CN117384857A - 一种pf4基因修饰的间充质干细胞外泌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体及其应用，所述PF4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。本发明对PF4的基因序列进行优化，优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体的浓度明显提高；优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体可以明显降低LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症因子的释放量，具有抗炎作用；优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体可以改善老龄化小鼠的行为和认知能力，在制备治疗神经退行性疾病的药物中具有良好的应用前景。

Description

一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体及其应用

技术领域

本发明涉及一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体及其应用，属于遗传工程技术领域。

背景技术

大脑健康是最大的生物医学挑战之一，认知是大脑健康的重要表现，其在正常衰老、许多神经退行性疾病、神经系统疾病和精神疾病、儿童发育综合征、创伤性脑损伤和压力中受损或中断。神经退行性疾病是一种神经元结构或功能的逐渐丧失，最终导致细胞萎缩和死亡的疾病。神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、多系统萎缩症和朊病毒疾病等。

最近的研究表明，血小板因子4(PF4)在恢复活力中起作用，特别是在大脑中。它在恢复活力方面的功能包括增强认知，恢复衰老的海马体，促进大脑的年轻化。PF4表达为约100个氨基酸的前体蛋白，随后加工成约70个氨基酸的成熟蛋白。PF4蛋白包括9条β链和两个螺旋、一个氨基末端信号序列。

外泌体是一种直径在30-150nm之间由细胞释放到细胞外空间的膜结合小泡。外泌体携带多种内容物，包括蛋白质、脂质、RNA和DNA。外泌体作为细胞间通讯的载体，可以将它们的货物转移到目标细胞，从而调节基因表达和细胞功能，外泌体在细胞间通讯中起着至关重要的作用，它们携带各种生物材料，并参与各种生理和病理过程。

目前针对外泌体的研究主要是利用干细胞外泌体治疗各种疾病，例如间充质干细胞的外泌体、神经干细胞的外泌体等。CN113679850A采用的技术为一种被靶向修饰且装载有药物的外泌体，该外泌体装载有相关的神经营养因子，可以靶向性地向神经组织受体细胞递送神经营养因子，从而通过抗炎、抗凋亡、促进神经细胞存活、促进神经再生的方式减轻神经组织损伤并促进修复。但该专利中采用的是HEK293细胞，该细胞为肿瘤细胞，很难用于临床。

利用PF4基因修饰的外泌体来治疗神经退行性疾病，目前还没有研究。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体及其应用，实现以下发明目的：提高间充质干细胞外泌体的分泌量；降低LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症因子的释放量；改善老龄化小鼠的行为和认知能力。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体，所述PF4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

所述外泌体的制备方法包括构建含PF4基因的腺相关病毒表达载体、腺相关病毒表达载体感染脐带间充质干细胞、含有PF4基因外泌体的提取。

所述构建PF4基因的腺相关病毒表达载体的方法为将PF4基因和信号肽基因串联后，连接到腺相关病毒载体上，得到含PF4基因的腺相关病毒表达载体。

所述信号肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

所述腺相关病毒表达载体感染脐带间充质干细胞的方法为将含PF4基因的腺相关病毒表达载体包装后，感染P3代间充质干细胞，24小时后，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞培养基，培养3天，得到含外泌体的细胞培养上清。

所述的间充质干细胞外泌体在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

1、本发明对PF4的基因序列进行优化，优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体的浓度明显提高。

2、优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体可以明显降低LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症因子的释放量，具有抗炎作用。

3、优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体可以改善老龄化小鼠的行为和认知能力。老龄化小鼠注射优化后的PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体后，能够作用于小鼠脑部，提高提高老年鼠的脑部功能，具体包括空间学习能力、学习记忆能力和记忆保持能力，在制备治疗神经退行性疾病的药物中具有良好的应用前景。

附图说明

图1 为实施例1培养的脐带间充质干细胞的显微镜图；

图2为 PF4融合基因的结构图；

图3为腺相关病毒感染间充质干细胞24h后的显微镜图；

图4为PF4-优化后转染的MSC、PF4-优化前转染的MSC与未转染MSC在PF4基因mRNA水平的相对表达柱状图；

图5为外泌体标志物的鉴定图；

其中A为免疫印迹鉴定外泌体标志物CD61、CD83和Calnexin，B为Exo-PF4-优化后外泌体的电镜图；

图6为实施例5各组BV2细胞上清中IL-1β含量的柱状图；

图7为实施例5各组BV2细胞上清中IL-6含量的柱状图；

图8为实施例5各组BV2细胞上清中TNF-α含量的柱状图；

图9为外泌体治疗策略流程示意图；

图10为电刺激Y迷宫实验中小鼠的学习能力柱状图；

图11为电刺激Y迷宫实验中小鼠的记忆保持能力柱状图；

图12为Y迷宫不同组小鼠自发轮流率的柱状图；

图13 Morris水迷宫不同组小鼠目标象限滞留时间百分比的柱状图。

具体实施方式

实施例1 脐带间充质干细胞的获得

取医院捐献的新生儿脐带，在超净工作台中先用75%酒精消毒两次，放在培养皿中，用镊子剥离出其中的华通氏胶组织，用剪刀剪碎至0.5mm²的小块；将剪碎的华通氏胶组织转移到T75培养瓶中，加入含有5%Vol HMSC Supplement（HMSC添加物）的间充质干细胞培养基（购自天津辛普森国际生命科技有限公司），放在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

每2天用显微镜观察，待长出的干细胞铺满瓶底的80%时（见图1），进行传代，传代后细胞生长速度加快，每2-3天传一代，传至P3代时冻存细胞，得到冻存的P3代间充质干细胞。

实施例2构建含PF4基因的腺相关病毒表达载体

在NCBI上查询到PF4基因的原始序列（NM_002619.4），对其进行氨基酸序列优化，其中优化位点为C10A、C36A、C52A、P58L、K66E、L67H。将优化后的PF4基因的核苷酸序列（SEQID No.2）和信号肽基因的核苷酸序列（SEQ ID No.3）串联后，得到PF4优化后融合基因（SEQID No.1），构建到腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP上，得到的重组表达载体，命名为pAAV-PF4-优化后，其PF4的融合基因结构见图2。

同时采用NM_002619.4中的PF4基因的核苷酸序列，与信号肽序列（上述SEQ IDNo.3）串联，得到PF4优化前融合基因（SEQID No.4），构建到腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP上，得到的重组表达载体，命名为pAAV-PF4-优化前。

使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，其中pAAV-PF4-优化后的质粒浓度为1.2µg/µL，pAAV-PF4-优化前的质粒浓度为1.3µg/µL。

实施例3腺相关病毒表达载体感染脐带间充质干细胞

1、利用293T细胞包装腺相关病毒

按照常规方法复苏293T细胞，并将其传代后细胞铺满80%的瓶底时用于转染。pAAV-PF4-优化后的质粒（pAAV-PF4-优化前的质粒）与腺相关病毒包装质粒pAAV-RC8与pHelper采用LipoFiter转染试剂转染293T细胞。

48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的荧光表达情况，72h后收取全部上清和细胞，转移至离心管，4000g离心30min，去除上清，加入 PBS混匀，放在-80℃反复冻融5次，使细胞充分裂解，用超速离心机进行纯化浓缩，用PBS重悬，测定腺相关病毒滴度。

本发明中含pAAV-PF4-优化后的病毒滴度为1.21×10⁹TU/mL，含pAAV-PF4-优化前的病毒滴度为1.08×10⁹TU/mL。

2、腺相关病毒感染脐带间充质干细胞

将冻存的P3代间充质干细胞（MSC）进行复苏，传代一次后，MSC在T175瓶的融合度达到60%时，用于腺相关病毒感染。

对MSC进行计数，MSC的数量为6×10⁶个/瓶，分别将制备好的pAAV-PF4-优化后病毒或pAAV-PF4-优化前病毒以MOI=100加入其中，放在37℃，5%的CO₂培养箱中培养24小时后（见图3），400g离心5min，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞培养基，培养3天，收集全部的细胞培养上清。同时收集2种过表达PF4的干细胞和未转染的MSC，检测三种不同细胞在mRNA水平上的表达情况。

结果如图4所示，过表达PF4-优化后的MSC、过表达PF4-优化前的MSC与未转染的MSC相比，过表达PF4-优化后的MSC在mRNA水平上表达强度为未转染的MSC的63倍，过表达PF4-优化前的MSC在mRNA水平上表达强度为未转染的MSC的44倍；过表达PF4-优化后的MSC和过表达PF4-优化前的MSC相比，在mRNA水平上的表达强度明显提高。

实施例4含有PF4基因外泌体的提取与鉴定

（1）将实施例3收集的细胞培养上清液用于外泌体提取。

（2）使用梯度离心的方案提取外泌体。200mL细胞培养上清于300g、4℃离心5分钟除去死细胞；2000g、4℃离心20分钟去除细胞碎片；10000g、4℃离心30分钟进一步去除大囊泡；而后于100000g、4℃超速离心90分钟。

（3）超速离心后的沉淀用50mL PBS重悬，再次于100000g、4℃超速离心90分钟进一步纯化外泌体。

（4）加入10mL PBS（购自索莱宝）重悬外泌体，使用0.22μm滤器过滤除菌，即为Exo-PF4-优化前外泌体或Exo-PF4-优化后外泌体（即过表达PF4基因修饰的MSC外泌体），BrandFord法测浓度后分装，于-80℃保存。

用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对制备得到的Exo-PF4-优化前外泌体和Exo-PF4-优化后外泌体进行检测，结果显示，Exo-PF4-优化后外泌体的浓度为589.5μg/mL，粒径值范围为89nm-130nm，平均粒径值为109nm；Exo-PF4-优化前外泌体的浓度为456.8μg/mL，粒径值范围为84nm-120nm，平均粒径值为104nm，可见，Exo-PF4-优化后外泌体的浓度明显高于Exo-PF4-优化前外泌体的浓度。

采用免疫印迹鉴定外泌体标志物CD81、CD63和Calnexin（阴性）。结果如图5A所示，分离获得的Exo-PF4-优化后外泌体和Exo-PF4-优化前外泌体均表达外泌体标志蛋白CD63和CD81，阴性蛋白Calnexin无表达。同时利用电镜分析外泌体的形态，如图5B所示，具有非常明显的膜结构。

实施例5 Exo-PF4-优化后外泌体或Exo-PF4-优化前外泌体对BV2小胶质细胞炎症因子的表达水平的影响试验

按照常规技术培养BV2小胶质细胞，将BV2小胶质细胞接种于6孔板中，每孔接种5×10⁵个细胞，待细胞融合度达到70%时，分别加入终浓度为60μg/mL的Exo-PF4-优化后外泌体或Exo-PF4-优化前外泌体，1h后再加入200ng/mL（终浓度）的LPS再孵育24h。设置脂多糖（200ng/mL的LPS）处理的模型组作为对照1组，同时以正常的BV2小胶质细胞作为对照2组。细胞处理结束后，收集细胞4000rpm离心5min，上清用于炎症因子检测。

按照ELISA检测试剂盒说明书分别检测细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。96孔ELISA板中分别加入待测样本或不同浓度梯度的标准品溶液，37℃孵育90min，洗涤除去其他未结合物质；加入一抗溶液，37℃孵育60min，弃溶液；加入HRP标记二抗，37℃孵育30min，彻底洗涤未结合的酶标抗体；加底物显色450nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算样本中炎症因子水平。

结果如图6、7、8所示，与正常对照组比较，LPS模型组细胞上清IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著增高。与LPS模型组比较，Exo-PF4-优化前和Exo-PF4-优化后给药组显著降低细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，表明PF4外泌体可有效抑制LPS诱导BV2细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α释放。与Exo-PF4-优化前相比较，Exo-PF4-优化后给药组效果更佳。

实施例6 Exo-PF4-优化后改善老龄化小鼠的行为和认知

治疗策略流程见图9，购买8周龄的C57BL6/J小鼠，正常饲养到20月龄，使用20月龄C57BL6/J小鼠每组10只。尾静脉分别给与300μg/mL的Exo-PF4-优化后外泌体、300μg/mL的Exo-PF4-优化前外泌体和PBS处理，均注射200μL，每周1次，持续4周。所有老鼠持续饲养到25个月。另设置有3月龄小鼠对照组10只。

（1）电刺激Y迷宫试验

Y 迷宫由3个互为120°角的相同长度的臂组成，分别称为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区。通常把下臂（Ⅰ臂）定为起步区，左侧（Ⅱ臂）为安全区，右侧（Ⅲ臂）为电击区，三臂相交处为隔离区(0区) 。迷宫底铺以铜棒，可以通电刺激，三臂顶端各装有15W的信号灯。

将小鼠放入Y-迷宫箱中适应5 min后，给予适当电击至其对Y迷宫的3臂均探索进入为止。选择活跃，对电击反应较敏感，逃避反应迅速者供测试用。

实验前先将小鼠放入迷宫，让其适应5 min，训练组小鼠在起步区予以电击致其逃至安全区，灯光持续15s，然后熄灯休息45s，开始下一次操作，每次实验在每只小鼠上重复20次为一轮，实验在黑暗、安静的环境中进行。

凡小鼠受电击后10s内一次性从起步区逃至安全区的反应称为“正确反应”，否则为“错误反应”，以连续正确反应达9次或以上定为学会标准，达到学会标准所需的电击次数表示学习能力指标，电击次数少说明学习能力强。24h后进行记忆保持能力的检测，记忆保持能力为正确反应次数(9次)占总检测次数的百分比。

图10中记录了小鼠在训练过程中出现连续正确反应9次，小鼠所用的全部训练次数；图11中记录了24h后出现9次正确反应占总检测次数的百分比。

PBS老龄鼠出现连续9次正确反应所需总次数最高，约为42次，24h后记忆保持能力检测中正确次数占总次数约为30％；3月龄年轻鼠出现连续9次正确反应所需总次数减少，约为16次，24h后记忆保持能力检测中正确次数占总次数的百分比约为64.2％。通过向小鼠注射一定剂量的PF4外泌体，均获得了减少总次数、提高正确次数百分比的效果；注射Exo-PF4-优化前老龄鼠出现连续9次正确反应所需总次数约为35次，24h后记忆保持能力检测中正确次数占总次数约为41％；注射Exo-PF4-优化后老龄鼠出现连续9次正确反应所需总次数约为27次，24h后记忆保持能力检测中正确次数占总次数约为52.9％。

（2）Y迷宫交替行为实验

Y迷宫，由3等长臂组成（每个壁的尺寸为50cm×18cm×35cm），每两个臂之间夹角为120度，迷宫内臂及底部均涂为黑色。将小鼠放在Y迷宫任意一臂末端，任其自由探索5min，摄像系统记录动物5min的行为变化，记录以下各项指标：①总进臂次数（the totalnumber of entries）：动物进入迷宫臂的次数（以小鼠四只脚均进入臂为进臂一次标准）；②轮流（交替）一次（an alternation）：依次连续进入Y迷宫全部三个臂一次。③最大轮流次数（The number of maximum alternations）：总进臂次数-2。自发轮流率=总轮流次数/最大轮流次数×100%。

由图12可知，3月龄年轻鼠的自发轮流率为31.5%，PBS老龄鼠的自发轮流率为11.8%，Exo-PF4-优化前老龄鼠的自发轮流率为15.9%，Exo-PF4-优化后老龄鼠的自发轮流率为22.3%。

（3）Morris水迷宫试验

Morris水迷宫为一圆形水池，直径为100cm，高为50cm，水池水深为30cm，一个圆形平台直径为9cm（高度28cm），藏匿于2cm的水面之下。水池的内部不得有任何标记，水中加入适量的新鲜牛奶，使水池成为不透明的乳白色。在水池的上缘等距离地设东、南、西和北4个标记点，作为动物进水池的入水点，以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水桶部分均等的分为4个象限。在第四象限中央水下2cm处隐藏放置平台。

每只小鼠每天进行3次测试，分别从四个象限面向水池池壁侧放入水中，让其寻找平台，限时60s，小鼠找到平台后，让其在平台上停留15s。超过60s无法寻找到平台者，则引导其上平台，停留15s。训练间歇期为15min，共训练5天。

在第六天进行空间探索试验，移除平台，以第二象限为起点，将小鼠面对池壁放入池中，记录其在60s内的游泳轨迹，分析目标象限滞留时间百分比。

如图13所示，3月龄年轻鼠在目标象限滞留时间占比最多，大约为55％；PBS组老龄鼠在目标象限滞留时间占比最低，约为24％。通过注射一定剂量的PF4外泌体，可以一定程度提高目标象限区间的时间占比。Exo-PF4-优化前老龄鼠在目标象限滞留时间占比约为31％、Exo-PF4-优化后老龄鼠在目标象限滞留时间占比约为39％。

Claims (6)

1.一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述PF4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述外泌体的制备方法包括构建含PF4基因的腺相关病毒表达载体、腺相关病毒表达载体感染脐带间充质干细胞、含有PF4基因外泌体的提取。

3.根据权利要求2所述的一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述构建PF4基因的腺相关病毒表达载体的方法为将PF4基因和信号肽基因串联后，连接到腺相关病毒载体上，得到含PF4基因的腺相关病毒表达载体。

4.根据权利要求3所述的一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述信号肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求2所述的一种PF4基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述腺相关病毒表达载体感染脐带间充质干细胞的方法为将含PF4基因的腺相关病毒表达载体包装后，感染P3代间充质干细胞，24小时后，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞培养基，培养3天，得到含外泌体的细胞培养上清。

6.权利要求1所述的间充质干细胞外泌体在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。