CN111060693A - Psap蛋白对于als疾病发病机制的作用及其验证方法 - Google Patents

Psap蛋白对于als疾病发病机制的作用及其验证方法 Download PDF

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CN111060693A CN201911253827.2A CN201911253827A CN111060693A CN 111060693 A CN111060693 A CN 111060693A CN 201911253827 A CN201911253827 A CN 201911253827A CN 111060693 A CN111060693 A CN 111060693A
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Abstract

本发明提供了PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，具体包括以下：一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子‑3诱导的运动神经元退化变性的影响；二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。本发明为揭示ALS发病机制提供了科学依据，同时也将提供新的治疗ALS的靶标，对人类健康具有深远的科学意义和广阔的市场前景。

Description

PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法。
背景技术
肌萎缩脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种神经系统退行性疾病，属于罕见病，美国报告ALS的发病率(每年新发病例)为2/10万～4/10万，患病率为4/10万～6/10万。1869年法国神经生物学家Charcot首先描述该病，由于大脑皮质、脑干和脊髓前角的上下运动神经元进行性退化变性，最初导致肌肉无力、萎缩，逐渐瘫痪，并伴随言语、吞咽、呼吸功能障碍，多数病人最终死于呼吸衰竭。流行病学研究表明大约90％-95％ALS病例属于散发性ALS(sporadic ALS，sALS)，5％-10％ALS病例属于家族性ALS(familial ALS，fALS)，而20％fALS病人存在铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxidedismutase 1，SOD1)基因突变。ALS发病后进展迅速，据统计经确诊的病人平均生存期只有18个月，极少数病人存在个体差异，生存期可达十年以上。ALS发病原因十分复杂，研究表明，氧化应激、兴奋性毒性、炎症、缺乏生长因子、细胞凋亡等均能诱发ALS。由于ALS的发病机制尚不明确，目前也没有特效疗法或治疗药物。
大量研究结果表明线粒体在ALS疾病中发挥重要的作用，同时死亡受体6(Deathreceptor 6，DR6)是治疗ALS疾病的重要靶标，目前发现早老素1相关蛋白(Presenilin1associated protein，PSAP)不仅特异性定位于线粒体，而且在DR6诱导的神经细胞退化凋亡中扮演重要的角色，因此，明确PSAP在ALS疾病发病机制中的作用，对于进一步揭示ALS发病机制提供了科学依据，同时也将提供新的治疗ALS的靶标，对人类健康具有深远的科学意义和广阔的市场前景针，对以上所述，在这里提出PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法。
发明内容
本发明的目的在于提供PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，解决了背景技术中所提出的问题。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，具体包括以下：
一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；
二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；
三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。
进一步地，步骤一的PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响具体方法包括以下，选取孕期14.5天野生型和PSAP基因敲除小鼠，取出胚胎，去除胚胎外胞膜，去除头、四肢和内脏，将其余胚胎转移至装有PBS的培养皿中冲洗，生物解剖显微镜下取出脊柱C1-C3区，用灭菌剪刀细细剪碎，连同PBS溶液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清，加3ml胰酶重悬沉淀，置于37℃水浴中消化20min；20min后，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10ml B27培养基重新悬浮，置于35mm细胞培养皿中，共四组，标记A、B、C、D，其中培养皿A和B为野生型小鼠中提取的细胞，培养皿C和D为PSAP基因敲除小鼠中提取的细胞；放于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育；第二天加神经生长因子，浓度为50μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察感觉神经元轴突的变化；
预冷的PBS冲洗细胞3次，去除剩余的培养液；
4％多聚甲醛室温固定，20min，预冷的PBS冲洗3次；
0.3％Triton X-100处理，5min，预冷的PBS冲洗3次；
10％山羊血清封闭30min；
弃去封闭液，加入10％山羊血清稀释一抗，4℃，过夜；
0.1％PBST洗3次，7min/次；加入10％山羊血清稀释荧光标记
二抗，室温，2小时；
0.1％PBST洗3次后，加入DAPI，5min；
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。
进一步地，步骤一PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响，操作包括以下选取孕期14.5天野生型和PSAP-/-小鼠，提取细胞方法如上，分别置于标记A、B、C、D的四个35mm细胞培养皿中，第二天加入脑源神经营养因子，神经营养因子-3，浓度均为10μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察运动神经元轴索的变化。
进一步地，步骤二，选取NSC34细胞，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，24h后收集样品，通过CCK-8实验检测细胞死亡情况，Western blot实验检测PARP裂解片段，caspase活化，免疫沉淀实验检测SOD1-PSAP，PSAP-Bax，SOD1-Bax复合物；为研究PSAP的作用，在对照组及实验组细胞中分别转染非靶向性siRNA及PSAP特异性siRNA试剂，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，检测PARP裂解片段，caspase活化，SOD1-Bax复合物的形成等。
进一步地，步骤三包括小鼠饲养及交配繁殖、观测生存时间、记录发病时间、体重监测实验、尼氏染色计数脊柱运动神经元、HE染色检测腿部肌肉变化、小鼠足迹实验、神经肌肉连接NMJ实验、统计学处理。
进一步地，小鼠饲养及交配繁殖，转人类SOD1G93A基因小鼠和同窝非转基因小鼠是由购自于美国Jackson实验室的B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J，和已构建的PSAP-/-小鼠，均在恒温22-24℃、恒湿40％-60％、12h光照/黑暗交替循环中饲养，经过交配繁殖后，最终得到实验所需的四个组：野生型小鼠、SOD1G93A转基因小鼠、PSAP-/-和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠，按照美国Jackson实验室的实验流程，提取小鼠尾部全基因组DNA，进行PCR验证小鼠的基因型。
进一步地，观测生存时间，n＝10，雄鼠，由于SOD1G93A转基因小鼠发病特点，发病末期小鼠极端痛苦，从步态不稳到双下肢出现偏瘫或双侧瘫痪，最终完全瘫痪，不能自主进食，因此应在小鼠失去自理生存能力前将其处死，而死亡判断依据为：将带有SOD1G93A基因的小鼠，即SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠侧卧放置，若30秒内不能自主翻身至正常状态，则记为死亡，该天即为小鼠的死亡时间，出生日至死亡时间为生存时间。根据这一标准，记录SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠的生存时间，利用Kaplan-Meier分析软件整理数据，得到生存时间曲线。
进一步地，记录发病时间，n＝10，雄鼠，SOD1G93A小鼠发病的定义为，如小鼠在转棒仪Rota-rod上停留的时间恒速20rpm小于3min，则该天记为小鼠发病的时间，根据这一标准，记录SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠的发病时间。
进一步地，体重监测实验，n＝15，雄鼠，第10周开始记录四组小鼠体重，每周两次，最后计算小鼠的平均体重。
进一步地，尼氏染色计数脊柱运动神经元，ALS疾病主要特征之一是运动神经元大量退化变性，尼氏体是一种嗜碱性物质，神经元的标志物之一，根据SOD1G93A小鼠发病进程，分别于60天未发病期，90天发病早期和120天发病末期选取小鼠，野生型小鼠组，n＝3；PSAP-/-小鼠组，n＝3；SOD1G93A小鼠组，n＝3；SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组，n＝3，取出脊髓L2-L5段，4％多聚甲醛固定48h后，制备冰冻切片，连续切片的厚度为10μm，连续切片200张，其中每三张切片取一张做尼氏染色，染料焦油紫染色，最终镜下计数，计数标准为：靶标神经元所在区域为脊髓前角部分，运动神经元有明显的细胞核以及尼氏体结构。
进一步地，HE染色检测腿部肌肉变化，SOD1G93A转基因小鼠发病后腿部肌肉逐渐萎缩，为了检验PSAP对肌肉萎缩情况的影响，本实验于60天，90天和120天分别选取四组小鼠，取小鼠腓肠肌部分样品，浸泡于4％多聚甲醛20min，迅速用OCT包被，置于-80℃冰箱。随后制备冰冻切片，连续切片的厚度为10μm，标记好的切片通过苏木精-伊红染色法，简称HE染色，最后镜下观察肌肉形态。
HE染色步骤为：
二甲苯(I)2min
二甲苯(II)2min
二甲苯(III)2min
100％乙醇(I)1min
100％乙醇(II)1min
100％乙醇(III)2min
95％乙醇30s
50％乙醇30s
清水洗至切片洁净
去离子水稍微冲洗3次
苏木精液染色30s
流水冲洗直至去除苏木精液
1％盐酸-乙醇分化液中迅速沾洗10-15次
去离子水稍微冲洗
置于氨水(返蓝液)中返蓝10s
温水冲洗3-5min
80％乙醇30s
1％伊红液染色30s
95％乙醇(I)30s
95％乙醇(II)30s
95％乙醇(III)30s
100％乙醇(I)沾洗10次
100％乙醇(II)沾洗10次
100％乙醇(III)1min
二甲苯(I)2min
二甲苯(II)2min
二甲苯(III)2min
中性树胶封片。
进一步地，小鼠足迹实验，为了观察PSAP对小鼠发病后行走能力的影响，50天开始足迹实验，野生型小鼠组，n＝3；PSAP-/-小鼠组，n＝3；SOD1G93A小鼠组，n＝3；SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组，n＝3，在一个长50cm宽约7cm的跑道里铺上白色的记录纸，小鼠后爪染上蓝黑色液体，使其顺利从跑道的起始跑到另一端。测取3个连续的足迹，记录平均值。
进一步地，神经肌肉连NMJ实验，神经肌肉接头是传递神经和肌肉之间信号传导和输送营养物质的关键部位，由运动神经元、Schwann细胞和神经终末相互作用而成，若运动神经元大量退化变性，导致神经肌肉连接的突触结构功能丧失，无法传递电活动，最终肌肉萎缩，丧失运动能力。本实验于60天，90天和120天分别选取四组小鼠，取小鼠腓肠肌部分样品，浸泡于4％多聚甲醛于4℃固定过夜，PBS溶液冲洗，
分别于10％，20％，30％蔗糖溶液中浸泡20min，120min，16h，
迅速用OCT包被，置于-80℃冰箱。
随后制备冰冻切片，连续切片的厚度为20μm，
切片置于PBST溶液10min
0.3％Triton X-100处理30min
10％山羊血清封闭1h，
去除封闭液，加入10％山羊血清稀释α-bungarotoxin conjugate(标记乙酰胆碱受体，红色)染液，室温避光放置30min，
去除染液，加入10％山羊血清稀释一抗(抗-neurofilament M抗体，标记运动神经元轴索，绿色和抗-SV2抗体，标记运动终板上的突触小泡，绿色)，4℃过夜，
0.1％PBST洗3次，5min/次，
加入10％山羊血清稀释荧光标记二抗，室温孵育1h，
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。
进一步地，统计学处理，采用Graphpad统计学软件对数据进行统计处理，各组数据用均数±标准误(x+SEM)表示，Kaplane-Meier(K-M)生存分析用于生存时间和发病时间和的统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明为揭示ALS发病机制提供了科学依据，同时也将提供新的治疗ALS的靶标，对人类健康具有深远的科学意义和广阔的市场前景。
附图说明
图1本发明的整体验证方法框架示意图；
图2PSAP蛋白水平降低阻断DR6诱导的细胞凋亡；
图3为DR6过表达时可检测到PSAP-Bax复合物的结果图；
图4为PSAP延缓NGF缺乏引起的感觉神经元轴索变性的结果图；
图5(A-D)为SOD1G93A过表达可诱导细胞凋亡的结果图；
图6(A-D)为PSAP、Bak和Bax对于SOD1G93A诱导的细胞凋亡的验证图；
图7为小鼠生存时间曲线示意图；
图8为小鼠发病时间曲线示意图；
图9为尼氏染色检测小鼠运动神经元数目统计图；
图10ALS小鼠末期足迹变化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-10，本实用发明提供一种技术方案：PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，具体包括以下：
一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；
二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；
三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。
步骤一的PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响具体方法包括以下，选取孕期14.5天野生型和PSAP基因敲除小鼠，取出胚胎，去除胚胎外胞膜，去除头、四肢和内脏，将其余胚胎转移至装有PBS的培养皿中冲洗，生物解剖显微镜下取出脊柱C1-C3区，用灭菌剪刀细细剪碎，连同PBS溶液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清，加3ml胰酶重悬沉淀，置于37℃水浴中消化20min；20min后，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10ml B27培养基重新悬浮，置于35mm细胞培养皿中，共四组，标记A、B、C、D，其中培养皿A和B为野生型小鼠中提取的细胞，培养皿C和D为PSAP基因敲除小鼠中提取的细胞；放于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育；第二天加神经生长因子，浓度为50μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察感觉神经元轴突的变化；
预冷的PBS冲洗细胞3次，去除剩余的培养液；
4％多聚甲醛室温固定，20min，预冷的PBS冲洗3次；
0.3％Triton X-100处理，5min，预冷的PBS冲洗3次；
10％山羊血清封闭30min；
弃去封闭液，加入10％山羊血清稀释一抗，4℃，过夜；
0.1％PBST洗3次，7min/次；加入10％山羊血清稀释荧光标记
二抗，室温，2小时；
0.1％PBST洗3次后，加入DAPI，5min；
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。
步骤一PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响，操作包括以下选取孕期14.5天野生型和PSAP-/-小鼠，提取细胞方法如上，分别置于标记A、B、C、D的四个35mm细胞培养皿中，第二天加入脑源神经营养因子，神经营养因子-3，浓度均为10μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察运动神经元轴索的变化。
步骤二，选取NSC34细胞，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，24h后收集样品，通过CCK-8实验检测细胞死亡情况，Western blot实验检测PARP裂解片段，caspase活化，免疫沉淀实验检测SOD1-PSAP，PSAP-Bax，SOD1-Bax复合物；为研究PSAP的作用，在对照组及实验组细胞中分别转染非靶向性siRNA及PSAP特异性siRNA试剂，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，检测PARP裂解片段，caspase活化，SOD1-Bax复合物的形成等。
步骤三包括小鼠饲养及交配繁殖、观测生存时间、记录发病时间、体重监测实验、尼氏染色计数脊柱运动神经元、HE染色检测腿部肌肉变化、小鼠足迹实验、神经肌肉连接NMJ实验、统计学处理。
小鼠饲养及交配繁殖，转人类SOD1G93A基因小鼠和同窝非转基因小鼠是由购自于美国Jackson实验室的B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J，和已构建的PSAP-/-小鼠，均在恒温22-24℃、恒湿40％-60％、12h光照/黑暗交替循环中饲养，经过交配繁殖后，最终得到实验所需的四个组：野生型小鼠、SOD1G93A转基因小鼠、PSAP-/-和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠，按照美国Jackson实验室的实验流程，提取小鼠尾部全基因组DNA，进行PCR验证小鼠的基因型。
观测生存时间，n＝10，雄鼠，由于SOD1G93A转基因小鼠发病特点，发病末期小鼠极端痛苦，从步态不稳到双下肢出现偏瘫或双侧瘫痪，最终完全瘫痪，不能自主进食，因此应在小鼠失去自理生存能力前将其处死，而死亡判断依据为：将带有SOD1G93A基因的小鼠，即SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠侧卧放置，若30秒内不能自主翻身至正常状态，则记为死亡，该天即为小鼠的死亡时间，出生日至死亡时间为生存时间。根据这一标准，记录SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠的生存时间，利用Kaplan-Meier分析软件整理数据，得到生存时间曲线。
记录发病时间，n＝10，雄鼠，SOD1G93A小鼠发病的定义为，如小鼠在转棒仪Rota-rod上停留的时间恒速20rpm小于3min，则该天记为小鼠发病的时间，根据这一标准，记录SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠的发病时间。
体重监测实验，n＝15，雄鼠，第10周开始记录四组小鼠体重，每周两次，最后计算小鼠的平均体重。
尼氏染色计数脊柱运动神经元，ALS疾病主要特征之一是运动神经元大量退化变性，尼氏体是一种嗜碱性物质，神经元的标志物之一，根据SOD1G93A小鼠发病进程，分别于60天未发病期，90天发病早期和120天发病末期选取小鼠，野生型小鼠组，n＝3；PSAP-/-小鼠组，n＝3；SOD1G93A小鼠组，n＝3；SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组，n＝3，取出脊髓L2-L5段，4％多聚甲醛固定48h后，制备冰冻切片，连续切片的厚度为10μm，连续切片200张，其中每三张切片取一张做尼氏染色，染料焦油紫染色，最终镜下计数，计数标准为：靶标神经元所在区域为脊髓前角部分，运动神经元有明显的细胞核以及尼氏体结构。
HE染色检测腿部肌肉变化，SOD1G93A转基因小鼠发病后腿部肌肉逐渐萎缩，为了检验PSAP对肌肉萎缩情况的影响，本实验于60天，90天和120天分别选取四组小鼠，取小鼠腓肠肌部分样品，浸泡于4％多聚甲醛20min，迅速用OCT包被，置于-80℃冰箱。随后制备冰冻切片，连续切片的厚度为10μm，标记好的切片通过苏木精-伊红染色法，简称HE染色，最后镜下观察肌肉形态。
HE染色步骤为：
二甲苯(I)2min
二甲苯(II)2min
二甲苯(III)2min
100％乙醇(I)1min
100％乙醇(II)1min
100％乙醇(III)2min
95％乙醇30s
50％乙醇30s
清水洗至切片洁净
去离子水稍微冲洗3次
苏木精液染色30s
流水冲洗直至去除苏木精液
1％盐酸-乙醇分化液中迅速沾洗10-15次
去离子水稍微冲洗
置于氨水(返蓝液)中返蓝10s
温水冲洗3-5min
80％乙醇30s
1％伊红液染色30s
95％乙醇(I)30s
95％乙醇(II)30s
95％乙醇(III)30s
100％乙醇(I)沾洗10次
100％乙醇(II)沾洗10次
100％乙醇(III)1min
二甲苯(I)2min
二甲苯(II)2min
二甲苯(III)2min
中性树胶封片。
小鼠足迹实验，为了观察PSAP对小鼠发病后行走能力的影响，50天开始足迹实验，野生型小鼠组，n＝3；PSAP-/-小鼠组，n＝3；SOD1G93A小鼠组，n＝3；SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组，n＝3，在一个长50cm宽约7cm的跑道里铺上白色的记录纸，小鼠后爪染上蓝黑色液体，使其顺利从跑道的起始跑到另一端。测取3个连续的足迹，记录平均值。
神经肌肉连NMJ实验，神经肌肉接头是传递神经和肌肉之间信号传导和输送营养物质的关键部位，由运动神经元、Schwann细胞和神经终末相互作用而成，若运动神经元大量退化变性，导致神经肌肉连接的突触结构功能丧失，无法传递电活动，最终肌肉萎缩，丧失运动能力。本实验于60天，90天和120天分别选取四组小鼠，取小鼠腓肠肌部分样品，浸泡于4％多聚甲醛于4℃固定过夜，PBS溶液冲洗，
分别于10％，20％，30％蔗糖溶液中浸泡20min，120min，16h，
迅速用OCT包被，置于-80℃冰箱。
随后制备冰冻切片，连续切片的厚度为20μm，
切片置于PBST溶液10min
0.3％Triton X-100处理30min
10％山羊血清封闭1h，
去除封闭液，加入10％山羊血清稀释α-bungarotoxin conjugate(标记乙酰胆碱受体，红色)染液，室温避光放置30min，
去除染液，加入10％山羊血清稀释一抗(抗-neurofilament M抗体，标记运动神经元轴索，绿色和抗-SV2抗体，标记运动终板上的突触小泡，绿色)，4℃过夜，
0.1％PBST洗3次，5min/次，
加入10％山羊血清稀释荧光标记二抗，室温孵育1h，
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。
统计学处理，采用Graphpad统计学软件对数据进行统计处理，各组数据用均数±标准误(x+SEM)表示，Kaplane-Meier(K-M)生存分析用于生存时间和发病时间和的统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。
实施例
结果
1、PSAP可抑制DR6诱导的细胞凋亡
利用RNAi技术降低PSAP的蛋白表达水平，结果显示几乎完全抑制了DR6诱导的PARP裂解产物的生成及caspases的活化，证明PSAP在DR6诱导的细胞凋亡中起着关键的作用。并且DR6过表达时能够检测到PSAP-Bax复合物的形成。
2、PSAP对缺乏神经生长因子NGF诱导的感觉神经元退化变性的影响
我们从野生型和PSAP-/-小鼠中提取培养感觉神经元细胞，当培养基中缺乏神经生长因子NGF 48h后，显微镜下观察发现神经轴索的不连续性，即发生退化变性，而从PSAP-/-小鼠中提取培养的细胞中没有发生神经轴索的退化变性，说明PSAP参与调节感觉神经元轴索退化变性，可以延缓或者阻断NGF缺乏引起的感觉神经元轴索变性。
3、SOD1G93A过表达可诱导小鼠运动神经元发生细胞凋亡
将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag分别转入小鼠运动神经元细胞NSC-34中，CCK-8实验(A)、Western blot(B)及Annexin V/PI双染色法(C)实验结果表明过表达SOD1G93A可诱导细胞凋亡，并且可诱导细胞色素C(Cytochrome C)、Bak从线粒体释放到胞浆中，Bax从胞浆转移到线粒体上。
4、利用siRNA干扰技术，降低细胞中PSAP、Bak或者Bax的蛋白表达水平，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag分别转入小鼠运动神经元细胞NSC-34中，CCK-8实验(A)、Western blot(B)、Caspase-3活性检测(C)及Annexin V/PI双染色法(D)实验结果表明PSAP、Bak及Bax对于SOD1G93A诱导的细胞凋亡是必须的。
5、观测生存时间(n＝10，雄鼠)结果显示，SOD1G93A小鼠组的生存时间为124±1.3天，而SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组的生存时间为136±2.5天，二者相比，P值<0.01，具有统计学意义，SOD1G93A/PSAP-/-小鼠寿命得到延长，说明PSAP在ALS发病机制中发挥重要作用。
6、记录发病时间(n＝10，雄鼠)曲线显示，SOD1G93A小鼠组的发病时间为100±2.8天，而SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组的发病时间为119±1.7天，二者相比，P值<0.01，具有统计学意义，说明PSAP基因敲除可推迟SOD1G93A小鼠发病时间。
7、尼氏染色计数脊髓运动神经元
根据SOD1G93A转基因小鼠发病时间，我们选取60天(未发病期)、90天(发病初期)及120天(发病末期)的小鼠进行实验。
尼氏染色法计数发现，90天时，SOD1G93A小鼠组的运动神经元数目约为366±1.3个，而SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组的运动神经元数目约为444±2.1个，说明在发病初期PSAP对运动神经元的退化变性已经发挥作用，PSAP基因敲除可减慢运动神经元的退化死亡。120天时，SOD1G93A小鼠组的运动神经元数目约为157±2.4个，而SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组的运动神经元数目约为330±2.8个，二者相比，P<0.01，具有统计学意义，说明在发病末期，PSAP仍然延缓运动神经元的退化变性。
8、小鼠足迹实验
小鼠在发病末期(120天)时运动步伐及步长均有变化，与尼氏染色法计数运动神经元实验数据相符，E-G是三只SOD1G93A转基因雄性小鼠，发病末期双脚已无法完全脱离地面行走，步长较短，步伐拖沓。B-D是三只SOD1G93A/PSAP-/-雄性小鼠，与A(野生型雄性小鼠)相比，虽然步长没有野生型小鼠长，但双脚能够脱离地面行走，与SOD1G93A小鼠相比，步伐整齐，步长较长，正是由于运动神经元退化死亡的延缓，大大改善了小鼠的运动功能。此部分实验还需要更多的小鼠计算平均步长，进行统计学处理。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (14)

1.PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：具体包括以下：
一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；
二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；
三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。
2.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤一的PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响具体方法包括以下，选取孕期14.5天野生型和PSAP基因敲除小鼠，取出胚胎，去除胚胎外胞膜，去除头、四肢和内脏，将其余胚胎转移至装有PBS的培养皿中冲洗，生物解剖显微镜下取出脊柱C1-C3区，用灭菌剪刀细细剪碎，连同PBS溶液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清，加3ml胰酶重悬沉淀，置于37℃水浴中消化20min；20min后，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10ml B27培养基重新悬浮，置于35mm细胞培养皿中，共四组，标记A、B、C、D，其中培养皿A和B为野生型小鼠中提取的细胞，培养皿C和D为PSAP基因敲除小鼠中提取的细胞；放于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育；第二天加神经生长因子，浓度为50μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察感觉神经元轴突的变化；
预冷的PBS冲洗细胞3次，去除剩余的培养液；
4％多聚甲醛室温固定，20min，预冷的PBS冲洗3次；
0.3％Triton X-100处理，5min，预冷的PBS冲洗3次；
10％山羊血清封闭30min；
弃去封闭液，加入10％山羊血清稀释一抗，4℃，过夜；
0.1％PBST洗3次，7min/次；加入10％山羊血清稀释荧光标记
二抗，室温，2小时；
0.1％PBST洗3次后，加入DAPI，5min；
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。
3.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤一PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响，操作包括以下选取孕期14.5天野生型和PSAP-/-小鼠，提取细胞方法如上，分别置于标记A、B、C、D的四个35mm细胞培养皿中，第二天加入脑源神经营养因子，神经营养因子-3，浓度均为10μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察运动神经元轴索的变化。
4.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤二，选取NSC34细胞，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，24h后收集样品，通过CCK-8实验检测细胞死亡情况，Western blot实验检测PARP裂解片段，caspase活化，免疫沉淀实验检测SOD1-PSAP，PSAP-Bax，SOD1-Bax复合物；为研究PSAP的作用，在对照组及实验组细胞中分别转染非靶向性siRNA及PSAP特异性siRNA试剂，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，检测PARP裂解片段，caspase活化，SOD1-Bax复合物的形成等。
5.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤三包括小鼠饲养及交配繁殖、观测生存时间、记录发病时间、体重监测实验、尼氏染色计数脊柱运动神经元、HE染色检测腿部肌肉变化、小鼠足迹实验、神经肌肉连接NMJ实验、统计学处理。
6.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：小鼠饲养及交配繁殖，转人类SOD1G93A基因小鼠和同窝非转基因小鼠是由购自于美国Jackson实验室的B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J，和已构建的PSAP-/-小鼠，均在恒温22-24℃、恒湿40％-60％、12h光照/黑暗交替循环中饲养，经过交配繁殖后，最终得到实验所需的四个组：野生型小鼠、SOD1G93A转基因小鼠、PSAP-/-和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠，按照美国Jackson实验室的实验流程，提取小鼠尾部全基因组DNA，进行PCR验证小鼠的基因型。
7.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：观测生存时间，n＝10，雄鼠，由于SOD1G93A转基因小鼠发病特点，发病末期小鼠极端痛苦，从步态不稳到双下肢出现偏瘫或双侧瘫痪，最终完全瘫痪，不能自主进食，因此应在小鼠失去自理生存能力前将其处死，而死亡判断依据为：将带有SOD1G93A基因的小鼠，即SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠侧卧放置，若30秒内不能自主翻身至正常状态，则记为死亡，该天即为小鼠的死亡时间，出生日至死亡时间为生存时间。根据这一标准，记录SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠的生存时间，利用Kaplan-Meier分析软件整理数据，得到生存时间曲线。
8.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：记录发病时间，n＝10，雄鼠，SOD1G93A小鼠发病的定义为，如小鼠在转棒仪Rota-rod上停留的时间恒速20rpm小于3min，则该天记为小鼠发病的时间，根据这一标准，记录SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠的发病时间。
9.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：体重监测实验，n＝15，雄鼠，第10周开始记录四组小鼠体重，每周两次，最后计算小鼠的平均体重。
10.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：尼氏染色计数脊柱运动神经元，ALS疾病主要特征之一是运动神经元大量退化变性，尼氏体是一种嗜碱性物质，神经元的标志物之一，根据SOD1G93A小鼠发病进程，分别于60天未发病期，90天发病早期和120天发病末期选取小鼠，野生型小鼠组，n＝3；PSAP-/-小鼠组，n＝3；SOD1G93A小鼠组，n＝3；SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组，n＝3，取出脊髓L2-L5段，4％多聚甲醛固定48h后，制备冰冻切片，连续切片的厚度为10μm，连续切片200张，其中每三张切片取一张做尼氏染色，染料焦油紫染色，最终镜下计数，计数标准为：靶标神经元所在区域为脊髓前角部分，运动神经元有明显的细胞核以及尼氏体结构。
11.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：HE染色检测腿部肌肉变化，SOD1G93A转基因小鼠发病后腿部肌肉逐渐萎缩，为了检验PSAP对肌肉萎缩情况的影响，本实验于60天，90天和120天分别选取四组小鼠，取小鼠腓肠肌部分样品，浸泡于4％多聚甲醛20min，迅速用OCT包被，置于-80℃冰箱。随后制备冰冻切片，连续切片的厚度为10μm，标记好的切片通过苏木精-伊红染色法，简称HE染色，最后镜下观察肌肉形态。
HE染色步骤为：
二甲苯(I)2min
二甲苯(II)2min
二甲苯(III)2min
100％乙醇(I)1min
100％乙醇(II)1min
100％乙醇(III)2min
95％乙醇30s
50％乙醇30s
清水洗至切片洁净
去离子水稍微冲洗3次
苏木精液染色30s
流水冲洗直至去除苏木精液
1％盐酸-乙醇分化液中迅速沾洗10-15次
去离子水稍微冲洗
置于氨水(返蓝液)中返蓝10s
温水冲洗3-5min
80％乙醇30s
1％伊红液染色30s
95％乙醇(I)30s
95％乙醇(II)30s
95％乙醇(III)30s
100％乙醇(I)沾洗10次
100％乙醇(II)沾洗10次
100％乙醇(III)1min
二甲苯(I)2min
二甲苯(II)2min
二甲苯(III)2min
中性树胶封片。
12.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：小鼠足迹实验，为了观察PSAP对小鼠发病后行走能力的影响，50天开始足迹实验，野生型小鼠组，n＝3；PSAP-/-小鼠组，n＝3；SOD1G93A小鼠组，n＝3；SOD1G93A/PSAP-/-小鼠组，n＝3，在一个长50cm宽约7cm的跑道里铺上白色的记录纸，小鼠后爪染上蓝黑色液体，使其顺利从跑道的起始跑到另一端。测取3个连续的足迹，记录平均值。
13.根据利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：神经肌肉连NMJ实验，神经肌肉接头是传递神经和肌肉之间信号传导和输送营养物质的关键部位，由运动神经元、Schwann细胞和神经终末相互作用而成，若运动神经元大量退化变性，导致神经肌肉连接的突触结构功能丧失，无法传递电活动，最终肌肉萎缩，丧失运动能力。本实验于60天，90天和120天分别选取四组小鼠，取小鼠腓肠肌部分样品，浸泡于4％多聚甲醛于4℃固定过夜，PBS溶液冲洗，
分别于10％，20％，30％蔗糖溶液中浸泡20min，120min，16h，
迅速用OCT包被，置于-80℃冰箱。
随后制备冰冻切片，连续切片的厚度为20μm，
切片置于PBST溶液10min
0.3％Triton X-100处理30min
10％山羊血清封闭1h，
去除封闭液，加入10％山羊血清稀释α-bungarotoxin conjugate(标记乙酰胆碱受体，红色)染液，室温避光放置30min，
去除染液，加入10％山羊血清稀释一抗(抗-neurofilament M抗体，标记运动神经元轴索，绿色和抗-SV2抗体，标记运动终板上的突触小泡，绿色)，4℃过夜，
0.1％PBST洗3次，5min/次，
加入10％山羊血清稀释荧光标记二抗，室温孵育1h，
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。
14.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：统计学处理，采用Graphpad统计学软件对数据进行统计处理，各组数据用均数±标准误(x+SEM)表示，Kaplane-Meier(K-M)生存分析用于生存时间和发病时间和的统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111575235A (zh) * 2020-06-02 2020-08-25 好当家集团有限公司 小分子海参肽促神经元功能的实验方法

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