KR20100104385A

KR20100104385A - 중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100104385A
Application number: KR1020090022761A
Authority: KR
Inventors: 곽규범; 원성식; 송희진
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-17
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2010-09-29

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 국소 투여용 약학 조성물을 제공한다. 국소적인 투여, 특히 피하 주사(subcutaneous injection)에 의한 국소적인 투여에 의하여도 면역을 효과적으로 억제시킴으로써 아토피성 피부염을 치료할 수 있음이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 면역억제가 온화하게 이루어짐으로써, 전신 투여에 의한 급격한 면역억제에 따라 발생할 수 있는 부작용을 회피할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 아토피성 피부염

Description

중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물{Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising mesenchymal stem cells}

본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 국소 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 심한 가려움증을 수반하는 만성 염증성 피부 질환이다. 아토피성 피부염은 유전적 알레르기 성향, 다양한 환경 요인, 면역체계 이상 등이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있으나, 아직 구체적인 발병 메커니즘이 완전히 밝혀져 있지는 않다. 아토피성 피부염이 발병하면 피부 각질층의 세라마이드 양이 적어지고, 따라서 피부가 수분을 충분히 유지하기 힘들어져 결국 피부가 건조해지고 가려워진다. 피부가 건조해지고 손상되면, 각종 알러지 유발물질(allergen)이나 균이 쉽게 피부를 통과해 염증반응 등을 일으키게 된다. 어린이 질환이 성인질환으로 이어지면 국민의료비가 급격히 늘어 2030년 GDP(국내총생산) 대비 국민의료비가 지금의 3배로 전망되는 등 국가발전의 불이익을 초래하게 될 것으로 전망되고 있다. 현재 어린이 아토피성 피부염 환자는 세 명 중 한 명꼴에 이 르며, 소아 조사 대상의 73.8%가 생후 1년 내에 아토피성 피부염을 겪었으며 태어나면서부터 아토피성 피부염을 앓은 경우도 42.3%에 달하는 것으로 보고되고 있다.

아토피성 피부염 치료를 위해 사용되는 약물로는 보습제와 스테로이드제가 주로 사용되고 있다. 어린이 아토피성 피부염의 증상완화를 위해 보습제를 사용하는 부모가 91.9%에 달하고 있으나, 이 가운데 26%만이 사용 중인 보습제에 만족하고 있는 실정이며, 불만족스러운 가장 큰 이유는 효과가 없거나 일시적인 증상 완화에 그치기 때문인 것으로 조사된 바 있다.

스테로이드제(예를 들어, 부신피질 호르몬제 등)는 비장, 림프노드 및 골수에 있는 림프구, 단핵구를 고갈시켜 이들 세포들이 염증부위에 이르는 양을 줄이거나 대식세포와 중성구 및 항원항체의 면역작용을 방해함으로써, 염증반응을 억제한다. 그러나, 아토피성 피부염은 만성 피부 질환이기 때문에, 스테로이드제의 장기간 및 고용량 사용으로 인하여 다양한 부작용이 나타나는 문제가 있다. 예를 들어, 외형적인 변화로서 붓거나 얼룩다람쥐같이 늘어지는 양볼, 얼굴형이 둥글게 변하는 월상안(Moon-face), 들소의 등처럼 뒷목 부분이 굽어지는 현상(버팔로 험프-혹), 식욕의 급격한 증가로 인한 비만 등이 나타나며, 또한 지방 분포를 재분배하여 팔과 다리는 가늘어지는 한편, 얼굴과 배는 부어 오늘 듯 둥글게 커지는 현상을 일으킨다. 그리고 피부위축, 혈관확장, 탈색, 자반 등이 있고, 피부를 약화시키고, 약화된 피부로 인해 모세혈관이 드러날 수 있으며 쉽게 멍이 들기도 하고 심리적변화로는 신경과민, 초조, 우울증, 불면증이 나타나기도 한다. 또한, 내성이 생겨 사용할수록 효과가 떨어지게 되며, 고용량으로 사용하게 됨으로써 감염에 대한 감수성 이 증가하여 흔히 보기 힘든 별난 감염을 일으키게 된다. 예를 들어, 당뇨, 백내장, 고혈압을 악화시키고, 혈액내 콜레스테롤과 중성지방의 수치를 증가시키며, 어린이에 있어서는 성장을 억제하고 6개월 이상 복용 시 어른이 되었을 때의 키가 줄어들기도 한다. 여러 형태의 쿠싱증후군(Cushings) 질환의 발현 및 뼈, 근육 및 피부과 같은 지지(supporting)조직의 부작용이 일어날 수 있으며 고혈압과 주요 감염에 대한 방어작용에 이상이 올 수 있다. 또한, 고관절, 견관절, 슬관절, 기타 다른 관절에서 뼈의 무혈관성 괴사를 일으킬 수 있으며, 위장관으로부터 칼슘의 흡수를 억제함으로써 뼈를 약화시켜 부러지기 쉽게 하고, 골다공증을 일으키기도 한다.

한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 골수, 제대혈, 지방, 근육 등의 조직으로부터 분리될 수 있는 다분화능을 가진 세포로서, MSC의 기능에 관하여 다양한 연구가 진행되고 있다. 예를 들어, Nauta 등은 MSC의 면역조절기능(immunomodulatory properties)을 보고한 바 있다(Nauta AJ, et.al, Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells, Blood 2007 Nov 15; 110(10): 3499-3506). Nauta 등에 따르면, MSC가 말초 관용(peripheral tolerance), 이식 관용(transplantation tolerance), 자가면역(autoimmunity), 종양 억제(tumor evasion), 태아-모체간 관용(fetal-maternal tolerance)의 유지에 있어서 면역조절제로서 기능할 수 있다. 인간, 비비(baboon), 쥐에서, MSC는 T-임파구의 in vitro 활성화 및 증식을 억제함으로써 면역억제 기능을 가지며, 이러한 억제 기능은 동종항원(alloantigen), 마이토젠(mitogen)에 유도되는 T-세포의 증식 및 CD3 및 CD28 항체에 의한 T-세포 활성화에 영향을 준다. MSC는 세포독성 T-임파 구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)의 세포독성(cytotoxicity)을 저해하며, 이는 세포독성 자체를 직접 억제하는 것이 아니라, CTL의 증식을 억제함으로 이루어진다. 이러한 저해는 직접적인 세포-세포 접촉을 필요로 하지 않으며, 수용성 인자들(soluble factors)을 매개로 이루어지며, 이러한 수용성 인자들은 MSC와 임파구(lymphocyte)의 직접 접촉을 통해서 만들어지게 되고, TGF-β 및 HGF(hepatocyte growth factor)가 주요 억제 인자 중 하나임이 밝혀진 바 있다.

본 발명자들은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)의 다양한 기능을 연구하던 중, 국소적으로 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 MSC를 피하 주사(subcutaneous injection)한 결과, 놀랍게도 투여 초기에는 면역글로불린의 양이 증가하다가 서서히 면역글로불린의 양이 감소하는 형태를 나타냄으로써 아토피성 피부염이 치료된다는 것을 발견하였다. 특히, 국소적인 피하 주사에 의해서도 면역이 억제될 수 있다는 것은 매우 놀라운 것이며, 또한 면역억제가 온화하게 이루어짐으로써, 전신 투여에 의한 급격한 면역억제에 따라 발생할 수 있는 부작용(side effects)을 회피할 수 있다.

따라서, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 국소 투여(topical administration)용 약학 조성물이 제공된다.

상기 상기 국소 투여는 피하 주사(subcutaneous injection)에 의한 투여가 바람직하고, 상기 중간엽 줄기세포의 단회 투여량은 4 × 10⁵ 내지 1 × 10⁶ cells, 더욱 바람직하게는 약 5 × 10⁵cells 이 바람직하다. 또한, 본 발명의 약학 조성물 은 집먼지 진드기에 의해 유발된 아토피성 피부염에 바람직하게 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로서 중간엽 줄기세포를 포함하는 국소 투여용 약학 조성물로서, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다. 중간엽 줄기세포를 국소적인 투여, 특히 피하 주사(subcutaneous injection)에 의한 국소적인 투여에 의하여도 면역을 효과적으로 억제시킴으로써 아토피성 피부염을 치료할 수 있음이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 면역억제가 온화하게 이루어짐으로써, 전신 투여에 의한 급격한 면역억제에 따라 발생할 수 있는 부작용(side effects)을 회피할 수 있다.

본 발명은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 국소 투여(topical administration)용 약학 조성물을 제공한다.

중간엽 줄기세포를 국소적인 투여에 의하여 면역을 효과적으로 억제시킴으로써 아토피성 피부염을 치료할 수 있음이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 중간엽 줄기세포의 면역억제가 중간엽 줄기세포와 임파구(lymphocyte)와의 직접 접촉을 통해서 이루어진다는 종래의 보고((Nauta AJ, et.al, Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells, Blood 2007 Nov 15; 110(10): 3499-3506)를 감안할 때, 중간엽 줄기세포의 국소투여에 의해서도 면역억제가 유도된다는 것은 매우 놀라운 것이다. 또한, 투여 초기에는 오히려 면역글로불린의 양이 증가하다가 서서히 면역글로불린의 양이 감소하는 형태를 나타내며, 따라서, 전신 투여에 의한 급격한 면역억제에 따라 발생할 수 있는 부작용(side effects)을 회피할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 골수, 제대혈, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 근육 등의 다양한 세포로부터 유래될 수 있으며, 공지의 방법에 따라 쉽게 분리할 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포는 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있으며, 침습적 시술이 필요 없으므로, 지방 유래 중간엽 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 중간엽 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 분리된 중간엽 줄기세포는 통상의 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있다. 상기 배지로는 공지된 통상의 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 15%, 페니실린과 스트렙토마이신 1%로 보충된 DMEM 배지를 사용할 수 있다. 배양된 중간엽 줄기세포는 배지를 갈아주면서 연속적으로, 바람직하게는 약 3∼5 계대(passage)로, 계대배양될 수 있으며, 얻어진 중간엽 줄기세포는 동결건조하여 보관되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 국소 투여(topical administration)용 약학 조성물로서, 상기 국소 투여는 피하 주사에 의한 투여가 바람직하다. 상기 중간엽 줄기세 포의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여기간 등에 따라 다르지만, 예를 들면, 4 × 10⁵ 내지 1 × 10⁶ cells, 바람직하게는 약 5 × 10⁵cells 의 단회 투여량으로 1회 이상, 바람직하게는 3∼5회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 원인에 의한 아토피성 피부염에 적용될 수 있으며, 집먼지 진드기에 의해 유발된 아토피성 피부염에 더욱 바람직하게 적용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액상 주사제 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 보존제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 마우스 지방유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

22 ± 3g 의 마우스 3마리를 CO₂로 질식사시킨 후, 100% 알콜에 넣어 온몸에 알콜을 뭍힌 다음, 평판에 고정시켰다. 소독된 실험용 가위와 핀셋을 이용하여 털 이 있는 피부를 수직이 되도록 목 위까지 자른 다음, 잘려진 부분을 최대한 늘려 고정시킨 다음, 장기와 피부 사이에 있는 노란색의 지방을 분리하였다. 분리된 지방 0.7 ± 0.3g(한 마리기준)을 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 없는 Free media [L-글루타민 2 ml/L, 소듐 피루베이트 110 mg/L이 보충된 low glucose DMEM]에 넣은 다음, 소독된 가위를 이용하여 잘게 잘라준 후, 0.075% 콜라게나아제 10 ml를 넣어 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 얻어진 배양액을 1600 rpm으로 10분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다. 잔류물을 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 15%, 페니실린과 스트렙토마이신 1%가 보충된 DMEM 배지에 시딩(seeding)한 다음, 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 배지를 3일 마다 갈아주면서 37℃에서 5 계대(passage)까지 계대배양하였으며, 각 계대에서 얻어진 중간엽 줄기세포는 동결건조하여 질소 중에 보관하였다. 상기 제1 계대 후 얻어진 중간엽 줄기세포의 현미경 사진은 도 1과 같다. 도 1에서 A, B, C, 및 D는 각각의 배양 접시(petri dish)에서 관찰된 중간엽 줄기세포의 현미경 사진이다.

실시예 2. 마우스 지방유래 중간엽 줄기세포의 유세포 분석

실시예 1에서 제4 계대 후 얻어진 중간엽 줄기세포의 표면항원을 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 중간엽 줄기세포를 DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척한 다음, 약 1×10⁵의 세포를 에펜도르프 시험 관(Eppendorf tube) 중에서 FACS 완충액[FBS 40 ml (최종 4%), 5% NaN₃(5 g/100 ml) 10 ml (소듐 아지드, 최종 0.05%), 10X PBS 100 ml (최종 1X), D.W. 850 ml] 50 ㎕에 현탁시켰다. 항체(CD44; Immunobiology 214 2009 179, CD117, CD29; Journal of Cellular Biochemistry 2003 89:1235, CD34; Journal of Cellular Biochemistry 2003 89:1235, CD73; BLOOD 2009 113 5, CD13; STEM CELLS AND DEVELOPMENT 2006 15:905) 1 ㎕를 가한 다음, 차가운 얼름 중에 30분 동안 암소에서 방치하였다. 상기 FACS 완충액을 가하여 5,000 rpm으로 약 4분 동안 원심분리하여 세척하였으며, 상기 세척과정을 추가로 2회 수행하였다. 얻어진 세포를 상기 FACS 완충액 300 ㎕에 재현탁 시키고, 유세포 분석기 시험관에 옮긴 다음, 유세포 분석을 실시하였다. 유세포 분석결과는 도 2와 같다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 중간엽 줄기세포는, 보고된 바와 같이, CD44, CD29는 양성이었으며 CD13, CD14, CD73, 및 CD117는 음성이었다(CD44; Immunobiology 214 2009 179, CD117, CD29; Journal of Cellular Biochemistry 2003 89:1235, CD34; Journal of Cellular Biochemistry 2003 89:1235, CD73; BLOOD 2009 113 5, CD13; STEM CELLS AND DEVELOPMENT 2006 15:905). 따라서, 실시예 1에서 얻어진 세포는 중간엽 줄기세포의 특성을 가짐을 알 수 있다.

실시예 3. 중간엽 줄기세포의 아토피성 피부염 치료 활성 평가

(1) 아토피성 피부염 유발

Yamamoto 등의 보고(Allergology International. 2007; 56: 139-148)에 따라, 5-6 주령된 female Nc/Nga 마우스(SLC, Japan)의 등 부위를 제모한 후, 아토피 유발물질을 등 부위와 귀부위에 6회 도포하여 아토피를 유발시켰다. 아토피 유발물질은 Biostir AD로서 집먼지 진드기(house dust mite; Dermatophagoides farinae)로부터 추출한 단백질과 Derf I, Derf II 가 포함된 연고제를 Biostir, Inc (Hyogo Japan)에서 구입하여 사용하였다.

(2) 아토피성 피부염이 유발된 마우스의 중증도 분석방법

등과 귀의 아토피성 피부염의 생성은 육안으로 보기에 알 수 있을 정도로 강력하였으나 생성된 정도의 개체 편차가 매우 심하였다 [실험 1은 50%(20/40마리) 실험 2는 69% (18/26마리)]. 귀 두께 및 채취한 혈중 IgE의 농도에 따라 중증도를 결정하여 중증의 동물을 유의한 차이가 나지 않도록 선별하였다. 귀의 두께 측정으로 아토피성 피부염의 중증도를 측정하는 방법은 여러 연구자들이 사용하는 인정된 방법으로서(International Immunopharmacology 2008 8, 1475.1480; Spring-loaded microcalipus (Mitutoyo Co., Kanakawa Japan), 5번씩 반복하여 측정하였다. IgE 농도를 측정하기 위하여, 혈액을 꼬리에서 채취하여 혈장을 분리하여 100-200ul씩 -70 ℃에 보관하여 일괄적으로 분석하였다. IgE 농도 분석은 IgE ELISA kit[ Shibayagi Co., Ltd. (Gunma Japan)]를 사용하여 수행하였다.

(3) 아토피성 피부염 치료 활성 평가

상기 (2)에서 선별된 아토피성 피부염이 유발된 마우스 8마리를 4마리씩 2군 으로 나누고, 제1군에는 실시예 1에서 제4 계대 후 얻어진 중간엽 줄기세포 5 x 10⁵ 를 50 ul의 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 현탁시켜 1 주일 간격으로 4회 마우스의 오른쪽 귀에 피하 주사하였다. 제2군에는 50 ul의 인산 완충 식염수만을 동일한 방법으로 피하 주사하였다. 투여 종료 후, 마우스의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈중 IgE 농도를 IgE ELISA kit[ Shibayagi Co., Ltd. (Gunma Japan)]를 사용하여 측정하였다.

도 3은 상기 (1) 내지 (3)의 시험과정을 모식도로 나타낸 것이며, 도 4는 각 단계에서 마우스의 혈중 IgE 농도의 변화 추이를 나타낸 것이다. 도 4에서 ■ 및 ●는 각각 중간엽 줄기세포 및 PBS를 주입하였을 때의 혈중 IgE 농도를 나타낸다.도 4의 결과로부터, 중간엽 줄기세포를 4 회 주입한 후 1주 후부터 IgE의 양이 유의성 있게 감소하는 양상을 나타냄을 알 수 있다.

도 1은 마우스의 지방으로부터 유래된 중간엽 줄기세포의 현미경 사진이다. 도 1에서 A, B, C, 및 D는 제1 계대 후 각각의 배양 접시(petri dish)에서 관찰된 중간엽 줄기세포의 현미경 사진이다.

도 2는 마우스의 지방으로부터 유래된 중간엽 줄기세포의 표면항원을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다

도 3은 중간엽 줄기세포의 아토피성 피부염 치료 활성 평가 과정을 모식도로 나타낸 것이다.

도 4는 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 중간엽 줄기세포를 피하 주사하였을 때, 마우스의 혈중 IgE 농도 변화 추이를 나타낸 것이다. 도 4에서 ■ 및 ●는 각각 중간엽 줄기세포 및 PBS를 주입하였을 때의 혈중 IgE 농도를 나타낸다.

Claims

중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 국소 투여(topical administration)용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 국소 투여가 피하 주사에 의한 투여임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 단회 투여량이 4 × 10⁵ 내지 1 × 10⁶ cells 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 단회 투여량이 5 × 10⁵cells 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아토피성 피부염이 집먼지 진드기에 의해 유발된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.