CN104651307A - 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术 - Google Patents

Abstract

一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术属于第三类医疗技术，按照如下步序进行：(1)亚健康人群筛选，(2)自体免疫细胞的采集，(3)自体免疫细胞在GMP车间培养诱导，(4)免疫细胞制剂的质量控制，(5)细胞移植，(6)随访及康复方案调整。采用自体免疫细胞进行亚健康康复，一方面可以免去配型及一些传染病指标的检测，另一方面也快捷方便，更重要的是由于采用的是自体细胞，完全没有任何的排异反应，只要亚健康者没有特殊的身体疾病状况均可移植并产生良好康复效果。同时，不像其它亚健康康复法如中医疗法、自然疗法、运动、营养疗法，自体免疫细胞康复法可以从根本上改善亚健康人群身体状况，恢复原有的健康。

Description

一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术

技术领域

本发明是将自体免疫细胞培养诱导用于亚健康康复，涉及基础医学、康复医学领域。

背景技术

当人类进入二十一世纪，生命质量的提高和生命时间的延长，人们对健康的需求日益强烈，对疾病认识的水平也不断提高。医学的发展也从过去的疾病治疗策略转向生物-心理-社会医学模式，当今医学的主题是预防疾病，特别是亚健康人群的保健。一项WHO的调查显示：真正健康的人群仅占5％，疾病者为20％，而75％的人群处于亚健康状况。我国亚健康人群约为70％。何为亚健康，它是指是介于健康和疾病之间的一种生理功能低下的状态，主要表现为出现明显身心不适现象但机体无结构和代谢的异常。亚健康状态是没有明显临床症状的，也不能用相关临床诊断指标确诊，而疾病的发生往往都有个量变到质变的发展过程，亚健康状态正是从健康向疾病发展的过渡阶段。常见″亚健康″状态表现：浑身无力，容易疲倦，思想涣散，头痛，耳鸣，眼睛疲劳，鼻塞眩晕，咽喉异物感，手足发凉麻木，便秘，颈肩僵硬，胃闷不适，睡眠不良，心悸气短，容易晕车，起立时眼前发黑，早晨起床有不快感等。关于亚健康病因学说，当前比较流行的是免疫学说、自由基学说，同时与遗传背景相关。亚健康的治疗目前常用的方法有传统疗法、心理疏导、运动疗法、营养疗法等，这些疗法具有一定的效果，但不能很好地改善亚健康人群身体状况。

免疫系统是人体最重要的组成部分，是人体健康的保护墙，由免疫器官(骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾、胸腺等)、免疫细胞(淋巴细胞、单核吞噬细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞、血小板等)和免疫分子(补体、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等)等组成，起着免疫防御、免疫自稳和免疫监视的功能。免疫系统功能紊乱，尤其是免疫细胞的质和量的改变会对机体健康产生重大影响。亚健康状态时，人体生理功能下降，免疫力低下，导致身体疾病症状加重和身体的社会功能的缺陷，致使慢性疾病的调节机能削弱，进而引起躯体功能性或器质性病变。这种改变正是免疫细胞发生了变化，如在消极情绪状态下淋巴细胞增殖减少，自然杀伤细胞活性降低，血液循环中白细胞和抗体的数量改变，导致免疫功能减退。免疫系统是一个高度复杂的系统，它与机体内部其它各系统、各脏器相辅相成，帮助我们抵御外部微生物的侵入。免疫系统功能的低下将会导致：①免疫防御功能降低，各种来自外界的病毒、细菌入侵人体，导致感冒和腹泻。②机体自身稳定破坏，协调系统内各细胞、器官之间的能力下降，导致身体出现一些异常症状，如内分泌系统紊乱，在女性会出现月经失调而经前腹痛、烦躁易怒、面色萎暗和肥胖等；神经系统紊乱就容易出现心悸、多梦、失眠等症状；同时会出现过敏如常因花粉、尘埃、动物皮毛、药物、食物敏感而打喷嚏、流眼泪、脸部瘙痒、皮疹等免疫反应。③免疫细胞监视能力降低。亚健康状态时，人们常轻微发烧、咽喉痛、淋巴结肿大、注意力不易集中、全身无力、体内荷尔蒙代谢失调。长久以后引起正常细胞的异常突变，由于机体清除能力下降，使得这些细胞得以繁殖扩散而最终形成肿瘤。

免疫细胞是免疫系统的主角，改善和提高免疫系统细胞的质和量是亚健康康复的关键。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killers，CIK)，是将亚健康者外周血淋巴细胞在体外与多种细胞因子共培养后所获得的一群异质性细胞。CIK细胞具有增殖快速、杀伤能力强、具有广谱杀伤效应、对正常细胞无损伤作用、可调整人体的免疫状态、刺激骨髓造血等重要作用，是目前已知活性最高的非特异性杀伤免疫效应细胞。树突状细胞(dendriticcell，DC)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，也是唯一能激活幼稚T细胞的抗原递呈细胞，在免疫应答的诱导中具有独特地位。它最重要的作用是可摄取肿瘤抗原，提呈给T淋巴细胞，诱导、激活、增殖细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，从而介导强大的特异性细胞免疫功能。同时DC细胞对机体还可以发挥非特异性免疫保护作用。DC细胞和CIK细胞共培养(DCIK)可以相互促进对方的保护性细胞因子的产生，提高彼此的免疫功效。利用亚健康者外周血免疫细胞经体外培养诱导产生的DCIK细胞回输，启动人体免疫机制，提高人体免疫力，可使亚健康者提高生活质量，增强食欲、改善睡眠、增强体力，且安全无毒副作用，是任何传统康复法所无法比拟的。通过体外体内法将自体免疫细胞回输可使亚健康者恢复其原有的健康状况。

发明内容

本发明的目的是提供一种亚健康康复新技术，它是获取亚健康者外周血，并在100级GMP厂房分离单个核细胞，添加相关营养因子等诱导培养并经质检，合格的免疫细胞回输给亚健康者本人，达到其康复的目的。这种自体免疫细胞康复无需配型，无需检测特定的病毒，简单易行、安全可靠，并具有良好的康复效果。

具体实施方式

通过本实施例来具体说明本发明一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，将亚健康者外周血单个核细胞分离，并诱导培养用于亚健康自身康复。本发明操作步序如下：

(1)亚健康人群筛选，入选者年龄35-55岁成年男女，没有重大疾病，身体状况稳定。参与者进行健康问卷、自评、问诊、一级检查和二级检查。评价结果符合亚健康标准即疲劳(休息不能缓解的疲劳；往常从事的活动下降50％)加任意6项次要症状(①畏寒、低热，②咽喉不适，③淋巴结肿大，④不能解释的全身无力感，⑤肌肉酸痛，⑥头痛，⑦日常活动后疲劳感不能回复，⑧关节疼痛，⑨睡眠紊乱，⑩精神、神经症状；急性、亚急性出现)和任意2条体征(①颈淋巴结肿大≤2cm，②低热，②咽喉炎)，或者疲劳加任意8项次要症状。自我评价(早上起床时发丝掉落，情绪抑郁，健忘，工作令人厌倦，有自闭症式的渴望，工作效率明显下降，身体倦怠，工作情绪无法高涨，进餐少，盼望早点逃离办公室，对污染、噪声非常敏感，比常人渴望清幽，不再热衷于朋友聚会，经常失眠，体重明显下降，易感冒，性能力下降)大于等于50分。一般身体检查正常，二级检查包括免疫细胞分类(总T淋巴细胞、总B淋巴细胞、辅助／诱导T细胞、抑制／杀伤T细胞、r／＆T细胞、NK细胞、NK-T细胞，总白细胞及分类，DC细胞，CIK细胞，调节性T细胞即Treg、髓源性抑制细胞即MDSCs)、免疫细胞功能(T、B、NK免疫细胞增殖检测，超敏反应)、免疫分子(补体、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子)和SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)检测有三项以上阳性或者高于／低于正常值。根据这些结果制定康复方案，即自体免疫细胞康复疗程及辅以心理疏导、饮食调整、生理(包括休息、锻炼等)调节、传统康复(中药、推拿按摩、针灸艾灸等)。

(2)自体免疫细胞的采集。无菌条件下静脉抽取亚健康者外周血50毫升，肝素(20U／mL)抗凝，混匀并填写样本信息表，在4℃无菌环境下运至100级G M P车间加工。

(3)自体免疫细胞在GMP车间培养诱导。①CIK细胞和DC细胞的诱导扩增。在百级GM P车间条件下，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，将分离得到的单个核细胞(用毛细管插到云雾层，该层白色略带黄色)按照细胞浓度为5X10⁵／ml接种于PRMI1640培养基，添加1000u／ml of IFN-gama、100u／ml of IL-1a、500u／ml of IL-2细胞因子、100u／ml青霉素、100u／ml链霉素，1％自体血清，置37℃、5％CO2条件下常规培养24小时。转移细胞培养上清液(粘附细胞供DC细胞诱导扩增所用)即非粘附性细胞至另一经5ug／mlof anti-CD3单抗包被的培养瓶，在37℃、5％CO2条件下常规培养7天，期间3-4天更换培养液并添加细胞因子及血清，此为CIK(cytokine induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)细胞。未转移的粘附细胞用PRMI1640培养基继续培养并添加100u／ml青霉素、100u／ml链霉素、1000u／ml of GM-CSF、500u／ml of IL-4及2％的自体血清等培养7天，期间更换一次培养液并添加相应因子和血清，此为DC(dendritic cells，树突状细胞)细胞。②DC和CIK细胞共培养及分子表达的检测：将培养7天的DC和CIK细胞以1：3比例混合，培养液为上述CIK细胞培养液，37℃、5％CO2条件下常规培养7天，期间3-4天更换培养液并添加细胞因子及血清。检测粘附细胞DC细胞表达CD80、CD40、MHC-DR、IL-12水平及非粘附细胞CIK表达CD28、CD40和CD40L的表达水平。

(4)免疫细胞制剂的质量控制。细胞培养诱导完成或培养过程中进行各项指标的检测，这些指标包括：

①无菌检测。细菌检测：参照药典2010版附录XII A无菌检测法或用BD公司的血细菌培养瓶，取细胞培养上清液3-5ml于BD血细菌培养瓶，置于培养仪培养2周后观察结果。另一种简易方法是将细胞培养上清液离心后取沉淀物涂片革兰氏染色镜检。结实验结果应为阴性。内毒素检测：参照药典2010版附录XII E细菌内毒素检查法，内毒素限值的确定按照相关说明计算。支原体检测：参照药典2010版附录XII B支原体检查法，结果应为无支原体生长。

②生物活性检测。效应细胞DCIK体外生物活性分析(以同源CIK细胞、DC细胞作为对照)，将诱导培养的DCIK细胞、CIK细胞和DC细胞分别加适量培养液(上述CIK细胞培养液)，计数调节细胞密度4×10⁶个／ml，并经培养液倍比稀释后其密度各分别为：4×10⁶、2×10⁶、1×10⁶和0.5×10⁶个／ml。靶细胞A549的准备：贴壁生长细胞用胰蛋白酶消化液处理、离心后，取悬浮细胞用PBS缓冲液重复洗涤，加适量10％FCS RPMI1640悬浮细胞，计数并用培养液调节细胞密度为2×10⁵个ml。细胞毒活性检测：接种靶细胞A549，按每孔2×10⁴个／100ul，于96孔平底细胞培养板中培养4h上，按效靶比10∶1、5∶1、2.5∶1和1.25∶1分别加入96孔板中，经效应细胞培养液在37℃、5％CO2条件下常规培养过夜，加入MTT液，最后测A570值。计算杀伤率：杀伤率＝1-[(靶效细胞总数-效应细胞)／靶细胞]×100％。

③存活率。将DCIK细胞制成1.0×10⁶个／ml细胞悬液，取0.2ml细胞悬液并加入0.5ml台盼蓝溶液和0.3ml PBS，充分混匀静置5-15分钟。混匀细胞并用血细胞计数于普通显微镜下观察计数：正常细胞不被染色，细胞死亡后细胞膜通透性增大，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈蓝色。细胞活力(％)＝(总细胞数-着色细胞数)÷总细胞数×100％。

④细胞纯度。适量的PBS缓冲液重悬DC或CIK细胞并调整细胞浓度为2×10⁷个／ml。采用直接标记的一抗，以CD1a+CD80双标记法检测DC细胞，以CD3+CD56双标记法检测CIK细胞(抗体加入浓度为0.5-1ug／10⁶细胞)。抗体加入后冰上孵育5-10分钟，加入缓冲液4℃下300-400g离心5分钟，并弃去上清，重复洗涤3次。用500ul缓冲液重悬细胞后上机检测，操作尽量保持在避光和4℃左右的温度下进行。双阳性细胞数占总细胞数的百分比即为DC细胞或CIK细胞纯度。

(5)细胞移植。临近移植前做革兰氏染色，并与亚健康者签署知情者同意书，并按照康复计划将质检合格的DCIK细胞在无菌条件下静脉输注亚健康者本人，100ml生理盐水含DC细胞和CIK细胞分别为1×10⁷和1×10⁹于静脉内注射。细胞输注时间是抽血后2周、3周、5周、8周、12周。细胞注射后的安全性观察：发热、失眠、厌食和发疹等。剩余细胞用自体血浆或血清(90％)加DMSO(10％)液氮冻存备用。

(6)随访及康复方案调整。细胞移植后对亚健康者进行健康访问、复查，并根据康复结果调整康复计划。

Claims (7)

1.一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征在于：

(1)亚健康人群筛选，入选者年龄35-55岁成年男女，没有重大疾病，身体状况稳定。参与者进行健康问卷、自评、问诊、一级检查和二级检查。

(2)自体免疫细胞的采集。无菌条件下取得亚健康者静脉抗凝血，4℃并运至GMP车间。

(3)自体免疫细胞CIK和DC在GMP车间培养诱导。在百级GMP车间条件下，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，将分离得到的单个核细胞接种于PRMI1640培养基，并添加细胞因子培养。转移细胞培养上清液(粘附细胞供DC细胞诱导扩增所用)至另一经anti-CD3单抗包被的培养瓶培养，此为CIK细胞。未转移的粘附细胞用PRMI1640培养基继续培养并添加GM-CSF、IL-4及自体血清等培养，此为DC细胞。DC和CIK细胞按照一定比例共培养，并细胞表面分子的表达进行检测。

(4)免疫细胞制剂的质量控制。细胞培养完成或培养过程中进行各项指标的检测，这些指标包括：无菌实验(包括细菌、内毒素和支原体)、生物活性检测、存活率、细胞纯度及细胞鉴定。

(5)细胞移植。临近移植前做革兰氏染色，签署细胞输注知情者同意书，按照康复计划将质检合格的DCIK细胞在无菌条件下静脉输注亚健康者本人。

(6)随访及康复方案调整。细胞移植后对亚健康者进行健康访问、复查，并根据康复结果调整康复计划。

2.根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步序(1)亚健康人群筛选，入选者年龄35-55岁成年男女，没有重大疾病，身体状况稳定。参与者进行健康问卷、自评、问诊、一级检查和二级检查。评价结果符合亚健康标准即疲劳(休息不能缓解的疲劳；往常从事的活动下降50％)加任意6项次要症状(①畏寒、低热，②咽喉不适，③淋巴结肿大，④不能解释的全身无力感，⑤肌肉酸痛，⑥头痛，⑦日常活动后疲劳感不能回复，⑧关节疼痛，⑨睡眠紊乱，⑩精神、神经症状；急性、亚急性出现)和任意2条体征(①颈淋巴结肿大≤2cm，②低热，②咽喉炎)，或者疲劳加任意8项次要症状。自我评价大于等于50分。一般身体检查正常，二级检查包括免疫细胞分类、免疫细胞功能、免疫分子和SOD检测有三项以上阳性或者高于／低于正常值。

3.根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步序(2)自体免疫细胞的采集。无菌条件下静脉抽取亚健康者外周血50毫升，肝素(20U／mL)抗凝，混匀并填写样本信息表，在4。℃无菌环境下运至100级G M P车间加工。

4.根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步序(3)自体免疫细胞在GMP车间培养诱导。在百级G M P车间条件下，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，将分离得到的单个核细胞按照细胞浓度为5X10⁵／ml接种于PRMI1640培养基，添加1000u／ml of IFN-gama、100u／ml of IL-1a、500u／ml of IL-2细胞因子、100u／ml青霉素、100u／ml链霉素，1％自体血清，常规培养24小时。转移细胞培养上清液(粘附细胞供DC细胞诱导扩增所用)至另一经5ug／ml of anti-CD3单抗包被的培养瓶，常规培养7天，此为CIK(cytokine induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)细胞。未转移的粘附细胞用PRMI1640培养基继续培养并添加1000u／ml of GM-CSF、500u／mlof IL-4及2％的自体血清等培养7天，此为DC(dendritic cells，树突状细胞)细胞。将培养7天的DC和CIK细胞以1：3比例混合，培养液为上述CIK细胞培养液，常规培养7天，检测粘附细胞DC细胞表达CD80、CD40、MHC-DR、IL-12水平及非粘附细胞CIK表达CD28、CD40和CD40L的表达水平。

5.根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步序(4)免疫细胞制剂的质量控制。细胞培养诱导完成或培养过程中进行各项指标的检测，这些指标包括：①微生物检测包括无菌检测、内毒素检测和支原体检测。参照药典2010版附录XIIA无菌检测法或用BD公司的血细菌培养瓶，取细胞培养上清液3-5ml于BD血细菌培养瓶，置于细菌培养仪培养2周后观察结果；内毒素检测，参照药典2010版附录XII E细菌内毒素检查法，内毒素限值的确定按照相关说明计算；支原体检测，参照药典2010版附录XII B支原体检查法，结果应为无支原体生长。②生物活性检测。效应细胞DCIK体外生物活性分析(以同源CIK细胞、DC细胞作为对照)，将诱导培养的DCIK细胞密度调整为4×10⁶个／ml、2×10⁶、1×10⁶和0.5×10⁶个／ml。靶细胞A549用胰蛋白酶消化液处理、离心后，取悬浮细胞用PBS缓冲液重复洗涤，加适量10％FCS RPMI1640悬浮细胞，计数并用培养液调节细胞密度为2×10⁵个ml。在上述靶细胞中加入效应细胞培养过夜，用MTT法检测同时以CIK细胞和DC细胞作对照。③存活率：将DCIK细胞制成1.0×10⁶个／ml细胞悬液，取0.2ml细胞悬液并加入0.5ml台酚蓝溶液和0.3ml PBS，充分混匀静置5-15分钟。混匀细胞并用血细胞计数于普通显微镜下观察计数，细胞活力(％)＝(总细胞数-着色细胞数)÷总细胞数×100％。④细胞纯度：适量的PBS缓冲液重悬DC或CIK细胞并调整细胞浓度为2×10⁷个／ml。采用直接标记的一抗，以CD1a+CD80双标记法检测DC细胞，以CD3+CD56双标记法检测CIK细胞(抗体加入浓度为0.5-1ug／10⁶细胞)。抗体加入后冰上孵育5-10分钟，加入缓冲液重复洗涤3次后上机检测，双阳性细胞数占总细胞数的百分比即为DC细胞或CIK细胞纯度。

6.根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步序(5)细胞移植。临近移植前做革兰氏染色，并与亚健康者签署知情者同意书，并按照康复计划将质检合格的DCIK细胞在无菌条件下静脉输注亚健康者本人。细胞注射后的安全性观察：发热、失眠、厌食和发疹等。剩余细胞用自体血浆或血清(90％)加DMSO(10％)液氮冻存备用。

7.根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步序(6)随访及康复方案调整。细胞移植后对亚健康者进行健康访问、复查，并根据康复结果调整康复计划。