KR102237646B1 - 타크롤리무스 및 비타민d를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

타크롤리무스 및 비타민d를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타크롤리무스 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포로의 분화를 억제하는 효과가 우수하여, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

타크롤리무스 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating immune disease comprising tacrolimus and vitamin D}
본 발명은 타크롤리무스 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.
따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 또한 Th1과 같은 IFN-gamma를 분비하는 면역세포에는 효과적으로 작용하는 데 반하여 또다른 병인 세포인 Th17에는 효과적으로 작용하지 못하는 단점이 있다.
또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다. 따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
KR 10-1234993
따라서 본 발명의 목적은 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, IL-17, IL-22 또는 IL-23의 발현 및 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈 및 궤양성 대장염, 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증, 이식편대숙주질환 중에서 선택될 수 있다.
나아가 본 발명은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포로의 분화를 억제하는 효과가 우수하여, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 따른 염증성사이토카인 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 T 세포를 Anti-CD3와 Anti-CD28로 자극하여 분화시켰을 때 타크롤리무스와 비타민D의 단독 혹은 병용 투여 시의 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 따른 Th17 및 염증성사이토카인 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 실제 신장이식 후 타크롤리무스를 복용 중인 환자를 대상으로 비타민 D3 투여량에 따른 효과를 분석한 결과이다.
본 발명은 효과적인 면역질환의 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 타크롤리무스(Tacrolimus)와 비타민 D를 복합처리하는 경우 매우 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있음을 규명한 점에 특징이 있다.
따라서 본 발명은 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 상기“타크롤리무스(Tacrolimus)”는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이며, Streptomyces tsukubaensis에 의해 만들어진 면역억제제이다.
면역억제작용은 사이클로스포린보다도 강하고, 장기이식 시 특히 간을 이식할 때 거부반응을 억제시키기 위해 사용한다고 알려져 있다. 또한, T세포 내의 타크로리무스결합단백질과 결합하여 칼시뉴린의 작용을 억제시킴으로써 IL-2의 생성을 억제하여 결과적으로는 면역현상을 억제한다고 알려져 있는 화합물이다.
Figure 112014106224475-pat00001

한편, 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.
특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.
또한, 앞서 종래기술에도 기술한 바와 같이, T 세포는 Treg 세포 이외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
그러나 Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D의 병용 투여가 면역질환의 치료에 효과가 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 사람의 신장 근위 세뇨관 상피세포(Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells;HRPTEpiC)에 IL-17과 TNF-α 처리를 하면 IL-6와 IL-8 의 분비가 증가되는 등 염증이 발생함을 알 수 있었다(도 1 A 및 B 참조). 그러나 비타민 D를 추가하면 증가되었던 IL-6와 IL-8 의 분비가 감소됨을 알 수 있었다(도 1 C 및 D 참조). 마찬가지로 신장 뇨세관 상피세포(renal tubular epithelial cell)를 사람의 퍼리페럴 T세포(human peripheral T cell)와 공동배양(coculture)을 하면 신장 뇨세관 상피세포에서 IL-6와 IL-8 의 분비가 현저하게 증가하고 비타민 D 를 추가하면 역시 IL-6, IL-8 의 분비가 감소함을 알 수 있었다. 그러나 타크롤리무스를 단독 처리를 했을 때는 IL6, IL-8의 분비를 억제하지 못하였으나, 본 발명의 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여하면 IL-6, IL-8 의 분비가 현저하게 감소됨이 확인되어 타크롤리무스의 불완전한 효과를 비타민 D3 추가로서 보완할 수 있음을 알 수 있었다(도 1 E 및 F 참조).
따라서 본 발명은 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 타크롤리무스(Tacrolimus) 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure 112014106224475-pat00002

또한, 본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.
그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 “자가면역질환”이라고 한다.
또한, 염증성 질환이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.
또한, 본 발명에서 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 치료또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 면역질환을 경감시킴.
(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및
(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민D를 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
사람의 신장 근위 세뇨관 상피 세포 배양
사람의 신장 근위 세뇨관 상피세포(Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells;HRPTEpiC)는 비필수아미노산(non-essential amino acids), 비타민(vitamins), 유기물 및 무기물 화합물(organic and inorganic compounds), 호르몬(hormones), 성장인자(growth factors), 미량 무기물(trace minerals), 2% FBS 조성의 Epithelial Cell Medium (EpiCM)에서 배양하였다. 하기 실험을 위하여 패시지(passage)가 5 ~ 10사이인 세포를 사용하였으며, 24웰 플레이트(well plate)에 1x104세포/well당 깔아서 배양하였다.
< 실시예 2>
환자의 말초 혈액 단핵세포 분리와 배양
환자로부터 얻은 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 혈액을 PBS (Phosphate-Buffered Saline)와 1:1로 섞어 Ficoll과 혈액+PBS을 1:4의 비율로 Ficoll층이 흐트러지지 않게 50 ml 튜브에 천천히 띠운 다음 혈액을 2000 rpm, 30분간 원심 분리하였다. 버피코트(Buffy coat)층만을 따서 새 튜브에 담은 후 PBS로 세척하고 세포 수를 세어 5X105개씩을 48웰 플레이트(NUNCTM,Denmark)에 배양하였다.
< 실시예 3>
세포자극 및 유세포 분석
상기 실시예 2의 방법으로 분리한 PBMC 세포를 각각 PMA (50ng/ml), Ionomycin (1ug/ml)과 Golgi-stop으로 4시간 동안 처리하여 PE/cy7 anti human CD4로 세포 표면을 염색(staining)하고 Cytofix/Cytoperm (BD ParMingen)를 이용하여 fixation /permabilization 시킨 후 PE Conjugated Anti human IL-17A, FITC Conjugated Anti human IFN-g, APC anti human IL-10로 세포에 각각 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. FACs 버퍼로 씻어준 후 유세포 분석기(FACs Calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)로 측정하였다.
< 실시예 4>
사이토카인 측정
세포실험에서 분리한 배양액과 환자 혈청에서 IL-6, IL-8, IL-17, IL-22, IL-23, IL-1b를 sandwich ELISA를 이용하여 농도를 측정하였다. Sandwich ELISA용 96웰 플레이트(NUNC, Denmark)에 단클론성 IL-6, IL-8, IL-17, IL-22, IL-23, IL-1b항체(R&D, USA)를 각각 4 μg/mL로 50 μl/well씩 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 차단용액(1% BSA/PBST) 을 200 μl/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다.
스탠다드(Standard)로는 재조합 IL-6, IL-8, IL-17, IL-22, IL-23, IL-1b (R&D, USA)를 이용하여 각각 5 ng/mL∼78 pg/mL 농도를 사용하였다. 표준시료와 함께 측정할 분리한 환자 혈청을 50 μl/ well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응용기를 세척용액(0.05% Tween 20/PBS)으로 4번 세척하고 바이오티닐레이티드(biotinylated) IL-6, IL-8, IL-17, IL-22, IL-23, IL-1b(R&D,USA)항체(R&D, USA)를 200 ng/mL로 희석하여 50 μl/well씩 넣어 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척용액으로 4번 세척하였다. 마지막으로는 Extravidin-Alkaline phosphatase conjugate (SIGMA, USA)를 1：2,000으로 희석하여 50 μl/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 그런다음 세척시켰으며, 세척 후 phosphate disodium salt hexahydrate (PNPP, Fluka)/Diethanolamine 용액(DEA, 97Ml, NaN3 0.2 g, MgCl2H2O 0.1 g, 1차 증류수 800 ml)을 1 mg/ml 농도로 녹여 50 μl/well씩 넣어 30분 후 0.2 M NaOH로 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
< 실시예 5>
신호전달 인자 조사
전기영동은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)을 사용하였고 전기영동시 한 레인(lane)에 가하는 시료는 세포 수 5×105 정도의 양이 되게 조절하였다. 전기영동 후 젤은 나이트로셀룰로스(nitrocellulose) 흡착지(Amersham Pharmacia Biotech, Germany)를 사용하여 4℃,100volt,150mA로 2시간 동안 단백을 이동시켰다. 전기영동을 끝낸 후 흡착지를 분리해 내어 차단용액(5% fat free skim milk in Tris-Buffered Saline)에 담가 실온에서 1시간 반응시켰다.
차단용액을 버리고 세척용액(0.01% Tween20/Tris-Buffered Saline)으로 차단용액을 세척하였다. 흡착지를 꺼내어 1：1,000으로 희석한 항 VDR, p-mTOR, mTOR, p-Akt, Akt, p-s6k, p-stat3(705), p-stat3(727), stat3, REDD1 항체(Cell signaling, USA) 또는 항 beta-actin 항체(SIGMA, USA)로 4℃의 온도에서 밤새 반응시키고 흡착지를 꺼내어 세척용액으로 3회 세척하였다. 항체 희석액으로 HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 goat anti-rabbit IgG (PIERCE, USA)로 1：1,000으로 희석한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 흡착지를 꺼내어 세척용액으로 4번 세척하고 Supersignal west Pico Chemiluminescent Substrate(PIERCE, USA)의 용액 1, 2를 1：1로 섞어서 흡착지에 반응시키고 X-ray film (AGFA, Belgium)에 노출시켜 항체 결합 신호를 확인하였다.
< 실시예 6>
Real - time PCR
IL-17의 유전자 발현을 조사하기 위해, 염기서열 IL-17 (sense: CCT CAA AGC TCA GCG TGT CC, antisence: GAG CTC ACT TTT GCG CCA AG), b-actin (sence: GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA G, antisence: TGT AGT TTC ATG GAT GCC ACA G)를 사용하였다. real-time PCR을 위해 SYBR Green I (Roche Diagnostic, Mannheim,Germany)를 사용하였고, 라이트 사이클러 장치(Light Cycler instrument; Roche Diagnostic)로 분석하였다.
< 실험예 1>
타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 따른 염증성사이토카인 억제 효과
본 발명자들은 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 따라 염증성사이토카인 억제 효과가 있는지 여부를 알아보기 위해서 실험한 결과, 사람의 신장 근위 세뇨관 상피세포(Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells;HRPTEpiC)에 IL-17과 TNF-α 처리를 하면 IL-6와 IL-8 의 분비가 증가되는 등 염증이 발생함을 알 수 있었다(도 1 A 및 B 참조). 그러나 비타민 D를 추가하면 증가되었던 IL-6와 IL-8 의 분비가 감소됨을 알 수 있었다(도 1 C 및 D 참조).
마찬가지로 신장 뇨세관 상피세포(renal tubular epithelial cell)를 사람의 퍼리페럴 T세포(human peripheral T cell)와 공동배양(coculture)을 하면 신장 뇨세관 상피세포에서 IL-6와 IL-8 의 분비가 현저하게 증가하고 비타민 D 를 추가하면 역시 IL-6, IL-8 의 분비가 감소함을 알 수 있었다. 그러나 타크롤리무스를 단독 처리를 했을 때는 IL6, IL-8의 분비를 억제하지 못하였으나, 본 발명의 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여하면 IL-6, IL-8 의 분비가 현저하게 감소됨이 확인되어 타크롤리무스의 불완전한 효과를 비타민 D3 추가로서 보완할 수 있음을 알 수 있었다(도 1 E 및 F 참조).
< 실험예 2>
말초혈액 단핵세포에서 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 따른 면역질환 치료 효과 분석
본 발명자들은 말초혈액 단핵세포에서 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 따른 면역질환 치료 효과를 알아보기 위하여 T 세포를 Anti-CD3와 Anti-CD28로 자극하여 분화시켰을 때 타크롤리무스와 비타민D의 단독 혹은 병용 투여 시의 효과를 비교하였다.
그 결과, 도 2C에서 보이는 것과 같이 비타민 D3는 타크롤리무스를 효과적으로 억제하지만 타크롤리무스는 억제하지 못함을 알 수 있었다. 그리고 도 2G에서 보이는 것과 같이, 타크롤리무스에 의해서 억제되지 않았던 Th17가 비타민 D3의 추가에 의하여 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다(도 2 참조).
또한, Th17 으로 분화를 유도한 조건(IL-1beta, IL-6)으로 말초혈액 단핵구를 처리했을 때도 비타민 D3는 농도 의존적으로 Th17을 억제함을 알 수 있었고(도 3C 참조), 타크롤리무스에 의해서 억제되지 않는 Th17는 비타민 D3 추가에 의해서 Th17가 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다(도 3D 참조).
면역반응을 유발한다고 알려져 있는 염증성사이토카인인 IL-17, IL-22은 본 발명의 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여에 의해서 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다(도 3E,F,G,H 참조).
< 실험예 3>
신장이식 후 타크롤리무스를 복용 중인 환자를 대상으로 비타민 D3 투여량에 따른 면역질환 치료 효과 분석
상기 실험예 1 및 2의 실험으로 타크롤리무스와 비타민D 단독 투여보다 본 발명의 타크롤리무스와 비타민D 병용 투여를 했을 때 염증성 사이토카인의 발현이 확연히 억제되어 면역질환의 치료에 이를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명자들은 이에 더 나아가 실제 신장이식 후 타크롤리무스를 복용 중인 환자를 대상으로 비타민 D3 투여량에 따른 효과를 분석하였다.
도 4에서 언급되어 있는 T1 군은 비타민 D3의 양에 따른 하위 1/3, T2 군은 비타민 D3의 양에 따른 중간, T3 군은 비타민 D3의 양에 따른 상위 1/3을 의미한다.
도 4B의 결과를 보면, 혈중 비타민 D3의 농도가 높은 T3 군의 경우 T1, T2 군에 비하여 이식 후 거부반응이 월등히 적게 발생함을 알 수 있었고, Th17 연관된 싸이토카인인 IL-17, IL-22, IL-23 및 IL-1b의 농도 역시 혈중 비타민 D3의 농도가 높은 T3에서 T1, T2 군보다 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 4 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 타크롤리무스 및 비타민 D3는 1:10의 중량비율로 혼합하고,
    상기 고형장기는 신장인 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, IL-17, IL-22 또는 IL-23의 발현 및 생성을 억제하는 것인, 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 시험관 내에서(in vitro), 타크롤리무스(Tacrolimus) 및 비타민 D3를 세포에 처리하는 단계를 포함하고, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, IL-17, IL-22 또는 IL-23의 발현 및 생성을 억제하여 고형 장기 이식 후기 및 만성 거부증을 억제하는 방법으로,
    상기 타크롤리무스 및 비타민 D3는 1:10의 중량비율로 혼합하고
    상기 고형장기는 신장인 것인, 방법.
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