JP7442874B2 - アルツハイマー病における標的としてのtpkの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、医学の分野、特にアルツハイマー病における標的としてのTPKの使用に関する。
アルツハイマー病(AD)は最も一般的な認知症であり、主に認知と記憶の慢性的かつ進行性の退行と人格の変化を特徴とします。2015年までに世界中で5000万人以上のAD患者がおり、その発生率は65歳以上の人々の年齢とともに増加しました。世界的な高齢化の継続的な進展に伴い、ADは社会や家族に大きな経済的・精神的負担をもたらしている。
この観点から、発明の特定の実施形態は、アルツハイマー病を治療又は予防する際の新規な標的としてのTPKの使用を提供し、その特定の技術的解決策は以下のとおりである:
本発明の実施例又は先行技術の技術的解決手段をより明確に説明するために、実施例で使用される図面を以下に簡単に示す。
AD患者は、脳内に複数のカスケード型病態生理学的変化を有しており、脳グルコース代謝異常は、その一貫した病理学的特徴であり、認知機能の退行と密接に関連し、臨床症状より何年も前から現れる。グルコースは、脳内細胞の主要なエネルギー基質であり、グルコース代謝の中間産物も神経伝達物質の合成の基質を提供する。脳内グルコース代謝は主に2つのプロセスを含み、それは、それぞれ、膜透過輸送とグルコースの細胞内代謝である。AD患者の細胞内グルコース利用障害は、主にグルコース代謝の主要な酵素であるトランスケトラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性低下によるものである。チアミン二リン酸(TDP)は、チアミンの主要な活性化型であるが、これら3つの主要な酵素の共通の補酵素であり、グルコース代謝に重要な役割を果たしている。上記の3つの主要な酵素の活性低下及びTDPの顕著な欠落は、AD患者に特異的かつ普遍的であり、血管性認知症、前頭側頭型認知症、パーキンソン病の患者には存在しない。チアミンピロホスホキナーゼ(TPK)は、TDP合成の主要な酵素であるのみならず、脳内におけるTDPの恒常性を維持するための重要な因子である。本発明者は、さらなる研究を通じて、TDPレベルの欠乏による脳グルコース代謝の低下がADの発症に関連すること、ADがTPKタンパク質の発現に関連することを見出した。さらに、TPK遺伝子ノックアウトによる脳内TPKタンパク質量の抑制は、明らかにチアミン代謝障害、グルコース代謝異常をもたらし、さらに重要なことは、AD様の神経変性疾患、脳萎縮、Aβやタウの病理学的変化、神経炎症、神経血管障害を誘導することができる。したがって、TPK遺伝子又はタンパク質は、ADにおいて非常に重要な役割を果たし、それゆえ、ADを治療及び予防するための新しい標的となる。TPK遺伝子又はタンパク質を標的として脳内のTPKタンパク質のキナーゼ活性及び/又は発現量を促進させることにより、TPKタンパク質阻害によるADを予防することができる。標的動物におけるTPK遺伝子ノックアウトによる動物モデルの構築方法により得られた動物モデルは、神経変性疾患の研究、特にアルツハイマー病の研究に用いることができ、これには、疾患治療研究及び非疾患治療研究を含む。動物モデルにおける非疾患治療研究には、具体的には、例えば、1)神経変性疾患のメカニズムを調査及び/又は研究すること、2)神経変性疾患を治療することができる産物を調製及び/又はスクリーニングすること、3)神経変性疾患を診断及び/又は示唆することができる分子マーカーを探索及び検証すること、等が含まれる。
単純チアミン食欠乏(TD)モデル、及びピリチアミン注入(PTD)と組み合わせた、チアミン食欠乏モデルを用いて、それぞれ、実験を行った。TD及びPTDモデルの動的変化を追跡した。TD 11日、18日、26日及びPTD 7日、11日を含む6群(n=4)を比較のために設定した。同日に出生し、体重が類似している3か月齢のC57マウスを選択した。グループ分けに応じて異なるモデリング開始時点を選択し、最終的には同日にモデリングを完了し、サンプリングも同様とした。TDモデル:正常飲料水及びチアミン欠乏飼料でそれぞれ11日間、18日間及び26日間モデリング;PTDモデル:正常飲料水、チアミン欠乏飼料、及び500μg/(kg・d)の用量で0.1mg/mLのPT(ピリチアミン)の毎日の腹腔内注射でそれぞれ7日間及び11日間モデリング;対照群:正常飲料水、正常飼料及び正常生理食塩水の腹腔内注射。モデリングが完了したら、マウスをイソフルランの吸入で麻酔し、眼を摘出し、ヘパリン抗凝固剤を含む試験管に採血し、それを急速に転倒させて混合した。150μL全血に等量の7.5%PCAを添加し、ボルテックスで混合した。マウスを氷上で頸椎脱臼により急速に屠殺し、脳、腎臓、肝組織等を採取して重量を測定した。組織の重量を記録した。組織をKH2PO4と、組織:(mg)KH2PO4(μL)=100:900の比で混合し、70Hzで90秒間、組織グラインダーで粉砕し、30分間完全に粉砕した後に氷浴に供し、使用するまで-80℃で保存した。TD及びPTDモデルにおいて、マウスの脳、血液、肝臓、及び腎臓におけるTDP、TMP及びTM活性の比較を図1及び図2に示し、正常マウスの脳、血液、肝臓、及び腎臓におけるTPK活性の比較を図3に示した。
1.ターゲティングベクターの構築
ベクターには細菌人工染色体(BAC)を用い、エクソン4に隣接するイントロンを相同アームとして構築した標的配列「5’-相同アーム-loxP-エクソン4-frt-Neo-frt-loxP-相同アーム-3’」を挿入し、遺伝子ノックアウトのための標的ベクターを構築する(図4参照)。
TPK-floxP+/-胚幹細胞の入手及びスクリーニング
(1)マウス胚性幹細胞(ES)の作製
栄養膜細胞としての一次マウスはい線維芽細胞を、ES細胞を解凍する前日に0.1%ゼラチンで処理した皿に接種し、1000U/mLの濃度でLIFを添加した細胞培養ブロス中で培養した。
[1]ES細胞をパンクレアチンで消化した後、PBS(約2×10^7/mL)に再懸濁し、氷上に置いた;
[2]線形化標的ベクター(45μg)を1mL細胞と混合し、エレクトロポレーションタンクに装填し、600V、25μF、10msのパラメーターでエレクトロトランスフォーメーションを実施した;
[3]エレクトロトランスフォーメーション後の細胞を、完全に密集したトロホブラストを有するディッシュに接種し、37℃のインキュベーターに入れ、G418(280μg/mL)を含有する細胞スクリーニングブロスを添加して、24時間後に置換した。
培養数日後にクローンの選択を開始し、単一の未分化ESクローンを低倍率顕微鏡下で選択し、以下の培養のために96ウェルプレートに配置した;各クローンを2つに分け、1つを凍結保存し、もう1つを増幅及び継代培養のために24ウェルプレートに移した。
G418耐性の陽性クローンを選択して増幅し、ゲノムDNAを抽出して酵素消化し、アガロースゲル電気泳動のバンドを解析した。その後、Tpk exon4の5’及び3’末端を標的とするプローブを用いてサザンブロットを行い、対照ES細胞と標的ES細胞とを区別するバンドにしたがって同定を行った。ここで、
PCR同定のためのプライマーは以下のとおりであった:
(1)マウス胚盤胞の調製
4週齢のC57BL/6雌マウスを選抜し、正午に10IUのゴナドトロピンを腹腔内に注射した。48時間後に10IUのヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射し、雌マウスを雄マウスとともにケージに入れた。次の日の朝に、雌マウスの膣栓の有無を検査し(0.5日と記録)、3日後に膣栓を有する雌マウスを殺処分し、子宮を摘出し、胚盤胞をBMOC-3培養液で洗浄した後、60mmのディッシュに滴下した培養液に胚盤胞を移し、鉱物油覆った。胞胚腔に拡大させた後、マイクロインジェクションを行った。
マイクロインジェクション用の保持ピペット及び注入ピペットを準備した。インジェクションの3時間前に、インジェクション用のES細胞に、置換用の新鮮な培養液を添加した。パンクレアチン消化の際に単一細胞懸濁液を調製した。明るい表面を有する小型及び円形のES細胞をインジェクションのために選択し、各胚に約12個から15個のES細胞を注射し、注射された胚盤胞は一般に1時間培養後に正常な形態を回復し、形態が損傷していない胚盤胞を移植のために選択した。
偽妊娠マウスの作製:白の昆明種の雌マウスを精管結紮した雄マウスと交配し、翌日(0.5日と記録)に膣栓検査を行った。2日後には偽妊娠マウスを胚移植に用いることができる。偽妊娠マウスをイソフルランで麻酔し、10個の注入された胚盤胞を一側子宮に移植するために背部手術を行った。手術が成功した場合、17日後に新生児マウスが誕生する可能性があり、数日後の毛の色から、標的ES細胞を組み込んだTPK-floxPキメラマウスが得られたか否かを視覚的に判定することが可能であり、全体の毛に対する褐色の毛の割合からキメラの度合いを推定した。
得られたTPK-floxPキメラマウスをFlpツールマウスと交配したところ、Flpツール酵素はFrt部位でNeo配列の開裂を誘導でき、純化により、ノックアウト可能なTpk-loxP+/+ホモ接合マウスが得られた。
(1)上記の操作により得られ、確認されたTpk-loxP+/+マウスは、Tpkノックアウトを達成することができる;
(2)Tpk-loxP+/+マウスとCamK2α-Cre/ERT2+/-マウスを交配して、CamK2α-Cre/ERT2+/-;Tpk-loxP+/+マウスを得て、これを遺伝的に同定し、交配した。
CamkII-Cre/ERT2+/-マウスとの交配により皮質と海馬に特異的なTPK遺伝子ノックアウトを行い、3ヶ月齢のマウスにTomaxifenを腹腔内投与してTPK遺伝子ノックアウトを誘導した。TPK遺伝子ノックアウトマウスの表現型解析を行、その結果を図6から図11に示す。
本実施例における抗体の情報は以下のとおりであった。
ヒト由来のHEK293細胞から逆転写により作製したcDNAからヒトTPK配列をPCRにより増幅し、PCR増幅産物を制限エンドヌクレアーゼ(5’:BamHI-HF(緩衝液4)、3’:ClaI(緩衝液4+BSA))で消化した後、732bpの標的遺伝子配列断片TPK1(NM_022445)(配列番号14)を得た。コード配列のC末端に8個のMycタグの反復配列を挿入してTPK1-Mycを生成し、標的断片をpCS2ベクターにクローニングし、次いでTPK過剰発現プラスミドを構築した(図12参照)。
フォワードプライマー:AT-GGATCC(BamHI)-ACCATGGAGCATGCCTTTACCCCG(配列番号15);
リバースプライマー:AT-ATCGAT(ClaI)-GGCTTTTGATGGCCATGGTCCA(配列番号16)。
1)HEK293-APP細胞を10cmのディッシュ中で培養し、ディッシュ中の培地を少なくとも90%の付着細胞の集密度になるまで除去した。付着細胞を1mLの37℃で予備加熱した1×PBS緩衝液で穏やかに洗浄し、続いてPBSを除去し、次いで、0.25%の質量体積%濃度を有する1mLの37℃で予備加熱したトリプシン-EDTAをディッシュに添加し、次にこれを穏やかにシェイクして、消化液を付着細胞と完全に接触させた。HEK293-APP細胞を室温に置いたが、消化には約2分から4分しか必要としなかった。
2)10%FBS(体積%濃度)を含む37℃で予備加熱した4mLのDMEM培地を添加して消化を終了させた後、穏やかに上下にピペッティングした。HEK293-APP細胞懸濁液を収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。
3)上清を廃棄し、HEK293-APP細胞をそれぞれ1mlのチップで穏やかに上下させて分散させた。
4)実験条件に従って、3)のHEK293-APP細胞を12ウェルプレートに150,000個/ウェルで接種し、2日間培養後、75%から85%の集密度に接着成長させた後、以下のリポソームトランスフェクション実験を行った。
1)-20°Cからプラスミドを取り出し、常温で溶解し、13,000rpm、室温で3分間遠心分離した。
2)プラスミド溶液の調製:X806(TPK過剰発現プラスミド(1.218μg/μl))とCtrlプラスミド(空の対照プラスミド(1.21μg/μl))をそれぞれopti-MEM培地に1:50の質量体積比でプレミックスした。
3)リポソーム溶液の調製:リポフェクタミン2000をopti-MEM培地に1:50質量体積比で混合した。
4)等容量のプラスミド溶液とリポソーム溶液を混合し、室温で20分間放置して、プラスミドとリポソームの複合体を形成した。混合物は6時間安定であった。
5)12ウェルの細胞培養プレートに、1ウェル当たり合計150μlの混合物を添加した。蓄積を避けるために、混合物を上下にピペッティングするか、プレートを前後に振とうした。
6)プラスミド-リポソーム混合物を添加したHEK293-APP細胞を二酸化炭素インキュベーター中に24時間及び48時間置いた後、細胞からのタンパク質試料の収集、処理及び試験を行った。
リポソームでトランスフェクトしたHEK293-APP細胞を24時間及び48時間培養した後、37℃に予熱した1×PBSで3回洗浄した。PBSを廃棄し、100μlのRIPA溶解溶液(プロテアーゼ阻害剤PMSFを含む)を12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに添加した。RIPA溶解溶液を細胞と完全に接触させた後、5分間氷上に置いた。細胞を細胞スクレーパー又はチップでこすり落とした後、チューブに採取し、4℃、13,000rpmで15分間遠心分離した。沈殿物を廃棄し、タンパク質上清を回収し、そのタンパク質濃度をBCAキットで測定した後、次いで、ウェスタンブロットにより標的タンパク質の発現を検出した。
HEK293-APP細胞株における24時間(TPK OVER-1)及び48時間(TPK OVER-1)のTPKプラスミドの過剰発現がWB法により検出された。検出の具体的方法は以下のとおりである。
2)電気泳動:1×泳動緩衝液、90Vで20分間から30分間泳動後、次いで、120Vで60分間から90分間泳動。
3)膜への転移:PVDF膜を活性化のためにメタノール中に置き、続いて400mAの定電流で100分間ポリアクリルアミドゲルから固体支持体、PVDF膜にタンパク質を移動させた。
4)抗体反応:PVDFを5%BSA(TBST中の質量体積百分率濃度)で2時間ブロッキングし、一次抗体を加え、4℃で一晩置いた。1×TBSTで10分間3回洗浄した後、PVDF膜を5%BSA(TBST中)で希釈した二次抗体とともに室温で2時間インキュベートし、続いて1×TBSTで10分間3回洗浄した。
5)ECL現像液:CLiNX発光装置(CLiNX、Chemi scopeseries 6000)を用いて現像を行った。
Claims (16)
- チアミンピロホスホキナーゼ(TPK)またはTPK発現ベクターを含む、アルツハイマー病の予防又は治療のための医薬。
- 脳内のTPKタンパク質のキナーゼ活性及び/又は発現レベルを促進するための、請求項1記載の医薬。
- アルツハイマー病を予防又は治療するための医薬をインビトロまたはエクスビボでスクリーニングする方法であって、
被検化合物についてチアミンピロホスホキナーゼ(TPK)のキナーゼ活性及び/又は発現レベルを測定する工程、および
前記被検化合物から、チアミンピロホスホキナーゼ(TPK)のキナーゼ活性及び/又は発現レベルを促進する試薬を選択する工程
を含む、方法。 - 前記試薬が、チアミンピロホスホキナーゼ(TPK)タンパク質を調節する試薬及び/又はチアミンピロホスホキナーゼ(TPK)遺伝子を調節する試薬である、請求項3記載の方法。
- 標的動物においてTPK遺伝子のノックアウトにより動物モデルを構築することを特徴とする、アルツハイマー病の動物モデル構築方法。
- 標的動物が齧歯類であることを特徴とする請求項5記載の動物モデルの構築方法。
- 前記齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項6に記載の動物モデルの構築方法。
- TPK遺伝子のエクソン4をノックアウトすることを特徴とする請求項5記載の動物モデルの構築方法。
- 遺伝子ノックアウトのためのターゲティングベクターTPK-loxpを構築し、該ターゲティングベクターを標的動物に導入してTPK-loxP+/+標的動物を得る工程を含むことを特徴とする請求項5に記載の動物モデル構築方法。
- 前記標的化ベクターの配列が配列番号1に記載されていることを特徴とする、請求項9に記載の動物モデル構築方法。
- TPK-loxP+/+標的動物とCamK2α-Cre/ERT2+/-標的動物とを交配し、TPK遺伝子の条件付きノックアウトがされた、CamK2α-Cre/ERT2+/-;TPK-loxP+/+標的動物を得る工程をさらに含むことを特徴とする請求項9記載の動物モデル構築方法。
- アルツハイマー病の研究における、請求項5~11のいずれか一項記載の動物モデルの構築方法により得られる動物モデルの使用。
- 細菌人工染色体をベクターとして用い、TPK遺伝子のエクソンに相同な配列の両端にネオマイシン耐性遺伝子配列と共に直接loxP配列を挿入することを特徴とする、アルツハイマー病の動物モデルのターゲティングベクターの構築方法。
- 前記エクソンがエクソン4であることを特徴とする、請求項13に記載の標的ベクターの構築方法。
- ターゲティングベクターの配列が配列番号1に記載されていることを特徴とする、請求項14に記載のターゲティングベクター構築方法。
- 請求項13~15のいずれかに記載の構築方法によって構築された標的化ベクター。
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