KR20220041179A - 알츠하이머병의 표적으로 tpk 적용 - Google Patents

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천지우 중
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상하이 레이징 파마수티컬 씨오., 엘티디.
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Abstract

알츠하이머병 치료의 표적으로서 티아민 피로포스포키나아제 TPK의 용도가 제공되며. 억제된 TPK로 인한 AD 증상은 TPK를 표적으로 하여 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진함으로써 예방될 수 있다.

Description

알츠하이머병의 표적으로 TPK 적용
본 출원은 "동물 모델의 제작 방법 및 해당 모델의 활용"라는 명칭으로 2019년 8월 2일에 출원된 중국특허출원 201910711540.3, "알츠하이머병의 표적으로 TPK 용도"라는 명칭으로 2020년 1월 14일에 출원된 중국특허출원 202010038537.2를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 의학 분야, 특히 알츠하이머 병의 표적으로서 TPK의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer’disease, AD)은 인지 및 기억의 만성 및 진행성 퇴행 및 성격 변화를 주로 특징으로 하는 가장 흔한 유형의 치매이다. 2015년까지 전 세계적으로 5천만 명 이상의 알츠하이머병 환자가 있었고 발병률은 65세 이상의 사람들의 연령에 따라 증가하였다. 전 세계적인 고령화 진행의 지속적인 발전과 함께 알츠하이머병은 사회와 가족에게 막대한 경제적, 정신적 부담을 안겨주고 있다.
AD는 신경 세포의 손실, 신경교 세포의 활성화, 아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta-protein, Aβ)의 세포외 침착에 의해 형성된 특징적인 노인성 전염병(senile plagues), 및 세포 내 타우 단백질(Tau protein)의 과인산화로 인한 신경섬유 엉킴 등을 포함하는 다양한 병태생리학적 변화가 있는 질병이다. 또한, 시냅스 소실, 대뇌 글루코스 대사 장애, 산화 스트레스 등도 AD 뇌의 지속적인 병리학적 변화이며, 환자의 대뇌 글루코스 대사의 감소는 인지 장애와 밀접한 관련이 있다.
발병 기전이 불분명하기 때문에 AD의 효과적인 치료 방법은 아직 부족하다. 고전적인 "Aβ 캐스케이드 가설(Aβ cascade hypothesis)"은 항상 AD 발병을 설명하는 가장 주류 이론이다. 이를 바탕으로, 다양한 형질전환 동물모델이 개발되고 의약품 개발을 위한 실험이 이루어지고 있으나 모두 현재 임상 2상/3상에서 종료되거나 실패하였다. 타우 단백질의 비정상적인 축적을 억제하는 것과 같은 다른 새로운 약물들도 원하는 결과를 얻지 못하였다. AD 메커니즘과 약제에 대한 연구의 진행을 제한하는 여러 가지 요인이 있으며, 그 중 약제의 표적을 선정하는 것이 먼저이다. AD는 다양한 병태생리학적 변화가 있는 질환으로, 단일 표적에 대한 약제로는 질병의 진행을 완전히 막을 수 없으며, 새로운 치료 표적의 개발이 필요하다. 또한, 기존의 AD 연구 동물 모델은 주로 유전적 배경에 기반하여 확립되었으며, 보다 정확하게는 AD에 대한 동물 모델이 아닌 Aβ 캐스케이드 가설의 모델이며 AD 뇌의 여러 병태생리학적 변화를 완전히 모의할 수 없으며, 기존 동물모델에서 효과가 검증된 약제는 임상시험에서 기대한 결과를 얻지 못했다. 현재 AD에 적합한 동물 모델을 찾는 것이 시급한 문제이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 특정 실시양태는 알츠하이머병을 치료 또는 예방하는 신규 표적으로서 TPK의 용도를 제공하며, 이의 특정 기술 솔루션은 다음과 같다:
알츠하이머병 치료 또는 예방의 표적으로 TPK 유전자 또는 단백질의 용도.
선택적으로, TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 하여, 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준이 촉진된다.
알츠하이머병 예방 또는 치료용 약제, 또는 상기 약제의 스크리닝 또는 조제에서 표적으로서 TPK 유전자 또는 단백질의 용도.
선택적으로, TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 상기 약제는 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진한다.
알츠하이머병 예방 또는 치료용 약제의 제조에서 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 시약의 용도.
선택적으로, 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 시약은 TPK 단백질을 조절하는 시약 및/또는 TPK 유전자를 조절하는 시약이다.
TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약제는 뇌에서 TPK 단백질의 키나아제 활성 및/또는 발현 수준을 촉진한다.
알츠하이머 병의 동물 모델 제작에서 표적으로 TPK 유전자 또는 단백질의 용도.
동물 모델의 제작 방법으로서, 상기 동물 모델은 표적 동물에서 TPK 유전자 녹아웃에 의해 제작된다.
선택적으로, 상기 표적 동물은 설치류이다.
선택적으로, 상기 설치류는 마우스이다.
선택적으로, 상기 TPK 유전자의 엑손4는 녹아웃된다.
선택적으로, 상기 방법은 유전자 녹아웃을 위한 표적 벡터 TPK-loxp를 제작하는 단계; 표적 동물에 표적 벡터를 도입하여 TPK-loxP+/+ 표적 동물을 얻는 단계를 포함한다.
선택적으로, 상기 표적 벡터의 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
선택적으로, 상기 방법은 TPK-loxP+/+ 표적 동물을 CamK2α-Cre/ERT2+/- 표적 동물과 교배시켜, TPK 유전자의 조건부 녹아웃이 있는 CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ 표적 동물을 얻는 단계를 추가로 포함한다.
비-질병-치료 목적의 신경퇴행성 질환 연구에서 동물 모델의 구축을 위한 상기 방법으로 얻은 동물 모델의 용도.
선택적으로, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이다.
동물 모델용 표적 벡터 제작 방법은 박테리아 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome)를 벡터로 사용하며, 네오마이신 내성 유전자 서열과 함께 TPK 유전자의 엑손에 상동인 서열 양 말단에 직접 loxP 서열을 삽입한다.
선택적으로, 상기 엑손은 엑손4이다.
선택적으로, 상기 표적 벡터의 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
동물 모델용 표적 벡터 제작을 위한 상기 방법에 의해 구축된 표적 벡터.
본 발명은 AD에 대한 신규 치료 표적을 제공하며, 본 발명의 특정 실시양태는, 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진함으로써, 티아민 대사 장애, 포도당 대사 장애, 인지 퇴행 유발, 뉴런 소실, 신경교 세포 활성화, 시냅스 기능 장애, Aβ 침착 증가, Tau 단백질의 비정상적인 인산화 증가 등과 같은 TPK 단백질 수준 억제로 인한 알츠하이머병 증상 치료 또는 예방한다. AD 연구를 위한 기존 동물 모델의 한계와 현재 티아민 결핍 동물 모델의 단점과 관련하여, 본 발명의 특정 실시양태의 동물 모델의 제작 방법은 TPK 유전자 녹아웃에 의해 새로운 대뇌 티아민-결핍 동물 모델을 제작하고, 대뇌 포도당 대사의 감소를 유도하여 인지 퇴행 유발, 뉴런 소실, 신경교 세포 활성화, 시냅스 기능 장애, Aβ 침착 증가, Tau 단백질의 비정상적인 인산화 증가 등을 야기할 수 있다. 상기 동물 모델은 AD-유사 만성, 다중 병태생리학적 변화를 시뮬레이션할 수 있으며, AD 발병 및 발달에서 TDP 결핍 및 포도당 대사 장애의 역할 뿐만 아니라 AD의 병태생리학적 변화 간의 상관관계를 연구하는 데 사용할 수 있으며, AD 연구의 확장, AD 병태생리학적 조사, 질병 진단을 위한 새로운 분자 마커 및 약제용 치료 표적 모색 등에 매우 중요한 과학적 의의와 응용 가치가 있다.
알츠하이머병 환자는 뇌에 다단계 병태생리학적 변화가 있으며, 여기서 대뇌 포도당 대사 장애는 일관된 병리학적 특징이며, 인지 퇴행과 밀접한 관련이 있으며 임상 증상보다 수년 전에 나타난다. 포도당은 뇌에서 세포의 1차 에너지 기질이며, 포도당 대사의 중간 산물은 또한 신경전달물질 합성을 위한 기질을 제공한다. 대뇌 포도당 대사는 주로 두 가지 과정을 포함하며, 이는 각각 막횡단 수송과 포도당의 세포내 대사이다. 알츠하이머병 환자의 세포내 포도당 이용 장애는 주로 포도당 대사에서 주요 효소의 활성 감소, 즉 트랜스케톨라제(transketolase), 피루브산 탈수소효소(pyruvate dehydrogenase) 및 α-케토글루타레이트 탈수소효소(α-ketoglutarate dehydrogenase)의 활성 감소에 의해 야기된다. 티아민의 주요 활성 형태인 티아민 디포스페이트(Thiamine diphosphate, TDP)는 이러한 세 가지 핵심 효소의 공통 조효소이며 포도당 대사에서 중요한 역할을 한다. 상기 3가지 핵심 효소의 감소 활성과 TDP의 현저한 결핍은 알츠하이머병 환자에서 특이적이고 보편적이며, 혈관성 치매, 전두측두엽 치매 및 파킨슨병 환자에게는 나타나지 않는다. 티아민 피로포스페이트(TPK)는 TDP 합성의 핵심 효소일 뿐만 아니라, 뇌에서 TDP 수준의 항상성을 유지하는 중요한 요소이다. 본 발명의 발명자는 추가 연구를 통해 TDP 결핍으로 인한 대뇌 포도당 대사의 감소가 AD의 발생과 연관되고, AD가 TPK 단백질의 발현과 연관됨을 발견하였다. 또한, TPK 유전자 녹아웃에 의한 뇌의 TPK 단백질 수준 억제는 명백하게 티아민 대사 장애, 포도당 대사 장애를 유발할 수 있으며, 더 중요하게는 놀랍게도 AD-유사 신경퇴행성 질환, 뇌위축증, Aβ 및 타우의 병리학적 변화, 신경염증 및 신경혈관 장애를 유발할 수 있다. 따라서 TPK 유전자 또는 단백질은 AD에서 매우 중요한 역할을 하므로 AD 치료 및 예방의 새로운 표적이다. TPK 단백질 억제에 의한 AD는 TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 하여 뇌에서 TPK 단백질의 키나아제 활성 및/또는 발현량을 촉진시켜 예방할 수 있다. 상기 표적 동물에서 TPK 유전자 녹아웃에 의한 동물 모델 제작 방법으로 얻어진 동물 모델은 퇴행성 신경 질환 연구, 특히 질병-치료 및 비-질병-치료 목적을 위한 연구를 포함하여 알츠하이머병 연구에 활용될 수 있다. 동물 모델에서 비-질병-치료를 위한 연구는 구체적으로, 예를 들어, 1) 신경퇴행성 질환의 메커니즘 조사 및/또는 연구; 2) 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있는 제품의 준비 및/또는 스크리닝; 3) 신경퇴행성 질환을 진단 및/또는 제안할 수 있는 분자 마커를 찾고 확인하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 뇌에서 TPK 단백질의 발현 수준의 촉진은 TPK 단백질의 발현 억제 예방, TPK 단백질 발현 수준 증가, TPK 단백질 활성 증가 또는 TPK 단백질 안정성 증가를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 뇌에서 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 시약은 TPK 단백질을 조절하는 시약일 수 있고, 또한 TPK 유전자를 조절하는 시약일 수 있다. 상기 시약에는 뇌에서 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하기 위한 촉진제, 작용제, 활성화제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시약은 화합물, 화학 소분자, 생체 분자, 구체적으로 예를 들어, TPK 결합 단백질, TPK에 대한 화학적 작용제 또는 TPK를 변형시키는 효소 등과 같은 TPK 단백질을 조절하는 시약, TPK 유전자의 복제 또는 전사를 활성화하는 물질, TPK 유전자의 발현을 증가시키는 물질, TPK 유전자의 프로모터를 촉진하는 상향 조절제, TPK 유전자의 특이적 과발현을 위한 단백질과 같은 TPK 유전자를 조절하는 시약 등일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 약제는 뇌에서 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 시약의 안전하고 효과적인 용량 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 상기 약학적 제형은 일반적으로 투여와 일치하며, 제형의 투여 형태는 주사제, 경구 제형(정제, 캡슐제, 경구 용액), 경피 제형 또는 서방성 제형일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 표적 동물은 영장류 또는 설치류 등, 추가로 마우스를 포함하는 비-인간 동물이다. 상기 방법은 TPK 유전자의 엑손4가 녹아웃되고, 마우스의 경우, TPK 유전자는 총 9개의 엑손을 가지고 있고, ATG는 엑손2에 위치하고, 종결코돈은 엑손9에 위치하며, 엑손4는 녹아웃의 표적으로 선택되고, 한편으로, 상기 녹-아웃된 엑손 서열은 3의 정수배가 아니고, 다운스트림 리딩 프레임(downstream reading frame)에서 프레임시프트 돌연변이를 야기할 수 있고; 한편, 상기 선택된 엑손이 번역 개시 부위에 가까울수록 유전자의 기능이 덜 유지될 수 있다.
변형된 Cre-loxP 재조합효소 시스템을 사용하여 TPK 유전자의 조건부 녹아웃에 대한 동물 모델을 확립할 수 있는 본 발명의 특정 실시양태는 하기 단계를 포함한다: TPK-loxP 유전자 녹아웃을 위한 표적 벡터를 구성하는 단계, 표적 동물에 표적 벡터를 도입하여 TPK-loxP+/+ 표적 동물을 얻는 단계, TPK-loxP+/+ 표적 동물과 CamK2α-Cre/ERT2+/- 표적 동물을 교배시키는 단계, TPK 유전자의 조건부 녹아웃이 있는 CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ 표적 동물을 획득하는 단계. 특히, 박테리아 인공 염색체가 벡터로 사용될 수 있고, 직접적인 loxP 서열 및 네오마이신 내성 유전자의 서열이 적합한 엑손의 상동 서열의 측면에 삽입될 수 있고; 상기 표적 벡터는 전기변환에 의해 배아 줄기(ES) 세포로 형질전환되고; 올바른 사이트에 있는 올바른 서열로 형질전환된 ES 세포는 항생제 내성, PCR 및 서던 블롯에 대한 스크리닝에 의해 식별되고; 상기 양성 클론은 표적 동물의 배반포에 미세주입되며; 성공적으로 주입된 배반포를 표적 동물의 자궁에 이식하여 ES 세포와 통합된 키메라 표적 동물을 생산하고; 상기 수득된 키메라 표적 동물을 Flp 도구 표적 동물과 교배시켜, 유도에 의해 네오마이신 내성 유전자의 서열을 절단하고, 정제시 녹아웃 전위를 갖는 TPK-loxP+/+ 표적 동물을 수득할 수 있고; 돌연변이 에스트로겐 수용체 요소(mutant estrogen receptor element, LBD-ER)와 조합된 CamK2α를 갖는 Cre 도구 표적 동물은 상기 TPK-loxP+/+ 표적 동물과의 교배를 위해 선택되었으며; 식별 시 안정적으로 유전되는 CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ 표적 동물을 얻는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 박테리아 인공 염색체를 벡터로 사용하는 동물 모델용 표적 벡터의 제작 방법이 제공되며, 네오마이신 내성 유전자 서열과 함께 TPK 유전자의 엑손에 상동인 서열의 양 말단에 직접 loxP 서열이 삽입된다.
본 발명의 동물 모델에 대한 표적 벡터의 제작 방법의 특정 실시양태에서, 상기 엑손은 엑손4이고 다음 표적 서열이 제작된다: "5'-homologous arm-loxP-exon4-frt-Neo-frt-loxP-homologous arm-3'"
본 발명의 동물 모델에 대한 표적 벡터의 제작 방법의 특정 실시양태에서, 상기 표적 벡터의 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 또한 상기 동물 모델에 대한 표적 벡터의 제작 방법에 의해 수득된 동물 모델에 대한 표적 벡터가 제공된다.
본 발명의 실시예 또는 선행기술의 기술적 해결방안을 보다 명확하게 설명하기 위하여, 실시예에서 사용되는 도면을 간략히 제시하면 다음과 같다.
도 1은 실시예 1의 TD 모델 마우스의 뇌, 혈액, 간 및 신장에서 TDP, TMP 및 TM 수준의 비교를 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 PTD 모델 마우스의 뇌, 혈액, 간 및 신장에서 TDP, TMP 및 TM 수준의 비교를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에서 정상 마우스의 뇌 및 혈액, 간 및 신장에서 TPK 효소의 활성을 비교한 것이다.
도 4는 실시예 2에서 사용된 표적 벡터의 플라스미드 맵을 나타내며, 여기서 NotI는 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 표적 사이트이며, 3'arm과 5'arm은 엑손4 옆에 있는 상동 서열이고, Neo 카세트(Cassette)는 네오마이신 내성 유전자 코딩 서열이고, loxP 서열은 녹아웃될 단편을 찾고 표적화하기 위한 것이고, Frt는 Flp가 Neo 서열을 자르기 위한 인식 사이트이다.
도 5는 실시예 2의 CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ 마우스의 제조를 위한 간략한 흐름도를 나타내며, 여기서 1은 수득된 표적 벡터의 배아 줄기 세포로의 전기-형질전환(electro-transformation)이고; 2는 올바른 양성 클론을 선택하는 것이며, 3은 Flp 마우스와 교차하여 Neo 서열을 제거하고 CamK2αCamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ mice 마우스를 얻는다.
도 6은 TPK 및 TDP 발현에 대한 TPK 유전자 녹아웃의 영향을 나타낸 것으로, 상기 실험에서 비교 마우스 모델을 나타내었으며, 여기서 WT 마우스는 TPKfl/fl 마우스, 즉 TPK-loxP+/+ 마우스이고, CamkII-KO 마우스는 CamK2α-Cre/ERT2+/-이고; Tpk-loxP+/+ 마우스는 TPK 녹아웃 마우스이다; b는 TPK-flox 마우스의 유전자 녹아웃 구조를 나타내고, c-d는 CamkII-KO 마우스와 WT 마우스에서 TPK 효소의 발현 수준을 비교한 것을 나타내고, e-f는 CamkII-KO 마우스와 WT 마우스에서 TDP, TMP 및 TM 수준의 비교를 나타내고, g-i는 CamK2α-Cre/ERT2+/- 마우스와 루시페라제 리포터 마우스(luciferase reporter mice) Ai9를 교배하여 얻은 CamK2α-Cre/ERT2+/-를 나타내며, Cre는 Ai9 마우스의 피질과 해마에서 주로 발현되지만 소뇌와 뇌간에서는 발현되지 않는다.
도 7은 실시예 2에서 토막시펜(Tomaxifen) 유도 TPK 유전자 녹아웃 1, 2, 2.5개월 후의 FDG-PET 시험, 내당능 장애 및 체중 및 공복 혈당 변화의 결과를 나타낸 것으로, 여기서, a-f는 토막시펜 유도 TPK 유전자 녹아웃 후 1, 2, 2.5개월 후 뇌 영역의 포도당 대사 변화에 대한 FDG-PET 평가이고, g-j는 토막시펜 유도 TPK 유전자 녹아웃 후 1, 2, 2.5개월 후 내당능 장애이며, k-l은 토막시펜 유도 TPK 유전자 녹아웃 1, 2, 2.5개월 후 체중 및 공복 혈당의 변화이다.
도 8은 실시예 2에서 TPK 유전자 녹아웃 후 글리코라이시스(glycolysis) 및 트리카르복실산 사이클 장애(tricarboxylic acid cycle disorder)의 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 2에서 TPK 유전자 녹아웃 전후의 병리학적 시험 결과를 나타내며, 여기서, a-c는 TPK 유전자-녹아웃 마우스의 피질 표면적 및 체중의 변화를 나타내고; d는 TPK 유전자-녹아웃 마우스에서 뉴런의 변화를 나타내고; e는 TPK-녹아웃 마우스에서 Tunel-양성 세포의 변화 결과를 나타내고; f는 TPK-녹아웃 마우스에서 Y-미로 평가의 인지 장애 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 2에서 TPK 유전자 녹아웃 전후에 유발된 Aβ 및 tau의 병리학적 변화 결과를 나타내며, 여기서, a-c는 TPK 유전자 녹아웃 전후의 Aβ40/Aβ42 비율뿐만 아니라 가용성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42 수준의 ELISA 검출을 나타내고; d-e는 WB 및 RT-PCR 검출에 의한 TPK 유전자 녹아웃 전후의 해마 및 피질에서 APP 및 Bacel의 단백질 발현 수준 및 mRNA 수준의 변화를 나타내고; f는 면역형광 염색 검출에 의한 TPK 유전자 녹아웃 전후의 피질 및 해마의 인산화된 Tau 수준의 변화를 나타낸다.
도 11은 실시예 2에서 TPK 유전자 녹아웃 전후에 유발된 신경염증 반응 및 혈관 기능장애 결과를 나타낸 것이며, 여기서, a-d는 IHC 검출에 의한 TPK 유전자 녹아웃 전후의 마우스 피질 및 해마에서 미세아교세포 및 성상교세포의 활성화 및 증식을 나타내고; e-f는 RT-PCR 검출에 의한 TPK 유전자 녹아웃 전후의 마우스 해마 및 피질에서 Ibal 및 GFAP mRNA 수준을 나타내고; g-j는 면역형광 염색 검출에 의한 TPK 유전자 녹아웃 전후의 마우스 피질 및 해마에서 혈관 형태(blood vessel morphology) 및 혈관 IgG 누출을 나타낸다.
도 12는 실시예 3의 TPK 과발현 플라스미드를 나타낸다.
도 13은 실시예 3에서 24시간 및 48시간 후 HEK293-APP 세포주에서 TPK 과발현 플라스미드 및 이의 대조군의 WB 검출 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예에 비추어 추가로 예시된다.
실시예 1
실험은 각각 단순 티아민 식이 결핍(Thiaminediet-deprivation, TD) 모델과 티아민 식이 결핍과 피리티아민 주사(pyrithiamine injection, PTD) 모델의 조합으로 수행되었다. TD 및 PTD 모델의 동적 변화가 뒤따랐다. 비교를 위해 TD 11일, 18일, 26일 및 PTD 7일, 11일을 포함하는 6개 그룹(n=4)을 설정하였다. 같은 날 태어나 비슷한 체중을 가진 3개월 된 C57 마우스를 선택하였다. 그룹화에 따라 모델링을 시작하는 시점을 다르게 선택하였고, 최종적으로 상기 샘플링과 같은 날 모델링을 완료하였다. TD 모델: 일반 식수 및 티아민-결핍 식이(Thiamine-deficient diet)으로 각각 11일, 18일 및 26일 동안 모델링; PTD 모델: 일반 식수, 티아민-결핍 식이 및 500ug/(kg·용량의 0.1mg/mL PT(피리티아민(pyrithiamine)) 매일 복강 내 주사로 각각 7일 및 11일 동안 모델링; 대조군: 일반 식수, 일반 사료, 생리식염수 복강 내 주사. 상기 모델링이 완료되면, 상기 마우스를 이소플루란(isoflurane)을 흡입하여 마취하였고, 눈을 제거하였고, 상기 혈액을 헤파린 항응고제가 포함된 튜브에 샘플링한 다음, 혼합을 위해 빠르게 뒤집었다. 동일한 부피의 7.5% PCA를 150uL 전혈에 첨가하고, 이를 볼텍싱하여 혼합하였다. 상기 마우스를 얼음 위에서 경추 탈구시키고 신속하게 희생시키고, 뇌, 신장, 간 조직 등을 샘플링하고 무게를 잰다. 상기 조직의 무게를 기록하였다. 상기 조직은 조직(mg):KH2PO4(uL)=100:900의 비율로 KH2PO4와 혼합되었으며, 티슈 그라인더로 70Hz에서 90초간 분쇄하고 30분 동안 완전히 분쇄한 후 얼음 수조(ice bath)에 두고 사용할 때까지 -80℃에 보관한다. TDP, TMP 및 TM(티아민) 수준은 고성능 액체 크로마토그래피로 측정하였다. TD 및 PTD 모델에서, 마우스의 뇌, 혈액, 간 및 신장에서 TDP, TMP 및 TM 활성의 비교를 도 1 및 도 2에 나타내었으며, 정상 마우스의 뇌, 혈액, 간 및 신장에서 TPK 활성의 비교를 도 3에 나타내었다.
상기 실험에 따르면, TD 모델에서 혈액, 간 및 신장과 비교하여 TDP 수준의 현저하게 느린 감소가 뇌에서 나타나는 특징이 발견되어 뇌에서 TDP 손실에 대한 보호를 나타낸다(도 1 참조). PTD 모델에서, TPK에 대한 특정 억제제인 PT는 신체의 TDP, 특히 뇌의 TDP 수준의 항상성을 손상시킬 수 있다(도 2 참조). 정상 마우스의 다른 조직에서 티아민 피로포스포키나아제(Thiamine pyrophosphokinase, TPK) 활성을 추가로 검출한 결과 TPK 활성이 뇌에서 가장 높았으며(도 3), 이는 뇌 조직에 특이적인 TPK의 높은 활성이 뇌에서 TDP 항상성을 유지하는 열쇠라고 추정할 수 있다.
실시예 2
1. 표적 벡터(targeting vector)의 구성
박테리아 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)를 벡터로 사용하고 엑손4 옆에 상동 팔로 인트론을 사용하여 구성된 표적 서열 "5’arm-loxP-exon4-frt-Neo-frt-loxP-homologous arm-3'"가 삽입되어 유전자 녹아웃을 위한 표적 벡터를 구성한다(도 4 참조).
2. CamK2α-Cre/ERT2+/-의 구성; TPK-loxP+/+ 마우스의 구성(도 5 참조)
TPK-floxP+/- 배아줄기세포(embryonic stem cell) 획득 및 스크리닝
(1) 마우스 배아줄기(ES) 세포의 제조
ES 세포를 해동하기 전날 0.1% 젤라틴을 처리한 디쉬에 세포영양막(trophoblasts)인 1차 마우스 배아 섬유아세포를 접종하여 LIF가 1000U/mL 농도로 첨가된 세포 배양액에서 배양하였다.
(2) ES 세포의 전기-변형(Electro-transformation)
① ES 세포를 판크레아틴(pancreatin)으로 분해한 다음, PBS(약 2*107/mL)에 재현탁하고 얼음 위에 놓았다.
② 선형화된 표적 벡터(45ug)를 1mL 셀과 혼합하고, 전기천공 탱크(electroporation tank)에 로딩하고, 600V, 25uF, 10ms의 매개변수로 전기 변환하였다.
③ 전기-변형 후 세포를 완전 컨플루언시(full confluency)의 영양막이 있는 접시에 접종하고 37℃ 인큐베이터에 넣고 G418(280ug/mL)을 함유하는 세포 스크리닝 브로쓰를 24시간 후 교체를 위해 첨가하였다.
(3) ES 양성 클론의 픽업(Picking up) 및 증폭
클론의 선택은 배양 후 수일 후에 시작되었으며, 단일 미분화 ES 클론을 저-배율 현미경으로 선택하고 다음 배양을 위해 96웰 플레이트에 넣었으며; 각 클론을 두 개로 나누어 하나는 동결보존하고 다른 하나는 증폭 및 계대배양을 위해 24-웰 플레이트로 패시징(passaging)하였다.
(4) 표적화된 ES 세포의 PCR 및 서던 블롯 식별
G418에 내성이 있는 양성 클론을 선택하여 증폭하고, 게놈 DNA를 추출하고, 효소적으로 소화하고, 아가로스 겔로 전기영동 밴드를 분석하였다. 그런 다음 서던 블롯(Southern blot)은 Tpk exon4의 5' 및 3' 말단을 표적으로 하는 프로브로 수행되었으며, 식별은 대조군과 표적화된 ES 세포 사이의 구별되는 밴드에 따라 수행되었다. 그 중,
PCR 식별을 위한 프라이머는 하기와 같다:
Figure pct00001
서던 블롯을 위한 5' 및 3' 프로브를 준비하기 위한 프라이머는 하기와 같다:
Figure pct00002
배반포 미세 주입(blastocyst microinjection)에 의한 TPK-floxP 키메라 마우스의 구성
(1) 마우스 배반포의 분리
4주령 C57BL/6 암컷 마우스를 선택하고, 정오에 10 IU 성선자극호르몬(gonadotropin)을 복강내 주사하였다. 48시간 후에 10 IU 인간 융모막 성선 자극 호르몬을 주입하였고, 암컷 마우스를 수컷 마우스와 함께 우리에 가두었다. 다음날 아침, 암컷 마우스의 질마개를 확인하고(0.5일로 기록), 질마개가 있는 암컷 마우스를 3일 후 희생시켰으며, 자궁을 적출하고 배반포를 BMOC-3 브로쓰(broth)로 헹구어 냈다. 상기 배반포를 미네랄 오일로 덮인 60mm 접시에 적하 브로쓰에 옮겼다. 상기 미세주입은 포배강(blastocoele)이 확장된 후 수행되었다.
(2) 배반포 미세주입
미세주입용 홀딩피펫과 주입피펫을 준비하였다. 주입 3시간 전에 주입을 위해 ES 세포에 대한 교체를 위해 신선한 브로쓰를 첨가하였다. 단일-세포 현탁액은 판크레아틴 소화 시 제조되었다. 밝은 표면을 가진 작고 둥근 ES 세포가 주입을 위해 선택되었으며, 각 배아에 약 12~15개의 ES 세포를 주입하였고, 주입된 배반포는 일반적으로 1시간 배양 후 정상적인 형태를 회복하였으며, 완전한 형태를 갖는 배반포가 이식을 위해 선택되었다.
(3) 배반포 이식
가임신한 마우스의 준비: 흰색 Kunming 품종의 암컷 쥐를 혈관 이완된 수컷 쥐와 교배하고, 다음날(0.5일로 기록) 질 플러그존을 확인하였다. 상기 가임신한 마우스는 이틀 후 배아 이식에 사용할 수 있다. 상기 가임신한 마우스를 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취하고, 10개의 주입된 배반포를 편측 자궁으로 옮기는 등 수술을 실시하였다. 외과적 이식이 성공하면 17일 후에 신생아 마우스가 태어날 수도 있고, 며칠 후 머리 색깔에 따라 육안으로 판별이 가능하며, 표적화된 ES 세포가 통합된 TPK-floxP 키메라 마우스를 얻었는지 여부 및 전체 모발에 대한 갈색 모발의 비율에 따라 키메라 정도를 추정하였다.
TPK-loxP+/+ 키메라 마우스 획득
얻어진 TPK-floxP 키메라 마우스를 Flp 도구 마우스와 교배시켰고, Flp 도구 효소는 Frt 부위에서 Neo 서열의 절단을 유도할 수 있고, 녹아웃 전위를 갖는 Tpk-loxP+/+ 동형 접합 마우스는 정제시 수득될 수 있다.
CamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ 마우스 획득
(1) Tpk-loxP+/+ 마우스는 상기-언급된 조작에 의해 얻어지고 Tpk 녹아웃을 달성할 수 있음이 확인되었다;
(2) Tpk-loxP+/+ 마우스를 CamK2α-Cre/ERT2+/- 마우스와 교배하여 CamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ 마우스를 얻었으며, 이는 유전적으로 확인된 후 번식한 것입니다.
식별용 프라이머:
Figure pct00003
조건부 TPK 유전자 조건부 녹아웃을 보유한 마우스의 표현형
TPK 유전자 녹아웃은 피질과 해마에서 특이적으로 CamkII-Cre/ERT2+/- 마우스와 교배하여 달성되었고, TPK 유전자 녹아웃을 유도하기 위해 3개월령 마우스에 Tomaxifen을 복강 내 주사하였다. TPK 유전자가 녹아웃된 마우스의 표현형 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 6-11에 나타내었다.
도 6을 참조하면, 대뇌 TPK 단백질 수준 및 TDP 수준은 티아민(thiamine) 수준에 영향을 미치지 않고 토막시펜 유도 TPK 유전자 녹아웃 후 2.5개월 후에 유의하게 감소될 수 있다. 도 7을 참조하면, 토막시펜이 TPK 유전자 녹아웃을 유도한 후 각각 1, 2, 2.5개월 후에 FDG-PET를 수행하였고, 이는 혈당 분석 및 내당능 검사에 의해 발견되었으며, TPK 녹아웃 마우스는 상당한 대뇌 포도당 대사 장애, 말초 포도당 항상성 및 포도당 내성 장애를 나타냈다. 도 8을 참조하면, 대사학적 연구는 TPK 유전자 녹아웃이 해당과정 및 트리카르복실산 회로 장애를 유발하는 것을 입증하였다. 도 9를 참조하면, 병리학적 검출은 TPK 유전자 녹아웃이 현저하게 대뇌 위축, 시냅스와 뉴런의 큰 손실, Tunel 양성 세포의 증가, 염색체 응축 및 핵융합을 유발할 수 있음을 입증하였다. 도 10을 참조하면, AD에 필수적인 Aβ 및 tau에 대한 병리학적 연구는 TPK 유전자 녹아웃이 Aβ40 및 Aβ42의 생산을 유의하게 증가시킬 수 있음을 나타내었으며, 상기 증가는 주로 APP 발현 및 Bace1 단백질 수준 증가 및 Tau 단백질 인산화 증가에 의해 달성되었다. 도 11을 참조하면, 염증반응은 AD의 발생과 발달에 중요한 역할을 하며, TPK 유전자 녹아웃 마우스에서 성상교세포와 미세아교세포의 상당한 활성화와 뇌 피질 및 해마의 염증 인자 발현 증가가 있음을 발견하였고, 한편, TPK 유전자 녹아웃은 신경혈관 장애와 혈관 투과성을 증가시켰다.
결론적으로, 뇌의 TDP 항상성 조절의 핵심효소인, TPK 유전자의 녹아웃은 티아민 대사 장애, 포도당 대사 장애를 야기하며, 더 중요하게는 놀랍게도 AD-유사 신경퇴행성 질환, 뇌위축증, Aβ 및 tau의 병리학적 변화, 신경염 및 신경혈관 장애를 유발할 수 있다.
실시예 3
이 실시예에서 항체의 정보는 다음과 같다:
Figure pct00004
이 실시예에서 시약의 정보는 다음과 같다:
Figure pct00005
1. TPK 과발현 플라스미드의 구성
인간 TPK 서열은 인간 기원의 HEK 293 세포로부터 역전사에 의해 생성된 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭되었고, 상기 PCR 증폭의 산물은 732bp의 표적 유전자 서열 단편 TPK1(NM_022445)(서열번호 14)과 제한 엔도뉴클레아제(5': BamHI-HF(Buffer 4), 3': ClaI(Buffer 4+BSA))로 절단하였다. 8개의 반복되는 Myc 태그를 코딩 서열의 C 말단에 삽입하여 TPK1-Myc를 생성하고, 상기 표적 단편을 pCS2 벡터에 클로닝하여 TPK 과발현 플라스미드를 구성하였다(도 12 참조).
PCR 증폭용 프라이머:
정방향 프라이머: AT-GGATCC(BamHI)-ACCATGGAGCATGCCTTTACCCCG(서열번호 15);
역방향 프라이머: AT-ATCGAT(ClaI)-GGTCTTTGATGGCCATGGTCCA(서열번호 16).
2.HEK293-APP 세포 및 배양
1) HEK293-APP 세포를 10cm 디쉬에서 배양하고, 디쉬 내의 배지를 부착 세포의 적어도 90% 이상의 컨플루언시(confluency)될 때 제거하였다. 상기 부착된 세포를 37℃로 예열된 1X PBS 완충액 1mL로 부드럽게 세척한 후 PBS를 제거한 다음, 37℃로 예열된 Trypsin-EDTA(질량 백분율 농도 0.25%) 1mL를 접시에 첨가하고, 그런 다음 부드럽게 흔들어 소화 용액이 부착 세포와 완전히 접촉하도록 한다. HEK293-APP 세포를 실온에 두었고, 소화에 약 2-4분이 필요하였다.
2) 10% FBS(부피 퍼센트 농도)를 포함하는 4mL 37℃ 예열된 DMEM 배지를 첨가하여 소화를 종료한 다음 부드럽게 위아래로 피펫팅한다. HEK293-APP 세포 현탁액을 수집하고, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다.
3) 상층액은 버리고, HEK293-APP 세포의 세포를 각각 1ml 팁으로 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 분산시켰다.
4) 실험 조건에 따라, 3)의 HEK293-APP 세포를 150,000 cells/well로 12-well plate에 접종하고, 2일 배양 후, 상기 세포가 75-85% 컨플루언시(confluency)까지 부착하여 성장한 후, 다음 리포좀 형질감염(liposome transfection) 실험을 수행하였다.
3. 리포솜 형질감염 실험(Liposome transfection experiment)
1) -20℃에서 플라스미드를 제거하고 상온에서 녹인 후, 13,000 rpm, 상온에서 3분간 원심분리하였다.
2) 플라스미드 용액 제형화: X806(TPK 과발현 플라스미드(1.218μg/μl)) 및 Ctrl 플라스미드(빈 대조군 플라스미드(1.21μg/μl))를 각각 질량-부피 비율 1:50에서 opti-MEM 배지와 사전 혼합하였다.
3) 리포솜 용액의 제형화: 리포펙타민 2000을 opti-MEM 배지와 1:50 질량 부피비로 혼합하였다.
4) 동량의 플라스미드 용액과 리포솜 용액을 혼합하고, 실온에서 20분간 방치하여 플라스미드와 리포솜의 복합체를 형성하였다. 상기 혼합물은 6시간 내에 안정하였다.
5) 혼합물을 12-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 총 150㎕씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 위아래로 피펫팅하거나 플레이트를 앞뒤로 흔들어 축적을 방지하였다.
6) 플라스미드-리포솜 혼합물이 첨가된 HEK293-APP 세포를 24시간 및 48시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에 넣은 후 세포로부터 단백질 샘플을 수집, 처리 및 시험하였다.
4. HEK293-APP 세포의 단백질 샘플 수집 및 처리
리포솜으로 형질감염된 HEK293-APP 세포를 24시간 및 8시간 동안 배양한 후, 37℃로 예열된 1x PBS로 세포를 3회 세척하였다. PBS를 버리고 ,12-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100㎕ RIPA 용해 용액(프로테아제 억제제 PMSF 함유)을 첨가하였다. 상기 RIPA 용해 용액을 세포와 완전히 접촉시킨 후, 얼음 위에 5분간 두었다. 상기 세포를 세포 스크레퍼 또는 팁으로 스크래핑 후, 튜브에 수집하고 4℃, 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 침전물은 버리고, 상기 단백질 상층액을 수집하여, BCA kit로 단백질 농도를 측정한 후, 웨스턴 블롯(Western blot)으로 표적 단백질의 발현을 확인하였다.
5. 웨스턴 블롯 검출
24시간(TPK OVER-1) 및 48시간(TPK OVER-1) 동안 HEK293-APP 세포주에서 TPK 플라스미드의 과발현이 WB에 의해 검출되었습니다. 구체적인 검출 방법은 다음과 같다.
1) 겔 준비: 위쪽 겔(top gel)(질량-부피 백분율 농도는 5%이다); 아래쪽 겔(lower gel)(질량-부피 백분율 농도는 10%이다.).
2) 전기영동: 1X 러닝 버퍼(running buffer), 90V에서 20-30분 동안 러닝한 다음, 120V에서 60-90분 동안 러닝한다.
3) 멤브레인 이동: PVDF 멤브레인을 활성화를 위해 메탄올에 넣은 다음, 100분 동안 400mA의 정전류에서, 폴리아크릴아미드 겔에서 고체 지지체인 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동하였다.
4) 항체 반응: PVDF를 5% BSA(TBST 중 질량-부피 백분율 농도)로 2시간 동안 블라킹하고(blocked), 1차 항체를 첨가한 후 4℃에서 밤새 방치하였다. 10분 동안 1X TBST로 3회 세척한 후, PVDF 막을 실온에서 2시간 동안 5% BSA(TBST 내)로 희석한 2차 항체와 함께 배양한 다음, 10분 동안 1X TBST로 3회 세척하였다.
5) ECL 현상 솔루션: 개발은 CLiNX 발광 기기(CLiNX, Chemi 스코프 시리즈 6000)를 사용하여 수행되었다.
T-Test는 통계 분석에 의해 사용되었다. WB 테스트 결과 HEK293-APP 세포에서 APP 단백질의 발현이 유의하게 감소했으며 모든 비교에서 유의한 차이가 관찰되었다(*p < 0.05; **p < 0.01)(도 13 참조).
TPK의 과발현이 HEK293-APP 세포에서 APP 단백질의 발현 수준을 감소시킬 수 있고, APP 단백질 수준은 블랭크 대조군과 비교하여 24h 및 48h 그룹 모두에서 유의한 차이로 감소된 것을 알 수 있으며, TPK 과발현 플라스미드가 HEK293-APP 세포에서 APP 단백질의 발현 수준을 억제할 수 있음을 나타낸다. 따라서, TPK 과발현은 HEK293-APP 세포에서 APP 단백질의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.
상기에서 언급한 것은 단지 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐이다. 당업자는 본 발명의 원리를 벗어나지 않고 본 발명을 추가로 수정하고 연마할 수 있음을 주목해야 하며, 이는 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.

Claims (21)

  1. 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 위한 표적으로 TPK 유전자 또는 단백질의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진함으로서, TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약제, 또는 약제의 스크리닝 또는 제조에 있어서 표적으로 TPK 유전자 또는 단백질의 용도.
  4. 제3항에 있어서, TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 상기 약제가 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 시약의 용도.
  6. 제5항에 있어서, 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진하는 시약이 TPK 단백질을 조절하는 시약 및/또는 TPK 유전자를 조절하는 시약인 것을 특징으로 하는 용도.
  7. TPK 유전자 또는 단백질을 표적으로 하여 뇌에서 키나아제 활성 및/또는 TPK 단백질의 발현 수준을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약제.
  8. 알츠하이머병 동물 모델 구성에서 표적으로 TPK 유전자 또는 단백질의 용도.
  9. 동물 모델이 표적 동물에서 TPK 유전자 녹아웃(knockout)에 의해 구성되는 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 동물이 설치류인 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  12. 제11항에 있어서, TPK 유전자의 엑손(exon) 4가 녹아웃된 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 방법은,
    유전자 녹아웃을 위한 표적 벡터 TPK-loxp를 구성하는 단계,
    TPK-loxP+/+ 표적 동물을 얻기 위해 표적 동물에 표적 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표적 벡터의 서열은 서열번호 1에 기재된 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 방법은,
    TPK-loxP+/+ 표적 동물과 CamK2α-Cre/ERT2+/- 표적 동물을 교배시키는 단계,
    TPK 유전자의 조건부 녹아웃이 있는 CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ 표적 동물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 모델 제작 방법.
  16. 비-질환-치료 목적의 신경퇴행성 질환 연구에 있어서 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 동물 모델의 제작 방법에 의해 수득된 동물 모델의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머 병인 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 벡터로서 박테리아 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome)를 이용하여, 네오마이신 내성 유전자 서열(neomycin resistance gene sequence)과 함께 TPK 유전자의 엑손과 상동인 서열의 양 말단에 직접 loxP 서열을 삽입한 것을 특징으로 하는 동물 모델용 표적 벡터의 제작 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 엑손은 엑손 4인 것을 특징으로 하는 표적 벡터의 제작 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 표적 벡터는 서열번호 1에 기재된 것을 특징으로 하는 표적 벡터의 제작 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제작 방법에 의해 제작된 표적 벡터.
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