de trimetilolpropano. Acrilato sintetizado conforme conhecido na técnica ou obtido a partir de um vendedor comercial, tal como Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc. e Sartomer, Inc.
[0228] O material polimérico pode ser disperso na superfície de um material de suporte. Os materiais de suporte adequados para cultivar células incluem uma substância cerâmica, um vidro, um plástico, um polímero ou copolímero, quaisquer combinações dos mesmos ou um revestimento de um material em outro. Em alguns casos, um vidro inclui vidro soda- cal, vidro pirex, vidro vycor, vidro de quartzo, silício ou derivados desses ou similares.
[0229] Em alguns casos, plásticos ou polímeros, incluindo polímeros dendríticos, incluem poli(cloreto de vinila), poli(álcool vinílico), poli(metacrilato de metila), poli(acetato de vinila-anidrido maleico), poli(dimetilsiloxano) monometacrilato, polímeros de olefina cíclica, polímeros de fluorocarbono, poliestirenos, polipropileno, polietilenoimina ou derivados desses ou similares. Em alguns casos, os copolímeros incluem poli(acetato de vinila-co-anidrido maleico), poli(estireno-co- anidrido maleico), poli(etileno-co-ácido acrílico) ou derivados desses ou similares.
[0230] As células cardíacas geneticamente modificadas da presente invenção incluem, porém sem limitação, cardiomiócitos, cardiomiócitos nodais, cardiomiócitos condutores, cardiomiócitos de trabalho, precursores de cardiomiócito, célula progenitora de cardiomiócito, célula- tronco cardíaca e células musculares cardíacas. Em algumas modalidades, o precursor de cardiomiócito refere-se à célula que tem a capacidade (sem diferenciação ou reprogramação) para originar a progênie que inclui cardiomiócitos maduros (de estágio final). As células precursoras de cardiomiócitos podem frequentemente identificadas com o uso de um ou mais marcadores selecionados dentre GATA-4, Nkx2.5 e a família MEF-2 de fatores de transcrição. Em alguns casos, cardiomiócitos referem-se a cardiomiócitos imaturos ou cardiomiócitos maduros que expressam um ou mais marcadores (algumas vezes pelo menos 3 ou 5 marcadores) a partir da seguinte lista: troponina I cardíaca (cTnI), troponina T cardíaca (cTnT), cadeia pesada de miosina sarcomérica (MHC), GATA-4, Nkx2.5, N-caderina, β1-adrenoceptor (β1-AR), ANF, a família MEF-2 de fatores de transcrição, creatina quinase MB (CK-MB), mioglobina ou fator natriurético atrial (ANF). Em algumas modalidades, as células cardíacas geneticamente modificadas demonstram atividade contrátil periódica espontânea. Em alguns casos, quando essas células cardíacas são cultivadas em um ambiente de cultura de tecido adequado com uma concentração de Ca2+ apropriada e equilíbrio de eletrólitos, pode ser observado que as células contraem de uma maneira periódica através de um eixo geométrico da célula e, então, se liberam da contração, sem ter que adicionar quaisquer componentes adicionais ao meio de cultura. Em algumas modalidades, as células cardíacas são células cardíacas hipoimunes.
[0231] A eficácia de células cardíacas preparadas conforme descrito no presente documento pode ser avaliada em modelos animais para criolesão cardíaca, o que faz com que 55% do tecido de parede do ventrículo esquerdo se torne tecido cicatricial sem tratamento (Li et al., Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakai et al., Ann. Thorac. Surg. 8:2.074, 1999, Sakai et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999). O tratamento bem-sucedido pode reduzir a área da cicatriz, limitar a expansão da cicatriz e melhorar a função cardíaca conforme determinado por pressão sistólica, diastólica e desenvolvida. A lesão cardíaca pode também ser modelada com o uso de uma bobina de embolização na porção distal da artéria descendente anterior esquerda (Watanabe et al., Cell Transplant. 7:239, 1998), e a eficácia do tratamento pode ser avaliada por histologia e função cardíaca.
[0232] Em algumas modalidades, as células cardíacas geneticamente modificadas (por exemplo, células cardíacas hipoimune) são administradas a um paciente, por exemplo, um paciente humano que precisa das mesmas. As células cardíacas podem ser administradas a um paciente que sofre de cardiomiopatia pediátrica, cardiomiopatia relacionada à idade, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia isquêmica crônica, cardiomiopatia periparto, cardiomiopatia inflamatória, outra cardiomiopatia, miocardite, lesão por reperfusão isquêmica do miocárdio, disfunção ventricular, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, doença da artéria coronária, doença cardíaca de estágio final, aterosclerose, isquemia, hipertensão, reestenose, angina pectoris, coração reumático, inflamação arterial ou doença cardiovascular. Em alguns casos, o paciente teve um infarto do miocárdio. Em casos particulares, o paciente está passando por cirurgia de bypass da arterial coronária.
[0233] As células cardíacas geneticamente modificadas podem ser transplantadas no paciente com o uso de técnicas cirúrgicas bem conhecidas para enxertar tecido e/ou células isoladas em um coração. Em algumas modalidades, as células são introduzidas no tecido cardíaco do paciente por injeção (por exemplo, injeção intramiocárdica, injeção intracoronária, injeção trans-endocárdica, injeção trans- epicárdica, injeção percutânea), infusão e implantação.
[0234] A administração (entrega) da célula cardíaca geneticamente modificada inclui, porém sem limitação, administração subcutânea ou parenteral, incluindo intravenosa, intra-arterial (por exemplo, intracoronária), intramuscular, intraperitoneal, intramiocárdica, trans-endocárdica, trans- epicárdica, intranasal assim como intratecal e técnicas de infusão.
[0235] Em algumas modalidades, o paciente que recebeu as células cardíacas geneticamente modificadas também recebe um fármaco cardíaco. Os exemplos ilustrativos de fármacos cardíacos que são adequados para uso em terapia de combinação incluem, porém sem limitação, fatores de crescimento, polinucleotídeos que codificam fatores de crescimento, agentes angiogênicos, bloqueadores de canal de cálcio, agentes anti-hipertensivos, agentes antimitóticos, agentes inotrópicos, agentes antiaterogênicos, anticoagulantes, beta-bloqueadores, agentes antiarítmicos, agentes anti-inflamatórios, vasodilatadores, agentes trombolíticos, glicosídeos cardíacos, antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos, agentes que inibem protozoários, nitratos, inibidores da enzima conversora da angiotensina (ACE), antagonista de receptor de angiotensina II, peptídeo natriurético cerebral (BNP); agentes antineoplásicos, esteroides e similares.
[0236] Os efeitos de terapia de acordo com os métodos da invenção podem ser monitorados de uma variedade de formas. Por exemplo, um eletrocardiograma (ECG) ou monitor Holter pode ser utilizado para determinar a eficácia do tratamento. Um ECG é uma medida dos ritmos cardíacos e impulsos elétricos e é uma forma muito eficaz e não invasiva de determinar se a terapia melhorou ou manteve, preveniu ou retardou a degradação da condução elétrica no coração de um indivíduo. O uso de um monitor Holter, um ECG portátil que pode ser utilizado por longos períodos de tempo para monitorar anormalidades cardíacas, distúrbios de arritmia e similares, é também um método confiável para avaliar a efetividade da terapia. Um ECG ou estudo nuclear pode ser usado para determinar a melhora na função ventricular.
[0237] Conforme será entendido por aqueles na técnica, os derivados de HIP diferenciados são transplantados com o uso de técnicas conhecidas no campo que dependem tanto do tipo de célula quanto do uso final dessas células. Em geral, as células HIP diferenciadas da invenção são transplantadas ou por via intravenosa ou por injeção em locais particulares no paciente. Quando transplantadas em locais particulares, as células podem ser suspensas em uma matriz de gel para impedir a dispersão enquanto se estabilizam.
IX CÉLULAS ENDOTELIAIS DERIVADAS DE CÉLULAS HIP
[0238] Em algumas modalidades, as células endoteliais são derivadas das células HIP descritas no presente documento. Por exemplo, células endoteliais humanas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP humanas. Similarmente, células endoteliais murinas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP murinas. Tais células endoteliais são células endoteliais hipoimunes.
[0239] Os métodos úteis para diferenciar as células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias em células endoteliais são descritos, por exemplo, nos documentos no US2004/0009589, WO2011/090684 e WO2012/006440.
[0240] Em várias modalidades, células HIP (por exemplo, células HIP de camundongo e células HIP humanas) podem ser cultivadas em meio de cultura que compreende um inibidor de GSK3, um inibidor de ALK, um inibidor de trajetória de BMP, um inibidor de ROCK, um ativador de sinalização de WNT, um inibidor de sinalização de WNT, um agonista de WNT, um antagonista de WNT, um inibidor de Src, um inibidor de EGFR, um ativador de PCK, uma citocina, um fator de crescimento, um composto de diferenciação de célula endotelial, um composto promotor de célula endotelial e similares.
[0241] O ativador de sinalização de WNT (por exemplo, um inibidor de GSK3) inclui, porém sem limitação, CHIR-99021. O ativador de PCK inclui, porém sem limitação, PMA. O inibidor de sinalização de WNT inclui, porém sem limitação, um composto selecionado dentre KY02111, SO3031
(KY01-I), SO2031 (KY02-I) e SO3042 (KY03-I) e XAV939. O inibidor de Src inclui, porém sem limitação, A419259. O inibidor de EGFR inclui, porém sem limitação, AG1478.
[0242] Os exemplos não limitantes de um agente para gerar uma célula endotelial a partir de uma iPSC incluem activina A, BMP-4, Wnt3a, VEGF, proteína frisada solúvel, ciclosporina A, angiotensina II, fenilefrina, ácido ascórbico, dimetilsulfóxido, 5-aza-2'-desoxicitidina e similares.
[0243] As células da presente invenção podem ser cultivadas em uma superfície, tal como uma superfície sintética para suportar e/ou promover a diferenciação de células HIP em células endoteliais hipoimunes. Em algumas modalidades, a superfície compreende um material polimérico incluindo, porém sem limitação, um homopolímero ou copolímero dentre um ou mais monômeros de acrilato selecionados. Os exemplos não limitantes de monômeros de acrilato e monômeros de metacrilato incluem diacrilato de tetra(etilenoglicol), dimetacrilato de glicerol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de poli(etilenoglicol), dimetacrilato de di(etilenoglicol), dimetacrilato de tetra(etilenoglicol), propoxilato diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de neopentil glicol, benzoato diacrilato de trimetilolpropano, etoxilato de trimetilolpropano (1 EO/OH) metila, diacrilato de triciclo[5.2.1.02,6]decano- dimetanol, etoxilato diacrilato de neopentil glicol e triacrilato de trimetilolpropano. Acrilato sintetizado conforme conhecido na técnica ou obtido a partir de um vendedor comercial, tal como Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc. e Sartomer, Inc.
[0244] Em algumas modalidades, as células endoteliais podem ser inoculadas em uma matriz polimérica. Em alguns casos, a matriz polimérica é biodegradável. As matrizes biodegradáveis adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem colágeno-GAG, colágeno, fibrina, PLA, PGA e copolímeros de PLA/PGA. Os materiais biodegradáveis adicionais incluem poli(anidridos), poli(hidróxi ácidos), poli(orto ésteres), poli(propilfumeratos), poli(caprolactonas), poliamidas, poliaminoácidos, poliacetais, policianoacrilatos biodegradáveis, poliuretanos biodegradáveis e polissacarídeos.
[0245] Polímeros não biodegradáveis podem também ser usados. Outros polímeros não biodegradáveis, mas biocompatíveis incluem polipirrol, polianilinas, politiofeno, poliestireno, poliésteres, poliuretanos não biodegradáveis, poliureias, poli(acetato de etileno vinila), polipropileno, polimetacrilato, polietileno, policarbonatos e poli(óxido de etileno). A matriz polimérica pode ser formada em qualquer formato, por exemplo, como partículas, uma esponja, um tubo, uma esfera, uma fita, uma fita bobinada, uma rede capilar, um filme, uma fibra, uma malha ou uma folha. A matriz polimérica pode ser modificada para incluir materiais de matriz extracelular naturais ou sintéticos e fatores.
[0246] O material polimérico pode ser disperso na superfície de um material de suporte. Os materiais de suporte adequados para cultivar células incluem uma substância cerâmica, um vidro, um plástico, um polímero ou copolímero, quaisquer combinações dos mesmos ou um revestimento de um material em outro. Em alguns casos, um vidro inclui vidro soda- cal, vidro pirex, vidro vycor, vidro de quartzo, silício ou derivados desses ou similares.
[0247] Em alguns casos, plásticos ou polímeros, incluindo polímeros dendríticos, incluem poli(cloreto de vinila), poli(álcool vinílico), poli(metacrilato de metila), poli(acetato de vinila-anidrido maleico), poli(dimetilsiloxano) monometacrilato, polímeros de olefina cíclica, polímeros de fluorocarbono, poliestirenos, polipropileno, polietilenoimina ou derivados desses ou similares. Em alguns casos, os copolímeros incluem poli(acetato de vinila-co-anidrido maleico), poli(estireno-co- anidrido maleico), poli(etileno-co-ácido acrílico) ou derivados desses ou similares.
[0248] Células endoteliais geneticamente modificadas da invenção podem expressar um ou mais marcadores de célula endotelial. Os exemplos não limitantes de tais marcadores incluem VE-caderina (CD144), ACE (enzima conversora da angiotensina) (CD143), BNH9/BNF13, CD31, CD34, CD54 (ICAM- 1), CD62E (E-Selectina), CD105 (Endoglina), CD146, Endocan (ESM-1), Endoglyx-1, Endomucina, Eotaxina-3, EPAS1 (proteína 1 de domínio PAS endotelial), antígeno relacionado a Fator VIII, FLI-1, Flk-1 (KDR, VEGFR-2), FLT-1 (VEGFR-1), GATA2, GBP-1 (proteína 1 de lização a guanilato), GRO-alfa, HEX, ICAM- 2 (molécula de adesão intercelular 2), LM02, LYVE-1, MRB (magic roundabout), Nucleolina, PAL-E (pathologische anatomie Leiden- endotélio), RTKs, sVCAM-1, TALI, TEM1 (Marcador endotelial de tumor 1), TEM5 (Marcador endotelial de tumor 5), TEM7 (Marcador endotelial de tumor 7), Trombomodulina (TM, CD141), VCAM-1 (molécula de adesão de célula vascular 1) (CD106), VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular), vWF (fator de von Willebrand), ZO-1, molécula de adesão seletiva de célula endotelial (ESAM), CD102, CD93, CD184, CD304 e DLL4.
[0249] As células endoteliais incluem, porém sem limitação, células progenitoras endoteliais, células endoteliais capilares, células endoteliais arteriais, células endoteliais venosas, células endoteliais vasculares linfáticas, outras células endoteliais vasculares, células endoteliais aórticas, células endoteliais da barreira hematoencefálica, células endoteliais cardíacas, células endoteliais renais e células endoteliais hepáticas. Os tipos e características de diferentes células endoteliais são descritos em Atkins et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, e Vascular Biology, 2011, 31:1.476 a 1.484 e no documento no US
5.980.088. Em algumas modalidades, a célula endotelial geneticamente modificada isolada da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula endotelial vascular, célula endotelial cerebral, célula endotelial renal e célula endotelial aórtica. Em uma modalidade preferencial, a célula endotelial é uma célula endotelial capilar.
[0250] Em algumas modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são geneticamente manipuladas para expressarem um gene exógeno que codifica uma proteína de interesse, tal como, porém sem limitação, uma enzima, hormônio, receptor, ligante ou fármaco que é útil para tratar um distúrbio/afecção ou atenuar os sintomas do distúrbio/afecção. Métodos padrão para modificar geneticamente as células endoteliais são descritos, por exemplo, no documento no US5.674.722.
[0251] Tais células endoteliais podem ser usadas para fornecer a síntese constitutiva e a entrega de polipeptídeos ou proteínas, que são úteis na prevenção ou no tratamento da doença. Desse modo, o polipeptídeo é secretado diretamente na corrente sanguínea ou em outra área do corpo (por exemplo, central sistema nervoso central) do indivíduo.
Em algumas modalidades, as células endoteliais podem ser modificadas para secretar insulina, um fator de coagulação de sangue (por exemplo, Fator VIII ou Fator de von Willebrand), alfa-1 antitripsina, adenosina desaminase, ativador de plasminogênio de tecido, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL- 2, IL-3) e similares.
[0252] Em certas modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas podem ser modificadas de modo que melhorem seu desempenho no contexto de um enxerto implantado. Os exemplos ilustrativos não limitantes incluem secreção ou expressão de um agente trombolítico para prevenir a formação de coágulo intraluminal, secreção de um inibidor de proliferação de músculo liso para prevenir estenose luminal devido à hipertrofia de músculo liso e expressão e/ou secreção de um fator autócrino ou mitogênio de célula endotelial para estimular a proliferação de células endoteliais e melhorar a extensão ou duração do revestimento de célula endotelial do lúmen de enxerto.
[0253] Em algumas modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são utilizadas para entrega de níveis terapêuticos de um produto secretado a um membro ou órgão específico. Por exemplo, um implante vascular revestido com células endoteliais geneticamente modificadas (transduzidas) in vitro pode ser enxertado em um membro ou órgão específico. O produto secretado das células endoteliais transduzidas serão entregues em altas concentrações ao tecido perfundido, alcançando, assim, um efeito desejado a uma localização anatômica alvejada.
[0254] Em outras modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são geneticamente manipuladas para conter um gene que rompe ou inibe a angiogênese quando expresso por células endoteliais em um tumor de vascularização. Em alguns casos, as células endoteliais podem também ser geneticamente manipuladas para expressar qualquer um dos genes suicidas selecionáveis descritos no presente documento, o que permite a seleção negativa de células endoteliais enxertadas mediante a conclusão do tratamento de tumor.
[0255] Em algumas modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são administras a um paciente, por exemplo, um paciente humano que precisa das mesmas. As células endoteliais podem ser administradas a um paciente que sofre de uma doença ou afecção, tal como, porém sem limitação, doença cardiovascular, doença vascular, doença vascular periférica, doença isquêmica, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, doença obstrutiva vascular periférica, acidente vascular cerebral, lesão por reperfusão, isquemia dos membros, neuropatia (por exemplo, neuropatia periférica ou neuropatia diabética), falência de órgão (por exemplo, insuficiência hepática, insuficiência renal e similares), diabetes, artrite reumatoide, osteoporose, lesão vascular, lesão de tecido, hipertensão, angina pectoris e infarto do miocárdio devido à doença da artéria coronária, hipertensão vascular renal, insuficiência renal devido à estenose da artéria renal, claudicação das extremidades inferiores e similares. Em certas modalidades, o paciente sofreu ou está sofrendo de um acidente vascular cerebral ou ataque isquêmico temporário, que, em alguns casos, pode ser devido a uma doença cerebrovascular. Em algumas modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são administradas para tratar isquemia de tecido, por exemplo, conforme ocorre na ateroesclerose, infarto do miocárdio e isquemia dos membros e para o reparo de vasos sanguíneos lesionados. Em alguns casos, as células são usadas na bioengenharia de enxertos.
[0256] Por exemplo, as células endoteliais geneticamente modificadas podem ser usadas na terapia celular para o reparo de tecidos isquêmicos, formação de vasos sanguíneos e válvulas cardíacas, engenharia de vasos artificiais, reparo de vasos danificados e indução da formação de vasos sanguíneos em tecidos geneticamente modificados (por exemplo, antes do transplante). Adicionalmente, as células endoteliais podem ser adicionalmente modificadas para entregar agentes para alvejar e tratar tumores.
[0257] Em modalidades específicas, é fornecido no presente documento um método de reparo ou substituição para tecido que precisa de células vasculares ou vascularização. Esse método envolve administrar a um paciente humano que precisa de tal tratamento uma composição contendo as células endoteliais isoladas para promover a vascularização em tal tecido. O tecido que precisa de células vasculares ou vascularização pode ser um tecido cardíaco, tecido hepático, tecido pancreático, tecido renal, tecido muscular, tecido neural, tecido ósseo, entre outros, que pode ser um tecido danificado e caracterizado por morte celular em excesso, um tecido em risco de dano ou um tecido artificialmente modificado.
[0258] Em certas modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são usadas para melhorar implantes prostéticos (por exemplo, vasos produzidos a partir de materiais sintéticos, tais como Dacron e Gortex.) que são usados em cirurgia reconstrutiva vascular. Por exemplo, enxertos arteriais prostéticos são frequentemente usados para substituir artérias doentes que perfundem órgãos vitais ou membros. Em outras modalidades, as células endoteliais geneticamente modificadas são usadas para cobrir a superfície de válvulas cardíacas prostéticas para diminuir o risco da formação de êmbolos tornando a superfície da válvula menos trombogênica.
[0259] As células endoteliais geneticamente modificadas podem ser transplantadas no paciente com o uso de técnicas cirúrgicas bem conhecidas para enxertar tecido e/ou células isoladas em um vaso. Em algumas modalidades, as células são introduzidas no tecido cardíaco do paciente por injeção (por exemplo, injeção intramiocárdica, injeção intracoronária, injeção trans-endocárdica, injeção trans-epicárdica, injeção percutânea), infusão, enxerto e implantação.
[0260] A administração (entrega) da célula endotelial geneticamente modificada inclui, porém sem limitação, administração subcutânea ou parenteral, incluindo intravenosa, intra-arterial (por exemplo, intracoronária), intramuscular, intraperitoneal, intramiocárdica, trans- endocárdica, trans-epicárdica, intranasal assim como intratecal e técnicas de infusão.
[0261] Conforme será entendido por aqueles na técnica, os derivados de HIP diferenciados são transplantados com o uso de técnicas conhecidas no campo que dependem tanto do tipo de célula quanto do uso final dessas células. Em geral, as células HIP diferenciadas da invenção são transplantadas ou por via intravenosa ou por injeção em locais particulares no paciente. Quando transplantadas em locais particulares, as células podem ser suspensas em uma matriz de gel para impedir a dispersão enquanto se estabilizam. X. NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS HIPOIMUNES DERIVADOS DE
CÉLULAS HIP
[0262] Em algumas modalidades, neurônios dopaminérgicos (DA) são derivados das células HIP descritas no presente documento. Por exemplo, neurônios DA humanos podem ser produzidos diferenciando-se células HIP humanas. Similarmente, neurônios DA murinos podem ser produzidos diferenciando-se células HIP murinas. Tais neurônios DA são neurônios DA hipoimunes.
[0263] Os métodos úteis para diferenciar células- tronco pluripotentes em neurônios DA são descritos, por exemplo, nas Patentes nos U.S. 9.968.637 e 7.674.620, cujas revelações em sua totalidade, incluindo os relatórios descritivos, estão incorporados ao presente documento a título de referência. Métodos adicionais para produzir células DA a partir de células-tronco pluripotentes humanos podem ser encontrados em, por exemplo, Kim, J.-H., et al., Nature, 2002, 418,50 a 56; Björklund, L.M., et al., PNAS, 2002, 99(4), 2.344 a 2.349; Grow, D.A., et al., Stem Cells Transl Med. 2016, 5(9):1.133 a 1.144, e Cho, M. S., et al., PNAS, 2008, 105:3.392 a 3.397.
[0264] O termo “neurônios dopaminérgicos” refere- se a células neuronais que expressam tirosina hidroxilase (TH), a enzima limitante de taxa para síntese de dopamina. De preferência, os neurônios dopaminérgicos secretam o neurotransmissor dopamina e têm pouca ou nenhuma expressão de dopamina-β-hidroxilase. Um neurônio dopaminérgico pode expressar um ou mais dentre os seguintes: enolase específica para neurônio (NSE), l-aminoácido aromático descarboxilase, transportador de monoamina vesicular 2, transportador de dopamina, Nurr-1, e receptor de dopamina-2 (receptor de D2). Um neurônio dopaminérgico inclui um célula-tronco neuronal, célula progenitora neuronal, neurônio dopaminérgico imaturo e neurônio dopaminérgico maduro.
[0265] O termo “células-tronco neurais” refere-se a um subconjunto de células pluripotentes que se diferenciaram parcialmente ao longo de uma trajetória de célula neural e expressam alguns marcadores neurais, incluindo, por exemplo, nestina. As células-tronco neurais podem se diferenciar em neurônios ou células gliais (por exemplo, astrócitos e oligodendrócitos). O termo “células progenitoras neurais” refere-se a células cultivadas que expressam FOXA2 e baixos níveis de β-tubulina, mas não tirosina hidroxilase (isto é, que têm um fenótipo FOXA2+/β-tubulinaLO/TH−). Tais células progenitoras neurais têm a capacidade de se diferenciar em uma variedade de subtipos neuronais; particularmente uma variedade de subtipos neuronais dopaminérgicos, mediante cultura dos fatores adequados, tais como aqueles descritos no presente documento.
[0266] As células HIP e os neurônios DA derivados de células HIP podem ser cultivados em um meio de crescimento. Os meios de crescimento ilustrativos incluem, porém sem limitação, meio de célula-tronco embrionária humana (meio de hESC), meio de cultura de célula de mamífero Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), meio F12 de Ham, Neurobasal™ (ThermoFisher), Substituto de Soro Knockout (KOSR), Meio Eagle Essencial Mínimo - modificação alfa (Alfa MEM), DMEM Knockout
(KO-DMEM), N-2 (ThermoFisher), meio de cultura de célula estromal MS-5 e similares.
[0267] Os aditivos úteis que promover diferenciação, crescimento, expansão, manutenção e/ou maturação de neurônios DA incluem, porém sem limitação, Wnt1, fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2), FGF8, FGF8a, Sonic Hedgehog (SHH), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de transformação α (TGF-α), TGF- β3, interleucina 1 beta (IL1β), fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF), um inibidor de GSK-3 (por exemplo, CHIR-99021), um inibidor de TGF-β (por exemplo, SB- 431542), suplemento de B-27, dorsomorfina, purmorfamina, noguina, ácido retinoico, cAMP, ácido ascórbico, GlutaMax™, neurturina, Substituição de Soro Knockout, N-acetil cisteína, ligante c-kit, formas modificadas dos mesmos, miméticos dos mesmos, análogos dos mesmos e variantes dos mesmos. Em algumas modalidades, os neurônios DA são diferenciados na presença de um ou mais fatores que ativam ou inibem a trajetória de WNT, a trajetória de NOTCH, trajetória de SHH, a trajetória de BMP, a trajetória de FGF, a trajetória de TGFβ e similares. Protocolos de diferenciação e descrições detalhadas dos mesmos são fornecidos, por exemplo, nas Patentes no U.S. 9.968.637 e
7.674.620, Kim, J.-H., et al., Nature, 2002, 418,50 a 56; Björklund, L.M., et al., PNAS, 2002, 99(4), 2.344 a 2.349; Grow, D.A., et al., Stem Cells Transl Med. 2016, 5(9):1.133 a
1.144, e Cho, M. S., et al., PNAS, 2008, 105:3.392 a 3.397, as revelações em suas totalidades incluindo a descrição detalhada da invenção, exemplo, métodos, métodos online e resultados estão incorporados ao presente documento a título de referência.
[0268] Para caracterizar e monitorar a diferenciação de DA e avaliar o fenótipo de DA, a expressão de qualquer número de marcadores moleculares e genéticos pode ser avaliada. Por exemplo, a presença de marcadores genéticos pode ser determinada por vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. A expressão de marcadores moleculares pode ser determinada quantificando-se métodos tal como, porém sem limitação, ensaios baseados em qPCR, imunoensaios, ensaios de imunocitoquímica, ensaios de imunoblotting e similares.
[0269] Os marcadores exemplificativos para neurônios DA incluem TH, β-tubulina, proteína box pareada (Pax6), proteína intensificadora do gene de insulina (ISL1), nestina, diaminobenzidina (DAB), canal de potássio retificador interno ativado por proteína G 2 (GIRK2), proteína associada a microtúbulo 2 (MAP-2), proteína 1 relacionada a receptor nuclear (NURR1), transportador de dopamina (DAT), proteína forkhead box A2 (FOXA2), FOX3, doublecortina e fator de transcrição de LIM homeobox 1-beta (LMX1B) e similares.
[0270] Os neurônios DA podem ser também avaliados de acordo com marcadores eletrofisiológicos celulares. A eletrofisiologia das células pode ser avaliada com o uso de ensaios conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, célula inteira e patch clamp perfurado, ensaios para detectar a atividade eletrofisiológica das células, ensaios para medir a magnitude e duração de potencial de ação das células e ensaios funcionais para detectar a produção de dopamina de células DA.
[0271] Em algumas modalidades, a diferenciação de neurônio DA é caracterizada por potenciais de ação rítmicos espontâneos e potenciais de ação de alta frequência com adaptação de frequência de pico mediante injeção de corrente de despolarização. Em outras modalidades, a diferenciação de DA é caracterizada pela produção de dopamina. O nível de dopamina produzida é calculado medindo-se a extensão de um potencial de ação no ponto em que atingiu metade de sua amplitude máxima (metade da extensão máxima de pico).
[0272] Em algumas modalidades, os neurônios DA derivados de células HIP são administrados a um paciente, por exemplo, paciente humano, para tratar uma doença ou afecção neurodegenerativa. Em alguns casos, a doença ou afecção neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Parkinson, doença de Huntington e esclerose múltipla. Em outras modalidades, os neurônios DA são usados para tratar ou atenuar um ou mais sintomas de um distúrbio neuropsiquiátrico, tal como transtorno de hiperatividade e déficit de atenção (ADHD), Síndrome de Tourette (TS), esquizofrenia, psicose e depressão. Em ainda outras modalidades, os neurônios DA são usados para tratar um paciente com neurônios DA comprometidos.
[0273] Os neurônios DA diferenciados podem ser transplantados ou por via intravenosa ou por injeção em locais particulares no paciente. Em algumas modalidades, as células DA diferenciadas são transplantadas na substância negra (particularmente em ou adjacente da região compacta), a área tegmental ventral (VTA), o caudado, o putâmen, o núcleo accumbens, o núcleo subtalâmico ou qualquer combinação dos mesmos do cérebro para substituir os neurônios DA cuja degradação resultou em doença de Parkinson (PD). As células DA diferenciadas podem ser injetadas na área alvo como uma suspensão de células. Alternativamente, as células DA diferenciadas podem ser integradas em uma matriz de suporte ou arcabouço quando contidas em tal dispositivo de entrega. Em algumas modalidades, o arcabouço é biodegradável. Em outras modalidades, o arcabouço não é biodegradável. O arcabouço pode compreender materiais naturais ou sintéticos (artificiais).
[0274] Os princípios gerais das formulações terapêuticas das composições celulares são encontrados em Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996, e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000, especificamente incorporados ao presente documento a título de referência. Em algumas modalidades, os neurônios DA diferenciados são fornecidos na forma de uma composição farmacêutica. A entrega dos neurônios DA pode ser atingida com o uso de um veículo adequado, tal como, porém sem limitação, lipossomas, micropartículas ou microcápsulas. Em outras modalidades, os neurônios DA diferenciados são administrados em uma composição farmacêutica que compreende um excipiente isotônico. A composição farmacêutica é preparada sob condições que são suficientemente estéreis para administração humana.
[0275] Conforme será entendido por aqueles na técnica, os derivados de HIP diferenciados são transplantados ou enxertados com o uso de técnicas conhecidas no campo que dependem tanto do tipo de célula quanto do uso final dessas células. Em geral, as células HIP diferenciadas da invenção são transplantadas ou injetadas em locais particulares no paciente. Quando transplantadas em locais particulares, as células podem ser suspensas em uma matriz de gel para impedir a dispersão enquanto se estabilizam.
XI. CÉLULAS DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNES DERIVADAS DE CÉLULAS HIP
[0276] Em algumas modalidades, as células de ilhota pancreática (também denominadas células beta pancreáticas) são derivadas das células HIP descritas no presente documento. Por exemplo, células de ilhota pancreática humanas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP humanas. Similarmente, células ilhota pancreática murinas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP murinas. Tais células de ilhota pancreática são células de ilhota pancreática hipoimunes.
[0277] Em algumas modalidades, as células de ilhota pancreática são derivadas das células HIP descritas no presente documento. Os métodos úteis para diferenciar células- tronco pluripotentes em células da ilhota pancreática são descritos, por exemplo, na Patente nº U.S. 9.683.215; Patente nº U.S. 9.157.062 e na Patente nº U.S. 8.927.280.
[0278] Em algumas modalidades, as células de ilhota pancreática produzidas pelos métodos conforme revelado no presente documento secretam insulina. Em algumas modalidades, uma célula de ilhota pancreática exibe pelo menos duas características de uma célula de ilhota pancreática endógena, por exemplo, porém sem limitação, a secreção de insulina em resposta à glicose e a expressão de marcadores de células beta.
[0279] Os marcadores de células beta ou marcadores progenitores de células beta exemplificativos incluem, porém sem limitação, c-peptídeo, Pdx1, transportador de glicose 2 (Glut2), HNF6, VEGF, glicoquinase (GCK), pró- hormônio convertase (PC1/3), Cdcp1, NeuroD, Ngn3, Nkx2.2,
Nkx6.1, Nkx6.2, Pax4, Pax6, Ptfla, Isl1, Sox9, Sox17 e FoxA2.
[0280] Em algumas modalidades, as células de ilhota pancreática isoladas produzem insulina em resposta a um aumento na glicose. Em várias modalidades, as células de ilhota pancreática isoladas secretam insulina em resposta a um aumento na glicose. Em algumas modalidades, as células têm morfologia distinta, tal como uma morfologia de célula de paralelepípedo e/ou um diâmetro de cerca de 17 µm a cerca de 25 µm.
[0281] Em algumas modalidades, o método para diferenciar células HIP em células de ilhota pancreática hipoimunes compreende cultivar as células-tronco HIP no meio de cultura que compreende FGF10. Em alguns casos, o meio de cultura que compreende um ou mais fatores de diferenciação selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de queratinócito (KGF), fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação α (TGFα), fator de crescimento de transformação β (TGFβ), fator de crescimento de hepatócito (HGF), Wnt3a, Activina A, Nodal, KAAD-CYC, (fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), nicotinamida, indolatam V, um inibidor de HDAC, IDE1 e IDE2. Em algumas modalidades, as células HIP são diferenciadas em células de ilhota pancreática cultivando-se as células em meio de cultura que compreende um ou mais dos seguintes: fator de crescimento do tipo insulina (IGF), fator de crescimento de transformação (TGF), fator de crescimento de fibroblasto (EGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), sonic hedgehog (SHH) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), superfamília de fator de crescimento de transformação β (TGFβ), proteína morfogênica óssea 2 (BMP2), proteína morfogênica óssea 7
(BMP7), um inibidor de GSK3β, um inibidor de ALK, um inibidor de receptor de BMP tipo 1, ácido retinoico e qualquer combinação dos mesmos.
[0282] Em algumas modalidades, uma população de células-tronco pluripotentes hipoimunes (células HIP) pode ser colocada em contato com ou exposta a um ou mais dos compostos de Fórmula (I), por exemplo, IDE1 ou IDE2, conforme descrito no presente documento, sozinha, e em outras modalidades, uma população de células-tronco pluripotentes pode ser colocada em contato com pelo menos um agente adicional, concomitante com (por exemplo, em combinação com), subsequente a ou antes do contato da célula pluripotente com um composto de Fórmula (I), conforme revelado no documento nº US 8.927.280.
[0283] Em algumas modalidades, o composto adicional para uso em combinação com compostos de Fórmula (I), conforme revelado no documento nº US 8.927.280 pode incluir, porém sem limitação, agentes de membro da família de fator de crescimento de transformação β (TGFβ) (por exemplo, Nodal ou Activina A), membro da família de fator de crescimento de fibroblastos (FGF) (por exemplo, FGF10), membro da família de fator de crescimento de Wnt (por exemplo, Wnt3a), proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) e/ou membros da trajetória de AKT/PI3K. A definição e os detalhes da trajetória TGF-beta3/BMP são revelados na técnica, por exemplo, Kawabata M. e Miyazono K., J. Biochem. (Tóquio), 125, 9 a 16 (1999); Wrana J. L., Miner. Electrolyte Metab., 24, 120 a 130 (1998); e Markowitz S. D., e Roberts A. B., Cytokine Growth Factor Rev., 7, 93 a 102 (1996). Em algumas modalidades, uma célula-tronco pluripotente pode ser exposta a um composto de Fórmula (I), por exemplo, IDE1 e/ou IDE2 em combinação com pelo menos um composto ou fator adicional, incluindo, porém sem limitação, ciclopamina, membros da família de TGF (TGF-alfa, Activina A, Activina B, TGF-β-1, TGF-beta-3), exendina 4, nicotinamida, n- butirato, DMSO, cido all-trans-retinoico, GLP-I, proteínas morfogênicas ósseas (BMP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-7), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF-I, IGF-II), fatores de crescimento de fibroblastos (FGF7, FGF10, bFGF, FGF4), outros fatores de crescimento (EGF, beta celulina, hormônio do crescimento, HGF), outros hormônios (prolactina, colecistocinina, gastrina I, lactogênio placental), antagonistas da família de TGF-β (Noguina, folistatina, cordina), IBMX, wortmanina, dexametazona, Reg, INGAP, cAMP ou ativadores de cAMP (forscolina) e/ou componentes da matriz extracelular (laminina, fibronectina).
[0284] Em algumas modalidades, a célula HIP é colocada em contato com pelo menos um inibidor de histona desacetilase (HDAC) (por exemplo, um inibidor de HDAC classe I/II) para diferenciar a célula de uma célula da ilhota pancreática. A histona desacetilase (HDAC) é uma classe de enzimas que remove grupos acetila de um aminoácido e-N-acetil lisina em uma histona. As HDACs exemplificativas incluem aquelas HDAC de Classe I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8; e HDACs de Classe II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7A, HDAC9, HDAC10. HDACs de mamíferos de tipo I incluem: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 e HDAC11. HDACs de mamíferos de tipo II incluem: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9 e HDAC1.
[0285] Diversas classes estruturais de reguladores negativos de HDACs (por exemplo, inibidores de HDAC) foram desenvolvidos, por exemplo, carboxilatos de peso molecular pequeno (por exemplo, menor que cerca de 250 amu),
ácidos hidroxâmicos, benzamidas, epoxicetonas, peptídeos cíclicos e moléculas híbridas. (Consultar, por exemplo, Drummond D C, Noble C O, Kirpotin D B, Guo Z, Scott G K, et al. (2005) Clinical development of histone deacetylase inhibitors as anticancer agents.
Annu Rev Pharmacol Toxicol 45: 495 a528, (incluindo exemplos específicos no mesmo) que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Os exemplos não limitantes de reguladores negativos de HDACs tipo I/II incluem: Ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA (por exemplo, MK0683, vorinostat) e outros ácidos hidroxâmicos), BML-210, Depudecina (por exemplo, (-)-Depudecina), Toxina HC, Nullscript (4-(1,3-Dioxo-1H,3H- benzo[de]isoquinolin-2-il)-N-hidroxibutanamida), Fenilbutirato (por exemplo, fenilbutirato de sódio) e Ácido Valproico ((VPA) e outros ácidos graxos de cadeia curta), Scriptaid, Suramina Sódica, Tricostatina A (TSA), Composto APHA 8, Apicidina, Butirato de sódio, butirato de pivaloiloximetila (Pivanex, AN-9), Trapoxina B, Clamidocina, Depsipeptídeo (também conhecido como FR901228 ou FK228), benzamidas (por exemplo, CI-994 (isto é, N-acetil dinalina) e MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido m- carboxicinamínico, ácido bisidroxâmico), JNJ16241199, Tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (isto é, ácido 6-(3-clorofenilureido)caproico hidroxâmico), AOE (ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico), CHAP31, CHAP 50, IDE1 e IDE2. Outros inibidores incluem, por exemplo, formas negativas dominantes das HDACs (por exemplo, formas cataliticamente inativas), inibidores de siRNA das HDACs e anticorpos que se ligam especificamente às HDACs.
Os inibidores estão comercialmente disponíveis, por exemplo, junto à BIOMOL
International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene e Sigma Aldrich. Em algumas modalidades, IDE1 ou IDE2 é um inibidor de histona desacetilase preferencial.
[0286] A diferenciação das células HIP pode ser atingida colocando-se, por exemplo, sobrepondo-se, uma monocamada de células HIP em contato com um componente ou componentes da matriz extracelular (ECM). Em algumas modalidades, a camada de células HIP é colocada em contato com um componente de matriz extracelular que é um ou mais dentre: laminina, por exemplo, laminina 1; colágeno, por exemplo, colágeno IV; entactina; proteoglicano sulfato de heparina; nidogênio. O componente de matriz extracelular pode ser uma substância derivada de membrana basal, por exemplo, uma membrana basal disposta por uma célula, por exemplo, uma célula tumoral, por exemplo, uma célula de tumor de Engelbreth-Holm- Swarm (EHS). Em algumas modalidades, o componente de matriz extracelular é Matrigel™, que está comercialmente disponível junto à Becton-Dickenson. O componente extracelular pode incluir, ainda: um ou mais fatores de crescimento, uma ou mais matriz metaloproteinases (MMP), por exemplo, MMP-2, MMP-3, e combinações dos mesmos.
[0287] As células HIP podem ser cultivadas na presença da matriz extracelular ou componente ou componentes da matriz extracelular por um período de pelo menos 1, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 25, 28, 30, 35, 40, 42, 48, 50 ou mais dias.
[0288] Em algumas modalidades, as células da ilhota pancreática derivadas de HIP podem ser administradas a um paciente, por exemplo, um paciente humano que precisa do mesmo. Em alguns casos, o paciente tem uma doença, distúrbio ou afecção que pode ser tratada com o uso de tais células. Em outras palavras, a administração das células da ilhota pancreática derivadas de HIP pode reduzir ou atenuar pelo menos um efeito adverso ou sintoma associado ao metabolismo de insulina como é bem conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o paciente tem uma doença caracterizada por atividade de insulina insuficiente que pode incluir doenças em que há uma utilização anormal de glicose devido à função de insulina anormal. A função de insulina anormal pode incluir qualquer anormalidade ou comprometimento na produção de insulina (por exemplo, expressão e/ou transporte através de organelas celulares, tais como deficiência de insulina resultante, por exemplo, da perda de células β); secreção (por exemplo, comprometimento das respostas secretórias de insulina); a forma da própria molécula de insulina (por exemplo, estrutura primária, secundária ou terciária); efeitos da insulina em células-alvo (por exemplo, resistência à insulina em tecidos corporais incluindo tecidos periféricos); e respostas das células-alvo à insulina.
[0289] Os métodos comuns para administrar células de ilhota pancreática a sujeitos, particularmente sujeitos humanos, são descritos no presente documento. Por exemplo, as células de ilhota pancreática podem ser administradas a um sujeito por injeção ou implante das células nos sítios-alvo nos sujeitos. Adicionalmente, as células podem ser inseridas em um dispositivo de entrega que facilita a introdução por injeção ou implante das células nos sujeitos. Tais dispositivos de entrega incluem tubos, por exemplo, cateteres para injetar células e fluidos no corpo de um sujeito receptor. Em uma modalidade preferencial, os tubos têm adicionalmente uma agulha, por exemplo, uma seringa, através dos quais as células da invenção podem ser introduzidas no sujeito em um local desejado. As células de ilhota pancreática podem ser inseridas em tal dispositivo de entrega, por exemplo, uma seringa, de diferentes formas. Por exemplo, as células podem ser suspensas em uma solução ou incorporadas em uma matriz de suporte quando contidas em tal dispositivo de entrega.
[0290] Conforme usado no presente documento, o termo “solução” inclui um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável em que as células da invenção permanecem viáveis. Os carreadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. O uso de tais carreadores e diluentes é bem conhecido na técnica. A solução é, de preferência, estéril e fluida até o ponto em que as células e solução possam passar através de uma seringa. Em algumas modalidades, a solução é estável sob as condições de fabricação e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos, através do uso de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Tais soluções podem ser preparadas incorporando-se as células da ilhota pancreática descritas no presente documento em um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável, seguido por esterilização filtrada.
[0291] Matrizes de suporte em que as células da ilhota pancreática podem ser incorporadas ou integradas incluem matrizes que são compatíveis com o receptor e que se degradam em produtos que não são nocivos para o receptor. Matrizes biodegradáveis naturais e/ou sintéticas são exemplos de tais matrizes. As matrizes biodegradáveis naturais incluem coágulos plasmáticos, por exemplo, derivados de mamífero, e matrizes de colágeno. As matrizes biodegradáveis sintéticas incluem polímeros sintéticos, tais como polianidretos, poliortoésteres e ácido polilático. Outros exemplos de polímeros sintéticos e métodos para incorporar ou integrar células nas matrizes são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 4.298.002 e na Publicação de Patente no U.S. 5.308.701. As matrizes fornecem suporte e/ou proteção para as células pancreáticas frágeis in vivo.
[0292] Conforme será entendido por aqueles na técnica, os derivados de HIP diferenciados são transplantados ou enxertados com o uso de técnicas conhecidas no campo que dependem tanto do tipo de célula quanto do uso final dessas células. Em geral, as células HIP diferenciadas da invenção são transplantadas ou injetadas em locais particulares no paciente. Quando transplantadas em locais particulares, as células podem ser suspensas em uma matriz de gel para impedir a dispersão enquanto se estabilizam. XII. CÉLULAS HIPOIMUNES DE EPITÉLIO PIGMENTADO DA RETINA (RPE) DERIVADAS DE CÉLULAS HIP
[0293] Em algumas modalidades, as células do epitélio pigmentado da retina (RPE) são derivadas das células HIP descritas no presente documento. Por exemplo, células de RPE humanas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP humanas. Similarmente, células de RPE murinas podem ser produzidas diferenciando-se células HIP murinas. Tais células de RPE são células de RPE hipoimunes.
[0294] As células HIP descritas no presente documento podem ser diferenciadas em células do epitélio pigmentado da retina (RPE), incluindo células progenitoras de RPE, células de RPE imaturas, células de RPE maduras e células de RPE funcionais.
[0295] Os métodos úteis para diferenciar células- tronco pluripotentes embrionárias em células de RPE são descritos, por exemplo, nas Patentes nos U.S. 9.458.428 e
9.850.463, cujas revelações em sua totalidade, incluindo os relatórios descritivos, estão incorporados ao presente documento a título de referência. Os métodos adicionais para produzir células de RPE a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias humanas podem ser encontrados, por exemplo, em Lamba et al., PNAS, 2006, 103(34):
12.769 a 12.774; Mellough et al., Stem Cells, 2012, 30(4):673 a 686; Idelson et al., Cell Stem Cell, 2009, 5(4): 396 a 408; Rowland et al., Journal of Cellular Physiology, 2012, 227(2):457 a 466, Buchholz et al., Stem Cells Trans Med, 2013, 2(5): 384 a 393 e da Cruz et al., Nat Biotech, 2018, 36:328 a
337.
[0296] O termo células de “RPE” refere-se a células do epitélio pigmentado da retina que têm perfil de expressão genética similar ou substancialmente similar àquele de células de RPE nativas. Tais células de RPE derivadas de células-tronco pluripotentes podem possuir a morfologia de folha plana poligonal de células de RPE nativas quando cultivadas até confluência em um substrato plano.
[0297] As células HIP e as células de RPE derivadas de células HIP podem ser cultivadas em um meio de crescimento. Os meios de crescimento ilustrativos incluem,
porém sem limitação, X-VIVO 10™ (Lonza Biosciences), X-VIVO 15™ (Lonza Biosciences), MTESR2™ (Stem Cell Technologies), NUTRISTEM™ (StemGent) e HESCGRO™ (Millipore). Lonza X-VIVO 10™ suplementado com 5 a 40% de Substituto de Soro Knockout Livre de Xeno (XF-KOSR™, Invitrogen), MX-302 (Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) com suplemento B-27), meio Essential 8™, meio de células de mamífero Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), meio F12 de Ham, Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), Meio Eagle Essencial Mínimo (MEM), Meio do Instituto Roswell Park Memorial 1640 (RPMI-1640), meio MCDB e similares.
[0298] Os aditivos úteis que promovem a diferenciação, crescimento, expansão, ,manutenção e/ou maturação de células de RPE incluem, porém sem limitação, um inibidor de sinalização de BMP (por exemplo, LDN-193189, dorsomorfina, cordina, cerberus e noguina), um inibidor de sinalização de WNT (por exemplo, proteína relacionada a Dickkopf (DKK1), IWP-2, IWP-3, IWP-4, XAV939, proteína relacionada ao receptor frizzled decretada (SFRP1 e SFRP2) e Fator Inibidor de Wnt 1 (WIF-1)), um inibidor de sinalização de FGF (por exemplo, SU5402, AZD4547 e PD173074), fator de crescimento semelhante a insulina (IGF1), nicotinamida, ácido benzoico, ácido 3-aminobenzoico, 6-aminonicotinamida, um inibidor de poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) (por exemplo, 3-aminobenzamida, iniparibe (BSI 201), olaparibe (AZD-2281) e rucaparibe (AG014699, PF-01367338), veliparibe (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, e BMN-673), um inibidor de ROCK (por exemplo, Y-27632, tiazovivina, GSK429286A e Fasudil), fator de crescimento de fibroblasto básico 1 (bFGF1), FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, SUN13837, F2A4-K-
NS, tricostatina A, activina A, activina AB, activina B, BMP- 4, BMP-7, TGF-β1, peptídeo intestinal vasoativo (VIP), forscolina, rolipram, suplemento de B-27, Substituto de Soro Knockout, suplemento de N2, taurina, progesterona, vitamina A, blebistatina, formas modificadas dos mesmos, miméticos dos mesmos, análogos dos mesmos e variantes dos mesmos. Os protocolos de diferenciação e descrições detalhadas dos mesmos são fornecidos, por exemplo, nas Patentes nos U.S. 9.458.428 e
9.850.463, e da Cruz et al., Nat Biotech, 2018, 36:328 a 337, cujas revelações em sua totalidade, incluindo a descrição detalhada da invenção, exemplos, métodos, métodos online e resultados estão incorporados ao presente documento a título de referência.
[0299] Em algumas modalidades, as células de RPE hipoimunes são diferenciadas, propagadas ou imobilizadas em um substrato de cultura celular. Os substratos de cultura celular exemplificativos comumente usados são substratos como matrigel™ (Corning Life Sciences), camadas de células alimentadas com fibroblasto embrionário de camundongo, fibroblastos embrionários humanos, epitélio das trompas de falópio ou camadas alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano. Substratos livres de Xeno podem ser também usados, como, porém sem limitação, Synthemax™ (Corning Life Sciences), CELLstart™ (Invitrogen), GELstart™ (Invitrogen) e StemAdhere™ (Primorigen). Os substratos de cultura celular adicionais podem compreender um ou mais dos seguintes, incluindo vitronectina humana purificada, vitronectina humana recombinante, fibronectina humana recombinante (por exemplo, RetroNectin®; Takara Bio), laminina humana purificada, laminina recombinante, laminina recombinante 511, laminina recombinante 521, poli-D-lisina e similares.
[0300] Em certas modalidades, as células de RPE são diferenciadas, propagadas ou imobilizadas em um substrato biocompatível, como um substrato sintético. Os substratos não limitantes incluem substratos poliméricos, membranas de poliéster, membranas de tereftalato de polietileno (PET), membranas de poli(ácido DL-lático-co-glicólico) (PLGA), membranas de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), membranas de policaprolactona, arcabouços artificiais submetidos a eletrofiação produzidos a partir de metilmetacrilato e poli(etilenoglicol) e similares. Os substratos exemplificativos são substratos descritos, por exemplo, na Patente no U.S. 8.808.687, cuja revelação em sua totalidade está incorporada ao presente documento a título de referência. Os exemplos ilustrativos de materiais adequados para o substrato incluem, porém sem limitação, parileno polipropileno, poli-imida, vidro, nitinol, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, colágeno, colágeno quimicamente tratado, polietersulfona (PES), poli(glicerol- sebacato) PGS, poli(estireno-isobutil-estireno), poliuretano, acetato de etil vinila (EVA), polieteréter cetona (PEEK), Kynar (Fluoreto de polivinilideno; PVDF), Politetrafluoroetileno (PTFE), Polimetilmetacrilato (PMMA), Pebax, acrílico, poliolefina, polidimetilsiloxano (PDMS) e outros elastómeros de silicone, polipropileno, hidroxiapetita, titânio, ouro, prata, platina, outros metais e ligas, cerâmicas, plásticos e misturas ou combinações dos mesmos. Os materiais adequados adicionais usados para construir um substrato incluem, porém sem limitação, poli-para-xililenos (por exemplo, parileno, incluindo, porém sem limitação, parileno A, parileno AM,
parileno C, parileno tratado com amônia, parileno C tratado com polidopamina), poli(ácido láctico) (PLA), polietileno- acetato de vinila, poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA), poli(D,L-lactídeo), poli(carbonato de D,L-lactídeo-co- trimetileno), colágeno, colágeno heparinizado, colágeno desnaturado, colágeno modificado (por exemplo, silicone com gelatina), outras matrizes de crescimento celular (tal como SYNTHEMAX™), poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) e/ou outro polímero, copolímeros ou copolímero em bloco, poli(caprolactona) contendo arginina-glicina-asparagina cíclica, arginina-glicina-ácido aspártico linear ou cíclico, mesclas de policaprolactona e polietilenoglicol (PCL-PEG), poliuretanos termoplásticos, poliéter uretanos modificados com silicone, poli(carbonato uretano) ou poli-imida. Os poliuretanos termoplásticos exemplificativos são polímeros ou copolímeros que podem compreender poliuretanos alifáticos, poliuretanos aromáticos, materiais formadores de hidrogel de poliuretano, poliuretanos hidrofílicos ou combinações dos mesmos. Os exemplos não limitantes incluem elastano (poli(éter uretano)), como Elasthane™ 80A, Lubrizol, Tecophilic. ™, Pellethane™, Carbothane™, Tecothane™, Tecoplast™ e Estane™. Os poliéter uretanos modificados com silicone podem incluir Carbosil™ 20 ou Pursil™ 20 80A e similares. Poli(carbonato uretano) pode incluir Bionate™ 80A ou polímeros similares.
[0301] Em algumas modalidades, o substrato é biodegradável. Em outras modalidades, o substrato não é biodegradável. Nas modalidades particulares, o substrato compreende um ou mais componentes biodegradáveis e um ou mais componentes não biodegradáveis.
[0302] Para caracterizar e monitorar a diferenciação de RPE e avaliar o fenótipo de RPE, a expressão de qualquer número de marcadores moleculares e genéticos pode ser avaliada. Por exemplo, a presença de marcadores genéticos pode ser determinada por vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. A expressão de marcadores moleculares pode ser determinada quantificando-se métodos tal como, porém sem limitação, ensaios baseados em qPCR, imunoensaios, ensaios de imunocitoquímica, ensaios de imunoblotting e similares.
[0303] Os marcadores exemplificativos para células de RPE incluem proteína box pareada (Pax6), proteína Rax homeobox (Rax), proteína LIM/homeobox 2 (Lhx2), proteína homeobox SIX3, enzima tirosinase (TYR), fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), proteína de ligação a retinaldeído celular (CRALBP), tripsina-1 (tripsinogênio catiônico, TYRP1), tripsina-2 (tripsinogênio aniônico, TYRP2), proteína de premelanossoma (PMEL17), homólogo de proteína de locus prata (SILV), homólogo contendo homeodomínio ceh-10 (Chx10), bestrofina-1 (BEST) e proteína de 65 kDa específica para epitélio pigmentado da retina (RPE65).
[0304] As células de RPE podem estar também associadas de acordo com os marcadores fisiológicos e marcadores morfológicos celulares. Imunocitoquímica e microscopia eletrônica podem ser usados para determinar a morfologia das células. As células de RPE podem ser avaliadas com o uso de ensaios funcionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, definição do perfil de secreção de fator derivado de epitélio pigmentado (PEDF), ensaios de fagocitose de segmentos externos da haste (ROS), ensaios para conversão de trans retinol em 11-cis retinol, ensaios para determinar a secreção polarizada de fatores de crescimento e ensaios para detectar junções firmes que criam uma barreira elétrica podem ser usados para caracterizar as células de RPE derivadas de células HIP.
[0305] Em algumas modalidades de diferenciação, as células-tronco pluripotentes sofrem indução neural e expressam um ou mais marcadores de progenitor retinal Pax6, Rax, Lhx2, Six3 ou quaisquer outros marcadores moleculares, fisiológicos ou morfológicos de indução neural. Em outras modalidades, as células de diferenciação sofrem especificação de RPE e/ou formam estruturas de roseta. Conforme as células continuam a se diferenciar, as estruturas de roseta podem aplanar em uma camada ou uma folha de células de RPE imaturas. A camada de células de RPE imaturas pode compreender células planas com um formato poligonal e/ou hexagonal.
[0306] Em algumas modalidades, o RPE hipoimune é implantado em um paciente que precisa do mesmo. As células de RPE podem ser implantadas em um paciente que sofre de degeneração macular ou um paciente que tem células de RPE danificadas. Em algumas modalidades, o paciente tem degeneração macular relacionada à idade (AMD), AMD precoce, AMD intermediária, AMD tardia, degeneração macular relacionada à idade não neovascular, degeneração macular seca (degeneração macular relacionada à idade seca), degeneração macular úmida (degeneração macular relacionada à idade úmida), degeneração macular juvenil (JMD) (por exemplo, doença de Stargardt, doença de Best e retinosquise juvenil), Ameurose Congênita de Leber ou retinite pigmentosa. Em outras modalidades, o paciente sofre de descolamento da retina.
[0307] As células de RPE podem ser imobilizadas em qualquer um dos substratos descritos no presente documento para produzir um emplastro de RPE que pode ser transplantado em um paciente que precisa do mesmo. O emplastro que compreende uma ou mais camadas de células de RPE pode ser cirurgicamente administrado ou entregue a um tecido ocular. Em alguns casos, os emplastros são entregues à retina neural ou ao espaço subretinal. Em certas modalidades, os emplastros são entregues por via endoscópica, através de métodos baseados em cateter, por via intravascular, por via intramuscular ou por outros meios conhecidos na técnica para um tecido ocular particular. O posicionamento de emplastros pode ser determinado com o uso de estereobiomicroscopia, fotografia de fundo, tomografia óptica de domínio espectral (SD-OCT) e outros métodos reconhecidos por aqueles na técnica.
[0308] Conforme será entendido por aqueles na técnica, os derivados de HIP diferenciados são transplantados ou enxertados com o uso de técnicas conhecidas no campo que dependem tanto do tipo de célula quanto do uso final dessas células. Em geral, as células HIP diferenciadas da invenção são transplantadas ou injetadas em locais particulares no paciente. Quando transplantadas em locais particulares, as células podem ser suspensas em uma matriz de gel para impedir a dispersão enquanto se estabilizam.
[0309] A fim de que a invenção descrita no presente documento possa ser completamente entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Deve ser entendido que esses exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e não devem ser interpretados como limitantes desta invenção de qualquer maneira. XIII. EXEMPLOS EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES
INDUZIDAS DE CAMUNDONGO
[0310] O método descrito no presente documento é adaptado de Diecke et al., Sci Rep, 2015, 8081.
[0311] Fibroblastos murinos da ponta da cauda de camundongos foram dissociados e isolados com colagenase tipo IV (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) e mantidos com meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), L-glutamina, 4,5 g/l de glicose, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina a 37 °C, 20% de O2 e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada.
[0312] 1×106 fibroblastos murinos foram, então, reprogramados com o uso de um plasmídeo mini-intrônico com otimização de códon inovador (co-MIP) (10 a 12 μm de DNA) que expressa quatro fatores de reprogramação Oct4, KLF4, Sox2 e c- Myc com o uso do sistema Neon Transfection. Após transfecção, os fibroblastos foram colocados em placas em uma camada de alimentador de fibroblastos embrionários murinos (MEF) e mantidos em meio de fibroblasto com a adição de butirato de sódio (0,2 mM) e 50 μg/ml de ácido ascórbico.
[0313] Quando colônias semelhantes a ESC apareceram, o meio foi trocado por meio de iPSC murina contendo DMEM, 20% de FBS, L-glutamina, aminoácidos não essenciais (NEAA), β-mercaptoetanol e 10 ng/ml de fator inibitório da leucemia (LIF). Após 2 passagens, as iPSCs murinas foram transferidas para placas revestidas com gelatina a 0,2% e adicionalmente expandidas. Com cada passagem, as iPSCs foram classificadas pelo marcador de pluripotência murina SSEA-1 com o uso de classificação de células ativadas magnéticas (MACS).
[0314] As iPSCs de camundongo isoladas podem ser usadas para gerar iPSCs hipoimunogênicas de camundongo de acordo com o método descrito acima. EXEMPLO 2: GERAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES
INDUZIDAS DE SER HUMANO
[0315] A linhagem de iPSC Epissômica Humana Gibco™ (número de catálogo A18945, ThermoFisher) foi derivada de sangue de cordão umbilical CD34+ com o uso de um sistema epissômico à base de EBNA de três plasmídeos e sete fatores (SOKMNLT; SOX2, OCT4 (POU5F1), KLF4, MYC, NANOG, LIN28 e antígeno SV40L T). Essa linhagem de iPSC é considerada de pegada zero visto que não havia integração no genoma do evento de reprogramação. Mostrou ser livre de todos os genes de reprogramação. Os protocolos para descongelamento, cultura e passagem das iPSCs humanas são fornecidos no manual do produto.
[0316] A pluripotência das iPSCs humanas pode ser determinada por ensaios de teratoma in vivo e ensaios de expressão de genes pluripotentes in vitro (por exemplo, PCR e arranjos) ou por manchamento com fluorescência para marcadores pluripotentes.
[0317] A linhagem de iPSC Epissômica Humana Gibco™ tem um cariotipo normal e expressão endógena de marcadores pluripotentes como OCT4, SOX2 e NANOG (conforme mostrado por RT-PCR) e OCT4, SSEA4, TRA-1-60 e TRA-1-81 (conforme mostrado por ICC). A expressão de genoma total e análises de perfilagem epigenética demonstraram que essa linhagem de hiPSC epissômica é molecularmente indistinguível de linhagens de células-tronco embrionárias humanas (Quintanilla et al., PloS One, 2014, 9(1): e85419). Em diferenciação direcionada e análises de teratoma, essas hiPSCs mantiveram seu potencial de diferenciação para as linhagens ectodérmicas, endodérmicas e mesodérmicas (Burridge et al.,
PLoS One, 2011, 6(4): e18293). Adicionalmente, linhagens vasculares, hematopoiéticas, neurais e cardíacas foram derivadas com eficiências robustas (Burridge et al., supra). TABELA 1. PROTOCOLO ILUSTRATIVO PARA CULTIVAR IPSCS HUMANAS (POR EXEMPLO, CAS9 IPSCS) Título Cultura de iPSC humana As células-tronco pluripotentes induzidas têm a capacidade de gerar progênie diferenciada representativa de todas as três camadas germinais (ectoderma, endoderme e mesoderma). A capacidade de expandir células pluripotentes in Introdução vitro e submeter as mesmas à diferenciação direta para produzir tipos de células específicos é essencial para o desenvolvimento de terapias baseadas em células para substituir ou restaurar tecido que foi danificado por doença ou lesão.
1. Meio Essential 8 Flex (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo A2858501)
2. Suplemento Celular Revita (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo A2644501)
3. Matrigel diluído (Corning, número de catálogo Materiais 356231), diluído em DMEM Knockout (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 10829)
4. Versene (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 15040066)
5. Placas de cultura celular de 10 cm² (Corning, número de catálogo353003) Protocolo Notas Descongelar 1x frasco em 1x placa de 10 cm², após aproximadamente 4
1. a 5 dias, as células atingiram 60 a 70% de confluência e estarão prontas para divisão
Título Cultura de iPSC humana Reconstituir Matrigel 1:40 em DMEM Knockout frio e misturar bem. Colocar as placas em incubadora a
2. 37 °C por 30 minutos para usar as placas imediatamente e vedar com parafilme e armazenar a 2 a 8 °C por até 7 dias. Cultivar iPSC humana Cas9 em Incubar as placas de 10 cm2 revestidas com células a 37
3. Matrigel diluído (1:40 em DMEM KO) °C / 5% de em Meio Essential 8 Flex. CO2. Pipetar delicadament e. Não Trocar o meio diariamente e passar turbilhonar!
4. as células a cada 3 a 4 dias 1:6 ! usando Versene por 9 min a 37 °C. Centrifugaçã o a 800 rpm, 4 min a 4 °C Suplemento de Células Revita foi
5. adicionado a 1:100 no meio após divisão pelas primeiras 24 h.
[0318] As iPSCs humanas isoladas podem ser usadas para gerar iPSCs hipoimunogênicas humanas (células HIP) de acordo com o método descrito acima. EXEMPLO 3: CÉLULAS PLURIPOTENTES HIPOIMUNOGÊNICAS
FORAM MENOS SUSCETÍVEIS A EXTERMÍNIO POR CÉLULA NK E FAGOCITOSE POR MACRÓFAGO.
[0319] Os exemplos foram realizados para avaliar a capacidade de células pluripotentes hipoimunogênicas (por exemplo, iPSCs b2m-/-ciita-/-CD47 tg de camundongo e iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas) e para evadir trajetórias de resposta imunológica inata.
[0320] Em particular, ensaios de imunomancha ligado à enzima (Elispot) foram realizados. Células NK foram cocultivadas com células HIP de camundongo ou células HIP humanas (iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo ou iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas) e a liberação de IFNγ foi medida (por exemplo, frequências de mancha de IFNγ inata foram medidas com o uso de um leitor de placa Elispot). Em alguns exemplos, CD47 foi bloqueado com o uso de um anticorpo anti-CD47.
[0321] iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo cocultivados com células NK de camundongo, tal como aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos falharam em estimular a ativação de células NK (Figura 1). As iPSCs B2m-/-Ciita-/- de camundongo ativaram a liberação de IFNγ por células NK no ensaio Elispot, enquanto as iPSCs B2m-/-Ciita- /-CD47 tg de camundongo não o fizeram. CD47 de bloqueio (por exemplo, uso de um anticorpo anti-CD47) não tiveram efeito sobre as iPSCs B2m-/-Ciita-/- de camundongo. Entretanto, o bloqueio de CD47 suprimiu completamente a proteção que as iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg tinham. As células YAC-1 que são conhecidas por ativar células NK e, assim, a liberação de IFNγ servido como um controle.
[0322] iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas cocultivadas com células NK humanas falharam em estimular a ativação de célula NK. A Figura 2 mostra que as iPSCs B2M-/- CIITA-/- humanas ativaram a liberação de IFNγ por célula NK no ensaio Elispot, enquanto as iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas não o fizeram. O bloqueio de CD47 não teve efeito sobre as iPSCs B2M-/-CIITA-/- humanas, mas suprimiu a proteção que as iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas tiveram. As células K562 que são conhecidas por ativar células NK e, assim, a liberação de IFNγ servido como um controle.
[0323] A Figura 3 mostra resultados de Elispot de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo incubadas com células NK humanas (aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos). iPSCs B2m-/-Ciita-/- de camundongo e iPSCs B2m- /-Ciita-/-CD47 tg de camundongo ativaram a liberação de IFNγ por células NK humanas. O bloqueio de CD47 não teve efeito sobre a resposta de células NK. As células YAC-1 produziram uma liberação de IFNγ forte por células NK humanas e serviram como um controle.
[0324] A Figura 4 mostra resultados de Elispot de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas incubadas com células NK de camundongo (aproximadamente 95% de células NK e 5% de macrófagos). iPSCs B2M-/-CIIta-/- humanas e iPSCs B2M-/-CIIta- /-CD47 tg humanas ativaram a liberação de IFNγ por células NK de camundongo. O bloqueio de CD47 não teve efeito sobre a resposta de células NK. As células K562 humanas produziram uma liberação de IFNγ forte por células NK de camundongo e serviram como um controle.
[0325] Ensaios de fagocitose por macrófago foram também realizados para determinar se as células HIP da presente invenção são suscetíveis à fagocitose por macrófago. Brevemente, as células HIP descritas no presente documento foram identificadas com luciferase de vagalume e cultivadas com macrófagos. A viabilidade ou presença das células HIP foi analisada por um ensaio repórter de luciferase.
[0326] A Figura 5 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos humanos. O sinal de viabilidade das iPSCs B2M-/- CIITA-/- humanas caiu significativamente quando incubadas com macrófagos. Por outro lado, o sinal de viabilidade das iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas não mudou na presença de macrófagos humanos. TritonX-100 que exterminou todas as células HIP foi usado como um controle. O bloqueio de CD47 eliminou os recursos protetores de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas e tornou as mesmas suscetíveis à fagocitose por macrófago e eliminação.
[0327] A Figura 6 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos de camundongo.
[0328] O sinal de viabilidade das iPSCs B2m-/- Ciita-/- de camundongo caiu significativamente quando incubadas com macrófagos. Em contrapartida, o sinal de viabilidade das iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo não mudou na presença de macrófagos de camundongo. TritonX-100 que exterminou todas as células HIP foi usado como um controle. O bloqueio de CD47 eliminou os recursos protetores de iPSCs B2M- /-CIITA-/-CD47 tg de camundongo e tornou as mesmas suscetíveis à fagocitose por macrófago e eliminação. TritonX-100 que exterminou todas as células HIP foi usado como um controle.
[0329] A Figura 7 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos de camundongo. Os sinais de viabilidade tanto de iPSCs B2M-/-CIITA-/- humanas quanto de iPSCs B2M-/-CIITA-/- CD47 tg humanas caíram significativamente quando cocultivadas com macrófagos de camundongo. TritonX-100 que exterminou todas as células HIP foi usado como um controle.
[0330] A Figura 8 mostra os resultados de ensaio de fagocitose de iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo identificadas com luciferase de vagalume cocultivadas com macrófagos humanos. Os sinais de viabilidade tanto de iPSCs B2m-/-Ciita-/- de camundongo quanto de iPSCs B2m-/-Ciita-/- CD47 tg de camundongo caíram significativamente quando cocultivadas com macrófagos humanos. TritonX-100 que exterminou todas as células HIP foi usado como um controle.
[0331] Os resultados fornecidos no presente documento mostram que iPSCs B2m-/-Ciita-/-CD47 tg de camundongo e iPSCs B2M-/-CIITA-/-CD47 tg humanas tiveram capacidade de evadir às respostas imunológicas inatas, tal como ativação de células NK e fagocitose por macrófago. EXEMPLO 4: GERAÇÃO DE CARDIOMIÓCITOS derivados de CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS DE SER HUMANO
[0332] São fornecidos no presente documento métodos para gerar cardiomiócitos (CMs) derivados de célula HIP humanas. Em uma modalidade exemplificativa, as células HIP humanas foram diferenciadas em uma monocamada in vitro de cardiomiócitos. O procedimento exemplificativo descrito no presente documento foi adaptado a partir de Sharma et al., J Vis Exp, 2015, 97, doi:10.3791/52628, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade e especificamente para as técnicas de diferenciar as células.
[0333] As células HIP humanas foram colocadas em placas em Matrigel diluído (356231, Corning) em placas de 6 poços e mantidas em meio Essential 8 Flex (Thermo Fisher). O meio foi trocado a cada 24 horas.
[0334] Após as células estarem a 90% a 100% de confluência, a diferenciação foi iniciada (Figura 10), e meio de diferenciação de CM no Dia 0 foi trocado por 5 ml de RPMI1640
(Gibco, número de catálogo 61870) contendo 2% de B-27 menos Insulina (Gibco, número de catálogo A1895601) e CHIR-99021 2 µM a 8 µM (Selleck Chem, número de catálogo S1263). Em alguns casos, a concentração de CHIR-99021 foi 6 µM. Não houve troca de meios entre o Dia 0 e o Dia 2 de diferenciação.
[0335] No Dia 2 (Figura 11), o meio de diferenciação de CM foi trocado por RPMI1640 contendo 2% de B- 27 menos insulina sem CHIR-99021. Tomou-se cuidado para não agitar as células.
[0336] No Dia 3 (Figura 12), o meio de diferenciação de CM foi trocado por RPMI1640 contendo 2% de B- 27 menos insulina e 5 µl de IWR1 (um inibidor de WNT, Selleck Chem, número de catálogo S7086). Tomou-se cuidado para não agitar as células. Após o meio ter sido trocado, as células foram deixadas permanecer em repouso na incubadora a 37 °C por 48 horas. Não houve troca de meios entre o Dia 3 e o Dia 5 de diferenciação.
[0337] No Dia 5 (Figura 13), o meio de diferenciação de CM foi trocado de volta por meio RPMI1640 contendo 2% de B-27 menos insulina e incubado por 48 horas. O meio de diferenciação de CM no Dia 5 foi o mesmo que o meio no Dia 2. Após o meio ter sido trocado, as células foram deixadas permanecer em repouso na incubadora a 37 °C por 48 horas.
[0338] No Dia 7 (Figura 14), o meio de diferenciação de CM foi trocado por RPMI1640 contendo B27 mais insulina (Gibco, número de catálogo 17504044) e substituído em dias alternados posteriormente pelo mesmo meio. O batimento espontâneo de cardiomiócitos foi visível pela primeira vez aproximadamente no dia 8 ao dia 10.
[0339] Após 10 dias de diferenciação (Figura 15),
mais de 50% das áreas celulares estavam batendo. As estruturas semelhantes a ramo estavam altamente pronunciadas. Em alguns casos, as células foram terminalmente diferenciadas e não proliferaram mais. Visto que as células estavam batendo, a cultura de cardiomiócitos foi mantida no meio de diferenciação de CM do Dia 7. O meio foi trocado em dias alternados.
[0340] Em alguns casos, quando as células diferenciadas não estavam batendo ou se houvesse áreas de batimento pequenas, as células foram submetidas a inanição de glicose. A inanição de glicose desprendeu as células não cardiomiócitos da placa de cultura. O meio foi trocado no dia 10 de diferenciação por meio de purificação que compreende RPMI1640 sem glicose (Gibco, número de catálogo 11879) contendo B-27 mais insulina (Gibco, número de catálogo 17504044). As células foram mantidas em meio de purificação por 3 dias (até o dia 13 de diferenciação).
[0341] No Dia 13, o meio foi trocado pelo meio de diferenciação de CM do Dia 7 para manter os cardiomiócitos na cultura. Em alguns exemplos, o procedimento de purificação (inanição de glicose) foi repetido no Dia 14, de modo que o meio fosse trocado por meio de diferenciação de CM no Dia 17. As células restantes eram cardiomiócitos altamente purificados.
[0342] Os cardiomiócitos isolados e purificados foram mantidos em meio de diferenciação de CM do Dia 7 no Dia
7. O meio foi trocado em dias alternados. Em algumas modalidades, cerca de 1x106 cardiomiócitos foram colocados em placas em uma placa de 6 poços.
[0343] Os cardiomiócitos com batimento foram congelados em meio de congelamento e armazenados em nitrogênio líquido. Em alguns casos, o meio de congelamento incluiu 90% de FCS inativado por aquecimento e 10% de DMCO ou um equivalente livre de xeno. Após descongelamento, os cardiomiócitos continuaram a bater.
[0344] A Figura 9 fornece um diagrama do método de diferenciação. A Figura 10 mostra iPSCs humanas cultivadas em Matrigel™ imediatamente antes do início da diferenciação (ampliação de 100x). A Figura 11 mostra células no dia de diferenciação 2 antes da alteração de meio (ampliação de 100x). As células permaneceram em uma monocamada com aproximadamente 10% de células flutuantes. O meio de diferenciação era amarelado antes da troca de meio. A Figura 12 mostra células no dia de diferenciação 3 antes da alteração de meio (ampliação de 100x). As células permaneceram em uma monocamada com aproximadamente 20% de células flutuantes. O meio era de cor menos amarelada em comparação com o dia 2 de diferenciação. Algumas estruturas semelhantes a vesícula estavam visíveis na monocamada. A Figura 13 mostra células no dia de diferenciação 5 antes da alteração de meio (ampliação de 100x). As células permaneceram em uma monocamada com aproximadamente 15% de células flutuantes. Cardiomiócitos apareceram acima de outros agrupamentos de células. A Figura 14 mostra células no dia de diferenciação 7 antes da alteração de meio (ampliação de 100x). As células permaneceram em uma monocamada com aproximadamente 15% de células flutuantes. Estruturas semelhantes a ramos estavam visíveis. A Figura 15 mostra células no dia de diferenciação 9 antes da alteração de meio (ampliação de 100x). Os cardiomiócitos com batimento eram visíveis e apareceram mais escuros na foto. EXEMPLO 5: CÉLULAS HIP MURINAS DIFERENCIADAS EM
CARDIOMIÓCITOS INDUZIDOS
[0345] As células mHIP foram diferenciadas em cardiomiócitos induzidos murinos (hmiCM). Antes da diferenciação, as células mHIP e miPSCs foram passadas duas vezes em placas revestidas com gelatina para remover as células alimentadoras. No dia 0, a diferenciação foi iniciada com
80.000 células/ml em IMEM/F12 de Ham (3:1, ambos Corning) + 0,5% de suplemento de N2, 1% de ácido retinoico B27, 0,05% de BSA, 1% de pen-estrep, 1% de glutamina (Gibco), 5 mg/ml de ácido ascórbico e 40 nl/ml de MTG (ambos Sigma-Aldrich) por 2 dias em placas de 10 cm não revestidas. No dia 2, as células foram transferidas em IMEM/F12 de Ham (3:1, ambos Corning) com 0,5% de suplemento de N2, 1% de ácido retinoico B27, 0,05% de BSA, 1% de pen-estrep, 1% de glutamina (todos Gibco), 5 mg/ml de ácido ascórbico e 40 nl/ml de MTG (Sigma-Aldrich) por 2 dias em placas de 10 cm não revestidas. No dia 4, as células foram colocadas em placas em placa de 6 poços revestidas com gelatina em meio SP34 contendo 1% de glutamina, 50 µg/ml de ácido ascórbico, 5 ng/ml de VEGF, 500 ug/ml de hFGFb e 25 ng/ml de hFGF10 (R&D Systems). O meio foi trocado no dia 7 por meio SP34 contendo 1% de glutamina e 50 ug/ml de ácido ascórbico e foi trocado em dias alternados. O batimento celular começou em torno do dia 11 a 14 e demonstrou sua função.
[0346] As células foram enriquecidas por separação com o uso de MACS de acordo com o protocolo dos fabricantes com o uso de microesferas magnéticas revestidas com mAb anti-CD15 (Miltenyi) para seleção negativa. O fluxo passante contendo hiCMs e miCMs enriquecidos foi colocado em placas novamente e usado para diferentes ensaios. A diferenciação foi confirmada por rtPCT para Gata4 e Mhy6
(Figura 16). O iniciador direto Gata4 (SEQ ID NO:7) era: 5’-CTGTCATCTCACTATGGGCA-3’
[0347] e o iniciador inverso (SEQ ID NO:8) era: 5’-CCAAGTCCGAGCAGGAATTT-3’
[0348] O iniciador direto Mhy6 (SEQ ID NO:9) era 5’-ATCATTCCCAACGAGCGAAAG-3’
[0349] e o iniciador inverso (SEQ ID NO:10) era 5’-AAGTCCCCATAGAGAATGCGG-3’
[0350] A diferenciação foi também confirmada por imunofluorescência (IF). Os anticorpos primários eram contra actinina α-sarcomérica (EA-53, Abcam) ou troponina I (ab47003, Abcam) seguida por anticorpo secundário correspondente conjugado com AF488 ou AF555 (Invitrogen). (Dados não mostrados.) EXEMPLO 6: HIPO-MCMS TRANSPLANTADOS SOBREVIVEM A
LONGO PRAZO EM RECEPTORES ALOGÊNICOS
[0351] hiCMs e miCMs foram transplantados na zona de borda do infarto de camundongos receptores alogênicos (BALB/c). A linhagem de células é luciferase (+) que gerou CMs luc (+) que foram seguidos in vivo por bioluminescência (BLI).
[0352] Transdução de células HIP e iPSCs para expressar luciferase. As células foram transduzidas para expressar Fluc. Cem mil células mHIP ou miPSCs foram colocadas em placas em placa de 6 poços revestidas com gelatina e incubadas de um dia para o outro a 37 °C e 5% CO2. No dia seguinte, o meio foi trocado e um frasco de partículas lentivirais Fluc que expressam o gene luciferase II sob um promotor de EF1a geneticamente modificado novamente (GenTarget, San Diego, CA) foi adicionado a 1,5 ml de meio. Após 36 horas, 1 ml de meio de cultura foi adicionado. Após mais 24 horas, uma troca de meio completa foi realizada. Após 2 dias, a expressão de luciferase foi confirmada adicionando- se D-luciferina (Promega, Madison, WI). Os sinais foram quantificados com um IVIS 200 (Perkin Elmer Waltham, MA) em fótons máximos s -1 cm -2 por esterradiano.
[0353] Os hiCMs não foram rejeitados e não migraram para outros órgãos 28 dias pós-transplante (Figura 17). Os hiCMs evadiram o reconhecimento imunológico após transplante alogênico, mostrando sobrevida longitudinal. Devido ao fato de que a injeção foi no músculo cardíaco, as células transplantadas foram opcionalmente mapeadas. Os hiCMs resultaram em enxerto de “supercélula”, mas nenhum com os miCMs. (Dados não mostrados.) MAPEAMENTO ÓPTICO:
[0354] Preparação de Langendorff de Coração Total. Quatro a cinco semanas após a cirurgia, os camundongos sofreram eutanásia por deslocamento cervical. As orelhas foram rapidamente excisadas e colocadas em solução de Tyrode modificada gelada de composição (em mmol/l) 93 de NaCl, 20 de NaHCO3, 1 de Na2HPO4, 1 de MgSO4, 5 de KCl, 1,8 de CaCl2, 20 de acetato de Na, 20 de glicose. Os corações foram montados por meio da aorta em uma cânula e retrogradamente perfundidos a 9 ml/min com o uso da mesma solução de Tyrode a 37 °C com o pH mantido a 7,4 por borbulhamento com uma mistura gasosa de 95% de O2/5% de CO2. O perfusato foi, então, trocado por uma solução de Tyrode contendo 10 mmol/l de 2,3-butanediona monoxima (BDM) e 10 μmol/l de blebistatina (Enzo Life Sciences, Exeter, Reino Unido) para inibir a contração e minimizar os artefatos de movimento. Os corações foram posicionados na horizontal em uma câmara de Perspex construída customizada para possibilitar o imageamento do ventrículo esquerdo (LV). Um pseudoeletrocardiograma (ECG) foi monitorado através do experimento com o uso de 2 eletrodos de disco de Ag/AgCl colocados próximos ao coração, com um eletrodo de referência colocado no banho de perfusão. Dois eletrodos de platina conectados a um estimulador isolado foram posicionados no apêndice atrial direito (RA) para possibilitar a estimulação dos corações por meio da trajetória de condução fisiológica do endocárdio ao epicárdio, a uma duração de ciclo de 200 ms (5 Hz).
[0355] As medições ópticas foram realizadas conforme descrito em detalhes anteriormente (Kelly et al., Circ. Arrhythmia Electrophysiol 6:809 a 817 (2013), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Em resumo, os corações foram carregados com um bolus de 50 μl de corante sensível à tensão 2 mM (di-4- ANEPPS) durante um período de 10 min. Registros de epifluorescência de fóton único de campo amplo do LV foram realizados com o uso de uma câmera CardioCMOS-SM128 (Redshirt Imaging, Decatur, GA) com um filtro de emissão passa-longa de 590 nm. Excitação foi fornecida por luz LED a 470 nm. A resolução da imagem foi 128 × 128 pixels/quadro, e os registros foram realizados a uma taxa de quadro de 2,5 kHz. Microscopia de varredura a laser de dois fótons (2P) (2PLSM) foi executada com o uso de um microscópio vertical Zeiss LSM 510 NLO (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com um laser ajustável de 690 a 1.080 nm Ti:Sapphire (Chameleon Ultra II, Coherent, Santa Clara, CA). Essas medições de 2P forneceram um alto grau de resolução de profundidade, possibilitando a identificação das camadas de tecido distintas que exibem atividade elétrica
(Rubart, 2004). Di-4-ANEPPS foi excitado a 920 nm, com emissão coletada por dois detectores PMT bialcalinos a 510 a 560 nm e 590 a 650 nm, respectivamente, possibilitando que medições ratiométricas fossem realizadas. Varreduras de linha, com um tempo de varredura de 0,39 ms para varreduras curtas e 1,93 ms para varreduras longas, foram realizadas na direção de orientação celular observada na superfície epicardial. A varredura de linha foi iniciada após a chagada do pulso disparador, sincronizado por pulso de estímulo elétrico usado para estimular os corações.
[0356] Registros de campo amplo e voltagem de 2P sequenciais foram realizados em miocárdio afastado da cicatriz de infarto no NZ, no BZ na borda da cicatriz visivelmente, adjacente ao NZ e dentro do IZ em direção ao centro da cicatriz. O mapeamento elétrico de campo amplo com o uso de lentes objetivas 10×/0,3 NA (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) foi primeiramente usado para identificar as áreas de atividade elétrica remanescente dentro do BZ e do IZ. O mapeamento elétrico de campo amplo foi, então, repetido em regiões que exibem sinais elétricos com uma lente objetiva 40×/0,8 NA (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) para localizar adicionalmente áreas eletricamente ativas. Finalmente, as estruturas no plano óptico foram imageadas com o uso de excitação de 2P em modo de varredura de quadro, então, sinais elétricos registrados com o uso de modo de varredura de linha nas profundidades distintas abaixo da superfície epicardial. Uma série de registros foi realizada, iniciando em 50 μm abaixo da superfície e em profundidades crescentes (etapas de 50 a 100 μm) até a razão entre sinal e ruído (S/N) se tornar muito baixa para distinguir um sinal de potencial de ação (AP) claro. A capacidade de visualizar estruturas claras diminuiu em camadas mais profundas; a profundidade máxima a partir da qual imagens discerníveis poderiam ser obtidas na zona, mas sinais elétricos de registros de varredura de linha poderiam sempre ser registrados além das camadas em que as estruturas poderiam ser imageadas. Não foi, portanto, possível identificar a fonte de atividade elétrica diretamente a partir de imagens de estrutura de tecido nas camadas mais profundas. Um subconjunto de análises foi realizado com o uso de uma configuração de varredura a laser de 2P vertical modificada (Intelligent Imaging Innovations; Denver, CO) que utiliza um par de detectores GaAsP PMT de alta sensibilidade e com o uso de uma combinação de FluoVolt e Rhod2AM, excitados a 840 nm. Os mesmos foram usados para verificar conclusões em uma configuração de sensibilidade mais alta.
[0357] Determinação da Fonte de Atividade Elétrica na Cicatriz. Para determinar a origem celular da atividade elétrica na cicatriz, medições de Ca2+ intracelular foram realizadas nas regiões em que sinais de tensão foram medidos por carregamento anterior do miocárdio com Fura-2/AM. Se os sinais estivessem surgindo de miócitos residuais, transientes de Ca2+ (CaTs) poderiam ser esperados em resposta a um estímulo elétrico. Entretanto, se os sinais de tensão estivesses surgindo de miócitos anormais ou outras entidades celulares (isto é, fibroblastos ou miofibroblastos), os CaTs podem não ser produzidos em resposta à estimulação elétrica (Chilton et al., 2007).
[0358] A solução de Tyrode para esses experimentos foi suplementada com 1 mmol/l de probenecide para bloquear transportadores de ânion que excretam Fura-2,
melhorando, assim, a retenção de corante na célula. (Di Virgilio et al., Biochem. J. 256:959 a 963 (1988), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade). Fura-2/AM foi preparado como um estoque de 1 mmol/l em DMSO-ácido plurônico F-127 (25% em p/v). Um bolus de 100 μl de corante foi injetado em uma armadilha de bolhas na linha de perfusão para permitir a diluição do corante e carregamento lento no coração. Bolus adicionais de corante foram injetados se necessário devido à perda baixa ou dependente do tempo de sinal de fluorescência. Fura-2/AM foi excitado com 2P a 760 nm, e a emissão de fluorescência foi direcionada através de um espelho dicroico de 650 nm passa- curta e coletado a 510 a 560 nm. As medições de Ca2+ foram realizadas imediatamente após quaisquer sinais de tensão terem sido detectados no mesmo plano de foco e com o uso da mesma linha de varredura e tempo de varredura de 1,93 ms.
[0359] Análise e Interpretação de Dados. Os sinais de tensão de campo amplo tiveram a média calculada a partir de arranjos de 3 × 3 pixels. A tensão de 2P e sinais de Ca2+ foram processados com o uso de software escrito customizado que utilizou as informações exatas de tempos de duração de ciclo e taxas de varredura de linha para alinhar e produzir uma tensão média ou traço de Ca2+ a partir de 25 estímulos sequenciais (5 s de registros). As características de sinal de AP foram analisadas a partir do traço médio. Essas medições incluíram 10 a 90% do tempo de elevação (TRise) e duração do AP a partir de 50% de ativação até 50, 75, e 90% de repolarização (APD50, APD75 e APD90, respectivamente). Os tempos de ativação foram determinados como o tempo de chegada do AP nesse ponto na parede LV em relação ao tempo de estimulação.
[0360] S/N foi calculado como a amplitude de pico do traço inteiro após um único pulso de estímulo (sinal) dividido pela amplitude de pico do traço durante o período diastólico (ruído) (Figura Suplementar S1). Um valor de S/N de 1 indicou sem sinal sobre e acima do ruído da linha de base. Com base nas observações de traços individuais e valores de S/N correspondentes, um S/N > 1,4, foi considerado um sinal temporário significativo (tensão ou Ca2+). Todos os traços com S/N > 1,4 foram, ainda, examinados para eliminar sinais artefatuais produzidos por movimento ou picos de ruído. Todos os dados são expressos como média ± erro-padrão. Os grupos de dados foram comparados com o uso de teste t de Student.
[0361] A histopatologia e manchamento de tricromo de corações receptores 28 dias após infarto do miocárdio revelaram que o tamanho do infarto em receptores alogênicos de hiCMs foi significativamente reduzido assim como o tamanho do ventrículo esquerdo. O comprimento do infarto foi medido a partir de 25 lâminas com um vão de 150 µm cada (a cada 10ª lâmina, com 3 seções 5 µm em cada lâmina; lâmina 1 a 250). Foram identificados cardiomiócitos de doador positivos alfa- sarcoméricos e estrutura de vaso prematuras nos receptores que receberam as células hiCMs. Em contrapartida, nenhuma célula foi detectada com os miCMs alogênicos (Figura 18).
[0362] A análise de alça de PV detalhada demonstrou uma melhora significativa de parâmetros do ventrículo esquerdo. IT indicou não apenas sobrevida de células alogênicas, mas também que as mesmas foram enxertadas e funcionalmente restauraram o coração após infarto do miocárdio (Figura 19A). A análise de alça de PV de corações com infarto que receberam injeções de miCMs (verde) ou “supercélula” hiCMs (vermelho).
[0363] Os seguintes parâmetros mostraram que os hiCMs restaram a função do coração: A fração de ejeção (EF) é a razão entre o volume de sangue ejetado do ventrículo por batida e o volume de sangue nesse ventrículo ao final da diástole. O volume de batimento (SV) é o volume de sangue ejetado por um ventrículo em uma única contração. É a diferença entre o volume diastólico final e o volume sistólico final. (Figura 19B.) O trabalho de batimento ventricular (SW) é definido como o trabalho realizado pelo ventrículo esquerdo para ejetar o volume de batimento para a aorta. O débito cardíaco (CO) é definido como a quantidade de sangue bombeado pelo ventrículo por tempo unitário. (Figura 19C). A relação de volume de pressão sistólica final (ESPVR) descreve a pressão máxima que pode ser desenvolvida pelo ventrículo em qualquer dado volume da câmara cardíaca. A ESPVR é relativamente insensível a mudanças em pré-carga, pós carga e frequência cardíaca. Isso torna a mesma um índice aprimorado de função sistólica em relação a outros parâmetros hemodinâmicos como fração de ejeção, débito cardíaco e volume de batimento.
[0364] O infarto do miocárdio resulta em função de bomba reduzida do coração, com volume aumentado e pressão diminuída na análise de alça P-V. Quando cardiomiócitos HIP foram injetados após infarto do miocárdio, as alterações na pressão e volume são impedidas, indicando a regeneração do coração e remodelagem impedida. EXEMPLO 7: CÉLULAS HIP HUMANAS DIFERENCIADAS EM
HICMS
[0365] As células HIP humanas foram diferenciadas em cardiomiócitos hipoimunes. As células hHIP foram colocadas em placas em Matrigel diluído (356231, Corning) em placas de 6 poços e mantidas em meio Essential 8 Flex (Thermo Fisher). A diferenciação foi iniciada em 90% de confluência, e o meio foi trocado por 5 ml de RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos Insulina (Gibco) e CHIR-99021 6 μM (Selleckchem). Após 2 dias, o meio foi trocado por RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos insulina sem CHIR. No dia 3, 5 ul de IWR1 foram adicionados ao meio por mais dois dias. No dia 5, o meio foi trocado de volta para RPMI-1640 contendo 2% de meio B-27 menos insulina e deixado por 48 h. No dia, o meio foi trocado por RPMI-1640 contendo B27 mais insulina (Gibco) e substituído a cada 3 dias posteriormente pelo mesmo meio.
[0366] A purificação de cardiomiócitos foi realizada no dia 10 após a diferenciação. Em resumo, o meio foi trocado por meio com baixo teor de glicose e mantido por 3 dias. No dia 13, o meio foi trocado de volta para RPMI-1640 contendo B27 mais insulina. Esse procedimento foi repetido no dia 14 novamente.
[0367] O fenótipo de diferenciação foi confirmado por rtPCR para troponina (cTNT, dados não mostrados). O iniciador direto (SEQ ID NO:11) foi: 5’-GAGGCACCAAGTTGGGCATGAACG A-3’,
[0368] O iniciador inverso (SEQ ID NO:12) foi: 5’-GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA’
[0369] O fenótipo de diferenciação foi também confirmado por manchamento com imunofluorescência (IF). Os anticorpos primários eram contra actinina α-sarcomérica (EA- 53, Abcam) e troponina I (ab47003, Abcam) seguida por anticorpo secundário correspondente conjugado com AF488 ou AF555
(Invitrogen). Os núcleos da célula foram manchados com DAPI. O imageamento foi realizado com o uso de um microscópio confocal a laser Leica SP5 (Leica). (Dados não mostrados.)
[0370] O batimento espontâneo de cardiomiócitos foi visível em torno do dia 10 de diferenciação. Os cardiomiócitos mostram taxas de batimento similares a tecido cardíaco humano e são sensíveis à estimulação cardíaca (por isoprenalina) e bloqueio cardíaco (por verapamil). EXEMPLO 8: CÉLULAS HICM SOBREVIVEM A TRANSPLANTE
ALOGÊNICO EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS
[0371] Os cardiomiócitos hipoimunes sobreviveram após o transplante em camundongos humanizados alogênicos (camundongos NSG-SGM3 humanizados (18 a 30 semanas) adquiridos junto ao Laboratories (Sacramento, CA). Os camundongos NSG- SGM3 enxertados com célula-tronco hematopoiética CD34+ humana desenvolveram células imunes humanas de múltiplas linhagens e demonstram um sistema imunológico humano funcional, exibindo respostas imunológicas dependentes de célula T sem reatividade imunológica de célula doadora direcionada ao hospedeiro. Os animais foram atribuídos aleatoriamente aos grupos experimentais. A porcentagem de células CD3+ entre a população de células CD45+ humanas foi avaliada em cada animal e as porcentagens de CD3 nunca foram significativamente diferentes entre os grupos WT e B2M−/−CIITA−/−CD47 tg (Deuse et al., Nat Biotech 37(3):252 a 258 (2019), incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade).
[0372] hiCMs do tipo selvagem ou B2M-/-CIITA-/- CD47 tg transplantadas por via intramuscular em camundongos humanizados alogênicos confirmaram os dados de camundongo em um modelo de camundongo humanizado adicional. Os cardiomiócitos foram longitudinalmente seguidos por bioluminescência (BLI). Todos os enxertos de hiCM wt foram rejeitados ao longo do tempo (5 animais). Todos os cinco enxertos de hiCM B2M-/-CIITA-/- CD47 tg sobreviveram permanentemente (Figura 20). As células hiCM hipoimunes também sobreviveram após o transplante após infarto do miocárdio (Figura 21). EXEMPLO 9: GERAÇÃO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS DERIVADAS DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS DE CAMUNDONGO
[0373] São fornecidos no presente documento métodos para gerar células endoteliais (ECs) derivadas de iPSC humanas. Em uma modalidade exemplificativa, iPSCs murinas (tais como células HIP murinas) podem ser diferenciadas em uma monocamada in vitro de células endoteliais.
[0374] O protocolo inclui usar uma placa de formato de 6 poços ou uma placa de 10 cm. As células foram tripsinizadas com tripsina padrão. Entretanto, as células tripsinizadas não foram centrifugadas. Em vez do, as colônias tripsinizadas foram ressuspensas em meio a um volume maior que 3 vezes o volume de tripsina usado.
[0375] Antes da diferenciação (aproximadamente 12 dias), fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) foram descongelados - 1x106 MEF por poço (placa de 6 poços) em placas revestidas com gelatina com o uso de meio MEF. 1 frasco de iPSCs foi descongelado e transferido para três placas de 6 poços em MEFs. O meio ESC foi trocado a cada dia. As colônias foram divididas em MEF 1:3 a 1:6 em meio ESC (aproximadamente 8 dias após descongelamento). As colônias de NT-ESC foram observadas em MEFs antes da divisão (magnificação 100x). As colônias foram divididas de MEFs em gelatina 1:3 a 1:6 em meio
ESC (aproximadamente 4 dias após a divisão anterior; também denominado Dia 2).
[0376] No Dia 0 ao Dia 2, as células foram 70 a 85% confluentes para iniciar o protocolo de diferenciação. O meio de diferenciação de EC nº 1 incluiu RPMI e suplemento de B-27 menos insulina (Life Technologies) e CHIR-99021 5 µM (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA) por 2 dias. Cerca de 2,5 ml de meio por placa de 6 poços ou laca de 10 cm foram usados. Nenhum meio foi trocado entre o dia 0 a 2. As células foram deixadas na incubadora sem movimentação.
[0377] No Dia 2 ao Dia 4, a morfologia de cultura celular foi observada. O meio foi trocado por meio de diferenciação de EC nº 2 contendo RPMI e suplemento de B-27 menos insulina e incluindo CHIR-99021 2 µM. Tomou-se cuidado para evitar agitar as células.
[0378] No Dia 4 ao Dia 7, o meio de diferenciação de célula endotelial (EC) nº 3 que compreende meio RPMI menos insulina foi usado. As trocas de meio foram realizadas no dia 4 e no dia 6. Os agrupamentos de células não diferenciados permaneceram flutuando e as colônias de EC iniciais apareceram.
[0379] No Dia 7 ao Dia 17, as colônias de EC continuaram a proliferar até confluência na placa. O meio de diferenciação de célula endotelial (EC) nº 3 que compreende meio EC (Lonza, Benicia, Califórnia) suplementado com VEGF, FGF, inibidor ROCK, SB431542 e Y-27632. Durante a diferenciação de EC, o meio foi trocado aproximadamente em dias alternados (tal como no dia 7, dia 9, dia 11 e dia 13).
MATERIAIS E REAGENTES
[0380] Tripsina: Gibco, Número de Catálogo 12605-
010.
[0381] Revestimento de gelatina: EmbryoMax® 0,1% de Solução de Gelatina, Número de Catálogo ES-006-B. A superfície das placas foram revestidas com a solução, e as placas revestidas foram armazenadas a 37 °C até o uso.
[0382] Meio MEF: DMEM + glutamax + piruvato de sódio, com 4,5 g/l de glicose (Gibco), 15% de FBS, NEAA, e 1% de Penicilina/Estreptomicina (P/S).
[0383] Meio EC para Dia 0 a Dia 2: RPMI e suplemento de B-27 menos insulina (Life Technologies Número de catálogo: A1895601, CHIR-99021 5 µM (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA. Número de catálogo S2924) e 1% de P/S.
[0384] Meio EC para Dia 2 a Dia 4: RPMI e suplemento de B-27 menos insulina (Life Technologies Número de catálogo: A1895601, CHIR-99021 2 µM (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA. Número de catálogo S2924) e 1% de P/S.
[0385] Solução de estoque de CHIR (10 mM) foi diluída em meio até 5 µM (1:2.000) para o meio do Dia 0 ao Dia
2. Solução de estoque de CHIR foi diluída em meio até 2 µM (1:5.000) para o meio do Dia 2 ao Dia 4.
[0386] Meio EC para o Dia 4 ao Dia 7 (meio RPMI menos insulina): RPMI e suplemento de B-27 menos insulina com 50 ng/ml de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF; R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA), 10 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto básico (FGFb; R&D Systems), Y-27632 10 μM (inibidor ROCK) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA), e SB 431542 1 μM (Sigma-Aldrich) por 3 dias.
[0387] Meio EC para o Dia 7 ao Dia 14 (meio EC da Lonza): Meio EGM-2 SingleQuots (ou CC-3162 EGMTM-2 BulletKitTM, EBMTM-2 mais SingleQuotsTM da Growth Supplements, 500 ml), Y-27632 10 μM (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA),
SB 431542 1 μM (Sigma-Aldrich), 25 ng/ml de VEGF e 2 ng/ml de FGF.
[0388] As células CD31+ foram classificadas e selecionadas dentre ECs murinas derivadas de células-tronco pluripotentes. Os métodos de classificação baseados em microesfera esférica incluindo MACS foram realizados. Por exemplo, microesferas de CD31 (Miltenyi, número de catálogo 130-097-418) foram usadas para seleção positiva de células CD31+. Foram observadas células após o dia 12-dia 14 e antes da classificação MACS (ampliação de 100x). As colônias de EC foram 80% a 90% confluentes e agrupamentos de células não diferenciados estavam presentes. Células longas em formato de haste representaram as células diferenciadas do mesênquima.
[0389] Um protocolo ilustrativo para seleção por MACS de células CD31+ é conforme segue.
1. Lavaram-se as células 1x com PBS
2. Tripsina: 0,5 ml/poço; 5 min de incubação a 37 °C
3. Interrompeu-se a tripsinização com meio (meio dos dias 7 a 14), 1 ml/poço
4. Usou-se a pipeta de Eppendorf de 1.000 µl: poço ressuspenso para dissolver os agrupamentos
5. Usou-se o filtro de malha de 100 µm amarelo em tubo falcon de 50 ml para remover agrupamentos e células coletadas em tubo de 50 ml
6. Centrifugou-se tubo de 50 ml a 300 g, 5 min, 4 °C
7. Observou-se o pélete em tubo de 50 ml. Pélete grande = aproximadamente 90 células Mio
8. Calculou-se por 10 células Mio: 90 µl de tampão MACS + 10 µl de microesferas
9. Removeu-se o sobrenadante para obter um pélete celular seco
10. Ressuspendeu-se o pélete com o uso de uma pipeta de Eppendorf de 1.000 µl em tampão MACS
11. Adicionou-se com microesferas de pipeta de Eppendorf de 200 µl amarelas de 10. E ressuspender.
12. Submeteu-se a vórtice (muito curto)
13. Incubou-se a 4 °C (refrigerador) por 30 min
14. Lavou-se com 1 a 2 ml de tampão MACS por 10 células Mio adicionando-se o tampão no tubo de 50 ml
15. Centrifugou-se a 300 g, 5 min, a 4 °C
16. Colocou-se colunas MidiMACS em ímã. Adicionaram- se 3 ml de tampão MACS em coluna (como “preparação”). Sob coluna: tubo Falcon de 50 ml
17. Removeu-se o sobrenadante do pélete celular (pélete precisa ser seco)
18. Adicionaram-se 500 µl de tampão MACS em pélete (sempre usar 500 µl independente do tamanho do pélete)
19. Adicionaram-se os 500 µl (células+tampão MACS) em coluna e aguardar até passar pela coluna
20. Adicionaram-se 3 ml de tampão MACS puro em coluna e aguardou-se até terem passado pela coluna: realizou-se 3 vezes (etapa de lavagem)
21. Removeu-se a coluna do ímã e colocou-se em um tubo falcon de 15 ml
22. Adicionaram-se 5 ml de tampão MACS em coluna e usou-se “carimbo” ou “êmbolo”: Prensou-se os 5 ml no tubo falcon de 15 ml para eluir células CD31+
23. Centrifugaram-se as células a 300 g, 5 min, 4 °C
24. Peletizou-se (aproximadamente 5 a 10 Mio se for grande): colocou-se em placas de 6 poços 1x (revestida com gelatina)
25. Meio: Meio de diferenciação de EC para do dia 7 ao dia 14. Não se moveu a placa antes do dia 3 após MACS; não tirar as mesmas da incubadora antes disso.
26. Manteve-se o meio de diferenciação do dia 7 a 14 até o dia 5.
27. Trocou-se o meio no dia 5 após classificação por MACS para: meio Lonza EGM-2 SingleQuots (CC-3162 EGMTM-2 BulletKitTM, EBMTM-2 mais SingleQuotsTM da Growth Supplements, 500 ml) mais Y-27632 10 μM.
28. Trocou-se o meio em dias alternados. Manteve-se as células em placas revestidas com gelatina.
29. Quando necessário, as células foram divididas a 1:3 com tripsina.
30. Para caracterizar as ECs, imunocitoquímica, ensaios de LDL e/ou ensaios de formação de tubo foram realizados de acordo com os métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0390] A Figura 22 mostra colônias de NT-ESC em MEFs antes da divisão (ampliação de 100x). A Figura 23 mostra NT-ESCs em gelatina imediatamente antes do início da diferenciação (ampliação de 100x). A Figura 24 mostra células no dia 2 de diferenciação (ampliação de 100x) antes de o meio de diferenciação ter sido alterado de CHIR 5 µM a CHIR 2 µM. CHIR causa diferenciação mesodérmica. As células não mesodérmicas formaram agrupamentos e podem ser vistas flutuando. A Figura 25 mostra células no dia 4 de diferenciação de EC (ampliação de 100x) antes de o meio ter sido alterado. As colônias de EC aparecem abaixo dos agrupamentos de células não diferenciados flutuantes. A Figura 26 mostra células de EC no dia 7 de diferenciação (ampliação de 100x). As colônias de EC foram visíveis e se tornaram mais confluentes. Apenas alguns agrupamentos de células não diferenciados estavam visíveis. A Figura 27 mostra células após o dia 12-dia 14 e antes da classificação MACS (ampliação de 100x). EXEMPLO 10 – CÉLULAS HIP DIFERENCIADAS EM CÉLULAS ENDOTELIAIS MURINAS (MIECS)
[0391] iPSC e miPSC HIP foram diferenciadas em células endoteliais (miEC), mas apenas as miECs derivadas de célula HIP sobreviveram a longo prazo em um hospedeiro alogênico. HIP e miPSC foram colocadas em placas em gelatina em placas de 6 poços e mantidas em meio de iPSC de camundongo. Após as células terem atingido 60% de confluência, a diferenciação foi iniciada e o meio foi trocado por RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos Insulina (ambos da Gibco) e CHIR- 99021 5 μM (Selleckchem, Munique, Alemanha). No dia 2, o meio foi trocado por meio reduzido: RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos Insulina (ambos da Gibco) e CHIR-99021 2 μM (Selleckchem). Do dia 4 ao dia 7, as células foram expostas ao meio RPMI-1640 EC, RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos Insulina mais 50 ng/ml de fator de crescimento endotelial vascular de camundongo (mVEGF; R&D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto de camundongo básico (mFGFb; R&D Systems), Y-27632 10 μM (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) e SB 431542 1 μM (Sigma-Aldrich). Os agrupamentos de células endoteliais foram visíveis a partir do dia 7 e as células foram mantidas em meio EGM-2 SingleQuots (Lonza) mais 10% de FCS hi (Gibco), 25 ng/ml de mVEGF, 2 ng/ml de mFGFb, Y- 27632 10 μM (Sigma-Aldrich) e SB 431542 1 μM. O processo de diferenciação foi concluído após 21 dias e as células não diferenciadas se desprenderam durante o processo de diferenciação. Para purificação, as células passaram por purificação por MACS de acordo com o protocolo dos fabricantes com o uso de microesferas magnéticas revestidas com mAb anti- CD15 (Miltenyi, Auburn, CA) para seleção negativa.
[0392] A diferenciação de células endoteliais foi confirmada por rtPCR e imunofluorescência. As HIP e miECs altamente purificadas do fluxo passante foram cultivadas em meio EGM-2 SingleQuots mais suplementos e 10% de FCS hi. TrypLE foi usado para passar as células 1:3 a cada 3 a 4 dias. PCR foi realizada conforme descrito acima. Os seguintes iniciadores foram usados: Iniciador direto de VE-Caderina (SEQ ID NO:13): 5’-GGATGCAGAGGCTCACAGAG-3’, e o iniciador inverso (SEQ ID NO:14): 5’-CTGGCGGTTCACGTTGGACT-3’. As células de EC tanto das miPSCs quanto das células HIP mostraram um perfil de expressão genética diferenciado, incluindo expressão de VE- caderina, em que as células progenitoras não mostraram (Figura 28).
[0393] Seu fenótipo foi também confirmado por imunofluorescência (IF) para CD31 (ab28364, Abcam) e VE- Caderina (sc-6458, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Em resumo, as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS por 15 min. As membranas celulares foram permeabilizadas com solução de permeabilização (ASB-0102, Applied StemCell), seguida por solução de bloqueio (ASB-0103, Applied StemCell) e incubação com os anticorpos primários. Para visualização, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com AF488 ou AF555 (Invitrogen). Após manchamento de núcleos com DAPI, as imagens foram obtidas e analisadas com um microscópio confocal a laser Leica SP5 (Leica). As células EC tanto das miPSCs enquanto das células HIP mancharam positivamente para CD31 e VE-Caderina (dados não mostrados).
[0394] A formação de tubo também foi confirmada por um ensaio imunofluorescente. 2,5×105 miECs foram manchados com CFSE 5 µM e 0,1 μg/ml de Hoechst (ambos da Thermo Fisher) por 10 minutos à temperatura ambiente e colocados em placas em 10 mg/ml de Matrigel não diluído (356231, Corning, Corning, NY) em placas de 24 poços. Após 48 h, formações de tubo foram visualizadas por IF (dados não mostrados). EXEMPLO 6 – CÉLULAS ENDOTELIAIS DERIVADAS DE MHIP
SOBREVIVEM A TRANSPLANTE ALOGÊNICO
[0395] hipo-mECs alogênicas sobreviveram em um in vivo em um modelo de isquemia de membro posterior. Enxertos de mECs Fluc+ wt ou B2M-/-CIITA-/- CD47 tg foram transplantados em camundongos alogênicos após remoção do A. femoralis e foram longitudinalmente seguidos por BLI. Quinze animais foram usados por grupo.
[0396] Para imageamento por bioluminescência (BLI), sal de potássio de D-luciferina de vagalume (375 mg/kg; Biosynth AG, Staad, Suíça) foi dissolvido em PBS (pH 7m4) (Gibco, Invitrogen) e foi injetado por via intraperitoneal (250 μl por camundongo) em camundongos anestesiados. Os animais foram imageados com o uso do sistema IVIS 200 (Xenogen). A bioluminescência da região de interesse (ROI) foi quantificada em unidades de fótons máximos por segundo por centímetro quadrado por esterradiano (p/s/cm2/sr). O sinal máximo de uma ROI foi medido com o uso do software Living Image (MediaCybernetics). Os camundongos foram monitorados no dia 0, no dia 1 e em dias alternados até o dia 30 e a cada 10 dias em seguida.
[0397] Os valores de BLI de todos os animais foram plotados. Muitas mECs do tipo selvagem imunogênicas foram rejeitadas dentro de 15 dias mostrando sinais de BLI em declínio ao longo do tempo enquanto os enxertos de B2M-/-CIITA- /- CD47 tg sobreviveram todos (Figura 29). EXEMPLO 11 – CÉLULAS EC DERIVADAS DE CÉLULA MHIP
EVADIRAM AS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS IN VITRO
[0398] As células endoteliais derivadas de célula HIP não produziram respostas de IFN-ү ou exterminadora natural in vitro.
[0399] Ensaio Elispot. Para ensaios de ensaio de imunospot ligado a enzimas unidirecional (Elispot), esplenócitos de receptor foram isolados de baços 5 dias após a injeção celular e usados como células responsivas. As células doadoras foram tratadas com mitomicina (50 μg/ml por 30 min) e usadas como células estimuladoras. Cem mil células estimuladoras foram incubadas com 1×106 esplenócitos responsivos de receptor por 24 h e frequências de manchas de IFN-γ e IL-4 foram enumeradas com o uso de um leitor de placa de Elispot.
[0400] Anticorpos específicos para doador. Soros de camundongos receptores foram descomplementados por aquecimento a 56 °C por 30 min. Quantidades iguais de soros e suspensões de células (5×106/ml) foram incubadas por 45 min a 4 °C. As células foram identificadas com IgM anticamundongo de cabra conjugada a FITC (Sigma-Aldrich) e analisadas por citometria de fluxo (BD Bioscience).
[0401] Ensaios de Elispot de célula NK de Camundongo in vitro. Células NK foram isoladas de baços frescos de BALB/c 18 h após injeção de poli I:C (150 ng de Poli I:C em
200 μl de solução salina estéril, por via intraperitoneal (i.p.), Sigma-Aldrich). Após lise de células vermelhas, as células foram purificadas por classificação de microesfera magnética revestida com mAb anti-CD49b e foram usadas como células responsivas. Essa população de células foi > 99% de CD3- e células NK contidas (> 90%) e outras células, incluindo células mieloides (< 10%). Com o uso de princípio de Elispot, as células NK foram cocultivadas com miPSCs B2m-/-Ciita-/- ou B2m-/-Ciita-/- Cd47 tg na presença de IL-2 (1 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ) e sua liberação de IFN-γ foi medida. As células YAC-1 (Sigma-Aldrich) serviram como um controle positivo. Células estimuladoras tratadas com mitomicina (50 μg/ml por 30 min) foram incubadas com células NK (1:1) por 24 h e as frequências de mancha de IFN-γ foram enumeradas com o uso de um leitor de placa de Elispot.
[0402] Cinco dias após a injeção de miECs derivadas de miPSC wt em receptores C57BL/6 ou BALB/c, os esplenócitos foram recuperados para ensaios de Elispot de IFN- γ (box 25º a 75º percentil com mediana, whiskers min-máx, 6 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). A resposta de IFN-γ foi vastamente mais forte em todos os receptores alogênicos. A fluorescência média (MFI) de ligação de IgM a miECs derivadas de miPSC wt incubadas com soro de receptor após 5 dias (box 25º a 75º percentil com mediana, whiskers min-máx, 6 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). Houve resposta de IgM marcadamente mais forte em todos os recipientes alogênicos (Figura 30).
[0403] Similarmente, miECs derivadas de miPSC B2m-/-Ciita-/- Cd47 tg foram injetadas em receptores C57BL/6 ou BALB/c e Elispots de IFN-γ foram realizados após 5 dias (box
25º a 75º percentil com mediana, whiskers min-máx, 6 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). A fluorescência média (MFI) de ligação de IgM a miEC derivada de miPSC 1B2m-/-Ciita- /- Cd47 tg incubadas com soro de receptor após 5 dias (box 25º a 75º percentil com mediana, whiskers min-máx, 6 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). Não houve resposta de IFN-γ ou resposta de IgM mensurável em receptores alogênicos. Para avaliar o efeito inibitório de superexpressão de Cd47 sobre o extermínio por célula NK, Elispots de IFN-γ com células NK foram realizados com miECs derivadas de miPSC B2m-/-Ciita-/- ou miPSC B2m-/-Ciita-/- Cd47 tg ((box 25º a 75º percentil com mediana, whiskers min-máx, 6 experimentos independentes, ANOVA com teste posterior de Bonferroni), Apenas derivados de miPSC B2m-/-Ciita-/- foram suscetíveis a extermínio por célula NK (Figura 30). EXEMPLO 12 – MORFOLOGIA DE CÉLULA ENDOTELIAL
DERIVADA DE CÉLULA HIP
[0404] As células endoteliais derivadas de célula HIP mostraram a morfologia de EC típica. Enxertos de miEC B2m- /-Ciita-/- Cd47 tg em matrigel foram transplantados por via subcutânea em camundongos BALB/c alogênicos. Esses derivados hipoimunogênicos amadureceram adicionalmente in vivo ou mudaram sua morfologia ao longo do tempo em receptores alogênicos.
[0405] Oitocentas mil miECs B2m-/-Ciita-/- Cd47 tg em Matrigel diluído 1:1 (Corning) foram injetadas em camundongos BALB/c alogênicos. Tampões de Matrigel foram recuperados em múltiplos pontos no tempo até 56 dias e fixados em 4% de paraformaldeído em PBS com 1% de glutaraldeído por 24 h. As amostras foram desidratadas, embebidas em parafina e cortadas em seções de 5 µm de espessura. Para histopatologia, as seções foram manchadas com hematoxilina e eosina (Carl Roth), e as imagens tomadas com um microscópio de luz invertida. A origem das células foi demonstrada com manchamento de imunofluorescência. As seções foram reidratadas e sofreram recuperação de antígeno e bloqueio. As amostras foram incubadas com anticorpos contra luciferase (ab21176), VE-Caderina (SC- 6458) e um anticorpo secundário correspondente conjugado com AF488 ou AF555 (Invitrogen). Os núcleos celulares foram contramanchados com DAPI, e as imagens tomadas com um microscópio confocal a laser Leica SP5 (Leica, Wetzlar, Alemanha).
[0406] Para experimentos de comanchamento de miECs e células imunes, os anticorpos primários foram usados contra VE-Caderina (SC-6458, Sigma) e CD3 (ab16669, Abcam), seguidos pelo anticorpo secundário correspondente conjugado com AF488 ou AF555 (Invitrogen). Formação prematura de vaso foi observada. Dados não mostrados.
[0407] As miECs transplantadas começaram a se organizar em estruturas circulares por volta do dia 14 e formaram vasos primitivos que continham eritrócitos em torno da semana 3 (Dados não mostrados).
[0408] Doppler de perfusão (Periscan PIM II” (PERIMED Ltd., Itália) das células tomadas de animais do Exemplo 6 demonstrou nova formação e vaso e resgatou o membro no grupo de hipo-EC (Dados não mostrados). EXEMPLO 13 – CÉLULAS HIP HUMANAS DIFERENCIADAS EM
CÉLULAS ENDOTELIAIS
[0409] As células HIP humanas foram diferenciadas em células hiEC. hiPSC do tipo selvagem e células HIP humanas foram colocadas em placas em Matrigel diluído (356231, Corning) em placas de 6 poços e mantidas em meio Essential 8 Flex (Thermo Fisher). A diferenciação foi iniciada em 60% de confluência, e o meio foi trocado por RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos insulina (ambos da Gibco) e CHIR-99021 5 μM (Selleckchem). No dia 2, o meio foi trocado por meio reduzido: RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos insulina (Gibco) e CHIR- 99021 2 μM (Selleckchem). Do dia 4 ao dia 7, as células foram expostas ao meio RPMI-1640 EC, RPMI-1640 contendo 2% de B-27 menos insulina mais 50 ng/ml de fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF; R&D Systems), 10 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto humano básico FGFb; R&D Systems), Y-27632 10 μM (Sigma-Aldrich) e SB 431542 1 μM (Sigma-Aldrich). Os agrupamentos de células endoteliais foram visíveis a partir do dia 7 e as células foram mantidas em meio EGM-2 SingleQuots (Lonza) mais 10% de FCS hi (Gibco), 25 ng/ml de VEGF, 2 ng/ml de FGFb, Y-27632 10 μM (Sigma-Aldrich) e SB 431542 1 μM (Sigma- Aldrich). O processo de diferenciação foi concluído após 14 dias e as células não diferenciadas se desprenderam durante o processo de diferenciação. Para purificação, as células foram tratadas com PluriSln-1 20 μM (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) por 48 h. As ECs altamente purificadas foram cultivadas em meio EGM-2 SingleQuots (Lonza) mais suplementos e 10% de FCS hi (Gibco). TrypLE Express foi usado para passar as células 1:3 a cada 3 a 4 dias.
[0410] Manchamento com IF foi realizado conforme descrito acima para confirmar seu fenótipo. Os anticorpos primários foram usados contra CD31 (ab28364, Abcam) e VE- Caderina (sc-6458, Santa Cruz Biotechnology), seguidos pelo anticorpo secundário correspondente conjugado com AF488 ou
AF555 (Invitrogen). Os núcleos da célula foram manchados com DAPI. O imageamento foi realizado com o uso de um microscópio confocal a laser Leica SP5 (Leica). PCR para VE-Caderina (direto (SEQ ID NO:15): 5’-AAGATGCAGAGGCTCATG-3’, e o iniciador inverso (SEQ ID NO:16): 5’-CATGAGCCTCTGCATCTT-3’) foi realizada conforme descrito acima.
[0411] hiPSCs wt (a) e hiPSCs B2M-/-CIITA-/- CD47 tg (b) foram diferenciadas com sucesso em derivados de hiEC correspondentes. As células EC foram ambas de hiPSCs e as células HIP mostraram um perfil de expressão genética diferenciado, incluindo expressão de CDH5, onde as células progenitoras não mostraram. As miECs foram positivas para CD31 e VE-caderina por imunofluorescência confocal. Todos os derivados perderam sua expressão de genes de pluripotência (imagens representativas de dois experimentos independentes) (Figura 31 e dados não mostrados). EXEMPLO 14 – CÉLULAS HIEC SOBREVIVERAM EM
CAMUNDONGOS HUMANIZADOS
[0412] Células HIP humanas sobreviveram ao enxerto em camundongos com sistemas imunológicos humanizados. Os camundongos NSG-SGM3 humanizados (18 a 30 semanas) foram adquiridos junto ao Jackson Laboratories (número de catálogo SMG3-CD34, Sacramento, CA). Camundongos NSG-SGM3 enxertados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ humanas (HSE) desenvolveram células imunes humanas de múltiplas linhagens. Demonstraram um sistema imunológico funcional que exibe respostas imunológicas dependentes de célula T sem reatividade imunológica de célula doadora direcionada ao hospedeiro. Os animais foram atribuídos aleatoriamente aos grupos experimentais. A porcentagem de células CD3+ entre a população de células CD45+ humanas foi avaliada em cada animal e as porcentagens de CD3 nunca foram significativamente diferentes entre grupos do tipo selvagem e B2M-/-CIITA-/- CD47 tg. Todos os camundongos NSG-SGM3 humanizados eram do tipo HLA-A, e o número de erros de pareamento com o enxerto celular calculado. Em ensaios Elispot com grupos de hiEC, sempre houve 2 erros de pareamento.
[0413] Enxertos de hiEC do tipo selvagem ou B2M- /-CIITA-/- CD47 foram injetados em camundongos NSG-SGM3 humanizados alogênicos. Elispots de IFN-γ foram realizados após 5 dias (média ± s.d., 3 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). A frequência de mancha de fundo em camundongos virgens é mostrada (média ± s.d., 4 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). l, MFI de ligação de IgM a hiEC incubada com soro de receptor após 5 dias (média ± s.d., 3 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). A fluorescência de fundo em camundongos virgens é mostrada (média ± desvio padrão, 3 animais por grupo, teste t de Student bicaudal). Elispots de IFN-γ com células NK humanas foram realizados com hiECs B2M-/-CIITA-/- hiECs ou B2M-/-CIITA-/- CD47 tg (box 25º a 75º percentil com mediana, whiskers min- máx, 6 experimentos independentes, ANOVA com teste posterior de Bonferroni). (Figura 32)
[0414] Todas as publicações e documentos de patente revelados ou mencionados no presente documento estão incorporadas a título de referência, em sua totalidade. A descrição anterior foi apresentada apenas para propósitos ilustrativos e descritivos. Esta descrição não se destina a limitar a invenção à forma exata revelada.
[0415] Entende-se que o escopo da invenção é definido pelas reivindicações anexas ao mesmo.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS INFORMAL SEQ ID NO:1 – Proteína ß-2-Microglobulina humana
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFH PSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKI
VKWDRDI SEQ ID NO:2 – Proteína CIITA humana, terminação N de 160 aminoácidos
MRCLAPRPAGSYLSEPQGSSQCATMELGPLEGGYLELLNSDADPLCLYHFY DQMDLAGEEEIELYSEPDTDTINCDQFSRLLCDMEGDEETREAYANIAELDQYVFQDSQLE
GLSKDIFKHIGPDEVIGESMEMPAEVGQKSQKRPFPEELPADLKHWKP SEQ ID NO:3 – Proteína CD47 humana
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNT TEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNY TCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMD EKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGL
TSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE SEQ ID NO:4 – Proteína Quinase Timidina do Vírus Herpes Simplex (HSV-tk)
MASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLR VYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEI SAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHVGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYP AARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAA IRRVYGLLANTVRYLQGGGSWWEDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAP ELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPG
SIPTICDLARTFAREMGEAN SEQ ID NO:5 – Proteína Citosina Desaminase (CD) de Escherichia coli
MSNNALQTIINARLPGEEGLWQIHLQDGKISAIDAQSGVMPITENSLDAEQ GLVIPPFVEPHIHLDTTQTAGQPNWNQSGTLFEGIERWAERKALLTHDDVKQRAWQTLKWQ IANGIQHVRTHVDVSDATLTALKAMLEVKQEVAPWIDLQIVAFPQEGILSYPNGEALLEEA LRLGADVVGAIPHFEFTREYGVESLHKTFALAQKYDRLIDVHCDEIDDEQSRFVETVAALA HHEGMGARVTASHTTAMHSYNGAYTSRLFRLLKMSGINFVANPLVNIHLQGRFDTYPKRRG ITRVKEMLESGINVCFGHDDVFDPWYPLGTANMLQVLHMGLHVCQLMGYGQINDGLNLITH HSARTLNLQDYGIAAGNSANLIILPAENGFDALRRQVPVRYSVRGGKVIASTQPAQTTVYL
EQPEAIDYKR SEQ ID NO:6 – Proteína Caspase 9 humana truncada
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNI DCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQF PGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDES PGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLD DIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS

Claims (164)

REIVINDICAÇÕES
1. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA diferenciada de uma célula-tronco pluripotente induzida hipoimune (célula HIP), caracterizada pela atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e pela atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena terem sido eliminadas e pela expressão de CD47 ter sido aumentada.
2. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC humana, o gene B2M ser gene B2M humano, o gene CIITA ser gene B2M humano e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 humano sob o controle de um promotor.
3. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC de camundongo, o gene B2M ser gene B2M de camundongo, o gene CIITA ser gene B2M de camundongo e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 de camundongo sob o controle de um promotor.
4. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela eliminação da atividade de gene B2M resultar de uma reação de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene B2M.
5. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela eliminação da atividade de gene CIITA resultar de uma reação de CRISPR/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene CIITA.
6. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender adicionalmente um gene suicida que é ativado por um agente de gatilho que induz a célula HIP a morrer.
7. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV- tk) e pelo agente de gatilho ser ganciclovir.
8. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4.
9. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
10. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli e pelo agente de gatilho ser 5-fluorocitosina (5-FC).
11. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
12. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.
13. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível e o agente de gatilho ser um indutor químico de dimerização (CID).
14. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6.
15. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.
16. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo CID ser o composto AP1903.
17. CÉLULA CARDÍACA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pela célula cardíaca hipoimune isolada ser selecionada a partir do grupo que consiste em um cardiomiócito, cardiomiócito nodal, cardiomiócito condutor, cardiomiócito de trabalho, precursor de cardiomiócito, célula progenitora de cardiomiócito, célula-tronco cardíaca e célula muscular cardíaca.
18. MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA AFECÇÃO OU DOENÇA CARDÍACA, sendo que o método é caracterizado por compreender administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população das células cardíacas hipoimunes isoladas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela composição compreender adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pela administração compreender a implantação no tecido cardíaco do paciente, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intracoronária, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intramiocardial, injeção trans-endocardial, injeção trans- epicardial ou infusão.
21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pela afecção ou doença cardíaca ser selecionada a partir do grupo que consiste em cardiomiopatia pediátrica, cardiomiopatia relacionada à idade, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia isquêmica crônica, cardiomiopatia periparto, cardiomiopatia inflamatória, outra cardiomiopatia, miocardite, lesão por reperfusão isquêmica do miocárdio, disfunção ventricular, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, doença da artéria coronária, doença cardíaca de estágio final, aterosclerose, isquemia, hipertensão, reestenose, angina pectoris, coração reumático, inflamação arterial ou doença cardiovascular.
22. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS CARDÍACAS HIPOIMUNES a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) cultivar uma população de células HIP em um meio de cultura que compreende um inibidor de GSK; (b) cultivar a população de células HIP em um meio de cultura que compreende um antagonista de WNT para produzir uma população de células pré-cardíacas; e (c) cultivar a população de células pré-cardíacas em um meio de cultura que compreende insulina para produzir uma população de células cardíacas.
23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo inibidor de GSK ser CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo inibidor de GSK estar a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM.
25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo antagonista de WNT ser IWR1, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo antagonista de WNT estar a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM.
27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células pré-cardíacas da etapa (c) em um meio de cultura sem glicose.
28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células pré-cardíacas da etapa (c) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células cardíacas da etapa (d) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 29, caracterizado por compreender adicionalmente isolar a população de células cardíacas hipoimunes de células não cardíacas.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por compreender adicionalmente crioconservar a população isolada de células cardíacas hipoimunes.
32. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA diferenciada de uma célula-tronco pluripotente hipoimune (célula HIP) caracterizada pela atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e pela atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena terem sido eliminadas e pela expressão de CD47 ter sido aumentada.
33. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC humana, o gene B2M ser gene B2M humano, o gene CIITA ser gene B2M humano e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 humano sob o controle de um promotor.
34. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pela célula C iPS HIP ser uma iPSC de camundongo, o gene B2M ser gene B2M de camundongo, o gene CIITA ser gene B2M de camundongo e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 de camundongo sob o controle de um promotor.
35. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizada pela eliminação da atividade de gene B2M resultar de uma reação de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene B2M.
36. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizada pela eliminação da atividade de gene CIITA resultar de uma reação de CRISPR/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene CIITA.
37. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizada por compreender adicionalmente um gene suicida que é ativado por um agente de gatilho que induz a célula HIP a morrer.
38. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV- tk) e pelo agente de gatilho ser ganciclovir.
39. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4.
40. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
41. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli e pelo agente de gatilho ser 5-fluorocitosina (5-FC).
42. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
43. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.
44. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível e o agente de gatilho ser um indutor químico de dimerização (CID).
45. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6.
46. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.
47. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizada pelo CID ser o composto AP1903.
48. CÉLULA ENDOTELIAL HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, em que a célula endotelial hipoimune isolada é caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula endotelial capilar, célula endotelial vascular, célula endotelial aórtica, célula endotelial cerebral e célula endotelial renal.
49. MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA AFECÇÃO OU DOENÇA VASCULAR, sendo que o método é caracterizado por compreender administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células endoteliais hipoimunes isoladas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 48.
50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pela composição compreender adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz.
51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pela administração compreender a implantação no tecido do paciente, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intracoronária, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intramiocardial, injeção trans-endocardial, injeção trans- epicardial ou infusão.
52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pela afecção ou doença vascular ser selecionada a partir do grupo que consiste em lesão vascular, doença cardiovascular, doença vascular, doença isquêmica, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão, lesão de tecido isquêmico, isquemia dos membros, acidente vascular cerebral, neuropatia e doença cerebrovascular.
53. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS HIPOIMUNES a partir de uma população de células-tronco pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) cultivar uma população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende um inibidor de GSK; (b) cultivar a população de células HIP em um segundo meio de cultura que compreende VEGF e bFGF para produzir uma população de células pré-endoteliais; e (c) cultivar a população de células pré-endoteliais em um terceiro meio de cultura que compreende um inibidor de ROCK e um inibidor de ALK para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes.
54. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo inibidor de GSK ser CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizado pelo inibidor de GSK estar a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM.
56. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, caracterizado pelo inibidor de ROCK ser Y-27632, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
57. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado pelo inibidor de ROCK estar a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 20 µM.
58. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, caracterizado pelo inibidor de ALK ser SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
59. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado pelo inibidor de ALK estar a uma concentração na faixa de cerca de 0,5 µM a cerca de 10 µM.
60. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 59, caracterizado pelo primeiro meio de cultura compreender de 2 µM a cerca de 10 µM de CHIR-99021.
61. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 60, caracterizado pelo segundo meio de cultura compreender 50 ng/ml de VEGF e 10 ng/ml de bFGF.
62. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo segundo meio de cultura compreender adicionalmente Y-27632 e SB-431542.
63. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo terceiro meio de cultura compreender 10 µM de Y-27632 e 1 µM de SB-431542.
64. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo terceiro meio de cultura compreender adicionalmente VEGF e bFGF.
65. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 64, caracterizado pelo primeiro meio de cultura e/ou pelo segundo meio não terem insulina.
66. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 65, caracterizado pelo segundo meio de cultura compreender adicionalmente um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
67. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 66, caracterizado pelo terceiro meio de cultura compreender adicionalmente um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
68. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 67, caracterizado por compreender adicionalmente isolar a população de células endoteliais hipoimunes de células não endoteliais.
69. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado por compreender adicionalmente crioconservar a população isolada de células endoteliais hipoimunes.
70. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO diferenciado de uma célula-tronco pluripotente hipoimune (célula HIP) caracterizado pela atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e pela atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena terem sido eliminadas e pela expressão de CD47 ter sido aumentada.
71. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela célula HIP ser uma iPSC humana, o gene B2M ser gene B2M humano, o gene CIITA ser gene B2M humano e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 humano sob o controle de um promotor.
72. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela célula HIP ser uma iPSC de camundongo, o gene B2M ser gene B2M de camundongo, o gene CIITA ser gene B2M de camundongo e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 de camundongo sob o controle de um promotor.
73. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 72, caracterizado pela eliminação da atividade de gene B2M resultar de uma reação de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene B2M.
74. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 73, caracterizado pela eliminação da atividade de gene CIITA resultar de uma reação de CRISPR/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene CIITA.
75. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 74, caracterizado por compreender adicionalmente um gene suicida que é ativado por um agente de gatilho que induz a célula HIP a morrer.
76. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo gene suicida ser um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk) e pelo agente de gatilho ser ganciclovir.
77. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo gene HSV- tk codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4.
78. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo gene HSV- tk codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
79. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo gene suicida ser um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli e pelo agente de gatilho ser 5-fluorocitosina (5-FC).
80. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo gene CD codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
81. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo gene CD codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.
82. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível e o agente de gatilho ser um indutor químico de dimerização (CID).
83. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pela proteína caspase 9 induzível compreender pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6.
84. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pela proteína caspase 9 induzível compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.
85. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, caracterizado pelo CID ser o composto AP1903.
86. NEURÔNIO DOPAMINÉRGICO HIPOIMUNE ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 85, em que o neurônio dopaminérgico hipoimune isolado é caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma célula- tronco neuronal, célula progenitora neuronal, neurônio dopaminérgico imaturo e neurônio dopaminérgico maduro.
87. MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA DOENÇA OU AFECÇÃO NEURODEGENERATIVA, sendo que o método é caracterizado por compreender administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população dos neurônios dopaminérgicos hipoimunes isolados, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 70 a 86.
88. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pela composição compreender adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz.
89. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizado pela população dos neurônios dopaminérgicos hipoimunes isolados estar em um arcabouço biodegradável.
90. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, caracterizado pela administração compreender transplante ou injeção.
91. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 90, caracterizado pela doença ou afecção neurodegenerativa ser selecionada a partir do grupo que consiste em doença Parkinson, doença de Huntington e esclerose múltipla.
92. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS HIPOIMUNES a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) cultivar a população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende um ou mais fatores selecionados a partir do grupo que consiste em sonic hedgehog (SHH), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblasto 8 (FGF8), WNT1, ácido retinoico, um inibidor de GSK3β, um inibidor de ALK e um inibidor de ROCK para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos imaturos; e (b) cultivar a população de neurônios dopaminérgicos imaturos em um segundo meio de cultura que é diferente do primeiro meio de cultura para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes.
93. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo inibidor de GSK3β ser CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
94. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizado pelo inibidor de GSK3β estar a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM.
95. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 94, caracterizado pelo inibidor de ALK ser SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
96. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 95, caracterizado pelo inibidor de ALK estar a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM.
97. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 96, caracterizado pelo primeiro meio de cultura e/ou pelo segundo meio de cultura não terem soro animal.
98. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 95, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de neurônios dopaminérgicos imaturos da etapa (a) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
99. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 98, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de neurônios dopaminérgicos da etapa (b) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
100. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 99, caracterizado por compreender isolar a população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes de neurônios não dopaminérgicos.
101. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado por compreender adicionalmente crioconservar a população isolada de neurônios dopaminérgicos hipoimunes.
102. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA diferenciada de uma célula-tronco pluripotente induzida hipoimune (célula HIP) caracterizada pela atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e pela atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena terem sido eliminadas e pela expressão de CD47 ter sido aumentada.
103. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 102, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC humana, o gene B2M ser gene B2M humano, o gene CIITA ser gene B2M humano e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 humano sob o controle de um promotor.
104. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 102, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC de camundongo, o gene B2M ser gene B2M de camundongo, o gene CIITA ser gene B2M de camundongo e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 de camundongo sob o controle de um promotor.
105. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 104, caracterizada pela eliminação da atividade de gene B2M resultar de uma reação de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene B2M.
106. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 105, caracterizada pela eliminação da atividade de gene CIITA resultar de uma reação de CRISPR/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene CIITA.
107. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE
ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 106, caracterizada por compreender adicionalmente um gene suicida que é ativado por um agente de gatilho que induz a célula HIP a morrer.
108. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 107, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk) e pelo agente de gatilho ser ganciclovir.
109. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 108, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4.
110. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 108, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
111. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 107, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli e pelo agente de gatilho ser 5-fluorocitosina (5-FC).
112. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 111, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
113. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 111, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.
114. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE
ISOLADA, de acordo com a reivindicação 107, caracterizada pelo gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível e o agente de gatilho ser um indutor químico de dimerização (CID).
115. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 114, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6.
116. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 114, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.
117. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 116, caracterizada pelo CID ser o composto AP1903.
118. CÉLULA DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 114 a 117, em que a célula de ilhota pancreática hipoimune isolada é caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula progenitora de ilhota pancreática, célula de ilhota pancreática imatura e célula de ilhota pancreática madura.
119. MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE DIABETES, sendo que o método é caracterizado por compreender administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população das células de ilhota pancreática hipoimunes isoladas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 102 a 118.
120. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pela composição compreender adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz.
121. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 119 ou 120, caracterizado pela população das células de ilhota pancreática hipoimunes isoladas estar em um arcabouço biodegradável.
122. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 121, caracterizado pela administração compreender transplante ou injeção.
123. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS DE ILHOTA PANCREÁTICA HIPOIMUNES a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunogênicas (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas iPSCs hipoimunogênicas, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) cultivar a população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende um ou mais fatores selecionados a partir do grupo que consiste em fator de crescimento do tipo insulina (IGF), fator de crescimento de transformação (TGF), fator de crescimento de fibroblasto (EGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), sonic hedgehog (SHH) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), superfamília de fator de crescimento de transformação β (TGFβ), proteína morfogênica óssea 2 (BMP2), proteína morfogênica óssea 7 (BMP7), um inibidor de GSK3β, um inibidor de ALK, um inibidor de receptor de BMP tipo 1 e ácido retinoico para produzir uma população de células de ilhota pancreática imaturas; e (b) cultivar a população de células de ilhota pancreática imaturas em um segundo meio de cultura que é diferente do primeiro meio de cultura para produzir uma população de células de ilhota pancreática.
124. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo inibidor de GSK3β ser CHIR-99021, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
125. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 123 ou 124, caracterizado pelo inibidor de GSK3β estar a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM.
126. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 125, caracterizado pelo inibidor de ALK ser SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
127. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 126, caracterizado pelo inibidor de ALK estar a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM.
128. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 127, caracterizado pelo primeiro meio de cultura e/ou pelo segundo meio de cultura não terem soro animal.
129. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 128, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células de ilhota pancreática imaturas da etapa (a) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
130. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 129, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células de ilhota pancreática da etapa (b) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
131. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 130, caracterizado por compreender adicionalmente isolar a população de células de ilhota pancreática de células de não ilhota pancreática.
132. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado por compreender adicionalmente crioconservar a população isolada de células de ilhota pancreática hipoimunes.
133. CÉLULA DE EPITÉLIO PIGMENTADO DA RETINA (RPE) HIPOIMUNE ISOLADA diferenciada de uma célula-tronco pluripotente induzida hipoimune (célula HIP) caracterizada pela atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e pela atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena terem sido eliminadas e pela expressão de CD47 ter sido aumentada.
134. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 133, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC humana, o gene B2M ser gene B2M humano, o gene CIITA ser gene B2M humano e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 humano sob o controle de um promotor.
135. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 133, caracterizada pela célula HIP ser uma iPSC de camundongo, o gene B2M ser gene B2M de camundongo, o gene CIITA ser gene B2M de camundongo e a expressão de CD47 aumentada resultar da introdução na iPSC de pelo menos uma cópia de um gene CD47 de camundongo sob o controle de um promotor.
136. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 135, caracterizada pela eliminação da atividade de gene B2M resultar de uma reação de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene B2M.
137. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 136, caracterizada pela eliminação da atividade de gene CIITA resultar de uma reação de CRISPR/Cas9 que rompe ambos os alelos do gene CIITA.
138. CÉLULA DE RPE GENETICAMENTE MODIFICADA ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 137, caracterizada por compreender adicionalmente um gene suicida que é ativado por um agente de gatilho que induz a célula HIP a morrer.
139. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 138, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk)
e pelo agente de gatilho ser ganciclovir.
140. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 139, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4.
141. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 139, caracterizada pelo gene HSV-tk codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
142. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 138, caracterizada pelo gene suicida ser um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli e pelo agente de gatilho ser 5-fluorocitosina (5-FC).
143. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 142, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
144. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 142, caracterizada pelo gene CD codificar uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.
145. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 138, caracterizada pelo gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível e o agente de gatilho ser um indutor químico de dimerização (CID).
146. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 145, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6.
147. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 145, caracterizada pela proteína caspase 9 induzível compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.
148. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 145 a 147, caracterizada pelo CID ser o composto AP1903.
149. CÉLULA DE RPE HIPOIMUNE ISOLADA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 145 a 148, em que a célula de RPE hipoimune isolada é caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula progenitora de RPE, célula de RPE imatura, célula de RPE madura e célula de RPE funcional.
150. MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE UMA AFECÇÃO OCULAR, sendo que o método é caracterizado por compreender administrar uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população das células de RPE hipoimunes isoladas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 133 a 149.
151. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pela composição compreender adicionalmente um carreador terapeuticamente eficaz.
152. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 150 ou 151, caracterizado pela população das células de RPE hipoimunes isoladas estar em um arcabouço biodegradável.
153. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 150 a 152, caracterizado pela administração compreender transplante ou injeção à retina do paciente.
154. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 150 a 153, caracterizado pela afecção ocular ser selecionada a partir do grupo que consiste em degeneração macular úmida, degeneração macular seca, degeneração macular juvenil, Amaurose Congênita de Leber, retinite pigmentosa e deslocamento da retina.
155. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS DE EPITÉLIO PIGMENTADO DA RETINA (RPE) HIPOIMUNES a partir de uma população de células pluripotentes hipoimunes (células HIP) por diferenciação in vitro, em que a atividade de gene de β-2 microglobulina (B2M) endógena e a atividade de gene de transativador de classe II (CIITA) exógena foram eliminadas e a expressão de CD47 foi aumentada nas células HIP, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) cultivar a população de células HIP em um primeiro meio de cultura que compreende qualquer um dos fatores selecionados a partir do grupo que consiste em activina A, bFGF, BMP4/7, DKK1, IGF1, noggin, um inibidor de BMP, um inibidor de ALK, um inibidor de ROCK e um inibidor de VEGFR para produzir uma população de células pré-RPE; e (b) cultivar a população de células pré-RPE em um segundo meio de cultura que é diferente do primeiro meio de cultura para produzir uma população de células de RPE hipoimunes.
156. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo inibidor de ALK ser SB-431542, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
157. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 155 ou 156, caracterizado pelo inibidor de ALK estar a uma concentração na faixa de cerca de 2 µM a cerca de 10 µM.
158. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 155 a 157, caracterizado pelo inibidor de ROCK ser Y‐27632, um derivado do mesmo ou uma variante do mesmo.
159. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 155 a 158, caracterizado pelo inibidor de ROCK estar a uma concentração na faixa de cerca de 1 µM a cerca de 10 µM.
160. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 155 a 159, caracterizado pelo primeiro meio de cultura e/ou pelo segundo meio de cultura não terem soro animal.
161. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 155 a 160, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células pré-RPE da etapa (a) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
162. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 155 a 161, caracterizado por compreender adicionalmente cultivar a população de células de RPE da etapa (b) em um meio de cultura que compreende um agente de gatilho se as células HIP compreenderem um gene suicida, em que o agente de gatilho é ganciclovir se o gene suicida for um gene de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-tk), o agente de gatilho é 5-fluorocitosina (5-FC) se o gene suicida for um gene de citosina desaminase (CD) de
Escherichia coli, ou o agente de gatilho é um indutor químico de dimerização (CID) se o gene suicida codificar uma proteína caspase 9 induzível.
163. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 155 a 162, caracterizado por compreender adicionalmente isolar a população de células de RPE hipoimunes de células de não RPE.
164. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado por compreender adicionalmente crioconservar a população isolada de células de RPE hipoimunes.
BR112021000637-0A 2018-07-17 2019-07-17 Célula cardíaca hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca, método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes, célula endotelial hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular, método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes, neurônio dopaminérgico hipoimune isolado, método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa, método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes, célula de ilhota pancreática hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de diabetes, método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes, célula de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular, e método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimunes BR112021000637A2 (pt)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862698984P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698965P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698978P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698981P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698973P 2018-07-17 2018-07-17
US62/698,981 2018-07-17
US62/698,978 2018-07-17
US62/698,973 2018-07-17
US62/698,965 2018-07-17
US62/698,984 2018-07-17
PCT/US2019/042117 WO2020018615A2 (en) 2018-07-17 2019-07-17 Cells differentiated from immunoengineered pluripotent cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021000637A2 true BR112021000637A2 (pt) 2021-04-13

Family

ID=69165113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021000637-0A BR112021000637A2 (pt) 2018-07-17 2019-07-17 Célula cardíaca hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca, método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes, célula endotelial hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular, método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes, neurônio dopaminérgico hipoimune isolado, método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa, método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes, célula de ilhota pancreática hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de diabetes, método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes, célula de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular, e método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimunes

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210292715A1 (pt)
EP (1) EP3824074A4 (pt)
JP (2) JP2021530232A (pt)
KR (1) KR20210032454A (pt)
CN (1) CN112639079A (pt)
AU (1) AU2019305585A1 (pt)
BR (1) BR112021000637A2 (pt)
CA (1) CA3109078A1 (pt)
IL (1) IL279871A (pt)
MX (1) MX2021000614A (pt)
SG (1) SG11202100157YA (pt)
WO (1) WO2020018615A2 (pt)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
GB2584664B (en) * 2019-06-10 2023-05-24 Newcells Biotech Ltd Improved retinal organoids and methods of making the same
WO2021041316A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Sana Biotechnology, Inc. Cd24 expressing cells and uses thereof
WO2021146471A2 (en) * 2020-01-15 2021-07-22 The Regents Of The University Of California Transplanted cell protection via inhibition of polymorphonuclear cells
JP2023520997A (ja) 2020-03-25 2023-05-23 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 神経学的障害及び神経学的病態の処置のための低免疫原性神経細胞
CA3176644A1 (en) * 2020-04-27 2021-11-04 Sonja SCHREPFER Repeat dosing of hypoimmunogenic cells
WO2021231712A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Rxcell Inc. Hypoimmunogenic cells and uses thereof in immune responses
CA3188664A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Sonja SCHREPFER Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions
EP4251741A1 (en) 2020-11-30 2023-10-04 CRISPR Therapeutics AG Gene-edited natural killer cells
US11965022B2 (en) 2020-12-31 2024-04-23 Sana Biotechnology, Inc. Methods and compositions for modulating CAR-T activity
AU2022230995A1 (en) 2021-03-03 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Immunosuppressive therapies for use with cardiomyocyte cell therapies, and associated methods and compositions
KR20240013135A (ko) 2021-05-27 2024-01-30 사나 바이오테크놀로지, 인크. 조작된 hla-e 또는 hla-g를 포함하는 저면역원성 세포
IL310089A (en) 2021-07-14 2024-03-01 Sana Biotechnology Inc Differential expression of Y-linked antigens in hypoimmunogenic cells
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
EP4384598A1 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
WO2023019203A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Inducible systems for altering gene expression in hypoimmunogenic cells
IL310691A (en) 2021-08-11 2024-04-01 Sana Biotechnology Inc Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
EP4384193A2 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
AU2022343749A1 (en) * 2021-09-13 2024-03-28 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of committed cardiac progenitor cells
WO2023047433A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 The University Of Jordan Dental pluripotent stem cells
CN115873797A (zh) * 2021-09-29 2023-03-31 北京干细胞与再生医学研究院 一种视网膜色素上皮细胞的扩增培养基及培养方法
WO2023069480A1 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 Vascugen, Inc. Hypoimmune vasculogenic cells
WO2023122337A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
WO2023133568A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmune beta cells differentiated from pluripotent stem cells and related uses and methods
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023173123A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
WO2023196980A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Fate Therapeutics, Inc. Stealth strategy engaging immune recognition pathways for use in allogeneic cell therapies
CN114958768B (zh) * 2022-06-02 2023-03-24 健颐生物科技发展(山东)有限公司 Fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法
WO2024003349A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Novo Nordisk A/S Enhancing neuronal differentiation of ventral midbrain neural progenitor cells
WO2024030959A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Methods for differentiating cardiomyocytes
WO2024050349A2 (en) * 2022-08-30 2024-03-07 Emendobio Inc. Strategies for knock-ins at b2m safe harbor sites
WO2024092015A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Adhesion molecule inhibition for stem cell therapies

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4134095A1 (en) * 2009-09-15 2023-02-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
WO2014078414A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Joseph Wu Chemically defined production of cardiomyocytes from pluripotent stem cells
CN105358680B (zh) * 2013-04-03 2019-06-25 富士费勒姆细胞动力学有限公司 用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物
US20160230143A1 (en) * 2013-09-19 2016-08-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
CN107921148A (zh) * 2015-05-08 2018-04-17 哈佛学院校长同事会 通用供体干细胞和相关方法
ES2895676T3 (es) * 2015-09-01 2022-02-22 Ncardia B V Un método in vitro para diferenciar una población de células madre pluripotentes humanas en una población de células cardiomiocitas
PT3371314T (pt) * 2015-11-04 2023-08-31 Fate Therapeutics Inc Modificação genómica de células pluripotentes
CN108048484B (zh) * 2017-11-14 2021-07-06 海南一龄医疗产业发展有限公司 诱导性多能干细胞及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112639079A (zh) 2021-04-09
AU2019305585A1 (en) 2021-01-28
IL279871A (en) 2021-03-01
SG11202100157YA (en) 2021-02-25
JP2024050597A (ja) 2024-04-10
US20210292715A1 (en) 2021-09-23
WO2020018615A3 (en) 2020-02-27
CA3109078A1 (en) 2020-01-23
WO2020018615A2 (en) 2020-01-23
JP2021530232A (ja) 2021-11-11
MX2021000614A (es) 2021-07-02
EP3824074A4 (en) 2022-04-20
KR20210032454A (ko) 2021-03-24
EP3824074A2 (en) 2021-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112021000637A2 (pt) Célula cardíaca hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença cardíaca, método para produzir uma população de células cardíacas hipoimunes, célula endotelial hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ou doença vascular, método para produzir uma população de células endoteliais hipoimunes, neurônio dopaminérgico hipoimune isolado, método para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção neurodegenerativa, método para produzir uma população de neurônios dopaminérgicos hipoimunes, célula de ilhota pancreática hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de diabetes, método para produzir uma população de células de ilhota pancreática hipoimunes, célula de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimune isolada, método para tratar um paciente que sofre de uma afecção ocular, e método para produzir uma população de células de epitélio pigmentado da retina (rpe) hipoimunes
JP6893527B2 (ja) ＳＣ−β細胞及び組成物並びにその生成方法
JP6041270B2 (ja) 角膜内皮細胞の製造方法
Gilpin et al. Enhanced lung epithelial specification of human induced pluripotent stem cells on decellularized lung matrix
JP6388831B2 (ja) 単離ヒト肺前駆細胞およびその使用
US20190032018A1 (en) Reprogramming cardiomyocytes with one transcription factor
US20120009158A1 (en) VENTRICULAR INDUCED PLURIPOTENT STEM (ViPS) CELLS FOR GENERATION OF AUTOLOGOUS VENTRICULAR CARDIOMYOCYTES AND USES THEREOF
US20220090020A1 (en) Differentiation of pancreatic endocrine cells
US20200231933A1 (en) Human pluripotent stem cell derived endocardial endothelium
CN113226387A (zh) 可生物降解的组织置换植入物及其用途
WO2019107535A1 (ja) 多能性幹細胞からの立体臓器の構築
US20230042917A1 (en) Direct reprogramming of somatic cells into myogenic cells
WO2022110494A1 (zh) 用于重编程细胞的方法
WO2006017567A2 (en) Customizing stem cell-derived cardiomyocytes for transplantation
WO2022235610A9 (en) Electrophysiological modification to suppress arrhythmias
US20230030814A1 (en) Freeze-Dried Preparations Comprising Megakaryocytes and Platelets
CN116323677A (zh) 视网膜色素上皮和光感受器双层及其用途
WO2019093047A1 (ja) インビトロでの機能的な外分泌腺の製造方法、および、当該方法によって製造される外分泌腺
TW202340454A (zh) 將誘導性多能幹細胞分化為視網膜色素上皮細胞之方法、視網膜色素上皮細胞以及使用該視網膜色素上皮細胞之方法
WO2020190939A1 (en) Methods of promoting cellular maturation with ampk activators
JP2024520424A (ja) 黄斑、中心および末梢網膜色素上皮細胞を生成する方法
JP2024520423A (ja) 弱接着細胞を収容するための二次マトリックスを有する生分解性組織スキャフォールド
Guddati Derivation of cardiomyocytes from embryonic stem cells and development of techniques to study cardiac lineage
Shojaie Extracellular Matrix-Mediated Lung Epithelial Cell Differentiation
Croze Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: Methods, Lines, and Behaviors