JP3471739B2 - α１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
α１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、α1EＣａ2+チャネ
ル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニ
ング方法、より詳しくは、電位依存性α1EＣａ2+チャネ
ルに依存する炎症性疼痛等の侵害受容性疼痛の予防・治
療薬のスクリーニング方法に関する。
ル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニ
ング方法、より詳しくは、電位依存性α1EＣａ2+チャネ
ルに依存する炎症性疼痛等の侵害受容性疼痛の予防・治
療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】電位依存的にカルシウムイオンを透過さ
せて情報伝達を行う膜タンパク質として知られる電位依
存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）は、Ｌ−、Ｎ−、
Ｐ−、Ｑ−、Ｒ−、及びＴ−タイプと名付けられたいく
つかの性質的に異なるグループに分類されている（Cell
Ca24, 307-323, 1998、Rev. Physiol. Biochem. Pharm
acol. 139, 33-87, 1999）。これらのタイプのＶＤＣＣ
は、神経伝達物質放出、膜興奮性、及び遺伝子発現のコ
ントロールを含むさまざまな神経細胞活性に対し重要な
役割を果たすことが知られている（Neuron 21, 13-26,
1998）が、各チャネルタイプの正確な役割は未だ明らか
となっていない。特に、Ｒ−タイプＣａ2+チャネル機能
の理解においては遅れている。Ｒ−タイプＣａ2+チャネ
ルは、もともとＬ−、Ｎ−、Ｐ−、Ｑ−タイプＣａ2+チ
ャネルに対するブロッカーにおいてもチャネル耐性であ
ると定義され（Neuropharmacology 32, 1075-1088, 199
3）、従って、Ｒ−タイプ電流が、いくつかの異なる薬
物耐性Ｃａ2+電流の混合物であるという可能性もある。
Ｒ−タイプＣａ2+チャネルは、特定の神経細胞のある一
定のセットにおける神経伝達物質の放出及び細胞体樹状
突起（somatodendritic）の興奮性に重大な役割を果た
すと示唆されているが（Neuropharmacology 32,1075-10
88, 1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4720-472
5, 1998、J. Neurosci. 19, 726-736, 1999）、このチ
ャネルの生理的機能は未だ不明である。
せて情報伝達を行う膜タンパク質として知られる電位依
存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）は、Ｌ−、Ｎ−、
Ｐ−、Ｑ−、Ｒ−、及びＴ−タイプと名付けられたいく
つかの性質的に異なるグループに分類されている（Cell
Ca24, 307-323, 1998、Rev. Physiol. Biochem. Pharm
acol. 139, 33-87, 1999）。これらのタイプのＶＤＣＣ
は、神経伝達物質放出、膜興奮性、及び遺伝子発現のコ
ントロールを含むさまざまな神経細胞活性に対し重要な
役割を果たすことが知られている（Neuron 21, 13-26,
1998）が、各チャネルタイプの正確な役割は未だ明らか
となっていない。特に、Ｒ−タイプＣａ2+チャネル機能
の理解においては遅れている。Ｒ−タイプＣａ2+チャネ
ルは、もともとＬ−、Ｎ−、Ｐ−、Ｑ−タイプＣａ2+チ
ャネルに対するブロッカーにおいてもチャネル耐性であ
ると定義され（Neuropharmacology 32, 1075-1088, 199
3）、従って、Ｒ−タイプ電流が、いくつかの異なる薬
物耐性Ｃａ2+電流の混合物であるという可能性もある。
Ｒ−タイプＣａ2+チャネルは、特定の神経細胞のある一
定のセットにおける神経伝達物質の放出及び細胞体樹状
突起（somatodendritic）の興奮性に重大な役割を果た
すと示唆されているが（Neuropharmacology 32,1075-10
88, 1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4720-472
5, 1998、J. Neurosci. 19, 726-736, 1999）、このチ
ャネルの生理的機能は未だ不明である。
【０００３】ＶＤＣＣは、α1、α2−δ、β及びγサブ
ユニットで構成される異種多重結合体（heteromultime
r）である。α1サブユニットは、チャネル機能に必須で
あり、各Ｃａ2+チャネルのタイプを決定する。現在まで
に１０種の異なるα1ｃＤＮＡ（α１A，α１B，α１C，
α１D，α１E，α１F，α１G，α１H，α１I，α１S）
がさまざまな組織からクローニングされ、このクローニ
ングされたα1サブユニットと天然Ｃａ2+チャネルとの
関係を明らかにするために数多くの研究がなされてきた
（Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 139, 33-87, 19
99）。α1サブユニットのほとんどは、選択的スプライ
シングによる分子的構造を持つことが知られており、ほ
とんどの場合、各α1のアイソフォームの機能的特性
は、関連する天然チャネルの特性と類似していることが
確認されている。しかし、α1Eサブユニットの場合、α
1Eサブユニットを有するＣａ2+チャネル（α1EＣａ2+チ
ャネル）が単一タイプのチャネルのみを表しているかど
うかは未だ明らかにされていない。
ユニットで構成される異種多重結合体（heteromultime
r）である。α1サブユニットは、チャネル機能に必須で
あり、各Ｃａ2+チャネルのタイプを決定する。現在まで
に１０種の異なるα1ｃＤＮＡ（α１A，α１B，α１C，
α１D，α１E，α１F，α１G，α１H，α１I，α１S）
がさまざまな組織からクローニングされ、このクローニ
ングされたα1サブユニットと天然Ｃａ2+チャネルとの
関係を明らかにするために数多くの研究がなされてきた
（Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 139, 33-87, 19
99）。α1サブユニットのほとんどは、選択的スプライ
シングによる分子的構造を持つことが知られており、ほ
とんどの場合、各α1のアイソフォームの機能的特性
は、関連する天然チャネルの特性と類似していることが
確認されている。しかし、α1Eサブユニットの場合、α
1Eサブユニットを有するＣａ2+チャネル（α1EＣａ2+チ
ャネル）が単一タイプのチャネルのみを表しているかど
うかは未だ明らかにされていない。
【０００４】不均一系において発現する場合、Ｔ−タイ
プチャネルの透過性（J. Neurosci.16, 4983-4993, 199
6）と類似した透過性を有するα1Eサブユニットは、高
電位活性化型チャネルと低電位活性化型チャネルとの間
の活性化電位範囲、すなわち中間電位活性化型チャネル
であろうと考えられている（Science 260, 1133-1136,
1993、Pflugers Arch. 433, 523-532, 1997）。さら
に、α1E遺伝子の発現は、マウス精子形成細胞及びラッ
ト心筋細胞におけるＴ−タイプチャネルの存在と関連し
ている（FEBS lett. 388, 150-154, 1996、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA94, 14936-14941, 1997）。これらの結
果は、α1Eサブユニットが少なくともＴ−タイプＣａ2+
チャネル機能の側面を有することを示唆している。言う
までもなく、α1E遺伝子ファミリーの他のメンバーの発
現は、高電位活性化型チャネルを発生させ（Nature(Lon
don) 363, 455-458, 1993、Receptors Channels 2, 303
-314, 1994）、神経細胞系ラットα1E遺伝子の発現と神
経細胞系Ｒ−タイプ・チャネルとの相互関係が証明され
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7760-7765, 199
8）、高電位により活性化されたＲ−タイプ・チャネル
におけるα1Eサブユニットの関連性を示唆している。
プチャネルの透過性（J. Neurosci.16, 4983-4993, 199
6）と類似した透過性を有するα1Eサブユニットは、高
電位活性化型チャネルと低電位活性化型チャネルとの間
の活性化電位範囲、すなわち中間電位活性化型チャネル
であろうと考えられている（Science 260, 1133-1136,
1993、Pflugers Arch. 433, 523-532, 1997）。さら
に、α1E遺伝子の発現は、マウス精子形成細胞及びラッ
ト心筋細胞におけるＴ−タイプチャネルの存在と関連し
ている（FEBS lett. 388, 150-154, 1996、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA94, 14936-14941, 1997）。これらの結
果は、α1Eサブユニットが少なくともＴ−タイプＣａ2+
チャネル機能の側面を有することを示唆している。言う
までもなく、α1E遺伝子ファミリーの他のメンバーの発
現は、高電位活性化型チャネルを発生させ（Nature(Lon
don) 363, 455-458, 1993、Receptors Channels 2, 303
-314, 1994）、神経細胞系ラットα1E遺伝子の発現と神
経細胞系Ｒ−タイプ・チャネルとの相互関係が証明され
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7760-7765, 199
8）、高電位により活性化されたＲ−タイプ・チャネル
におけるα1Eサブユニットの関連性を示唆している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】今日まで、哺乳類にお
いては１０種のα１サブユニットが見い出されている
が、個々のα１サブユニットを有するチャネルがどのよ
うな生理機能を担っているかは必ずしも明確ではない。
特にα1Eサブユニットを有するＣａ2+チャネル（α 1EＣ
ａ2+チャネル）は、特異的なブロッカーも現在のところ
見い出されておらず、その生理機能がよくわかっていな
い。本発明の課題は、α1EＣａ2+チャネルの生理機能を
明らかにすると共に、電位依存性Ｃａ2+チャネルに依存
する炎症性疼痛等の侵害受容性疼痛などのα1EＣａ2+チ
ャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法を提供することにある。
いては１０種のα１サブユニットが見い出されている
が、個々のα１サブユニットを有するチャネルがどのよ
うな生理機能を担っているかは必ずしも明確ではない。
特にα1Eサブユニットを有するＣａ2+チャネル（α 1EＣ
ａ2+チャネル）は、特異的なブロッカーも現在のところ
見い出されておらず、その生理機能がよくわかっていな
い。本発明の課題は、α1EＣａ2+チャネルの生理機能を
明らかにすると共に、電位依存性Ｃａ2+チャネルに依存
する炎症性疼痛等の侵害受容性疼痛などのα1EＣａ2+チ
ャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、α1EＣａ
2+チャネルの生理的機能を理解するため、薬理学的アプ
ローチではなく、遺伝子的アプローチが有効であると考
えた。そこで、ＥＳ細胞を用いたジーンターゲティング
によりα1E変異マウスを作製し、その生体における機能
を明らかにすることを試みた。まず、マウスα1Eサブユ
ニットをコードするカクナーレ（cacna1e）の第１エク
ソン内に核移行シグナルをつけた大腸菌βガラクトシダ
ーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子がインフレームで挿入されたタ
ーゲティングベクターを作製し、ＥＳ細胞Ｊ１に導入し
て相同組み換え体を得た。そして常法に従い変異マウス
を作製した。ホモ接合体変異マウス（α1E -/-）は自発
的運動の減少及び臆病性の兆候を示したが、他の一般的
行動は見たところ正常であった。一方、ヘテロ接合体変
異マウス（α1E +/-）を用いて、前記リポーター遺伝子
の発現によるＸ−ｇａｌ染色を行うことによりα1Eサブ
ユニットの発現部位を検討したところ、α1Eサブユニッ
トが脳内だけでなく、後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄後
角（ＳＣ）等の痛覚伝達コントロールに関連する様々な
部位で発現することを見い出した。最近、チャネルブロ
ッカーにより直接的に、又はレセプター／Ｇ−タンパク
質経路（Curr. Opin. Neurobiol. 8, 351-356, 1998）
により間接的に行うＣａ2+チャネル機能の調整が、痛覚
伝達をコントロールし、痛覚症状を和らげる治療手段と
して注目されている（Trends Pharmacol. Sci. 20,329-
337, 1999）。
2+チャネルの生理的機能を理解するため、薬理学的アプ
ローチではなく、遺伝子的アプローチが有効であると考
えた。そこで、ＥＳ細胞を用いたジーンターゲティング
によりα1E変異マウスを作製し、その生体における機能
を明らかにすることを試みた。まず、マウスα1Eサブユ
ニットをコードするカクナーレ（cacna1e）の第１エク
ソン内に核移行シグナルをつけた大腸菌βガラクトシダ
ーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子がインフレームで挿入されたタ
ーゲティングベクターを作製し、ＥＳ細胞Ｊ１に導入し
て相同組み換え体を得た。そして常法に従い変異マウス
を作製した。ホモ接合体変異マウス（α1E -/-）は自発
的運動の減少及び臆病性の兆候を示したが、他の一般的
行動は見たところ正常であった。一方、ヘテロ接合体変
異マウス（α1E +/-）を用いて、前記リポーター遺伝子
の発現によるＸ−ｇａｌ染色を行うことによりα1Eサブ
ユニットの発現部位を検討したところ、α1Eサブユニッ
トが脳内だけでなく、後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄後
角（ＳＣ）等の痛覚伝達コントロールに関連する様々な
部位で発現することを見い出した。最近、チャネルブロ
ッカーにより直接的に、又はレセプター／Ｇ−タンパク
質経路（Curr. Opin. Neurobiol. 8, 351-356, 1998）
により間接的に行うＣａ2+チャネル機能の調整が、痛覚
伝達をコントロールし、痛覚症状を和らげる治療手段と
して注目されている（Trends Pharmacol. Sci. 20,329-
337, 1999）。
【０００７】そこで、上記α1EＣａ2+チャネル発現の痛
覚コントロールシステムにおける生理学的関連性をさら
に調べるために、α1E変異マウスを用いて痛覚伝達に関
する各種の行動学的試験を行った。その結果、いくつか
の試験で、ヘテロ接合体変異マウス（α1E +/-）及びホ
モ接合体変異マウス（α1E -/-）は、野生型マウス（α
1E +/+）とは異なった応答を示した。すなわち、ヘテロ
接合体変異マウス及びホモ接合体変異マウスは、急性の
機械的刺激、熱刺激、及び化学的刺激に対し正常な痛覚
行動を示したが、炎症性体性痛に対しては鈍い応答を示
した。ホモ接合体変異マウスは、野生型マウスに比べて
も見たところ正常な応答を示したが、ヘテロ接合体変異
マウスは、炎症性内臓痛に対し鈍い応答を示した。さら
に、内臓痛刺激で前感作したホモ接合体変異マウスは、
下行性疼痛抑制経路の長期的影響が有力な野生型マウス
とは非常に対照的で、炎症性体性痛に対し強い応答を示
した。これらの結果は、α1EＣａ2+チャネルが、脊髄及
び脊髄上位のレベルで痛覚行動をコントロールしている
ことを示している。これまで、痛覚関連現象が欠損した
遺伝子変異マウスに関しいくつかの発表がされている
が、本発明者らにより作製されたα1E変異マウスは下行
性疼痛抑制経路欠損の可能性を示す最初のケースであ
る。本発明はかかる知見に基づいて完成するに至ったも
のである。
覚コントロールシステムにおける生理学的関連性をさら
に調べるために、α1E変異マウスを用いて痛覚伝達に関
する各種の行動学的試験を行った。その結果、いくつか
の試験で、ヘテロ接合体変異マウス（α1E +/-）及びホ
モ接合体変異マウス（α1E -/-）は、野生型マウス（α
1E +/+）とは異なった応答を示した。すなわち、ヘテロ
接合体変異マウス及びホモ接合体変異マウスは、急性の
機械的刺激、熱刺激、及び化学的刺激に対し正常な痛覚
行動を示したが、炎症性体性痛に対しては鈍い応答を示
した。ホモ接合体変異マウスは、野生型マウスに比べて
も見たところ正常な応答を示したが、ヘテロ接合体変異
マウスは、炎症性内臓痛に対し鈍い応答を示した。さら
に、内臓痛刺激で前感作したホモ接合体変異マウスは、
下行性疼痛抑制経路の長期的影響が有力な野生型マウス
とは非常に対照的で、炎症性体性痛に対し強い応答を示
した。これらの結果は、α1EＣａ2+チャネルが、脊髄及
び脊髄上位のレベルで痛覚行動をコントロールしている
ことを示している。これまで、痛覚関連現象が欠損した
遺伝子変異マウスに関しいくつかの発表がされている
が、本発明者らにより作製されたα1E変異マウスは下行
性疼痛抑制経路欠損の可能性を示す最初のケースであ
る。本発明はかかる知見に基づいて完成するに至ったも
のである。
【０００８】すなわち本発明は、電位依存性Ｃａ2+チャ
ネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト動物に被検物質
を投与し、該遺伝子変異非ヒト動物における侵害受容性
疼痛の程度を測定・評価することを特徴とするα1EＣａ
2+チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のス
クリーニング方法（請求項１）や、遺伝子変異非ヒト動
物における侵害受容性疼痛の程度を、野生型の非ヒト動
物の場合と比較・評価することを特徴とする請求項１記
載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾病の予防
・治療薬のスクリーニング方法（請求項２）や、電位依
存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト
動物が、電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニット遺
伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物であることを
特徴とする請求項１又は２記載のα1EＣａ2+チャネル機
能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング
方法（請求項３）や、非ヒト動物がマウスであることを
特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のα1EＣａ2+チ
ャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法（請求項４）や、侵害受容性疼痛が炎症性
疼痛であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記
載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾病の予防
・治療薬のスクリーニング方法（請求項５）や、電位依
存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト
動物に由来する細胞・組織に被検物質を接触せしめ、該
細胞・組織につながった脊髄における電気生理学的応答
の程度を測定・評価することを特徴とするα1EＣａ2+チ
ャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法（請求項６）や、脊髄における電気生理学
的応答の程度を、野生型の非ヒト動物の場合と比較・評
価することを特徴とする請求項６記載のα1EＣａ2+チャ
ネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリー
ニング方法（請求項７）や、電位依存性Ｃａ2+チャネル
α1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト動物が、電位依存性
Ｃａ2+チャネルα 1Eサブユニット遺伝子機能が染色体上
で欠損した非ヒト動物であることを特徴とする請求項６
又は７記載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾
病の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項８）
や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項
６〜８のいずれか記載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に
起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法（請
求項９）に関する。
ネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト動物に被検物質
を投与し、該遺伝子変異非ヒト動物における侵害受容性
疼痛の程度を測定・評価することを特徴とするα1EＣａ
2+チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のス
クリーニング方法（請求項１）や、遺伝子変異非ヒト動
物における侵害受容性疼痛の程度を、野生型の非ヒト動
物の場合と比較・評価することを特徴とする請求項１記
載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾病の予防
・治療薬のスクリーニング方法（請求項２）や、電位依
存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト
動物が、電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニット遺
伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物であることを
特徴とする請求項１又は２記載のα1EＣａ2+チャネル機
能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング
方法（請求項３）や、非ヒト動物がマウスであることを
特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のα1EＣａ2+チ
ャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法（請求項４）や、侵害受容性疼痛が炎症性
疼痛であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記
載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾病の予防
・治療薬のスクリーニング方法（請求項５）や、電位依
存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト
動物に由来する細胞・組織に被検物質を接触せしめ、該
細胞・組織につながった脊髄における電気生理学的応答
の程度を測定・評価することを特徴とするα1EＣａ2+チ
ャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法（請求項６）や、脊髄における電気生理学
的応答の程度を、野生型の非ヒト動物の場合と比較・評
価することを特徴とする請求項６記載のα1EＣａ2+チャ
ネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリー
ニング方法（請求項７）や、電位依存性Ｃａ2+チャネル
α1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト動物が、電位依存性
Ｃａ2+チャネルα 1Eサブユニット遺伝子機能が染色体上
で欠損した非ヒト動物であることを特徴とする請求項６
又は７記載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾
病の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項８）
や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項
６〜８のいずれか記載のα1EＣａ2+チャネル機能障害に
起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法（請
求項９）に関する。
【０００９】
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のα1EＣａ2+チャネル機能
障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方
法としては、電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニッ
ト遺伝子変異非ヒト動物に被検物質を投与し、該遺伝子
変異非ヒト動物における侵害受容性疼痛の程度を測定・
評価（解析）するスクリーニング方法や、電位依存性Ｃ
ａ2+チャネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト動物に
由来する細胞・組織に被検物質を接触せしめ、該細胞・
組織につながった脊髄における電気生理学的応答の程度
を測定・評価（解析）するスクリーニング方法であれば
特に制限されるものではないが、評価（解析）に際して
は、野生型の非ヒト動物の場合と比較・評価することが
好ましい。また、上記電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサ
ブユニット遺伝子変異非ヒト動物としては、電位依存性
Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニットをコードする遺伝子Ｄ
ＮＡの機能が染色体上で欠損したホモ接合変異非ヒト動
物（α1E -/ -）や、ヘテロ変異非ヒト動物（α1E +/-）を
挙げることができる。
障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方
法としては、電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニッ
ト遺伝子変異非ヒト動物に被検物質を投与し、該遺伝子
変異非ヒト動物における侵害受容性疼痛の程度を測定・
評価（解析）するスクリーニング方法や、電位依存性Ｃ
ａ2+チャネルα1Eサブユニット遺伝子変異非ヒト動物に
由来する細胞・組織に被検物質を接触せしめ、該細胞・
組織につながった脊髄における電気生理学的応答の程度
を測定・評価（解析）するスクリーニング方法であれば
特に制限されるものではないが、評価（解析）に際して
は、野生型の非ヒト動物の場合と比較・評価することが
好ましい。また、上記電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサ
ブユニット遺伝子変異非ヒト動物としては、電位依存性
Ｃａ2+チャネルα1Eサブユニットをコードする遺伝子Ｄ
ＮＡの機能が染色体上で欠損したホモ接合変異非ヒト動
物（α1E -/ -）や、ヘテロ変異非ヒト動物（α1E +/-）を
挙げることができる。
【００１１】上記電位依存性Ｃａ2+チャネルα1Eサブユ
ニットをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠
損したホモ接合変異非ヒト動物（α1E -/-）とは、例え
ばα1 Eサブユニットをコードする非ヒト動物の内在性遺
伝子の一部もしくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子
変異により不活性化され、野生型においてα1Eサブユニ
ットを発現する機能を失なった非ヒト動物等をいう。ま
た本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラッ
ト、モルモット等の齧歯目動物を具体的に挙げることが
できるが、これらに限定されるものではない。以下、α
1Eサブユニットをコードする遺伝子機能が染色体上で欠
損した非ヒト動物の作製方法を、α1Eサブユニット遺伝
子機能が染色体上で欠損したマウスを例にとって説明す
る。
ニットをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠
損したホモ接合変異非ヒト動物（α1E -/-）とは、例え
ばα1 Eサブユニットをコードする非ヒト動物の内在性遺
伝子の一部もしくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子
変異により不活性化され、野生型においてα1Eサブユニ
ットを発現する機能を失なった非ヒト動物等をいう。ま
た本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラッ
ト、モルモット等の齧歯目動物を具体的に挙げることが
できるが、これらに限定されるものではない。以下、α
1Eサブユニットをコードする遺伝子機能が染色体上で欠
損した非ヒト動物の作製方法を、α1Eサブユニット遺伝
子機能が染色体上で欠損したマウスを例にとって説明す
る。
【００１２】α1Eサブユニット遺伝子機能が染色体上で
欠損したマウス、すなわちホモ接合体変異マウス（α1E
-/-）は、例えば、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣ
Ｒ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、α1Eサ
ブユニット遺伝子をスクリーニングし、スクリーニング
されたα1Eサブユニット遺伝子の一部又は全部を、例え
ばＬａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等マーカ
ー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテ
リアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純
ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）
遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを
作製し、この作製されたターゲティングベクターを線状
化し、マイクロインジェクション法、エレクトロポレー
ション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相
同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−
ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビル
（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選
択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体
かどうかをサザンブロット法等により確認することが好
ましい。
欠損したマウス、すなわちホモ接合体変異マウス（α1E
-/-）は、例えば、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣ
Ｒ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、α1Eサ
ブユニット遺伝子をスクリーニングし、スクリーニング
されたα1Eサブユニット遺伝子の一部又は全部を、例え
ばＬａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等マーカ
ー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテ
リアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純
ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）
遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを
作製し、この作製されたターゲティングベクターを線状
化し、マイクロインジェクション法、エレクトロポレー
ション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相
同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−
ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビル
（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選
択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体
かどうかをサザンブロット法等により確認することが好
ましい。
【００１３】上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ
接合体変異マウス（α1E +/-）を得ることができ、ま
た、このヘテロ接合体変異マウスをインタークロスさせ
ることによって、ホモ接合体変異マウス（α1E -/-）を
得ることができる。そして、かかるホモ接合体変異マウ
スにα1Eサブユニットが欠損しているかどうかを確認す
る方法としては、例えば、上記の方法により得られたマ
ウスの尾端の一部から尾ＤＮＡを分離してサザンブロッ
ト法等により調べたり、このマウスの神経細胞等からＲ
ＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、
またこのマウスのα1Eサブユニットの発現をウエスタン
ブロット法等により調べる方法がある。
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ
接合体変異マウス（α1E +/-）を得ることができ、ま
た、このヘテロ接合体変異マウスをインタークロスさせ
ることによって、ホモ接合体変異マウス（α1E -/-）を
得ることができる。そして、かかるホモ接合体変異マウ
スにα1Eサブユニットが欠損しているかどうかを確認す
る方法としては、例えば、上記の方法により得られたマ
ウスの尾端の一部から尾ＤＮＡを分離してサザンブロッ
ト法等により調べたり、このマウスの神経細胞等からＲ
ＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、
またこのマウスのα1Eサブユニットの発現をウエスタン
ブロット法等により調べる方法がある。
【００１４】本発明のα1EＣａ2+チャネル機能障害に起
因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法として
は、ホモ接合体変異非ヒト動物（α1E -/-）及び／又は
ヘテロ接合体変異非ヒト動物（α1E +/-）、例えば、ホ
モ接合体変異マウス及び／又はヘテロ接合体変異マウス
に被検物質を投与し、好ましくはホモ接合体変異マウス
及び／又はヘテロ接合体変異マウスと、野生型マウス
（α1E +/+）、特に同腹の野生型マウスにそれぞれ被検
物質を投与し、該ホモ接合体変異マウス及び／又はヘテ
ロ接合体変異マウスにおける炎症性疼痛等の侵害受容性
疼痛の程度を野生型マウスにおける侵害受容性疼痛の程
度を比較・評価する方法を挙げることができる。上記侵
害受容性疼痛の程度の比較・評価としては、実施例に詳
しく説明されている、ホルマリンを用いて侵害受容器
（nociceptor）を直接刺激することによる痛覚応答の程
度の比較・評価や、ホルマリンによる炎症に誘発された
痛覚応答の程度の比較・評価や、酢酸の投与後の侵害受
容性応答（胴体部身震い）の程度の比較・評価や、酢酸
により感作したマウスにさらにホルマリン投与後の侵害
受容性応答の程度の比較・評価を挙げることができる。
また、α1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾病の予
防・治療薬のスクリーニング方法における被検物質の投
与方法としては、経口投与、静脈投与等特に制限される
ものでなく、被検物質を投与した後、ホモ接合体変異マ
ウス及び／又はヘテロ接合体変異マウスと野生型マウス
における侵害受容性応答の程度が測定され、その比較・
評価が行われる。
因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法として
は、ホモ接合体変異非ヒト動物（α1E -/-）及び／又は
ヘテロ接合体変異非ヒト動物（α1E +/-）、例えば、ホ
モ接合体変異マウス及び／又はヘテロ接合体変異マウス
に被検物質を投与し、好ましくはホモ接合体変異マウス
及び／又はヘテロ接合体変異マウスと、野生型マウス
（α1E +/+）、特に同腹の野生型マウスにそれぞれ被検
物質を投与し、該ホモ接合体変異マウス及び／又はヘテ
ロ接合体変異マウスにおける炎症性疼痛等の侵害受容性
疼痛の程度を野生型マウスにおける侵害受容性疼痛の程
度を比較・評価する方法を挙げることができる。上記侵
害受容性疼痛の程度の比較・評価としては、実施例に詳
しく説明されている、ホルマリンを用いて侵害受容器
（nociceptor）を直接刺激することによる痛覚応答の程
度の比較・評価や、ホルマリンによる炎症に誘発された
痛覚応答の程度の比較・評価や、酢酸の投与後の侵害受
容性応答（胴体部身震い）の程度の比較・評価や、酢酸
により感作したマウスにさらにホルマリン投与後の侵害
受容性応答の程度の比較・評価を挙げることができる。
また、α1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する疾病の予
防・治療薬のスクリーニング方法における被検物質の投
与方法としては、経口投与、静脈投与等特に制限される
ものでなく、被検物質を投与した後、ホモ接合体変異マ
ウス及び／又はヘテロ接合体変異マウスと野生型マウス
における侵害受容性応答の程度が測定され、その比較・
評価が行われる。
【００１５】他の態様の本発明のα1EＣａ2+チャネル機
能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング
方法としては、ホモ接合体変異非ヒト動物（α1E -/-）
及び／又はヘテロ接合体変異非ヒト動物（α1E +/-）、
例えば、ホモ接合体変異マウス及び／又はヘテロ接合体
変異マウスに由来する細胞・組織に被検物質を接触せし
め、好ましくはホモ接合体変異マウス及び／又はヘテロ
接合体変異マウスに由来する細胞・組織と、野生型マウ
ス（α1E +/+）、特に同腹の野生型マウスに由来する細
胞・組織にそれぞれ被検物質を接触せしめ、該細胞・組
織につながった脊髄における電気生理学的応答の程度を
測定し、比較・評価（解析）する方法を挙げることがで
きる。細胞・組織につながった脊髄標本は文献（Neuros
cience Res. Supple. 7, S140, 1988）記載の方法に準
じて調製することができる。また、脊髄における電気生
理学的応答としては、脊髄後角の侵害反射電位の変化等
を例示することができる。
能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング
方法としては、ホモ接合体変異非ヒト動物（α1E -/-）
及び／又はヘテロ接合体変異非ヒト動物（α1E +/-）、
例えば、ホモ接合体変異マウス及び／又はヘテロ接合体
変異マウスに由来する細胞・組織に被検物質を接触せし
め、好ましくはホモ接合体変異マウス及び／又はヘテロ
接合体変異マウスに由来する細胞・組織と、野生型マウ
ス（α1E +/+）、特に同腹の野生型マウスに由来する細
胞・組織にそれぞれ被検物質を接触せしめ、該細胞・組
織につながった脊髄における電気生理学的応答の程度を
測定し、比較・評価（解析）する方法を挙げることがで
きる。細胞・組織につながった脊髄標本は文献（Neuros
cience Res. Supple. 7, S140, 1988）記載の方法に準
じて調製することができる。また、脊髄における電気生
理学的応答としては、脊髄後角の侵害反射電位の変化等
を例示することができる。
【００１６】また、α1EＣａ2+チャネル機能障害に起因
する疾病としては、炎症性疼痛等の侵害受容性疼痛を具
体的に挙げることができ、本発明のスクリーニング方法
により得られるα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する
疾病の予防・治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与
することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、
カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、
エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。ま
た、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬
等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理
学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常
法に従って製造することができる。助剤としては、例え
ば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ
酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の
賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステ
アリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、ま
た注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロ
ピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活
性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤
にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助
剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与
量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症
状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
する疾病としては、炎症性疼痛等の侵害受容性疼痛を具
体的に挙げることができ、本発明のスクリーニング方法
により得られるα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因する
疾病の予防・治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与
することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、
カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、
エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。ま
た、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬
等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理
学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常
法に従って製造することができる。助剤としては、例え
ば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ
酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の
賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステ
アリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、ま
た注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロ
ピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活
性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤
にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助
剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与
量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症
状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００１７】傷みは不快な感覚と感情を伴い、通常、組
織の損傷によって、あるいは強い侵害性の刺激によって
引き起こされ、その原因により侵害受容性疼痛、神経因
性疼痛、心因性疼痛に大きく分けることができる。傷み
受容器（pain receptor）でのインパルスの発生、その
伝導、中枢神経系での処理は一括して侵害受容（nocice
ption）と呼ばれるが、本発明のα1EＣａ2+チャネル機
能障害に起因する疾病の予防・治療薬は、かかる侵害受
容を介しての傷みである侵害受容性疼痛に対する生体の
防御システムに重要な抗侵害受容性メカニズムを解明す
る上でも有用である。
織の損傷によって、あるいは強い侵害性の刺激によって
引き起こされ、その原因により侵害受容性疼痛、神経因
性疼痛、心因性疼痛に大きく分けることができる。傷み
受容器（pain receptor）でのインパルスの発生、その
伝導、中枢神経系での処理は一括して侵害受容（nocice
ption）と呼ばれるが、本発明のα1EＣａ2+チャネル機
能障害に起因する疾病の予防・治療薬は、かかる侵害受
容を介しての傷みである侵害受容性疼痛に対する生体の
防御システムに重要な抗侵害受容性メカニズムを解明す
る上でも有用である。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明の技術的範囲はかかる実施例に何ら限定され
るものではない。なお、本実施例においては、すべてＣ
５７Ｂｌ／６（Ｂ６）と１２９／Ｓｖとの交雑背景をも
つマウスを使用した。 実施例１（ターゲティングベクターの構築） マウスＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子を含むゲノムクローンを、
１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリー（Stratagene）
からラビットα1EｃＤＮＡ（FEBS Lett. 308,7-13, 199
2）の１８４ｂｐ（ｎｔ１−１８４）フラグメントをプ
ローブとしてスクリーニングした。エクソン１を含むλ
ファージクローンを単離し、インサートをpBluescriptI
I ＫＳ（＋）（Stratagene）へサブクローンした後、エ
クソン１のＮｏｔＩ部位からイントロン１のＳｓｔＩ部
位間の２．３ｋｂフラグメントを除去し、α1E発現細胞
を検出することができるように、ｎｌａｃＺ（Ｎ末端に
核局在シグナルを有するE.coliのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター
（ＰＧＫ−neo casette）からのネオマイシン耐性遺伝
子とともに、ＣＡＣＮＡ１Ｅのリーディングフレームに
読み枠を合わせて挿入することにより、ターゲティング
ベクターBIIZneoを構築した（図１Ａ参照）。かかるタ
ーゲティングベクターBIIZneoのｎｌａｃＺとＰＧＫ−n
eo casetteの両外側には、５′相同部位として１．３ｋ
ｂのＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメント（ＳａｌＩ部位は
ベクターから）及び３′相同部位として７ｋｂのＳｓｔ
Ｉ−ＳｓｔＩフラグメントがそれぞれ形成されている。
また、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を、陰
性選択マーカーとして使用した（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87, 9918-9922, 1990）。ＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子
のエクソン１の周辺の制限酵素地図及びターゲティング
ベクターの構造を図１に示す。図１Ａ中、■はエクソン
１のコーディング領域を、neoはＰＧＫ−neo cassette
を、ＤＴ−Ａはジフテリアトキシン−Ａフラグメント遺
伝子を、ＥはＥｃｏＲＩを、ＮはＮｏｔＩを、ＳはＳｓ
ｔＩ、ＸはＸｂａＩをそれぞれ表している。
が、本発明の技術的範囲はかかる実施例に何ら限定され
るものではない。なお、本実施例においては、すべてＣ
５７Ｂｌ／６（Ｂ６）と１２９／Ｓｖとの交雑背景をも
つマウスを使用した。 実施例１（ターゲティングベクターの構築） マウスＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子を含むゲノムクローンを、
１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリー（Stratagene）
からラビットα1EｃＤＮＡ（FEBS Lett. 308,7-13, 199
2）の１８４ｂｐ（ｎｔ１−１８４）フラグメントをプ
ローブとしてスクリーニングした。エクソン１を含むλ
ファージクローンを単離し、インサートをpBluescriptI
I ＫＳ（＋）（Stratagene）へサブクローンした後、エ
クソン１のＮｏｔＩ部位からイントロン１のＳｓｔＩ部
位間の２．３ｋｂフラグメントを除去し、α1E発現細胞
を検出することができるように、ｎｌａｃＺ（Ｎ末端に
核局在シグナルを有するE.coliのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター
（ＰＧＫ−neo casette）からのネオマイシン耐性遺伝
子とともに、ＣＡＣＮＡ１Ｅのリーディングフレームに
読み枠を合わせて挿入することにより、ターゲティング
ベクターBIIZneoを構築した（図１Ａ参照）。かかるタ
ーゲティングベクターBIIZneoのｎｌａｃＺとＰＧＫ−n
eo casetteの両外側には、５′相同部位として１．３ｋ
ｂのＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメント（ＳａｌＩ部位は
ベクターから）及び３′相同部位として７ｋｂのＳｓｔ
Ｉ−ＳｓｔＩフラグメントがそれぞれ形成されている。
また、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を、陰
性選択マーカーとして使用した（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87, 9918-9922, 1990）。ＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子
のエクソン１の周辺の制限酵素地図及びターゲティング
ベクターの構造を図１に示す。図１Ａ中、■はエクソン
１のコーディング領域を、neoはＰＧＫ−neo cassette
を、ＤＴ−Ａはジフテリアトキシン−Ａフラグメント遺
伝子を、ＥはＥｃｏＲＩを、ＮはＮｏｔＩを、ＳはＳｓ
ｔＩ、ＸはＸｂａＩをそれぞれ表している。
【００１９】実施例２（変異マウスの作製）
線状化した上記ターゲティングベクターBIIZneoを、エ
レクトロポレーション法によって、１２９／Ｓｖ株由来
のＪ１ ＥＳ細胞（Cell 69, 915-926, 1992）に導入し
た。ネオマイシン耐性ＥＳクローンをＧ４１８によって
選択し、相同組換えが生起したＥＳ細胞クローンをサザ
ンブロット分析によりスクリーニングした。１２７個の
ＥＳクローンのうち、相同組み換えが生起したアレルを
有することが確認された３個のクローンを用いて常法
（in Gene targeting. A practicalapproach, ed. Joyn
er, A.L. (IRL Press, Oxford), pp.107-146, 1993）に
より変異マウスを作製したところ、一匹のヘテロ接合体
変異マウス（α1E +/-）が得られ、次いでホモ接合体マ
ウスを得るために、このヘテロ接合体変異マウスをイン
タークロスしたところ、メンデルの法則に従いα1E欠損
変異マウス（α1E -/ -）を産生した。
レクトロポレーション法によって、１２９／Ｓｖ株由来
のＪ１ ＥＳ細胞（Cell 69, 915-926, 1992）に導入し
た。ネオマイシン耐性ＥＳクローンをＧ４１８によって
選択し、相同組換えが生起したＥＳ細胞クローンをサザ
ンブロット分析によりスクリーニングした。１２７個の
ＥＳクローンのうち、相同組み換えが生起したアレルを
有することが確認された３個のクローンを用いて常法
（in Gene targeting. A practicalapproach, ed. Joyn
er, A.L. (IRL Press, Oxford), pp.107-146, 1993）に
より変異マウスを作製したところ、一匹のヘテロ接合体
変異マウス（α1E +/-）が得られ、次いでホモ接合体マ
ウスを得るために、このヘテロ接合体変異マウスをイン
タークロスしたところ、メンデルの法則に従いα1E欠損
変異マウス（α1E -/ -）を産生した。
【００２０】実施例３（サザンブロット分析）
実施例２で得られたα1E欠損変異マウス等の尾ＤＮＡの
サザンブロット分析を行った。サザンブロット分析は、
尾ＤＮＡをＳｓｔＩで切断した後、アガロースゲル電気
泳動により分離してニトロセルロース膜に固定し、DIG
High Prime（Boehringer Mannheim）を使用してＤＩＧ
（digoxigenin）でラベルしたプローブ（図１参照）を
用いてハイブリダイゼーションを行い、アルカリホスフ
ァターゼ（ＡＰ）でラベルした抗ＤＩＧ抗体及びＡＰの
基質であるＣＳＰＤ（Boehringer Mannheim）を用いて
検出することにより行った。サザンブロットの結果を図
１Ｂに示す。図１Ｂ中、３．５ｋｂバンドは野生型対立
遺伝子（ＷＴ）に由来し、４．６ｋｂバンドはターゲッ
ト対立遺伝子（Ｍｕｔ）に由来している。＋／＋は野生
型を、＋／−はヘテロ接合体を、−／−はホモ接合変異
体をそれぞれ表している。
サザンブロット分析を行った。サザンブロット分析は、
尾ＤＮＡをＳｓｔＩで切断した後、アガロースゲル電気
泳動により分離してニトロセルロース膜に固定し、DIG
High Prime（Boehringer Mannheim）を使用してＤＩＧ
（digoxigenin）でラベルしたプローブ（図１参照）を
用いてハイブリダイゼーションを行い、アルカリホスフ
ァターゼ（ＡＰ）でラベルした抗ＤＩＧ抗体及びＡＰの
基質であるＣＳＰＤ（Boehringer Mannheim）を用いて
検出することにより行った。サザンブロットの結果を図
１Ｂに示す。図１Ｂ中、３．５ｋｂバンドは野生型対立
遺伝子（ＷＴ）に由来し、４．６ｋｂバンドはターゲッ
ト対立遺伝子（Ｍｕｔ）に由来している。＋／＋は野生
型を、＋／−はヘテロ接合体を、−／−はホモ接合変異
体をそれぞれ表している。
【００２１】実施例４（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
次に、上記得られたα1E欠損変異マウス等の脳における
α1E遺伝子の発現を、脳ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によ
り調べた。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＧＰＣ法（Anal. Bi
ochem. 167, 156-159, 1987）によりマウスの脳の全Ｒ
ＮＡを調製し、ランダムヘキサマー及びSuperscriptII
（Gibco BRL）をファーストストランドＤＮＡ合成に使
用した。このｃＤＮＡ標本を、ＲＮａｓｅＨで処理し、
ＰＣＲのテンプレートとして使用（０．１μｇＲＮＡ同
等物を１回の反応に使用）した。ＰＣＲプライマーとし
ては、ＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子のエクソン１におけるｎｌ
ａｃＺ挿入部位の上流域に位置するｍＡ１Ｅ−Ｆ１
（５′−ＡＧＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣ
−３′：配列番号１）及びＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子のエク
ソン２に位置するｍＡ１Ｅ−Ｒ１（５′−ＧＧＴＧＧＣ
ＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＣ−３′：配列番号２）
を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図１Ｃ（レーン１
は野生型、レーン２はヘテロ接合体、レーン３はホモ接
合変異体）に示す。図１Ｃに示されるように、α1E -/-
サンプルにおける陽性シグナルは全く観察されなかっ
た。図１Ｃ中、２３１ｂｐのフラグメントはＣＡＣＮＡ
１Ｅ発現の特徴であり、Ｍは１００ｂｐのladder（Gibc
o BRL）を示す。
α1E遺伝子の発現を、脳ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によ
り調べた。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＧＰＣ法（Anal. Bi
ochem. 167, 156-159, 1987）によりマウスの脳の全Ｒ
ＮＡを調製し、ランダムヘキサマー及びSuperscriptII
（Gibco BRL）をファーストストランドＤＮＡ合成に使
用した。このｃＤＮＡ標本を、ＲＮａｓｅＨで処理し、
ＰＣＲのテンプレートとして使用（０．１μｇＲＮＡ同
等物を１回の反応に使用）した。ＰＣＲプライマーとし
ては、ＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子のエクソン１におけるｎｌ
ａｃＺ挿入部位の上流域に位置するｍＡ１Ｅ−Ｆ１
（５′−ＡＧＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣ
−３′：配列番号１）及びＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子のエク
ソン２に位置するｍＡ１Ｅ−Ｒ１（５′−ＧＧＴＧＧＣ
ＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＣ−３′：配列番号２）
を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図１Ｃ（レーン１
は野生型、レーン２はヘテロ接合体、レーン３はホモ接
合変異体）に示す。図１Ｃに示されるように、α1E -/-
サンプルにおける陽性シグナルは全く観察されなかっ
た。図１Ｃ中、２３１ｂｐのフラグメントはＣＡＣＮＡ
１Ｅ発現の特徴であり、Ｍは１００ｂｐのladder（Gibc
o BRL）を示す。
【００２２】実施例５（ノーザンブロット分析）
また、α1E欠損変異マウス等の脳におけるα1E遺伝子の
発現を、脳ＲＮＡのノーザンブロット分析により調べ
た。ノーザンブロット分析は、これらマウスの脳ポリ
（Ａ）+ＲＮＡ（２．５μｇ）を各レーンに載せ、α1E
のリピートII及びIII間における細胞質ループに関連す
るＣＡＣＮＡ１ＥｃＤＮＡフラグメント（ほぼ１ｋｂ）
をプローブとしてブロットすることにより行った。ま
た、ＧＡＰＤＨプローブを、ローディングコントロール
として使用した（Gene 91, 185-191, 1990）。ノーザン
ブロットの結果を図１Ｄ（レーン１は野生型、レーン２
はヘテロ接合体、レーン３はホモ接合変異体）に示す。
図１Ｄに示されるように、α1E -/-サンプルにおける陽
性シグナルは全く観察されなかった。
発現を、脳ＲＮＡのノーザンブロット分析により調べ
た。ノーザンブロット分析は、これらマウスの脳ポリ
（Ａ）+ＲＮＡ（２．５μｇ）を各レーンに載せ、α1E
のリピートII及びIII間における細胞質ループに関連す
るＣＡＣＮＡ１ＥｃＤＮＡフラグメント（ほぼ１ｋｂ）
をプローブとしてブロットすることにより行った。ま
た、ＧＡＰＤＨプローブを、ローディングコントロール
として使用した（Gene 91, 185-191, 1990）。ノーザン
ブロットの結果を図１Ｄ（レーン１は野生型、レーン２
はヘテロ接合体、レーン３はホモ接合変異体）に示す。
図１Ｄに示されるように、α1E -/-サンプルにおける陽
性シグナルは全く観察されなかった。
【００２３】実施例６（イムノブロット分析）
さらに、これらマウスの脳膜タンパク質のイムノブロッ
ト分析についても行った。マウス脳からの１００，００
０×ｇ膜フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバ
ッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ６．８、
０．００５％クマシブリリアントブルー−Ｇ、１．５％
ドデシル硫酸ナトリウム、２Ｍ尿素、及び１０ｍＭdith
iothreitolを含む）に溶解させ、膜タンパク質（１００
μｇ／レーン）を５％ポリアクリルアミド・ゲル上で分
離した。分離されたタンパク質を、フッ化ポリビニリデ
ン膜（Immobilon Ｐ、Millipore）に移し、ＥＣＬシス
テム（Amersham-Pharmacia）を用い、分子量ｃａ．２５
０ｋＤの単一バンドを検知することができるウサギポリ
クローナル抗α1E抗体（Almone Labs）でブロットを検
出した。イムノブロットの結果を図１Ｅ（レーン１は野
生型、レーン２はヘテロ接合体、レーン３はホモ接合変
異体）に示す。図１Ｅに示されるように、α1E -/-サン
プルにおけるα1Eタンパク質は全く観察されなかった。
かかるα1E欠損変異が確認されたホモ接合変異体マウス
は、野生型同様の生存能力と繁殖力を有していた。
ト分析についても行った。マウス脳からの１００，００
０×ｇ膜フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバ
ッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ６．８、
０．００５％クマシブリリアントブルー−Ｇ、１．５％
ドデシル硫酸ナトリウム、２Ｍ尿素、及び１０ｍＭdith
iothreitolを含む）に溶解させ、膜タンパク質（１００
μｇ／レーン）を５％ポリアクリルアミド・ゲル上で分
離した。分離されたタンパク質を、フッ化ポリビニリデ
ン膜（Immobilon Ｐ、Millipore）に移し、ＥＣＬシス
テム（Amersham-Pharmacia）を用い、分子量ｃａ．２５
０ｋＤの単一バンドを検知することができるウサギポリ
クローナル抗α1E抗体（Almone Labs）でブロットを検
出した。イムノブロットの結果を図１Ｅ（レーン１は野
生型、レーン２はヘテロ接合体、レーン３はホモ接合変
異体）に示す。図１Ｅに示されるように、α1E -/-サン
プルにおけるα1Eタンパク質は全く観察されなかった。
かかるα1E欠損変異が確認されたホモ接合変異体マウス
は、野生型同様の生存能力と繁殖力を有していた。
【００２４】
実施例７（Ｘ−ｇａｌ及びＩＢ４によるダブル染色）
β−ｇａｌ活性を測定することにより、後根神経節（Ｄ
ＲＧ）及び脊髄後角（ＳＣ）におけるα1EＣａ2+チャネ
ルの発現を調べた。切開して取り出したＳＣ及びＤＲＧ
を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／リン酸バッ
ファー食塩水（ＰＢＳ）中で１時間潅流固定し、ＰＢＳ
でゆすぎ、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で一晩染色
した（Dev. Growth Differ. 40, 343-353, 1998）。そ
の後、それらをＰＢＳ中で４％ＰＦＡにより後固定し
た。ヘテロ接合変異体（α1E -/-）から得たＳＣ全体の
後方及び断面におけるＸ−ｇａｌ染色の結果をそれぞれ
図２Ａ及び図２Ｂに示す。ＳＣ全体をＸ−ｇａｌによっ
て染色した場合、ＳＣの全縦方向に沿って、後角に濃い
青色染色が観察された。なお、図２Ａ及び図２Ｂにおけ
る縮尺バーは１ｍｍを示す。
ＲＧ）及び脊髄後角（ＳＣ）におけるα1EＣａ2+チャネ
ルの発現を調べた。切開して取り出したＳＣ及びＤＲＧ
を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／リン酸バッ
ファー食塩水（ＰＢＳ）中で１時間潅流固定し、ＰＢＳ
でゆすぎ、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で一晩染色
した（Dev. Growth Differ. 40, 343-353, 1998）。そ
の後、それらをＰＢＳ中で４％ＰＦＡにより後固定し
た。ヘテロ接合変異体（α1E -/-）から得たＳＣ全体の
後方及び断面におけるＸ−ｇａｌ染色の結果をそれぞれ
図２Ａ及び図２Ｂに示す。ＳＣ全体をＸ−ｇａｌによっ
て染色した場合、ＳＣの全縦方向に沿って、後角に濃い
青色染色が観察された。なお、図２Ａ及び図２Ｂにおけ
る縮尺バーは１ｍｍを示す。
【００２５】β−ｇａｌ発現細胞の性質を調べるため、
Ｘ−ｇａｌ染色したＳＣを切断し、抗物質Ｐ抗体や植物
レクチンＩＢ４でダブルラベリングした。パラフィン又
は凍結部位（７μｍ）を、ペルオキシダーゼ−ラベルの
ＩＢ４（Sigma）で文献（J.Histochem. Cytochem. 38,
1683-1686, 1990）記載の方法に準じて染色した。ペル
オキシダーゼの基質として、３，３′−ジアミノベンジ
ジンを使用した。一般的に、主要求心性侵害受容神経細
胞は、物質Ｐやカルシトニン遺伝子関連ペプチド等のペ
プチド神経伝達物質を産出するものと、酵素マーカーを
発現し、ＩＢ４に結合するものの２種類におおまかに分
類されている（Neuron 20, 629-632, 1998）。ＩＢ４の
結合（茶色シグナル）を、ヘテロ接合変異体由来のＸ−
ｇａｌ染色ＳＣ部位において評価した結果を図２Ｃに示
す。図２Ｃに示されるように、Ｘ−ｇａｌシグナルがＩ
Ｂ４シグナルの外側及び内側の両方で観察されたので、
ダブル染色の結果は、ＳＣにおけるα1E発現細胞が層
I、II、場合によってはIIIに位置していることを示して
いる。従って、α1Eを発現する後角神経細胞の少なくと
も一部が、主要求心性侵害受容神経細胞により刺激され
ると考えられる。なお、図２Ｃにおける縮尺バーは１０
０μｍを示す。
Ｘ−ｇａｌ染色したＳＣを切断し、抗物質Ｐ抗体や植物
レクチンＩＢ４でダブルラベリングした。パラフィン又
は凍結部位（７μｍ）を、ペルオキシダーゼ−ラベルの
ＩＢ４（Sigma）で文献（J.Histochem. Cytochem. 38,
1683-1686, 1990）記載の方法に準じて染色した。ペル
オキシダーゼの基質として、３，３′−ジアミノベンジ
ジンを使用した。一般的に、主要求心性侵害受容神経細
胞は、物質Ｐやカルシトニン遺伝子関連ペプチド等のペ
プチド神経伝達物質を産出するものと、酵素マーカーを
発現し、ＩＢ４に結合するものの２種類におおまかに分
類されている（Neuron 20, 629-632, 1998）。ＩＢ４の
結合（茶色シグナル）を、ヘテロ接合変異体由来のＸ−
ｇａｌ染色ＳＣ部位において評価した結果を図２Ｃに示
す。図２Ｃに示されるように、Ｘ−ｇａｌシグナルがＩ
Ｂ４シグナルの外側及び内側の両方で観察されたので、
ダブル染色の結果は、ＳＣにおけるα1E発現細胞が層
I、II、場合によってはIIIに位置していることを示して
いる。従って、α1Eを発現する後角神経細胞の少なくと
も一部が、主要求心性侵害受容神経細胞により刺激され
ると考えられる。なお、図２Ｃにおける縮尺バーは１０
０μｍを示す。
【００２６】同様に、α1E +/-マウス腰部の後根神経節
（ＤＲＧ）全体のＸ−ｇａｌ染色を行った。結果を図２
Ｄ及びＥに示す。図２Ｄに示されるように、ＤＲＧのい
くつかの神経細胞はβ−ｇａｌを発現した。α1Eを発現
する細胞型を調べるため、Ｘ−ｇａｌ染色した腰部ＤＲ
Ｇ部位をＩＢ４でダブルラベリングした。ＩＢ４の結合
（茶色シグナル）を、ヘテロ接合変異体由来のＸ−ｇａ
ｌ染色ＤＲＧ部位において評価した結果を図２Ｅに示
す。図２Ｅに示されるように、いくつかのＸ−ｇａｌ染
色された神経細胞もまたＩＢ４で染色されている。図２
Ｅ中、Ｘ−ｇａｌでのみラベリングされた神経細胞が矢
印で示されている。なお、図２Ｄにおける縮尺バーは
０．５ｍｍを、図２Ｅにおける縮尺バーは５０μｍを示
す。
（ＤＲＧ）全体のＸ−ｇａｌ染色を行った。結果を図２
Ｄ及びＥに示す。図２Ｄに示されるように、ＤＲＧのい
くつかの神経細胞はβ−ｇａｌを発現した。α1Eを発現
する細胞型を調べるため、Ｘ−ｇａｌ染色した腰部ＤＲ
Ｇ部位をＩＢ４でダブルラベリングした。ＩＢ４の結合
（茶色シグナル）を、ヘテロ接合変異体由来のＸ−ｇａ
ｌ染色ＤＲＧ部位において評価した結果を図２Ｅに示
す。図２Ｅに示されるように、いくつかのＸ−ｇａｌ染
色された神経細胞もまたＩＢ４で染色されている。図２
Ｅ中、Ｘ−ｇａｌでのみラベリングされた神経細胞が矢
印で示されている。なお、図２Ｄにおける縮尺バーは
０．５ｍｍを、図２Ｅにおける縮尺バーは５０μｍを示
す。
【００２７】実施例８（Ｘ−ｇａｌ染色後のＲＮＡイン
サイチュー ハイブリダイゼーション） Ｘ−ｇａｌ染色した腰部ＤＲＧの凍結部位（７μｍ）
を、文献（in Guide totechniques in mouse developme
nt, eds. Wassarman, P.M. & DePamphilis, M.L. (Acad
emic Press, San Diego), pp.368-370, 1993）記載の方
法に準じて、インサイチュー ハイブリダイゼーション
用に処理した。ＲＴ−ＰＣＲで増幅したマウスＰＰＴ−
Ａ（preprotachykininＡ）の部分的なｃＤＮＡフラグメ
ント（０．８ｋｂ）を、ｐＣＲII（Invitrogen）にクロ
ーニングし、得られたプラスミドをＤＩＧ−ラベル リ
ボプローブ合成用のテンプレートとして用いた。ＡＰ−
ラベル抗ＤＩＧ抗体（Boehringer Mannheim）及びＡＰ
用基質としてのニトロブルー塩化テトラゾリウム及び５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を用い、
ハイブリダイズしたプローブを検出した。ＰＰＴ−Ａ
ｃＤＮＡフラグメントのクローニングに、ＳＰ−Ｆ１
（５′−ＧＴＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＡＡＣ−
３′ｎｔ８１−１００、GenBank Accession No. D1758
4：配列番号３）及びＳＰ−Ｒ１（５′−ＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＧＡ−３′nt902-921：配列
番号４）のプライマーを用いた。結果を図２Ｆに示す。
図２Ｆに示されるように、いくつかのＸ−ｇａｌ染色さ
れた神経細胞もまたＰＰＴ−Ａシグナルを示していた。
図２Ｆ中、Ｘ−ｇａｌでのみラベリングされた神経細胞
を矢印で示した。なお、図２Ｆにおける縮尺バーは５０
μｍを示す。
サイチュー ハイブリダイゼーション） Ｘ−ｇａｌ染色した腰部ＤＲＧの凍結部位（７μｍ）
を、文献（in Guide totechniques in mouse developme
nt, eds. Wassarman, P.M. & DePamphilis, M.L. (Acad
emic Press, San Diego), pp.368-370, 1993）記載の方
法に準じて、インサイチュー ハイブリダイゼーション
用に処理した。ＲＴ−ＰＣＲで増幅したマウスＰＰＴ−
Ａ（preprotachykininＡ）の部分的なｃＤＮＡフラグメ
ント（０．８ｋｂ）を、ｐＣＲII（Invitrogen）にクロ
ーニングし、得られたプラスミドをＤＩＧ−ラベル リ
ボプローブ合成用のテンプレートとして用いた。ＡＰ−
ラベル抗ＤＩＧ抗体（Boehringer Mannheim）及びＡＰ
用基質としてのニトロブルー塩化テトラゾリウム及び５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を用い、
ハイブリダイズしたプローブを検出した。ＰＰＴ−Ａ
ｃＤＮＡフラグメントのクローニングに、ＳＰ−Ｆ１
（５′−ＧＴＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＡＡＣ−
３′ｎｔ８１−１００、GenBank Accession No. D1758
4：配列番号３）及びＳＰ−Ｒ１（５′−ＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＧＡ−３′nt902-921：配列
番号４）のプライマーを用いた。結果を図２Ｆに示す。
図２Ｆに示されるように、いくつかのＸ−ｇａｌ染色さ
れた神経細胞もまたＰＰＴ−Ａシグナルを示していた。
図２Ｆ中、Ｘ−ｇａｌでのみラベリングされた神経細胞
を矢印で示した。なお、図２Ｆにおける縮尺バーは５０
μｍを示す。
【００２８】（行動様式の研究）上記の実験から明らか
なように、α1EＣａ2+チャネルは痛覚伝達コントロール
に関連する主要求心性神経細胞である後根神経節（ＤＲ
Ｇ）及び脊髄後角（ＳＣ）で発現することがわかった。
また、実験者がマウスを拾い上げようとしたとき、ホモ
接合体変異マウス（α1E -/-）は、野生型マウス（α1E
+/+）と比べ、より激しくもがき、脱出を試みることが
多く、動物の異常感情状態が示された。そこで、以下に
示す不安関連試験や痛覚関連試験等の行動様式の研究を
行った。この行動様式の研究は、ブラインド実験形態と
し、データは平均値±ＳＥＭで表し、多重比較のための
Tukey試験、あるいはグループ間比較のためのStudent's
t試験により解析した。
なように、α1EＣａ2+チャネルは痛覚伝達コントロール
に関連する主要求心性神経細胞である後根神経節（ＤＲ
Ｇ）及び脊髄後角（ＳＣ）で発現することがわかった。
また、実験者がマウスを拾い上げようとしたとき、ホモ
接合体変異マウス（α1E -/-）は、野生型マウス（α1E
+/+）と比べ、より激しくもがき、脱出を試みることが
多く、動物の異常感情状態が示された。そこで、以下に
示す不安関連試験や痛覚関連試験等の行動様式の研究を
行った。この行動様式の研究は、ブラインド実験形態と
し、データは平均値±ＳＥＭで表し、多重比較のための
Tukey試験、あるいはグループ間比較のためのStudent's
t試験により解析した。
【００２９】実施例９（不安関連試験）
一連の実験開始時において生後６〜９週間の雌雄のマウ
スを用いた。全マウスを３つの行動様式パラダイムで連
続的に試験した。試験開始前にマウスを１週間別々に飼
い、毎日手で触れた。各セッション開始前に、試験装置
を１％酢酸で洗浄した。オープンフィールド試験は、５
０ｃｍ×５０ｃｍ×４０ｃｍの大きさの塩化ポリビニル
（ＰＶＣ）プレートで作製したオープンフィールドの中
央部に各マウスを移し、カラートラッキングシステム
（CompACT VAS；ムロマチキカイ、東京都）を用いて５
分間ロコモーター活性を測定した。高架かつ迷路試験
は、透明プラスチック壁をもつ２つのオープンアーム
（２３ｃｍ×８ｃｍ）及び２つのクローズドアーム（高
さ１５ｃｍ）で構成し、アーム及び中央広場は白色プラ
スチック（ＰＶＣ）プレート製で床から５０ｃｍの高さ
にし、オープンアームを、プレクシグラス製の縁（高さ
３ｍｍ）で囲い動物が迷路から落ちるのを防いだ。各マ
ウスを、中央広場に移し、その行動を５分間ビデオ録画
し、１フレーム／秒のＴＩＦＦフォーマットデータとし
てビデオ画像を保存し、ＮＩＨＩｍａｇｅプログラム
（米国National Institutes of Health開発、http://rs
b.info.nih.gov/nih-image/）から変換されたソフトで
あるＮＩＨＩｍａｇｅＥＰ２．１０（O'hara and Co. L
td.、東京都）を用いて、マッキントッシュコンピュー
ターで分析した。オープン及びクローズドアームで費や
された総時間数をそれぞれ計算した。また、聴覚刺激応
答試験は、刺激チャンバー（ＳＲ−ＬＡＢシステム、サ
ンディエゴ）を用いて測定した。マウスの動きを観察す
るため底部に圧電性振動加速度計を設けたプレクシグラ
ス製円柱に各マウスを入れ、セッション開始時に５分間
雑音（６５ｄＢ）にマウスをさらし、円柱の２５ｃｍ上
方にあるスピーカーから聴覚刺激（１０５、１１５、又
は１１７ｄＢの白色騒音パルスを任意順で、１ｍｓｅｃ
間ずつ）を与えた。音パルスの間隔は、３０秒で、全体
で６０パルス与えた。
スを用いた。全マウスを３つの行動様式パラダイムで連
続的に試験した。試験開始前にマウスを１週間別々に飼
い、毎日手で触れた。各セッション開始前に、試験装置
を１％酢酸で洗浄した。オープンフィールド試験は、５
０ｃｍ×５０ｃｍ×４０ｃｍの大きさの塩化ポリビニル
（ＰＶＣ）プレートで作製したオープンフィールドの中
央部に各マウスを移し、カラートラッキングシステム
（CompACT VAS；ムロマチキカイ、東京都）を用いて５
分間ロコモーター活性を測定した。高架かつ迷路試験
は、透明プラスチック壁をもつ２つのオープンアーム
（２３ｃｍ×８ｃｍ）及び２つのクローズドアーム（高
さ１５ｃｍ）で構成し、アーム及び中央広場は白色プラ
スチック（ＰＶＣ）プレート製で床から５０ｃｍの高さ
にし、オープンアームを、プレクシグラス製の縁（高さ
３ｍｍ）で囲い動物が迷路から落ちるのを防いだ。各マ
ウスを、中央広場に移し、その行動を５分間ビデオ録画
し、１フレーム／秒のＴＩＦＦフォーマットデータとし
てビデオ画像を保存し、ＮＩＨＩｍａｇｅプログラム
（米国National Institutes of Health開発、http://rs
b.info.nih.gov/nih-image/）から変換されたソフトで
あるＮＩＨＩｍａｇｅＥＰ２．１０（O'hara and Co. L
td.、東京都）を用いて、マッキントッシュコンピュー
ターで分析した。オープン及びクローズドアームで費や
された総時間数をそれぞれ計算した。また、聴覚刺激応
答試験は、刺激チャンバー（ＳＲ−ＬＡＢシステム、サ
ンディエゴ）を用いて測定した。マウスの動きを観察す
るため底部に圧電性振動加速度計を設けたプレクシグラ
ス製円柱に各マウスを入れ、セッション開始時に５分間
雑音（６５ｄＢ）にマウスをさらし、円柱の２５ｃｍ上
方にあるスピーカーから聴覚刺激（１０５、１１５、又
は１１７ｄＢの白色騒音パルスを任意順で、１ｍｓｅｃ
間ずつ）を与えた。音パルスの間隔は、３０秒で、全体
で６０パルス与えた。
【００３０】ホモ接合体変異マウス（α1E -/-）の行動
は概ね正常に見えたが、オープンフィールド試験によっ
てわかったように、野生型マウス（α1E +/+）と比べ、
自発的なロコモーター活動のレベルが顕著に低下してい
た。計５分間のオープンフィールド試験における経路距
離（Ａ）及び運動時間（Ｂ）の結果を図３Ａ及び図３Ｂ
に示す（それぞれＰ＜０．０５及びＰ＜０．０１；＋／
＋はｎ＝１４、＋／−はｎ＝２２、−／−はｎ＝２
０）。α1E -/-マウスの場合、フィールドの中央領域
（内側の１６個の升目）で費やされた時間の割合は著し
く低かった（図３Ｃ、Ｄ；Ｐ＜０．０５）。これらの結
果は、α1E -/-マウスがより高レベルの不安をもってい
ることを示している。しかし、高架かつ迷路試験及び聴
覚刺激応答試験においては、３種の遺伝子型間において
全く著しい差異が観察されなかった。高架かつ迷路試験
の結果を図３Ｅ（＋／＋はｎ＝１５、＋／−はｎ＝１
８、−／−はｎ＝１９）に示す。図３Ｅ中、白色柱はオ
ープンアームで費やした時間、黒色柱はクローズドアー
ムで費やした時間をそれぞれ表している。また、聴覚刺
激応答試験の結果を図３Ｆ（＋／＋はｎ＝８、＋／−は
ｎ＝１０、−／−はｎ＝１５）に示す。図３Ｆには、１
０５ｄＢ（白色柱）、１１５ｄＢ（灰色柱）、及び１１
７ｄＢ（黒色柱）の刺激をそれぞれ与えたときの飛び上
がり応答の結果が示されている。
は概ね正常に見えたが、オープンフィールド試験によっ
てわかったように、野生型マウス（α1E +/+）と比べ、
自発的なロコモーター活動のレベルが顕著に低下してい
た。計５分間のオープンフィールド試験における経路距
離（Ａ）及び運動時間（Ｂ）の結果を図３Ａ及び図３Ｂ
に示す（それぞれＰ＜０．０５及びＰ＜０．０１；＋／
＋はｎ＝１４、＋／−はｎ＝２２、−／−はｎ＝２
０）。α1E -/-マウスの場合、フィールドの中央領域
（内側の１６個の升目）で費やされた時間の割合は著し
く低かった（図３Ｃ、Ｄ；Ｐ＜０．０５）。これらの結
果は、α1E -/-マウスがより高レベルの不安をもってい
ることを示している。しかし、高架かつ迷路試験及び聴
覚刺激応答試験においては、３種の遺伝子型間において
全く著しい差異が観察されなかった。高架かつ迷路試験
の結果を図３Ｅ（＋／＋はｎ＝１５、＋／−はｎ＝１
８、−／−はｎ＝１９）に示す。図３Ｅ中、白色柱はオ
ープンアームで費やした時間、黒色柱はクローズドアー
ムで費やした時間をそれぞれ表している。また、聴覚刺
激応答試験の結果を図３Ｆ（＋／＋はｎ＝８、＋／−は
ｎ＝１０、−／−はｎ＝１５）に示す。図３Ｆには、１
０５ｄＢ（白色柱）、１１５ｄＢ（灰色柱）、及び１１
７ｄＢ（黒色柱）の刺激をそれぞれ与えたときの飛び上
がり応答の結果が示されている。
【００３１】実施例１０（痛覚関連試験）
前記のように、α1EＣａ2+チャネルが痛覚伝達に関与し
ている可能性が明らかとなったので、α1E変異マウスの
痛覚関連行動を分析した。全実験は、知覚のある動物の
実験的痛覚研究のための倫理的ガイドライン（in Core
curriculm forprofessional education in pain 2nd e
d., ed. Fields, H.L. (IASP Press, Seattle), pp.111
-112, 1995）に基づいて行われ、以下の痛覚関連試験は
東京医科歯科大学Animal Care Committeeにより承認さ
れている。生後１５〜２０週間の雌雄のマウスを使用し
た。実験開始前少なくとも１時間、マウスを防音の実験
室に順応させた。また、実験は明条件下（明：暗＝１
２：１２）で行われた。最初に、von Frey試験により機
械的刺激に対する限界を調べた。機械的刺激に対して５
０％が後足を引っ込める行動が、von Frey hairsで上下
パラダイムを用いて示された（J. Neurosci. Methods 5
3, 55-63, 1994）。結果を図４Ａ（＋／＋はｎ＝１３、
＋／−はｎ＝２１、−／−はｎ＝２４）に示す。各遺伝
子型の動物は限界における顕著な差異の兆候を示さなか
った。
ている可能性が明らかとなったので、α1E変異マウスの
痛覚関連行動を分析した。全実験は、知覚のある動物の
実験的痛覚研究のための倫理的ガイドライン（in Core
curriculm forprofessional education in pain 2nd e
d., ed. Fields, H.L. (IASP Press, Seattle), pp.111
-112, 1995）に基づいて行われ、以下の痛覚関連試験は
東京医科歯科大学Animal Care Committeeにより承認さ
れている。生後１５〜２０週間の雌雄のマウスを使用し
た。実験開始前少なくとも１時間、マウスを防音の実験
室に順応させた。また、実験は明条件下（明：暗＝１
２：１２）で行われた。最初に、von Frey試験により機
械的刺激に対する限界を調べた。機械的刺激に対して５
０％が後足を引っ込める行動が、von Frey hairsで上下
パラダイムを用いて示された（J. Neurosci. Methods 5
3, 55-63, 1994）。結果を図４Ａ（＋／＋はｎ＝１３、
＋／−はｎ＝２１、−／−はｎ＝２４）に示す。各遺伝
子型の動物は限界における顕著な差異の兆候を示さなか
った。
【００３２】次に、不快熱刺激への応答を足引っこめ試
験、尾引っこめ試験、及びホットプレート試験により調
べた。腰髄及び仙髄レベルそれぞれでの脊髄反射を調査
するために足引っこめ及び尾引っこめ試験を行い、脊髄
上位（supraspinal）の侵害受容への関与を調査するた
めにホットプレート試験を行った（Pain 22, 1-31, 198
5）。足引っこめ試験としては、後足を引っ込める潜時
を、Hargreavesの方法（Pain 32, 77-88, 1988）により
Ugo Basile足底試験装置を用いて測定した。試験は、高
強度（赤外線強度４０）及び低強度（赤外線強度１０）
で行い、両強度共にカットオフ時間は２３秒とした。低
強度（白色柱；＋／＋はｎ＝１３、＋／−はｎ＝２１、
−／−はｎ＝２４）及び高強度（黒色柱；＋／＋はｎ＝
１２、＋／−はｎ＝１６、−／−はｎ＝１５）の不快熱
刺激に対する後足引っ込め応答潜時の結果を図４Ｂに示
す。尾引っこめ試験としては、マウスを軽く拘束しなが
ら、尾の３分の２を温水（４８〜４９℃）に浸し、尾引
っこめの潜時を記録した。カットオフ時間は２５秒とし
た。結果を図４Ｃに示す（＋／＋はｎ＝１２、＋／−は
ｎ＝１７、−／−はｎ＝１５）。また、ホットプレート
試験は、３温度（５０、５２、５５℃）で行い、後足を
舐めるまでの潜時を記録した。カットオフ時間は、５０
℃で６０秒、５２℃で４０秒、５５℃で３０秒とした。
ホットプレート試験において５０℃（白色柱）、５２℃
（黒色柱）、及び５５℃（灰色柱）での後足を舐めるま
での潜時の結果を図４Ｄ（＋／＋はｎ＝１１、＋／−は
ｎ＝１７、−／−はｎ＝１５）に示す。足引っこめ試
験、尾引っこめ試験、及びホットプレート試験におい
て、遺伝子型間で統計学的な差異は全く観察されなかっ
た（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）ことから、α1E変異マウスの機械
的刺激及び不快熱刺激への応答は正常であることがわか
った。
験、尾引っこめ試験、及びホットプレート試験により調
べた。腰髄及び仙髄レベルそれぞれでの脊髄反射を調査
するために足引っこめ及び尾引っこめ試験を行い、脊髄
上位（supraspinal）の侵害受容への関与を調査するた
めにホットプレート試験を行った（Pain 22, 1-31, 198
5）。足引っこめ試験としては、後足を引っ込める潜時
を、Hargreavesの方法（Pain 32, 77-88, 1988）により
Ugo Basile足底試験装置を用いて測定した。試験は、高
強度（赤外線強度４０）及び低強度（赤外線強度１０）
で行い、両強度共にカットオフ時間は２３秒とした。低
強度（白色柱；＋／＋はｎ＝１３、＋／−はｎ＝２１、
−／−はｎ＝２４）及び高強度（黒色柱；＋／＋はｎ＝
１２、＋／−はｎ＝１６、−／−はｎ＝１５）の不快熱
刺激に対する後足引っ込め応答潜時の結果を図４Ｂに示
す。尾引っこめ試験としては、マウスを軽く拘束しなが
ら、尾の３分の２を温水（４８〜４９℃）に浸し、尾引
っこめの潜時を記録した。カットオフ時間は２５秒とし
た。結果を図４Ｃに示す（＋／＋はｎ＝１２、＋／−は
ｎ＝１７、−／−はｎ＝１５）。また、ホットプレート
試験は、３温度（５０、５２、５５℃）で行い、後足を
舐めるまでの潜時を記録した。カットオフ時間は、５０
℃で６０秒、５２℃で４０秒、５５℃で３０秒とした。
ホットプレート試験において５０℃（白色柱）、５２℃
（黒色柱）、及び５５℃（灰色柱）での後足を舐めるま
での潜時の結果を図４Ｄ（＋／＋はｎ＝１１、＋／−は
ｎ＝１７、−／−はｎ＝１５）に示す。足引っこめ試
験、尾引っこめ試験、及びホットプレート試験におい
て、遺伝子型間で統計学的な差異は全く観察されなかっ
た（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）ことから、α1E変異マウスの機械
的刺激及び不快熱刺激への応答は正常であることがわか
った。
【００３３】次に、ホルマリン試験及び酢酸身震い試験
により炎症性疼痛に関連する応答を調べた。ホルマリン
試験は、マウスに軽いハロセン麻酔をかけ、ホルマリン
（食塩水中ＰＦＡが０．５％の１０μｌ）を、後足の後
部表面に皮下注射した。その後、マウスを観察チャンバ
ーに移した。注射した足を舐めたり、噛んだりするのに
費やした時間（痛覚応答時間）を、注射後１〜３分及び
５〜７分（フェイズＩ）、そして注射後１０〜４７分の
期間では、５分毎に２分間（フェイズII）測定した。フ
ェイズＩは、ホルマリンの侵害受容器（nociceptor）へ
の直接刺激による痛覚応答であり、フェイズIIは、ホル
マリンにより引きおこされた炎症による痛覚応答である
（in The Pharmacology of Pain, eds. Dickenson, A.
& Besson, J.- M. (Springer, Berlin), pp.1-20, 199
7）。ホルマリン試験の結果を図５Ａに示す。図５Ａに
は、野生型マウス（＋／＋；ｎ＝８）、ヘテロ接合体変
異マウス（＋／−；ｎ＝７）及びホモ接合体変異マウス
（−／−；ｎ＝９）におけるホルマリン誘発による後足
を舐める挙動が示され、白色柱はフェイズＩ、黒色柱は
フェイズIIをそれぞれ表している。図５Ａから、フェイ
ズＩにおいては、野生型マウス及び変異マウス間で顕著
な差異は観察されなかったが、フェイズIIでの応答は、
α1E +/-マウス及びα1E -/-マウスにおいて著しく低下す
る（それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）ことがわ
かる。
により炎症性疼痛に関連する応答を調べた。ホルマリン
試験は、マウスに軽いハロセン麻酔をかけ、ホルマリン
（食塩水中ＰＦＡが０．５％の１０μｌ）を、後足の後
部表面に皮下注射した。その後、マウスを観察チャンバ
ーに移した。注射した足を舐めたり、噛んだりするのに
費やした時間（痛覚応答時間）を、注射後１〜３分及び
５〜７分（フェイズＩ）、そして注射後１０〜４７分の
期間では、５分毎に２分間（フェイズII）測定した。フ
ェイズＩは、ホルマリンの侵害受容器（nociceptor）へ
の直接刺激による痛覚応答であり、フェイズIIは、ホル
マリンにより引きおこされた炎症による痛覚応答である
（in The Pharmacology of Pain, eds. Dickenson, A.
& Besson, J.- M. (Springer, Berlin), pp.1-20, 199
7）。ホルマリン試験の結果を図５Ａに示す。図５Ａに
は、野生型マウス（＋／＋；ｎ＝８）、ヘテロ接合体変
異マウス（＋／−；ｎ＝７）及びホモ接合体変異マウス
（−／−；ｎ＝９）におけるホルマリン誘発による後足
を舐める挙動が示され、白色柱はフェイズＩ、黒色柱は
フェイズIIをそれぞれ表している。図５Ａから、フェイ
ズＩにおいては、野生型マウス及び変異マウス間で顕著
な差異は観察されなかったが、フェイズIIでの応答は、
α1E +/-マウス及びα1E -/-マウスにおいて著しく低下す
る（それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）ことがわ
かる。
【００３４】次に、末梢における炎症応答について調べ
た。ＰＦＡ注射した右足の容積（Ｖ r）と、コントロー
ル左足の容積（Ｖl）を、plethysmometer（Unicom TK10
1、Unicom、千葉県）で測定することにより末梢におけ
る炎症を確認した。末梢炎症率（％）は、式；炎症率＝
（Ｖr−Ｖl）／Ｖl×１００により算出した。その結
果、ホルマリン注射による末梢における炎症応答におい
て差異は全く見い出されなかった（＋／＋及び−／−マ
ウスにおける周縁炎症率（％）はそれぞれ３０．０±
５．３（ｎ＝７）及び２９．８±３．９（ｎ＝５）であ
った）。以上のことから、α1EＣａ2+チャネルは、ＳＣ
及び／又はＤＲＧレベルにおける炎症性痛覚の伝達に関
与し、このチャネルのブロッカーが抗侵害受容（nocice
ption）に対し有用であることがわかる。
た。ＰＦＡ注射した右足の容積（Ｖ r）と、コントロー
ル左足の容積（Ｖl）を、plethysmometer（Unicom TK10
1、Unicom、千葉県）で測定することにより末梢におけ
る炎症を確認した。末梢炎症率（％）は、式；炎症率＝
（Ｖr−Ｖl）／Ｖl×１００により算出した。その結
果、ホルマリン注射による末梢における炎症応答におい
て差異は全く見い出されなかった（＋／＋及び−／−マ
ウスにおける周縁炎症率（％）はそれぞれ３０．０±
５．３（ｎ＝７）及び２９．８±３．９（ｎ＝５）であ
った）。以上のことから、α1EＣａ2+チャネルは、ＳＣ
及び／又はＤＲＧレベルにおける炎症性痛覚の伝達に関
与し、このチャネルのブロッカーが抗侵害受容（nocice
ption）に対し有用であることがわかる。
【００３５】酢酸の腹腔内注射により身震いと呼ばれる
典型的行動が誘発され、炎症による内臓痛のモデルとな
っている（in The Pharmacology of Pain, eds. Dicken
son,A. & Besson, J.- M. (Springer, Berlin), pp.1-2
0, 1997）。酢酸（０．６％）を腹腔内注射し（０．１
ｍｌ／体重１０ｇ）、２０分間の身震い数を計測する身
震い試験の結果を図５Ｂ（＋／＋はｎ＝６、＋／−はｎ
＝８、−／−はｎ＝１３）に示す。図５Ｂからもわかる
ように、０．６％酢酸の投与後の侵害受容性応答（胴体
部身震い）は、α1E +/-マウスにおいてのみ顕著に低下
した（Ｐ＜０．０５）。この結果は、α1EＣａ2+チャネ
ルの密度低下（正常値の半分程度）が、炎症による痛覚
低下に関与していることを示している。また、他のチャ
ネルがα 1E -/-マウスにおけるα1E欠損を埋め合わせる
可能性を明らかにしている。酢酸身震い試験の場合と比
べ、α1E -/-マウスのホルマリンへの応答がα1E +/+マウ
スより小さいという前記試験結果と合わせ考察すると、
両試験におけるα1E -/-マウスの応答の差異は、炎症性
の侵害受容（nociception）が異なるルートをたどるこ
とを反映している可能性がある。ホルマリンにより発生
した痛覚シグナルは腰部ＳＣに入るが、酢酸により発生
した痛覚シグナルは胸部及び腰部ＳＣに入る。埋め合わ
せのメカニズムがα1E -/-マウスにおいて起こるなら
ば、それは胸部レベルで起こると思われる。この点を確
かめるために、我々は、胸部及び腰部ＳＣにおけるＶＤ
ＣＣのα1Aα1Bα1Cα1D及びα1Gサブユニットをコード
する遺伝子発現を、半量的ＲＴ−ＰＣＲにより調査し
た。しかし、両部位におけるこれらの遺伝子発現は、α
1E +/+マウス、α1E +/-マウス、及びα1E -/-マウス間に
おいて顕著には異ならなかった。今までのところ我々
は、埋め合わせメカニズムの存在を示すデータを得てい
ない。これら一連の根拠により、埋め合わせメカニズム
存在の可能性が自動的に排除されるわけではないが、α
1E -/-マウスにおける身震い応答が脊髄上位（supraspin
al）の抗侵害受容性経路の阻害により維持されていると
見ることができる。
典型的行動が誘発され、炎症による内臓痛のモデルとな
っている（in The Pharmacology of Pain, eds. Dicken
son,A. & Besson, J.- M. (Springer, Berlin), pp.1-2
0, 1997）。酢酸（０．６％）を腹腔内注射し（０．１
ｍｌ／体重１０ｇ）、２０分間の身震い数を計測する身
震い試験の結果を図５Ｂ（＋／＋はｎ＝６、＋／−はｎ
＝８、−／−はｎ＝１３）に示す。図５Ｂからもわかる
ように、０．６％酢酸の投与後の侵害受容性応答（胴体
部身震い）は、α1E +/-マウスにおいてのみ顕著に低下
した（Ｐ＜０．０５）。この結果は、α1EＣａ2+チャネ
ルの密度低下（正常値の半分程度）が、炎症による痛覚
低下に関与していることを示している。また、他のチャ
ネルがα 1E -/-マウスにおけるα1E欠損を埋め合わせる
可能性を明らかにしている。酢酸身震い試験の場合と比
べ、α1E -/-マウスのホルマリンへの応答がα1E +/+マウ
スより小さいという前記試験結果と合わせ考察すると、
両試験におけるα1E -/-マウスの応答の差異は、炎症性
の侵害受容（nociception）が異なるルートをたどるこ
とを反映している可能性がある。ホルマリンにより発生
した痛覚シグナルは腰部ＳＣに入るが、酢酸により発生
した痛覚シグナルは胸部及び腰部ＳＣに入る。埋め合わ
せのメカニズムがα1E -/-マウスにおいて起こるなら
ば、それは胸部レベルで起こると思われる。この点を確
かめるために、我々は、胸部及び腰部ＳＣにおけるＶＤ
ＣＣのα1Aα1Bα1Cα1D及びα1Gサブユニットをコード
する遺伝子発現を、半量的ＲＴ−ＰＣＲにより調査し
た。しかし、両部位におけるこれらの遺伝子発現は、α
1E +/+マウス、α1E +/-マウス、及びα1E -/-マウス間に
おいて顕著には異ならなかった。今までのところ我々
は、埋め合わせメカニズムの存在を示すデータを得てい
ない。これら一連の根拠により、埋め合わせメカニズム
存在の可能性が自動的に排除されるわけではないが、α
1E -/-マウスにおける身震い応答が脊髄上位（supraspin
al）の抗侵害受容性経路の阻害により維持されていると
見ることができる。
【００３６】次に、体内侵害受容性応答に対する内臓痛
刺激による感作の影響を調べた。マウスを酢酸（０．６
％酢酸）により感作した。痛覚応答は、酢酸注射１時間
後に収まった。次に、ホームケージにマウスを戻した。
マウスの行動は、正常なように見え、痛みの兆候を示さ
なかった。感作マウスをさらに１８〜２０日間休養さ
せ、後足にホルマリンを注射した。フェイズＩにおける
ホルマリンへの応答は、α1E +/+マウスにおいてわずか
に低下したが、α1E +/-マウス及びα1E -/-マウスにおい
てはわずかに上昇した。フェイズIIでは、これに反し、
α1E +/+マウスとα1E -/-マウスとは互いに著しく対照的
な応答を示した（図５Ｃ）。α1E -/-マウスにおいて
は、ホルマリンを注射した無感作α1E -/-マウスと比
べ、フェイズII応答は著しく上昇した（Ｐ＜０．０１）
が、α1E +/+マウスは反対の応答を示した。α1E +/+マウ
スで観察された明白な痛覚抑制効果は、下行性疼痛抑制
系調節メカニズムの一例として解釈することができる。
図５Ｃにおける＋／＋はｎ＝４、＋／−はｎ＝１０、−
／−はｎ＝１０であり、無感作マウスのデータ（点付き
柱）も比較のために示されている。なお、無感作マウス
と比べ、感作したＢ６マウスにおいて著しいフェイズII
応答低下（Ｐ＜０．００１）も観察した（ｎ＝２５）。
刺激による感作の影響を調べた。マウスを酢酸（０．６
％酢酸）により感作した。痛覚応答は、酢酸注射１時間
後に収まった。次に、ホームケージにマウスを戻した。
マウスの行動は、正常なように見え、痛みの兆候を示さ
なかった。感作マウスをさらに１８〜２０日間休養さ
せ、後足にホルマリンを注射した。フェイズＩにおける
ホルマリンへの応答は、α1E +/+マウスにおいてわずか
に低下したが、α1E +/-マウス及びα1E -/-マウスにおい
てはわずかに上昇した。フェイズIIでは、これに反し、
α1E +/+マウスとα1E -/-マウスとは互いに著しく対照的
な応答を示した（図５Ｃ）。α1E -/-マウスにおいて
は、ホルマリンを注射した無感作α1E -/-マウスと比
べ、フェイズII応答は著しく上昇した（Ｐ＜０．０１）
が、α1E +/+マウスは反対の応答を示した。α1E +/+マウ
スで観察された明白な痛覚抑制効果は、下行性疼痛抑制
系調節メカニズムの一例として解釈することができる。
図５Ｃにおける＋／＋はｎ＝４、＋／−はｎ＝１０、−
／−はｎ＝１０であり、無感作マウスのデータ（点付き
柱）も比較のために示されている。なお、無感作マウス
と比べ、感作したＢ６マウスにおいて著しいフェイズII
応答低下（Ｐ＜０．００１）も観察した（ｎ＝２５）。
【００３７】この新規下行性疼痛抑制経路は、拡散性痛
み抑制コントロール（ＤＮＩＣ）経路に幾分類似してい
るが、異なるものである（Biol. Res. 28, 113-125, 19
95）。本発明者らは最近、感作Ｂ６マウスにおけるこの
痛覚応答抑制がモルヒネ様ペプチドに非依存性ではある
が、セロトニンレセプター（５−ＨＴ2A/2C）拮抗薬に
感受性があることを明らかにした。これにより、下行性
疼痛抑制経路におけるセロトニンの関与を示した。α1E
-/-マウスにおいて観察された痛覚応答の上昇は、下行
性疼痛抑制経路の抑制効果の低下、また、下行性疼痛抑
制促通経路の活性化が損なわれていないことにより説明
することができる。現実に、同種類の刺激が脊髄上位レ
ベルで抗侵害受容性及び侵害受容性経路の両方を活性化
させることが知られている（Pain 78, 59-69, 1998）。
み抑制コントロール（ＤＮＩＣ）経路に幾分類似してい
るが、異なるものである（Biol. Res. 28, 113-125, 19
95）。本発明者らは最近、感作Ｂ６マウスにおけるこの
痛覚応答抑制がモルヒネ様ペプチドに非依存性ではある
が、セロトニンレセプター（５−ＨＴ2A/2C）拮抗薬に
感受性があることを明らかにした。これにより、下行性
疼痛抑制経路におけるセロトニンの関与を示した。α1E
-/-マウスにおいて観察された痛覚応答の上昇は、下行
性疼痛抑制経路の抑制効果の低下、また、下行性疼痛抑
制促通経路の活性化が損なわれていないことにより説明
することができる。現実に、同種類の刺激が脊髄上位レ
ベルで抗侵害受容性及び侵害受容性経路の両方を活性化
させることが知られている（Pain 78, 59-69, 1998）。
【００３８】下行性疼痛抑制経路に関与するセロトニン
作動性神経細胞のプライマリーオリジンは延髄縫線核の
神経細胞であると考えられている（in Textbook of pai
n. 3rd ed., eds. Wall, P.D. & Melzack, R. (Churchi
ll Livingstone, Edinburgh), pp.243-257, 1994）。し
かし、α1E +/-における脳のＸ−ｇａｌ染色は延髄にお
けるα1E発現を示さなかったが（図２Ｇ）、延髄神経細
胞活性をコントロールするといわれている（in Textboo
k of pain. 3rd ed., eds. Wall, P.D. & Melzack, R.
(Churchill Livingstone, Edinburgh), pp.243-257, 19
94）中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ：periaqueductal gra
y）において検知された（図２Ｈ）。なお、図２Ｇにお
ける縮尺バーは０．５ｍｍを、図２Ｈにおける縮尺バー
は１００μｍを示す。従って、ＰＡＧ神経細胞の興奮性
をコントロールすることにより、及び／又は、延髄神経
細胞を活性化させるために興奮性伝達物質を放出するこ
とにより、α1EＣａ2+チャネルが下行性疼痛抑制に関与
するものであると推測することができる。図６はα1E変
異表現型を説明するモデルである。化学的刺激物注射の
結果として生じた炎症媒体は一次求心性繊維を刺激し、
後角神経細胞の興奮を誘発する。この情報はさらに脊髄
上位構造（例えば視床）へと運ばれる。α1EＣａ2+チャ
ネルは、遺伝子量に依存してこれら情報伝達の片方又は
両方を媒介する。Ｃａ2+チャネルはさらに、ＰＡＧ神経
細胞の興奮の上昇、あるいは、ターミナルから刺激伝達
物質の放出を誘発することにより延髄神経細胞を活性化
させ、下行性疼痛抑制シグナルを媒介する。延髄神経細
胞により放出されたセロトニンは、順番に脊髄痛覚伝達
の抑制コントロールを行う。
作動性神経細胞のプライマリーオリジンは延髄縫線核の
神経細胞であると考えられている（in Textbook of pai
n. 3rd ed., eds. Wall, P.D. & Melzack, R. (Churchi
ll Livingstone, Edinburgh), pp.243-257, 1994）。し
かし、α1E +/-における脳のＸ−ｇａｌ染色は延髄にお
けるα1E発現を示さなかったが（図２Ｇ）、延髄神経細
胞活性をコントロールするといわれている（in Textboo
k of pain. 3rd ed., eds. Wall, P.D. & Melzack, R.
(Churchill Livingstone, Edinburgh), pp.243-257, 19
94）中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ：periaqueductal gra
y）において検知された（図２Ｈ）。なお、図２Ｇにお
ける縮尺バーは０．５ｍｍを、図２Ｈにおける縮尺バー
は１００μｍを示す。従って、ＰＡＧ神経細胞の興奮性
をコントロールすることにより、及び／又は、延髄神経
細胞を活性化させるために興奮性伝達物質を放出するこ
とにより、α1EＣａ2+チャネルが下行性疼痛抑制に関与
するものであると推測することができる。図６はα1E変
異表現型を説明するモデルである。化学的刺激物注射の
結果として生じた炎症媒体は一次求心性繊維を刺激し、
後角神経細胞の興奮を誘発する。この情報はさらに脊髄
上位構造（例えば視床）へと運ばれる。α1EＣａ2+チャ
ネルは、遺伝子量に依存してこれら情報伝達の片方又は
両方を媒介する。Ｃａ2+チャネルはさらに、ＰＡＧ神経
細胞の興奮の上昇、あるいは、ターミナルから刺激伝達
物質の放出を誘発することにより延髄神経細胞を活性化
させ、下行性疼痛抑制シグナルを媒介する。延髄神経細
胞により放出されたセロトニンは、順番に脊髄痛覚伝達
の抑制コントロールを行う。
【００３９】最近、本発明者らにより、下行性疼痛抑制
経路の長期にわたる活性化が、酢酸注射と対照的に、ホ
ルマリン注射での前処理により誘発されないことが見い
出されている。これは、ホルマリン試験における応答低
下（図５Ａ）及び無感作α1E -/-マウスでの酢酸身震い
試験における（α1E +/-マウスと比較した）応答上昇
（図５Ｂ）と一致する。酢酸により誘発された下行性疼
痛抑制経路の活性化は、驚くほど長期間（少なくとも３
週間）続いた。ＰＡＧ／延髄軸でのシナプス伝達の長期
的増強（Nature(London) 361, 31-39, 1993）等、この
長期的増強効果に神経細胞可塑性が関与するとすれば、
α1EＣａ2+チャネルを通り流入するＣａ2+がこの過程に
不可欠であることを示す。
経路の長期にわたる活性化が、酢酸注射と対照的に、ホ
ルマリン注射での前処理により誘発されないことが見い
出されている。これは、ホルマリン試験における応答低
下（図５Ａ）及び無感作α1E -/-マウスでの酢酸身震い
試験における（α1E +/-マウスと比較した）応答上昇
（図５Ｂ）と一致する。酢酸により誘発された下行性疼
痛抑制経路の活性化は、驚くほど長期間（少なくとも３
週間）続いた。ＰＡＧ／延髄軸でのシナプス伝達の長期
的増強（Nature(London) 361, 31-39, 1993）等、この
長期的増強効果に神経細胞可塑性が関与するとすれば、
α1EＣａ2+チャネルを通り流入するＣａ2+がこの過程に
不可欠であることを示す。
【００４０】
【発明の効果】本発明のスクリーニング方法によると、
電位依存性Ｃａ2+チャネルに依存する炎症性疼痛等の侵
害受容性疼痛などのα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因
する疾病の予防・治療薬を得ることができ、またこれら
の予防・治療薬はα1EＣａ2+チャネルの生理機能を明ら
かにする上で有用である。
電位依存性Ｃａ2+チャネルに依存する炎症性疼痛等の侵
害受容性疼痛などのα1EＣａ2+チャネル機能障害に起因
する疾病の予防・治療薬を得ることができ、またこれら
の予防・治療薬はα1EＣａ2+チャネルの生理機能を明ら
かにする上で有用である。
【００４１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
<120> Screening methods of prophylactic/therapeutic agent for
diseases derived from impaired function of alpha-1E
Ca2+ channel
<130> A081P10
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:mA1E-F1
<400> 1
agcaggaacc gacaaggaac c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:mA1E-R1
<400> 2
ggtggccagg atcatgtact c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:SP-F1
<400> 3
gtctgaccgc aaatcgaac 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:SP-R1
<400> 4
caggaaacat gctgctagga 20
【図１】ホモ接合体変異マウス（α1E -/-）の作製に関
し、ＡはＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子のエクソン１の周辺の制
限酵素地図及びターゲッティングベクターの構造を示す
図であり、Ｂはサザンブロット分析、ＣはＲＴ−ＰＣＲ
分析、Ｄはノーザンブロット分析、Ｅはイムノブロット
分析の結果をそれぞれ示す図である。
し、ＡはＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子のエクソン１の周辺の制
限酵素地図及びターゲッティングベクターの構造を示す
図であり、Ｂはサザンブロット分析、ＣはＲＴ−ＰＣＲ
分析、Ｄはノーザンブロット分析、Ｅはイムノブロット
分析の結果をそれぞれ示す図である。
【図２】痛覚伝達に関与する神経系におけるＣＡＣＮＡ
１Ｅ遺伝子の発現パターンを示す図である(参考写真参
照)。
１Ｅ遺伝子の発現パターンを示す図である(参考写真参
照)。
【図３】野生型マウス（α1E +/+）、ヘテロ接合体変異
マウス（α1E +/-）及びホモ接合体変異マウス
（α1E -/-）における不安関連挙動試験の結果を示す図
である。
マウス（α1E +/-）及びホモ接合体変異マウス
（α1E -/-）における不安関連挙動試験の結果を示す図
である。
【図４】野生型マウス（α1E +/+）、ヘテロ接合体変異
マウス（α1E +/-）及びホモ接合体変異マウス
（α1E -/-）における急性痛み試験の結果を示す図であ
る。
マウス（α1E +/-）及びホモ接合体変異マウス
（α1E -/-）における急性痛み試験の結果を示す図であ
る。
【図５】皮下又は内蔵への化学的刺激に対する侵害受容
性応答の結果を示す図である。
性応答の結果を示す図である。
【図６】α1Eチャネル機能を説明するための図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｎ
Claims (9)
- 【請求項１】 電位依存性Ｃａ２＋チャネルα１Ｅサブ
ユニット遺伝子変異非ヒト動物に被検物質を投与し、該
遺伝子変異非ヒト動物における侵害受容性疼痛の程度を
測定・評価することを特徴とするα１ＥＣａ２＋チャネ
ル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項２】 遺伝子変異非ヒト動物における侵害受容
性疼痛の程度を、野生型の非ヒト動物の場合と比較・評
価することを特徴とする請求項１記載のα１ＥＣａ２＋
チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスク
リーニング方法。 - 【請求項３】 電位依存性Ｃａ２＋チャネルα１Ｅサブ
ユニット遺伝子変異非ヒト動物が、電位依存性Ｃａ２＋
チャネルα１Ｅサブユニット遺伝子機能が染色体上で欠
損した非ヒト動物であることを特徴とする請求項１又は
２記載のα１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾
病の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項４】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
する請求項１〜３のいずれか記載のα１ＥＣａ２＋チャ
ネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリー
ニング方法。 - 【請求項５】 侵害受容性疼痛が炎症性疼痛であること
を特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のα１ＥＣａ
２＋チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬の
スクリーニング方法。 - 【請求項６】 電位依存性Ｃａ２＋チャネルα１Ｅサブ
ユニット遺伝子変異非ヒト動物に由来する細胞・組織に
被検物質を接触せしめ、該細胞・組織につながった脊髄
における電気生理学的応答の程度を測定・評価すること
を特徴とするα１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因す
る疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項７】 脊髄における電気生理学的応答の程度
を、野生型の非ヒト動物の場合と比較・評価することを
特徴とする請求項６記載のα１ＥＣａ２＋チャネル機能
障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方
法。 - 【請求項８】 電位依存性Ｃａ２＋チャネルα１Ｅサブ
ユニット遺伝子変異非ヒト動物が、電位依存性Ｃａ２＋
チャネルα１Ｅサブユニット遺伝子機能が染色体上で欠
損した非ヒト動物であることを特徴とする請求項６又は
７記載のα１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾
病の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項９】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
する請求項６〜８のいずれか記載のα１ＥＣａ２＋チャ
ネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリー
ニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000333621A JP3471739B2 (ja) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | α１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000333621A JP3471739B2 (ja) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | α１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002139485A JP2002139485A (ja) | 2002-05-17 |
| JP3471739B2 true JP3471739B2 (ja) | 2003-12-02 |
Family
ID=18809670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000333621A Expired - Fee Related JP3471739B2 (ja) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | α１ＥＣａ２＋チャネル機能障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3471739B2 (ja) |
-
2000
- 2000-10-31 JP JP2000333621A patent/JP3471739B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002139485A (ja) | 2002-05-17 |
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