KR20020092891A - 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2 결핍 마우스 및 이의용도 - Google Patents
코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2 결핍 마우스 및 이의용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2가 결핍된 유전자전이된 마우스를 제공한다. CRFR2 돌연변이 마우스는 스트레스에 대해 과민성이며, 증가된 불안-유사 거동을 나타낸다. 돌연변이 마우스는 정상적 기초적 섭식과 체중 증가를 나타내지만, 섭식 방해 후 감소된 음식물 섭취를 나타낸다. 정맥내 UCN은 돌연변이 마우스에 어떠한 영향도 주지 않지만, 대조군 동물에서 감소된 동맥압을 유발한다. CRFR2이 결핍됨으로 인해, Edinger Westphal의 문측 영역중의 우로코르틴 mRNA가 상당히 증가하고, 편도선의 중추 핵에서 CRF mRNA가 상당히 증가한다. 이들 결과로 부터, CRFR1 돌연변이체 마우스와 달리 CRFR2 돌연변이 마우스는 스트레스에 대한 민감성이 증가되고 불안-유사 거동을 나타냄이 입증되었다.
Description
연방 기금 설명
본 발명은 부분적으로는 관허 제NIH DK-26741호하의 연방정부와 NRSA 조합 DK09841 및 DK09551로부터의 기금을 사용하여 달성되었다. 따라서, 연방정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
코르티코트로핀 분비 인자(CRF)는 시상하부의 뇌하수체 부신(HPA)계의 중요한 조정인자이다. 스트레스에 대응하여, 시상하부의 뇌실곁핵(PVN)으로부터 분비되는 코르티코트로핀 분비 인자는 뇌하수체 전엽의 부신피질자극세포 상의 코르티코트로핀 분비 인자 수용체를 활성화하여, 혈류 속으로 부신피질자극호르몬(ACTH)을 분비시킨다. 이어서, ACTH는 부신피질 속의 ACTH 수용체를 활성화시켜 글루코코르티코이드의 합성 및 분비를 증가시킨다[참조 문헌: 1].
CRF, CRFR1 및 CRFR2에 대한 수용체는 CNS 및 말초신경 전체에 걸쳐서 존재한다. CRF가 CRFR 2에 대해서 보다 CRFR1에 대해 친화성이 더 높은 반면, CRF-관련 단백질인 우로코르틴(UCN)은 CRF 보다 거의 40배나 높은 친화성으로 결합하기 때문에, 이는 CRFR2에 대한 내인성 리간드인 것으로 사료된다[참조 문헌: 2]. CRFR1 및 CRFR2는 약 71% 아미노산 서열 유사성을 공유하고, 뇌 및 말초 조직 내에 편중되는 점에서 구별된다[참조 문헌: 3-6]. CRFR1은 뇌하수체, 피질, 소뇌, 후뇌, 및 후구에서 주로 발현되는 반면, CRFR2는 외측 사이막, 배쪽 중간 시상하부(VMH), 맥락망총, 및 다수의 말초 부위에서 발견된다[참조 문헌: 5,7,8]. CRFR2는 몇가지 동형체(isoform)를 가지며, 이중의 하나는 모든 공지된 리간드에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: 9].
CRFR1이 결핍된 마우스는 HPA계 호르몬 수치가 감소되고 스트레스 대응력이 약화되며 불안-유사 거동이 감소된다[참조 문헌: 10,11]. 이러한 결과는 체내의 CRFR1 특이적 길항제를 사용하여 수득한 결과와 일치한다[참조 문헌: 12-14]. 반대로, CRFR2 특이적 길항제는 현재 이용될 수 없으며, 1995년 이의 클로닝 이후 CRFR2의 생리학적 기능에 대해 밝혀진 것이 거의 없다. UCN은 CRFR2에 대한 내인성 리간드일 수 있으며, 중추신경계에 투여되는 경우 섭식의 조절인자인 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: 15]. CRFR2가 음식물 섭취 조절 및 포만감에 대한 중추 부위인 배쪽 중간 시상하부에 편중되므로, 이들 수용체에 대한 우로코르틴 작용이 섭식에 영향을 줄 수 있다. 추가로, 우로코르틴의 말초 투여가 저혈압을 초래하며[참조 문헌: 2, 16], 이는 맥관계에서의 CRFR2의 작용으로부터 기인한다[참조 문헌: 5,8].
선행 기술은 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2가 결핍된 마우스의 결여에 소홀하였다. 본 발명은 당해 분야의 오랜 요구 및 소망을 성취시킨다.
발명의 요약
CRFR2의 발생적 및 생리학적 역활을 알아보기 위해, CRFR2가 결여된 돌연변이 마우스를 생산하여 분석하였다. CRFR2가 결핍된 마우스는 스트레스에 대한 반응에서 불안-유사 거동과 과민성 HPA계가 증가되는 것으로 나타났다. CRFR1 및 CRFR2 돌연변이 마우스는 불안 및 우울증의 유용한 모델을 제공하며, 추가로 이러한 질환의 원인이 되는 분자 메카니즘을 밝히는데 도움이 될 수 있다. 코르티코트로핀 분비 인자 시그날 전달 경로와 불안 및 우울증을 통제하는 데 있어서 이의 역활에 대한 연구는 이들 질환을 효과적으로 치료하는 데 요구되는 필요한 단서를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 코르코트로핀 분비 인자 수용체 2(CRFR2)의 하나 이상의 대립유전자가 파괴되어 당해 대립유전자로부터 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2 단백질을 발현하지 못하는 비-천연의 유전자전이된(transgenic) 마우스에 관한 것이다. 바람직하게는, 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2 대립유전자의 엑손 10, 11 및 12에 해당하는 DNA 서열이 결실되었다. 당해 유전자전이된 마우스에서 이들 DNA 서열은 네오마이신 내성 유전자 카세트로 치환될 수 있다. 유전자전이된 마우스는 이러한 치환에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 또한, 본 발명의 양태에는 본 발명의 마우스와 다른 종의 마우스를 교배한 자손이 포함된다.
본 발명의 다른 양태는 불안 또는 우울증을 연구하고 불안 또는 우울증에 대해 화합물이 미치는 영향을 시험하기 위해 CRFR2 결핍 마우스를 적용하는 것이다. 예를 들면, (a) 화합물을 본 발명의 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계, (b) 당해 마우스를 불안 관련 거동에 대해 시험하는 단계, 및 (c) 당해 마우스의 불안-유사 거동을 당해 화합물이 투여되지 않은 본 발명의 또 다른 유전자전이된 마우스의 불안 관련 거동과 비교하는 단계를 포함하여, 불안 조절 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 또한, (a) 화합물을 본 발명의 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계, (b) 당해 마우스를 우울증 유사 거동에 대해 시험하는 단계, 및 (c) 당해 마우스의 우울증 유사 거동을 당해 화합물이 투여되지 않은 본 발명의 또 다른 유전자전이된 마우스의 우울증 유사 거동과 비교하는 단계를 포함하여, 우울증 조절 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈압 또는 혈관생성에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝하기 위해 유사한 과정으로 CRFR2 결핍 마우스를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양태는, CRFR2 결핍 마우스를 HPA계의 생리학 연구에 적용하는 것, 예를 들면, (a) 화합물을 본 발명의 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계,(b) 당해 마우스를 스트레스-유발 상황에 두는 단계, (c) 당해 마우스에서 코르티코스테론 및 부신피질자극 호르몬의 혈장치를 모니터링하는 단계, 및 (d) 이들 혈장치를 스트레스-유발 상황에 두지 않은 본 발명의 또 다른 유전자전이된 마우스의 혈장치와 비교하는 단계를 포함하여, 스트레스에 대한 시상하부 뇌하수체 부신계의 반응에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 당해 마우스는 코르티코스테론 및 ACTH의 혈장치를 모니터링하여, 스트레스에 대한 HPA계의 반응에 미치는 화합물의 영향을 연구하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코르티코트로핀 분비 인자 및 우로코르틴과 같은 기타 단백질에 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2가 미치는 영향을 연구하는 데 있어서 본 발명의 마우스의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태는 CRFR2의 존재에 의해 방해받지 않는 CRFR1 반응을 검사하기 위한 CRFR2 결핍 마우스의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈관신생을 자극하거나 억제하기 위해 CRFR2 활성을 조작하는 것이다.
본 발명은 통상 신경생물학, 내분비학 및 정신병학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 불안 연구 및 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2가 결핍된 마우스에 관한 것이다.
본 발명의 상술한 특징, 이점 및 목적 뿐만 아니라 명백해질 기타 사항이 확인되고 상세하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 위에서 간단히 요약된 본 발명의 보다 상세한 설명이 첨부된 도면에서 설명된 특정 양태를 참조로 하여 주어질 것이다. 이들 도면은 명세서의 일부를 구성한다. 그러나, 첨부된 도면이 본 발명의 바람직한 양태를 설명하기 위함이므로 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 간주되어서는 안됨을 명심하여야 한다.
도 1A 내지 도 1E는 CRFR2-결핍 마우스의 생산에 사용된 공정, 돌연변이 마우스의 검출 및 이의 효과를 나타낸다. 도 1A는 막관통(transmembrane) 도메인 5에서 막관통 도메인 7의 말단의 절반을 암호화하는 엑손 10, 11 및 12의 결실을 나타내는 CRFR2 유전자의 게놈 구조를 나타낸다. 상동 재조합에 사용되는 표적화 작제물이 또한 도시되어 있다. 도 1B에서, 파괴된 대립유전자는 야생형(+/+), 이형접합체(+/-) 및 무표시(null) 돌연변이체(-/-) 마우스로부터 분리된 꼬리(tail) DNA의 서던 블롯팅 분석으로 검출한다. 도 1C는 CRFR2 대조군(상부) 및 돌연변이체(하부) 마우스에서125I-소바긴(Sauvagine)의 자동방사선술 결합 결과를 나타낸다. CRFR2 돌연변이 마우스의 측면 중격에서는 CRFR2가 결합하지 않지만, CRFR1 피질 결합은 대조군 마우스의 것과 유사하다. 도 1D는 부신의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 나타낸다. 10배 확대한 부신 크기(상부 패널) 또는 20배 확대한 구조에서 차이가 없음을 나타낸다[C(피질), M(수질), ZG(사구층), ZF(다발층) 및 ZR(그물층), n=8]. 도 1E는 4배 확대한 조직 절편화(상부 패널)를 위해 간에 올려 놓은 뇌하수체의 H&E 염색을 나타낸다(n=8). 뇌하수체 부신피질자극은 10배 확대한 항-ACTH 항체[참조 문헌: 20](하부 패널)로 확인된다[n=5, P(뇌하수체 후엽), I(뇌하수체 중엽), A(뇌하수체 전엽)]. 뇌하수체 또는 ACTH의 부신피질자극 편중 또는 발현 수준에 대한 어떠한 전체 해부학적 차이도 관찰되지 않는다.
도 2A 내지 도 2D는 돌연변이체 동물의 스트레스에 대한 HPA 계의 과민성을 입증한다. *: 세프 포스트-혹(Scheffe post-hoc) 시험에 의하면, 동일한 시점에서 야생형 대조군과 유의적으로 상이함, p<0.01. 혈장은 마취하지 않은 안와후 안출혈로 수득한다. 도 2A는 오전 7시에 스트레스전 ACTH 혈장치를 나타낸다(n=16). 도 2B는 오전 7시 및 오후 5시에서 기준 코르티코스테론 혈장치를 나타낸다(n=7). 도 2C는 ACTH에 대한 억제 스트레스 효과의 시간 과정을 나타낸다. 도 2D는 무표시 돌연변이 마우스의 오전 7시에서의 코르티코스테론 혈장치가 동일한 시점에서 야생형 대조군과 유의적으로 상이함을 입증한다(n=7).
도 3A 내지 도 3B는 야생형 및 돌연변이체 동배 새끼 마우스에서 음식물 섭취에 대한 24시간의 섭식 방해 효과를 나타낸다. 도 3A는 야생형 동배 새끼(n=10)과 비교한, 돌연변이체(n=7)의 기초적인 음식물 소비 및 24시간의 섭식 방해 기간후의 음식물 소비를 나타낸다(세프 포스트-혹 시험에 의하면, p<0.001). 도 3B는 야생형 및 돌연변이 마우스의 중량[기초(흰색 막대) 체중 및 섭식 방해 기간 후의 24시간의 재급식(흑색 막대) 후의 체중 둘다]을 나타낸다. 당해 그룹 사이에는 기초 체중과 재급식 후의 체중에 있어서 차이가 없다.
도 4A 내지 도 4H는 고위 플러스 미로 시험과 개방 필드 시험에서 돌연변이체 동물의 불안-유사 거동의 증가를 입증한다. 도 4A는 수컷 마우스에서 열린 팔에서의 시간 소비율(**, p<0.005)과 열린 팔에 대한 방문 수(*, p<0.02)가 야생형 대조군에 대한 것보다 돌연변이 마우스에서 유의적으로 적음을 나타낸다(대조군 n=7, 돌연변이체 n=7; 평균±SEM). 도 4B는 암컷 마우스에 대한 도 4A와 동일한시험을 나타낸다. 열린 팔에서의 시간 소비율(**, p<0.03) 및 열린 팔에 대한 방문 수(*, p<0.03)은 야생형 대조군에 대한 것보다 돌연변이 마우스에서 유의적으로 적었다(대조군 n=9, 돌연변이체 n=12; 평균±SEM). 도 4C 및 도 4D는, 전체 닫힌 팔 진입과 전체 팔 진입으로 측정한 운동 활성은 대조군 및 돌연변이체 동물(도 4C, 수컷 마우스; 도 4D, 암컷 마우스) 사이에서 차이가 없음을 나타낸다. 도 4E는 박스의 빛이 있는 곳에서 소비된 시간에 대해 명/암 박스 시험으로 측정한 불안-유사 거동에서 어떠한 차이도 관찰되지 않음을 나타낸다. 도 4F는 광상태 및 암상태 부분 사이의 이동 수에 대해 광상태/암상태 박스 실험으로 측정한 불안-유사 거동에서 어떠한 차이도 관찰되지 않음을 나타낸다. 도 4G는 개방 필드 장치의 내부 정방형에서의 시간 소비량을 나타낸다(*, p<0.05). 도 4H는 내부 정방형에서 발생하는 총 횡단의 존재를 나타낸다(**, p<0.01; 대조군, n=5; 돌연변이체, n=7; 평균±SEM).
도 5A 내지 도 5E는 돌연변이체 뇌에서 우로코르틴 및 CRF mRNA의 수준 증가를 나타낸다. 도 5B 내지 도 5E에 있어서, 모든 수는 돌연변이체 및 야생형 마우스에 대한 n=3의 평균치이다[피셔(Fisher) PLSD 포스트-혹 시험에 의하면, ±SEM, *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005]. 도 5A는 20배 확대한 문측(rostral) EW에서의 우로코르틴 mRNA(상부) 및 10배 확대한 cAmyg(중간) 및 뇌실곁핵(하부)에서의 CRF mRNA에 대한 원위치(in situ) 하이브리드화로부터 생성되는 은색 입자를 나타낸다. 도 5B는 문측 EW에서 우로코르틴 mRNA를 발현하는 세포 수를 측정하는 데 사용된 은색 입자의 반-정량적 분석을 나타낸다. 도 5C는 세포당 우로코르틴 mRNA의 평균 광학 밀도를 나타낸다. 도 5D는 cAmyg에서 CRF mRNA의 광학 밀도를 나타낸다. 도 5E는 뇌실곁핵에서 CRF mRNA의 광학 밀도를 나타낸다.
도 6는 야생형(n=5) 및 돌연변이 마우스(n=3)(흑색 막대)에서 우로코르틴 1.0㎍의 정맥내 주입에 대한 심혈관 반응을 나타낸다. 우로코르틴 주입에 대한 돌연변이 마우스의 현저한 무증상 반응이 관찰된다(***p<0.005). 또한, CRFR2 돌연변이 마우스에게는 UCN 주입으로 동맥압을 회복시킨 후 나트륨 니트로프루사이드(0.9% 염수 100㎕ 중의 0.8㎍)를 2차 주입한다(흰색 막대). 평균 동맥압(MAP)은 혈압 추적으로부터 측정한다.
본 발명에 따르면, 당업계의 기술내에서 통상의 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다[참조: Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S.J. Higgins Eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B. D. Hames & S.J. Higgins Eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)].
따라서, 본원에서 기재되는 경우, 다음 용어는 아래에 기재된 정의를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "cDNA"는 유전자의 mRNA 전사체의 DNA 복사체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "라이브러리의 스크리닝"은, 표지된 프로브를 사용하여, 적합한 조건하에 특정 DNA 라이브러리에 존재하는 프로브에 상보적인 서열이 있는지의 여부를 검사하는 방법을 의미한다. 또한, "라이브러리의 스크리닝"은 PCR에 의해 수행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PCR"은 당해 분야에 현재 공지되어 있는 다른 개량 기술 뿐만 아니라 물리스(Mullis)의 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호의 대상인 폴리머라제 연쇄 반응을 의미한다.
본원에 기재된 아미노산은 "L" 이성체 형태인 것이 바람직하다. 그러나, 면역글로불린 결합의 목적하는 작용 특성이 당해 폴리펩티드에 의해 보유되는 한, L 아미노산 잔기 대신에 "D" 이성체 형태의 잔기를 사용할 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 그룹을 의미한다. COOH는 폴리펩티드의 카복시 말단에 존재하는 유리 카복시 그룹을 의미한다. 표준 폴리펩티드 명명법[참조: J Biol. Chem., 243:3552-59(1969)]에 일치하게, 아미노산 잔기에 대한 약어는 당해 분야에 공지되어 있다.
모든 아미노산 잔기 서열은, 좌측 및 우측 배향이 아미노 말단으로 부터 카복시 말단으로의 통상의 방향으로 존재하는 형식으로 본원에서 기재됨에 주목해야 한다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 개시부 또는 종결부에 있는 대시(-)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가의 서열에 대한 펩티드 결합을 나타냄에 주목해야 한다.
"복제단위(replicon)"는, 생체내에서 DNA의 자가 복제 단위로서 작용하는, 즉 자체의 조절하에 복제할 수 있는 유전자 요소(예: 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.
"벡터"는 결합된 절편이 복제되도록 또다른 DNA 절편이 결합될 수 있는 복제단위(예: 플라스미드, 파아지 또는 코스미드)이다.
"DNA 분자"는 일본쇄 형태 또는 이본쇄 나선 형태인 데옥시리보뉴클레오티드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 당해 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하고, 특정한 3차 형태로 이를 한정하는 것은 아니다. 따라서, 이 용어에는 특히 선형 DNA 분자(예: 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견된 이본쇄 DNA가 포함된다. 본원에서 당해 구조를 언급함에 있어서, 표준 방식에 따르면, DNA의 비-전사된 주쇄(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 주쇄)를 따라 5' 에서 3' 방향으로의 서열만이 제공된다.
"복제 기원"은 DNA 합성에 관여하는 DNA 서열을 의미한다.
DNA "암호 서열"은 적절한 조절 서열의 조절하에 위치하는 경우, 생체내에서전사되고 폴리펩티드로 해독되는 이본쇄 DNA 서열이다. 암호 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 개시 코돈 및 3'(카복실) 말단의 해독 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호 서열은 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물(포유동물)로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열이 포함되나, 이로써 제한되지는 않는다.폴리아데닐화 시그날 및 전사 종결 서열은 일반적으로 암호 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
전사 및 해독 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날, 터미네이터 등의 DNA 조절 서열이, 숙주 세포에서 암호 서열의 발현을 위해 제공된다.
"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 하류(3' 방향) 암호 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 규정하기 위해, 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되고, 배경 이상의 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함하기 위한 상류(5' 위치)을 확장시킨다. 당해 프로모터 서열내에서, 전사 개시 부위 뿐만 아니라, RNA 폴리머라제의 결합을 위한 단백질 결합 도메인(보존(consensus) 서열)이 발견될 수 있다. 진핵생물 프로모터는 항상은 아니지만 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유한다. 원핵생물 프로모터는 -10 내지 -35 보존 서열 이외에 샤인-달가르노(Shine-Dalrarno) 서열을 함유한다.
"발현 조절 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및 해독을 제어 및 조절하는 DNA 서열이다. 암호 서열은 RNA 폴리머라제가 암호 서열을 mRNA로 전사시킨 다음, 암호 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독되는 때에, 세포에서 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하에" 있다.
"시그날 서열"은 암호 서열에 인접하여 포함될 수 있다. 상기 서열은 당해 폴리펩티드의 시그날 펩티드 N-말단을 암호화하며, 이 시그날 펩티드는 숙주세포에 정보를 전달하여, 폴리펩티드를 세포 표면으로 유도하거나, 당해 폴리펩티드를 매질내로 분비시키고, 이 시그날 펩티드는 단백질이 세포를 떠나기 전에 숙주 세포에 의해 절단된다. 시그날 서열은 원핵생물 및 진핵생물 고유의 다양한 단백질과 결합될 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 프로브를 언급하면서 본원에서 사용한 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 리보뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 정의된다. 이의 정확한 크기는, 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 작용 및 용도에 좌우되는 많은 인자에 의해 좌우될 것이다.
본원에 사용한 용어 "프라이머"는, 핵산 주쇄에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하, 즉 뉴클레오티드 및 유도제(예: DNA 폴리머라제의 존재하에 적합한 온도 및 pH에 있는 경우, 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는, 정제된 제한 소화에서 자연적으로 수득하거나 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 유도제의 존재하에 목적하는 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있도록 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 사용 방법을 포함하여, 다수의 인자에 좌우될 것이다. 예를 들면, 진단상 적용하는 경우, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15 내지 25개 이상의 뉴클레오티드를 함유하지만, 더 적은 뉴클레오티드를 함유할수 도 있다.
본원의 프라이머는 특정 표적 DNA 서열의 상이한 주쇄에 대해 "실질적으로" 상보적인 것이 선택된다. 이는 프라이머가 이들 각각의 주쇄와 하이브리드를 형성하는데 있어 충분히 상보적이어야 하는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 서열은주형의 정확한 서열을 반영할 필요가 없다. 예를 들면, 비-상보적인 뉴클레오티드 단편은 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있으며, 이때 프라이머 서열의 나머지는 주쇄에 대해 상보적일 수 있다. 한편으로, 비-상보적 염기 또는 더 긴 서열은 프라이머내로 산재될 수 있는데, 단 프라이머 서열은 서열과 충분히 상보적이거나 이와 하이브리드를 형성함으로써, 연장 생성물의 합성을 위한 주형을 형성한다.
본원에 사용한 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 각각 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 이의 근처에서 이본쇄 DNA를 절단하는 효소를 의미한다.
세포는 이러한 DNA가 세포내로 도입되는 경우, 외인성 또는 이종성 DNA에 의해 "형질전환된다". 형질전환 DNA는 세포의 게놈내로 통합(공유적으로 결합됨)될 수 있거나 통합될 수 없다. 예를 들면, 원핵생물, 효모 및 포유동물 세포에서, 형질전환 DNA는 에피솜 요소(예: 플라스미드)로 유지될 수 있다. 진핵 세포의 경우, 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 염색체에서 통합되어, 염색체 복제를 통해 딸 세포로 유전되는 세포이다. 이러한 안정성은, 형질전환 DNA를 함유하는 딸 세포의 개체군으로 이루어진 세포주 또는 클론을 확립할 수 있는 진핵 세포의 능력에 의해 증명된다. "클론"은 단일 세포, 또는 유사분열에 의해 원종으로부터 유래된 세포의 개체군이다. "세포주"는 많은 세대 동안 시험관내에서 안정하게 성장을 할 수 있는 1차 세포의 클론이다.
일반적으로, 삽입된 DNA 단편의 효율적인 전사를 촉진시키는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터는 숙주와 연관되어 사용된다. 발현 벡터는 통상적으로 복제 기원, 프로모터(들), 터미네이터(들) 뿐만 아니라, 형질전환된 세포에서 표현형에 의한 선별을 제공할 수 있는 특정 유전자를 함유한다. 형질전환된 숙주는 최적 세포 성장을 성취하기 위해 당해 분야에서 공지되어 있는 수단에 따라 발효되고 배양될 수 있다.
당해 분야의 숙련가들에게 익히 공지되어 있는 방법을 사용하여, 적합한 전사 및 해독 조절 시그날을 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 예를 들면, 당해 기술은 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y.]에 기재되어 있다. 유전자 및 이의 전사 조절 서열은, 전사 조절 서열이 유전자의 전사를 효과적으로 조절하는 경우, "작동가능하게 연결된"것으로서 정의된다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터가 포함되지만, 이로써 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 CRFR2가 결핍된 마우스에 관한 것으로서, 불안 및 HPA 계 순환계에서 CRFR2의 발생적 및 생리학적 역할을 알아보기 위한 것이다. 이는 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2의 엑손 10, 11 및 12를 결실시킴으로써 달성된다. 본 발명에 있어, 이들 서열은 네오마이신 내성 유전자 카세트로 치환된다. 마우스는 CRFR2가 결핍된 이형접합 또는 동형접합성일 수 있으며, 또 다른 종의 마우스와 교배될 수 있다.
본 발명은 또한 불안 또는 우울증 조절 활성에 대해 화합물을 시험하는 방법을 포함하여, 불안 및 우울증 연구에서 CRFR2가 결핍된 마우스의 적용에 관한 것이다. 혈압 및 혈관생성에 영향을 미치는 화합물은 CRFR2 마우스를 사용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명은 또한 시상하부 뇌하수체 부신(HPA)계의 분자 생리학 연구에서 CRFR2가 결핍된 마우스의 용도에 관한 것이다. 당해 마우스를 사용하여, 화합물이 스트레스에 대한 HPA 계의 반응에 미치는 효과를 시험할 수 있다.
본 발명은 또한 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 1, 우르코르틴, 및 기타 CRF 및 우르코르틴 수용체에 대한 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2의 분자 작용을 연구하는데 있어서 유전자전이된 마우스의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 CRFR2 네가티브 환경에서 CRFR1의 반응 및 활성을 연구하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, CRFR1 반응은 CRFR2 조절에 의해 방해받지 않고 연구할 수 있다.
본 발명은 또한 혈관신생을 자극하거나 억제하는데 있어서 CRFR2 활성의 효능제 및 길항제의 용도에 관한 것이다. CRFR2 활성을 자극하기위한 효능제의 용도는 암 치료용 혈관신생을 억제하는데 사용될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위해 제공되며, 특정 형태로 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
CRFR2 결핍 마우스의 생산
CRFR2 무표시(null) 돌연변이 마우스를 작제하기 위해서, CRFR2 좌위를 함유하는 게놈성 클론 DNA을 마우스 품종 129 게놈성 DNA 라이브러리로부터 분리한다. 이러한 클론으로부터, 표적화 벡터를 작제하며, 이때 5번째 막관통 도메인의 개시부로부터 7번째 막관통 도메인의 말단을 암호화하는 CRFR2 유전자의 엑손 10, 11 및 12가 네오마이신 내성 유전자 카셋트로 치환된다(도 1A). 수득되는 플라스미드 DNA를 NotI으로 선형화시키고 이전에 기술된 바와 같이[참조 문헌: 10], J1 배아 간(ES, embryonic stem) 세포내로 전기천공법으로 도입한다. 7 내지 9일 동안 G418(활성형) 0.2㎎/㎖에서 선별한 후, 네오마이신 내성 클론을 각각 선별하고 서던 블롯 분석으로 파괴된 CRFR2 대립유전자의 존재에 대해서 스크리닝한다.
포지티브 ES 클론을 C57BL/6 섬유아세포에 주사하여 키메라 마우스를 생산시킨다. 키메라 수컷을 키메라 암컷과 교배하여 C57BL/6-129 혼합된 배경 마우스를 생산시킨다. 파괴된 대립유전자의 유전(germ-line transmission)은 아구티(agouti) 모피색을 나타내는 F1 새끼로부터 수집된 꼬리 DNA의 서던 분석으로 검출한다(도 1B).
실시예 2
CRFR2 결핍 마우스에서 CRFR1 및 CRFR2 발현 분석
표적화된 결실이 CRFR2 유전자의 무표시 돌연변이를 초래하는지를 결정하기 위해서, 야생형 대조군 및 돌연변이체 동물로부터의 뇌 절편 상에서 수용체 방사선사진술을 수행한다.
20㎛ 절단된 뇌 조직을 함유하는 슬라이드를 실온에서 해동시키고 실온에서50mM 트리스 완충액(pH 7.4) 중에서 10분 동안 2회 세척한다. 이후, 절편을 실온에서 60분 동안 50mM 트리스(pH 7.4),125I-소바긴(sauvagine), 10mM MgCl2, 0.1% BSA, 및 0.05% 바시트라신을 함유하는 완충액중에서 항온처리한다. 소바긴은 CRF-관련된 펩티드이며 CRF 수용체에서의 효능제이다. 비특이적인 결합은125I-소바긴 및 1㎛ 차가운 소바긴 모두에 대해 노출시킨 인접한 절편내에서 뚜렷이 나타난다. 항온처리 기간 후, 슬라이드를 50mM 트리스 완충액 및 트리톤 X-100중에서 4℃에서 각각 5분 동안 2회 세척한다. 슬라이드를 탈이온수에 신속하게 침지시키고, 건조시키고 3일 동안 필름에 병치시킨다.
돌연변이 마우스에서, CRFR2에 특이적인 뇌 영역(측면 중격)에서 어떠한 결합도 검출되지 않았지만, 피질에서 CRFR1에 대한 결합은 유지된다(도 1C). 이러한 결과는 CRFR2 유전자의 파괴가 이러한 마우스에서 무표지 돌연변이를 초래한다는 것을 입증한다. 돌연변이 마우스는 가임성(fertile)이며 멘델 방식으로 돌연변이체 대립유전자를 유전시킨다.
실시예 3
CRFR2 결핍 마우스의 조직학적 분석
HPA 계의 발생이 CRFR2 결핍 마우스에서 손상되는지를 결정하기 위해서, 10 내지 12주령 수컷 마우스의 뇌하수체 및 부신을 절단하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색한다. 간략하면, 마우스를 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 관류시킨다. 조직을 제거하고 4℃에서 밤새 고정시키고, PBS 중 30% 수크로스내에서 동결보호시킨다. 조직을 12㎛ 두께로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다. 결과는 구조 또는 세포 유형에서 어떠한 명백한 차이도 나타나지 않았다(도 1D 내지 1E).
추가로, 뇌하수체 절편을 항-ACTH 항체로 염색한다. 이전에 기술된 바와 같이[참조 문헌: 10], 뇌하수체를 절단하고, 4% PFA중에서 5분 동안 고정시키고, PBS중에서 린스하고 ACTH 항체로 염색한다. 야생형과 돌연변이체 부신피질자극세포 (corticotropes) 사이에서 어떠한 정성적인 차이도 나타나지 않는다(도 1E).
실시예 4
CRFR2 결핍 마우스에서의 코르티코스테론 및 ACTH 수준의 결정
코르티코스테론 및 ACTH 분석을 위해서, 개별적으로 우리에 넣어둔 10 내지 12주령 수컷 마우스로부터 혈장을 수득한다. 샘플을 케이지의 동요 30초 이내에 마취시키지 않은 동물의 안와후 안 채혈로 수집한다. 기초 AM 샘플을 오전 7시에 수집한다. 기초 PM 샘플은 오후 5시에 수집한다. 방사면역 분석 키트에 의해 2회 측정된 바와 같이, 코르티코스테론 분석(제조원: ICN Biomedicals, Dosta, Mesa, CA)에 혈장 5㎕를 사용하고 ACTH 분석(제조원: Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA)에 혈장 50㎕를 사용한다. 정상적인 기초 수준의 ACTH 및 코르티코스테론이 돌연변이체 및 대조군 동물에서 확인되며(도 2A 내지 2B), 이는 ACTH 수준이 뇌에서 영향을 받지 않는다는 도 1E에서의 발견과 일치한다.
실시예 5
CRFR2 결핍 마우스에서 HPA 계 반응에서의 스트레스 효과
스트레스에 대한 HPA 계 반응을 연구하기 위해서, 동물을 시간을 증가시키면서 물리적 구속-스트레스에 노출시킨다. 혈액 샘플을 50㎖ 원뿔형 튜브(바닥이 제거된 플라스틱 원뿔형 튜브) 중에서 2, 5 또는 10분 동안 구속 스트레스를 준 후 즉시 수집한다. 각각의 마우스를 단 1회 채혈한다. 혈장 샘플을 즉시 원심분리시키고 분석을 수행할 때까지 -20℃에 저장한다. 방사면역 분석 키트에 의해 2회 측정된 바와 같이, 코르티코스테론 분석(제조원: ICN Biomedicals, Dosta, Mesa, CA)에 혈장 5㎕를 사용하고 ACTH 분석(제조원: Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA)에 혈장 50㎕를 사용한다.
대조군 동물에서는 ACTH 수준이 10분의 구속 후 피크에 도달한다. 반대로, 돌연변이체 동물에서 ACTH 수준은 현저하게 상승하여 단지 2분의 구속 스트레스 후 피크에 도달한다(도 2C). 유사하게, 돌연변이체 동물에서 코르티코스테론 수준은 2분의 구속 후에 유의하게 상승하는 반면, 대조군 동물 수준은 5분의 스트레스 후에 증가한다(도 2D). 이러한 결과는 돌연변이 마우스에서 스트레스에 대한 HPA 계의 과민 반응을 입증한다.
실시예 6
CRFR2 결핍 마우스는 섭식 방해에 민감하다
CRFR2는 VMH에 풍부하며 이전 연구들은 우로코르틴의 식욕감퇴 효과를 나타내지 때문에[참조 문헌: 15], 기초 섭식 및 체중 증가를 돌연변이체 및 야생형 동배 새끼들에서 측정하였다.
기초 섭식은 개별적으로 우리에 넣어둔 12 내지 16주령 수컷 동배 새끼들에서 측정하였다. 마우스 및 이들의 펠릿형 음식물을 매일 오전 9시에 무게를 측정한다. 섭식 방해 시험을 위해서, 대조군 및 돌연변이체 동배 새끼들을 개별적으로 우리에 넣어두고 이들의 기초 음식물 섭취 및 체중을 확립한다. 마우스를 정각 12시에 시작하여 24시간 동안 절식시키지만, 물은 마음대로 마시게 한다. 섭식 방해 기간 이후, 마우스의 체중을 측정하고 예비 펠릿형 음식물을 제공한다. 이후, 펠릿형 음식물을 소등(오후 18시) 전까지 두 시간 마다 무게를 측정한다. 펠릿형 음식물 및 마우스를 다음날 아침 다시 무게를 측정한다. 섭식 방해 동안 체중 손실 뿐만 아니라 섭식 방해 24시간 후 총 음식물 소비 및 체중 증가를 기록한다. CRFR2 돌연변이체(mut) 마우스 숫컷에서 기초 섭식 및 체중 증가는 야생형(wt) 동배 새끼들의 것과 유사하다(24시간 기초 음식물 소비 wt = 4.3 ±0.24g, mut = 4.6 ±0.23; 체중 wt = 21.7 ±0.66g, mut = 21.2 ±0.50g; n = 10마리, 평균값은 ±SEM이다).
스트레스성 자극이 돌연변이체 동물의 음식물 섭취를 변화시키는지를 결정하기 위해서, 대조군 및 돌연변이 마우스를 24시간 동안 절식시킨 후, 재급식하고, 이후, 이들의 음식물 섭취 및 체중 변화를 측정한다. 섭식 방해는 섭식 방해 24시간 후 돌연변이 마우스에서 음식물 섭취의 현저한 감소를 나타낸다(도 3A). 돌연변이 마우스는 섭식 방해 24시간 후 야생형 음식물 수준의 75%를 소비시킨다. 하지만, 돌연변이체 및 야생형 체중은 섭식 방해 또는 재급식 이후에 현저하게 변화하지 않는다(도 3B).
실시예 7
고위 플러스 미로에서 CRFR2 결핍 마우스의 불안 유사 거동에 대한 평가
CRFR1 돌연변이 마우스는 불안-유사 거동[참조 문헌: 10]를 나타내기 때문에, CRFR2 돌연변이 마우스를 3개의 상이한 시험 실례를 사용한 유사한 시험에서 분석한다. 제1 시험 실례에서, 대조군 및 돌연변이 동물을 고위 플러스 미로(EPM: Elevated Plus Maze)을 사용하여 평가한다. 22 내지 24주령의 숫컷 및 암컷 마우스를 본 실험에 사용한다. 야생형 동배 새끼 마우스를 대조군로서 사용한다. 동물을 그룹별로 수용하고 규칙적인 명/암 조건(점등: 6:00 AM, 소등: 6:00 PM)하에 유지하고 시험전에 일주일동안 격일로 취급한다.
플러스 미로 장치를 검은 플렉시글라스로 제작하고 2개의 열린 팔(arm)(30 x 5cm) 및 30cm 높이의 벽을 갖는 동일한 크기의 2개의 닫힌 팔을 장착한다. 고도가 지면으로 부터 30cm이다. 팔(arm)은 중심 정방형(5 x 5cm)에 의해 연결됨에 따라서 미로는 플러스 기호로 형성된다. 장치위에 위치하는 25와트 램프는 열린 팔에서 6lux의 밝기를 제공한다. 모든 시험은 명-암 사이클중에서 명 단계동안에 수행한다. 마우스를 거동 시험전에 1시간 동안 실험실 조건에 익숙하도록 하고 피검체를 각각 5분 기간에 시험한다.
각각의 마우스를 열린 팔과 직면한 중심 플랫폼상에 위치시켜 시험을 개시한다. 점수를 매긴 거동은 열린 팔 및 닫힌 팔로의 진입 수 및 미로의 다양한 구획상에서 소비한 시간의 양이다. 필로의 진입은 팔로 4개의 모든 발의 진입으로서 정의된다.
닫힌 팔 진입은 플러스 미로에서의 이동 활성의 지수로 취한다. 장치상에 탑재된 카메라를 통해 동물의 거동을 인접한 방에 위치한 비디오 모니터상에서 관찰할 수 있다. 시험 말기에 진입 수 및 열린 팔에서의 소비된 시간을 팔 진입의 총수 및 시험 지속시간의 퍼센테이지로 나타낸다. 결과는 평균값에 대한 평균 ± 표준 오차로서 나타낸다. EPM 시험으로부터 수득한 거동 계수는 스튜던트 t 시험을 사용하여 분석한다.
결과는 숫컷 및 암컷 CRFR2 돌연변이 마우스 모두가 야생형 대조군 보다 플러스 미로 장치의 열린 팔에서 시간을 덜 소비하고 진입 횟수가 적다. 숫컷 및 암컷 마우스 모두에 대한 열린 팔로의 진입 % 모두에 현저한 효과가 관찰된다(도 4A 및 4B). 불안-유사 거동의 증가는 2개의 그룹간에 전체 암 진입에 차이가 없음으로써 이동 활성의 변화로 인한 것이 아니다(도 4C 및 도 4D). 이들 결과는 CRFR2 돌연변이 마우스가 현저하게 증가된 불안-유사 거동을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 8
명/암 박스에서 CRFR2 결핍 마우스의 불안-유사 거동에 대한 평가
CRFR2 돌연변이 및 대조군 마우스의 거동은 또한 명/암 박스에서 불안-유사 거동에 대해 평가한다. 직사각형의 플렉시글래스 박스를 2개의 구획으로 나누고한 구획(28.5 cm x 27 cm)에는 백색의 페인트를 칠하고 다른 하나의 구획(14.5cm x 27.0cm)에는 검은색의 페인트를 칠한다. 밝기는 붉은색 플렉시글래스 뚜껑으로 덮여진 검은 구획에서 8럭스이고 백색 구획에서는 400럭스이다. 구획은 구분 중심에서 바닥 지면에 위치한 개방구(7.5cm x 7.5cm)에 의해 연결된다. 모든 시험은 19:00 시간 내지 21:00 시간사이에서, 사이클의 암 단계 동안에 수행한다. 각각의 동물을 백색 면적의 중심에 위치시켜 10분동안 시험하고 2개의 구획간의 이동수 및 백색 면적에서 소비된 시간의 양을 기록한다. 장치상에 탑재된 카메라를 통해 인접한 방에서 관찰하고 기록한다.
명/암 박스에서의 결과는 대조군 마우스에서 처럼 CRFR2 돌연변이 마우스가 박스의 명부에서 많은 시간을 소비하고 박스의 명암 부간에 이동횟수가 많다는 것을 입증한다(도 4E 및 도 4F). 이러한 실험에서 2개의 그룹간에 유의적 차이가 검출되지 않는다.
실시예 9
개방 필드 시험에서 CRFR2 결핍 마우스에서의 불안-유사 거동에 대한 평가
불안-유사 거동은 또한 개방 필드 장치에서 CRFR2 돌연변이체 및 대조군 마우스에서 분석한다. 개방 필드 장치는 바닥상에 페인트된 16개의 정방형(12 x 12cm)(12개의 외부 및 4개의 내부)을 갖는 백색 플렉시글라스 박스(50 x 50 x 22cm)로 구성된다. 필드의 중앙으로 집중된 램프는 바닥상에 120럭스의 밝기를 제공한다. 일정한 배경 백색 노이즈(52dB)를 갖는 방에서 명암 사이클의 암 단계동안에 시험을 수행한다. 각각의 마우스를 장치의 중앙에 위치시켜 10분간의 시험을 개시한다. 내부 정방형에서 소비된 시간(초), 이동(정방형을 횡단하는 횟수), 배변(대소변의 수), 뒷다리로 일어서기 및 시간 소비적인 털손질(초)을 비디오 기록으로 부터 정량화한다. 또한 내부 정방형 횡단은 이동 %로서 나타낸다. 개방 필드 시험에서의 결과는 CRFR2 돌연변이 마우스가 야생형 마우스(도 4G 및 H) 보다 시간을 덜 소비하고 보다 낮은 %로 내부 정방형을 횡단한다는 것을 보여준다. 이동, 뒷발로 일어서기, 배변 또는 털손질에서 그룹간에 어떠한 차이가 없다(데이타는 없음).
실시예 10
또 다른 유전자의 발현에 대한 CRFR2 결핍의 효과
전체적인 해부학적 결함이 HPA 계의 성분에서 검출되지 않음으로써(도 1D 및 도 1E), 돌연변이 동물에서의 스트레스 및 거동 반응에서의 변화는 CRF 시그날 전달 경로에서 또 다른 성분의 유전자 발현이 변화되어 야기된 것일 수 있다. 가능성을 조사하기 위해 UCN, CRF 및 CRFR1 mRNA의 발현을 원위치 하이브리드화에 의해 조사한다.
원위치 하이브리드화는 상기된 방법[참조 문헌: 36]에 따라 수행한다. 간략하면, 조직 절편(20㎛)을 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고 PBS로 린스하고 무수 아세트산중에 침지시키고 일련의 등급화된 에탄올로 탈수시키고 클로로포름으로 탈지시키고 다시 탈수시킨다. 이어서, 슬라이드를 습한 배양 챔버내에서 50%의 탈이온화된 포름아미드 하이브리드화 혼합물중에서 밤새 55℃에서35S-표지된 리보프로브와 하이브리드화시킨다. 항온처리한 후에, 슬라이드를 실온에서 30분동안 1 x SSC로 흔들면서 세척하고 30분동안 37℃에서 20㎍/ml의 RNase(프로메가)로 처리하고 실온에서 30분동안 1 x SSC 완충액중에서 린스하고 흔들면서 0.1 x SSC로 65℃에서 20분동안 3회 세척하고 실온에서 30분동안 0.1 x SSC로 린스하고 일련의 등급화된 에탄올로 탈수시키고 통기 건조시키고 3일동안 코닥 하이퍼필름(제조원: Eastman Kodak, Rochester, NY)에 병치시킨다.
필름이 현상된후, 슬라이드를 NTB2 액체 핵 에멀젼(Eastman Kodak: 물과 1:1로 희석됨)중에 침지시키고 10일동안 노출시키고 광그래픽적으로 처리하고 헤마톡실린으로 대조 염색시키고 커버글라스로 덮는다. 슬라이드를 영상 분석 시스템 영상 프로 플러스(제조원: Media Cybernetics, Silver Springs, MD)를 사용하여 분석한다. PVN 및 cAmyg의 분석을 위해, 원형 도구(면적 = 3022 픽셀)를 사용하여 각각의 절편에 대한 평균 광학 밀도를 측정하여 각각의 동물에 대한 해부학적으로 도해 일치된 절편을 PVN 및 cAmyg의 동일 영역을 비교한다. 우로코르틴을 발현하는 EW 세포체는 표준 광학 밀도 방법을 사용하여 분석하기에는 너무 분산되어 있다. 따라서, 파라미터를 사용하여 컴퓨터가 비-포지티브 세포 및 배경 은 입자를 배제하기 위해 선결된 바와 같이 색상 및 세포 크기에 의해 최소 광학 밀도를 발현하는 지정된 EW내에서 세포수를 측정한다. 우로코르틴 mRNA에 대해 컴퓨터에 의해 포지티브인 것으로 측정된 각각의 세포에 대한 광학 밀도를 계수한다. 이어서 각각의 절편에 대한 평균 광학 밀도 및 세포수를 비교한다.
도 5A에서 설명된 바와 같이, mRNA는 발현 세포수(도 5B) 및 돌연변이 동물에서 세포당 우로코르틴 mRNA 밀도(도 5C) 모두에 대한 에딩거 웨스트팔(EW: Edinger Westphal) 핵의 문측 영역에서 상당히 증가한다. 편도선의 중심 핵(cAmyg)은 무표시 돌연변이 동물에서 CRF mRNA가 상당히 증가하였음을 나타낸다(도 5A 및 5D). PVN에서 CRF mRNA의 상당한 변화가 근본적으로 스트레스 받지 않은 동물에서 검출되지 않는다(도 5A 및 5E). 뇌 또는 뇌하수체의 전엽내 CRFR1 mRNA의 발현 패턴 또는 수준이 돌연변이체와 야생형 마우스간에 차이가 없다(데이타는 나타내지 않음). 이들 결과는 CRFR2 돌연변이 마우스에서 cAmyg 내의 CRF mRNA 및 문측 에딩거 웨스트팔 핵내의 우로코르틴 mRNA의 발현 수준이 증가되었음을 나타낸다.
실시예 11
CRFR2 돌연변이 마우스내에서 UCN에 대해 반응한 저혈압의 평가
선행 보고는 우로코르틴의 말초 주사에 대해 반응한 저혈압을 제시하였다[참조 문헌: 2]. 또한, CRFR2는 혈관 내피 세포에 위치하고[참조 문헌: 5, 8], 우로코르틴의 혈관확장 작용에 대해 반응하는 것으로 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위해, CRFR 돌연연이체 및 대조군 마우스에 우로코르틴을 주사하고, 이들의 혈압의 변화를 측정한다.
우로코르틴 및 혈관확장제인 나트륨 니트로프루시드의 정맥내 주입에 대한 심혈관 반응을 이소플루오린으로 마취된 마우스(야생형: n=5; 돌연변이체: n=3)내에서 조사한다. 혈압 기록을 위한 동맥 카테터를 연화시키고 외부 직경 약 0.4mm로 잡아당긴 멸균 PE-10 관재료로부터 제작한다. 대퇴 동맥을 노출시키고, 헤파린 염수(500U/ml)로 충전된 동맥 카케터를 삽입하고, 수술용 실과 조직용 아교(Vetbond)로 봉합한다. 카테터를 혈압 트랜스듀서(Statham)에 연결하고, 동맥압 펄스를 굴드 펜(Gould pen)-기록기 상에 표시한다. 다음, 제2 카테터를 약물의 정맥내 주입을 위해 외경 정맥에 삽입한다. 약물 주입을 삽관 과정의 완료한 뒤 30분 후에 수행한다. 정맥 카테터를 약물-충전된 주입기에 연결한다. 주입을 0.5 내지 1분 동안 완료한다. 야생형 및 돌연변이체 둘 다에게 동일한 투여량의 우로코르틴(0.9% 염수 200㎕ 중의 0.1㎍) 및 염수(대조군으로서)를 제공한다.
사용되는 투여량은 스프라그 돌리 래트에서의 상응하는 연구로부터 수득된 데이터[참조 문헌: 2]를 참조하여 예비 실험으로부터 결정한다. 돌연변이체내에서의 우로코르틴 주사에 대한 심혈관 반응의 결핍이 마우스의 혈관확장 능력 결손에 기인하지 않는다는 것을 입증하기 위해, 돌연변이 마우스에게 또한 우로코르틴 주입으로부터의 동맥압의 회복 후에 나트륨 니트로프루사이드(0.9% 염수 100㎕ 중의 0.8㎍)의 제2 주입물을 제공한다. 평균 동맥압(MAP)을 혈압 추적으로부터 측정한다.
우로코르틴(0.1㎍)의 정맥내 주입은 대조군 마우스에서 현저한 혈압강화 반응(-28.3±2.0mmHg)을 초래한다(도 6). 동맥압의 감소는 기록 기간(90-120분) 동안 지속된다. 완전히 대조적으로, 돌연변이체는 우로코르틴에 대해 측정가능한 반응을 전혀 나타내지 않는다[단지 1마리의 조사된 돌연변이 마우스만이 매우 적고일시적인 감소(-3.5mmHg)를 나타내며, 이는 주사 압력 자체에 기인할 수도 있다(도 6)]. 돌연변이체의 말초 혈관계가 또 다른 자극에 대해 반응하여 혈관확장될 수 있음을 입증하기 위해, 산화질소 공여제로서 혈관확장을 야기시키는 나트륨 니트로프루사이드(NP)을 돌연변이 마우스에게 투여한다. 신속하고 강한 혈압강하 반응은 도 6에 도시된 바와 같이(흰 막대) 나트륨 니트로프루시드 주사에 반응하여 일관되게 관찰된다(-30.0±5.0mmHg). 마취하의 기초 MAP는 당해 실험 동안 돌연변이 마우스(76mmHg)와 야생형 마우스(74mmHg) 사이에 거의 차이가 나지 않는다.
실시예 12
CRFR2는 혈관신생에 영향을 미친다
CRFR2 돌연변이 마우스로부터의 기관의 조직학적 분석으로 뇌, 뇌하수체 및 부신을 포함한 수개의 기관의 혈관신생은 CRFR 결핍 마우스에서 현저하게 증가함을 밝혀내었다(데이터는 제시하지 않음). 이는 CRFR2가 혈관신생의 직접 조절인자로서 작용할 수 있음을 나타낸다. 따라서, CRFR의 효능제 또는 길항제로서 작용하는 리간드는 질환 상태에서 혈관신생의 조작에 사용할 수 있다. 일례는 증가된 혈관신생이 암 세포의 성장에 필수적인 암이다. CRFR 2활성을 자극함으로써, 효능제를 혈관신생의 억제에 사용하여, 암 세포의 성장을 방해할 수 있다.
실시예 13
불안 및 스트레스에 대한 CRFR2 결핍 효과의 요약
여기에 제시된 결과는 CRFR2 결핍 돌연변이 마우스가 스트레스-민감성 및 불안-유사 표현형을 나타냄을 제시한다. 기초 섭식 및 체중 증가가 정상적이더라도, 돌연변이 마우스는 섭식 방해의 스트레스 후의 재급식 기간 동안에 보다 적은 음식물을 소비함으로써 섭식 방해에 대해 반응한다. 이는 신진대사의 효과일 수 있는 한편, 돌연변이체 및 대조군 동물이 실험 동안 체중 증가 또는 감소에서 차이를 전혀 나타내지 않기 때문에, 섭식 방해의 스트레스가 동물의 불안 상태를 변화시켜, 이들의 식욕을 감소시키거나 이들의 신진대사에 영향을 미칠 수 있다. 돌연변이 마우스는 또한 구속 스트레스에 대한 신속한 HPA 반응을 나타내는데, 이는 또한 이들 동물이 스트레스에 대해 보다 민감하다는 것을 제시한다. 10분 동안의 구속 이후 관찰되는 돌연변이체에서의 ACTH 수준의 감소는 시상하부에서의 보다 신속한 네가티브 글루코코르티코이드 피드백의 결과일 수 있는데, 이는 돌연변이 마우스가 대조군 마우스보다 빨리 보다 높은 스테로이드 수준을 나타내기 때문이다. 따라서, 돌연변이 마우스에서 부신의 활성화를 유도하는 제2 메카니즘의 가능성을 제외할 수 없다. 함께 고려할 경우에, 섭식 및 HPA계 결과는 CRFR2 돌연변이 마우스에서의 스트레스에 대한 과민성을 제시하지만, 다른 생리학적 설명이 변화된 섭식 반응, 또는 돌연변이 마우스의 HPA계가 스트레스에 대해 반응하는 증가된 속도와 관련될 수 있을 것이다.
또한, 돌연변이 마우스는 EPM 및 개방 필드 시험에서 증가된 불안-유사 거동을 나타낸다. 그러나, 이들 마우스는 명/암 박스내에서 불안-유사 거동의 유사한 수준을 나타낸다. 약리학적 민감성 및 특이성이 일반적으로 다수의 불안 동물 시험을 통해 입증되더라도, 작업 차이가 때때로 관찰된다[참조 문헌: 17, 18]. 명/암 실례에서의 거동은 이러한 과업이 연구[참조 문헌: 19]보다 새로움에 대한 반응(새로움에 대한 공포증)과 관련이 있는 한편, EPM에서의 거동은 혐오 환경의 연구에 의해 측정된다[참조 문헌: 19]는 점에서 차이가 있을 수 있다. 시험 동안의 밝기 조건은 또한 동물 시험에서 불안제거 또는 불안발생 효과를 검출하는 효과에 상당히 영향을 미칠 수 있다[참조 문헌: 17]. CRFR2 돌연변이 마우스에 대한 결과의 이러한 프로파일은 혐오 환경의 연구와는 관련되었으나 새로움에 대한 공포증에는 관련되지 않은 증강된 정서성을 입증한다. CRFR2 돌연변이 마우스를 이용하여 수득된 결과는 거동 시험에서의 이러한 차이가 마우스에서 검출된 불안-유사 거동에서의 차이를 설명할 수 있음을 제시한다.
실시예 14
불안에 대한 cAmyg에서의 증가된 CRF의 가능한 효과
cAmyg에서의 증가된 CRF mRNA의 효과는 돌연변이 무우스의 불안-유사 거동 및 증가된 HPA계 민감성을 설명할 수 있는데, 이는 이러한 핵이 CRFR1을 발현시키고[참조 문헌: 8], 스트레스 시그날의 전달에서 중요한 역할을 하기[참조 문헌: 20] 때문이다. 또한, 풍부한 CRFR을 함유하는 중격이 편도선의 활성을 조절하는 것으로 제시되어 있고, 이러한 핵의 병소가 구속 스트레스 이후에 감소된 ACTH 분비를 초래한다[참조 문헌; 24-27]. 편도선의 병소가 CRF-유도된 불안[참조 문헌: 20], 중격 병소로부터 생성된 과정서성[참조 문헌: 21]을 차단하는 것으로 제시되어 있다. 이러한 신경 경로는 CRFR1 결핍 마우스에서 보여지는 감소된 불안-유사 거동(10)뿐만 아니라, CRFR2 결핍 마우스에서의 증가된 불안-유사 거동을 설명할 수 있다. 따라서, CRFR2 돌연변이 마우스는 불안-유사 거동에서의 수용체 조절의 신규한 메카니즘에 대한 가능한 증거를 제공한다. 스트레스 동안 측면 중격에서의 CRFR2는 편도선의 활성을 조절하고, CRFR2의 부재하에 비차단된 편도선 활성은 증가된 불안-유사 거동을 초래할 것이다.
측면 중격에서의 CRFR2는 또한 스트레스에의 HPA 반응에 대한 PVN 작용의 억제제로서 작용할 수 있다. 돌연변이 마우스는 측면 중격에서 CRFR2가 결핍되어 있기 때문에, PVN의 스트레스-유발된 활성화가 보다 신속하게 발생할 것이다. 또한, CRFR2는 스트레스 받지 않은 동물의 PVN내에서 발현된 우세한 CRF 수용체인 반면, CRFR1은 스트레스 조건하에서만 PVB에서 발견된다[참조 문헌: 28, 29]. 따라서, 스트레스 동안의 CRFR2의 부재하에 PVN 활성에 대한 국부적 효과는 변화할 수 있다.
실시예 15
문측 EW에서의 증가된 UCN mRNA에 의해 유발된 불안에 대한 가능한 메카니즘
문측 EW에서의 증가된 우로코르틴 mRNA는 돌연변이 마우스에서의 증가된 불안-유사 거동을 유도하는 메카니즘일 수 있는데, 이는 우로코르틴이 정맥내로 주사될 경우에 불안-유사 거동을 유도하는 것으로 제시되어 있기 때문이다[참조 문헌: 30]. 증가된 불안-유사 거동에 대한 추가의 설명, 예를 들어, 자율 신경계의 증가된 민감성[참조 문헌: 31-33]은 여전히 배제할 수 없다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 선행 연구는 불안 및 거동에서의 CRFR2의 역할과 관련된 결과와 상반되는 것으로 밝혀졌더라도, 이러한 보고는 CRFR1 안티센스 올리고뉴클레오티드의 주사에 의한 불안제거-유사 효과를 제시하지 않았다[참조 문헌: 34, 35].
실시예 16
CRFR2 무표시 마우스 및 자율 신경계의 민감성
불안-유사 거동의 증가, 예를 들어, 자율 신경계의 민감성 증대[참조문헌: 31 내지 33]에 대한 추가의 설명을 여전히 배제할 수 없다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 이전의 연구는 불안 및 거동에서의 CRFR2의 역활에 대한 모순된 결과를 밝혀냈다[참조문헌: 34, 35]. 비록 이러한 보고가 CRFR1 안티센스 올리고뉴클레오티드 주사에 의한 불안제거 효과를 나타내지만, 어떠한 연구도 CRFR2 안티센스 올리고뉴클레오티드 주사에 대하여 일관된 결과를 보고하지 않았다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 주사 기술이 잠재적 가능성을 제공하는 반면, 단백질 수준의 감소는 녹아웃 동물에서 달성되는 바와 같은 표적의 완전한 제거를 대신할 수 없기 때문에 아직 조사중이다.
실시예 17
혈관확장에 미치는 UCN의 효과
무표시 돌연변이 마우스에서 CRFR2의 부재는 혈관확장에 미치는 우로코르틴의 효과를 입증한다. 돌연변이 마우스는 정맥내 우로코르틴에 반응하지 않은 반면, 야생형 동물은 평균 세동맥 혈압이 급격하게 감소되는 것으로 나타난다. 니트로프루시드의 주사는 돌연변이체에서 혈관확장을 야기함으로써, 우로코르틴에 대한 반응 결여가 돌연변이체 혈관계의 물리적 확장 불능에 기인하는 것이 아니라, 특히 CRFR2의 부재에 기인한다는 것을 입증한다. 이러한 결과는, CRFR2 돌연변이 마우스가 우로코르틴에 대해 반응성을 나타내지 않기 때문에, 저혈압에 미치는 우로코르틴의 효과[참조문헌:2, 16]가 혈관 내피 세포의 CRFR2에서의 작용을 통하여 발생한다는 가설[참조문헌: 5, 8]을 뒷받침한다. 비록 UCN-유도된 혈관확장이 발생할 가능성이 매우 큰 생리학적 자극은 현재 공지되어있지 않지만, 혈관계의 CRFR2에 미치는 우로코르틴의 효과는 저혈압에 대한 약물 개발에 있어 주요 목표가 될 수 있다.
요약
요약하면, 상기 결과는 CRFR2가 결핍된 마우스가 불안 -유사 거동의 증가 및 스트레스에 반응하는 과민성 HPA계를 나타낸다는 것을 입증한다. CRFR1 및 CRFR2 돌연변이 마우스는 불안 및 우울증의 유용한 모델을 제공하며 추가로 이들 질병의 근간이 되는 분자 메카니즘을 명확히 하는데 도움을 준다. CRF 신호전달 경로 및 불안 및 우울증의 조절에서의 이의 역활에 관한 연구는 이들 질병의 효과적 치료에 필수적인 결정적 단서를 제공할 수 있다.
하기 문헌은 본원에서 참조로 인용된다:
본원에서 언급하는 모든 특허 또는 문헌은 본 발명에 관련되는 당해 분야의 숙련가의 수준을 나타낸다. 상기 특허 및 문헌은 각각의 개별적인 문헌이 구체적이며 개별적으로 본원에서 참조로 인용되는 것으로 나타난 바와 동일한 범주로 본원에서 참조로 인용된다.
당해 분야의 숙련가는 본 발명이 본 목적을 달성하고 언급한 목적 및 잇점뿐 아니라 본원 고유의 목적을 수득하는데 적합하다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 본원에서 기술하는 방법, 과정, 치료, 분자 및 특정 화합물에 따르는 본 실시예는 바람직한 양태를 대표하며 예시적이고 본 발명의 범주를 제한하지 않고자 한다. 당해 분야의 숙련가는 청구의 범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지내에 포함되는 한 변화시킬 수 있고 다르게 사용할 수 있다.
Claims (19)
- 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2(CRFR2)의 하나 이상의 대립유전자가 파괴되어, 당해 대립유전자로부터 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2 단백질을 발현하지 못하는 비-천연 유전자전이된 마우스.
- 제1항에 있어서, 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 2 대립유전자의 엑손 10, 11 및 12의 DNA 서열이 결실된 유전자전이된 마우스.
- 제2항에 있어서, DNA 서열이 네오마이신 내성 유전자 카세트로 치환된 유전자전이된 마우스.
- 제3항에 있어서, 치환에 대하여 이형접합성인 유전자전이된 마우스.
- 제3항에 있어서, 치환에 대하여 동형접합성인 유전자전이된 마우스.
- 제3항에 따르는 마우스와 다른 종의 마우스 사이의 교배 자손.
- (a) 화합물을 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스에게 투여하는 단계,(b) 당해 마우스를 불안-관련 거동에 대하여 시험하는 단계 및(c) 당해 마우스의 불안-유사 거동과 화합물을 투여하지 않은 제5항에 따르는 제2 유전자전이된 마우스의 불안-유사 거동을 비교하는 단계를 포함하여, 불안 조절 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법.
- 제7항에 있어서, 마우스를 고위 미로, 명/암 박스 및 개방 필드 시험으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시험 패러다임을 사용하여 불안에 대하여 시험하는 방법.
- (a) 화합물을 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계,(b) 당해 마우스를 우울증-유사 거동에 대하여 시험하는 단계 및(c) 당해 마우스의 우울증-유사 거동과 화합물을 투여하지 않은 제5항에 따르는 제2 유전자전이된 마우스의 우울증-유사 거동을 비교하는 단계를 포함하여, 우울증 조절 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법.
- (a) 화합물을 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계,(b) 당해 유전자전이된 마우스를 혈압 변화에 대하여 시험하는 단계 및(c) 당해 유전자전이된 마우스의 혈압 변화를, 상기 화합물을 투여하지 않은 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스 및 상기 화합물이 또한 투여된 야생형 마우스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 마우스의 혈압 변화와 비교하는 단계를 포함하여, 혈압을 조절하는 화합물을 스크리닝하는 방법.
- (a) 화합물을 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계,(b) 당해 유전자전이된 마우스를 혈관생성의 변화에 대하여 검정하는 단계 및(c) 당해 유전자전이된 마우스의 혈관생성의 변화를, 상기 화합물을 투여하지 않은 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스 및 상기 화합물을 투여한 야생형 마우스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마우스에서의 혈관생성의 변화와 비교하는 단계를 포함하여, 혈관생성에 영향을 주는 화합물을 스크리닝하는 방법.
- (a) 화합물을 제5항에 따르는 유전자전이된 마우스에 투여하는 단계,(b) 당해 마우스를 스트레스-유발 상황에 두는 단계,(c) 당해 마우스에서 코르티코스테론 및 부신피질자극 호르몬의 혈장치를 모니터링하는 단계, 및(d) 상기 혈장치를 스트레스-유발 상황에 두지 않은 제5항의 유전자전이된 마우스의 혈장치와 비교하는 단계를 포함하여, 스트레스에 대한 시상하부뇌하수체부신계의 반응에 영향을 주는 화합물을 스크리닝하는 방법.
- 제12항에 있어서, 스트레스-유발 상황이 신체적 구속 스트레스인 방법.
- (a) 제2 단백질에 영향을 주는 효능제를 제5항에 따르는 마우스에 투여하는단계,(b) 단백질 발현의 검정 및 단백질 활성의 검정으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제2 단백질의 검정을 수행하는 단계 및(c) 유전자전이된 마우스에 대한 검정 결과를 동일한 효능제를 투여한 야생형 마우스로부터 수득한 검정결과와 비교하는 단계를 포함하여, CRFR2가 제2 단백질에 미치는 효과를 측정하는 방법.
- 제14항에 있어서, 제2 단백질이 코르티코트로핀 분비 인자, 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 1, 우로코르틴, 코르티코트로핀 수용체 및 우로코르틴 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제5항에 있어서, CRFR2의 존재에 의해 방해되지 않는, 코르티코트로핀 분비 인자 수용체 1 반응의 연구용으로 사용되는 유전자전이된 마우스.
- 조직 또는 개체에 CRFR2 억제제를 투여하는 단계를 포함하여, 표적 조직 또는 개체의 혈관신생을 증가시키는 방법.
- CRFR2 활성을 자극하는 효능제를 투여하는 단계를 포함하여, 표적 조직 또는 개체의 혈관신생을 억제하는 방법.
- 제18항에 있어서, 암을 치료하는데 사용되는 방법.
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