JP4550530B2 - シナプス成熟障害モデル動物 - Google Patents
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ラットドレブリンcDNAのA型特異的挿入配列(ins2)をプローブとして、B6JマウスBACライブラリー(RPCI−23)(アメリカ合衆国Children’s Hospital Oakland Research Institute BAC/PAC Resources)をスクリーニングし、ドレブリンのコーディング領域を含む陽性クローンを得た。
陽性クローン(全長約200kbp)をいくつかの制限酵素で分断し、A型特異的挿入配列(ins2、エクソン11aに相当)を含む断片 HK(13.5kb)(図1;drebrin gene HK 13.5Kb 参照)を単離した。PCRの方法を使ってエクソン11aの216塩基上流にloxPを、154塩基下流にfrtで挟んだneo耐性遺伝子(pKG−neo)、さらにこれより67塩基下流にもう一つのloxPを挿入した。これにより、ドレブリンA特異的エクソン11aはfrtで挟まれたneo遺伝子とともに2つのloxPで挟まれた形(…〈エクソン10〉…〈loxP〉…〈エクソン11a〉…〈frt・neo・frt〉…〈loxP〉…〈エクソン11c〉…)となる(図1;targeting vector 参照)。また、ターゲティングベクター5’端となるBサイトに後の組み換え体のネガティヴ選別のためにジフテリア毒素A遺伝子を挿入した。図1には、ターゲティングベクター構築の概略が示されている。
実施例2で構築したターゲティングベクターを直鎖状として、C57BL/6Jマウスで樹立したES細胞(MS12)にエレクトロポレーション(電気穿孔法)により導入し、G418存在下で生存、増殖するESクローンを単離した。単離したESクローンのうちターゲティングベクターが相同組み換えされたものをサザンブロットで選別した(図2参照)。すなわち、ES細胞のゲノムDNAをKpnIで消化しアガロースゲル電気泳動後ナイロン膜に転写し、RI標識したドレブリン遺伝子SacI-EcoRI断片あるいはエクソン11Aをプローブとしてハイブリッド形成させ、オートラジオグラムにより陽性バンドを検出した。野生型では、いずれのプローブによっても約5.8kbのバンドのみ検出されるが、相同組み換えを起こしたものでは野生型のバンドの他に約7.9kbのバンドも検出される。
組み換えES細胞をICR由来の桑実胚へマイクロインジェクションし、これを偽妊娠の仮親子宮内に移植した。ES細胞由来の体細胞を高割合で有するキメラ個体を親として、組み換え遺伝子を有する子孫F1を得た。また、組み換え遺伝子を有する個体F1と、C57BL/6とを掛け合わせて得た受精卵に組み換え酵素flippaseの発現ベクターをマイクロインジェクションし、それを仮親に移植し組み換えfrtで挟まれたneo遺伝子を欠失した個体を得た。この個体では組み換えES細胞クローンの選別に用いたneo遺伝子を欠失している(…〈エクソン10〉…〈loxP〉…〈エクソン11a〉…〈frt〉…〈loxP〉…〈エクソン11c〉…)が、2つのloxPがドレブリンA特異的なエクソン11a(ins2)を挟む形で挿入されている。このFloxマウスでは細胞種、発生時期や薬物誘導などにより時期限定して組み換え酵素Creを発現するマウスとの掛け合わせにより、loxPで挟まれた領域(ins2を含む)を条件性(conditional)に欠失させることが可能となる。
組み換え遺伝子を有する個体F1を片親とし、発生初期から全細胞で組み換え酵素Creを発現しているトランスジェニックマウス(E2A−Cre)をもう一方の片親とし、これらを掛け合わせることで、2つのloxPで挟まれた領域(ins2とneo遺伝子を含む)を欠失したマウスのヘテロ個体を得た。この結果生じた2つのloxP配列にはさまれたドレブリンA特異的エクソン11Aを欠失させたヘテロマウスの雌雄を掛け合わせることによってドレブリンA特異的ノックアウトマウスを得た。ノックアウトのホモ個体は尾のDNAを使ったgenotyping(PCRによる)によって同定した。すなわち、エクソン11A周辺のプライマーを使うことにより野生型(WT:1,171bp)、ノックアウトヘテロ(802bpと1,171bp)、ノックアウトホモ(KO:802bp)を判別した。このドレブリンA特異的ノックアウトマウスではドレブリンAアイソフォームだけが欠失し、ドレブリンAの代わりにドレブリンEが発現されることから、ドレブリンEアイソフォームは残っている(…〈エクソン10〉…〈loxP〉…〈エクソン11c〉…)。
(1)ウェスタンブロット分析1
生後5〜6週齢のドレブリンAノックアウトマウス(ホモ)と生後11週齢の野生型マウスとをエーテルで麻酔後、頚椎を脱臼させ、大脳皮質を取り出し、それぞれ100μg(湿重量)を用いてウェスタンブロット分析を行った。結果を図3に示す。図3において、1,3,5レーンは野生型マウス、2,4,6レーンはドレブリンAノックアウトマウスであり、1,2レーンにはドレブリンA及びドレブリンEのC末端を共に認識するM2F6モノクローナル抗体を用い、2,4レーンにはシナプスタンパク質であるPSD95を認識する抗PSD95抗体を用い、5,6レーンにはドレブリンA及びドレブリンEのN末端を共に認識する抗ドレブリンADF−Hドメイン血清を用いた。図3の1レーンのバンドはドレブリンAを示し(本来大脳皮質においてはドレブリンAのみが発現する)、2レーンは(ドレブリンAより分子量が小さい)ドレブリンEを示しており、ノックアウトマウスではドレブリンAを発現することはないが新たにドレブリンEを発現していることがわかる。また、図3の3レーンのバンドに比べて4レーンのバンドは薄く、ノックアウトマウスではシナプス異常が生じていることが示唆されている。図3の5レーンのバンドはドレブリンAを示し、6レーンは(ドレブリンAより分子量が小さい)ドレブリンEを示しており、本ノックアウトマウスではドレブリンのN末端部を有するドレブリン分解物ではなく、ドレブリンAの代わりに完全長のドレブリンEが発現していることがわかる。
上記ウェスタンブロット分析1で用いたドレブリンAノックアウトマウス(KO(-/-))と野生型マウス(WT(WT / WT))の大脳皮質のホモジェネートを8%ゲルで泳動して、ウェスタンブロット分析を行った。1次抗体としては、ドレブリンAを特異的に認識するDAS2抗血清(×10000)を用い、2次抗体としてはHRP α mouse(×10000)を用いた。結果を図4に示す。図4から、ドレブリンAノックアウトマウス(ホモ)は、野生型マウスが発現するドレブリンAを発現していないことがわかる。
生後10週齢のドレブリンAノックアウトマウスと同腹の野生型マウス(KO(WT / WT))をエーテルで麻酔後、頚椎を脱臼させ、脳を取り出し、大脳、小脳、海馬を分離し、各々について50×量のサンプルバッファーでホモゲナイズし、各5μLを用いてウェスタンブロット分析を行った。1次抗体としては、ドレブリンのC末端エピトープを認識するM2F6モノクローナル抗体(×10000)を用い、2次抗体としてはHRP α mouse(×10000)を用いた。KO(WT / WT)と同様に、ノックアウトヘテロ(KO(WT/-))や、ドレブリンAトランスジェニックマウス(No43+)や、(No43+)と同腹の野生型マウス(No43−)についても、ウェスタンブロット分析を行った。なおウェスタンブロットにおける陽性対照としてベーターアクチン(×10000)を用いた。結果を図4に示す。図5において、左のレーンからKO(-/-)、KO(WT/-)、No43+、No43−を示す。大脳や海馬では本来ドレブリンAのみが発現し、小脳ではドレブリンEが発現する。図5の大脳や海馬におけるKO(WT / WT)、(No43+)及び(No43−)のバンドはドレブリンAを示し、KO(WT/-)の上下近接した2つのバンドはドレブリンAと(ドレブリンAより分子量が小さい)ドレブリンEを示しており、ドレブリンAとドレブリンEが共に発現していることがわかる。図5の小脳におけるバンドは(小脳において本来発現する)すべてドレブリンEを示している。
図3〜5に示される結果から、ドレブリンAノックアウトマウス(ホモ)は、ドレブリンAを発現しない(図4)が、本来ドレブリンAが主に発現する大脳皮質や海馬においては、ドレブリンAに代わってドレブリンEが発現し、ドレブリンとしての発現総量は、野生型マウスのドレブリン発現総量に匹敵していることから、ドレブリンA欠損に起因するシナプスの成熟のみが障害され、その他のドレブリン関連機能が正常であることが示唆された。
(1)方法
ドレブリンA特異的ノックアウトマウス(KO、n=9)およびその同腹の野生型マウス(WT、n=10)をショック箱に入れ1分後に条件刺激(70dBの10kHzトーンを10秒間)と無条件刺激(0.5mAの床からの電撃ショック、1秒間)の組合せ刺激(トーンの開始から9秒後にショック)を20秒間隔で2回提示し、その後1分後にホームケージに戻した。条件づけの1日後にマウスを再びショック箱に入れ、コンテクスト依存性の恐怖反応(すくみ反応、フリージング)を調べた。
WTは1日前にショックを受けた箱に入れられると直ちに強いフリージングを起こした(コンテクスト依存性の恐怖反応、2分間の計測の平均71.5±4.9%)。一方KOではフリージングのレベルはWTに比べ有意に低かった(2分間の計測の平均44.3±11.7%、p<0.05)。生得的な情動を調べる行動テストではKOとWTに大きな違いはなかった。したがってドレブリンAアイソフォームの欠失は基本的な行動には影響しないが、少なくともある種の学習を障害する。学習記憶はそれに関連する神経回路上の機能的、構造的変化が必要であると考えられており、樹状突起スパインにおけるドレブリンAがその機序の鍵となる分子であることが示唆される。
Claims (8)
- ドレブリン遺伝子のエクソン11aが欠失した変異遺伝子を有する全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト哺乳動物及びその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ドレブリン変異遺伝子を保有し、ドレブリンAを発現する機能を失ない、かつドレブリンAに代えてドレブリンEを発現する機能を有する非ヒト動物からなるシナプス成熟障害モデル動物。
- Cre−loxPを用いてドレブリン遺伝子のエクソン11aが欠失した変異遺伝子であることを特徴とする請求項1記載のシナプス成熟障害モデル動物。
- ドレブリン遺伝子のエクソン11aが欠失した変異遺伝子が、ドレブリン遺伝子のエクソン11aの全部とエクソン11bの一部が欠失した変異遺伝子であることを特徴とする請求項1又は2記載のシナプス成熟障害モデル動物。
- 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物。
- 請求項1〜4のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後に被検物質を投与し、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を評価するシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。
- 請求項1〜4のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を指標としてシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法。
- 請求項1〜4のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞に被検物質を投与し、シナプス成熟障害の程度を評価するシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。
- 請求項1〜4のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、シナプス成熟障害の程度を指標としてシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法。
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