JP5066710B2

JP5066710B2 - 精神発達遅滞の非ヒトモデル動物及び精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法

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Publication number: JP5066710B2
Application number: JP2007014795A
Authority: JP
Inventors: 均岡澤
Original assignee: 国立大学法人東京医科歯科大学
Priority date: 2007-01-25
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2027-01-25
Also published as: JP2008178351A

Description

本発明は、精神発達遅滞の非ヒト動物モデル及び精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。

精神発達遅滞（ＭＲ）とは、精神の発達停止あるいは発達不全の状態であり、発達期に明らかになる全体的な知能水準に寄与する能力、例えば認知、言語、運動及び社会的能力の障害によって特徴づけられる。精神発達遅滞は、さまざまな原因によって引き起こされ、染色体異常や、妊娠出産時の事故などといった脳の発達に支障を及ぼす要因が原因になり得る。

一方で、ＰＱＢＰ−１（Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｔｒａｃｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）は転写因子であるＢｒｎ２のポリグルタミン配列に結合するタンパク質として同定され、ポリグルタミン病原因遺伝子であるａｔａｘｉｎ−１（ＡＴ−１）やｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ（Ｈｔｔ）と共局在及び相互作用する事が報告されている。また、ＰＱＢＰ−１は、ヒトにおいてはＸ染色体に位置し、３つの主要な領域がある事が知られている。一つは、ＲＮＡポリメラ−ゼＩＩと結合するＷＷ領域（ＷＷＤ）。二つ目は、スプライシング因子複合体Ｕ５の構成成分であるＵ５−１５ｋＤと相互作用する事が判っているＣ末端領域（ＣＴＤ）。そして、ポリグルタミン病の原因遺伝子に含まれるポリグルタミン配列と結合するｐｏｌａｒ−ｒｉｃｈａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｐｅａｔ領域（ＰＲＤ）である。これらの構造上の特徴から、ＰＱＢＰ−１はポリグルタミン病のみならず、転写やＲＮＡ代謝など生物の生命活動に不可欠なプロセスに関与していることが示唆される（例えば、非特許文献１参照）。

最近では、ＰＱＢＰ−１遺伝子中のＷＷＤとＣＴＤ間の結合領域での挿入又は欠損により高頻度でヒト精神発達遅滞が引き起こされると共に、ＣＴＤ内に変異をもつ精神発達遅滞患者には、この領域の部分的な欠損がみられる事が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
また、現在までＰＱＢＰ−１は、Ｒｅｎｐｅｎｎｉｎｇ症候群やＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ−Ｈａａｎ症候群、Ｇｏｌａｂｉ−Ｉｔｏ−Ｈａｌｌ症候群として知られるＸ染色体関連精神発達遅滞の原因遺伝子であることが報告されている。

しかしながら、ＰＱＢＰ−１遺伝子は生物種によって構造が大きく異なっている場合もあり、ヒト以外の生物における機能及び作用機序については、不明な点が多い。特に、精神発達遅滞におけるＰＱＢＰ−１の病的機能については、全く判明しておらず、ＰＱＢＰ−１遺伝子を標的とした精神発達遅滞のモデル動物については、未だに作成されていない。

ＯｋａｚａｗａＨ，ＳｕｄｏｌＭ，ＲｉｃｈＴ．ＰＱＢＰ−１（Ｎｐ／ＰＱ）：Ａｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｔｒａｃｔ−ｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｎｕｃｌｅａｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎ−ｆｏｒｍｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ．ｒｅｖｉｅｗ．．ＢｒａｉｎＲｅｓＢｕｌｌ２００１１；５６（３−４）：２７３−８０．ＫａｌｓｃｈｅｕｅｒＶＭ，ｅｔａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１ｇｅｎｅｃａｕｓｅＸ−ｌｉｎｋｅｄｍｅｎｔａｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ．ＮａｔＧｅｎｅｔ．２００３２３；３５（４）：３１３−５．

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、精神発達遅滞の非ヒトモデル動物を提供することを目的とする。また、本発明は、前記精神発達遅滞の非ヒトモデル動物を用いて、精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、ヒトＰＱＢＰ−１の相同遺伝子であるｄＰＱＢＰ−１を機能欠損させた、精神発達遅滞の非ヒトモデル動物としてのショウジョウバエは、学習獲得能力の低下、寿命短縮、性行動の亢進、概日時計の乱れといった、行動異常が引き起こされるという知見である。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ＰＱＢＰ−１の機能が欠損している精神発達遅滞の非ヒトモデル動物を用いたことを特徴とする精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法である。
＜２＞ＰＱＢＰ−１遺伝子の変異によって、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しているモデル動物を用いた前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞ＰＱＢＰ−１遺伝子内のＷＷ領域の変異によって、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しているモデル動物を用いた前記＜２＞に記載の方法である。
＜４＞ＰＱＢＰ−１遺伝子の発現制御領域の変異によって、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しているモデル動物を用いた前記＜１＞に記載の方法である。
＜５＞染色体上の両アレルに前記変異を有するモデル動物を用いた前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞学習獲得能力の低下、寿命短縮、性行動の亢進及び概日時計の乱れのうち、少なくともいずれか一つを有するモデル動物を用いた前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞動物がショウジョウバエであるモデル動物を用いた前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞学習獲得能力、寿命、性行動及び概日時計のうち、少なくともいずれか一つを測定する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。

本発明によれば、精神発達遅滞の非ヒトモデル動物及び精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法を提供することができる。

以下、本発明の精神発達遅滞の非ヒトモデル動物について詳細に説明する。
（精神発達遅滞の非ヒトモデル動物）
本発明の精神発達遅滞の非ヒトモデル動物は、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損していることを特徴とする。

＜ＰＱＢＰ−１＞
本発明において、「ＰＱＢＰ−１」（Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｔｒａｃｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）とは、転写因子であるＢｒｎ２のポリグルタミン配列に結合するタンパク質として同定され、ポリグルタミン病原因遺伝子であるａｔａｘｉｎ−１（ＡＴ−１）やｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ（Ｈｔｔ）と共局在及び相互作用する事が報告されている。
なお、ＰＱＢＰ−１の呼称は種によって異なり、例えば、ショウジョウバエの場合には、ｄＰＱＢＰ−１と呼ばれている。

本発明において、「ＰＱＢＰ−１の機能が欠損している」とは、ＰＱＢＰ−１遺伝子がコードしているＰＱＢＰ−１タンパク質の機能が欠損していることを意味し、具体的には、ＰＱＢＰ−１タンパク質の産生量が欠損ないし低下している場合や、ＰＱＢＰ−１タンパク質の産生量に変化がなくてもＰＱＢＰ−１タンパク質の活性が欠損ないし低下している場合を含む。

ここで、前記「ＰＱＢＰ−１タンパク質の活性」とは、ＰＱＢＰ−１タンパク質が本来有する活性であって、前記活性の欠損ないし低下によって動物が精神発達遅滞の症状を呈するものであれば特に制限はなく、例えば、ポリグルタミン配列との結合活性、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合活性、スプライシング因子複合体Ｕ５の構成成分であるＵ５−１５ｋＤと相互作用する活性、転写抑制作用などが考えられる。

このようなＰＱＢＰ−１の機能の欠損は、ＰＱＢＰ−１遺伝子の変異やＰＱＢＰ−１遺伝子の発現制御領域の変異などにより生じさせることができる。また、ＰＱＢＰ−１の機能の欠損は、正常なＰＱＢＰ−１のタンパク質やｍＲＮＡを分解又はその活性を阻害する物質を産生させる改変により生じさせることもできる。

ＰＱＢＰ−１遺伝子の塩基配列は、例えばヒト、マウス、ナズナ、線虫、ショウジョウバエにおいて公知であり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる（例えば、ショウジョウバエｄＰＱＢＰ−１：ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＮＭ−１４３０７４）。また、公共データベースにその配列が登録されていない非ヒトモデル動物の場合には、常法により、既知の動物のＰＱＢＰ−１遺伝子との相同性から、そのＰＱＢＰ−１遺伝子をクローニングし、配列を決定することができる。

前記「ＰＱＢＰ−１遺伝子の変異」とは、ＰＱＢＰ−１遺伝子配列の欠失、置換、付加及び挿入のうち、少なくとも一つを含むものとする。前記ＰＱＢＰ−１遺伝子において前記欠失、置換、付加又は挿入を行う部位は、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しうる限り特に限定されるものではなく、エキソンだけでなくイントロンも含む。
さらに、本発明者らの知見により、ショウジョウバエの知能や他の行動に関してＰＱＢＰ−１遺伝子内のＷＷ領域が重要であることが示唆された。したがって、精神発達遅滞に関連するＰＱＢＰ−１の機能を欠損させるために、ＰＱＢＰ−１遺伝子の中でもＷＷ領域において変異していることが特に好ましい。ＷＷ領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合する領域として知られている。なお、ＷＷ領域が重要であるという知見に関しては、後記する実施例において詳細に説明する。

前記「ＰＱＢＰ−１遺伝子の発現制御領域の変異」とは、ＰＱＢＰ−１遺伝子の発現制御領域の欠失、置換、付加及び挿入のうち、少なくとも一つを含むものとする。前記発現制御領域としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、サプレッサーなどが挙げられ、前記発現制御領域において前記欠失、置換、付加又は挿入を行う部位は、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しうる限り特に限定されるものではない。
また、ポリアデニル鎖付加シグナル、ターミネーターなどの変異によりＰＱＢＰ−１遺伝子の発現を低下させてもよい。

そして、前記「ＰＱＢＰ−１遺伝子の変異」及び前記「ＰＱＢＰ−１遺伝子の発現制御領域の変異」により本発明の非ヒトモデル動物のＰＱＢＰ−１の機能を欠損させる場合には、染色体上の両アレルに同じ変異を有する方が、より確実にＰＱＢＰ−１の機能を欠損させることができる点で好ましい。ただし、変異した遺伝子にコードされるタンパク質がドミナントネガティブである場合には、染色体上の一方のアレルのみの変異であっても充分にＰＱＢＰ−１の機能が欠損しうるので、必ずしも染色体上の両アレルに同じ変異を有している必要はない。

−非ヒトモデル動物−
本発明における非ヒトモデル動物は、本来ＰＱＢＰ−１遺伝子を有する動物のうち、ヒト以外であればどのような動物であってもよく、「動物」には非ヒト哺乳動物だけでなく昆虫などの非脊椎動物も含むものとする。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、サルなどが用いられる。非脊椎動物としては、例えば、ショウジョウバエ、線虫などが用いられる。また、あらゆる「動物」の中では、ショウジョウバエが、Ｘ染色体関連精神発達遅滞の疾患モデル動物として既に利用されており、知見が蓄積されている点で特に好ましい。また、ショウジョウバエであれば、扱いが容易であり、繁殖させやすいという点でも非ヒトモデル動物として好ましい。

＜ＰＱＢＰ−１を欠損させた非ヒトモデル動物の作成方法＞
ＰＱＢＰ−１を欠損させた非ヒトモデル動物の作成方法としては、特に制限はなく、常法のトランスジェニック動物やノックアウト動物の作成方法から目的に応じて適宜選択することができる。ＰＱＢＰ−１遺伝子の塩基配列が既知の場合には、相同組替えを利用して欠損させることが好ましい。
具体的には、ターゲティングベクターを作成する工程、ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する工程、前記ＥＳ細胞を胚盤胞に導入する工程、及び、胚盤胞を仮親の子宮に移植する工程により作成する。なお、前記ターゲティングベクターには、通常、導入する変異の５’及び３’に連結された相同領域、ポジティブセレクション用のマーカーなどが含まれる。
また、非脊椎動物、例えば、昆虫であれば、トランスポゾン挿入、ＲＮＡｉ、化学物質誘発性遺伝子変異などにより作成することができる。

（精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法）
精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、本発明の精神発達遅滞の非ヒトモデル動物に対して、経口投与や静脈注射で候補物質を投与し、候補物質の投与前後で、精神発達遅滞の症状（異常行動）を測定する。そして、候補物質の投与前後での測定値を比較することにより、精神発達遅滞の症状の改善する活性を有する物質をスクリーニングすることができる。

前記スクリーニング方法において、学習獲得能力、寿命、性行動及び概日時計のうち、少なくともいずれか一つを測定することが好ましい。なお、本発明の精神発達遅滞の非ヒトモデル動物が、今後、新たな症状を有することが判明した場合には、新たに判明した症状を指標としてスクリーニングしてもよい。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１）
実施例１は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体のショウジョウバエについて、匂い条件付け学習・記憶解析を行った実施例である。

＜実験材料＞
−ショウジョウバエの系統−
ｗ^１１１８（ＣＳ）系統（野生型）は、神経科学総合研究所の斎藤実先生より供与された。
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン因子の遺伝子への導入により、ショウジョウバエＰＱＢＰ−１遺伝子が欠損した変異体ｗ；Ｐ｛ＦＲＴ（ｗ^ｈｓ）｝２ＡＰ｛ｎｅｏＦＲＴ｝８２ＢＰＢａｃ｛ＧＡＬ４Ｄ，ＥＹＦＰ｝ＣＧ１１８２０^{ＰＬ００１０９}（ｄＰＱＢＰ−１欠損変異系統）、及び、前記ｄＰＱＢＰ−１欠損変異系統と遺伝的背景が同様であるｗ；Ｐ｛ＦＲＴ（ｗ^ｈｓ）｝２ＡＰ｛ｎｅｏＦＲＴ｝８２Ｂ（正常系統）は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎｓｔｏｃｋｃｅｎｔｅｒより購入した。

購入した前記ｄＰＱＢＰ−１欠損変異系統のハエは、前記ｗ^１１１８（ＣＳ）系統と５回戻し交配を行い、遺伝的背景を野生型に合わせる事で、サイドエフェクトのないｗ；＋／＋；ＰＢａｃ｛ＧＡＬ４Ｄ，ＥＹＦＰ｝ＣＧ１１８２０^{ＰＬ００１０９}（ｄＰＱＢＰ−１欠損変異系統）を作成した。この戻し交配を行ったｄＰＱＢＰ−１欠損変異系統（以下、「ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体」と称する。）について、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子の欠損を確認するために、以下の試験（ａ）〜（ｃ）を実施した。

（ａ）ｄＰＱＢＰ−１遺伝子地図
常法に従って、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体におけるｄＰＱＢＰ−１遺伝子近傍の塩基配列を決定し、遺伝子地図を作成した。
図１は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体におけるｄＰＱＢＰ−１遺伝子とｐｉｇｇｙＢａｃの特徴・導入部位を示す地図である。図１に示すように、ｐｉｇｇｙＢａｃは、ハエの眼や脳周辺グリア細胞特異的に発現する内在性Ｐａｘ６遺伝子の制御下で働くＥＹＦＰ（黄色マーカー遺伝子）と転写活性遺伝子であるＧＡＬ４とを含む突然変異誘発トランスポゾン因子であり、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子の転写開始点より５０塩基部位に導入されていた。即ち、ｐｉｇｇｙＢａｃは、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子内のＷＷ領域に導入されていた。

（ｂ）蛍光顕微鏡観察
蛍光顕微鏡観察により、ｐｉｇｇｙＢａｃ導入マーカーであるＥＹＦＰの発現パターンを確認した。
図２は、野生型とｄＰＱＢＰ−１欠損変異体との蛍光顕微鏡像であって、（Ａ）は野生型の外観についての蛍光顕微鏡像、（Ｂ）はｄＰＱＢＰ−１欠損変異体の外観についての蛍光顕微鏡像、（Ｃ）は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体の頭部の凍結切片についての蛍光顕微鏡像である。図２（Ａ）で示す野生型ではＥＹＦＰの発現が確認できなかったのに対し、図２（Ｂ）で示すｄＰＱＢＰ−１欠損変異体では眼以外にもアンテナなどの数箇所の部位でＥＹＦＰの発現を確認できた。さらに、図２（Ｃ）に示すように、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体では、眼と神経系でのＥＹＦＰの発現を確認できた。

（ｃ）ノーザンブロット解析
ノーザンブロット解析により、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子の発現を調べた。ノーザンブロット解析は、以下の手順で行った。
ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体の頭部を採取し、ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。その後、ＭＯＰＳバッファー中のホルムアルデヒド−アガロースゲルで、１５μｇのＲＮＡを電気泳動して分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブラン（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にＲＮＡを転写した。メンブランに転写したＲＮＡをＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ（１２００００μＪ／ｃｍ^２）でメンブレンに固定した。プローブはｄＰＱＢＰ−１ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩＤＮＡ断片を用いた。プローブを［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて放射標識し、ＲＮＡを転写したメンブレンに６０℃、一晩、ハイブリダイズした。１×ＳＳＣバッファー，０．１％ＳＤＳ，５０℃，２０分で二回洗った。メンブレンをＸ線フィルムに当て、−８０℃で適当な時間置いた後、バンドを検出した。野生型及びｗ；Ｐ｛ＦＲＴ（ｗ^ｈｓ）｝２ＡＰ｛ｎｅｏＦＲＴ｝８２Ｂ（正常系統）についても、同様に解析した。

図３は、ノーザンブロット解析の結果を示す図である。図３に示すように、野生型及びｗ；Ｐ｛ＦＲＴ（ｗ^ｈｓ）｝２ＡＰ｛ｎｅｏＦＲＴ｝８２Ｂ（正常系統）ではｄＰＱＢＰ−１遺伝子の発現が見られたのに対し、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体ではｄＰＱＢＰ−１遺伝子の発現は全く見られなかった。

以上のようにｄＰＱＢＰ−１遺伝子の欠損が確認された、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体について、匂い条件付け学習・記憶解析を行った。なお、対照としては野生型を用いた。

＜方法＞
匂い条件付け学習・記憶解析の評価方法としては、１９８５年にＴｕｌｌｙらによって開発されたティーチングマシンによる匂い条件付けを採用した。具体的には、以下の手順で行った。
約１００匹のハエをトレーニングチャンバーに入れ、まず３−Ｏｃｔａｎｏｌ（ＯＣＴ）を嗅がせながら電気ショック（６０Ｖ）を１分間与える。次いで４−Ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｌ（ＭＣＨ）を電気ショックなしで１分間嗅がせる。ＯＣＴと電気ショックの関係を学習したハエは、テストで２つの匂いを嗅がせた時に、電気ショックのなかったＭＣＨの方（正解）のチューブに移動する。正答率は、ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＩｎｄｅｘ（ＰＩ）として、下記（１）式により算出した。次に電気ショック時に嗅がせる匂いをＭＣＨにして同様の操作を行い、２つのＰＩ値の平均値を算出した（ｎ＝１）。
なお、０時間後の記憶特性はトレーニング直後にテストを行うことで評価した。１時間後及び３時間後の記憶特性は、トレーニングを１回実施してから１時間後及び３時間後にテストを行うことで評価した。２４時間後の記憶特性は、トレーニングを１時間毎に５回実施してから２４時間後にテストを行うことで評価した。

・・・・・・（１）

＜結果＞
図４は、匂い条件付け学習・記憶解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、０〜３時間後の記憶特性を示すグラフであり、（Ｂ）は２４時間後の記憶特性を示すグラフである。
図４（Ａ）で示すように、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）は、匂いと電気刺激を関連づけてハエに覚えさせるトレーニングを行ってから直後に匂いをテストする０時間記憶（学習獲得能力テスト）が、野生型よりも顕著に低いことが判った。しかしながら、その後の記憶保持に関しては、１時間・３時間までの記憶の低下が野生型と同様のパターンを示す事から、短期記憶から中期記憶までの記憶保持は正常であることが示唆された。

また、図４（Ｂ）で示すように、長期記憶を評価する２４時間記憶解析においても野生型に比べｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）では記憶の大幅な減少が見られたが、一定の記憶は保持されていた。

実施例１によれば、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体の学習獲得能力は顕著に低下するが、学習段階以降の記憶過程においては、正常に記憶は保持されることが判った。

（実施例２）
実施例２は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体のショウジョウバエについて、匂い回避嗅覚機能及び電気刺激感覚・運動機能解析を行った実施例である。
なお、実施例２で用いたｄＰＱＢＰ−１欠損変異体及びその対照としての野生型は、実施例１の＜実験材料＞で記載されたものと同じであるので、説明は省略する。

＜方法＞
匂い回避嗅覚機能解析の評価方法としては、実施例１の匂い条件付け学習・記憶解析で用いたティーチングマシンにおいて、匂い物質（ハエの嫌う匂い）ＯＣＴ又はＭＣＨをそれぞれ別々に空気（無臭）と同時に９０秒間嗅がせ、ＯＣＴ又はＭＣＨの匂いに対して匂いのない方向へ逃げたハエの数を前記（１）式に当てはめ、ＰＩ値を算出する事で匂い回避嗅覚機能を評価した。なお、実施例２で使用したＯＣＴ又はＭＣＨの濃度は、実施例１の匂い条件付け学習・記憶解析時に用いたものと同じ濃度（原液濃度）と１／１０濃度である。

電気刺激感覚・運動機能解析の評価方法としては、６０Ｖ及び２０Ｖの電気刺激と電気刺激のない条件を９０秒間同時に与え、電気が流れるグリッドから、電気刺激のないチューブに逃げたハエの数より、匂い回避嗅覚機能解析と同様にＰＩ値を算出し、電気刺激に対する感覚・運動機能を評価した。

＜結果＞
表１は、匂い回避嗅覚機能及び電気刺激感覚・運動機能解析の結果を示す表である。

表１に示すように、匂い回避嗅覚機能において、野生型とｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（表中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）と間に差は見られなかった。また、電気刺激感覚・運動機能においても、野生型とｄＰＱＢＰ−１欠損変異体との間に差は見られなかった。

実施例２によれば、学習・記憶能力値に影響する要因として考えられる匂いに対する嗅覚機能及び電気刺激に対する感覚・運動機能が、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体において正常であることが示された。したがって、実施例１の匂い条件付け学習・記憶解析の結果は、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子欠損依存的に引き起こされたことが示唆された。さらには、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体において、匂い記憶の中枢であるキノコ体や匂い刺激を伝える投射神経で、形態的又は機能的変化が引き起こされている可能性が示唆された。

（実施例３）
実施例３は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体のショウジョウバエについて、寿命解析を行った実施例である。
なお、実施例３で用いたｄＰＱＢＰ−１欠損変異体及びその対照としての野生型は、実施例１の＜実験材料＞で記載されたものと同じであるので、説明は省略する。

＜方法＞
寿命解析の評価方法は以下の手順で行った。
ハエを孵化後から４時間以内にバージンの状態で採取し、通常のエサ（コーンミール／アガー含む）の入ったバイアル１本につき雄・雌それぞれ２５匹ずつ分けて回収した。これを各８バイアルずつ（ｗ^１１１８（ＣＳ）系統とショウジョウバエＰＱＢＰ−１欠損変異体を、それぞれ雄２００匹・雌２００匹、計４００匹ずつ）用意し、解析を試みた。ハエの飼育は、通常の飼育条件である室温２５℃・湿度６０％の条件下で行った。ハエは３日毎に新しいエサバイアルに移し、死んだハエの数を記録し、日毎のハエ生存率を算出し評価した。この解析は、全てのハエが死ぬまで行った。

＜結果＞
図５は、寿命解析の結果を示すグラフである。
図５に示すように、野生型よりもｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）では全体的に極端に寿命が短くなっていた。さらに、これら２つの系統間での最長寿命においても１０日以上の差が見られた。

実施例３の結果によれば、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子欠損依存的にハエの寿命が極端に短くなっていることが判った。

（実施例４）
実施例４は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体のショウジョウバエについて、性行動解析を行った実施例である。
なお、実施例４で用いたｄＰＱＢＰ−１欠損変異体及びその対照としての野生型は、実施例１の＜実験材料＞で記載されたものと同じであるので、説明は省略する。

＜方法＞
性行動解析の評価方法としては、１９９９年にＭｃＢｒｉｄｅらよって確立された性行動解析を用いた。具体的には、以下の手順で行った。
テストに用いるハエ（雄）は、孵化してから４時間以内にバージンの状態で麻酔をかけ、エサ入りバイアルに採取し、明期・暗期が１２：１２時間の条件下で４−６日間飼育した後、解析に用いた。また、前記テストバエの対象のハエ（ｗ^１１１８（ＣＳ）系統）は、孵化してから３時間以内のバ―ジンの雌、又は、孵化後３０分以内に採取し、孵化３時間以内のバージンの雄を用いた。
解析は、直径１５ｍｍ，深さ５ｍｍのガラス交配チャンバー（Ｉｋｅｄａ工房）中に、麻酔をかけていないテスト雄ハエとバージン雌又はバージン雄を同時に入れ、１０分間観察する事で行った。ＣｏｕｒｔｓｈｉｐＩｎｄｅｘ（ＣＩ）は、１０分間の観察時間に対し、テストハエが対象ハエに求愛行動を示した時間の割合から評価した。全ての解析は、明期に行った。

＜結果＞
図６は、性行動解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、テストバエ雄の対象ハエ雌への性行動を示すグラフであり、（Ｂ）は、テストバエ雄の対象ハエ雄への性行動を示すグラフである。
図６（Ａ）に示すように、ｗ^１１１８（ＣＳ）系統のバージンの雌に対する野性型の成熟した雄の求愛活動は観察時間の約２割であったのに対し、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）の成熟した雄ではおよそ５割程度の求愛活動を示し、亢進した性行動が認められた。
さらに、図６の（Ｂ）に示すように、バージンの雌とは異なる形態及びフェロモン特性を持つ未成熟な雄に対しても積極的に性行動を示し、バージン雌に対する求愛活動と同程度の性行動がｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）で観察された。面白いことに、ここで見られた性行動の殆どが求愛行動の初段階である対象バエの後を追いかけ翅をパタつかせる段階で見られた。

実施例４の結果によれば、ｄＰＱＢＰ−１遺伝子欠損依存的に雄の亢進した求愛活動が観察された。また、この亢進した性行動は、実施例３で認められたような減少した寿命が関与している事が示唆された。

（実施例５）
実施例５は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体のショウジョウバエについて、概日リズム及び活動性解析を行った実施例である。
なお、実施例５で用いたｄＰＱＢＰ−１欠損変異体及びその対照としての野生型は、実施例１の＜実験材料＞で記載されたものと同じであるので、説明は省略する。

＜方法＞
概日リズム及び活動性解析の評価方法は、以下の手順で行った。
ｗ^１１１８（ＣＳ）系統とショウジョウバエＰＱＢＰ−１欠損変異体のバージンハエ雄・雌それぞれ８匹ずつ（各１６匹）を用いた。これらのハエを一匹ずつＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＡｃｔｉｖｉｔｙＭｏｎｉｔｏｒ装置（Ｔｒｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）のガラスチューブに移し、明期・暗期が１２：１２時間（ＬＤ）の条件下で２日間概日リズムを同調させた。その後、Ａｐｐｌｅコンピューターに接続したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＡｃｔｉｖｉｔｙＭｏｎｉｔｏｒ装置を使い、ＬＤ及びＤＤ（暗期のみ）の条件下で各２日間解析を行った。

＜結果＞
図７は、概日リズム及び活動性解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、ＬＤの条件下での概日リズム及び活動性を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＤＤ（暗期のみ）の条件下での概日リズム及び活動性を示すグラフである。図７（Ａ）、（Ｂ）においては、縦軸は活動量を示し、横軸は、明暗の周期を示している。
図７（Ａ）に示すように、ＬＤ条件下においてｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）は、野生型と同様に光刺激に依存した活動パターン（概日リズム）を示した。
しかしながら、図７（Ｂ）に示すように、ＤＤ条件下においてｄＰＱＢＰ−１欠損変異体（図中では、ｐｉｇｇｙＢａｃＰＱＢＰ−１と記載）は、野生型のような２相性の概日リズムは殆ど見られなく、一日の活動量が全体的に顕著に低い事がわかった。

実施例５によれば、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体は、ＬＤ条件下では野生型と同様の活動パターン（概日リズム）を示したが、ＤＤ条件下では野生型のような概日リズムは殆ど見られなく、顕著な活動能力の低下がみられた。この事は、ｄＰＱＢＰ−１が概日時計を制御している時計遺伝子機能又は時計分子シグナル経路に影響している可能性が考えられる。

（その他）
以上のように、本実施例（実施例１ないし実施例５）によれば、ショウジョウバエにおける種々の行動（例えば、学習獲得能力の低下、寿命短縮、性行動の亢進、概日時計の乱れ）はｄＰＱＢＰ−１遺伝子が重要であり、このｄＰＱＢＰ−１欠損変異体が精神発達遅滞疾患のモデル動物になりえる事が証明された。

本発明の精神発達遅滞の非ヒトモデル動物は、精神発達遅滞におけるＰＱＢＰ−１遺伝子の病的機能の解明に利用することができ、また、精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質のスクリーニングに利用することができる。

図１は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体におけるｄＰＱＢＰ−１遺伝子とｐｉｇｇｙＢａｃの特徴・導入部位を示す地図である。図２は、野生型とｄＰＱＢＰ−１欠損変異体との蛍光顕微鏡像であって、（Ａ）は野生型の外観についての蛍光顕微鏡像、（Ｂ）はｄＰＱＢＰ−１欠損変異体の外観についての蛍光顕微鏡像、（Ｃ）は、ｄＰＱＢＰ−１欠損変異体の頭部の凍結切片についての蛍光顕微鏡像である。図３は、ノーザンブロット解析の結果を示す図である。図４は、匂い条件付け学習・記憶解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、０〜３時間後の記憶特性を示すグラフであり、（Ｂ）は２４時間後の記憶特性を示すグラフである。図５は、寿命解析の結果を示すグラフである。図６は、性行動解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、雄の雌への性行動を示すグラフであり、（Ｂ）は、雄の雄への性行動を示すグラフである。図７は、概日リズム及び活動性解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、ＬＤの条件下での概日リズム及び活動性を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＤＤ（暗期のみ）の条件下での概日リズム及び活動性を示すグラフである。

Claims

ＰＱＢＰ−１の機能が欠損している学習獲得能力の低下、寿命短縮、性行動の亢進及び概日時計の乱れのうち、少なくともいずれか一つの精神発達遅滞を有する非ヒトモデル動物を用いたことを特徴とする精神発達遅滞の症状を改善する活性を有する物質をスクリーニングする方法。
ＰＱＢＰ−１遺伝子の変異によって、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しているモデル動物を用いた請求項１に記載の方法。
ＰＱＢＰ−１遺伝子内のＷＷ領域の変異によって、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しているモデル動物を用いた請求項２に記載の方法。
ＰＱＢＰ−１遺伝子の発現制御領域の変異によって、ＰＱＢＰ−１の機能が欠損しているモデル動物を用いた請求項１に記載の方法。
染色体上の両アレルに前記変異を有するモデル動物を用いた請求項２から請求項４のいずれかに記載の方法。
動物がショウジョウバエであるモデル動物を用いた請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法。
学習獲得能力、寿命、性行動及び概日時計のうち、少なくともいずれか一つを測定する請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。