CN1188031C - 促肾上腺皮质素释放因子受体－2缺陷型小鼠及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了促肾上腺皮质素释放因子受体2缺陷的转基因小鼠。CRFR2突变小鼠对应激有超敏性，并表现出焦虑样行为增加。突变小鼠具有正常的基础摄食和体重增加，但在停止给予食物后表现出摄食减少。静脉内给予UCN对该突变小鼠没有作用，但能降低正常动物的动脉压。CRFR2的缺陷导致动眼神经副核的嘴侧中的尿皮质素mRNA显著增加，扁桃体中央核中的CRF mRNA显著增加。这些结果证明与CRFR1突变小鼠相反，CRFR2突变小鼠对应激的敏感性增加并表现出焦虑样行为。

Description

促肾上腺皮质素释放因子受体-2缺陷型小鼠及其用途
发明背景
联邦资助说明
本发明的完成部分使用了联邦政府的拨款No.NIH DK-26741和NRSA资金DK09841及DK09551。因此联邦政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明主要涉及神经生物学、内分泌学和精神病学领域。更具体地，本发明涉及对焦虑和促肾上腺皮质素释放因子受体-2缺陷型小鼠的研究。
相关领域描述
促肾上腺皮质素释放因子(CRF)是下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的关键性的协调剂。在对应力的应答中，下丘脑室旁核(PVN)释放的促肾上腺皮质素释放因子激活垂体前叶的促皮质激素细胞上的促肾上腺皮质素释放因子受体，导致将促肾上腺皮质素(ACTH)释放到血流中。AVTH进而激活肾上腺皮质中的ACTH受体而增加糖皮质激素的合成和释放(1)。
CRFR1和CRFR2(CRF的受体)遍布于CNS及外周组织。虽然CRF对CRFR1的亲和力比对CRFR2的亲和力高，但认为尿皮质素(urocortin)(一种UCN)(CRF相关肽)是CRFR2的内源性配体，因为它比CRF的亲和力几乎高40倍(2)。CRFR1和CRFR2有约71％氨基酸序列类似，且它们在脑和外周组织中定位不同(3-6)。CRFR1主要在垂体、皮质、小脑、菱脑和嗅球中表达，而CRFR2见于中隔旁侧、下丘脑室内侧(VMH)、脉络丛和许多外周部位(5，7，8)。CRFR2有一些同种型，其中有一种显示不结合任何已知配体(9)。
CRFR1缺陷型小鼠具有降低的HPA轴激素水平、对损伤的应激反应和降低的焦虑样表现(10，11)。这些结果与体内用CRFR1特异性拮抗剂得到的那些结果相一致(12-14)。相反，CRFR2特异性拮抗剂最近还没有获得，因为从其1995年克隆以来，对CRFR2的生理功能几乎没有多少阐明。UCN可能是CRFR2的内源性配体，并显示出当中枢进食时是给药的调节剂(15)。因为CRFR2位于下丘脑室内侧(摄食调节和腹饱满的中心位置)，尿皮质素对这些受体的作用可能影响摄食。另外，外周给予尿皮质素会导致低血压(2，16)，这可能是由于CRFR2在血管系统中的作用引起的(5，8)。
现有技术的不足是缺少促肾上腺皮质素释放因子受体-2缺陷型小鼠。本发明满足了本领域中这一长期存在的需要和愿望。
发明概述
为了剖析CRFR2的发育和生理作用，本发明制备了CRFR2突变裸鼠并对其进行分析。CRFR2缺陷型小鼠表现出增加的焦虑样行为和对应激反应的超敏性HPA轴。CRFR1和CRFR2突变小鼠了提供焦虑和抑郁的有价值的模型，并能进一步帮助说明这些疾病的分子机理。对促肾上腺皮质素释放因子信号途径及其在焦虑和抑郁控制中的作用的研究，可能为有效治疗这些疾病提供必需的线索。
因此，本发明涉及在至少一个促肾上腺皮质素释放因子受体2(CRFR2)的等位基因被破坏的一种非天然性转基因小鼠，所述的小鼠不能从所述的等位基因表达促肾上腺皮质素释放因子受体2蛋白质。较佳地，所述的促肾上腺皮质素释放因子受体2等位基因的外显子10、11和12的DNA序列已缺失。可用新霉素抗性基因盒置换转基因小鼠的这些DNA序列。这种转基因小鼠对此种置换可以是杂合性或纯合性小鼠。在本发明的实施例中还包括本发明小鼠与另一品系小鼠之间交配的后代。
本发明的另一实施例是将CRFR2缺陷型小鼠运用于研究焦虑或抑郁并测试某化合物对焦虑和抑郁的作用。例如，提供一种筛选具有焦虑调节活性的化合物的方法，所述的方法包括：a)将所述的化合物给予本发明的转基因小鼠；b)测试所述小鼠的焦虑相关行为；和c)比较所述小鼠与本发明另一种转基因小鼠(未给予所述的化合物)的焦虑样行为。另外，还提供了一种筛选具有抑郁调节活性的化合物的方法，所述的方法包括如下步骤：a)将所述的化合物给予本发明的转基因小鼠；b)测试小鼠的抑郁相关行为；和c)比较所述小鼠与本发明的另一种转基因小鼠(未给予所述化合物)的抑郁样行为。
本发明的另一实施例中包括以类似的流程用CRFR2缺陷型小鼠筛选能影响血压或血管生成的化合物。
本发明的另一实施例是将CRFR2缺陷型小鼠运用于对PHA轴的生理学研究，如一种筛选对下丘脑—垂体—肾上腺轴应激反应有影响的化合物的方法，其包括如下步骤：a)将所述的化合物给予本发明的转基因小鼠；b)将所述的小鼠置于诱导应激的条件中；c)监测所述小鼠的皮质酮和促肾上腺皮质激素的血浆水平；和d)将所述的水平与未被置于所述诱导应激条件中的本发明的转基因小鼠的相比较。
在本发明的另一实施例中，通过监测促肾上腺皮质素和ACTH的血浆水平，可用此小鼠来研究某化合物对HPA轴对应激反应的影响。
本发明的另一实施例涉及用本发明的小鼠来研究促肾上腺皮质素释放因子受体2对其它蛋白质如促肾上腺皮质素释放因子和尿皮质素的影响。
在本发明的另一实施例中，用CRFR2缺陷型小鼠来检验CRFR1的反应不受存在CRFR2的妨碍。
本发明的另一实施例是对CRFR2刺激或抑制血管生成活性的调控。
附图简述
通过参见本申请中包括的附图的某些实施例可以更详细地了解本发明上述的特征，优点和目的也会更清楚。这些图是说明书的一个组成部分。需要指出的是，附图是用来说明本发明的优选实施例的，不能视为对本发明范围的限制。
图1A-1E显示了产生CRFR2-缺陷型小鼠、对突变小鼠及其中影响检测所用的流程。图1A是CRFR2基因的基因组结构图示，显示编码第5跨膜区域到第7跨膜区域末端的一半的外显子10、11和12的缺失。还显示了用于同源重组的靶构建物。在图1B中，通过Southern印迹分析分离自野生型(+/+)、杂合型(+/-)和裸突变(-/-)小鼠分离的尾部DNA，检测到被破坏的等位基因。图1C显示了在CRFR2对照(上部)和突变(下部)小鼠中，125I-蛙皮降压肽结合的放射自显影的结果。注意，在CRFR2突变小鼠中隔旁侧中没有CRFR2结合，而CRFR1皮质结合与对照小鼠的类似。图1D显示了用苏木精和曙红(H&E)染色的肾上腺。注意10X放大倍数显示的肾上腺尺寸(上图)或20X放大倍数显示的结构(下图)没有差异，C，皮质；M，髓质；ZG，球状带；ZF，束状带；ZR，网状带；n＝8。图1E显示垂体的H&E染色，是固定在肝上进行组织切片(上图)(4X放大倍数)，n＝8。10X放大倍数，用抗-ACTH抗体(20)(下图)鉴定垂体促皮质激素细胞，n＝5，P，后叶，I，中叶；A，前叶。垂体或促皮质激素细胞定位或ACTH的表达水平没有观察到解剖学差异。
图2A-2D显示了突变动物中HPA轴对应激的超敏性。*＝相同时间点与野生型对照有显著性差异，p＜0.01(Scheffe-后hoc检验)。用未麻醉的眼眶后眼睛放血得到血浆。图2A显示了在7:00AM受应激前ACTH的血浆水平，n＝16。图2B显示了7:00AM和5:00PM时的皮质酮血浆基础水平，n＝7。图2C显示了约束应激对ACTH作用的时间过程。图2D显示了突变裸鼠在7:00AM时的皮质酮血浆水平与相同时间点的野生型对照存在显著性差异，n＝7。
图3A-3B显示了停止野生型和突变型同窝鼠仔摄食24小时的影响。图3A显示，用Scheffe后-hoc检验，与野生型一窝鼠仔相比，基础摄食和停止摄食24小时后突变型小鼠的食物消耗情况(n＝10)，p＜0.001。图3B显示了野生型和突变型小鼠的重量，基础(白色柱)重量和停止摄食后再喂食24小时后的重量(黑色柱)。注意组间基础体重或再喂食后体重间没有显著性差异。
图4A-4H显示在上升的加号迷宫(elevated plus maze)和敞开测试中突变型动物的焦虑样行为增加。图4A显示雄性小鼠花费在敞开臂的时间百分比(**，p＜0.005)和访问这些敞开臂的次数(*，p＜0.02)突变小鼠的比野生型对照明显少(对照n＝7，突变＝7，平均值±SEM)。图4B显示用雌性小鼠进行的与图4A相同的测试。花费在敞开臂的时间百分比(**，p＜0.03)和访问这些敞开臂的次数(*，p＜0.03)突变小鼠的比野生型对照明显少(对照n＝9，突变＝12，平均值±SEM)。图4C和4D显示对照和突变动物之间的运动能力没有差异(图4C，雄性小鼠；图4D，雌性小鼠)，通过总的封闭臂的进入数和总的臂进入数测定。图4E显示在明/暗盒实验中对于花费在盒明亮部分的时间所测定的焦虑样行为没有发现差异。图4F显示在明/暗实验中，对于明亮和黑暗部分变迁的次数所测定的焦虑样行为没有发现差异。图4G显示花费在敞开区域装置的内部区域的时间(*，p＜0.05)。图4H显示在内部区域发生的总交叉的存在情况(**，p＜0.01；对照，n＝5；突变，n＝7；平均值±SEM)。
图5A-5E显示突变鼠脑中尿皮质素和CRF mRNA水平增加。图5B到5E中，所有数据都是经Fischer的PLSD后-hoc检验的突变和野生型小鼠(n＝3)的平均值±SEM，*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.005。图5A显示20X放大倍数，嘴侧EW(上图)中尿皮质素mRNA，cAmyg(中图)中CRF mRNA和下丘脑旁核(下图)原位杂交(10X放大倍数)得到的银颗粒。图5B显示对银颗粒的半定量分析，用以确定嘴侧EW中表达尿皮质素mRNA的细胞数量。图5C显示每个细胞的尿皮质素mRNA的平均光学密度。图5D显示了cAmyg中CRF mRNA的光学密度。图5E显示下丘脑旁核中CRF mRNA的光学密度。
图6显示了野生型(n＝5)和突变型小鼠(n＝3)(黑色柱)对静脉内灌注1.0μg尿皮质素的心血管反应。发现突变小鼠对尿皮质素的注射明显没有反应。***p＜0.005。在从UCN灌注的动脉压恢复后，CRFR2突变小鼠还接收第二次灌注硝普钠(在100μl 0.9％盐水中含0.8μg)(白色柱)。由血压图确定平均动脉压(MAP)。
发明详述
根据本发明，可在本领域技能中采用常规分子生物学，微生物学，和DNA重组技术。这些技术在文献中有充分阐述，参见如，Maniatis，Fritsch & Sambrook，″分子克隆：实验室手册(1982)；″DNA Cloning：A Practical Approach，″卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；″寡核苷酸的合成″(M.J.Gait编辑，1984)；″核酸的杂交″[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；″转录和翻译″[B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，(1984)]；″动物细胞培养″[R.I.Freshney编辑(1986)]；″固定细胞和酶″[IRLPress，(1986)]；B.Perbal，″分子克隆的实用指南″(1984)。
由此，如果在本文出现，下列术语的具有如下定义。
本文所用的术语“cDNA”指基因mRNA转录的DNA拷贝。
本文所用的术语“筛选某文库”指用有标记的探针在适当的条件下来检验特定的DNA文库中是否存在与该探针互补的序列的过程。另外，“筛选某文库”也可用PCR进行。
本文所用的术语“PCR”指Mullis的美国专利No.4,683,195和4,683,202中以及本领域已知的其它改进中的聚合酶链式反应。
本文所述的氨基酸指“L”异构形式。但只要该多肽能维持免疫球蛋白-结合所需的功能特性时，“D”异构形式的残基可替代任何L-氨基酸残基。NH2指多肽氨基端存在的氨基。COOH指存在于羧基端的游离羧基。为了保证标准多肽名称，J Biol.Chem，243：3552-59(1969)，氨基酸残基的缩写是本领域已知的。
需要指出本文所有氨基酸残基序列都是以左端向右端取向为氨基-端到羧基-端的常规方向所表示的公式。另外，要指出的是在氨基酸残基序列起头或末端的破折号表示结合于另一个或多个氨基酸残基序列的肽。
“复制子”是一种基因元件(如质粒、染色体、病毒)在体内起到DNA复制的自主单位作用；即能在其自身的控制下复制。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体和粘粒，另一条DNA节段可与其结合，从而引起该结合节段的复制。
“DNA分子”指聚合形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)，无论是单链形式还是双链螺旋形式。这一术语只指分子的一级和二级结构，并不将它限制于任何特定的三级形式。所以，此术语本身包括在线性DNA分子(如限制片段)，病毒，质粒和染色体中发现的双链DNA。在论述时，结构按常规仅给出DNA非转录链的5’到3′方向的序列(即，具有与mRNA同源序列的链)。
“复制起点”指的是参与DNA合成的DNA序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，当其置于合适的调控序列的控制下时，在体内被转录并翻译成多肽。5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定了编码序列的边界。编码序列可包括，但不限于：原核序列、来自真核生物mRNA的eDNA、真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′端。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸信号、终止子等，提供了编码序列在宿主细胞中的表达。
“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶，并引发下游(3′方向)编码序列转录的DNA调控区。为了本发明的定义，启动子序列的边界在其3′端为转录起始位点，并向上游(5′方向)延伸包括引发超过背景的可检测水平的转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列中，可找到一转录起始位点，和蛋白结合域(共有序列)，负责结合RNA聚合酶。真核启动子常常，但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子含有Shine-Dalgarno序列和-10和-35共有序列。
“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。当编码序列在细胞中的转录和翻译控制序列的“控制下”，RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后翻译成该编码序列所编码的蛋白质。
“信号序列”可包括在编码序列附近。该序列编码信号肽，该多肽的N-末端，与宿主细胞联系，指引该多肽到细胞表面或将该多肽分泌到培养基中，而且在蛋白离开细胞前，宿主细胞将此信号肽切下。可发现信号序列与各种原核和真核生物天然的蛋白相连接。
本文所用的术语“寡核苷酸”指本发明的探针，定义为含有两和多个，优选三个以上脱氧核糖核苷酸的分子。它的确切大小取决于许多因素，这些因素进而又取决于该寡核苷酸的最终功能和用途。
本文所用的术语“引物”指一条寡核苷酸，不论是天然的纯化的限制性消化物，或是合成产生的，当将其置于引物延伸产物合成的条件下，能作为合成起始点。在存在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶和合适温度和pH下，合成的引物延伸产物与一核酸链互补。引物可以是单链或双链，而且必须足够长，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，对于诊断用途，由靶序列的复杂程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多的核苷酸，虽然它可含有较少的核苷酸。
本文选择的引物与具体靶DNA序列的不同链“基本上”互补。这意味着引物必须是充分互补，以与它们各自链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可将非互补的核苷酸片段与引物的5′末端结合，而引物剩余的序列和该链互补。另外，可将非互补碱基或较长的序列分散在引物中，只要引物序列与该序列充分互补或与其杂交，从而形成延伸产物合成的模板。
本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指能在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的酶。
用外源或异源DNA“转化”细胞，当这样的DNA被引入细胞时。转化的DNA可以或可以不整合(共价连接)入细胞基因组。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化的DNA可维持在附加型元件，如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是一种其中转化DNA整合在染色体内，从而通过染色体复制被子代细胞继承的细胞。这种稳定性可由真核细胞建立一群含有该转化DNA的子代细胞的细胞系或克隆的能力所证实。“克隆”是由一个细胞或一个祖先通过有丝分裂产生的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的一原代细胞的克隆。
通常，含有启动子序列的表达载体是与宿主配合使用的，其中启动子序列能促进插入的DNA片段有效转录。表达载体典型的包含复制起点，启动子，终止子，以及那些能在转化细胞中提供表型选择的特定基因。被转化的宿主可以按本领域已知的方法发酵和培养，以达到最佳细胞生长。
可用本领域技术人员熟知的方法构建含有合适转录和翻译控制信号的表达载体。参见如，Sambrook等人，1989，分子克隆：实验手册(第二版)Cold Spring，Harbor Press，N.Y.所述的技术。如果转录控制序列有效地控制了某基因的转录，该基因及其转录控制序列就定义为已被“可操纵性连接”。本发明的载体包括但不限于，质粒载体和病毒载体。
本发明涉及制备CRFR2缺陷型小鼠，用它来研究CRFR2在焦虑和HPA轴环路中的发育和生理作用。这通过删除促肾上腺皮质素释放因子受体2的外显子10、11和12进行。在本发明中，用新霉素抗性基因盒替代这些序列。这些小鼠可以是CRFR2缺陷的杂合或纯合性小鼠或者是与另一品系小鼠杂交的。
本发明还涉及将CRFR2缺陷型小鼠运用于焦虑或抑郁的研究中，包括测试化合物对焦虑和抑郁调节作用的方法。也可用CRFR2来筛选能影响血压和血管生成的化合物。
本发明还涉及将CRFR2缺陷型小鼠运用于对下丘脑-垂体-肾上腺(PHA)轴的生理学研究。可用此小鼠来测试某化合物对HPA轴对应激反应的作用。
本发明还涉及用该转基因小鼠来研究促肾上腺皮质素释放因子受体2对促肾上腺皮质素释放因子、促肾上腺皮质素释放因子受体1、尿皮质素和其它CRF和尿皮质素受体的分子功能。
另外，还可用本发明来研究CRFR1在CRFR2阴性条件下的反应和活性。以这种方法，可在不受CRFR调节的阻碍下研究CRFR1应答。
本发明还涉及用CRFR2活性的促效剂或拮抗剂来刺激或抑制血管生成。能刺激CRFR2活性的促效剂在癌症治疗中可用于抑制血管的生成。
以下的实施例的给出是为了说明本发明的各种具体实施方案，并不意味着以任何方式限定本发明。
实施例1
CRFR2缺陷型小鼠的产生
为了构建CRFR2突变裸鼠，从小鼠品系129的基因组DNA文库分离得到含有CRFR2基因座的基因组克隆DNA。由此克隆构建了寻靶载体，将其中编码起始于第5跨膜区域到第七跨膜区域末端的CRFR2基因的外显子10、11和12用新霉素抗性基因盒置换(图1A)。用NotI将得到的质粒DNA线性化，并电穿孔进入J1胚胎干细胞(ES)中，方法如(10)所述。在0.2mg/ml G418(活性形式)中筛选7-9天后，分别选出新霉素抗性的克隆，并用Southern印迹分析筛选存在CRFR2等位基因被破坏的那些克隆。
将阳性ES克隆注射入C57BL/6胚泡产生嵌合小鼠。将嵌合性雄鼠与嵌合性雌鼠杂交，生成C57BL/6-129混合背景小鼠。用Southern分析自F1幼鼠(表现出雌鼠毛色)收集的尾DNA来检测遭破坏的等位基因的种系的传代(图1B)。
实施例2
分析CRFR1和CRFR2在CRFR2缺陷型小鼠中的表达
为了确定靶缺失是否导致CRFR2基因的裸突变，对野生型对照和突变型动物的脑切片进行了受体放射自显影。
在室温中解冻含有20μm切片的脑组织玻片，并室温用50mM Tris缓冲液(pH7.4)洗涤2次10分钟。然后在含有50mM Tris(pH 7.4)、125I-蛙皮降压肽、10mM MgCl2、0.1％BSA、和0.05％杆菌肽素的缓冲液中室温培养60分钟。蛙皮降压肽是一种CRF相关肽，并是CRF受体的促效剂。在与125I-蛙皮降压肽和1μm冷蛙皮降压肽接触的相邻切片中探测到非特异性结合。培养后，用加有0.01％Triton X-100的50mM Tris缓冲液，4℃洗涤这些玻片2次，各5分钟。将这些玻片迅速浸泡在去离子水中、干燥并放置成膜3天。
在突变小鼠中，没有检测到脑区域与CRFR2的特异性结合，而在皮质中保持了与CRFR1的结合。这些结果表明CRFR2基因的破坏导致这些小鼠的裸突变。繁殖这些突变型小鼠，并以Mendelian方式使突变等位基因传代。
实施例3
对CRFR2缺陷型小鼠的组织学分析
为了确定CRFR2缺陷型小鼠是否有HPA轴的发育不全，将10-12周龄雄鼠的垂体和肾上腺切片，并用苏木精和曙红(H&E)染色。简单地说，用4％多聚甲醛(PFA)灌注小鼠。取出组织，4℃后固定过夜，并在30％蔗糖的PBS溶液中冷冻。将组织切片成12μm的厚度，并用苏木精和曙红染色。结果显示结构或细胞类型没有明显差异(图1D-1E)。
另外，用抗ACTH抗体染色垂体切成片。将垂体切片，在4％PFA中后固定5分钟，用PBS漂洗，并如(10)所述用ACTH抗体染色。在野生型和突变型促皮质激素细胞之间没有观察到质的差异(图1E)。
实施例4
测定CRFR2缺陷型小鼠的皮质酮和ACTH水平
为了进行皮质酮和ACTH分析，从单独关养的10-12周龄的雄性小鼠采集血浆。收集非麻醉动物眼眶后眼血得到样品，在笼中干扰30秒。在7:00AM收集基础AM样品。皮质酮试验(ICN Biomedicals，Dosta Mesa，CA)使用5μl血浆，ACTH试验(Nichols Institute Diagnostics，San Juan Carpistrano，CA)使用50μl血浆(用放射免疫试验试剂盒作一式两份测定)。找到了突变和对照动物的ACTH和皮质酮的正常基础水平(图2A-2B)，这与图1E(脑中ACTH的水平未受影响)相一致。
实施例5
CRFR2缺陷型小鼠中对HPA轴应激反应的影响
为了检验HPA轴对应激的反应，使动物经受生理性约束-应激一段加长的时间。动物在50ml锥形试管(带可除去底部的塑料锥形管)中经受约束应激2、5或10分钟后立即采集血样。每只小鼠只放血一次。立即离心血浆样品，并存储在-20℃直到进行试验。皮质酮试验(ICN Biomedicals，Dosta Mesa，CA)使用5μl血浆，ACTH试验(Nichols Institute Diagnostics，San Juan Carpistrano，CA)使用50μl血浆(用放射免疫试验试剂盒作一式两份测定)。
在约束后10分钟对照动物的ACTH水平达到顶峰。相反，突变动物的ACTH水平显著升高，仅在约束应力作用后2分钟就达到高峰(图2C)。类似地，在约束后2分钟突变动物的皮质酮水平也明显升高，而对照动物的水平在约束后5分钟才增加(图2D)。这些结果表明突变小鼠HPA轴对应激有超敏反应性。
实施例6
CRFR2缺陷型小鼠对食物缺乏敏感
由于CRFR2在VMH中很丰富，而且已有的研究表明尿皮质素有降低食欲作用，故测定了突变和野生型幼鼠的基础摄食和体重增加。
测定单独关养的12-16周龄雄性幼鼠的基础摄食。每天在09:00称重小鼠和它们的食物颗粒。在食物缺乏的实验中，将对照和匹配的突变型同窝仔鼠各自关养，并确定它们的基础摄食和体重。在12:00开始不给小鼠食物24小时，但任意给水。在停止给食后，称重小鼠，并给予预称重的饲料颗粒。然后每2个小时称重饲料颗粒直到关灯(18:00)。在第二天上午对饲料颗粒和小鼠再次称重。记录停止给予饲料过程中体重的减轻、以及在停止给饲料后的24小时食物的总消耗和体重的增加。CRFR2突变(mut)雄性小鼠与野生型(wt)对应同窝仔鼠的基础摄食和体重增加相类似(24小时基础食物消耗wt＝4.3±0.24g，mut＝4.6±0.23g；体重wt＝21.7±0.66g，mut＝21.2±0.50g；n＝10，平均值±SEM)。
为了确定应力刺激是否改变突变动物的摄食，停止给予对照和突变小鼠食物24小时，然后再喂食，测定它们的摄食和体重变化。停给饲料的结果显示在停给饲料后24小时突变小鼠的摄食显著减少(图3A)。在停给饲料后24的小时突变小鼠消耗的饲料水平是野生型小鼠的75％。但突变型和野生型小鼠的体重在停给饲料或再喂食后都没有显著的差异(图3B)。
实施例7
评估CRFR2缺陷型小鼠在上升的加号迷宫中的焦虑样行为
由于CRFR1突变小鼠表现出抗焦虑样行为(10)，用三种不同的测试示例以类似试验分析了CRFR2突变小鼠。在第一个测试示例中，用上升的加号迷宫(EPM)评估对照和突变动物。在该实验中使用了22-24周龄之间的雄性和雌性小鼠。将野生型同窝出生的幼鼠作为对照。将动物分组关养，并保持在规律性的明/暗(6:00AM开灯，6:00PM关灯)条件中，并在测试前1周隔天进行。
用黑色有机玻璃制成加号迷宫(plus maze)装置，有两个敞开的臂(30×5cm)和两个相同尺寸的封闭臂(墙高30cm)。它距地面高30cm。这些臂连接于一中心广场(5×5cm)，因此迷宫形成一个加号。在此装置上安置的25瓦灯为敞开的臂提供6勒克斯光水平。所有测试都是在明亮—黑暗循环中的明亮时期进行的。在行为测试前1个小时，让小鼠习惯实验室的条件，并以5分钟的间隔分别测试各个对象。
将各只小鼠置于中心平台并面对敞开臂，开始测试。进入敞开和封闭臂的次数和在迷宫各区域所花费的时间为行为分数。臂的进入定义为四只爪子都进入该臂。将进入封闭臂的次数作为在加号迷宫中运动活性的指数。固定在该装置上部的照相机使得能在安置在隔壁房间的视频监视器上观察动物的行为。在测试结束时，将进入次数和在敞开臂上花费的时间分别表达为占臂进入总次数的百分比和占总测试时间的百分比。以平均值±平均值的标准误差表示结果。用Studentt检验分析自EPM测试得到的行为参数。
结果显示雄性和雌性CRFR2突变小鼠比野生型对照小鼠花费在进入加号-迷宫装置的敞开臂的时间少，且频率也低。发现雄性和雌性小鼠进入敞开臂的百分比有显著的影响(图4A和4B)。焦虑样行为的增加不是由改变的运动活性引起的，因为两组间在封闭臂中的总体活动和臂进入总数上没有差异(图4C和4D)。这些结果表明CRFR2突变小鼠表现出显著增加的焦虑样行为。
实施例8
评估CRFR2缺陷型小鼠在明/暗盒中的焦虑样行为
还分析了CRFR2缺陷型突变小鼠和对照小鼠在明/暗盒中的焦虑样行为。将长方形、有机玻璃盒分成两个区室，一个涂成白色(28.5cm×27cm)，另一个涂成黑色(14.5×27.0cm)。用红色有机玻璃盖覆盖的黑色区室内的光密度为8勒克斯，白色区室内为400勒克斯，两区室通过一个位于分隔中心地面水平的开口(7.5cm×7.5cm)相连通。所有测试都在循环中的黑暗时期进行，即在19:00和21:00间。各只动物测试10分钟，将其置于白色区域的中央，记录其在这两个区室间移动的次数和在白色区域花费的时间。固定在该装置上部的照相机使得能在安置在隔壁房间的视频监视器上观察动物的行为。
明/暗盒得到的结果表明CRFR2突变小鼠花费在盒明亮部分的时间和在盒明亮与黑暗区室间的转移次数与对照小鼠的相同(图4E和4F)。在本实验中这两组间没有显著性差异。
实施例9
评估CRFR2缺陷型小鼠在敞开区域测试中的焦虑样行为
还分析了CRFR2突变小鼠和对照小鼠在敞开区域装置中的焦虑样行为。此敞开区域装置是由在底部涂成16个方块(12×12cm)(外部12个，内部4个)的白色有机玻璃盒(50×50×22cm)组成的。照向底部中央的灯向底部提供了120勒克斯的照明。在明亮-黑暗循环的黑暗期进行测试，室内的背景噪声恒定为52dB。将各只小鼠置于装置的中央，开始进行10分钟的测试。由视频记录器定量测定花费在内部方块中的时间(秒)、走动(穿过的方块数)、排便(粪团量fecalboli)、直立(rearing)和梳理皮毛(grooming)(秒)所花费的时间。以走动次数的百分比表达穿过内部方块的次数。敞开区域测试的结果表明CRFR2突变小鼠比野生型小鼠花费在内部方块的时间少且穿过的频率低(图4G和H)。在两组的走动、起立、排便或梳理皮毛上没有差异(没有显示数据)。
实施例10
CRFR2缺陷对其它基因表达的影响
由于在HPA轴的组成中未检测到明显的解剖学缺陷(图1D和1E)，突变动物在应力和行为反应中的变化就可能是由于CRF信号途径中其它成分基因表达的变化引起的。为了研究这种可能性，用原位杂交检验UCN、CRF和CRFR1mRNA的表达。
按(36)所述的方法进行原位杂交。简单地说，将组织切片(20μm)在4％多聚甲醛中固定，以PBS漂洗，浸泡在乙酸酐中，用一系列梯度乙醇脱水，在氯仿中脱脂，并再次脱水。然后在55℃的潮湿培养箱中，使玻片与35S-标记的核糖探针(50％去离子的甲酰胺杂交混合物中)杂交过夜。培育后，室温边振荡边用1XSSC洗涤这些玻片30分钟，37℃用20μg/ml RNase(Promega)处理30分钟，室温在1X SSC缓冲液中漂洗30分钟，65℃边振荡边用0.1XSSC洗涤20分钟3次，室温以0.1XSSc漂洗30分钟，用系列梯度乙醇脱水，风干，并置于Kodak超感光膜(Eastman Kodak，Rochester，NY)上3天。
膜显影后，将载玻片浸泡在NTB2液态核乳胶(Eastman Kodak；用水1∶1稀释)中，曝光10天，进行照片加工，用苏木精染色计数，并盖上盖玻片。用影像分析系统Image Pro Plus(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)分析载玻片。在PVN和cAmyg的分析中，用圆形工具(面积＝3022像素)来测定各切片的平均光密度，从而比较各动物相同的PVN和cAmyg区域相匹配切片的解剖学图。表达尿皮质素的EW细胞胞体太分散以至于不能用标准光密度方法分析。因此，使用这些参数，通过预先确定的除非阳性细胞和背景银颗粒处的颜色和细胞大小，让计算机来测定在所指定的表达最小光密度的EW中的细胞数。然后计算由计算机确定为尿皮质素mRNA阳性的各个细胞的光密度。再比较各切片的平均光密度和细胞数。
如图5A所示，在动眼神经副核(Edinger Westphal)(EW)的嘴侧区域中尿皮质素mRNA明显增加，突变动物中每个细胞中的尿皮质素mRNA(图5C)密度和细胞表达的数量都增加。显示在突变裸鼠的扁桃体(amygdala)中央核(cAmyg)，CRF mRNA明显增加(图5A&5D)。在基本未受应激作用动物的PVN中没有检测到CRF mRNA显著变化(图5A&5E)。突变和野生型小鼠之间脑或垂体腺前叶的CRFR1 mRNA表达模式和水平没有差异(没有显示数据)。这些结果表明CRFR2突变型小鼠的cAmyg中的CRF mRNA和动眼神经副核(Ew)嘴侧中的尿皮质素mRNA的表达水平增加。
实施例11
评估CRFR2突变小鼠在UCN反应中出现低血压
已有报道显示对外周注射尿皮质素的反应中出现低血压(2)。另外，已将CRFR2定位于血管内皮细胞(5，8)，而且还假设其负责尿皮质素的血管舒张作用。为了测试此假设，用尿皮质素注射CRFR2突变和对照小鼠，并测定它们的血压变化。
检验了用异氟麻醉的小鼠对静脉内灌注尿皮质素和硝普钠(一种血管扩张剂)的心血管反应(野生型n＝5；突变n＝3)。采用软化的拉制成～0.4mm外径的无菌PE-10管装配用于记录血压的动脉导管。暴露股动脉，植入灌满肝素盐水(500U/ml)的此动脉导管，并用手术线和组织胶(Vetbond)固定。将该导管连接于一血压转换器(Statham)，并在Gould pen-记录仪上显示动脉血压脉冲。然后在外颈静脉中植入另一导管，用于静脉内灌注药物。完成插管步骤后30分钟灌注药物。将静脉导管与灌满药物的针筒相连。在0.5-1.0分钟内完成灌注。野生型和突变型小鼠接收相同剂量的尿皮质素(在200μl 0.9％盐水中含0.1μg)和盐水(作为对照)。
参考在Sprague Dawley大鼠相应研究中所得到的数据，从初步实验确定所用的剂量(2)。为了验证突变小鼠缺少对尿皮质素注射的心血管反应不是由于小鼠丧失了血管舒张的能力，在尿皮质素灌注动脉压恢复后，突变小鼠又接收了第二次硝普钠(在100μl 0.9％盐水中含0.8μg)的灌注。从血压图确定了平均动脉压(MAP)。
静脉内灌注尿皮质素(0.1μg)导致对照小鼠明显的抑制性反应(-28.3±2.0mmHg)(图6)。在整个记录过程中动脉压保持下降(90-120分钟)。显示相反，突变小鼠表现出对尿皮质素不产生可测定的反应[只有一只突变小鼠的动脉压显示出极小的和瞬间降低，这很可能是由于注射压力本身所致(图6)]。为了验证突变小鼠的周围血管系统在对其它刺激的反应中能够血管舒张，将硝普钠(NP)(作为一氧化氮的供体能导致血管舒张)给予突变型小鼠。如图6(白色柱)所示，在对硝普钠(-30.0±5.0mmHg)注射的反应中持续观察到迅速和强烈的抑制反应。在本实验的过程中，突变型(76mmHg)和野生型小鼠(74mmHg)之间在麻醉下的基础MAP没有显著差异。
实施例12
CRFR2对血管生成的影响
对CRFR2突变小鼠的器官进行的组织学分析显示CRFR缺陷型小鼠的一些器官(包括脑、垂体和肾上腺)的血管生成明显增加(没有显示数据)。这表明CRFR2可能作为血管生成的直接调节剂起作用。因此为了调节疾病时的血管生成可采用作为CRFR2的促效剂或拮抗剂的配体。一个实例是癌症，癌细胞生长必须血管生成增加。通过刺激CRFR2的活性，可用促效剂来抑制血管生成，从而阻碍癌细胞的生长。
实施例13
CRDR2缺少对焦虑和应激影响的总结
本文的结果表明CRFR突变裸鼠表现出应激-敏感和焦虑样表型。虽然基础摄食和体重增加正常，但突变小鼠对食物停止给予的反应是在食物停止给予的应激后重新喂食过程中消耗较少的食物。虽然这可能是代谢的作用，因为在实验过程中突变和对照动物没有显示出在体重增加或减少上有差异，但可能是食物停止给予的应激改变了动物的焦虑状态，从而降低了它们的食欲或影响了它们的代谢。突变小鼠还显示还表现出对约束应激的迅速HPA反应，这再次表明这些动物对应激更敏感。在约束10分钟后观察到突变小鼠ACTH水平的降低可能是小鼠下丘脑上更迅速的糖皮质素负反馈的结果，因为突变小鼠比对照小鼠更早显示出更高的类固醇水平。因此，不能排除导致突变小鼠肾上腺活化有第二种机制的可能性。综合来看，虽然其它生理解释可能也参与突变小鼠对应激反应中的HPA轴速率的增加或进食反应的变化，但以上进食和HPA轴的结果表明CRFR2突变小鼠对应激的超敏性。
在EPM和敞开领域测试中突变小鼠也表现出焦虑样行为的增加。然而，在明/暗盒实验中这些小鼠表现出类似水平的焦虑样行为。虽然在许多动物的焦虑测试中证明了药物的敏感和特异性，但有时观察到作业差异(17，18)。在明/暗中的表现可能有差异，这种作业更多的与对新奇(neophobia)的反应而不是与探查相关(19)，而EPM中的表现则是由厌恶环境的探查而决定。测试过程中明亮条件也明显影响动物测试中检测抗焦虑或焦虑作用的能力(17)。CRFR2突变小鼠测试结果的这种特点表明与探查厌恶环境(而非新环境)相关的激动情绪增高。用CRFR2突变小鼠得到的结果提示行为测试中的这些差异可能解释小鼠中所检测到的焦虑样行为的差异。
实施例14
eAmyg中CRF的增加对焦虑的可能影响
eAmyg中CRF mRNA的增加可以解释突变小鼠焦虑样行为和HPA轴敏感性的增加，因为该核表达CRFR1(8)且在应激信号的转导中起主要作用(20)。另外，含有丰富的CRFR2的中隔显示能调节扁桃体的活性(21-23)，且该核的病变导致约束的应激后ACTH分泌降低(24-27)。已显示扁桃体的病变会封阻CRF-诱导的焦虑(20)以及中隔损伤导致的情感过强(21)。此神经途径可以解释在CRFR1缺陷型小鼠中观察到的焦虑样行为的减少，和在CRFR2缺陷型小鼠中观察到的焦虑样行为的增加。因此，CRFR2突变小鼠为焦虑样行为受体调节提供了新机制的证据。在应激过程中隔旁侧中的CRFR2可能调节了扁桃体的活性，且缺少CRFR2时未受阻断的扁桃体的活性可能导致焦虑样行为的增加。
中隔旁侧中的CRFR2也可能在对应激的HPA反应中起PVN作用的抑制剂功能。由于突变小鼠的中隔旁侧中缺乏CRFR2，应激诱导的PVN活化可能发生得更迅速。另外，CRFR2是未受应激动物的PVN中表达的主要CRF受体，而仅在应激条件下的PVN中发现CRFR1(28，29)。因此，在缺乏CRFR2时，可以改变应激过程中对PVN活性的局部影响。
实施例15
在嘴EW中UCN mRNA的增加导致焦虑的可能机制
嘴EW中尿皮质素mRNA的增加可能是导致突变小鼠焦虑样行为增加的第二个机制，因为当静脉内注射时尿皮质素已显示能诱导焦虑样行为(30)。也不能排除对焦虑样行为增加的其它解释，如自主神经系统敏感性的增加(31-33)。先前用反义寡核苷酸作的研究发现关于CRFR2在焦虑和行为中作用的相抵触结果，虽然这些报告说注射CRFR1反义寡核苷酸的确显示出焦虑样作用(34，35)。
实施例16
CRFR2裸鼠和自主神经系统的敏感性
也不能排除对焦虑样行为增加的其它解释，如自主神经系统敏感性的增加(31-33)。先前用反义寡核苷酸作的研究发现关于CRFR2在焦虑和行为中作用的相抵触结果(34，35)，虽然这些报告显示注射CRFR1反义寡核苷酸的焦虑样作用，但没有研究报道过对注射CRFR2反义寡核苷酸得到的一致性发现。虽然反义寡核苷酸注射方法提供了潜在的希望，但其依旧在研究中，因为蛋白质水平的降低不能取代该靶的完全消除(如在敲除动物中所实现的那样)。
实施例17
UCN对血管舒张的影响
突变裸鼠中CRFR2的缺失可以证明尿皮质素对血管舒张的影响。突变小鼠对静脉内注射尿皮质素不起反应，而野生型小鼠显示出平均小动脉压的明显降低。注射硝普盐导致突变小鼠血管舒张，从而证明缺少对尿皮质素的反应不是由于突变鼠血管系统生理上丧失扩张的能力，而是特异性缺乏CRFR2。这些结果支持了如下假设：通过血管内皮细胞(5，8)中的CRFR2的作用，尿皮质素对低血压(2，16)发生影响，因为CRFR2突变小鼠显示出对尿皮质素不起反应。虽然在UCN引发的血管舒张很可能发生在生理刺激下不是最近知晓的，尿皮质素对脉管系统中CRFR2的作用可能成为高血压药物开发中令人感兴趣的靶标。
结论
总之，这些结果表明CRFR2缺陷型小鼠表现出增加的焦虑样行为和对应激反应的超敏性HPA轴。CRFR1和CRFR2突变型小鼠提供了有价值的焦虑和抑郁模型，可能进一步有助于弄清这些疾病的分子机理。对CRF信号传递途径及其对焦虑和抑郁控制作用的研究可以提供有效治疗这些疾病所需的线索。
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本领域技术人员将不难领会，本发明很适合实施其目的，获得所述结果和优点。本文中所述的本发明实施例和所附带的方法、程序、处理、分子和具体化合物仅是优选实施例的代表，是示范性的，对本发明的范围不起任何限制作用。本领域技术人员可作出改变和其它用途，这些都包括在权利要求范围所限定的本发明范围中。

Claims (16)

1.一种制备非天然的转基因小鼠的方法，其特征在于，该方法包括破坏促肾上腺皮质素释放因子受体2(CRFR2)基因的至少一个等位基因，导致所述小鼠不表达所述等位基因的促肾上腺皮质素释放因子受体2蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促肾上腺皮质素释放因子受体2等位基因的外显子10、11和12的DNA序列缺失。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的DNA序列被新霉素抗性基因盒置换。
4.如权利要求3所述的转基因小鼠，其特征在于，所述小鼠中所述CRFR2基因的两个等位基因同时被破坏。
5.一种筛选具有焦虑调节活性的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将所述的化合物给予用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠；
b)测试所述小鼠的抑郁相关行为；
c)将所述小鼠的焦虑样行为与未给予所述化合物的用权利要求1所述的方法制备的另一种转基因小鼠的焦虑样行为。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用选自以下的方案测试所述小鼠的焦虑：上升的加号迷宫、明/暗盒和旷场测试。
7.一种筛选具有抑郁调节活性的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将所述的化合物给予用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠；
b)测试所述小鼠的抑郁样行为；
c)将所述小鼠的抑郁样行为与未给予所述化合物的用权利要求1所述的方法制备的另一种转基因小鼠的抑郁样行为作比较。
8.一种筛选能控制血压的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将所述的化合物给予用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠；
b)测试所述的小鼠的血压变化；
c)将所述的小鼠的血压变化与另一种小鼠的血压变化相比较，其中所述的另一种小鼠选自未给予所述化合物的用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠和给予所述化合物的野生型小鼠。
9.一种筛选影响血管生成的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将所述的化合物给予用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠；
b)测试所述的小鼠血管生成的变化；
c)将所述的小鼠血管生成变化与另一种小鼠血管生成的变化相比较，其中所述的另一种小鼠选自未给予所述化合物的用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠和给予所述化合物的野生型小鼠。
10.一种筛选对下丘脑-垂体-肾上腺轴对应激反应有影响的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将所述的化合物给予用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠；
b)将所述的小鼠置于诱发-应激的环境中；
c)监测所述小鼠的皮质酮和促肾上腺皮质激素的血浆水平；
d)将所述的水平与那些未置于诱发-应激环境中的用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠的水平相比较。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的诱发-应激的环境是理性约束-应激。
12.一种确定CRFR2对第二种蛋白质作用的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将能影响第二种蛋白质的促效剂给予用权利要求1所述的方法制备的转基因小鼠；
b)对第二种蛋白质进行试验，所述试验选自：蛋白质表达试验和蛋白质活性试验；和
c)将所述的转基因小鼠得到的试验结果与给予相同促效剂的野生型小鼠得到的结果相比较。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的第二种蛋白质选自：促肾上腺皮质素释放因子、促肾上腺皮质素释放因子受体1、尿皮质素、促肾上腺皮质素受体和尿皮质素受体。
14.CRFR2抑制剂的用途，其特征在于，该抑制剂用于制备增加靶组织或个体中血管生成的药物。
15.刺激CRFR2活性的促效剂的用途，其特征在于，该促效剂用于制备抑制靶组织或个体中血管生成的药物。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的药物用于治疗癌症。
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