KR100406484B1 - 타입 ５ 아데닐릴 싸이클라아제가 결실된 형질전환동물,그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

타입 ５ 아데닐릴 싸이클라아제가 결실된 형질전환동물,그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타입 5 아데닐릴 싸이클라아제(type 5 adenylyl cyclase, AC5)가 결실된 형질전환동물, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 구체적으로 유전적 돌연변이 방법에 의해 D2 도파민 수용체 시스템(D2 dopamine receptor system)은 손상된 반면 D1 도파민 수용체 시스템은 기능적으로 완전하게 작동하는 돌연변이 AC5-/- 형질전환동물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 AC5-/- 형질전환동물은 AC5가 D2 수용체와 연계되어 있으며 항정신병 약제(antipsychotic drug)의 작용을 위한 중요한 신경세포 구성 요소임을 밝힘으로써, 기저핵 신경계(basal ganglia system)에서 항정신병 약제의 약리학적 및 생리학적 작용을 밝히며, 나아가 항정신병 약제의 장기 투여에 따른 비가역적 부작용의 기전을 규명하고 그 치료 방법을 개발하는 데 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

Description

타입 ５ 아데닐릴 싸이클라아제가 결실된 형질전환동물, 그의 제조방법 및 용도{Transgenic animals deficient for type 5 adenylyl cyclase, a production method and an usage thereof}
본 발명은 타입 5 아데닐릴 싸이클라아제(type 5 adenylyl cyclase, 이하 "AC5"로 약칭함)가 결실된 형질전환동물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 유전적 돌연변이 방법에 의해 D2 도파민 수용체 시스템(D2 dopamine receptor system)은 손상된 반면 D1 도파민 수용체 시스템은 기능적으로 완전하게 작동하는 돌연변이 AC5-/- 형질전환동물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
도파민 시스템(dopaminergic system)은 운동 능력, 행동 개시 및 신경 내분비계 시스템 뿐만 아니라 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 약물 중독 및 정신 분열증(Schizophrenia) 등의 질환을 포함하는 병리학적 상태에서 매우 중요한 역할을 담당한다(Ebadi and Srinivasan,Pharmacol. Rev.,47, 575-604, 1995). 도파민 수용체(dopamine receptor) 활성의 생리학적 중요성은 아데닐릴 싸이클라아제(adenylyl cyclase, AC)의 작용과 밀접하게 연계되어 있다. 도파민 수용체는 D1 타입(D1-type, D1 및 D5) 및 D2 타입(D2-type, D2, D3 및 D4)으로 나뉘는데, 일단 활성화되면 D1 타입 수용체는 G 단백질(G protein)을 통해 AC를 자극하는 반면, D2 타입 수용체는 AC를 억제한다(Seeman and Van Tol,Trends. Pharmacol. Sci.,15, 264-270, 1994).
뇌에서 도파민 자극의 주된 요인은 중뇌에 위치하고 있는 흑질(substantia nigra, SN)의 치밀부(pars compacta)로부터 유래된다. SN 도파민 신경은 도파민 수용체(특히, D1 및 D2)가 고농도로 발견되는 선조체(corpus striatum)를 반영한다. 선조체와 흑질은 담창구(globus pallidus) 및 시상하핵(subthalamic nucleus)과 함께 기저 신경절 시스템(basal ganglia system)을 구성하는데, 기저 신경절 시스템은 운동능력의 조화와 개시의 감각 중추로서 필수적인 역할을 수행한다(Alexander and Crutcher,Trends. Neurosci.,13, 266-271, 1990). 따라서, 기저 신경절 시스템의 약리학적 간섭 또는 병리학적 변화는 운동 능력의 변화에 의해 명백하게 알 수 있다(Albin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,94, 12157-12161, 1997).
전 세계 인구의 약 1%가 고통받고 있는 심각한 정신질환인 조발성 치매는 망상, 환각 및 정신 이상 등의 눈에 보이는 증상(양성 증후군)과 사회적 금단 증상 및 감정 표현의 무감각 등의 눈에 보이지 않는 증상(음성 증후군)의 병적 특징을 나타낸다(Lipton and Cancro,In Comprehensive textbook of psychiatry/Ⅵ, 1987-2022, 1995). 임상에서 일반적으로 사용되고 있는 할로페리돌(haloperidol)과 같은 정형적 항정신병 약제(typical antipsychotic drug)들은 조발성 치매의 양성 증후군을 치유하는데는 효과적이지만, 파킨소니즘(Parkinsonism) 및 지발성 운동 장애(Tardive dyskinesia)를 포함하는 추체외로 부작용(extrapyramidal side effects, EPS)을 유발한다(Grebb,In Comprehensive textbook of psychiatry/Ⅵ, 1909-1915, 1995). 반대로, 클로자핀(clozapine) 및 올란자핀(olanzapine)과 같은 새로이 개발된 비정형적(atypical) 항정신병 약제들은 상기의 정형적 약제들보다는 EPS와 같은 부작용을 덜 유발하면서도 조발성 치매의 양성 증후군 뿐만 아니라 음성 증후군에도 상당한 효과를 보이지만, 비정형적 항정신병 약제를 사용한 환자들에게서 식물인간 상태를 초래하는 부작용을 유발하는 것으로 판명되었다(Van Kammen and Marder,In Comprehensive textbook of psychiatry/Ⅵ, 1987-2022, 1995; Blin, 1999). 할로페리돌과 같은 정형적 항정신병 약제는 도파민 D2 수용체의 활성을 억제하는 길항제로 작용하여 치료효과를 나타내는 반면, 비정형적 항정신병 약제들은 도파민 수용체 뿐만 아니라 세로토닌(serotonin), 무스카리닉(muscarinic) 또는 아드레너직 수용체(adrenergic receptors) 등의 활성도 억제하는 다중 수용체 길항제(multireceptor antagonist)로서 작용한다(Blin,Can. J. Psycjiatry.44, 235-244, 1999). 하지만, 지난 40여년 동안 지속된 관련 연구의 긴 역사에도 불구하고 현재까지 항정신병 약제의 자세한 기작, 장기간의 사용에 의한 변형 유전자의 발현 등을 포함하는 생리학적 변화 및 관련 신경 시스템의 생리학적 반응 등에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
오늘날까지, 9가지 종류의 AC가 포유동물에서 클론되었는데, 클론된 모든 AC는 G 단백질, Ca2+또는 인지질 2차 전달자(phospholipid second messengers)를 통해 전달된 다양한 신호에 의해 양성적으로 또는 음성적으로 조절된다(Mons and Cooper,Brain Res. Mol. Brain Res.,22, 236-244, 1995). 포유동물의 ACs는 Ca2+에 대한 민감성를 기준으로 하여 세 그룹으로 나뉘는데, 타입 1, 3 및 8을 포함하는 Ca2+-민감성 아데닐릴 싸이클라아제(Ca2+-sensitive AC); 타입 2, 4 및 7을 포함하는 Ca2+-비민감성 아데닐릴 싸이클라아제(Ca2+-insensitive AC); 및 타입 5 및 6을 포함하는 Ca2+-억제성 아데닐릴 싸이클라아제(Ca2+-inhibitable AC)로 구분되고 최근에 클론된 타입 9 AC는 상기 세 그룹의 AC와는 구별된다(Charbardes et al.,Cell Signal. 11, 651-663, 1999; Hurley, 1999). 상기의 모든 ACs는 GTP 결합 G-단백질 Gsα(GTP bound G-protein Gsα) 및 폴스콜린(forskolin)에 의해 활성화되고 활성화된 AC는 2차 전달자 cAMP를 형성한다. cAMP가 단백질 카이네이즈 A(ptorein kinase A) 및 MARK 경로 또는 이온 채널(ion channels)의 활성화를 유발하여 세포내로 유입되는 신호(incoming signals)를 축적하기 위한 세포성 생리기능을 변화시킨다(Dugan et al.,J. Biol. Chem.,274, 25842-25848, 1999).
타입 5 아데닐릴 싸이클라아제(AC5, ACV라고도 불림)는 상기에서 언급한 바와 같이 자유-Ca2+(free-Ca2+)에 의해 억제되는 Ca2+-억제성 아데닐릴 싸이클라아제로서 뇌의 선조체에서 집중적으로 발현된다(Glatt and Snyder,Nature,361, 536-538, 1993). AC5는 도파민 수용체로서 D1 및 D2가 주로 존재하는 선조체에서 집중적으로 발현되기 때문에 도파민 수용체 시스템에 있어 AC5가 매우 중요한 요인으로 작용함을 알 수 있다(Matsuoka et al.,J. Neurochem.,68, 498-506, 1997). 하지만, AC5 특이적 억제제(AC5 specific inhibitors)의 비유효성이 밝혀지면서 AC5의 생체내 역할을 보다 잘 이해하기 위한 최근의 연구들이 지연되고 있는 실정이다(Weiner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,87, 7050-7054, 1990). 따라서, 신호전달경로를 포함하는 수용체-효과기 작용(receptor-effector interaction)은 도파민 수용체 신호기작에 있어 틈새로 여겨지고 있다.
D1 및 D2 도파민 수용체를 제외하고, 선조체에서는 아데노신 수용체(adenosine receptor) A24및 무스카리닉 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor) m4를 포함하는 다른 7-막투과성-수용체(7-transmembrane receptors)들이 고밀도로 발현된다(Augood and Emson,Brain Res. Mol. Brain Res.,22, 204-210, 1994). 상기 수용체들은 도파민 시스템과 반응하여 상승적으로 작용하거나 기저 신경절 시스템의 생리기능을 조절하는데 있어 다양한 수준에서 길항적으로 작용한다. 실제로, 최근의 연구에서 무스카리닉 m4 수용체를 유전적으로 제거시킨 결과, D1-수용체 매개성 운동능력이 증가되었음이 보고되었다(Gomezaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,96, 10483-10488, 1999). 따라서, 상기 수용체들과 AC5가 선조체내의 동일한 위치에 존재한다는 것은 AC5가 도파민 수용체 시스템의 중추적인 역할을 수행하는지 또는 AC5가 선조성 신경세포(striatal neurons)에서 발현되는 다른 수용체들을 위해 일반적으로 사용될 수 있는 효과기인지 등에 대한 많은 의문들이 제기되고 있다.
본 발명자들은 만약 AC5가 선조체에서 수용체 신호기작에 중추적 역할을 수행한다면, 정신운동성 자극(psychomotor stimulants) 및 항정신병 약제와 같은 도파민 수용체 조절자(modulator) 및 다른 수용체 조절자에 의해 생산된 신경성 출력의 조절기작을 밝히기 위하여 AC5의 유전적 간섭을 유용하게 이용할 수 있다고 가정하였다. 이러한 가정을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 AC5 유전자가 결실된 AC5 넉아웃 생쥐(AC5 knockout mice)를 제조하여 기저 신경절 시스템과 관련된 도파민 수용체의 약리학적 기능뿐만 아니라 생리학적 기능을 세밀하게 조사하였다. 또한, 본 발명자들은 AC5가 선조체에서 주된 AC로서 다중 수용체를 위한 주요 효과기로 작용함을 밝히고, AC5가 D1 및 A2A수용체의 활성을 위해서가 아니라 D2 수용체의 신호기작 활성을 위한 필수 전달자로서 작용함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 AC5 유전자를 결실시키기 위한 AC5 넉아웃 카셋트(knockout cassette)의 동형 재조합(homologous recombination)에 의해 AC5가 결실된 형질전환동물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 AC5 넉아웃 카셋트에 의한 AC5 유전자의 돌연변이를 나타낸 것이고,
도 1b는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 게놈 DNA를 분리하여 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)을 수행한 결과이고,
도 1c는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체(striatum)에서 분리한 RNA에 대한 노던 블럿 분석(Northern blot analysis) 결과를 나타낸 것이고,
도 1d는 뇌 절편에서 AC5를 면역조직화학적으로 검출(immunohistochemical detection)한 결과를 나타낸 것이고,
1) AC5+/+ 야생형 자손의 선조체를 포함하는 뇌 절편
2) AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체를 포함하는 뇌 절편
도 2a는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서 폴스콜린(forskolin)에 의해 유도되는 아데닐릴 싸이클라아제의 활성을 나타낸 결과이고,
도 2b는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스의 대뇌 피질에서폴스콜린(forskoline)에 의해 유도되는 아데닐릴 싸이클라아제의 활성을 나타낸 결과이고,
도 3a는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 운동능력을 오픈 필드 실험(open field test)을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이고,
도 3b는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 오픈 필드에서의 수평운동능력을 5분 간격으로 나누어 비교한 결과이고,
도 4a는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 기저핵 체계의 아데닐 싸이클라제의 활성을 GTP가 있는 조건에서 조사한 결과를 나타낸 것이고,
도 4b는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 기저핵 체계의 아데닐 싸이클라제의 활성을 GTP 및 D1 도파민의 작용제(agonist)인 SKF38393가 있는 조건에서 조사한 결과를 나타낸 것이고,
도 4c는 D1 도파민의 작용제인 SKF38393 처리시 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 운동능력 변화를 비교한 결과이고,
도 4d는 D1 도파민의 길항제(antagonist)인 SCH23390 처리시 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 운동능력 변화를 비교한 결과이고,
도 5은 D2 도파민의 길항제인 설피라이드(sulpiride) 처리시 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 신경마비성 반응(neuroleptic responsiveness)을 비교한 결과이고,
도 6a는 할로페리돌(haloperidol)처리시 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 운동능력 변화를 비교한 결과이고,
도 6b는 클로자핀(clozapine)처리시 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 운동능력 변화를 비교한 결과이다.
상기 목적을 위하여, 본 발명은 AC5 유전자를 결실시키기 위한 AC5 넉아웃 카셋트(knockout cassette)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AC5 넉아웃 카셋트에 의해 AC5 유전자에 돌연변이를 갖는 수정란을 제공한다.
아울러, 본 발명은 AC5 넉아웃 카셋트의 동형 재조합(homologous recombination)에 의해 AC5가 결실된 형질전환동물 및 그의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 AC5 유전자를 결실시키기 위한 AC5 넉아웃 카셋트, 상기 AC5 넉아웃 카셋트에 의해 AC5 유전자에 돌연변이를 갖는 수정란, 이로부터 생산된 AC5가 결실된 형질전환동물을 제공한다,
먼저, 본 발명자들은 마우스의 AC5 유전자를 얻기 위하여 AC5 유전자의 특이서열을 인식하는서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머를 사용하여 AC5 유전자의 N 말단에 존재하는 369 bp DNA 단편을 증폭한 후 이를 이용하여 129SVJ 마우스의 게놈 DNA 라이브러리(mouse 129SVJ genomic DNA library, Stratagene)로부터 마우스 AC5 유전자의 전반부 대부분을 포함하는 AC5 게놈 DNA 클론을 선별하였다. 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 제한효소 처리를 하여 얻은, BamHI 제한효소 부위로부터 엑손 2(exon 2)의 앞쪽 일부분을 포함하는 2.2 Kb 절편과 엑손 2의 뒷부분에 존재하는 제한효소 부위 ApaI과 XhoI 사이를 포함하는 5.3 Kb 절편을 벡터의 양쪽 말단에 서브클로닝하여 AC5 넉아웃 카세트를 제조하고 이를 pAC5-neo-TK라 명명하였다(도 1a참조).
129SVJae 배아상태의 간 세포(embryonic stem cells)를 상기 AC5 넉아웃 카셋트를 이용한 동형 재조합(homologous recombination)에 사용하여 이형 돌연변이 F1 형질전환 마우스를 제조하고 동형접합체, 이형접합체 및 야생형(wild-type) 자손의 F2 잡종은 이형접합체 F1 마우스의 교배에 의하여 생산한다. F1 형질전환 마우스의 교배에 의해 생산된 자손들 중에 AC5-/- 형질전환 마우스인 동형접합체, 이형접합체 및 야생형 자손들은 1 : 2 : 1의 일반적인 교배 비율로 생산된다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 AC5 넉아웃 카세트의 동형 재조합에 의해 AC5 유전자에 돌연변이(null mutation)를 가지는데, 서던 블럿 분석 및 노던 블럿 분석을 수행하여 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스에서 AC5 유전자가 결실되어 발현되지 않음을 확인하였다(도 1b및도 1c참조).
또한, AC5-/- 형질전환 마우스에서 항-AC5 면역반응(anti-AC5 immunoreactivity)이 검출되지 않은 면역조직화학적 분석을 통해 AC5가 결실되었음을 확인하였으며, 이러한 결과는 상기의 서던 및 노던 블럿 분석 결과와 일치하는것이다(도 1d참조).
수정란의 발생과정 및 성체의 일생 동안 심장과 신장의 기능에 매우 중요한 역할을 한다고 알려진 AC5가 결실된 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스를 조직학적으로 분석한 결과, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 몸무게와 심장 및 신장의 현미경적 조직을 포함하는 대부분의 조사에서 AC5+/+ 야생형 자손과 별 다른 차이를 나타내지 않으며, 다만 초기 몸무게만이 다소 감소하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스에서 AC5 유전자의 결실은 마우스의 발생과정 중에 약간의 지연된 성장을 유발하지만 AC5 유전자가 마우스의 생존에 필수적인 것은 아님을 확인할 수 있다.
본 발명에서는 상기의 AC5-/- 형질전환 마우스를 이용하여 AC5 유전자의 돌연변이에 의한 AC 활성의 저하와 이와 관련된 생리활성 기작을 확인하였다.
먼저, AC5 유전자의 유전적 변화는 뇌의 선조체에서 AC 활성의 급격한 감소를 유발하는데, 오픈 필드 실험(open field test)을 수행하여 AC5 유전자의 돌연변이에 의한 AC5-/- 형질전환 마우스의 운동능력의 변화를 조사한 결과, AC5+/+ 야생형 마우스에서는 일반적으로 시간이 지남에 따라 주변 환경에 적응하게 되어 탐사 행동이 감소하는 양상을 보이는 반면, AC5-/- 형질전환 마우스에서는 이러한 탐사 행동의 시간-의존적 감소현상의 부재로 인하여 기본 운동능력에 있어서 미세한 증가가 있음을 확인하였다(도 2a및2b참조).
또한, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스에서 선조체에서의 잔존 AC 활성은 AC5 이외의 다른 AC와 관련되어 있다.
AC 활성 유도제인 폴스콜린을 처리한 후, 항체를 이용한 방사선 면역분석을 수행하여 AC5-/- 형질전환 마우스에서 변화된 AC 활성을 측정한 결과, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 AC5 유전자의 결실로 인해 AC5+/+ 야생형 자손에 비하여 폴스콜린-유도 AC 활성이 상당히 감소된 양상을 보이는 반면, 폴스콜린을 처리하지 않은 대조군에 비해서는 폴스콜린 처리시에 AC 활성이 증가되는 양상을 보인다(도 3a및도 3b참조). 이러한 결과들은 야생형 마우스에 존재하는 AC5가 뇌의 선조체에서 주요 AC로 작용하지만 AC5 이외에도 다른 타입의 AC가 동일한 뇌 조직에 존재함을 암시한다. 또한, 정상 마우스의 대뇌 전두 피질에서 역시 AC 활성은 AC5에 의해 대부분 조절되지만 폴스콜린-유도 AC 활성의 상당 부분이 AC5가 아닌 또 다른 타입의 AC에 의해 나타남을 알 수 있다.
이를 확인하기 위해, D1 작용제(agonist)를 사용하여 AC5가 D1 도파민 수용체 활성을 위한 필수적인 전달자(transducer)인지를 조사한 결과, AC5-/- 형질전환 마우스에서는 수평 운동능력이 2배 이상 증가하는 양상을 나타낸 반면(도 4c참조), D1 길항제(antagonist)를 투여한 경우에는 AC5-/- 형질전환 마우스의 수평 운동능력은 D1 길항제를 투여하지 않은 대조군에 비하여 상당히 억제되었다(도 4d참조). 이러한 결과는 AC5-/- 형질전환 마우스의 D1 수용체 시스템이 AC5 유전자의 유전적 변이에도 불구하고 기능적으로는 여전히 온전하게 작동함을 암시하며, 또한 D1 수용체 시스템이 AC5 이외의 다른 타입의 AC에 결합하거나 또는 AC 이외의다른 효과기에 결합함을 나타내는 것이다.
따라서, 상기의 AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서 관찰되는 잔여 AC 활성은 AC5와 D2 수용체의 결합에 의한 것이다.
AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서 관찰되는 잔여 AC 활성이 D1/AC 결합에 의한 것이 아니라 다른 수용체인 D2 수용체 시스템과의 결합에 의한 것인지를 확인하기 위하여 D2 길항제인 설피라이드(sulpiride)를 투여하여 운동능력의 변화를 관찰한 결과, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스에서는 일반 마우스의 D2 길항제 설피라이드에 대한 신경마비성 반응(neuroleptic responsiveness)이 완벽하게 사라지고 오히려 운동능력이 증가한 것으로 나타나, AC5 유전자의 유전적 결함이 D2 수용체 시스템에서 정상적으로 시작되는 신호전달 기작의 흐름(signaling flow)을 방해하기에 충분함을 확인하였다(도 5참조). 따라서, 정상 쥐에서는 AC5가 D2 수용체에 결합함을 알 수 있으며, 이러한 결과는 D2 수용체와 AC5가 선조체의 동일한 신경세포에 함께 존재한다는 이전의 연구결과와 일치하는 것이다(Mons N, Cooper DMF.,Brain Res. Mol. Res., 22, 236-244, 1993). 또한, 본 발명자들은 AC5-/- 형질전환 마우스의 설피라이드에 대한 신경마비성 반응의 부재가 D1 또는 D2 수용체의 발현 양상의 변화에 기인하는 것이 아님을 확인하였다.
상기의 사실을 근거로 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 도파민 수용체에 작용하는 항정신병 약제의 약제학적 기작을 밝히는데 이용될 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예의 하나로서 전형적인 항정신병 약제인할로페리돌(haloperidol)의 작용기작에 있어 신호전달 체계를 밝혔다.
AC5-/- 형질전환 마우스 및 야생형 자손에 할로페리돌을 투여한 후 이들의 운동능력 변화를 관찰한 결과, AC5-/- 형질전환 마우스는 대조군에 비하여 현저하게 증가된 운동능력을 보이는 반면, AC5+/+ 야생형 자손에서는 약물 투여 후 1 시간여만에 운동능력이 현저하게 감소하여 눈에 띄는 움직임 없이 단지 호흡만이 유지되는 냉동된 상태에 가까운 모습이 관찰되었는데(도 6a및도 6b참조), 이러한 결과는 AC5와 결합하는 D2 수용체 시스템이 뇌에서 할로페리돌 작용의 주된 경로에 있어 필수불가결한 신호전달 체계임을 의미한다. 또한, 상당히 낮은 용량의 할로페리돌을 투여한 AC5-/- 형질전환 마우스에서 극도로 활발한 움직임이 관찰되는데, 이는 할로페리돌의 약학적 작용에 있어 운동능력을 향상시키는 또 다른 성분이 존재함을 암시한다. 즉, 뇌 선조체의 신경세포 내 D2/AC5 시스템만이 할로페리돌의 유일한 표적이 아님을 나타낸다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 D2 도파민 수용체는 손상된 반면 D1 도파민 수용체 시스템은 온전하게 작동하는 AC5-/- 형질전환 마우스를 제공한다. 본 발명자들은 상기 AC5-/- 형질전환 마우스를 이용하여 D2 수용체 시스템은 AC5와 결함하여 작용하는 반면 D1 수용체 시스템은 AC5와 상관없이 작용한다는 사실과 AC5가 전형적인 항정신병 약제인 할로페리돌의 작용에 있어 매우 중요한 요소임을 밝혀냈다. 따라서, 지금까지 개발되어 사용중인 도파민 수용체에 작용하는 항정신병 약제들의 부작용을 고려할 때, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 항정신병약제의 약제학적 작용 기작을 밝히는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 기저 신경절 시스템의 약제학적 및 생리학적 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 AC5 넉아웃 카셋트의 동형 재조합(homologous recombination)에 의해 AC5가 결실된 형질전환동물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은
(1) AC5 유전자를 포함하는 AC5 게놈 DNA 클론을 얻는 단계;
(2) 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 AC5 넉아웃 카셋트를 제조하는 단계;
(3) 상기 넉아웃 카셋트를 배아간세포에 형질감염시키는 단계;
(4) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하는 단계 ;
(5) 상기 배아간세포가 주입된 포배강을 대리모의 자궁에 이식하여 카이메라 마우스(chimera mouse)를 얻는 단계;
(6) 상기 카이메라 마우스를 교배시켜 AC5 (+/-) 유전형질을 갖는 이형접합체(heterozygote) F1 형질전환 마우스를 얻는 단계; 및
(7) 상기 F1 형질전환 마우스를 교배시켜 AC5 (-/-) 유전형질을 갖는 동형접합체(homozygote) F2 형질전환 마우스를 얻는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> AC5가 결실된 형질전환동물의 제조
<1-1> AC5 넉아웃 카세트의 제조 및 동형 재조합에 의한 형질전환동물의 제조
마우스의 AC5 유전자를 얻기 위해, AC5 유전자의 특이서열을 인식하는서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. PCR 결과, AC5 유전자의 N 말단에 존재하는 369 bp DNA 단편이 증폭되었고 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 확인하였다. 상기와 같이 PCR로 증폭하여 얻은 AC5 유전자의 단편을 이용하여 129SVJ 마우스 게놈 DNA 라이브러리(mouse 129SVJ genomic DNA library, Stratagene)로부터 AC5 게놈 DNA 클론을 선별하였다. 이러한 선별과정을 거친 DNA 클론은 마우스 AC5 유전자의 전반부 대부분을 포함하는 1.3 Kb ApaI 단편을 포함하고 있으며, 본 발명자들은 이 단편을 엑손 2(exon 2)라 명명하였다. AC5 넉아웃 카세트를 제조하기 위하여, 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 제한효소 처리를 하여 얻은 BamHI 제한효소 부위로부터 엑손 2의 앞쪽 일부분을 포함하는 2.2 Kb 절편과 엑손 2의 뒷부분에 존재하는 제한효소 부위 ApaI과 XhoI 사이를 포함하는 5.3 Kb 절편을 벡터 pGK-neo(미국 시에틀의 프레드 허치슨 암연구소의 폴 소리아노 및 존홉킨스 의대의 임대식 박사로부터 기탁받음)의 양쪽 말단에 서브클로닝하여 AC5 넉아웃 카세트를 제조하고 이를 pAC5-neo-TK라 명명하였다(도 1a).
배아줄기세포(embryonic stem cells, ES cells)의 배양 및 발생은 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행하였다. 간단하게 설명하면, 상기와 같이 제조된AC5 넉아웃 카세트 pAC5-neo-TK를 129SVJae 배아 유래의 배아 줄기세포에 전기 충격(electroporation) 방법으로 형질감염(transfection)시키고 2 내지 3일 동안 배양한 후 다시 G418 및 갱싸이클로버(gancyclovor) 배지에서 배양함으로써 동형 재조합(homologous recombination) 방법에 의하여 게놈 내 AC5 유전자가 넉아웃 카셋트 pAC5-neo-TK에 의하여 정확하게 치환된 배아 줄기세포 클론을 선별 유지하였다. 상기와 같이 선별된 배아 줄기세포 클론을 C57BL/6J 마우스(미국 잭슨 연구실로부터 구입) 유래의 포배기의 포배강에 주입하고, 이들을 다시 ICR(미국 잭슨 연구실로부터 구입) 대리모의 수란관에 이식하여 배아 줄기세포 클론(129SVJae)과 C57BL/6J 마우스의 포배로부터 생성된 이형세포 교배종의 일종인 카이메릭 마우스(chimeric mouse)를 확보하였다. 상기와 같이 확보된 총 7종의 카이메릭 마우스로부터 유전적으로 안정화된 동형접합체 돌연변이 F1 형질전환 마우스(germ-line transmittable heterozygote mutant F1 mice)를 확보하였다. 동형접합체, 이형접합체 및 야생형(wild-type) 자손의 F2 잡종은 이형접합체 F1 마우스의 교배에 의하여 생산하였다. 상기와 같이 이형접합체 F1 마우스의 교배에 의해 생산되어 AC5 유전자에 돌연변이가 유발된 형질전환 동물이 되는 수정란을 2000년 7월 20일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0840BP).
상기와 같이 F1 형질전환 마우스의 교배에 의해 생산된 270 마리의 자손들 중에 동형접합체(AC5-/-), 이형접합체(AC5-/+) 및 야생형 자손(AC5+/+)들은 각각 58 마리(21.5%), 146 마리(54.1%) 및 66 마리(24.4%)였는데, 이는 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스가 멘델의 법칙에 준하여 일반적인 탄생 비율로 생산됨을 나타낸다.
<1-2> 형질전환 마우스의 AC5 유전자의 변형 확인
먼저, 상기 <1-1>에서 제조된 형질전환 마우스에서 AC5 유전자의 결실을 확인하기 위하여 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)을 실시하였다. 구체적으로, F2 마우스로부터 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 XbaI으로 처리한 후32P가 표지된 500 bp SalI/HindIII 단편을 탐침으로 사용하여 서던 블럿 분석을 수행하였다.
서던 블럿 분석 결과, AC5 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 AC5+/+ 야생형 자손은 13 Kb 위치에서 밴드가 검출된 반면, 돌연변이가 발생한 AC5-/- 형질전환 마우스는 9 Kb에서 밴드가 검출되어 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 AC5 유전자가 결실되어 있음을 확인하였다(도 1b).
또한, 본 발명의 AC5-/-형질전환 마우스에서 AC5 유전자가 발현되지 않음을 노던 블럿 분석(Northern blot analysis)으로 확인하였다. 구체적으로, F2 마우스의 선조체(striatum)로부터 전체 RNA를 분리한 후 이 중 30 ㎍ RNA에 마우스 AC5 cDNA의 3'-말단으로부터 PCR로 증폭시켜 얻은32P가 표지된 529 bp 단편을 탐침으로 사용하여 노던 블럿 분석을 수행하였다.
노던 블럿 분석 결과, AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체로부터 분리한 RNA에서는 AC5의 전사체가 전혀 검출되지 않은 반면, AC5 +/+ 야생형의 선조체로부터 분리한 RNA에서는 7 및 8.5 Kb에서 AC5 전사체가 검출되어, AC5 유전자에 돌연변이가생긴 AC5-/- 형질전환 마우스에서 AC5 유전자가 발현되지 않음을 확인하였다(도 1c).
상기 형질전환 마우스의 AC5 유전자의 결실은 면역조직화학적 분석을 통해서도 확인할 수 있다. 구체적으로, 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining)을 위하여 뇌 절편을 바이브라톰(vibratome, 독일 라이카사)에 의해 40 ㎛ 두께로 자르거나 동결절단기(cryostat)에 의해 14 ㎛ 두께로 자른 후 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 15 분간 처리하여 고정하였다. 폴리클로날 항-AC5 항체(polyclonal anti-AC5 abtibody)는 Santa Cruz사(미국)로부터 구입하여 사용하였다.
면역조직화학적 분석 결과, AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체를 포함하는 뇌 절편에서는 항-AC5 면역반응(anti-AC5 immunoreactivity)이 검출되지 않은 반면, AC5+/+ 야생형 마우스의 뇌 절편에서는 항-AC5 면역반응이 매우 강하게 검출되었다(도 1d). 이러한 결과는 상기의 서던 및 노던 블럿 분석 결과와 일치하는 것이다.
따라서, 본 발명은 AC5 넉아웃 카세트를 이용하여 동형 재조합에 의해 AC5 유전자가 결실된 AC5-/- 형질전환 마우스를 제조하였으며, 상기 형질전환 마우스에서 AC5 유전자가 결실되어 발현되지 않음을 확인하였다.
<1-3> AC5 유전자가 결실된 형질전환 마우스의 조직학적 분석
본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스들은 그들의 야생형 자손들과 외형적으로 커다란 차이를 보이지 않으며, 다만 몸무게가 초기 29주 동안 AC5+/+ 야생형 마우스의 90 내지 95% 정도로 감소하였다.
AC5는 수정란의 발생과정 및 성체의 일생 동안 심장과 신장의 기능에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 AC5 유전자가 결실된 AC5-/- 형질전환 마우스의 심장과 신장에 어떠한 변화가 나타나는지를 확인하기 위하여 조직학적 분석을 수행하였다. 조직학적 분석 결과, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 몸무게와 심장 및 신장의 현미경적 조직을 포함하는 대부분의 조사에서 야생형 자손과 별 다른 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과를 고려할 때, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스에서 AC5 유전자의 결실은 마우스의 발생과정 중에 약간의 지연된 성장을 유발하지만 AC5 유전자가 마우스의 발생과 생존에 필수적인 것은 아님을 나타낸다.
<실시예 2> AC5-/- 형질전환 마우스의 운동능력 측정
상기 실시예 1에서 제조된 AC5-/- 형질전환 마우스에서 AC5 유전자의 유전적 변화가 형질전환 마우스의 운동능력과 어떠한 관계가 있는지 확인하기 위하여, 새로운 환경에 노출되었을 경우 주변 환경을 탐사하기 위하여 발생하는 운동능력을 조사하는 오픈 필드 실험(open field test)을 수행하였다.
걷기, 뛰기, 기어오르기, 쥐어잡기, 똑 바로서기 및 먹기와 관련된 움직임등을 일반적인 운동능력이라고 볼 때, AC5-/- 형질전환 마우스는 AC5+/+ 야생형 자손과 비교하여 정상적인 운동능력을 나타내었으며, 소뇌성 비정상운동(ataxia) 또는 말단떨림(tremor)과 같이 운동능력의 이상을 나타내는 명백한 신호를 보이지 않았다. 또한, AC5-/- 형질전환 마우스의 기본 운동능력은 AC5+/+ 야생형 마우스의 운동능력보다 약간 증가하였다(도 3a). 일반적으로, AC5+/+ 야생형 마우스에서는 시간이 지남에 따라 주변 환경에 적응하게 되어 탐사 행동이 감소하는 양상을 보이는데, AC5-/- 형질전환 마우스에서 관찰되는 기본 운동능력에 있어 미세한 증가현상은 이와 같은 탐사 행동의 시간-의존적 감소현상의 부재와 관계가 있다(도 3b).
<실시예 3> AC5-/- 형질전환 마우스의 AC 활성 측정
AC5 유전자의 돌연변이에 의해 상실된 AC 활성을 측정하기 위하여, AC5-/- 형질전환 마우스와 야생형 마우스 자손의 뇌 조직에서 AC 활성을 측정하여 비교하였다.
구체적으로, AC 활성을 측정하기 위하여125I-cAMP 및 항-cAMP 항체(anti-cAMP antibody, Amersham)를 사용하는 방사선 면역분석(radioimmunoassay)을 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 10 내지 17주령의 어른 마우스로부터 뇌를 적출하여 상기 실시예 1의 (1-4)와 동일한 방법으로 절편을 만든 후, 뇌 절편을 15분 동안 15,000 g로 원심분리하여 막 단편(membrane fraction)을 얻었다. 상기 막 단편에 10 μM의 폴스콜린(forskolin, 시그마사)을 처리하여 30℃, 15분 동안 in vitro 상태에서 반응시켜 AC 활성을 유도하였다.
뇌 선조체에 폴스콜린을 처리한 후 방사선면역분석 결과, 폴스콜린을 처리하지 않은 상태에서는 AC5-/- 형질전환 마우스의 기본 AC 활성이 AC5+/+ 야생형 자손의 AC 활성과 비교하여 별 다른 차이를 나타내지 않았다. 하지만, 폴스콜린을 처리하여 AC 활성을 유도한 결과, AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서의 AC 활성은 AC5+/+ 야생형 자손의 AC 활성의 18% 정도로 매우 낮았고, AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서 폴스콜린에 의한 AC 활성의 증가 정도는 AC5+/+ 야생형 자손의 약 1/3 정도 수준이었다(도 2a).
또한, 상기와 동일한 방법으로 대뇌(cerebrum)의 전두 피질(frontal cortex)에서의 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 자손의 AC 활성을 측정하여 비교하였다. 폴스콜린을 처리하여 AC 활성을 유도한 경우, 대뇌의 전두 피질에서도 선조체에서와 동일하게 AC5-/- 형질전환 마우스의 폴스콜린-유도 AC 활성이 AC5+/+ 야생형 자손의 AC 활성보다 73% 정도 낮았다(도 2b).
상기 결과와 같이, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 AC5 유전자가 결실되어 야생형 자손에 비하여 폴스콜린-유도 AC 활성이 상당히 감소된 양상을 보였다. 하지만, 폴스콜린을 처리하지 않은 대조구에 비해서는 폴스콜린을 처리한 경우에 AC5-/- 형질전환 마우스의 AC 활성이 증가되는 양상을 나타내었다. 이는 야생형 마우스에 존재하는 AC5가 뇌의 선조체에서 주요한 AC로 작용하지만 AC5 이외에도 부가적인 AC가 동일한 뇌 조직에 존재함을 암시한다. 정상 마우스의 대뇌 전두 피질에서 역시 AC 활성의 대부분이 AC5에 의해 조절되지만 폴스콜린-유도 AC 활성의 상당 부분이 AC5가 아닌 또 다른 AC에 의해 나타남을 알 수 있다.
<실시예 4> AC5-/- 형질전환 마우스의 잔여 AC 활성 측정
<4-1> AC5와 D1 수용체 시스템의 작용기작
본 발명자들은 AC5가 정상 마우스의 선조체에서 주된 AC5 활성을 담당함을 확인하고(도 2), 정상 마우스에서 AC5가 D2 수용체 뿐 아니라 D1 수용체를 위한 중요한 신호 전달자인지를 조사하였다.
우선, GTP를 첨가한 경우에 AC5 (+/+) 야생형 마우스에서는 기저 AC5 활성이 증가되었으나, AC5 (-/-) 형질전환 마우스에서는 별다른 변화를 나타내지 않았다(도 4a). 반면, D1 수용체 작용제인 SKF38393을 첨가한 경우에는 야생형 마우스의 AC 활성이 현저하게 감소하였으나 AC5 (-/-) 형질전환 마우스의 선조체에서는 AC5 활성이 증가하였다(도 4b). AC5 (-/-) 형질전환 마우스의 선조체에서는 AC5 활성은 야생형 마우스에 비하여 약 22% 정도 증가하였는데, 이러한 결과는 D2 수용체와 같이 대부분의 D1 도파민 수용체들이 정상 마우스에서 주된 작용기로서 AC5를 사용함을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 상기 실시예 3에 나타난 바와 같이 AC5에 유전적 결함을 갖는 AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서 관찰되는 잔존 AC 활성이 AC5 이외의 다른 타입의 AC와 관련되어 있음을 확인하기 위하여, AC5에 대한 수용체-효과기 반응을 조사하였다. 구체적으로, 정신운동성 촉진제(psychomotor stimulants) 또는 항정신병 약제(antipsychotic drugs)를 사용하여 기저 신경절 시스템(basal ganglia system)의 신경 반응과 관련된 수용체-효과기 반응을 유도한 후 오픈 필드실험을 통해 행동 양상을 분석하였다.
먼저, AC5가 D1 도파민 수용체 활성을 위한 필수적인 전달자(transducer)인지를 확인하기 위하여, D1 작용제(agonist) SKF38393(토크리스사) 50 ㎎/㎏을 AC5-/- 형질전환 마우스 및 AC5+/+ 야생형 자손의 복강내로 투여한 후 수평 운동능력의 변화를 관찰하였다. 그 결과, AC5+/+ 야생형 자손 및 AC5-/- 형질전환 마우스 모두 D1 작용제를 투여하지 않은 대조군에 비하여 수평 운동능력이 증가되었으며, 특히 AC5-/- 형질전환 마우스에서는 수평 운동능력이 2배 이상 증가하는 양상을 나타내었다(도 4c).
또한, 0.3 ㎎/㎏의 D1 길항제(antagonist) SCH23390(토크리스사)을 각 마우스의 복강내로 투여하여 운동능력을 조사한 결과, AC5-/- 형질전환 마우스의 수평 운동능력은 D1 길항제를 투여하지 않은 대조군에 비하여 상당히 억제되는 것이 관찰되었는데(도 4d), 이러한 결과는 AC5-/- 형질전환 마우스의 D1 수용체 시스템이 AC5 유전자의 유전적 변이에도 불구하고 기능적으로는 여전히 온전하게 작동함을 암시하며, 또한 D1 수용체 시스템이 AC5 이외의 다른 AC에 결합하거나 또는 AC 이외의 다른 효과기에 결합함을 나타내는 것이다.
<4-2> AC5와 D2 수용체 시스템의 작용기작
본 발명은 상기 실시예 <4-1>에서와 같이 AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에서 관찰되는 잔여 AC 활성이 D1/AC 결합에 의한 것인지 또는 다른 수용체와 AC와의 결합에 의한 것인지를 조사하였다.
<4-2-1> AC5와 D2 수용체 시스템의 관계
AC5와 D2 수용체 사이의 결합관계를 알아보기 위하여, D2 길항제인 설피라이드(sulpiride, 토크리스사)를 마우스에 투여하여 운동능력의 변화를 관찰하였다.
구체적으로, 9 내지 18주령의 AC5-/- 형질전환 마우스 및 AC5+/+ 야생형 마우스 자손을 선택하여 이들 각각을 측정용 공간에 넣어 이들의 운동성 행동을 비디오 녹화 후 차후 TV 화면으로 이들의 움직임을 관찰 분석하였다. 측정용 공간은 너비 60 ×60 ㎠에 높이가 40 ㎝이고 바닥에는 5 ×5 정방형 모양으로 선이 그어져 있다. 실험 챔버안에 들어간 동물들은 30분 정도 그대로 방치하여 환경에 적응시킨 후 환경 적응 후반기에 D2 길항제로 작용하는 설피라이드를 투여하였다. 이때, 설피라이드는 투여량이 50 ㎎/㎏이 되도록 0.9% 식염수 120 ㎕에 용해시켜 실험동물의 복강내로 투여한 후 각 실험동물들의 운동능력 변화를 관찰하였다. 이 때, 수평 운동능력은 60분 동안(환경 적응 후부터 60분) 실험동물들이 실험 챔버 바닥의 5 ×5 정방형 모양의 선을 가로지르는(line-crossovers) 횟수를 세어 나타내었으며, 대조군으로 무조작의 야생형 마우스를 사용하여 기본적인 운동능력을 관찰하였다.
그 결과, D2 길항제 설피라이드는 관찰기간 내내 야생형 자손의 운동능력을 대조군에 비하여 상당히 억제시킨 반면, 동일한 양이 투여된 AC5-/- 형질전환 마우스에서는 이와 같은 운동능력의 억제가 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 오히려 D2 길항제 설피라이드를 투여하지 않은 대조군에 비하여 눈에 띄게 움직임이증가하였다(도 5). 이러한 AC5-/- 형질전환 마우스에서 D2 길항제 설피라이드에 대한 신경마비성 반응(neuroleptic responsiveness)이 완벽하게 사라지고 오히려 운동능력이 증가하는 결과는 AC5 유전자의 유전적 결함이 D2 수용체 시스템에서 정상적으로 시작되는 신호전달 기작의 흐름(signaling flow)을 방해하는 것을 의미한다. 따라서, 정상 쥐에서는 AC5가 D2 수용체에 결합함을 알 수 있고, 이러한 결과는 D2 수용체와 AC5가 선조체의 동일한 신경세포에 함께 존재한다는 이전의 연구결과와 일치하는 것이다(Mons N, Cooper DMF.,Brain Res. Mol. Res., 22, 236-244, 1993).
<4-2-2> AC5-/- 형질전환 마우스에서 D1 또는 D2 수용체의 정상 발현 확인
본 발명자들은 상기와 같이 AC5-/- 형질전환 마우스에서 관찰되는 설피라이드의 작용에 대한 신경마비성 반응의 부재가 D1 또는 D2 수용체 발현의 변화에 의한 것이 아니라 수용체에서 효과기로의 신호전달 기작의 억제에 의한 것임을 다음과 같은 실험을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 도파민 수용체-리간드 결합 분석(dopamine receptor-ligand binding assay)를 수행하여 선조체에서의 D1 및 D2 수용체의 밀도를 측정하였다. 먼저, 실시예 2와 동일한 방법으로 뇌 선조체의 막 단편을 준비한 후3H-SCH23390 또는3H-스피페론(3H-spiperone)을 사용하여 도파민 수용체-리간드 결합 분석을 실시하였다. 이 때, 비특이적 결합을 억제하기 위하여 냉각시킨 SCH23390 또는 부타클라몰(butaclamol)을 사용하였다. 이와 같이 측정한 각 D1 및 D2 길항제에 대한 선조체에서의 D1 및 D2 수용체의 밀도를 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1> 선조체에 존재하는 D1 및 D2 수용체의 밀도
3H-SCH23390 3H-스피페론
+/+ 2.16 +/- 0.30 (n=10) 1.47 +/- 0.10 (n=8)
-/- 2.22 +/- 0.28 (n=10) 1.25 +/- 0.09 (n=8)
상기표 1에 나타난 바와 같이, D1 길항제3H-SCH23390을 이용하여 수용체 결합을 조사한 결과, 선조체에서 D1 수용체의 농도는 야생형 자손에서 2.16 +/- 0.30 pmol/㎎ 단백질이고 AC5-/- 형질전환 마우스에서 2.22 +/- 0.28 pmol/㎎ 단백질로서, 두가지 유전형질 모두에서 거의 동일한 양이 검출되었다. 또한, D2 길항제3H-스피페론을 이용한 수용체 결합 조사 결과, 선조체에서 검출된 AC5-/- 형질전환 마우스와 야생형 자손의 D2 수용체의 농도 역시 야생형 자손에서 1.47 +/- 0.10 pmol/㎎ 단백질이고 AC5-/- 형질전환 마우스에서 1.25 +/- 0.09 pmol/㎎ 단백질로서 커다란 차이를 보이지 않았다. 이 외에도 D2 리간드125I-설피라이드를 뇌 조직 절편에 사용하여 수용체 결합을 조사한 결과, AC5-/- 형질전환 마우스의 선조체에 존재하는 D2 수용체 역시 야생형 자손의 선조체에 존재하는 것에 상응함을 나타내었다. 따라서, AC5-/- 형질전환 마우스에서 관찰되는 설피라이드의 작용에 대한 반응양상은 수용체의 발현양상의 변화에 기인하는 것이 아님을 알 수 있다.
<실시예 5> 할로페리돌의 작용에 대한 AC5-/- 형질전환 마우스의 반응
본 발명자들은 D2 수용체가 AC5와 실제로 결합함을 근거로, D2 수용체가 주된 표적으로 알려진 전형적인 항정신병 약제인 할로페리돌(haloperidol)의 약리적 기작을 밝히기 위하여 AC5-/- 형질전환 마우스를 이용하였다. AC5-/- 형질전환 마우스 및 야생형 자손에 할로페리돌을 0.3, 1.0 및 3 ㎎/㎏ 용량으로 복강내에 투여한 후 이들의 운동능력 변화를 관찰한 결과, AC5-/- 형질전환 마우스에서 할로페리돌은 행동능력에 있어 어떠한 억제현상도 유발하지 않았는데, AC5-/- 형질전환 마우스는 할로페리돌이 0.3 및 1.0 ㎎/㎏ 투여되었을 경우, 오히려 대조군에 비하여 현저하게 운동능력이 증가되었다. 단지, 할로페리돌이 3.0 ㎎/㎏ 투여된 경우에서만 대조군 수준의 운둥능력을 보였다. 한편, 동일한 양의 할로페리돌이 투여된 야생형 쥐에서는 약제물 투여 후 1 시간여만에 세 가지 용량의 할로페리돌을 투여한 경우 모두에서 운동능력이 현저하게 감소하여 눈에 띄는 움직임 없이 단지 호흡만이 유지되는 냉동된 상태에 가까운 모습이 관찰되었다(도 6a및도 6b). 이러한 결과는도 5에 나타난 결과와 함께 뇌에서 할로페리돌의 약학적 작용에 있어 주된 경로로서 D2/AC5 시스템이 필수불가결한 신호전달 체계임을 암시한다.
또한, 상당히 낮은 용량의 0.3 ㎎/㎏의 할로페리돌이 투여된 AC5-/- 형질전환 마우스를 대상으로 한 오픈 필드 실험에서 역시 AC5-/- 형질전환 마우스의 극도로 활발한 움직임이 관찰되었는데, 이는 할로페리돌의 약학적 작용에 있어 운동능력을 향상시키는 또 다른 기작이 존재함을 암시한다. 즉, 뇌 선조체의 신경세포내 D2/AC5 시스템만이 할로페리돌의 유일한 표적이 아님을 나타낸다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 D2 도파민 수용체 시스템은 손상된 반면 D1 도파민 수용체 시스템은 온전하게 작동하는 AC5-/- 형질전환 마우스를 제공한다. 본 발명자들은 상기 형질전환 마우스를 이용하여 D2 수용체 시스템은 AC5와 결함하여 작용하는 반면 D1 수용체 시스템은 AC5와 관계없이 작용한다는 사실과 AC5가 전형적인 항정신병 약제인 할로페리돌의 작용에 있어 매우 중요한 성분임을 입증하였다. 따라서, 장기간 사용시 유사 파킨슨병(Parkinsonism) 및 지연성 운동장애(Tardive dyskinesia) 등의 심각한 부작용을 초래하는 할로페리돌을 포함하는 항정신병 약제의 부작용을 고려할 때, 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스는 항정신병 약제의 약학적 작용 기작을 밝히는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 기저 신경절 시스템의 약학적 및 생리학적 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. D2 도파민 수용체 시스템(D2 dopamine receptor system)은 손상된 반면 D1 도파민 수용체 시스템은 온전하게 작동하는 AC5 유전자(type 5 adenylyl cyclase)가 결실된 AC5-/- 형질전환 마우스.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 AC5 유전자가 결실된 AC5-/- 형질전환 마우스의 수정란(수탁번호 : KCTC 0840BP).
  4. 삭제
  5. (1) AC5 유전자를 포함하는 AC5 게놈 DNA 클론을 얻는 단계;
    (2) 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 AC5 넉아웃 카셋트를 제조하는 단계;
    (3) 상기 넉아웃 카셋트를 배아간세포에 형질감염시키는 단계;
    (4) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하는 단계 ;
    (5) 상기 배아간세포가 주입된 포배강을 대리모의 자궁에 이식하여 카이메라 마우스(chimera mouse)를 얻는 단계;
    (6) 상기 카이메라 마우스를 교배시켜 AC5 (+/-) 유전형질을 갖는 이형접합체 F1 형질전환 마우스를 얻는 단계; 및
    (7) 상기 F1 형질전환 마우스를 교배시켜 AC5 (-/-) 유전형질을 갖는 동형접합체 F2 형질전환 마우스를 얻는 단계를 포함하는 형질전환 마우스의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 단계 (2)의 AC5 넉아웃 카셋트는 AC5 유전자의 5' 말단 엑손 부분과 3' 말단 엑손 부분을 벡터 pGK-neo의 양쪽 말단에 서브클로닝하여 제조되는 것을 특징으로 하는 형질전환 마우스의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 5' 말단 엑손 부분은 AC5 유전자의 5' 말단에 존재하는 BamHI 제한효소 부위로부터 AC5 유전자의 엑손 일부분을 포함하는 2.2 Kb 절편인 것을 특징으로 하는 형질전환 마우스의 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서, 3' 말단 일부분은 AC5 유전자의 엑손 3' 말단을 포함하는 제한효소 부위 ApaI과 XhoI 사이의 5.3 Kb 절편인 것을 특징으로 하는 형질전환 마우스의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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