CN117296798A - 父源非酒精性脂肪性肝病的动物模型构建方法、干预靶标及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种父源非酒精性脂肪性肝病的动物模型构建方法、干预靶标及其应用。所述的父源NAFLD动物模型，为雄性啮齿类动物(如Wistar大鼠)每天给予咖啡因(15、30、60mg/kg)胃內灌注，连续8周，然后与雌性大鼠受孕，获得子代，以建立父体孕前咖啡因暴露模型。子代出生后4周断奶，并雌、雄分笼，饲养至32周，雄、雌性子代均出现典型的NAFLD现象。基于父体孕前咖啡因暴露大鼠模型，出生后8周的雄性子代给予AVV8‑miR‑142‑3p腺相关病毒治疗可有效纠正NAFLD现象。本发明所建立的动物模型新颖、可靠、简便，并确定miR‑142‑3p可作为父源NAFLD的干预靶标。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型的构建方法、干预靶标及其应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是临床上最常见的慢性肝脏代谢性疾病，其主要包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。流行病学调查报告显示，全球约有四分之一的人患NAFLD[1]，其已经成为了威胁人类生命健康的重要原因。因此，揭示NAFLD发病机制并寻找潜在的干预靶标已成为亟待解决的问题。在生命早期配子形成及胚胎发育过程中受到不良环境因素影响可致子代胎儿代谢性适应及发育编程改变，从而增加出生后子代多疾病易感的风险。近年来，大量研究证实，父体孕前不良生活方式和环境暴露是导致子代发育迟缓及发育源性疾病患病风险增加的重要独立危险诱因。流行病学调查发现，父亲经历饥荒可致后代肥胖及糖尿病的发病风险增加[2]。与此同时，临床与实验室研究发现，父体孕前不良环境暴露(如吸烟、高脂饮食、外源物暴露、慢性应激等)可致子代宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)及出生后脂代谢功能紊乱、NAFLD等多种代谢性疾病易感[3,4]。表明，父体孕前不良环境因素暴露是导致子代脂代谢功能紊及NAFLD患病风险增加的重要危险诱因。但是，目前还未见父体孕前不良环境因素暴露致子代成年后NAFLD发生的动物模型。因此，建立稳定的父源NAFLD动物模型对于深入探究父源NAFLD发病机制，合理规避父体孕前不良环境暴露，对指导优生优育，提高人口质量具有十分重要的意义。
目前，虽然饮食诱导的NAFLD动物模型在临床前实验研究中广泛应用，但是这些模型也只能反映后天生活习惯因素对NAFLD发生的影响，忽略了父体孕前环境暴露带来的遗传因素的影响，且饮食诱导的NAFLD动物模型往往仅探究了单一性别(雄性或雌性)的改变，对不同性别间NAFLD的研究相对滞后。因此，现有研究迫切需要建立同时诱导出雄性和雌性同样高发的父源性NAFLD大鼠模型，与人类NAFLD高度相似，进一步探究其发病机制、早期防治，从而造福人类。
咖啡因作为一种广泛存在于咖啡、茶叶和多种功能饮料中的中枢兴奋剂和慢性应激源。研究证实，咖啡因具有生殖和发育毒性，长期摄入咖啡因和/或含咖啡因食品可致精子活力降低并影响受精后的胚胎发育[5]。因此，本研究通过父体孕前咖啡因灌胃模拟人类日常生活中的咖啡因暴露现象，建立父源NAFLD动物模型，该模型建立方法具有操作简单、成模率高、稳定可靠的优点。
表观遗传修饰(如DNA甲基化、非编码RNA等)是介导获得性性状遗传的重要方式。父母不良环境暴露所致的表观遗传变化可通过生殖细胞重编程传递致子代并能延续至多代。研究发现，精子非编码RNA(如miRNA)可作为一种表观遗传信息载体将父体获得性表型传递给子代。精子中的miRNAs可以介导父系获得性状的代际传递，如糖尿病、NAFLD、高胆固醇血症等代谢性疾病。此外，父体不良环境暴露(如饮酒、高脂饮食等)可致精子miRNAs(如miR-21、miR-30、let-7c等)表达谱发生改变并传递至子代，进而导致子代肝脏脂代谢关键基因表达变化、脂代谢功能改变[6-8]。表明，miRNAs作为父体遗传信息传递的载体和表观遗传修饰的重要标记，在父源性代谢性疾病发生过程中发挥着重要作用，可作为父源性NAFLD潜在的干预靶标。本发明基首次成功建立了父源NAFLD大鼠模型，通过生物信息学分析筛选和验证确定miR-142-3p可作为父源NAFLD的早期干预靶标，并证实过表达miR-142-3p能够有效纠正父源NAFLD现象，对于父源NAFLD的治疗药物开发和临床防治具有重要意义。
主要参考文献：
[1]Younossi ZM,Koenig AB,Abdelatif D,Fazel Y,Henry L,Wymer M.Globalepidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment ofprevalence,incidence,and outcomes.Hepatology 2016；64:73-84.
[2]Yan S,Hou W,Wu H,Jiang W,Li Y,Zhang Y,Li H,et al.Prenatal exposureto the Chinese famine and the risk of metabolic syndrome in adulthood acrossconsecutive generations.Eur J Clin Nutr 2020；74:1229-1236.
[3]Chang RC,Thomas KN,Bedi YS,Golding MC.Programmed increases inLXRalpha induced by paternal alcohol use enhance offspring metabolicadaptation to high-fat diet induced obesity.Mol Metab 2019；30:161-172.
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、有效可靠、可重复性强、简便易行的父源非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)动物模型的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供父源非酒精性脂肪性肝病的动物模型构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
S1：选取健康的雄性啮齿类动物，每日给予15、30和60mg/kg的咖啡因胃內灌注，雄鼠自由饮食、饮水；
S2：雄鼠连续8周每日胃內灌注不同剂量咖啡因后与正常雌鼠交配受孕；
S3：上述步骤S2的部分孕鼠于孕20天取胎鼠肝脏。部分孕鼠自然生产，获得F1代子代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性子代各6只进行哺乳喂养，子代出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分雄性子代继续正常饮食饲养至(8/32)周龄取血与肝脏；
S4：在上述步骤完成后，检测不同时间点(孕20、出生后32周)子代肝脏脂代谢相关指标来综合判定NAFLD；最终得到父源NAFLD动物模型。
作为优选方案，所述步骤S1中，啮齿类动物为大鼠、小鼠。
进一步地，所述步骤S3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。
更进一步地，所述步骤S4中，肝脏代谢改变检测相关指标是：血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力、肝脏甘油三酯含量、苏木素-伊红染色、油红O染色、Masson染色和天狼星红染色。
第二方面，本发明提供一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型在筛选抗父体孕前环境干扰物或药物中的应用，其特征在于：所述父源NAFLD动物模型由如以上任一构建方法得到。
第三方面，本发明提供一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型在筛选父源非酒精性脂肪性肝病早期干预靶标中的应用，其特征在于：所述父源NAFLD动物模型由如以上任一构建方法得到。
第四方面，本发明提供一种父源非酒精性脂肪性肝病早期干预靶标，所述干预靶标为miR-142-3p。
第五方面，本发明提供一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型在筛选/制备防治非酒精性脂肪性肝病治疗制剂的应用，其特征在于：所述父源NAFLD动物模型由如以上任一构建方法得到。
作为优选方案，所述父源NAFLD治疗制剂，包括：miR-142-3p腺相关病毒、miR-142-3p慢病毒等。
本发明的技术原理及研究过程如下：
本发明将雄性啮齿类动物(如Wistar大鼠)每天给予咖啡因(15、30、60mg/kg)胃內灌注，连续8周，然后与雌性大鼠受孕，获得子代，以建立父体孕前咖啡因暴露模型。通过检测父体孕前咖啡因暴露子代动物血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力和肝脏甘油三酯含量，观察肝脏苏木素-伊红染色、油红O染色、Masson染色和天狼猩红染色，进而建立父源NAFLD动物模型。该模型模拟了父源NAFLD发生发展的疾病表型，对阐明父源NAFLD发生发展的机制，确定早期干预靶标具有重要意义。
本发明的优点及有益效果如下：
1、本发明较为新颖、现实意义大。咖啡因作为一种广泛存在于咖啡、茶叶、软饮料及一些复方药物中的中枢兴奋剂，在日常生活中应用十分广泛，父体孕前咖啡因暴露是一种普遍的社会现象，因此本发明建立父体孕前咖啡因暴露所致的大鼠NAFLD模型较新颖，且能够反应日常生活现状，具有积极的现实意义。
2、本发明造模方法简单、检测指标稳定可靠、可重复性强。父体孕前给予不同剂量的咖啡因灌胃，子代出生后4周断奶，并采用标准饲料饲养致32周，采用血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力升高、肝脏甘油三酯含量、肝脏组织学染色(苏木素-伊红染色、油红O染色、Masson染色和天狼猩红染色)等指标能够模拟NAFLD患者肝脏脂代谢功能改变特征。本模型为父源NAFLD的动物模型构建提供了一种可靠的方法。
3、基于本发明构建的父源NAFLD动物模型，可用于指导父体孕前健康生活、探讨父源NAFLD发生的机制，并确定miR-142-3p可作为父源NAFLD的早期干预靶标。
附图说明
图1.父体孕前咖啡因暴露PPCE对雄性子代出生前、后肝脏病理改变及TG代谢的影响。
图1中：(A)：GD20雄性胎肝H&E染色和油红O染色；(B)：GD20雄性胎肝脂肪变性评分；(C)：GD20雄性胎肝TG含量；(D，E)：PW32雄性子代血清AST、ALT活力；(F)：PW32雄性子代肝脏外观形态；(G，H)：PW32雄性子代肝重和肝指数；(I)：PW32雄性子代肝脏H&E染色、油红O染色、Masson染色和天狼星红染色；(J-N)：PW32雄性子代肝脏NAS评分和纤维化评分；O：PW32雄性子代肝组织TG含量。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。TG：甘油三酯；GD20：孕20天；H&E：苏木素-伊红；PW32：出生后32周龄；AST：谷草转氨酶；ALT：谷丙转氨酶；NAS：NAFLD活动度评分。
图2.父体孕前咖啡因暴露PPCE对雌性子代出生前、后肝脏病理改变及TG代谢的影响。
图2中：(A)：GD20雌性胎肝H&E染色和油红O染色；(B)：GD20雌性胎肝TG含量；(C)：PW32雌性子代肝脏H&E染色和油红O染色；(D)：PW32雌性子代肝组织TG含量。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。TG：甘油三酯；GD20：孕20天；H&E：苏木素-伊红；PW32：出生后32周龄。
图3.父体孕前咖啡因暴露PPCE对雄性子代出生前、后肝脏脂代谢功能改变的影响。
图3中：(A-C)：GD20雄性胎肝转录组测序结果；(D)：GD20雄性胎肝脂代谢关键基因表达水平的统计图；(E)：GD20雄性胎肝脂代谢关键蛋白表达的免疫印迹图；(F)：GD20雄性胎肝脂代谢关键蛋白表达水平统计图；(G)：PW32雄性胎肝脂代谢关键基因表达水平的统计图；(H)：PW32雄性胎肝脂代谢关键蛋白表达的免疫印迹图；(I)：PW32雄性胎肝脂代谢关键蛋白表达水平统计图。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。GD20：孕20天；PW32：出生后32周龄。
图4.测序筛选父体孕前咖啡因暴露PPCE致雄性子代大鼠NAFLD发生的潜在毒性靶标。
图4中：(A)：亲代精子和胎肝中差异表达miRNAs的热图；(B)：亲代精子和子代胎肝中差异表达miRNAs的韦恩图；(C)：GD20子代肝脏中的miRNAs表达；(D)：FISH法检测胎鼠全身miR-142-3p的表达水平；(E)：PW32子代肝脏中差异表的达miRNAs；(F，G)：GD20和PW32子代肝脏中miR-142-3p的表达水平。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；GD20：孕20天；FISH：荧光原位杂交；PW32：出生后32周。
图5.父体孕前咖啡因暴露PPCE对雄性子代出生前、后肝脏miR-142-3p/ACSL4信号途径的影响。
图5中：(A)：miR-142-3p与靶基因ACSL4的结合图；(B)：GD20雄性胎肝ACSL4 mRNA表达水平；(C)：GD20雄性子代肝脏ACSL4蛋白表达水平；(D)：GD20雄性子代肝脏ACSL4蛋白表达水平统计图；(E)：GD20雄性胎肝ACSL4 mRNA表达水平；(F)：GD20雄性子代肝脏ACSL4蛋白表达水平；(G)：GD20雄性子代肝脏ACSL4蛋白表达水平统计图。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。ACSL4：脂酰辅酶A合成酶4；GD20：孕20天；PW32：出生后32周龄。
图6.miR-142-3p对大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs肝样分化细胞脂代谢功能的影响。
图6中：(A)：BMSCs肝样分化细胞脂质合成ACSL4，SREBP1，FASN和β氧化PPARα，CPT1α相关基因表达水平；(B)：BMSCs肝样分化细胞脂质合成ACSL4，SREBP1，FASN和β氧化PPARα，CPT1α相关蛋白表达水平；(C)：BMSCs肝样分化细胞脂质合成和β氧化相关基因表达水平统计图。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。ACSL4：脂酰辅酶A合成酶4；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1；FASN：脂肪酸合成酶；PPARα：过氧化物酶体增殖物激活受体α；CPT1α：肉毒碱棕榈酰转移酶1α。
图7.miR-142-3p靶向ACSL4调节大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs肝样分化细胞脂代谢。
图7中：(A)：BMSCs肝样分化细胞脂质合成ACSL4，SREBP1，FASN和β氧化PPARα，CPT1α相关基因表达水平；(B，C)：BMSCs肝样分化细胞脂质合成ACSL4，SREBP1，FASN和β氧化PPARα，CPT1α相关蛋白表达水平；(D)：BMSCs肝样分化细胞脂质合成ACSL4，SREBP1，FASN和β氧化PPARα，CPT1α相关蛋白的免疫荧光染色图；(E)：miR-142-3p与ACSL4双荧光素酶报告基因实验结果。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01；与PPCE组比较，#P<0.05，##P<0.01。ACSL4：脂酰辅酶A合成酶4；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1；FASN：脂肪酸合成酶；PPARα：过氧化物酶体增殖物激活受体α；CPT1α：肉毒碱棕榈酰转移酶1α。
图8.肝脏过表达miR-142-3p对父体孕前咖啡因暴露PPCE雄性子代NAFLD发生的影响。
图8中：(A)：PW32雄性子代肝脏脂代谢功能基因mRNA表达水平；(B)：PW32雄性子代肝脏H&E染色和油红O染色；(C)：PW32雄性子代肝脏组织评分；(D)：PW32雄性子代肝组织TG含量。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01；与PPCE组比较，#P<0.05，##P<0.01。NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；PW32：出生后32周龄；H&E：苏木素-伊红；TG：甘油三酯。
图9.皮质酮而非咖啡因介导精原细胞miR-142-3p启动子区高甲基化及低表达。
图9中：(A)：血清皮质酮的含量；(B)：睾丸GR mRNA表达水平；(C)：精子miR-142-3p启动子区甲基化水平；(D，E)：咖啡因和皮质酮对精原细胞miR-142-3p mRNA表达的影响；(F，G)：皮质酮对精原细胞miR-142-3p启动子区甲基化的影响。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01。GR：糖皮质激素受体。
图10.RU486干预逆转父体孕前咖啡因暴露PPCE所致雄性子代大鼠出生前后肝脏脂代谢功能紊乱。
图10中：(A，B)：GD20子代肝脏miR-142-3p的甲基化水平；(C，D)：GD20子代肝脏miR-142-3p、Acsl4、Srebp1、Fasn、Pparα和Cpt1αmRNA的表达水平；(E，F)：PW32子代肝脏miR-142-3p、Acsl4、Srebp1、Fasn、Pparα和Cpt1αmRNA的表达水平；(G)：H&E和ORO染色400×；(H，I)：GD20和PW32子代肝脏TG含量。与对照组CON比较，*P<0.05，**P<0.01；与PPCE组比较，#P<0.05，##P<0.01。GD20：孕20天；Acsl4：酯酰辅酶A长链家族成员4；Srebp1：固醇调节元件结合蛋白1；Fasn：脂肪酸合成酶；Pparα：过氧化物酶体增殖物激活受体α；Cpt1α：肉毒碱棕榈酰转移酶1α；PW32：出生后32周；H&E：苏木素-伊红；ORO：油红O；TG：甘油三酯。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明的技术内容作进一步的详细阐述。
【实施例1】父源非酒精性脂肪肝病动物模型的构建
1实验动物
SPF级健康Wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：SCXK(鄂)20200-2022。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。
实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
2实验方法
雄性Wistar大鼠60只(体重260-300g)适应性喂养2周后随机分为对照组、咖啡因组。咖啡因组大鼠每日给予不同剂量咖啡因(15、30、60mg/kg)胃內灌注，对照组给予等容生理盐水胃內灌注。连续给药8周后与正常雌性Wistar大鼠按照雄:雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。各组的大鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，每组随机选取12只正常饮食饲养至生后12周，上述实验完成后第2天，经麻醉处死动物。
3检测指标及方法
3.1血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力检测
运用谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力检测试剂盒(货号分别为：C009-2-1、C010-2-1，南京建成)检测各组大鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力。将血清样本从-80℃冰箱取出后置于冰上解冻并混合均匀。按试剂盒说明书操作步骤在96孔板中依次加入样品与相应的检测工作液，同时设置标准品孔与空白孔，混合均匀。反应结束后，运用酶标仪测定510nm处各孔的吸光度值，通过查标准曲线计算谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力。
3.2甘油三酯含量检测
运用甘油三酯含量检测试剂盒(A110-1，南京建成)检测各组大鼠肝脏中甘油三酯的含量。取50mg新鲜肝组织按体积比1:9加入生理盐水，在冰浴条件下匀浆，2500转/min，离心10min，取上清液用于检测。首先运用甘油三酯含量检测试剂盒检测各组大鼠肝组织匀浆液中甘油三酯的含量，随后运用BCA蛋白浓度检测试剂盒(P0012，上海碧云天)检测各组大鼠肝组织匀浆液中蛋白浓度，最后运用肝组织匀浆液中每g蛋白对应的甘油三酯含量作为肝组织中甘油三酯含量。即肝脏中甘油三酯含量＝mmol/g蛋白质。
3.3苏木素-伊红染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经脱水后在石蜡包埋机中包埋；将包埋的组织蜡块切成5μm薄片，制备肝组织切片；将切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次进行脱蜡；将切片依次置于100％、95％、85％、75％的乙醇中浸泡5min，蒸馏水清洗干净；将切片置于苏木精-伊红染液中浸泡30s，用蒸馏水清洗干净，然后置于1％盐酸酒精中浸泡并迅速取出，用蒸馏水清洗干净；将切片依次置于75％-、85％-，95％-、100％的乙醇中浸泡5min，置于通风橱中将残留的乙醇挥干，然后置于二甲苯溶液中浸泡5min，置于通风橱中将残留的二甲苯挥干；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜先观察染色结果。
3.4油红O染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经冰冻切片将小鼠肝组织样本切成6～8μm薄片，贴于载玻片上，并立即置于10％多聚甲醛中固定3min，蒸馏水清洗后置于-20℃保存。临用时将冻存的切片取出，室温下放置10min，置于60％异丙醇溶液中浸泡2min；将切片置于油红O染色液中染色10min，60％异丙醇溶液清洗掉多余染液，蒸馏水清洗干净；苏木精溶液复染30s，蒸馏水清洗干净；置于1％盐酸酒精中浸泡并迅速取出，蒸馏水清洗干净；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜下观察染色结果。
3.5Masson染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经脱水后在石蜡包埋机中包埋；将包埋的组织蜡块切成5μm薄片，制备肝组织切片。将石蜡切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次进行脱蜡；将切片依次置于100％、95％、85％、75％的乙醇中浸泡5min，蒸馏水清洗干净；随后用苏木精染色液浸染5min，蒸馏水洗；然后用Masson染液浸染5min；然后用分化液浸染3min；将切片依次置于75％、85％、95％、100％的乙醇中浸泡5min，置于通风橱中将残留的乙醇挥干，然后置于二甲苯溶液中浸泡5min，置于通风橱中将残留的二甲苯挥干；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜先观察染色结果。
3.6天狼星红染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经脱水后在石蜡包埋机中包埋；将包埋的组织蜡块切成5μm薄片，制备肝组织切片。将石蜡切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次进行脱蜡；将切片依次置于100％、95％、85％、75％的乙醇中浸泡5min，蒸馏水清洗干净；随后用苏木精染色液浸染5min，蒸馏水洗；然后用天狼星红染色液浸染60min；然后将切片依次置于75％、85％、95％、100％的乙醇中浸泡5min，置于通风橱中将残留的乙醇挥干，然后置于二甲苯溶液中浸泡5min，置于通风橱中将残留的二甲苯挥干；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜先观察染色结果。
3.7实时荧光定量PCR实验
运用Trizol试剂提取各组小鼠肝组织中的RNA，经逆转录后得到cDNA。将cDNA、各基因上、下游引物、标记SYBR GreenI荧光染料Mix等试剂混合均匀后置于RT-qPCR仪中反应。RT-qPCR反应条件如下(反应体系为10μL)：95℃预变性2min；95℃变性10s，62℃退火30s；72℃延伸15s，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct方法计算待测目的基因mRNA的相对表达量。
3.8Western blot实验
肝组织蛋白提取：取各组大鼠肝组织，剪取肝组织约50mg，置于1.5mL EP管中，加入400μL蛋白裂解液(哺乳动物蛋白提取试剂、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物按体积比98：1：1混合均匀)，运用超声破碎仪将肝组织充分破碎后置于冰上裂解30min。12000r/min，4℃离心15min，取上清液置于另一EP管中，即得肝组织蛋白提取液。取适量蛋白提取液用蒸馏水稀释后，按照BCA蛋白含量测定法测定蛋白浓度。剩余肝组织蛋白提取液按体积比4:1加入5×蛋白上样缓冲液，于95℃变性5min，即得各组蛋白样品，室温下冷却后置于-20℃保存，备用。
Western Blotting：按照SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书配制分离胶与浓缩胶，室温放置30～40min；取各组蛋白样品各100μg进行电泳；电泳结束后运用硝酸纤维素膜半干法，在25V/1.0A，25min的转膜条件下将SDS-PAGE凝胶中的蛋白样品转印至PVDF(0.45μm)膜上；载有蛋白样品的PVDF膜用5％的脱脂牛奶封闭1h；将目的基因抗体用5％BSA溶液按一抗稀释比例稀释后4℃孵育过夜，1×TBST清洗10min×3次；室温下二抗孵育1h，1×TBST清洗10min×3次；运用ECL发光法显色后运用G:BOX成像分析系统获得条带，以β-actin作为内参。
4实验结果
4.1PPCE对雄性子代出生前、后肝脏病理改变及TG代谢的影响
结果如图1所示。H&E和ORO染色结果显示，与对照组相比，GD20时PPCE组肝脏病理均出现明显的脂肪空泡样变性、脂肪样变性和脂质蓄积表现(图1中A)。同时，PPCE组肝脏脂肪变性评分(图1中B)和TG含量(图1中C)显著升高。在PW32时，PPCE组血清肝功能酶(AST、ALT)活力显著升高(图1中D，E)、肝脏外观呈浅棕色，肝重和肝指数显著升高(图1中F-H)。H&E、ORO、Masson和天狼星红染色结果显示，与对照组相比，PW32时PPCE雄性子代大鼠肝脏出现典型的NAFLD组织学特征，表现为明显的空泡样脂肪变性、炎性浸润(绿色箭头所示)和胶原纤维沉积(黑色和红色箭头所示)(图1中I)，肝脏NAS评分(图1中J-N)和TG含量显著升高(图1中O)。实验结果说明，PPCE可致雄性子代大鼠出生前后肝脏病理改变、成年后NAFLD发生。
4.2PPCE对雌性子代出生前、后肝脏病理改变及TG代谢的影响
结果如图2所示。与对照组相比，PPCE可致雌性子代胎肝部分肝细胞呈现明显的脂肪空泡、油红O染色显示存在明显的脂质蓄积(图2中A)，胎肝甘油三酯含量显著升高(图2中B)。与对照组比较，PPCE雌性子代PW32肝脏出现大量的空泡样脂肪变性并伴有过量脂质沉积(图2中C)，肝脏甘油三酯含量显著升高(图2中D)。实验结果说明，PPCE可致雌性子代大鼠出生前后肝脏病理改变、成年后NAFLD发生。但是值得注意的是，雌性子代肝脏病理改变程度明显较雄性子代轻，呈现出性别差异。
4.3PPCE对雄性子代出生前、后肝脏脂代谢功能改变的影响
结果如图3所示。转录组测序结果显示，PPCE可致雄性子代胎肝大量基因表达显著变化，其中差异变化的基因与脂代谢密切相关(图3中A-C)。RT-qPCR和蛋白免疫印迹实验结果显示，与对照组相比，PPCE可致雄性子代胎肝中脂肪酸合成相关基因mRNA和蛋白表达水平显著升高、β氧化相关蛋白水平显著降低(图3中D-F)；同时PPCE可致PW32雄性子代肝脏脂肪酸合成相关基因mRNA和蛋白表达水平显著升高、β氧化相关蛋白水平显著降低(图3中G-I)。实验结果说明，PPCE可致雄性子代出生前、后肝脏脂代谢功能改变，主要表现为脂肪酸合成增强、β氧化减弱。
综上，本发明方法通过雄性大鼠孕前连续8周给予咖啡因处理，子代出生后4周断奶继续给予常规饮食饲养至32周，发现父体孕前咖啡因暴露雄性和雌性子代均出现NAFLD的典型表现，说明成功建立了父源非酒精性脂肪肝病(NAFLD)模型。本发明的造模方法简单，模型中大鼠血清肝功能酶活力升高、肝脏甘油三酯含量显著升高、肝脏脂肪样变性明显、脂代谢功能基因表达改变，说明本发明造模方法稳定有效可靠，可重复性强。
【实施例2】用本发明模型寻找父源非酒精性脂肪肝病的早期干预靶标
1实验动物
SPF级健康Wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：SCXK(鄂)2020-2022。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
2实验动物处理
雄性Wistar大鼠30只(体重260-300g)适应性喂养2周后随机分为对照组、咖啡因组(15,30,60mg/kg·d)。咖啡因组大鼠每日给予不同剂量咖啡因胃內灌注，对照组给予等容生理盐水胃內灌注。连续给药8周后与正常雌性Wistar大鼠按照雄:雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。各组的大鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
收集亲代大鼠的精子样本。部分孕20天的母鼠经麻醉处死后收集雄性子代胎鼠肝脏样本。部分母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，每组随机选取12只正常饮食饲养至出生后32周，然后经麻醉处死动物，收集出生后32周雄性子代肝脏样本。
3大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)提取、培养、肝样细胞分化及转染
3.1BMSCs的提取
(1)超净台及细胞实验室环境用紫外照射30min以上进行杀菌，同时将BMSCs细胞提取及培养所需的试剂和耗材放入超净工作台，紫外照射30min以上进行杀菌。
(2)3周龄的Wistar雄性大鼠运用颈椎脱臼法处死，然后在75％乙醇中浸泡20min。
(3)在超净工作台中分离Wistar雄性大鼠的双下肢股骨与胫骨，去除骨表面附着的肌肉、筋膜等，然后用PBS冲洗后去除股骨或胫骨双侧的干髓端。
(4)注射器吸取不含血清的α-MEM培养基对股骨以及胫骨的骨髓腔进行充分冲洗，重复3～5次以保证获得足够的细胞。
(5)含有细胞的冲洗液经过轻轻吹打混合均匀，使其成为看不到大块骨髓的均匀液体，随后用孔径为70μm的细胞筛进行过滤。
(6)将过滤后的细胞悬液离心，室温条件下1500rpm离心5min，然后丢弃上清，下层细胞沉淀用含10％FBS、100mg/mL链霉素、100U/mL青霉素的α-MEM完全培养基(以下简称“培养基”)重悬。
(7)运用细胞计数器对细胞悬液的细胞数量进行计数，随后调整细胞密度，以大约1×106cells/mL密度接种在T25细胞培养瓶中，并在5％CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养，每天关注细胞的生长状态。
3.2BMSCs传代及铺板
(1)在显微镜下观察BMSCs生长状态，当贴壁细胞生长至90％左右密度时，弃掉培养瓶中培养基。
(2)在T25细胞培养瓶中加入适量PBS洗3次后，加入1mL胰蛋白酶消化液，放入细胞培养箱1～2min，在显微镜下观察到细胞成片脱落时，加入3mL完全培养基以终止消化。
(3)吸取培养基轻轻吹打细胞，随后将细胞培养基转移至离心管中，1000rpm的转速离心5min。
(4)离心结束后丢掉细胞上清，加入1mL完全培养基吹打重悬细胞沉淀。
(5)将细胞悬液以1×106cells/mL密度接种在培养板或传代于培养瓶中。
3.3BMSCs肝样细胞分化
待培养板中BMSCs细胞密度长至约80％时，将培养基更换成含有1％FBS、100U/mL链霉素、100U/mL青霉素、20ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、2ng/mL表皮生长因子(EGF)、50nmol/L地塞米松和50mg/mL胰岛素转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)的IMEM培养基(肝样细胞分化培养基)继续培养14天，这期间每天观察细生长状态，每3～4天更换一次分化培养基。
3.4BMSCs肝样分化细胞转染
Rat-miR-142-3p inhibitor、Rat-miR-142-3p mimics、microRNA inhibitor NC、microRNA mimics NC和Rat-ACSL4过表达质粒由吉玛基因构建合成。使用前将干粉状的siRNA离心后按说明书方法在每1OD microRNA inhibitor或mimics中加入250μL DEPC水，配成20μM溶液，置于-20℃保存。转染步骤如下：先在一无菌的RNase-free EP管中加入200μL无血清的opti-DMEM，10μL Rat-miR-142-3p inhibitor或microRNA inhibitor NC(终浓度为200pM)，为管①；后再另取一无菌EP管，加入200μL无血清的opti-DMEM及5μLLipo3000，为管②。分别轻轻混匀后静置5min，之后将管②缓慢滴加到管①中，室温静置20min。将六孔板中培养基换为新鲜的不含血清的分化培养基(每孔培养基体积1.6mL)，之后将管①和管②的混合液400μL轻轻加到细胞孔中。轻轻摇培养板使液体充分混匀后，放于细胞培养箱进行培养24h后更换化培养基或进行后续相关实验。按照上述同样的方法进行ACSL4过表达质粒转染。
4检测指标及方法
4.1miRNAs测序分析
(1)样品准备：取约100mg胎肝组织置于离心管中，-80℃保存备用。从大鼠附睾中取大鼠精子样本置于离心管中，-80℃保存备用。
(2)质控检测：提取样本中的总RNA，检测总RNA的浓度、纯度及完整性，以保障样品质量合格。
(3)RNA文库构建：运用带有Oligo-dT的磁珠富集真核生物的mRNA，并以mRNA为模板合成第一条cDNA链，随后依次加入缓冲液、dNTPs、无酶水和DNA合成酶等试剂合成第二条cDNA链。然后，经过cDNA纯化、末端修复后，通过RT-qPCR法富集得到cDNA文库。
(4)RNA文库质控：cDNA文库构建完成以后检测文库的浓度和插入片段的大小，最后运用RT-qPCR法对文库的有效浓度进行准确定量。
(5)测序分析：RNA文库质控检测合格后使用NovaSeq 6000系统进行高通量测序。
(6)随后对高通量测序数据进行处理与分析，包括基础分析(测序数据质控、序列对比分析、转录本组装)、miRNAs鉴定与预测、表达量分析(表达量详情、表达量分布、样本间关系分析)、表达量差异分析(表达量差异详情、差异量差异统计、表达量差异可视化分析)、miRNAs靶基因预测、基因集分析(Venn分析、聚类分析、功能注释分析、功能富集分析、表达相关性分析)等。
4.2实时荧光定量PCR实验
运用Trizol试剂提取各组小鼠肝组织中的RNA，经逆转录后得到cDNA。将cDNA、各基因上、下游引物、标记SYBR GreenI荧光染料Mix等试剂混合均匀后置于RT-qPCR仪中反应。RT-qPCR反应条件如下(反应体系为10μL)：95℃预变性2min；95℃变性10s，62℃退火30s；72℃延伸15s，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct方法计算待测目的基因mRNA的相对表达量。引物序列如下表1：
表1.引物序列。
4.3Western blot实验
肝组织蛋白提取：取各组大鼠肝组织，剪取肝组织约50mg，置于1.5mL EP管中，加入400μL蛋白裂解液(哺乳动物蛋白提取试剂、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物按体积比98：1：1混合均匀)，运用超声破碎仪将肝组织充分破碎后置于冰上裂解30min。12000r/min，4℃离心15min，取上清液置于另一EP管中，即得肝组织蛋白提取液。取适量蛋白提取液用蒸馏水稀释后，按照BCA蛋白含量测定法测定蛋白浓度。剩余肝组织蛋白提取液按体积比4:1加入5×蛋白上样缓冲液，于95℃变性5min，即得各组蛋白样品，室温下冷却后置于-20℃保存，备用。
Western Blotting：按照SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书配制分离胶与浓缩胶，室温放置30～40min；取各组蛋白样品各100μg进行电泳；电泳结束后运用硝酸纤维素膜半干法，在25V/1.0A，25min的转膜条件下将SDS-PAGE凝胶中的蛋白样品转印至PVDF(0.45μm)膜上；载有蛋白样品的PVDF膜用5％的脱脂牛奶封闭1h；将目的基因抗体用5％BSA溶液按一抗稀释比例稀释后4℃孵育过夜，1×TBST清洗10min×3次；室温下二抗孵育1h，1×TBST清洗10min×3次；运用ECL发光法显色后运用G:BOX成像分析系统获得条带，以β-actin作为内参。
4.4细胞免疫荧光染色
首先，将细胞爬片用预冷的PBS清洗2～3次，然后用4％甲醛固定液室温固定30min，随后用PBS清洗5min×3次；随后，放入pH 6.0的柠檬酸钠抗原修复液中，微波炉加热5min，进行抗原修复，自然冷却，然后用PBS清洗5min×3次；然后，用PBS配制的5％小牛血清蛋白(BSA)溶液室温温封闭30min；接着，将一抗工作液均匀滴加至样品上，4℃孵育过夜，一抗孵育结束后用PBS清洗5min×3次；进一步，将荧光标记的二抗工作液滴加到样品上，室温条件下避光孵育1h，二抗孵育结束后用PBS清洗5min×3次；进一步，加DAPI染色液避光条件下浸染细胞核5min，然后加入适量的荧光抗淬灭剂进行封片；最后，运用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察拍照。
5实验结果
5.1测序筛选PPCE致雄性子代大鼠NAFLD发生的潜在毒性靶标
结果如图4所示。与对照组比较，PPCE组父体精子和子代胎肝中多种miRNAs表达出现改变(图4中A)，其中共同差异表达的miRNAs有10种(图4中B)，尤以miR-142-3p变化最为显著(图4中C)。荧光原位杂交实验结果显示，胎肝miR-142-3p表达远高于其他脏器，具有较好的器官特异性(图4中D)。同时，测序分析提示，PW32时PPCE组肝脏中miR-142-3p差异变化最为显著(图4中E)。RT-qPCR结果表明，与对照组比较，GD20和PW32时PPCE组肝脏miR-142-3p表达显著降低(图4中F，G)。表明，PPCE可致父体精子miR-142-3p表达降低，并可延续至雄性子代肝脏，导致出生前、后肝脏miR-142-3p表达降低。实验结果说明，miR-142-3p可能是介导PPCE致雄性子代NAFLD发生的潜在毒性靶标。
5.2PPCE对雄性子代出生前、后肝脏miR-142-3p/ACSL4信号途径的影响
结果如图5所示。通过靶标预测数据库(TargetScan、miRDB和miRcode)分析发现长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)与miR-142-3p存在相互作用(图5中A)。随后，本发明检测了PPCE对雄性子代出生前、后肝脏ACSL4的mRNA和蛋白表达的影响。RT-qPCR和Western blot结果显示，与对照组比较，PPCE可致雄性子代胎肝及PW32子代肝脏中ACSL4的mRNA和蛋白表达水平显著升高(图5中B-G)。实验结果说明，PPCE可致雄性子代肝脏miR-142-3p/ACSL4信号通路改变。
5.3miR-142-3p对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)肝样分化细胞脂代谢功能的影响
在BMSCs定向分化肝样细胞模型上，运用miR-142-3p inhibitor和miR-142-3pmimics转染，观察miR-142-3p对BMSCs定向分化肝样细胞脂代谢关键基因表达的影响。结果如图6所示。与对照组比较，miR-142-3p inhibitor转染可致BMSCs定向分化肝样细胞中ACSL4及SREBP1、FASN、ACC、ACLY等脂质合成关键因子的mRNA和蛋白表达水平显著升高(图6中A-C)，PPARα、CPT1α的mRNA和蛋白表达水平显著降低(图6中A-C)。相反，miR-142-3pmimics转染能够显著降低肝细胞中ACSL4及SREBP-1、FASN、ACC、ACLY等脂质合成关键基因的mRNA和蛋白表达水平(图6中A-C)，并显著升高PPARα、CPT1αmRNA和蛋白的表达水平(图6中A-C)。实验结果表明，miR-142-3p具有调节肝细胞脂代谢的作用。
5.4miR-142-3p靶向ACSL4调节大鼠BMSCs肝样分化细胞脂代谢
在BMSCs定向分化肝样细胞模型上，转染miR-142-3p mimics，并过表达ACSL4，观察其对脂代谢关键基因表达的影响。结果如图7所示。与对照组比较，过表达ACSL4能够显著升高BMSCs定向分化肝样细胞中SREBP1、FASN、ACC等脂质合成关键因子的表达水平(图7中A-C)，同时显著降低PPARα、CPT1α的表达水平(图7中A-C)；然而，运用miR-142-3pmimics处理后能够明显逆转ACSL4过表达所致BMSCs定向分化肝样细胞脂代谢功能改变(图7中A-C)。免疫荧光染色得到了相同的结果(图7中D)。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-142-3p和ACSL4具有相互作用(图7中E)。实验结果说明，miR-142-3p能够通过靶向ACSL4调节BMSCs肝样分化细胞脂代谢。
综上，本发明方法通过生物信息学分析筛选和验证，发现miR-142-3p能够通过靶向ACSL4调节肝细胞脂代谢，其可作为父源NAFLD的早期干预靶标。
【实施例3】用本发明模型证实过表达miR-142-3p可治疗父源非酒精性脂肪肝病
1实验动物
SPF级健康Wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：SCXK(鄂)2020-2022。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
2实验方法
雄性Wistar大鼠30只(体重260-300g)适应性喂养2周后随机分为对照组、咖啡因组(15,30,60mg/kg·d)。咖啡因组大鼠每日给予不同剂量咖啡因胃內灌注，对照组给予等容生理盐水胃內灌注。连续给药8周后与正常雌性Wistar大鼠按照雄:雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。各组的大鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，每组随机选取16只正常饮食饲养至出生后8周，通过尾静脉注射AVV8-miR-142-3p过表达腺相关病毒；将AVV8-miR-142-3p干预的雄性大鼠随机分为2组，每组8只，其中一组饲养至出生后12周，另一组饲养至出生后32周。上述实验完成后第2天，经麻醉处死动物。
3 检测指标及方法
3.1 甘油三酯含量检测
运用甘油三酯含量检测试剂盒(A110-1，南京建成)检测各组大鼠肝脏中甘油三酯的含量。取50mg新鲜肝组织按体积比1:9加入生理盐水，在冰浴条件下匀浆，2500转/min，离心10min，取上清液用于检测。首先运用甘油三酯含量检测试剂盒检测各组大鼠肝组织匀浆液中甘油三酯的含量，随后运用BCA蛋白浓度检测试剂盒(P0012，上海碧云天)检测各组大鼠肝组织匀浆液中蛋白浓度，最后运用肝组织匀浆液中每g蛋白对应的甘油三酯含量作为肝组织中甘油三酯含量。即肝脏中甘油三酯含量＝mmol/g蛋白质。
3.2苏木素-伊红染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经脱水后在石蜡包埋机中包埋；将包埋的组织蜡块切成5μm薄片，制备肝组织切片；将切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次进行脱蜡；将切片依次置于100％乙醇、95％乙醇，85％乙醇、75％乙醇中浸泡5min，蒸馏水清洗干净；将切片置于苏木精-伊红染液中浸泡30s，用蒸馏水清洗干净，然后置于1％盐酸酒精中浸泡并迅速取出，用蒸馏水清洗干净；将切片依次置于75％乙醇、85％乙醇，95％乙醇、100％乙醇中浸泡5min，置于通风橱中将残留的乙醇挥干，然后置于二甲苯溶液中浸泡5min，置于通风橱中将残留的二甲苯挥干；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜先观察染色结果。
3.3油红O染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经冰冻切片将小鼠肝组织样本切成6～8μm薄片，贴于载玻片上，并立即置于10％多聚甲醛中固定3min，蒸馏水清洗后置于-20℃保存。临用时将冻存的切片取出，室温下放置10min，置于60％异丙醇溶液中浸泡2min；将切片置于油红O染色液中染色10min，60％异丙醇溶液清洗掉多余染液，蒸馏水清洗干净；苏木精溶液复染30s，蒸馏水清洗干净；置于1％盐酸酒精中浸泡并迅速取出，蒸馏水清洗干净；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜下观察染色结果。
3.4实时荧光定量PCR实验
运用Trizol试剂提取各组小鼠肝组织中的RNA，经逆转录后得到cDNA。将cDNA、各基因上、下游引物、标记SYBR GreenI荧光染料Mix等试剂混合均匀后置于RT-qPCR仪中反应。RT-qPCR反应条件如下(反应体系为10μL)：95℃预变性2min；95℃变性10s，62℃退火30s；72℃延伸15s，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct方法计算待测目的基因mRNA的相对表达量。
4实验结果
4.1肝脏过表达miR-142-3p对PPCE雄性子代NAFLD发生的影响
结果如图8所示。与对照组比较，AVV8-miR-142-3p过表达干预能够降低PPCE雄性PW32子代肝脏ACSL4的表达，抑制肝细胞脂肪酸从头合成相关基因(ACSL4、SREBP1、FASN、ACC)的表达、升高脂质β氧化相关基因(PPARα、CPT1α)的表达水平(图8中A)。此外，与对照组比较，PW32 PPCE雄性子代大鼠肝脏呈现明显的肝细胞脂肪样变性并伴大量脂质蓄积、Kleiner评分和肝脏TG含量显著升高(图8中B-D)，而运用AVV8-miR-142-3p干预后，PPCE雄性子代(PW32)大鼠肝脏未见明显的脂肪变性和脂质蓄积、Kleiner评分和肝脏TG含量显著降低(图8中B-D)。实验结果说明，肝脏过表达miR-142-3p可逆转PPCE雄性子代成年后NAFLD发生。
综上，本发明的造模方法通过父体孕前咖啡因暴露处理，部分出生后8周的雄性子代给予AVV8-miR-142-3p腺相关病毒靶向治疗，发现运用miR-142-3p靶向治疗后可纠正父体孕前咖啡因暴露雄性子代大鼠肝脏脂代谢功能紊乱，并遏制远期NAFLD发生。说明本发明模型可用于筛选父源NAFLD的治疗药物和治疗方法，并证实过表达miR-142-3p可治疗父源NAFLD，对于临床上父源NAFLD的治疗药物开发和防治具有积极作用。
【实施例4】用本发明模型探讨父源非酒精性脂肪肝病的诱因
1实验动物
SPF级健康Wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：SCXK(鄂)2020-2022。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
2实验动物处理
雄性Wistar大鼠30只(体重260-300g)适应性喂养2周后随机分为对照组PPCE组、RU486组(RU)和PPCE+RU486组(PPCE+RU)。PPCE组大鼠每天给予60mg/kg的咖啡因胃内灌注，RU组大鼠每天给予1.0mg/kg的RU486胃内灌注、PPCE+RU组大鼠每天给予60mg/kg的咖啡因和1.0mg/kg的RU486胃内灌注，对照组给予等容量生理盐水胃內灌注。连续给药8周后与正常雌性Wistar大鼠按照雄:雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。各组的大鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
部分孕20天的母鼠经麻醉处死后收集雄性子代胎鼠肝脏样本。部分母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，每组随机选取12只正常饮食饲养至出生后32周，然后经麻醉处死动物，收集出生后32周雄性子代肝脏样本。
3小鼠精原细胞培养与处理
小鼠精原细胞GC-1运用含10％FBS、1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基(以下简称“培养基”)在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期的GC-1细胞，弃除培养瓶中的原培养基，然后加入5mL 37℃预热的PBS缓冲液清洗2次，随后加入5mL含不同终浓度咖啡因(0、0.1、1、10μM)或皮质酮(0、125、250、500nM)的培养基，然后将细胞放置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。随后收集细胞，检测miR-142-3p的表达水平和启动子区甲基化水平。探讨不同浓度咖啡因和皮质酮对精原细胞miR-142-3p表达的影响。
4检测指标及方法
4.1miR-142-3p启动子区甲基化水平检测
运用重亚硫酸盐测序(BSP)法检测miR-142-3p启动子区甲基化水平，具体的操作方法如下所示。
(1)使用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取各样本基因组。
(2)将5μg提取得到的样本基因组DNA用无酶水溶解并稀释至体积为50μL，随后加入NaOH溶液后混合均匀，42℃水浴条件下变性30min。接着，向样品中依次加入30μL 10mM的对苯二酚、520μL 3M的亚硫酸氢钠，轻轻混合混匀。最后，每个样品中加入200μL石蜡油，50℃条件下避光水浴16h。
(3)使用纯化试剂盒进行过柱纯化，回收修饰后DNA，并进行PCR扩增。
(4)PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收扩增片段。然后，将扩增片段(目的基因)与克隆载体进行重组。
(5)将感受态细胞置于冰上解冻；取10μL重组后的产物加入感受态细胞中，轻轻混合，然后置于冰上孵育30min；随后立即将感受态细胞与重组产物混合物置于42℃恒温水浴中温浴90s，然后立即放置到冰上孵育2～3min。最后，加入500μL不含抗生素的LB培养基于37℃、250rpm的条件下振荡培养45min。
(6)随后3000rpmin离心2min，弃掉上清液。
(7)将菌液轻轻吹打混合均匀，然后加入到含有氨苄抗性的培养板中，用无菌的涂布器涂匀，然后倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
(8)选择3～5个克隆转化子进行菌落PCR，确认阳性的克隆子再进行测序鉴定。
4.2甘油三酯含量检测
运用甘油三酯含量检测试剂盒(A110-1，南京建成)检测各组大鼠肝脏中甘油三酯的含量。取50mg新鲜肝组织按体积比1:9加入生理盐水，在冰浴条件下匀浆，2500转/min，离心10min，取上清液用于检测。首先运用甘油三酯含量检测试剂盒检测各组大鼠肝组织匀浆液中甘油三酯的含量，随后运用BCA蛋白浓度检测试剂盒(P0012，上海碧云天)检测各组大鼠肝组织匀浆液中蛋白浓度，最后运用肝组织匀浆液中每g蛋白对应的甘油三酯含量作为肝组织中甘油三酯含量。即肝脏中甘油三酯含量＝mmol/g蛋白质。
4.3苏木素-伊红染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经脱水后在石蜡包埋机中包埋；将包埋的组织蜡块切成5μm薄片，制备肝组织切片；将切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次进行脱蜡；将切片依次置于100％、95％、85％、、75％的乙醇中浸泡5min，蒸馏水清洗干净；将切片置于苏木精-伊红染液中浸泡30s，用蒸馏水清洗干净，然后置于1％盐酸酒精中浸泡并迅速取出，用蒸馏水清洗干净；将切片依次置于75％、85％95％、100％的乙醇中浸泡5min，置于通风橱中将残留的乙醇挥干，然后置于二甲苯溶液中浸泡5min，置于通风橱中将残留的二甲苯挥干；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜先观察染色结果。
4.4油红O染色
取10％福尔马林固定后的肝组织，经冰冻切片将小鼠肝组织样本切成6～8μm薄片，贴于载玻片上，并立即置于10％多聚甲醛中固定3min，蒸馏水清洗后置于-20℃保存。临用时将冻存的切片取出，室温下放置10min，置于60％异丙醇溶液中浸泡2min；将切片置于油红O染色液中染色10min，60％异丙醇溶液清洗掉多余染液，蒸馏水清洗干净；苏木精溶液复染30s，蒸馏水清洗干净；置于1％盐酸酒精中浸泡并迅速取出，蒸馏水清洗干净；滴加适量中性树胶封片；置于显微镜下观察染色结果。
4.5实时荧光定量PCR实验
运用Trizol试剂提取各组小鼠肝组织中的RNA，经逆转录后得到cDNA。将cDNA、各基因上、下游引物、标记SYBR GreenI荧光染料Mix等试剂混合均匀后置于RT-qPCR仪中反应。RT-qPCR反应条件如下(反应体系为10μL)：95℃预变性2min；95℃变性10s，62℃退火30s；72℃延伸15s，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct方法计算待测目的基因mRNA的相对表达量。
5实验结果
5.1皮质酮(而非咖啡因)介导精原细胞miR-142-3p启动子区高甲基化及低表达
MiRNAs及其甲基化修饰是生殖细胞重编程过程中关键的表观遗传标记，可将父体经历不良环境的“印记”传递至子代。研究发现，父体慢性应激能够通过高糖皮质激素导致精子表观遗传修饰改变，从而编程子代肝脏糖代谢功能异常，提示高糖皮质激素可能是父源代谢性疾病发生的重要机制。因此，在本研究中，本发明首先检测了亲代雄性大鼠血清皮质酮含量、睾丸糖皮质激素受体(GR)表达水平及精子miR-142-3p启动子区甲基化水平。结果如图9所示。与对照组比比较，PPCE组亲代血清皮质酮含量和睾丸GR mRNA表达水平均显著升高(图9中A，B)，精子miR-142-3p启动子区甲基化水平明显升高(图9中C)。进一步，本发明在体外运用不同浓度咖啡因(0、0.1、1、10μM)或皮质酮(0、125、250、500nM)处理小鼠精原细胞，以确定精子miR-142-3p表达降低的原因。结果显示，与CON组比较，不同浓度咖啡因处理对精原细胞miR-142-3p表达无显著性影响(图9中D)，而不同浓度皮质酮处理后则能够显著降低精原细胞miR-142-3p表达水平(图9中E)，并升高miR-142-3p启动子区甲基化水平(图9中F，G)。实验结果表明，皮质酮(而非咖啡因)编程了PPCE父体精子miR-142-3p的高甲基化。
5.2RU486干预逆转PPCE所致雄性子代大鼠出生前后肝脏脂代谢功能紊乱
进一步，本发明在整体动物水平运用GR拮抗剂RU486同步干预PPCE大鼠，以确证父体高糖皮质激素介导PPCE雄性子代肝脏脂代谢功能改变的编程机制。结果如图10所示。与对照组比较，GD20和PW32时PPCE组肝脏miR-142-3p启动子区甲基化升高而表达降低(图10中A-D)，肝脏脂质合成功能基因表达增加而β氧化功能基因表达降低(图10中E，F)，同时肝脏脂质蓄积和TG含量增加(图10中G-I)。然而，RU486干预能够明显逆转PPCE所致雄性子代出生前后的上述变化(图10)。实验结果表明，高糖皮质激素暴露通过活化GR介导了PPCE所致雄性子代肝脏脂代谢功能改变。
综上，本发明方法证实皮质酮(而非咖啡因)可致精子miR-142-3p高甲基化而低表达，进而导致子代肝脏miR-142-3p高甲基化而表达降低，引起肝脏脂代谢功能紊乱，最终导致成年NAFLD发生。因此，应用本发明所述的模型阐明父源非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的诱因，对于解析父体孕前慢性应激状态对子代远期代谢健康的影响和指导育龄男性生育期健康生活具有重要的现实意义。
Claims (9)
1.一种父源非酒精性脂肪性肝病的动物模型构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
S1：选取健康的雄性啮齿类动物，每日给予不同剂量即15、30、60mg/kg咖啡因胃內灌注，雄性啮齿类动物自由饮食、饮水；
S2：雄性啮齿类动物连续8周每日胃內灌注不同剂量咖啡因后与正常雌鼠交配受孕；
S3：上述步骤S2的部分孕鼠于孕20天取胎鼠肝脏；部分孕鼠自然生产，获得F1代子代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性子代各6只进行哺乳喂养，子代出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分雄性子代继续正常饮食饲养至8/32周龄取血与肝脏；
S4：在上述步骤完成后，检测不同时间点即孕20、出生后32周子代肝脏脂代谢相关指标来综合判定非酒精性脂肪性肝病；最终得到父源非酒精性脂肪性肝病动物模型。
2.根据权利要求1所述的父源非酒精性脂肪性肝病的动物模型构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，啮齿类动物为大鼠、小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的父源非酒精性脂肪性肝病的动物模型构建方法，其特征在于：所述步骤S3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。
4.根据权利要求3所述的父源非酒精性脂肪性肝病动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S4中，肝脏脂代谢检测相关指标是：血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力、肝脏甘油三酯含量、苏木素-伊红染色、油红O染色、Masson染色和天狼星红染色。
5.一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型在筛选抗父体潜在发育毒性环境干扰物或药物中的应用，其特征在于：所述动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。
6.一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型在筛选父源非酒精性脂肪性肝病早期干预靶标中的应用，其特征在于：所述动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。
7.一种父源非酒精性脂肪性肝病早期干预靶标，其特征在于：所述干预靶标为miR-142-3p。
8.一种父源非酒精性脂肪性肝病动物模型在筛选/制备防治非酒精性脂肪性肝病治疗制剂中的应用，其特征在于：所述父源非酒精性脂肪性肝病动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述父源非酒精性脂肪性肝病治疗制剂包括：miR-142-3p腺病毒、miR-142-3p慢病毒。
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