KR101613371B1 - 면역질환 치료효과를 갖는 신규한 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규 화합물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제시키며, 면역조절 기능을 갖는 조절 T 세포의 활성을 증대시킬 뿐만 아니라, 자가 항체 생산을 억제하여 과도한 면역반응을 제어할 수 있으며 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 효과가 있어, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 치료를 위한 용도로 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

면역질환 치료효과를 갖는 신규한 화합물 및 이의 용도{Novel compounds having treatment of immune diseases and use therof}

본 발명은 면역질환의 치료 및 예방 효과가 우수한 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.

면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 전 세계에서 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.

염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 산화질소(NO) 등). 그러나 염증의 이들 매개자중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.

또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상 (림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다. 자가면역 질환으로서는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 류마티스성 질환, 건선, 전신성 피부근염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 또는 항원에 의한 면역반응 악화, 즉, 천식, 약물 또는 음식에 대한 알레르기 등. 이러한 질환들은 모두 제한성이고 만성인 질환들이며, 경우에 따라서는 치명적이고, 현재까지 상기 질환들을 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는 실정이다. 그러므로 당해 질환의 진행 중에 질환을 경감시키거나 완화시킬 수 있는 약물, 의약 또는 매체라면 환자의 건강을 위해서 중요한 해결 수단이 된다고 할 것이다.

자가면역 질환의 치료방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 집중적인 노력을 해왔다. 오늘날, 자가면역 질환의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용에 근거한 것이다. 그러나 이와 같은 약리 요법은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로, 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 이러한 약리 요법을 장기간 사용하였을 경우 여러 가지 세포 독성 작용이 문제가 되어, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써, 환자를 감염증 및 암에 걸릴 위험에 노출시킬 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적 증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다.

따라서 자가면역질환, 염증성 질환 등과 같은 면역질환을 치료할 수 있는 물질로서, 부작용이 없으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 인체 부작용이 적으면서 면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 소재를 모색하던 중, 새로이 합성한 신규 화합물이 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2013-0069737호

따라서 본 발명의 목적은 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 상기 본 발명의 신규 화합물을 미분화 T 세포에 처리하여 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 및 Th17 세포의 활성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 상기 본 발명의 신규 화합물을 미분화 T 세포에 처리하여 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화 및 Treg 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 신규한 화합물인 N-에틸-4-플루오로페닐 바이구아나이드(N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 염증성 사이토카인의 생성을 감소 또는 억제시키고, 자가 항체 생산을 억제시키며, 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-17, IL-6, TNF-a, IFN-r, MMP-9 또는 STAT-3일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgG1 또는 IgG2a일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 조절 T 세포(Regulatory T cell)의 활성을 촉진 또는 증가시키고, 병인세포인 Th17 세포의 활성은 감소 또는 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 조성물에 0.1mM ~ 10mM의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 및 궤양성 대장염 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이식거부질환은 이식편대숙주질환(Graft versus host disease)일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 상기 본 발명의 신규 화합물을 미분화 T 세포에 처리하여 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 및 Th17 세포의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 상기 본 발명의 신규 화합물을 미분화 T 세포에 처리하여 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화 및 Treg 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규 화합물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제시키며, 면역조절 기능을 갖는 조절 T 세포의 활성을 증대시킬 뿐만 아니라, 자가 항체 생산을 억제하여 과도한 면역반응을 제어할 수 있으며 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 효과가 있어, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 치료를 위한 용도로 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 정상마우스의 비장세포를 대상으로 각 농도별 SD-282화합물 처리에 따른 세포독성, 자가항체 생산정도, 염증성 사이토카인의 생성 및 염증성 유전자 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정상마우스의 비장세포를 대상으로 각 농도별 SD-282화합물 처리에 따른 Th17억제와 Treg 활성촉진, 파골세포 분화억제 및 과활성화된 Th17억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 류마티스 관절염이 유도된 마우스의 비장세포를 대상으로 각 농도별 SD-282화합물 처리에 따른 세포독성, 자가항체 생산정도, 염증성사이토카인의 생성 및 염증성 유전자 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 류마티스 관절염이 유도된 마우스의 비장세포를 대상으로 각 농도별 SD-282화합물 처리에 따른 Th17억제와 Treg 활성촉진, 파골세포 분화억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 루프스가 발병된 마우스의 비장세포를 대상으로 각 농도별 SD-282 화합물 처리에 따른 세포독성, 자가항체 생산정도, 염증성 사이토카인의 생성 및 염증성 유전자 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 루프스가 발병된 마우스의 비장세포를 대상으로 각 농도별 SD-282화합물 처리에 따른 Th17억제와 Treg 활성촉진 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 인간 말초 혈액으로부터 분리한 림프구를 대상으로 각 농도별 SD-282 화합물 처리에 따른 세포독성 및 염증성 사이토카인의 생성정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 하기의 신규 화합물들을 사용할 수 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

따라서 본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 신규 화합물을 제공할 수 있다.

보다 바람직하게 상기화학식의 화합물은 N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide이다.

본 발명자들은 상기 합성한 신규 화합물이 면역질환을 치료할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화합물은 염증성 사이토카인의 생성을 감소 또는 억제시키고, 자가 항체 생산을 억제시키며, 파골세포의 분화를 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났고, 이때 상기 염증성 사이토카인으로는 이에 제한되지는 않으나, IL-17, IL-6, TNF-a, IFN-r, MMP-9 또는 STAT-3일 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 화합물이 자가 항체인 IgG, IgG1 또는 IgG2a의 생산을 억제하여 과도한 면역반응을 억제시키는 조절 능력이 있음을 알 수 있었다.

나아가 상기 본 발명의 화합물은 조절 T 세포(Regulatory T cell)의 활성을 촉진 또는 증가시키고, 병인세포인 Th17 세포의 활성은 감소 또는 억제시키는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 상기 본 발명에서 새로운 합성한 상기 화합물이 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역 질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

그러나 현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

이러한 점에서 본 발명에서 제공하는 신규 화합물은 염증성사이토카인 생성 억제와 Th17 세포 억제 및 Treg 세포 활성의 작용이 모두 동시에 작동될 수 있는 기능이 있어 종래 치료제에 비해 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있을 것으로 보인다.

나아가 본 발명의 일실시예의 결과를 보면 본 발명의 화합물이 STAT3의 유전자 발현도 억제하는 활성이 있음을 확인할 수 있었는데, 최근에는 다양한 암 종에서 STAT1, STAT3 및 STAT5의 활성화된 형태가 발견되고 있으며, STAT3는 백혈병과 같은 혈액암 뿐만 아니라, 유방암, 두부경부암, 흑색종, 난소암, 폐암, 췌장암, 전립선암과 같은 다양한 고형암에서 활성화되어 있어 중요한 항암 타겟이 되고 있다(Hua Yu and Richard Jove, Nature Review Cancer.,2004, 8, 945).

또한, STAT3의 활성은 세포사멸을 억제하고, 신생혈관(angiogenesis)을 유도하며, 면역회피를 유도하는 것으로 알려진 바 있다((Wang T. et al., Nature Medicine., 2004, 10, 48). 따라서 STAT3 활성 억제는 복합적인 항암 기작으로 종양을 제어할 수 있는 효과가 있고, STAT3 단백질은 종양뿐만 아니라 다양한 세포내 기능에도 관여하므로 이의 저해제 발굴은 면역억제제로의 개발도 가능하다.

또한, 참고로 면역계는 정상상태에서는 자가 항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.

최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경 하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.

또한, T 세포는 Treg 세포 이 외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

또한, Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.

또한, Treg 세포는 Foxp3를 발현하고 있는데 Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다.

따라서 이러한 종래 면역질환 치료와 관련된 기술개발 현황을 살펴볼 때 본 발명에서 제공하는 신규 화합물은 종래 해결하지 못했던 문제점의 해결과 함께 보다 효과적인 약리효과를 보이고 있어 면역질환 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

그러므로 본 발명에서 제공하는 상기 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 상기 신규 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있는데, 본 발명자들은 이들 화합물을 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 합성 제조하였다.

본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.

또한, "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

또한 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 주조직적합성분자는 당단백 항원의 종류에 따라 결정되는데, 조직적합항원이 일치하지 않아서 일어나는 면역반응은 성공적인 이식을 가로막는 장애가 되고 있어, 조직적합항원 검사의 정확성과 일치 여부의 조사는 매우 중요한 요소이다.

사람에게는 여러 종류의 조직적합항원이 있는데, 그 중 HLA-A, -B,-C를 포함하는 Class I 항원이 있고, HLA-DR,-DP, -DQ를 포함하는 Class II 항원이 있다. 이들 항원의 생물학적 기능은 T 림프구에게 항원을 전달하며, Class I 항원은 대부분의 유핵세포에서 발현되며 이를 통해 전달되는 항원들은 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의해 인식된다. Class II 항원은 항원제시세포로 알려진 수지상세포, B 림프구, 활성화된 T 림프구, 큰포식세포 등에서 발현되며, CD4+ T 림프구에게 항원을 전달하는 기능을 한다. T 림프구에 전달된 항원들은 T 림프구 수용체에 결합함으로써 T 림프구가 항원을 인식하게 되는데 이식하는 과정에서 자신의 것이 아닌 다른 사람으로부터 유래한 조직적합항원을 높은 빈도로 인식하게 된다. 공여자 또는 환자의 전체 T 림프구 중 1~10% 정도가 환자 또는 공여자로부터 유래한 조직적합항원을 인식하여 이에 대한 반응으로 증식하게 되고, 일련의 면역반응을 일으키게 되는데 이를 "동종반응(Alloresponse)"라고 한다. 또한 공여자의 T 림프구가 환자의 조직적합항원에 대하여 면역반응을 일으키는 것을 이식편대숙주질환(GVDH)"라고 하며, 반대로 환자의 T 림프구가 공여자의 조직적합항원에 대하여 일으키는 반응을 이식거부반응(graft rejection)"이라고 한다.

따라서 이식 과정에서 발생하는 면역반응에 의한 비정상적인 반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

또한, 본 발명에서 예방 및 치료할 수 있는 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 류마티스 관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 및 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

상기 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 본 발명의 신규 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 상기 신규 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명은 또한, 면역질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 본 발명에서 제공하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 상기 본 발명의 화합물을 세포에 처리하여 세포 내에서 Th17세포의 활성을 감소시키는 방법을 제공할 수 있으며, 시험관 내에서 제1항의 화합물을 세포에 처리하여 세포 내에서 Treg 세포의 활성을 증가시키는 방법도 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

본 발명에 따른 면역질환 치료 효과를 갖는 신규 화합물의 합성

본 발명자들은 면역질환 치료를 위한 새로운 치료제의 후보물질로서 하기 구조식을 갖는 새로운 신규 화합물을 아래와 같은 방법을 통해 합성하였다. 먼저 밀봉반응기에 아닐린 화합물(1.0 mmol)을 아세토나이트릴 용매에 녹인 후 다이시아노다이아마이드(1.0 mmol)와 진한 황산(1.0 mmol)을 첨가하고 밀봉한 후 175 ℃에서 1시간 교반하였다. 이후실온으로 식혀 흰색 고체를 생성하였고, 용매를 제거한 후 헥산과 이소프로필알콜로 세척하여 흰색 고체 형태의 하기 화합물(SD-282)을 합성하였다.

합성된 화합물에 대해서는 ¹H-NMR 분석을 통해 각 화합물을 동정하였고 그 결과는 다음과 같다.

¹H-NMR 분석 결과 상기 SD-282 화합물은 ¹H-NMR (600MHz, DMSO) δ(ppm) : 7.36-7.34 (m, 2H), 7.31-7.28 (m, 2H) 7.105 (s, 2H) 6.89 (s,4H) 3.69 (t, 2H, J=7.2Hz), 1.07 (t, 3H, J=7.2 Hz), MS (m/z) : [M+H]⁺ 224의 결과를 얻었다. 또한 상기 기술된 방법과 유사한 방법을 통해 다른 화합물들인 SD-281, SD-283 및 SD-284 화합물을 합성하였다.

<실험방법>

<1> 분석대상 세포

본 발명자들은 본원에서 새롭게 합성한 상기 본 발명의 신규 화합물이 면역질환을 치료 및 예방할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험군을 토대로 하기 실험을 수행하였다.

본 발명의 실험에서 수행한 실험군

실험군	실험 대상세포
정상마우스군	정상마우스 DBA1J 마우스의 비장, BM 세포
류마티스관절염 마우스군	CIA로 류마티스 관절염이 유도된 DBA1J 마우스의 비장, BM 세포
루프스 마우스군	루프스가 발병된 sanroque 마우스의 비장, BM 세포
인간 P.B군	인간말초 혈액(P.B)에서 분리한 림프구

보다 구체적으로, 상기 정상마우스 군은 DBA/1J계 정상마우스로부터 수득한 비장세포를 대상으로 본 발명의 화합물을 처리하기 전에 anti-CD3 0.5ug/ml 자극 조건에서 72h 배양하여 상기 세포를 활성화 시킨 후 사용하였다.

또한 류마티스 관절염 마우스는 DBA/1J계 정상마우스를 사용하여 제조하였는데, 상기 정상마우스에 제 2형 콜라겐 (Cll) 을 4㎎/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액 (dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N Nacl) 으로 투석하여 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis)를 함유하는 complete Freund's adjuvant (CFA, Chondrex) 와 동량으로 섞은 후 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕ (즉 100㎕/100㎍) 으로 주사하였다 (1차 주사). 이로부터 2주 후 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's adjuvant (IFA, Chondrex) 와 섞은 후 100㎕ (즉 100㎕/100㎍) 를 한쪽 뒷다리(발바닥(foot pad))에 2차 주사하여 류마티스 관절염이 발병된 마우스를 제조하였고, 제조된 관절염 마우스로부터 비장세포를 수득하여 사용하였고 역시 anti-CD3 0.5ug/ml 자극 조건에서 72h 배양하여 상기 세포를 활성화 시킨 후 사용하였다.

또한 루프스 발병 마우스 모델은 당업계에서 루프스 모델로 사용되고 있는 sanroque 마우스를 사용하였으며, 인간 P.B군은 인간 말초혈액으로부터 림프구를 수득하여 사용하였다. 상기 각 마우스 및 인간말초혈액으로부터 비장세포의 분리 및 림프구의 분리는 당업계에 널리 알려진 일반적인 방법을 사용하여 수행하였고 수득한 세포는 모두 anti-CD3 0.5ug/ml 자극 조건에서 72h 배양하여 상기 세포를 활성화 시킨 후 사용하였다.

<2> 세포독성 분석(MTT 분석)

본 발명에서 합성한 화합물이 세포에 독성을 유발시키는지 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였는데, 대상세포들을 대상으로 각 세포를 플레이트(96 well plate)에 웰당 2×10⁵개의 세포수로 맞추어 분주하고 본 발명의 화합물을 각 농도별로 처리하고 72시간 동안 배양한 다음, 세포에 MTT 용액(0.5% 3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 다시 배양한 다음, ELISA(enzymelinked immunospecific assay) 측정기로 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성 유무를 관찰하였다.

<3> 자가항체 생산 면역반응 조절 분석

혈청 내 Total IgG와 Total IgG1 및 IgG2a 항체 생산에 본 발명의 신규 화합물이 영향을 미치는지 확인하기 위해 효소결합 면역측정법(ELISA)을 수행하였다. 따라서 본 발명의 화합물을 처리한 세포들을 대상으로 sandwich ELISA를 이용하여 Total IgG와 항체 특이적인 IgG1 및 IgG2a를 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 각각의 단클론성 anti-mouse IgG 와 CII로 상온에서 1시간 반응시키고 이후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. Mouse contorl serum를 1/2씩 연속 희석하여 스탠다드(standard)로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 첨가하고 실온에서 1시간 반응하였다. 이후 anti-mouse IgG-HRP, anti-mouse IgG2a-HRP 1시간 실온 반응시키고 4회 세척한 다음, TMB system으로 발색하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

<4> 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 염증 및 면역질환의 원인 물질인 염증성 사이토카인의 생성에 본원의 신규 화합물이 영향을 미칠 수 있는지를 확인하기 위해, 각 실험군을 대상으로 IL-17, IL-6, TNF-a, IFN-r, MMP-9, STAT-3의 생성 정도 및 이들 사이토카인의 mRNA의 발현정도를 분석하였는데, 염증성 사이토카인의 생성정도는 본 발명의 화합물이 처리되어 배양된 세포들을 대상으로 상층액을 수득한 후, 효소결합 면역측정법(ELISA)을 통해 분석하였는데, 구체적으로 상기 세포에 각 사이토카인에 대한 특이 항체(anti-IL-17, anti-IL-6, anti-TNF-a, anti-IFN-r, anti-MMP-9, anti-STAT-3)로 4에서 밤새 반응시킨 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후, biotinylated된 상기 각 항체를 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 염증성 사이토카인의 발현 정도 분석은 분석 대상 세포들로부터 총 RNA을 수득한 다음, IL-17, IL-6, TNF-a 및 IFN-r에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 mRNA의 양을 분석하였다.

<5> Th17 세포억제 및 Treg 세포유도 활성 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명의 신규 화합물이 염증유발과 관련된 Th17세포의 분화 및 활성을 억제할 수 있는지와 동시에 면역조절능을 갖는 Treg 세포의 활성은 촉진시킬 수 있는지 확인하기 위해 유세포분석기를 사용하여 분석하였다. 즉, T 세포를 대상으로 Th 17세포 또는 Treg 세포 분화조건으로 세포를 배양한 후, Foxp3+ Treg 세포 또는 il-17+ Th 17의 세포수를 유세포분석기를 통해 분석하였다.

<6> 파골세포 분화억제 효과

파골세포 분화 과정에서 본 발명의 신규 화합물의 영향을 조사하기 위해, 마우스의 골수세포를 수득하고 골수세포를 MCSF(macrophage colony-stimulating factor) 및 용해성 RANKL의 존재 하에서 분화되도록 유도하였다(Sugatani et al. 2003, J. Cell. Biochem. 90, 59-67 방법 참조). 골수세포는 6주령의 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 준비하였고, 37℃에서 8구 챔버 슬라이드(3×10⁵세포/구; Nalge Nunc International, Naperville, IL)에서 M-CSF(30ng/ml:R&D Systems, Minneapolis, MN)의 존재 하에 정치시켰고, 3일 후에 림프구를 포함한 비접착성 세포를 제거한 다음, 접착성 파골세포의 전구세포를 M-CSF(30ng/ml) 및 RANKL(30ng/ml; Strathmann, Hamburg, Germany)의 존재 하에서 추가로 4일 동안 배양하여 파골세포를 수득하였다. 이때 세포배양 배지는 M-CSF 및 RANKL가 첨가되어 있는 동안에 1차례 교환하였다. 세포를 고정하고 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)에 대하여 염색 키트(sigma)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 염색을 실시하였다. 각 챔버에서 현미경으로 (40배율)관찰한 결과, 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP 양성 다핵세포는 파골세포로서 계수되었다(Sugatani. et al. 2003,J. Cell. biochem. 90, 59-67).

또한, 골수세포를 파골세포로 분화하고, M-CSF 및 RANKL의 존재하에서 본원발명의 신규 화합물을 각 농도로 처리한 다음, 48시간 동안 배양시키고, 이후 세포를 TRAP에 대하여 염색하고 TRAP 양성인 다핵 세포를 계수하였다.

<실험예 1>

본 발명에 따른 신규 화합물의 세포독성 분석결과

상기 실시예 1에서 합성한 신규 화합물이 세포 독성이 있는지 확인하기 위해 상기 표 2에 기재된 각 실험군의 세포들을 대상으로 앞서 기술된 바와 같이 MTT 분석을 수행하였다. 즉, 각 실험군의 세포를 웰당 2×10⁵개의 세포수로 맞추어 분주하고 4개의 화합물 각각을 각 농도별로 처리한 후, 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 신규 화합물인 SD-282 화합물을 처리한 군은 대조군(아무것도 처리하지 않은 군) 또는 메트포민 처리군과 비교했을 때 세포 농도별 처리에 따른 세포 독성이 관찰되지 않는 것으로 보아 본 발명의 신규 화합물은 정상 세포 및 질병군 세포에 따른 세포 독성이 없다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

본 발명에 따른 신규 화합물의 자가항체 생산 면역반응 조절효과 결과

상기 실시예 1에서 합성한 신규 화합물의 자가항체 생산에 의한 면역반응에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 상기 기술된 4개 군의 마우스로부터 안와채혈을 통해 각 마우스 군으로부터 혈액을 수득하고 혈청을 분리하여 IgG, IgG1, IgG2a의 양을 측정하였다.

분석 결과, 본원의 화합물이 질병 조건에서 자가항체 생산 상태인 면역 글로불린(총 IgG, IgG1, IgG2)의 양이 화합물의 처리 농도별로 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 신규한 본 발명의 화합물은 과도한 면역반응을 억제하는 면역조절 기능을 가지고 있음을 알 수 있었다(하기 표 3 참조).

	총 IgG			IgG1			IgG2
	A	B	C	A	B	C	A	B	C
대조군	11	83.2	141.5	311.4	286	422.3	103.2	109.6	151.9
SD-281	2.3	58.1	124.5	83.8	135.2	258.2	35.6	33.5	84.3
SD-282	0.7	60.3	127.7	1	218.7	425.4	37.1	38.3	110.9
SD-283	2.9	49.6	113.5	41	135.3	296.5	97.6	99.4	76

단위:ng/ml

A: 정상마우스 세포, B: 류마티스관절염세포, C: 루프스 세포

< 실험예 3>

염증성 사이토카인의 생성 및 유전자 발현 억제 분석결과

본원발명의 신규 화합물이 염증 및 면역질환을 유도하는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고 나아가 이들 인자를 유전자 수준에서 억제하는지 확인하기 위한 실험을 상기 실험방법 <4>에 기재된 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향 분석에 기술된 방법으로 실험을 수행하였다.

분석 결과, 본 발명의 신규 화합물 모두 염증성 사이토카인인 IL-17, IL-6, TNF-a , IFN-r, MMP-9, STAT-3의 생성 및 유전자 수준에서의 발현을 모두 처리 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 신규 화합물은 염증성 사이토카인의 생성 억제를 통해 면역질환을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다(하기 표 4 참조).

4가지 화합물의 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향 분석

	IL-17				IL-6				TNF-a				IFN-r
	A	B	C	D	A	B	C	D	A	B	C	D	A	B	C	D
대조군	3.2	3.7	0.9	0.3	2.2	1.9	1.8		0.9	0.1	1.3		9.4	8.3	14.5	0.2
SD-281	1.7	2.2	0.6	0.1	1.4	1.4	1		0.5	0.4	0.7		5.8	5.3	10	0.1
SD-282	1.7	2.1	0.6	0.1	1.3	1.3	1		0.4	0.4	0.7		3.3	2.9	7.6	0.1
SD-283	1.6	2.2	0.4	0.1	1.4	1.1	0.9		0.5	0.3	0.6		7.2	5.4	5.5	0.1
SD-284				0.1												0.08

단위:ng/ml

A: 정상마우스 세포, B: 류마티스관절염세포, C: 루프스 세포, D: 인간 말초혈액의 림프구

SD-284 화합물의 정상마우스 세포를 대상으로 한 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향 분석

	IL-17	IL-6	TNF-a	IFN-r
대조군	7.6	1.8	0.7	10
SD-284	6.5	0.7	0.5	4.9

단위:ng/ml

본 발명의 화합물의 염증성인자의 활성 억제 분석

	TNF-a			MMP-9			STAT3
	A	B	C	A	B	C	A
대조군	1	1	1	1	1	1	1
SD-281	0.2	0.6	0.1	0.5	0.4	0.4	1.2
SD-282	0.07	0.06	0.8	0.1	0.08	1.3	0.6
SD-283	0.4	0.06	0.1	0.3	1	0.04	1.3

단위: 유전자 발현

A: 정상마우스 세포, B: 류마티스관절염세포, C: 루프스 세포

<실험예 4>

Th17 및 Treg 세포의 조절활성 분석결과

본 발명자들은 본원의 신규 화합물에 대해 염증성 사이토카인인 IL-17을 분비하는 Th17 세포의 분화 및 활성과 함께 면역조절능을 갖는 Treg 세포의 분화 및 활성을 동시에 조절할 수 있는지 조사하기 위해 상기 <5>에 기재된 Th17 세포억제 및 Treg 세포유도 활성 분석을 수행하였다.

분석 결과, 본원발명의 신규 화합물은 Th17 분화 조건에서 질병세포에서의 IL-17 발현을 감소시키고 질병세포인 Th17 세포로의 분화를 억제시키는 활성이 있는 것으로 나타났고, 동시에 Treg 조건하에서는 면역조절세포의 마커인 Foxp3의 발현 및 Foxp3 발현 세포수가 증가하는 것으로 나타났다. 더불어 과 활성된 Th17세포를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 화합물의 Th17 억제 및 Treg 활성 영향분석

TCR condition	Th17			Treg
	A	B	C	A	B	C
대조군	2	3.4	1.1	2.6	3.3	2.8
SD-281	1.2	1.5	0.8	2	4.6	2.8
SD-282	1.2	1.5	0.9	2.5	4.6	2.9
SD-283	1.1	2.3	0.5	3	5.1	3.3

A: 정상마우스 세포, B: 류마티스관절염세포, C: 루프스 세포, D: 인간 말초혈액의 림프구

본 발명에 따른 화합물의 Th17 분화 조건에서 Th17 에 미치는 영향 분석

Th17 condition	Th17
	A
대조군	5.7
SD-281	0.4
SD-282	0.5
SD-283	0.9
SD-284	2

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신규 화합물이 Th17 및 Treg을 개별적으로 조절하는 것이 아니라 동시에 조절할 수 있어 보다 효과적으로 면역조절능을 유도할 수 있음을 알 수 있었으며, 이로써 보다 효율적인 면역조절제 또는 면역질환 치료제로 본원에서 신규로 합성한 상기 신규 화합물을 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실험예 5>

파골세포 분화억제 분석결과

본 발명자들은 본원의 신규 화합물이 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는지 확인하기 위해, M-CSF 및 RANKL로 자극된 세포에서 본 발명의 화합물에 의한 파골세포 분화억제 정도를 파골세포 분화인자인 TRAP 염색을 통해 확인하였다.

분석결과, 본 발명의 신규 화합물이 파골세포 분화 마커인 TRAP이 발현된 세포수가 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본원발명의 신규 화합물은 관절 파괴를 유발하는 파골세포의 분화능을 효과적으로 감소시켜 파골세포의 분화로 인한 질환의 예방 및 치료에도 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 화합물의 파골세포 분화 억제 효과 분석

	TRAP+세포
	A	B
대조군	310	246
SD-281	196	57
SD-282	157	89
SD-283	123	85

A: 정상마우스 세포, B: 류마티스관절염세포

이상 상기와 같은 실험 결과는 상기 표의 결과들 이외에 도 1~ 도 7의 결과를 통해서도 위의 기술된 결과의 내용을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. 하기 화학식으로 표기되는 신규 화합물 또는 이의 염;
   

   

   .
2. 제1항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염 또는 루프스인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제2항에 있어서,
   상기 화합물은 조성물에 0.1mM ~ 10mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제1항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 또는 루프스의 예방 또는 치료를 위한 면역조절제 조성물.
12. 시험관 내에서 제1항의 화합물을 미분화 T 세포에 처리하여 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 및 Th17 세포의 활성을 감소시키는 방법.
13. 시험관 내에서 제1항의 화합물을 미분화 T 세포에 처리하여 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화 및 Treg 세포의 활성을 증가시키는 방법.

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