JP2004524843A - Bace−1のトランスジェニックノックアウト - Google Patents
Bace−1のトランスジェニックノックアウト Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004524843A JP2004524843A JP2002567822A JP2002567822A JP2004524843A JP 2004524843 A JP2004524843 A JP 2004524843A JP 2002567822 A JP2002567822 A JP 2002567822A JP 2002567822 A JP2002567822 A JP 2002567822A JP 2004524843 A JP2004524843 A JP 2004524843A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bace
- transgenic
- animal
- gene
- allele
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 65
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 95
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 claims description 80
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 claims description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 75
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 claims description 32
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 26
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 26
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 16
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 13
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 claims description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002439 beta secretase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 5
- 101710150192 Beta-secretase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 4
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 6
- 229940125759 BACE1 protease inhibitor Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 47
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 37
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 35
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 35
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 35
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 31
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 21
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 description 3
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 2
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 2
- 101000894883 Homo sapiens Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010036908 Presenilin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000009547 development abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 2
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N urobilinogen Chemical compound CCC1=C(C)C(=O)NC1CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(CC3C(=C(CC)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LNNSWWRRYJLGNI-NAKRPEOUSA-N Ala-Ile-Val Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LNNSWWRRYJLGNI-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010033918 Alanine-glyoxylate transaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- -1 Aβ41 Proteins 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 108091061949 BACE1-AS Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000894895 Homo sapiens Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035039 Piloerection Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012419 Presenilin-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 206010039897 Sedation Diseases 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007737 beta-secretases Proteins 0.000 description 1
- 238000011325 biochemical measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000004321 blink reflex Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000013872 defecation Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000021824 exploration behavior Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 102000038383 gamma-secretases Human genes 0.000 description 1
- 108091007739 gamma-secretases Proteins 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N levobunolol Chemical group O=C1CCCC2=C1C=CC=C2OC[C@@H](O)CNC(C)(C)C IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007658 neurological function Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009038 pharmacological inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005371 pilomotor reflex Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028527 righting reflex Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000036280 sedation Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 1
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【0001】
(関連出願の相互参照)
この出願は、2001年2月23日出願のUSSN 60/271,092、2001年2月26日出願のUSSN 60/271,514及び2001年5月25日出願のUSSN 60/293,762の優先権に基いており、如何なる目的においても、それぞれを引用により本明細書に取り込む。
【0002】
本発明は、神経学的な疾患及び薬物の技術的分野に属する。
【背景技術】
【0003】
アルツハイマー病(AD)は、この千年紀もの間、社会に突きつけられた大きな未解決の問題の一つである。この4半世紀の間にかなりの研究がなされたにも拘らず、この病気の基本的な病態生理に作用する薬物は存在しない。ADの重要な特徴の一つは、脳、特に認知と記憶に関係する領域における、凝集したベータアミロイドペプチド(Aβ)からなるプラークの蓄積である(Selkoe, Annu. Rev. Neurosci., 17, 489-517 (1994).)。直接的な神経毒性を持つと思われるAβの過剰生産を、ADの初期段階において検出することができ、実際に、認知障害が認められる以前に検出可能である。Aβは、その前駆体タンパクであるAPPから、それぞれβ-及びγ-セクレターゼ酵素によるN及びC末端でのタンパク分解プロセスにより生産される。APP、プレセニリン1またはプレセニリン2の遺伝子に突然変異があると、Aβ1-42ペプチドの過剰生産を生じ、早期発症性の家族性ADを引き起こす。β-及びγ-セクレターゼの同定は、1984年から研究されており、1999年に、不充分ではあるがN-末端β部位APP切断酵素(BACE-1)が報告された(Yan, 等, Nature, 402, 533-537 (1999).)。更に、β-セクレターゼ活性を持つタンパク分解酵素が存在するかも知れない。
【0004】
BACE-1 mRNAは、広範囲には低レベルで、脳では中程度のレベルで、且つ膵臓では高レベルで発現している。しかし、β-セクレターゼ活性は膵臓では低く、脳で最も高い。このmRNAと活性との不一致は、恐らく、膵臓で支配的なBACE-1転写物であるエクソン3の3分の2を欠如しているスプライシング変異体が、小胞体中で、不完全に処理されて残留するタンパクを生じさせるためである。脳において、BACE-1 mRNAは、ニューロンにのみ広範に発現しており、in situ ハイブリダイゼーションにより小脳、皮質及び海馬に顕著な発現が認められる。BACE-1は、細胞のトランス−ゴルジネットワークにおいて、基質であるAPPと共存している。
【0005】
小分子のBACE-1阻害剤について、アルツハイマー病の薬理的治療薬としての有効性が研究されているところであるため、BACE-1が脳における主なβ-セクレターゼであることを立証すると共に、BACE-1阻害剤が、APPプロセッシングの阻害以外の如何なる効果を有するかを理解する必要がある。また、BACE-1が、脳において主要なβ-セクレターゼ活性を構成することを示すことも、重要である。本明細書における開示は、これらの知見、とりわけ、これらの知見をスクリーニング法に使用することを、報告及び権利請求するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0006】
(本発明の概要)
本発明は、β−セクレターゼ1(BACE−1)遺伝子の少なくとも一つの非機能性対立遺伝子を持つトランスジェニック非ヒト動物を提供する。あるトランスジェニック動物は、対立遺伝子のホモ接合体である。あるトランスジェニック動物は、マウスまたはラットのようなげっ歯類である。
【0007】
あるトランスジェニック動物は、その遺伝子の内在性対立遺伝子と、その構造物の遺伝子と充分に配列関連性を示す部分によって挟まれた陽性選別マーカーを含む構造物との間の相同組換えにより作製され、内在性対立遺伝子との組換えにより陽性選別マーカーが内在性対立遺伝子中に導入され、遺伝子が非機能性となる。他のトランスジェニック動物は、遺伝子の内在性対立遺伝子と、相同性組換えを行なうのに充分な配列関連性を示す部分に挟まれた陽性選別マーカーを含む構造物との間の相同組換えにより作製される。これらの部分はfrt組換え部位に挟まれているため、構造物は内在性遺伝子と組換えを行なって、陽性選別マーカー及びfrt組換え部位を内在性対立遺伝子に導入し、frt組換え部位は相互に組換えを行なうことによって、flp組換え部位の間にあるDNAを削除し欠失により非機能性となった内在性対立遺伝子を生じる。
【0008】
一部のトランスジェニック動物において、対立遺伝子は、少なくとも遺伝子のエクソン部分の欠失により非機能性となる。一部のトランスジェニック動物において、対立遺伝子は、少なくとも遺伝子のエクソン1の部分の欠失により非機能性となる。一部のトランスジェニック動物において、対立遺伝子は、BACE-1のラムダKOSゲノムクローンを含むターゲッティングベクターとの相同組換えにより非機能性となる。そのような動物において、ラムダKOSゲノムクローンは、エクソン1の5.5 kb上流と2 kb下流を包含するネズミ129/SvEv株のBACE-1核酸を含んでいる。一部の動物において、対立遺伝子は、エクソン1の最初のメチオニンの次の2塩基対から始まる165塩基対の欠失及びトランスジェニック非ヒト動物を作製するために使用される129 ES細胞へ電気穿孔により導入されるターゲッティングベクター中の発現カセットによってエクソン1の末端を置換することによる延長により、非機能性となる。一部の動物では、対立遺伝子はエクソン4-8の欠失により非機能性となる。
【0009】
一部のトランスジェニック動物はさらに家族性アルツハイマー病の原因となるAPP遺伝子の突然変異を含む導入遺伝子を含んでいる。一部のそのような動物では、導入遺伝子はヒトAPP695のコドン595及び596における突然変異、またはそのイソフォームまたはフラグメントを含んでおり、そしてその位置595及び596に相当する位置のアミノ酸残基はそれぞれアスパラギン及びロイシンである。一部のそのような動物では、導入遺伝子はAPP770のコドン717の突然変異または717位置に突然変異アミノ酸残基を有するAPP770のイソフォームまたはフラグメントを含んでいる。一部のそのような動物において、突然変異アミノ酸残基はイソロイシン、フェニルアラニンまたはグリシンである。一部のそのような動物において、動物は非機能対立遺伝子のホモ接合性である。一部のそのような動物において、動物は導入遺伝子のヘテロ接合性である。
【0010】
本発明はさらに請求項1のトランスジェニック動物由来の皮質細胞培養を提供する。この皮質細胞培養は初代細胞培養であり得る。21.その皮質細胞培養の一部はAβの残基13-28を認識する抗体によって認識されるペプチドの検出し得る量を含んでいる。
【0011】
本発明はさらにAβの残基13-28を認識する抗体によって認識されるペプチドのβ−セクレターゼ以外のプロテアーゼ(「非β−セクレターゼプロテアーゼ」)による生産の阻害をスクリーニングする方法を提供する。その方法は以下を含む:上記のトランスジェニック動物またはそれから誘導された皮質細胞培養を試薬に曝露し、薬物に曝露したトランスジェニック動物または細胞培養中で生産されたペプチドを検出し、そして薬物に曝露されていないトランスジェニック動物または細胞培養に比較して曝露されたトランスジェニック動物または細胞培養における生産ペプチドの量の減少を阻害作用の指標とする。
【0012】
本発明はさらにβ−セクレターゼ阻害剤の潜在的副作用の分析方法を提供する。その方法は、上記トランスジェニック動物またはそれから誘導された細胞培養をβ−セクレターゼ阻害剤に曝露する;トランスジェニック動物または皮質細胞の少なくとも1成分のレベルが阻害剤の投与に対応する変化を生じるか否かを測定し;少なくとも一つの成分のレベルの変化を潜在的副作用の指標とすることを含んでいる。この測定段階は複数のmRNA種のレベルの変化を測定することができる。
【0013】
本発明はさらにβ−セクレターゼ1(BACE-1)遺伝子の非機能性対立遺伝子を少なくとも一つ含む胚性幹細胞を提供する。一部の胚性幹細胞は対立遺伝子のホモ接合性である。一部の胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞である。一部の胚性幹細胞は、相同組換えの際にBACE-1遺伝子のエクソン4から8がFLP組換え酵素標的部位(frt部位)で挟まれるように設計されたターゲッティングベクターで相同組換えを行なうことにより作製される。一部の胚性幹細胞は、ゲノム遺伝子座に関して、相同性が5'領域の4.5 kb及び3'領域の第3 frt部位までの4.3 kb及びさらに3'の1.5 kbをカバーする用に設計されたターゲッティングベクターと相同組換えを行なうことにより作製される。一部の胚性幹細胞はBACE-1のエクソン4-8を欠失した非機能的対立遺伝子についてホモ接合性である。一部の胚性幹細胞は、BACE-1遺伝子中にネオマイシン耐性遺伝子を導入する第一ターゲッティングベクターと、そしてネオマイシン耐性遺伝子をヒグロマイシン耐性遺伝子カセットで置換する第2ターゲッティングベクターと相同組換えすることにより作製される。
【0014】
本発明はさらに上記胚性幹細胞の分化により発生した胚盤胞を提供する。
【0015】
(定義及び略語)
略語
Aβは、β-アミロイドペプチドを意味し、ADは、アルツハイマー病を意味し、APPは、アミロイド前駆体タンパクを意味し、BACE-1は、β部位APP切断酵素を意味する。
【0016】
定義
APP695,APP751及びAPP770は、それぞれ、ヒトAPP遺伝子によってコードされている695、751及び770アミノ酸残基長のポリペプチドのことである(Kang 等, Nature 325, 773 (1987)、Ponte等, Nature 331, 525 (1988)、及び Kitaguchi 等, Nature 331, 530 (1988) 参照)。異なるナンバリングの取り決めが種々のイソフォームに使用されているが、これらは容易に相互変換される。ヒトアミロイド前駆体タンパク(APP)におけるアミノ酸は、特記しない限りAPP770イソフォームの配列に従ってナンバリングする。
【0017】
β-アミロイドペプチドとしても知られるAβ、即ちA4ペプチド(US 4,666,829 ; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)参照)は、39-43アミノ酸のペプチドであり、アルツハイマー病の特徴的プラークの主な成分である。Aβは、β及びγセクレターゼと呼ばれる二つの酵素による大きなタンパクAPPのプロセッシングにより生成する(Hardy, TINS 20, 154(1997)参照)。アルツハイマー病と関連するAPPにおける既知の突然変異は、β及びγセクレターゼの作用部位の近くまたはAβの範囲内で生じる。例えば、位置717は、AβへのプロセッシングにおけるAPPのγ-セクレターゼ切断部位に近く、670/671位置はβ-セクレターゼ切断部位に近い。生成されるAβの42/43アミノ酸型が増加するようにAβを生成する切断反応との相互作用により、突然変異がADを引き起こすと考えられている。
【0018】
Aβは、古典的経路及び補体第二経路の両者を安定させることもできるし、活性化することもできるという変わった特性を持っている。特に、Aβは、Clqに結合し、最終的にはC3biに結合する。この会合は、B細胞の活性化に至るマクロファージへの結合を促進する。さらに、C3biは解離して、次いでT細胞依存性の挙動においてB細胞上のCR2に結合してこれらの細胞の活性が10,000倍増加する。この機序により、Aβが他の抗原に対する過剰の免疫応答を引き起こす原因となる。
【0019】
Aβにはいくつかの型が天然に存在する。Aβのヒト型はAβ39,Aβ40,Aβ41,Aβ42及びAβ43と呼ばれる。これらのペプチドの配列及びこれらとAPP前駆体との関係は、Hardy 等., TINS 20, 155-158 (1997)の図1に示されている。
例えば、Aβ42は、以下の配列を有する。
【0020】
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH
【0021】
Aβ41、Aβ40及びAβ39は、それぞれ、C末端からAla、Ala-Ile、及びAla-Ile-Valが脱落している点でAβ42と異なる。Aβ43は、 Aβ42のC末端にスレオニン残基が存在する点でAβ42と異なる。
【0022】
外来性DNA部分は、細胞に対しては異種(例えば、細胞と異なる種)であるか、その細胞のDNA部分と同種ではあっても宿主細胞ゲノム中で異常な位置に存在する。逆に、内在性DNA部分または遺伝子は、ある種で天然に存在し、本来の位置に存在する。
【0023】
トランスジェニック哺乳動物において、生殖細胞及び体細胞の全てまたは実質的に全て(すなわち、体細胞の突然変異によるわずかな変異という例外の可能性を有する)は、初期胚段階において、その哺乳動物またはその哺乳動物の先祖に導入された導入遺伝子を含んでいる。
【0024】
配列の比較において典型的には、一の配列が、被検配列と比較される対照配列としての役目を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、被検配列及び対照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて配列座標を指定し、更に配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメータに基いて、対照配列に対する被検配列の配列相同パーセントを計算する。
【0025】
比較のための配列の最適な位置合わせは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性整列アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性探索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ使用計算方法(GAP,BESTFIT,FASTA,及びWisconsin Genetics Software Packageの中のTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、または視覚による比較(一般的にはAusubel 等.,前出を参照)により行なうことができる。
【0026】
パーセント配列相同性及び配列類似性を測定するのに適当なアルゴリズムの他の例としては、BLASTアルゴリズムがあり、これはAltshul 等., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)で記述されている。
BLAST分析を行なうためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して誰でも入手することができる。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させた時に、正の閾値スコアー(some positive-valued threshold score)Tに一致するか満足する、被検配列中の長さWの短い文字列を発見することにより高スコアー配列対(HSP)を同定する。Tを、隣接文字列スコアー閾値という(Altschul 等., 前出)。これら最初の隣接文字列の探索は、それらを含む長いHSPを発見するために調査を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、この文字列のヒットを、各配列の両方向へ、累積整列スコアーが増加する限り拡大させる。ヌクレオチド配列については、パラメータM(一致する残基対に対する報奨スコアー;常に>0)及びN(一致しない残基に対する罰スコアー;常に<0)を使用して累積スコアーを計算する。アミノ酸配列については、スコアーマトリックスを累積スコアーの計算に使用する。各方向への文字列探索の拡張は次の場合に中止する。即ち、累積整列スコアーが到達した最大値から、数値Xだけ低下する場合、1以上の負スコアーの残基配列の蓄積により、累積スコアーが零以下になる場合、または何れかの配列末端に達している場合、である。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内にあるか否かを判断するには、BLASTプログラムのデフォルトパラメータが適している。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、11の文字列長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=‐4、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のBLASTPプログラムは、デフォルトとして3の文字列長(W)、10の期待値(E)、BLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する。TBLATNプログラム(ヌクレオチド配列の代わりにプロテイン配列を使用)は、デフォルトとして3の文字列長(W)、10の期待値(E)及びBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する。(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)参照)。
【0027】
パーセント配列相同性の計算に加えて、BLASTアルゴリズムは、二つの配列間の類似性の統計的分析も行なう(Karlin & Altshul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787(1993)参照)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小合計確率(the smallest sum probability(P(N)))であり、これは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、被検核酸と対照核酸の比較における最小合計確率が、約0.1未満、より望ましくは0.01未満、そして最も望ましいのは約0.001未満であるならば、被検核酸は対照核酸と類似すると考えられる。
【0028】
(発明の詳細な説明)
I. 総論
本発明は、β-アミロイド前駆体タンパク(「APP」)のアミノ酸596及び597(APP695の取り決めによりナンバリングされた。)の間を切断する能力を持つ機能的な酵素(「β−セクレターゼ」)をコードする機能的な対立遺伝子を欠失した動物を提供する。望ましくは、当該動物は、機能的なβ−セクレターゼをコードする遺伝子の対立遺伝子の少なくとも一つを欠失するように遺伝子操作されていか、当該機能的なβ−セクレターゼ対立遺伝子を欠失させた動物の子孫である(その両者とも本明細書では「β−セクレターゼノックアウト」と呼ぶ)。
【0029】
本発明はまた、家族性アルツハイマー病と関連する、APP遺伝子中に突然変異を有する導入遺伝子を含有するβ−セクレターゼノックアウトを提供する。
【0030】
本発明はまた、Aβまたはそのフラグメントの生産に影響を与えるβ−セクレターゼ以外のタンパク分解酵素(「非β−セクレターゼタンパク分解酵素」)を阻害する薬物をスクリーニングする方法を提供する。そのタンパク分解酵素には、非限定的に、推定されている、γ−セクレターゼ、プレセニリン1、プレセニリン2及びBACE-2が含まれる。
【0031】
非β−セクレターゼタンパク分解酵素を阻害する薬物をスクリーニングするために有用であることに加えて、本発明の動物はまた、介在する新たな標的を同定したり、β−セクレターゼを阻害する薬剤の種々の年齢における毒性の起こり易さを評価するために有用である。
【0032】
II. β−セクレターゼ
β−セクレターゼ酵素は、残基596及び597(APP695の取り決めによりナンバリングされた)または670及び671(APP770の取り決めによりナンバリングされた)の間でアミロイド前駆体タンパク(APP)を切断する。この酵素のヒト型及びマウス型は、多数のグループによりクローン化されており、膜結合アスパラチルタンパク分解酵素であると報告されている。(Sinha, Nature 402: 537-540, 1999; Yan, Nature 402: 533-536, 1999; Vassar, Science, 286: 735-741, 1999) これらの文献に報告されている配列は、同じ遺伝子の対立遺伝子であり、本明細書ではBACE-1と呼ぶ。文脈から明らかである以外は、β−セクレターゼ酵素、cDNAまたは遺伝子への言及は、上記文献のいずれかに記載されているようなBACE-1に関するもの、並びにその対立遺伝子、種及び誘導された変異体への言及を意味する。誘導変異体は、上記文献に記載されている典型的なBACE-1配列の少なくとも一つに対して、核酸またはアミノ酸レベルで少なくとも90%、95%または99%の配列相同性を示すことが好ましい。β−セクレターゼの第二の非対立遺伝子型が、Pharmacia WO 00/17369、2000年3月30日公開;FEBS Lett 2000 Feb 18; 468(1): 59-64; and Acquati 等., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Aug 15; 97(17): 9712-7により記述されている。この型はBACE-2と呼ばれるであろう。
【0033】
III. トランスジェニック動物の作製
本発明のトランスジェニック動物は、BACE-1遺伝子の内在性対立遺伝子の一つまたは両方を、非機能性の形態で持っている。不活性化は内在性遺伝子の修飾によって行なわれ、通常、遺伝子のコード領域における欠失、置換または挿入による。この修飾により遺伝子産物の合成を阻害することができ、あるいは機能上の活性を失った遺伝子産物となる。典型的な修飾は、エクソン内に選別マーカーのような外来性遺伝子切片を導入することにより、エクソンを中断させるか削除することである。
【0034】
マウスにおける内在性遺伝子の不活性化は、マウス胚性幹(ES)細胞中の内在性遺伝子とターゲッティング構造体との間の相同組換えにより行なわれる。典型的には、ターゲッティング構造体は、標的とされる遺伝子の部分に挟まれた陽性選別マーカーを含んでいる。通常、その遺伝子部分は、標的とされる遺伝子と同じ種(例えば、マウス)に由来する。しかし、その部分は、それと相同組換えを行なうために標的とされる遺伝子と充分な配列相同性を持つならば、ヒトのような異なる動物種由来であってもよい。典型的に構造体はまた、内在性遺伝子と相同組換えを行なうように設計された部分の一つまたは両者の外側に配設された陰性選別マーカーを含んでいる(6,204,061参照)。任意に、その構造体はまた、内在性遺伝子と相同組換えを行なうように設計された部分の範囲内またはその末端の位置で、frtのような一対の部位特異的組換え部位を含んでいる。この構造体は、通常、電気穿孔法によりES細胞に導入され、陽性選別マーカー及びその側鎖部分の一部(並びに、もし存在する場合には、frt部位)を内在性遺伝子に導入する、内在性遺伝子との相同組換えを行なう。所望の組換えを行なったES細胞は、陽性及び陰性の選別により選別することができる。陽性選別は、所望の相同組換えが行なわれた細胞を選別し、陰性選別は、組換えが行なわれなかった細胞を選別する。これらの細胞は、インビトロで培養された着床前胚から得られる(Bradley 等., Nature 309, 255-258 (1984)(全ての目的においてその全体の引用により取り込まれる))。形質転換されたES細胞を、非ヒト動物の胚盤胞と組合せる。ES細胞は、胚をクローン化し、一部の胚においては、得られたキメラ動物の生殖系を形成若しくは付与する(Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988) (全ての目的のためにその全体を引用により取り込む)。キメラ動物は、非トランスジェニック動物と交配して、ヘテロ接合性トランスジェニック動物を作製することができる。ヘテロ接合性動物を相互に交配して、ホモ接合性動物を作製することができる。ヘテロ接合性動物またはホモ接合性動物のいずれも、flp組換え酵素を発現するトランスジェニック動物と交配することができる。組換え酵素の発現により、もし存在すれば、導入されたfrt部位間のDNA部分が削除される。
【0035】
機能的な不活性化は、他の種、例えばラット、ウサギ並びにその他のげっ歯類である、ヒツジのようなウシ科、ヤギのようなヤギ科、ブタのようなブタ科においても行なうことができ、ウシ及びバッファローのようなウシ科が適している。マウス以外の動物で機能的に不活性な遺伝子を作製するためには、核移植技術が、望ましい(Lai 等., Sciences 295, 1089-92 (2002)参照)。種々のタイプの細胞を、ES細胞及び胎児繊維細胞を含む、卵母細胞中に移植する核のドナーとして使用することができる。ドナー核は、構造体を導入したインビトロ培養細胞から得られ、上記のようにして(WO 98/37183 and WO 98/39416参照、それぞれ全ての目的のために全体を引用により取り込む)、内因性遺伝子との相同組換えを行なう。ドナー核は、卵母細胞中に、電気的または化学的に導入される融合によって(WO 97/07669, WO 98/30683 and WO 98/39416のいずれか一つを参照)、あるいはマイクロインジェクション(WO 99/37143参照、全ての目的についてその全体を引用して取り入れた)によって、導入される。次いで、移植卵母細胞を培養して胚に成長させ、次いで、それを偽妊娠雌動物の卵管に移植し、トランスジェニック仔の誕生に至る(WO 97/07669, WO 98/30683 and WO 98/39416のいずれか一つを参照)。ヘテロ接合導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を交配して、ホモ接合導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を作製することができる。
【0036】
本発明の一部のトランスジェニック動物は、BACE-1の一つまたは両者を不活性化した対立遺伝子、並びにアルツハイマー病、その病状、または基礎を成す生化学過程に関連する、他の表現型を与える第二導入遺伝子を持っている。例えば、一部のトランスジェニック動物は、BACE-1の一つまたは両者を不活性化した対立遺伝子、及び家族性アルツハイマー病に関係する変異のあるAPPの変異型をコードする第二導入遺伝子を持っている。そのような動物は、BACE-1の機能的に不活性化なトランスジェニック動物と、ヒトAPPの変異型を発現するトランスジェニック動物とを交配することにより作製することができる。後者の例としては、Games 等, 前出、によって記述されたAPPの717突然変異を持つマウス、及びMcConlogue 等, US 5,612,486 及びHsiao 等, Science 274, 99 (1996); Staufenbiel 等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt 等., Neuron 19, 939-945 (1997))によって記述されているようなAPPのスウェーデン突然変異を持つマウスがある。APPの717突然変異は、フェニルアラニン、グリシンまたはイソロイシンとすることができる。
【0037】
IV. スクリーニングの方法
本発明のトランスジェニック動物、またはそれに由来する細胞は、化合物をスクリーニングする種々の方法に有用である。一部の方法において、トランスジェニック動物は、BACE-1以外のβ−セクレターゼ活性を持つ酵素の阻害剤を同定するための化合物をスクリーニングするのに使用される。β−セクレターゼ切断によりATF-APP及びAβと呼ばれる二つの産物を生成する。したがって、切断反応及びその阻害は、これらフラグメントの何れかの発生によりモニターすることができる。ATF-APPの発生は、McConlogue 等, US 5,612,486により記述されているようにしてモニターすることができ、Aβは、本願の実施例またはUS 6,114,133に記述されているようにしてモニターすることができる。化合物による阻害は、化合物の存在する場合と存在しない場合のATF-APPまたはAβのレベルを比較することにより測定される。化合物が存在しない場合に比較して存在する場合にATF-APPまたはAβのレベルが減少すれば、化合物がβ−セクレターゼ活性の阻害剤であることを示す。β−セクレターゼ阻害剤である化合物は、アルツハイマー病の治療に対して潜在的に有用な薬理作用を持っており、さらにスクリーニングに用いることができる。本発明のトランスジェニック動物はまた、γ−セクレターゼ、あるいはプレセニリン1及び2を含む、APPに作用する他のタンパク分解酵素の阻害剤を、スクリーニングするのに有用である。γ−セクレターゼは、AβのC末端を生じさせ、その切断はAβペプチドまたはその抗原決定基の発生を追跡することによりモニターすることができる。Aβの種々の抗原決定基に対する抗体は、WO 00/72880に記述されている。
【0038】
本発明のトランスジェニック動物又はそれに由来する皮質細胞はまた、β−セクレターゼの阻害剤と判明した化合物の毒性プロフィールを調べるのに有用である(例えば、Games 等.,前出、のようなβ−セクレターゼ機能を持つマウスモデルにおける既報スクリーニングの結果のように)。毒性プロフィールは、多数のmRNAまたはそれによってコードされているタンパクの発現をモニターすることにより調べられる。発現をモニターするアレイ及び装置及びそれらを使用する方法は、Affymetrix社から入手することができる。被検阻害剤の発現プロフィールを、望ましくない副作用を持つ、又は持たない他の化合物のプロフィールと比較することができる(US 5,811,231; 6,040,138参照)。副作用の少ない1以上の化合物とプロフィールが類似していれば、その阻害剤は、副作用の可能性が少ないことを示すため、さらなるスクリーニングのための(例えば、臨床試験の)候補として残される。1以上の副作用を持つ化合物とプロフィールが類似していれば、阻害剤自体が副作用を生じ易いことを示している。これらの副作用は、阻害剤のβ−セクレターゼとの相互作用の結果として生じているわけではないので、そのβ−セクレターゼ阻害作用を残したまま望ましくない副作用を取り除くように阻害剤を設計し直すことは可能であろう。BACE-1ノックアウト動物は、作用機序を解明するためにも、薬剤とアルツハイマー病の治療という点での潜在的な活性との構造活性相関性を評価するためにも有用である。
【0039】
本発明のトランスジェニック動物またはそれに由来する皮質細胞は、機能的なBACE-1を持つアルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルと比較するための対照動物として使用することができる。BACE-1阻害剤は、BACE-1機能を持つトランスジェニック動物モデルにおいて、AβまたはATF-APPの生成を阻害するはずであり、機能的に不活性化されたBACE-1の両対立遺伝子を持つトランスジェニック動物では効果が無いはずである。
【実施例】
【0040】
本発明は、2系統のBACE-1ノックアウトマウスを開示する。即ち、一つはエクソン1の一部を置換したものであり、もう一つはエクソン4-8を削除したものである(図1A)。エクソン1の破壊は、開始メチオニンの直ぐ下流に挿入された発現カセットを含み、エクソン4-8欠失は、活性部位における二つのアスパラギン残基の一つを取り除いた。BACE-1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子における欠失は、発育に悪影響を及ぼさず、遺伝子型はほぼメンデル遺伝で予想される数で伝達された。特に、2系列のマウスのヘテロ接合×ヘテロ接合の交配による仔の遺伝子型は次の通りである。即ち、野生型:ヘテロ接合:ホモ接合=29:77:29(エクソン4-8系から生れた仔の数は比較的少なかったが、二つの系統の何れかである仔もおおよそメンデル遺伝に従っていた)。剖検を、エクソン1を破壊したBACE-1及びエクソン4-8を欠失したBACE-1 -/-、+/-及び+/+のマウスに対して行ない、肉眼的に組織の病理的異常を調べた(表1)。遺伝子型と明らかに関連する肉眼的な異常は、どの月齢においても認められなかった。最終体重及び脳、腎臓、副腎、胸腺、肝臓、膵臓、精巣及び卵巣の重量には、遺伝子型による相違はなかった。一般的に、BACE-1 -/- 、+/-及び+/+マウスの間には、肉眼的または顕微鏡的相違は認められなかった。特に、脳の形態は正常であった。
【0041】
BACE-1欠失動物は、その野生型及びヘテロ接合の同複仔と同様に正常に離乳し成長した。飼育ケージ中における動物の行動異常を繰り返し観察したが、何も認められなかった。7-17週齢の各遺伝子型の動物から、連続4日間24時間尿を採取した。尿量、pH、比重、尿沈渣、尿糖及びタンパクレベルを含む標準的尿検査値には遺伝子型による相違を認めなかった。また、BUN、クレアチニン、グルコース、トランスアミナーゼ、ビリルビン、電解質、クレアチンキナーゼ、及びアルカリ性ホスファターゼを含む臨床化学的パラメータについての標準的検査では、これらの動物の遺伝子型に関連する相違は検出されなかった。血液の細胞分画は、ホモ接合ノックアウト、ヘテロ接合、及び野生型の仔の間に差はなかった。
【0042】
BACE-1遺伝子のエクソン1を欠失した雌雄マウスについて生理的機能のいくつかの尺度並びに基礎的行動と反応性を試験した。50-120日齢の範囲(表1)の10匹の野生型(+/+)、10匹のヘテロ接合(+/-)及び10匹のホモ接合(-/-)マウスをこの試験に使用した。雌-/-マウス(n=2、共に範囲の上限)を除いて、日齢は性及び遺伝子型との間でバランスを取った。肉眼的な行動観察並びに身体的及び生理的な機能のスコアリングは、「SHIRPA」試験の修正版により行なった(Roger 等, Mamm. Genome, 8, 711-713 (1997)参照)。オープンフィールドの活動は、光電管を装着した行動監視装置で測定した。この試験成績は、より多数のマウスについて種々の月齢において試験されるまでは予備的なものと思われるが、遺伝子型の間には明らかな相違は認められなかった。
【0043】
全てのマウスは正常な歩行を示し、鼻での吸気、立ち上がり、排尿及び排便を含めて探索的行動は正常であった。この探索状態は、習性に従うものであり、全ての群で類似していた。握力(grip strength)に相違はなく、全てのマウスは、背中の表面を触れた時に正常に反応して強い立ち直り反射を示した。180°回転する時間として測定された向地性反応、及び垂直スクリーンの登り開始時間は、非常に速やかであり、全群で同じであった。全ての遺伝子型ともに、覚醒時に眼を開けており、角膜に軽く触れると瞬き反射を同じようにした。震顫または立毛を示す動物はなく、安静時呼吸及び体温には群による差はなかった。同様に、全ての遺伝子型において耳の内側を軽く触れた時に類似の耳翼反応の分布を示した。
【0044】
β-セクレターゼは、当初、操作上から特異的にAPPの切断を生じてAβのN末端及び完全な分泌フラグメントsAPPβを放出する活性として定義された。BACE-1は、その活性を持つタンパク分解酵素と同定されたが、BACE-1が脳細胞における唯一の、あるいは主なβ-セクレターゼであるかさえも不明である。β-セクレターゼ活性を低下させるBACE-1破壊の程度を検出するために、酵素活性を、-/-、-/+及び+/+の胎児の初代皮質培養において測定した。野生型培養のβ-セクレターゼ活性は、加えた細胞性タンパクの量に比例した。ホモ接合性BACE-1ノックアウト動物の初代皮質培養では、β-セクレターゼ活性は検出されなかった。しかし、野生型皮質培養に認められた活性は、27倍に希釈してもバックグランド以上の活性を示した。したがって、BACE-1は皮質細胞において主たるβ-セクレターゼである。図2A,2B及び2Cを参照。
【0045】
もしBACE-1が完全な細胞中でβ-セクレターゼとして機能しているならば、BACE-1ノックアウト培養においてAβレベルは減少していると予想される。脳細胞中におけるAPPプロセッシングに対するBACE-1の効果を測定するために、上記のβ-セクレターゼ活性に使用した初代皮質培養においてAβx-40を測定した。Aβx-40のELISAは、容易にげっ歯類Aβを検出するので、他のAβELISAの代りに使用した。ノックアウト-/-培養において、Aβx-40生産は、野生型培養に対して15倍減少していた。このAβペプチド生産の減少は、最近報告された他のBACE-1ノックアウトマウスの結果と一致している。さらに、この知見は、我々がこれらの培養で測定したβ-セクレターゼ活性の量と一致している。したがって、BACE-1は、皮質ニューロンにおける主要β-セクレターゼであり、Aβ生産に必要である。
【0046】
BACE-1が脳組織における主たるβ-セクレターゼであることを確認するために、酵素活性の測定を、エクソン1破壊BACE-1ノックアウトマウスの皮質P2ペレットについて行なった(図3A及び3B参照)。野生型マウスの皮質P2ペレットの酵素活性は、加えたタンパク量に比例し(データは示さず)、β-セクレターゼ活性の選択的阻害剤により完全に阻害された(図3A、I1)。一つのアミノ酸の違いにより親和性は100,000倍異なる、二つの基質類似阻害剤による酵素活性阻害のIC50値(図3A)は、P2ペレットにおいて、ヒト脳から精製した酵素の値と一致していた。従って、我々がP2ペレットにおいて測定した酵素活性は、精製されたBACE-1活性と同一の挙動を示す。野生型マウスにおいて、強い活性が観察されたが、-/-ノックアウトマウスの皮質抽出物には活性が検出されなかった(図3B)。このことはBACE-1が、生体マウス脳組織における主なβ-セクレターゼであることを示している。
【0047】
BACE-1ノックアウトマウスは、一般的に健康であり、そして脳において主要β-セクレターゼを欠損していることを我々は立証した。そのために、我々は独立した2系統のBACE-1ノックアウトマウスを作製し、生化学的、組織学的、臨床化学的及び行動学的な技術を使用してこれらの動物を調べた。BACE-1除去によりβ-セクレターゼ活性は低下し、Aβ生産を減少したが、これらのマウスには生理的にあるいは基礎的行動には肉眼的な欠陥がない。特に、これらのマウスは子宮内で正常に成長し、そしてノックアウト対立遺伝子は、メンデル遺伝により予測される比率で遺伝する。遺伝子型による明らかな異常は、新鮮な組織にも、若齢及び高齢の動物における脳の組織学的検査にも認められなかった。総合して、これらの知見は、BACE-1遺伝子は、発育には必要が無く、初期成人期を通して機能することを示している。
【0048】
脳は他の組織よりも高いレベルのβ-セクレターゼ活性を含んでいるので、行動パラダイムにおける振る舞いが、脳機能の鋭敏な指標として使用される。ホモ接合性及びヘテロ接合性のBACE-1ノックアウトマウスの予備的行動評価では、野生型の仔と比較して明らかな機能異常は認められなかった。BACE-1活性の欠損は、著しい過剰活動、鎮静、あるいはその他の運動失調を誘発しない。さらに、肉眼的な行動観察及び神経筋活性の試験は、これらの動物における基本的神経学的及び生理学的機能における明らかな欠陥を示さなかった。これらの結果は予備的なものであり、我々は現在両性の多数のマウスについて、そしてより繊細な効果を検出する種々な条件の下に、より詳細な行動分析を行なっている。
【0049】
重要なのは、β-セクレターゼ活性は、初代皮質培養中及びホモ接合性BACE-1ノックアウトマウスの脳中では検出されず、BACE-1が、マウス脳におけ主たるβ-セクレターゼ酵素であることが示されたことである。さらに、BACE-1は、ヒト脳においても主たるβ-セクレターゼのようである。明らかに、BACE-1の欠損は、初代皮質培養においてAβ生産の大幅な減少を生じる。内在性ネズミAPPからのAβ生産を検出するために全ての型のAβx-40を検出するELISAを使用する必要があったので、ノックアウト培養中に認められた少量の検出可能なAβは、Aβの開始アスパラギン酸を過ぎて開始する型が存在する可能性を示している。また、皮質培養がニューロン及びグリアの両細胞を含んでいたので、BACE2のβ-セクレターゼ活性はインビボでは立証されていないが、少量のAβが、低活性の他の酵素、例えばBACE2により生じた可能性がある。しかしながら、これらのデータは、BACE-1が、Aβ生産に必要とされる主なβ-セクレターゼであることを再度立証している。
【0050】
我々のデータは、BACE-1活性の薬理学的阻害は、Aβの生産を著しく減少することを示している。したがって、小分子のBACE-1阻害剤は、アルツハイマー病患者の脳においてアミロイド斑の蓄積を阻止するはずであり、既に存在する斑の成長を阻止するであろう。特に、BACE-1活性の欠失は、マウスにおいて充分に寛容であり、4ヶ月齢まで深刻な欠陥は認められていない。我々はまだ高齢マウスにおける評価を行なっていないが、BACE-1ノックアウトマウスの表現型が総合的に健康であることから、BACE-1阻害が重篤な副作用を招くとは思われない。
【0051】
APPが記述され、Aβとの関係が解明されて以来この15年間に、APPからAβへの代謝に関係する理論上の酵素に関する研究が徹底的に行なわれた。γ-セクレターゼ酵素は結局同定されなかったが、プレセニリンと関係するようである。BACE-1酵素の発見は、ADにおけるAβによる神経毒性を制するための可能な方法として研究し得る標的分子を提供した。BACE-1機能のノックアウトは深刻な発育異常も出生後の生化学的または行動的欠陥も生じない。これは著しい発育異常を生じるプレセニリン機能欠陥とは対照的である。この点においてこの事実は、BACE-1がAD薬物療法の開発において優れた治療標的であり、またこの酵素の小分子阻害剤がADの発症及び進行を止めるのに有用であることを示している。
【0052】
BACE-1ノックアウトマウスは、毒性、構造活性相関及びBACE-1阻害剤の候補化合物の有用性を試験し、評価するためにも使用することができた。
【0053】
我々はまたβ−セクレターゼノックアウトマウス及びGames 等, 前出、により記述されているPDAPPマウスとの交配を行なった。非機能性BACE-1のヘテロ接合性マウスをホモ接合性PDAPPと交配して、非機能性BACE-1及びFAD突然変異APP導入遺伝子の両者についてヘテロ接合性であるマウスを作製した(ヘテロ接合性BACE-1,PDAPPマウス)。この遺伝子型を持つマウスを相互に交配して、非機能性BACE-1及びFAD突然変異APP導入遺伝子についてホモ接合性であるマウスを作製した(ホモ接合性BACE-1,PDAPPマウス)。
【0054】
β−セクレターゼレベルの有意な減少が、ヘテロ接合性マウスに観察された(7日齢マウスで32%、1ヶ月齢マウスで52%)。Aβレベルは、2セットのマウスにおいてそれぞれ15-18%及び12%低下した。1ヶ月齢のマウスにおける減少は、Mann Whitney及びStudentのt検定で有意であった。若干の小さな減少が、Aβ42に認められ、これはMann Whitneyで有意であったがStudentのt検定では有意ではなかった。完全長APP及び分泌APPの合計レベルには有意な増加が認められた。
【0055】
ヘテロ接合性動物におけるAPPの増加はより大きく、Aβの減少はより著しかった。APPの増加は、β−セクレターゼ活性の減少と一致しており、PDAPPマウス脳における内在性APPのβ−セクレターゼ切断は、Aβの最終生産よりBACE-1活性とより密接に相関していることを示している。β−セクレターゼレベルとAβレベルとの間の比較的弱い相関は、Aβのレベルが、一部、例えばγ−セクレターゼによる代謝回転及びその後のプロッセシング等、他の因子によって決定されていることを示唆する。
【0056】
Aβ及びβ−セクレターゼのレベルは、いずれも、ホモ接合性マウス(すなわち、非機能的BACE-1対立遺伝子及び突然変異APP対立遺伝子についてのホモ接合性マウス)では検出されなかった。
【0057】
材料と方法
BACE-1標的組換えES細胞(エクソン4-8)の作製。
相同組換えに際して、BACE-1遺伝子のエクソン4から8が、FLP組換え酵素標的部位(frt部位)に挟まれるようにターゲッティングベクターを設計した。ゲノム遺伝子座に関して、5'領域での相同性は4.5 kbをカバーし、3'領域での相同性は第3のfrt部位までの4.3 kbをカバーし、付加的な3'領域での相同性は1.5 kbをカバーした。相同組換えの選別は、BACE-1遺伝子のエクソン3及び4の間にfrtに挟まれたネオマイシン耐性カセットの挿入により行なった。親胚性幹(10)細胞系E14(129/Ola)を、BACE-1遺伝子座の有効なターゲティングを達成するために使用した。電気穿孔の後、組換え細胞をG418(Geneticin,Gibco/BRL)で、陽性選別した。BACE-1遺伝子のターゲティング及び第3のfrt部位の組込みを、HpaI制限酵素消化及び3'外部プローブBを使用するサザンハイブリダイゼーションにより耐性ESクローン中に検出した。プローブBはプライマー
5'-GACAGATGAATTCCTATCTTG-3'(SEQ. ID. NO. 1)及び
5'-GTCTCTTCCTCATCAACTGTC-3'(SEQ. ID. NO. 2)を使用してマウスゲノムDNAからPCRにより作製した。一つのターゲティングベクターの組込みが確認された。適切にターゲティングされたES細胞を、C57BL/6マウスの胚盤胞中に注入した。キメラ仔をC57BL/6マウスと交配してflp標的組換えBACE-1対立遺伝子についてヘテロ接合性の動物を作製した。インビボで選別マーカーを除くために、これらのマウスを、C57BL/6×CBAに基づくCMVエンハンサー/ニワトリアクチンプロモーターの調節の下にflp組換え酵素を発現する形質転換マウスと交配した。
【0058】
エクソン1 BACE-1ノックアウトマウスの作製。
エクソン1の上流5.3 kb及び下流2.5 kbをカバーするネズミ129/SvEv株BrdのBACE-1をコードするラムダKOSゲノムクローンを、ノックアウトターゲッティングベクターを作製するために使用した(Wattler 等. Biotechniques, 26, 1150-1160 (1999)参照)、(図1C)。開始メチオニンの次の2塩基対から始まるエクソン1の165塩基対の削除及びエクソン1の末端の延長は、ターゲッティングベクター中の発現カセットにより置換される。ネオマイシン耐性遺伝子は、相同組換えの陽性選別用に組込まれ、HSV-チミジンキナーゼ遺伝子は、ランダムな組込みに対する陰性選別用に組込まれた。ターゲッティングベクターを129/SvEvBrd ES細胞中に電気穿孔により導入し、そしてクローンにG418(Geneticin, Gibco/BRL)によるネオマイシン耐性に対する陽性選別及びガンシクロビル(ロッシュ)によるチミジンキナーゼに対する陰性選別を行なって選別した。クローンについてXbaI消化及び図1Cに示すブローブPとのハイブリド形成を利用するサザン分析により、相同組換についてスクリーニングした。
プローブPは、プライマー
5'-CGGAGCCCAACTGTCAAAAAG-3'(SEQ. ID. NO. 3)、及び
5'-CCAACCGTGCCCTCCTGC-3'(SEQ. ID. NO. 4)を使用して、マウスゲノムDNAからPCRにより作製した。
組換えは、PvuIIによるゲノムDNAの消化及びプライマー
5'-GTGTCATGTAACTCAGGCTG-3'(SEQ. ID. NO. 5)及び
5'-GGTAATCTATGCAGAGCAGA(SEQ. ID. NO. 6)を使用して、マウスゲノムDNAからPCRにより作製したプローブとハイブリッド形成することにより確認した。
一つのターゲッティングベクターの組込みが確認された。適切な標的を持つES細胞を、C57Bl/6アルビノマウスの胚盤胞中に注入した。キメラ仔をC57Bl/6アルビノマウスと交配して、BACE-1ノックアウト対立遺伝子のヘテロ接合性の動物を作製した。ヘテロ接合性のマウス同士を交配してノックアウト対立遺伝子のホモ接合性マウスを作製した。実験マウスの遺伝子型は殺処理時に採取した組織により確認した。
【0059】
Aβ ELISA.
Aβx-40用のAβELISAは、捕捉用に抗体2G3を使用し、10μg/mlでコートし、抗体266をレポーターとして1μg/mlで使用した以外は、Johnson-wood 等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 1550-1555 (1997)の記述に従って実施した。げっし類Aβを対照として使用し、初代皮質細胞の培養に使用したのと同じ培地を、試験試料で均等な希釈率で標準反応に加えた。
【0060】
脳皮質培養。
BACE-1エクソン1破壊ヘテロ接合性(+/-)雌雄マウスを交配し、定期の妊娠によりE16マウス胎児を得た。初代皮質培養は個々の胎児の皮質から作製し、各胎児の後半身を上記のように遺伝子型分類に使用した。E16マウス胎児の大脳皮質を各胎児から個別に切り出し、すりつぶしてトリプシン処理し、単細胞懸濁液とした。細胞を、ポリエチレンイミンでコートした24ウエルプレートに、5%ウシ胎児血清(Gibco)及び5% Chang補助剤(Irvine Scientific)を含む神経培地(MEM, Gibco)中625,000細胞/ウエルの密度で入れた。インビトロで4-5日置いた後、培地を交換し、さらに1-3日インキュベートした後、Aβ ELISA用の調整培地に移した。
【0061】
培養細胞のβ-セクレターゼ活性測定。
初代培養皮質細胞をPBSで洗い、抽出用緩衝液(1 mM HEPES, pH7.5, 1 mM EDTA , 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μg/ml E-64及び10 μg/mlペプスタチン A)中で細胞を溶解し、14,000 rpm 5分間遠心分離した。上清部分について、APPのC末端125アミノ酸に融合させた細菌性マルトース結合タンパクを含む構造体を基質として使用して、β-セクレターゼ活性を直接測定した。酵素測定は、2時間37℃でインキュベートして行った。総細胞タンパクは、反応当たり2.5 μg未満であり、活性は加えたタンパクの量に比例した。
【0062】
脳ホモジネートにおけるβ-セクレターゼ活性測定。
殺処理後短時間でマウスから皮質を切り取り、重量を測定し、凍結した。以降の処理はすべて4℃あるいは氷上で行なった。マウス皮質を脳g当たり4 mlのホモジネーション緩衝液(250 mMスクロース,2 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH7.5)中でホモジネートした。懸濁液を1,000 x gで20分間遠心分離した。上清を保存し、ペレットをホモジネーション緩衝液に再懸濁し、前と同様に遠心分離した。上清を最初の上清と合わせて16,000 x gで20分間遠心分離した。生成したペレット(P2)を1.5 mlのP2抽出緩衝液(150 mM塩化ナトリウム,2 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 20 mM MES, pH 6.0, 5μg/mlロイペプチン,2μg/ml E64, 1.0 μg/mlペプスタチン,0.2 mM PMSF)と1時間攪拌して抽出した。懸濁液を16,000 x gで20分間遠心分離した。抽出された上清を、Tris塩基で中和し、APPのC末端125アミノ酸に融合した細菌性マルトース結合タンパクを含む構造体を基質として使用して、β-セクレターゼ活性を測定した、ただし、酵素測定反応は、2時間37℃インキュベートし、ELISA測定の前に1/5に希釈した。酵素活性は、測定に使用したP2ペレットのタンパク量に対して正規化した。ヒトBACE-1対照は前記のように脳から精製した(Sinha , Nature, 402, 537-540 (1999)参照)。
【0063】
肉眼的行動観察及びオープンフィールド活動測定。
身体及び生理機能の肉眼的な観察及びスコアリングは「SHIPRA」試験の修正法に従って行なった。水平活動の測定は、ホトセルを装着したDigiscan活動測定装置で行なった。
【0064】
動物の取扱。
動物の取扱は、全て本研究所の動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールを使用した。行動観察及び剖検に先立って、エクソン1破壊動物を採尿代謝ケージ中で6日間順化させた。尿は連続4日間24時間尿を採取した。尿分析項目は、尿量、比重、pH、タンパク、グルコース、ケトン、潜血、ウロビリノゲン、黄疸試験及び尿沈渣であった。剖検時には、マウスをイソフルオランで麻酔し、後大静脈から完全な血球分類及び血清生化学分析を行なうための採血をした。血液検査は、標準的細胞計数、塗沫標本の血球分類及び形態評価であった。血清生化学分析はBUN、グルコース、クレアチニン、コレステロール、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギンアミノトランスフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、総タンパク、アルブミン、リン、カルシウム、クレアチンキナーゼ、ナトリウム、カリウム、塩素イオン、トリグリセリド、総ビリルビン、及び直接ビリルビンについて行なった。CBCを表1のエクソン4-8欠失動物について行なった。
【0065】
詳細な肉眼的剖検を行なった。最終の体重、並びに脳、腎臓、副腎、胸腺、肝臓、精巣または卵巣の重量を測定した。マウスを、脳における生化学的測定を容易にするために、ヘパリン加0.9%食塩液で左心室を通して潅流した。脳を取出し、2等分し、右半分から皮質、海馬、小脳、及び中脳を取出し生化学分析用に凍結した。左半分の脳は4%パラホルムアルデヒド中で固定した。脳(小脳、脳幹、皮質、海馬、下垂体、及び嗅葉)の連続切片を検査した。
【0066】
表1.剖検及び組織学検査を行なったBACE-1ノックアウト動物。
エクソン1破壊動物も行動観察に使用した。
【0067】
【表1】
【0068】
本発明について明確にし、理解を深める目的で詳細な記述をしたが、この開示を読むことにより当業者には、本発明の範囲から離れること無く形や細部に変更を加え得ることは明らかであろう。上記の例は本発明を説明するために提供したものであり、範囲を限定するものではない。本発明のその他の変異体は当業者には明らかであり、本発明の請求の範囲に包含されるものである。したがって、本発明の範囲は上記説明によって決定するのではなく、均等な価値の完全な範囲を持つ追加の特許請求の範囲によって決定されるべきである。本申請に引用された全ての出版物、参考文献、及び特許文献は、各個別出版物または特許文献がそれぞれ記述する程度に、全ての目的についてその全体を引用して取り入れた。
【図面の簡単な説明】
【0069】
【図1A】エクソン4-8を欠損したBACE-1ノックアウトマウスの作製及び遺伝子型に関する。3個のfrt部位(灰色三角)及びネオマイシン耐性遺伝子がES細胞に適切に組込まれた状態を示す。
【図1B】エクソン4-8を欠損したBACE-1ノックアウトマウスの作製及び遺伝子型に関する。左側の二つのサザンブロットは、マウスが、標的対立遺伝子を含む標的ES細胞を使用して作製されたことを示している。ターゲットBACE-1ヘテロ接合体マウスとCMVエンハンサー/ニワトリアクチンプロモーターの調節の下にflp組換え酵素を発現する形質転換マウスを交配することにより、右側サザンブロットに示されるようにヘテロ接合性新生仔においてエクソン4-8が欠失している。
【図1C】エクソン4-8を欠損したBACE-1ノックアウトマウスの作製及び遺伝子型に関する。エクソン1における欠失及び挿入によるBACE-1ノックアウトマウスの作製を示す。エクソン1を含むBACE-1ゲノム遺伝子座の部分を下線と印を付けたエクソン1の位置(黒枠)で示し、開始メチオニンの位置をATGで示す。発現カセットにより置換される領域に下線を付け、そしてデルタKOで示す。ノックアウト遺伝子座の構造は下に縞の枠で示される挿入された発現カセットにより示される。IRESは、ポリシストロン性翻訳のための内部リボソーム結合部位を示す。βGALは、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を、MC1 NEOはポリオーマエンハンサー/単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターによるネオマイシン耐性遺伝子発現用発現カセットを示す。
【図2A】野生型及びホモ接合性BACE-1ノックアウトマウスの初代皮質細胞におけるβ-セクレターゼ活性及びAβ生産に関する。初代皮質培養は、エクソン1破壊BACE-1ノックアウトマウス雌雄-/+の交配により得られた-/-及び+/+の胎児個体から作製した。5日間プレートに置き、培地を交換し、2日後に細胞を採取した。培地も培地交換の後1,2及び3日後に採取した(図2B及び図2Cも同じ)。β-セクレターゼ活性は+/+(WT、丸)及び-/-(KO、三角)初代皮質培養の細胞抽出において測定し、そして反応に加えた細胞タンパクの関数として示した。
【図2B】細胞抽出タンパク2.3μg中のβ-セクレターゼ活性が+/+(WT)及び-/-(KO)胎児により示された。
【図2C】採取3日後に培地に放出されたAβx-40wが、+/+(WT)及び-/-(KO)胎児により示された。多数のウエルから採取したAβx-40測定値はウエル中の細胞タンパクのmgに対して正規化した。誤差棒は標準偏差を示す。
【図3A】BACE-1ノックアウトマウスの脳におけるβ-セクレターゼ活性及び阻害に関する。スタチン由来基質類似β-セクレターゼ阻害剤P10‐P4' statV (I1、丸及びひし形)及びP10‐P4' stat(I2、四角及び三角)を、野生型P2ペレット(黒ひし形及び黒三角)及びヒト脳から精製したBACE-1(白丸及び白四角)のβ-セクレターゼ活性の阻害に使用した。精製BACE-1及びP2ペレットの両者に対してI1は2 nMのIC50を有し、I2は200μMのIC50を有する。
【図3B】BACE-1ノックアウトマウスの脳におけるβ-セクレターゼ活性及び阻害に関する。ホモ接合性及びヘテロ接合性のエクソン1破壊BACE-1ノックアウトマウスの脳ホモジネートにおいて測定したβ-セクレターゼ活性を示す。4匹の+/+及び4匹の-/-マウスの脳皮質をホモジネートし、β-セクレターゼ活性を方法について記述したようにP2ペレットで測定した。P2膜タンパクのmg当たりの活性を示す。-/-検体の活性は検定の検出限界以下である。誤差棒は標準偏差を示す。
Claims (34)
- β−セクレターゼ1(BACE-1)遺伝子の非機能性対立遺伝子を少なくとも一つ含むトランスジェニック非ヒト動物。
- 該対立遺伝子が、ホモ接合性である請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- げっ歯類である請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- マウスである請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該動物またはその先祖が、その遺伝子の内在性対立遺伝子と、その遺伝子と充分な配列関連性を示す部分によって挟まれている陽性選別マーカーを含む構造体との相同組み換えにより作製されて、該構造体が該内在性対立遺伝子と組み換えられ、該陽性選別マーカーが該内在性対立遺伝子に導入されて、該内在性対立遺伝子を非機能性とする、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
- 該動物またはその先祖を、その遺伝子の内在性対立遺伝子と、その遺伝子と充分な配列関連性を示す部分によって挟まれている陽性選別マーカーを含む構造体との間の相同組換えにより作製し、これらの部分をfrt組換え部位に挟むことによって該構造体に内在性対立遺伝子との組換えを行なわせ、陽性選別マーカー及びfrt組換え部位を内在性対立遺伝子に導入し、該frt組換え部位は、それによって、flp組換え部位の間に存在するDNAと組換えを行なって欠失非機能型の内在性対立遺伝子を生じている請求項1に記載のトランスジェニック動物。
- 該対立遺伝子が、遺伝子におけるエクソンの少なくとも一の部位の欠失により、非機能性を付与されている、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
- 該対立遺伝子が、遺伝子のエクソン1の少なくとも1の部位の欠失により、非機能性を付与されている、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
- 該対立遺伝子が、BACE-1のラムダKOSゲノムクローンを含むターゲッティングベクターとの相同組換えにより、非機能性を付与されている、請求項8に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該ラムダKOSゲノムクローンが、エクソン1の上流5.5 kb及び下流2 kbをカバーするネズミ129/SvEv株のBACE-1核酸を含む、請求項9に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該対立遺伝子が、開始メチオニンの後の2塩基対から始まるエクソン1の165塩基対の欠失、並びにトランスジェニック非ヒト動物を作製するために使用された129ES細胞中に電気穿孔導入されたターゲッティングベクター中の発現カセットで置換されたエクソン1末端の延長により、非機能性を付与されている、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該対立遺伝子が、エクソン4-8の欠失により、非機能性を付与されている、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- さらに、家族性アルツハイマー病に関係するAPP遺伝子の突然変異を有する導入遺伝子を含む、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該導入遺伝子が、ヒトAPP695のコドン595及び596における突然変異体、またはそのイソフォーム若しくはフラグメントを含み、位置595及び596に対応する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、アスパラギン及びロイシンである請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該導入遺伝子が、APP770のコドン717の突然変異体、または717位置の突然変異アミノ酸残基を持つAPP770のイソフォーム若しくはフラグメントを含む、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該突然変異アミノ酸残基が、イソロイシン、フェニルアラニンまたはグリシンである、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該動物が、非機能性対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該動物が、該導入遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項1に記載のトランスジェニック動物から誘導した、皮質細胞培養。
- 該細胞培養が、初代細胞培養である請求項19に記載の皮質細胞培養。
- 該細胞培養が、Aβのアミノ酸残基13-28を認識する抗体によって認識されるペプチドを、検出可能な量含んでいる請求項19に記載の皮質細胞培養。
- Aβのアミノ酸残基13-28を認識する抗体によって認識されるペプチドの、β−セクレターゼ以外のタンパク分解酵素(「非β−セクレターゼタンパク分解酵素」)による生産の阻害をスクリーニングする方法において、
請求項1に記載のトランスジェニック動物またはそれから誘導した皮質細胞培養を、ある薬剤に曝露し、
該薬物に曝露したトランスジェニック動物または細胞培養中のペプチド生産を検出する工程を含み、
該薬物に曝露されていないトランスジェニック動物または細胞培養と比較して、曝露されたトランスジェニック動物または細胞培養におけるペプチド生産の減少を、阻害作用の指標とする、上記方法。 - 該皮質細胞培養を、薬剤に曝露する請求項22に記載の方法。
- 該皮質細胞培養が、初代細胞培養である請求項22に記載の方法。
- 請求項1のトランスジェニック動物またはそれから誘導した皮質細胞培養を、β−セクレターゼ阻害剤に曝露し;
該阻害剤の投与に対応してトランスジェニック動物または皮質細胞の少なくとも1成分のレベルについての変化を測定する工程を含み、
該少なくとも1成分のレベルの変化を、潜在的副作用の指標とする、β−セクレターゼの阻害剤の潜在的副作用を分析する方法。 - 該測定工程が、複種のmRNAのレベルを測定する工程である、請求項25に記載の方法。
- β−セクレターゼ1(BACE-1)遺伝子の非機能性対立遺伝子の少なくとも一つを含む胚性幹細胞。
- 該対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項27に記載の胚性幹細胞。
- マウス胚性幹細胞である請求項27に記載の胚性幹細胞。
- 相同組換えの際に、BACE-1遺伝子のエクソン4から8が、FLP組換え酵素標的部位(frt部位)に挟まれるように設計された、ターゲッティングベクターとの相同組換えにより作製される請求項27に記載の胚性幹細胞。
- ゲノム遺伝子座に関して、5'領域での相同性は4.5 kbをカバーし、3'領域での相同性は第3 frt部位至るまでの4.3 kbをカバーし、付加的な3'領域での相同性は1.5 kbをカバーするように設計されたターゲッティングベクターとの相同組換えにより作製される請求項30に記載の胚性幹細胞。
- BACE-1のエクソン4-8を欠失した非機能性対立遺伝子についてホモ接合性である請求項27に記載の胚性幹細胞。
- BACE-1遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を導入する第1ターゲッティングベクター、並びにネオマイシン耐性遺伝子をヒグロマイシン耐性遺伝子カセットで置換している第2ターゲッティングベクターによる相同組換えを行なうことにより作製される請求項27に記載の胚性幹細胞。
- 請求項27に記載の胚性幹細胞の分化により形成された胚盤胞。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27109201P | 2001-02-23 | 2001-02-23 | |
US27151401P | 2001-02-26 | 2001-02-26 | |
US29376201P | 2001-05-25 | 2001-05-25 | |
PCT/US2002/005639 WO2002068955A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-02-22 | Transgenic knockouts of bace-1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004524843A true JP2004524843A (ja) | 2004-08-19 |
Family
ID=27402337
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002567822A Pending JP2004524843A (ja) | 2001-02-23 | 2002-02-22 | Bace−1のトランスジェニックノックアウト |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7309811B2 (ja) |
EP (1) | EP1434988A4 (ja) |
JP (1) | JP2004524843A (ja) |
CA (1) | CA2438832A1 (ja) |
WO (1) | WO2002068955A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013501520A (ja) * | 2009-08-11 | 2013-01-17 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 標的改変によるホモ接合生物 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7115410B1 (en) * | 1999-02-10 | 2006-10-03 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | β-secretase enzyme compositions and methods |
US7605249B2 (en) * | 2002-11-26 | 2009-10-20 | Medtronic, Inc. | Treatment of neurodegenerative disease through intracranial delivery of siRNA |
US20050009110A1 (en) * | 2003-07-08 | 2005-01-13 | Xiao-Jia Chang | Methods of producing antibodies for diagnostics and therapeutics |
JP2007522129A (ja) * | 2004-01-21 | 2007-08-09 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | アスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬を用いるアミロイドーシスの処置方法 |
WO2006099379A2 (en) * | 2005-03-14 | 2006-09-21 | Transtech Pharma, Inc. | Benzazole derivatives, compositions, and methods of use as b-secretase inhibitors |
US9277737B2 (en) | 2006-09-21 | 2016-03-08 | Probiodrug Ag | Mouse models carrying a knock-out mutation of the QPCTL-gene |
AU2010251176A1 (en) * | 2009-05-19 | 2011-12-08 | Probiodrug Ag | Mouse models carrying a knock-out mutation of the QPCTL-gene |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4666829A (en) | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
US6040138A (en) | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
US5604102A (en) | 1992-04-15 | 1997-02-18 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors |
AU692434B2 (en) | 1993-01-21 | 1998-06-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and diagnostic kits utilizing mammalian stress promoters to determine toxicity of a compound |
US6114133A (en) | 1994-11-14 | 2000-09-05 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) |
GB9517780D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
US5945577A (en) | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
GB9703550D0 (en) | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
WO1998039416A1 (en) | 1997-03-06 | 1998-09-11 | Infigen, Inc. | Method of cloning animals |
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US6331659B1 (en) | 1998-01-21 | 2001-12-18 | University Of Hawaii | Cumulus cells as nuclear donors |
KR100866676B1 (ko) | 1998-09-24 | 2008-11-11 | 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 | 알츠하이머병 세크레타제 |
WO2000047618A2 (en) * | 1999-02-10 | 2000-08-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | HUMAN β-SECRETASE ENZYME, INHIBITORS AND THEIR COMPOSITIONS AND USES |
AU2002243391A1 (en) * | 2000-10-27 | 2002-06-24 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Beta-secretase transgenic organisms, anti-beta-secretase antibodies, and methods of use thereof |
-
2002
- 2002-02-22 JP JP2002567822A patent/JP2004524843A/ja active Pending
- 2002-02-22 WO PCT/US2002/005639 patent/WO2002068955A1/en active Application Filing
- 2002-02-22 US US10/082,804 patent/US7309811B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-22 CA CA002438832A patent/CA2438832A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-22 EP EP02719072A patent/EP1434988A4/en not_active Ceased
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013501520A (ja) * | 2009-08-11 | 2013-01-17 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 標的改変によるホモ接合生物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20020194632A1 (en) | 2002-12-19 |
WO2002068955A1 (en) | 2002-09-06 |
EP1434988A4 (en) | 2005-12-14 |
CA2438832A1 (en) | 2002-09-06 |
US7309811B2 (en) | 2007-12-18 |
EP1434988A1 (en) | 2004-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Von Koch et al. | Generation of APLP2 KO mice and early postnatal lethality in APLP2/APP double KO mice | |
Zheng et al. | Mice deficient for the amyloid precursor protein gene | |
Roberds et al. | BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary β-secretase activity in brain: implications for Alzheimer’s disease therapeutics | |
Qian et al. | Mutant human presenilin 1 protects presenilin 1 null mouse against embryonic lethality and elevates Aβ1–42/43 expression | |
US6187992B1 (en) | Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene | |
Forss‐Petter et al. | Targeted inactivation of the X‐linked adrenoleukodystrophy gene in mice | |
Zekri et al. | Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP | |
Eliason et al. | A knock-in reporter model of Batten disease | |
Jiang et al. | Targeted disruption of Nphp1 causes male infertility due to defects in the later steps of sperm morphogenesis in mice | |
US20060015954A1 (en) | GPR54 knock-out mammals and screening methods using them | |
JP2001517065A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
US6452065B2 (en) | Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background | |
JP2023104002A (ja) | エクソンヒト化マウス | |
US7309811B2 (en) | Transgenic mice knockouts of BACE-1 | |
JP7442874B2 (ja) | アルツハイマー病における標的としてのtpkの使用 | |
JP4550530B2 (ja) | シナプス成熟障害モデル動物 | |
US20080120731A1 (en) | Transgenic Animal Models for Neurodevelopmental Disorders | |
JP5308651B2 (ja) | Drp1欠損非ヒト哺乳動物 | |
JP2002543767A (ja) | 生殖細胞と体細胞が4e−bp1をコードするdnaにノックアウト突然変異を含有する非ヒトトランスジェニック動物 | |
US20080295186A1 (en) | Neurotrypsin overexpressing animal | |
US20030121069A1 (en) | Disruption of the phosphodiesterase 10 gene | |
US8101816B2 (en) | RGMc modified transgenic animals | |
US20080268445A1 (en) | Ant2 Conditional Knockout Mouse and Methods | |
JPWO2004113531A1 (ja) | 条件的自食作用欠損動物及び疾患モデル動物 | |
JP2000504202A (ja) | 本来のアミロイド前駆体タンパク質欠失トランスジェニック動物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070126 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070425 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070507 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070525 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070601 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070626 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070703 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070726 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081125 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090225 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20090202 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090304 |
|
A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20090721 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090803 |