WO2023140721A1 - 위암 환자 장내균총 분석을 통한 면역 저하 진단과 장내균총을 이용한 테라그노시스 조성물 - Google Patents

위암 환자 장내균총 분석을 통한 면역 저하 진단과 장내균총을 이용한 테라그노시스 조성물 Download PDF

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WO2023140721A1
WO2023140721A1 PCT/KR2023/001123 KR2023001123W WO2023140721A1 WO 2023140721 A1 WO2023140721 A1 WO 2023140721A1 KR 2023001123 W KR2023001123 W KR 2023001123W WO 2023140721 A1 WO2023140721 A1 WO 2023140721A1
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WO
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cancer
composition
cells
expression
tumor
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PCT/KR2023/001123
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English (en)
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송교영
조미라
전주연
정윤주
김소정
이승윤
우진석
이건희
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a diagnosis of immunosuppression by analyzing the intestinal flora of gastric cancer patients and a theragnosis composition using the intestinal flora.
  • chemotherapeutic agents prescribed to cancer patients target cancer cells and have an effect of killing cancer cells, but also affect normal cells, resulting in side effects such as hair loss, fever, and reduced immunity in patients. Since then, based on genetic studies on cancer, target anticancer agents targeting genetic mutations occurring in each cancer type have been developed, and side effects caused by existing chemotherapy agents have been improved.
  • cancer cells which adapt very quickly to the environment, induce resistance to anticancer agents to escape from the attack of target anticancer agents, and there is a problem that 100% continuous cancer treatment effect by targeted anticancer agents cannot be expected.
  • immunotherapeutic agents for various immune checkpoint inhibitors that control the immunity of patients while maintaining anticancer effects have been developed and are being used as therapeutic agents for patients.
  • treatment for PD-1/PD-L1 is known to show a high therapeutic response in patients with skin cancer, lung cancer, and the like.
  • These immuno-anticancer agents have functions of inhibiting the proliferation of cancer cells and increasing the activity of immune cells by regulating the function of immune cells in the tumor microenvironment.
  • immuno-anticancer drugs also do not show the same anti-cancer effect in all patients, biomarkers for immuno-anticancer drugs are not clearly identified, anti-cancer drug resistance occurs due to JAK-STAT gene mutation, autoimmune diseases due to the characteristics of antibody composites, and expensive treatment costs.
  • the microbiome refers to microorganisms living in the human body, and includes the microorganisms in the intestine.
  • the number of microbiome is more than twice the number of pure human cells, and the number of genes is more than 100 times. Therefore, it is also called the Second Genome because it is impossible to discuss human genes without mentioning microorganisms.
  • the microbiome is a field that can be widely used in the development of new drugs and research on treatments for incurable diseases, as it can analyze the relationship between the principle of production of beneficial and harmful bacteria and diseases.
  • the microbiome is also used in the development of food, cosmetics, and therapeutics.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • probiotics that can directly control the structure of the human intestinal microbiome are emerging.
  • probiotics have been known to be deeply related to the human microbiome through many studies, and their function as a regulator that changes the intestinal environment is attracting attention.
  • Intake of probiotics is known to promote digestion through microbiome regulation, as well as suppress inflammatory bowel disease, infectious diseases, or harmful bacteria.
  • Prebiotics are defined as 'substances that are selectively used by beneficial bacteria conducive to health among host microorganisms', and dietary fiber and oligosaccharides serving as food for lactic acid bacteria are typical examples.
  • Synbiotics are a combination of probiotics and prebiotics.
  • postbiotics which has recently been attracting attention, is a material containing useful metabolites produced by probiotics and components of microorganisms, and is clearly defined as 'a non-living form of microorganisms beneficial to the host's health or a formulation containing components of the microorganisms'.
  • the present inventors confirmed that the novel compound can suppress the expression of PD-L1, a cancer cell surface protein, and effectively kill cancer cells, thereby suppressing the immune response evasion of cancer cells and increasing the activity of immune cells.
  • the microbiome with reduced diversity and taxa was identified and selected, and it was confirmed that the selected strains improved the immunity of the cancer patient group and that the metabolites of the strain also improved the immune response. As a result, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a compound represented by Formula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving cancer, comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer with increased expression of Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1), comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • PD-L1 Programmed Death-Ligand 1
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, containing butyrate or microbiome as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving cancer, including butyrate or microbiome as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to administer a composition containing butyrate or a microbiome as an active ingredient to a subject; Faecalibacterium sp. It is to provide a method for increasing strains of Faecalibacterium sp. and reducing Phylum strains of Proteobacteria, including.
  • Another object of the present invention is to provide a method for increasing T cell function and antigen presenting cell (Antigen Presenting Cell, APC) function of a cancer patient group, comprising administering to a subject a composition containing butyrate or a microbiome as an active ingredient.
  • APC Antigen Presenting Cell
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of butyrate or microbiome.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is provided.
  • the present invention provides an anticancer adjuvant comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer, comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer with increased expression of Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1), comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • PD-L1 Programmed Death-Ligand 1
  • the present invention provides a cancer treatment method comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising butyrate or microbiome as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer, including butyrate or microbiome as an active ingredient.
  • the step of administering to a subject a composition containing butyrate or a microbiome as an active ingredient; Faecalibacterium sp. Increases strains of Faecalibacterium sp. in a cancer patient group and provides a method for reducing Proteobacteria phylum strains.
  • the present invention provides a method for increasing T cell function and antigen presenting cell (Antigen Presenting Cell, APC) function of a cancer patient group, comprising administering to a subject a composition containing butyrate or a microbiome as an active ingredient.
  • APC Antigen Presenting Cell
  • the present invention provides a method for treating cancer comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of butyrate or microbiome.
  • SD217 a novel compound of the present invention, specifically kills gastric cancer cells and effectively inhibits the expression of PD-L1, a surface protein expressed by gastric cancer cells to evade the human immune response, thereby killing gastric cancer cells and enhancing immune function.
  • the diversity of the intestinal flora was reduced in gastric cancer patients, and it was confirmed that the composition ratio of the intestinal flora was different from that of healthy adults and patients with benign tumors.
  • the immune function was lowered, and the immune function of the patient was lowered as the gastric cancer progressed.
  • butanoic acid inhibits tumor growth and reduces the expression of tumor markers and immunocompromised markers in an avatar animal model of a gastric cancer patient in which the patient's immune status is reflected and a gastric cancer cell line is transplanted. Therefore, it was confirmed that personalized medicine can be realized by diagnosing the intestinal flora colony collapse and immunosuppression in the gastric cancer patient group, and confirming the effect of increasing immunity and restoring the intestinal flora according to the treatment with the effective substance of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing apoptosis of gastric cancer cell lines treated with SD217 of the present invention by flow cytometry (A: flow cytometry results, B: quantification of analysis results).
  • Figure 2 is a flow cytometric analysis of the expression of PD-L1, a surface protein of gastric cancer cell lines treated with SD217 of the present invention (A: flow cytometry results, B: quantification of analysis results).
  • Figure 3 is a diagram showing tumor growth inhibition by administering SD217 of the present invention to mice with gastric cancer tumors (A: confirmation of tumor growth inhibition, B: quantification of tumor volume).
  • Figure 4 is a diagram quantifying early and late apoptosis of SD217 of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram comparing intestinal flora diversity in gastric cancer patients and healthy adults (A: comparison of intestinal flora diversity, B: comparison of reduced intestinal flora).
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the diversity of intestinal flora in gastric cancer patients and healthy adults by ⁇ -diversity and ⁇ -diversity (A: Observed OTU and Chao1 analysis results, B: PCoA plot and bray curstis distance analysis results).
  • composition ratio of intestinal flora in gastric cancer patients and patients with benign tumors (A: comparison of composition ratio of intestinal flora, B: comparison of composition of the genus Faecalibacterium)
  • Figure 8 is a diagram comparing the expression of T cell immunity deterioration factors in gastric cancer patients and benign tumor patients (A: IL-10 expression confirmed, B: IL-17 expression confirmed, C: INF- ⁇ expression confirmed).
  • FIG. 9 is a diagram comparing the expression of PD-1, a marker for lowering T cell immunity, in gastric cancer patients and benign tumor patients (A: comparison of CD4 + cells, B: comparison of CD8 + cells).
  • FIG. 10 is a diagram comparing the expression of PD-L1, an immunosuppression factor, in antigen-presenting cells in gastric cancer patients and benign tumor patients (A: comparison of CD68 + cells, B: comparison of CD11 + cells).
  • FIG. 11 is a diagram comparing the expression of IL-10, an immunity-lowering factor, in antigen-presenting cells in gastric cancer patients and benign tumor patients (A: comparison of CD68 + cells, B: comparison of CD11 + cells).
  • FIG. 12 is a diagram comparing the expression of PD-1 and CTLA-4, which are T-cell immunity reducing factors, in early gastric cancer patients and late gastric cancer patients (A: PD-1 expression comparison, B: CTLA-4 expression comparison).
  • FIG. 13 is a diagram comparing the expression of PD-L1 and IL-10, which are immunity-lowering factors of antigen-presenting cells, in early gastric cancer patients and late gastric cancer patients (A: comparison of PD-L1 expression, B: comparison of IL-10 expression).
  • FIG. 14 is a diagram comparing the expression of PD-L1, an immunocompromising factor in antigen-presenting cells, according to the course of gastric cancer in gastric cancer patients (A: comparison of CD68 + cells, B: comparison of CD11 + cells).
  • FIG. 15 is a view showing the expression of PD-L1 and IL-10, which are immunocompromising factors, in gastric cancer tissues according to the course of gastric cancer in gastric cancer patients by confocal microscopy (A: analysis result, B: quantification of analysis result).
  • 16 is a diagram comparing the expression of PD-L1 and IL-10 in macrophages of gastric cancer patients treated with butyrate (A: comparison of PD-L1 expression, B: comparison of IL-10 expression).
  • 17 is a diagram comparing the expression of PD-L1 according to the treatment of Faecalibacterium prausnitzii in macrophages of gastric cancer patients.
  • Figure 18 is a diagram confirming the expression of immunocompromised markers according to the treatment of butyrate or Faecalibacterium prausnitzii in macrophages of gastric cancer patients (A: quantification of marker expression in macrophages, B: quantification of marker expression in culture medium, C: quantification of marker expression according to Faecalibacterium prosnichi treatment).
  • FIG. 19 is a diagram showing apoptosis according to treatment of gastric cancer cell lines with Faecalibacterium prausnitzii of the present invention by flow cytometry (A: flow cytometry results, B: quantification of analysis results).
  • FIG. 20 is a diagram showing apoptosis in gastric cancer cell lines treated with butyrate by flow cytometry (A: flow cytometry results, B: quantification of analysis results).
  • 21 is a diagram confirming cell viability according to treatment of gastric cancer cell lines with butyrate using absorbance.
  • FIG. 22 is a diagram confirming tumor growth inhibition according to treatment with butanoic acid in an immunostimulating avatar animal model of a gastric cancer patient (A: tumor growth inhibition result, B: quantification of tumor volume).
  • FIG. 23 is a diagram confirming the expression of tumor markers and immunocompromised markers in tumor tissues following treatment with butanoic acid in an immunosimilar avatar animal model of a gastric cancer patient by immunohistochemical staining (A: staining result, B: staining result quantification).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a compound represented by Formula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • SD217 compound of the present invention may be a compound (1-(2,4-difluorophenyl)biguanide) represented by Formula 1, and a specific preparation method is described in Preparation Example 1 below.
  • prevention refers to any action that suppresses symptoms or delays the progression of a specific disease by administering the composition of the present invention.
  • treatment refers to all activities that improve or beneficially change the symptoms of a specific disease by administration of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutically acceptable salt may include an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and organic acids and inorganic acids may be used as the free acid.
  • the organic acid may include, but is not limited to, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, glutamic acid, aspartic acid, and the like.
  • the inorganic acid may include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant in addition to the active ingredient.
  • an adjuvant in addition to the active ingredient.
  • any one may be used without limitation, but, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the effect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared in the form of incorporating the active ingredient into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers usable in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations may be prepared by mixing active ingredients with at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, preservatives, etc. may be included in addition to commonly used diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • As a base for suppositories witepsol, tween 61, cacao paper, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • composition according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration are contemplated, eg oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the subject. It is obvious that the concentration of the active ingredient included in the pharmaceutical composition can be variously selected according to the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmacological activity may not appear, and if the concentration exceeds 5,000 ⁇ g/ml, toxicity to the human body may be exhibited.
  • the composition may increase apoptosis of cancer cells, and the apoptosis may be early or late apoptosis.
  • the composition may inhibit the growth of cancer cells.
  • the composition may inhibit the expression of Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1), a surface protein of cancer cells.
  • PD-L1 Programmed Death-Ligand 1
  • PD-L1 and PD-1 of the present invention are cancer cell or hematopoietic cell surface proteins and T cell surface proteins.
  • PD-1 which is a T cell surface protein, binds to PD-L1
  • PD-L1 When PD-1, which is a T cell surface protein, binds to PD-L1, it is a protein that induces cancer cells to evade the immune response of T cells. It is a protein that lowers cancer cell specificity and, as a result, lowers immune function.
  • the cancer is gastric cancer, colon cancer, rectal cancer, perianal cancer, bone cancer, cerebrospinal tumor, head and neck cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, biliary tract cancer, bladder cancer, testicular cancer, small intestine cancer, germ cell tumor, endometrial cancer, fallopian tube carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, multiple myeloma, sarcoma, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, bladder It may be a cancer selected from the group consisting of cancer, urethral cancer, pituitary adenoma, renal pelvic carcinoma, spinal cord tumor, multiple myeloma, glioma cancer, CNS central nervous system tumor, hematopoietic tumor, fibrosarcoma, neuroblastoma, astrocytoma, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, pancreatic
  • the present invention provides an anticancer adjuvant comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the "anti-cancer adjuvant" of the present invention is an agent capable of improving, improving or enhancing the anti-cancer effect of an anti-cancer agent, which itself does not exhibit anti-cancer activity, but when used together with an anti-cancer agent, improves, improves or enhances the anti-cancer effect of the anti-cancer agent.
  • an agent exhibiting concentration-dependent anticancer activity when used together with an anticancer agent at a level that does not exhibit anticancer activity by itself, it may be an agent that can improve, enhance or enhance the anticancer effect of the anticancer agent.
  • the administration route of the anti-cancer adjuvant may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the anticancer adjuvant of the present invention may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, intranasally, pulmonaryly, or intrarectally, as desired, but is not limited thereto.
  • the anticancer adjuvant may be administered by any device capable of moving an active substance to a target cell.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer, comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the term “improvement” refers to any action that at least reduces a parameter associated with the condition being treated, eg, the severity of a symptom.
  • the food composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like conventional food compositions.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrins, cyclodextrins, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents thaumatin
  • stevia extracts eg rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention can be formulated in the same way as the pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, and health supplements.
  • the food composition may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the food composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages.
  • the functional food composition of the present invention may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. for the purpose of preventing or treating cancer.
  • 'health functional food composition' refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having useful functionalities for the human body in accordance with Act No. 6727 on Health Functional Foods, and nutrients for the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention may contain ordinary food additives, and its suitability as a food additive is determined by the standards and standards for the item in accordance with the General Rules and General Test Methods of Food Additives approved by the Korea Food and Drug Administration, unless otherwise specified.
  • Examples of the items listed in the 'Food Additive Code' include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum; and mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum
  • mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • a health functional food in the form of a tablet is a mixture obtained by mixing the active ingredient of the present invention with excipients, binders, disintegrants, and other additives, granulated in a conventional manner, and then compression-molded by adding a lubricant or the like, or the mixture can be directly compressed.
  • the health functional food in the form of a tablet may contain a flavoring agent and the like as needed.
  • hard capsules can be prepared by filling ordinary hard capsules with a mixture of the active ingredient of the present invention mixed with additives such as excipients
  • soft capsules can be prepared by filling a mixture of the active ingredient of the present invention mixed with additives such as excipients into a capsule base such as gelatin.
  • the soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, if necessary.
  • the health functional food in the form of a pill can be prepared by molding a mixture of the active ingredient of the present invention mixed with an excipient, a binder, a disintegrant, etc.
  • a health functional food in the form of granules may be prepared in a granular form by a conventionally known method of mixing an excipient, a binder, a disintegrant, etc. of the active ingredient of the present invention, and may contain a flavoring agent, a flavoring agent, etc., if necessary.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer with increased expression of Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1), comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • PD-L1 Programmed Death-Ligand 1
  • the composition may decrease the expression of PD-L1, and reducing the expression of PD-L1 may increase the cancer-specific activity of immune cells.
  • the present invention provides a cancer treatment method comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the treatment method of the present invention includes administering to a subject a therapeutically effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the specific therapeutically effective amount for a specific individual is preferably applied differently depending on the type and degree of response to be achieved, the specific composition including whether other agents are used as the case may be, the individual's age, body weight, general health condition, sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, various factors including drugs used together with or concurrently used with the specific composition, and similar factors well known in the medical field.
  • the daily dosage is 0.0001 to 100 mg/kg, preferably 0.01 to 100 mg/kg, based on the amount of the pharmaceutical composition of the present invention, and may be administered 1 to 6 times a day.
  • the dosage or dosage of each active ingredient should be such that the content of each active ingredient is too high to prevent side effects. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates as well as livestock such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, and cats.
  • the recombinant peptide or recombinant vector of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes. All modes of administration can be envisaged, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising butyrate or microbiome as an active ingredient.
  • microbiome refers to the entire genetic information of microorganisms living in the human body or the microorganisms themselves. It is a compound word of microbiota and genome, which are microorganisms that live and coexist in the human body. It means a field that can be widely used in the study of the microbial environment in the human body, such as
  • the microbiome may be Faecalibacterium prausnitzii .
  • the composition may be one that increases immune function, and may be one that inhibits the expression of immune degrading factors IL-10, IL-17 and INF- ⁇ .
  • increasing the immune function may be suppressing the expression of programmed cell death-1 (PD-1) or CTLA-4 of T cells.
  • PD-1 programmed cell death-1
  • CTLA-4 CTLA-4
  • increasing the immune function may be suppressing the expression of Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) and IL-10 in antigen presenting cells (APCs) or cancer tissues, and the antigen presenting cells may be macrophages or dendritic cells.
  • PD-L1 Programmed Death-Ligand 1
  • APCs antigen presenting cells
  • the antigen presenting cells may be macrophages or dendritic cells.
  • the composition may increase apoptosis of cancer cells.
  • the cancer is gastric cancer, colon cancer, rectal cancer, perianal cancer, bone cancer, cerebrospinal tumor, head and neck cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, biliary tract cancer, bladder cancer, testicular cancer, small intestine cancer, germ cell tumor, endometrial cancer, fallopian tube carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, multiple myeloma, sarcoma, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, bladder It may be selected from the group consisting of cancer, urethral cancer, pituitary adenoma, renal pelvic carcinoma, spinal cord tumor, multiple myeloma, glioma cancer, CNS central nervous system tumor, hematopoietic tumor, fibrosarcoma, neuroblastoma, astrocytoma, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, kidney
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer, including butyrate or microbiome as an active ingredient.
  • the step of administering to a subject a composition containing butyrate or a microbiome as an active ingredient; Faecalibacterium sp. Increases strains of Faecalibacterium sp. in a cancer patient group and provides a method for reducing Proteobacteria phylum strains.
  • the present invention provides a method for increasing T cell function and antigen presenting cell (Antigen Presenting Cell, APC) function of a cancer patient group, comprising administering to a subject a composition containing butyrate or a microbiome as an active ingredient.
  • APC Antigen Presenting Cell
  • the present invention provides a method for treating cancer comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of butyrate or microbiome.
  • SD217 a novel compound of the present invention, could specifically kill gastric cancer cells. Specifically, after inoculating 2x10 5 of AGS cell line, which is a gastric cancer cell line, into a 6-well plate, overnight, the novel compound of the present invention, SD217, was treated at a concentration of 0.2 mM, and after Annexin / PI staining after 48 hours, apoptosis was analyzed by flow cytometry to analyze cells. As a control group, a vehicle group treated with the same amount of PBS was used. Thereafter, early apoptosis cells were identified, and a late apoptosis/necrotic cell ratio was confirmed to confirm the death of the gastric cancer cell line.
  • AGS cell line which is a gastric cancer cell line
  • PD-L1 protein is a surface protein of gastric cancer cells
  • PD-L1 is a protein that binds to programmed cell death-1 (PD-1), a surface protein of activated T cells, to evade the immune response of T cells.
  • PD-1 programmed cell death-1
  • SD217 a novel compound of the present invention, inhibits tumor growth.
  • a gastric cancer transplantation animal model was prepared by subcutaneously injecting 5x10 6 of the AGS cell line, which is a gastric cancer cell line, into an immunodeficient mouse (NSG) of 6-8 weeks of age. After that, SD217 was orally administered daily at a concentration of 50 mg/kg. After AGS cell injection and SD217 administration, the size of the tumor was measured three times each week using calipers, and the length of the long axis and short axis of the tumor was substituted into Equation 1 below to calculate the tumor volume. As a control group, a vehicle group injected with the same amount of PBS was used.
  • SD217 a novel compound of the present invention, induces early and late apoptosis of gastric cancer cell lines. Specifically, after inoculating 2x10 5 of AGS cell line, which is a gastric cancer cell line, into a 6-well plate, overnight, the novel compound of the present invention, SD217, was treated at concentrations of 1, 5, 10, 20 and 50 mM, and after Annexin / PI staining after 48 hours, flow cytometry was analyzed to analyze apoptotic cells.
  • GC gastric cancer
  • HC healthy controls
  • BT benign tumor
  • fecal samples were stored at -70°C until analysis.
  • metagenome analysis bacterial genomic DNA isolation, microbial-specific 16S rRNA gene amplification, next-generation sequencing (NGS) analysis, and gut flora analysis and profiling were analyzed.
  • the gene was amplified with primers prepared at the site that could contain the V3 and V4 parts of the variant region among the bacterial-specific 16S rRNA gene sequences, and an index sequence for distinguishing the samples was attached.
  • PCR was performed twice to construct a library, and then sequencing was performed using Illumina's Miseq.
  • the translated sequences were analyzed using Quantitative Insights into Microbiological Ecology 2 (QIIME 2) and Lefse, which are bioinformatic analysis tools, and intestinal flora profiling was performed using Prism and R for statistical processing. Then, in order to confirm the abundance of the flora of each group, ⁇ -diversity analysis and ⁇ -diversity analysis were performed to analyze the similarity between each group.
  • ⁇ -diversity analysis confirmed that the Observed OTUs level was significantly different between the GC group and the H group, and it was confirmed that the Chao1 level of the GC group decreased in the Chao1 analysis (Fig. 6A).
  • PERMANOVA permutational multivariate analysis of variance
  • Fig. 6B the difference between HC-GC was significantly higher than the difference between each group of HC and GC in the distribution of bray curstis distance
  • PD-1 programmed cell death-1
  • PD-L1 Programmed Death-Ligand 1
  • APC antigen presenting cells
  • the purpose of this study was to determine whether immunity decreases according to the progression of gastric cancer in gastric cancer patients. Specifically, in the same manner as in Example 6-2, the expression of PD-1 and immunocompromised marker CTLA-4 in T cells of early gastric cancer patients (Early gastric cancer, EGC/stage 0 to 1a) and late gastric cancer patients (Advanced gastric cancer, AGC/stage 1b onwards) was confirmed.
  • PD-L1 in both macrophages and dendritic cells increased in the gastric cancer patient group. As the stage of gastric cancer progressed, PD-L1 also increased.
  • the expression of immune-decreasing markers in gastric cancer tissues was confirmed by confocal microscopy. Specifically, the expression of PD-L1 and IL-10 was compared in gastric cancer tissues of early gastric cancer patients (Early gastric cancer, EGC/stage 0 to 1a) and late gastric cancer patients (Advanced gastric cancer, AGC/stage 1b onwards).
  • Example 7 Based on the results of Examples 5 to 7, it was attempted to determine whether butyrate, a metabolite of Faecalibacterium, increases immunity. Specifically, the peripheral mononuclear cells isolated from the patient in Example 6-3 were treated with butanoic acid at concentrations of 0.5 and 1 mM and then cultured for 3 days, and then suppressed the expression of PD-L1 and IL-10 associated with reduced immunity. It was confirmed through flow cytometry. Macrophage markers were stained with the CD68 marker. As a control group, a vehicle group treated with PBS was used for isolated peripheral mononuclear cells.
  • FIG. 18 compared to the Nil group, in the Vehicle group, the expression of PD-L1 and IL-10, which are immunocompromised markers, increased in macrophages, and IL-10 in the culture medium increased significantly.
  • PD-L1 and IL-10 which were increased, and IL-10 in the culture medium were significantly decreased (FIG. 18A and B).
  • FIG. 18C Faecalibacterium prosnich
  • Faecalibacterium prosnich Faecalibacterium prausnitzii
  • Faecalibacterium prausnitzii which was confirmed to be reduced in gastric cancer patients in the present invention, was intended to determine whether apoptosis was induced in gastric cancer cell lines.
  • AGS cells which are gastric cancer cell lines, were cultured, and the cultured AGS cells were treated with Faecalibacterium prausnitzii of the present invention at a concentration of 10 ⁇ g/ml, and apoptosis induced cells were analyzed by flow cytometry.
  • a control group a vehicle group treated with the same amount of PBS was used.
  • Faecalibacterium prosnich Faecalibacterium prausnitzii
  • Faecalibacterium prausnitzii metabolite butyrate of the present invention, Faecalibacterium prausnitzii
  • AGS cell lines were treated with butanoic acid at concentrations of 0.5, 1, and 1.5 mM, and cells inducing apoptosis were analyzed by flow cytometry.
  • the cell killing effect of butyrate was confirmed by measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm for cell viability.
  • a simulated avatar model of a gastric cancer patient was created. Specifically, 6-8 week old immunodeficient mice (NSG) were intravascularly injected with 5x10 6 /mice of PBMC (Peripheral blood mononuclear cells) derived from gastric cancer patients. One week after PBMC injection, gastric cancer cell line AGS cell line 5x10 6 was subcutaneously injected to create a simulated stomach cancer patient avatar model (AGS+PBMC, Vehicel (PBMC)).
  • NSG immunodeficient mice
  • AGS cell line 5x10 6 was subcutaneously injected to create a simulated stomach cancer patient avatar model (AGS+PBMC, Vehicel (PBMC)).
  • a group administered with only AGS (AGS only) was used as a control group.
  • butanoic acid was orally administered daily at a concentration of 200 mg/kg.
  • the size of the tumor was measured three times using calipers every week, and the length of the long axis and short axis of the tumor was substituted into Equation 1 to calculate the tumor volume.
  • mice of each group of Example 10-1 were humanely sacrificed, and transplanted tumor tissues were obtained. Thereafter, the obtained tissues were sectioned, and the expression of tumor markers NF- ⁇ b and STAT3 and immunocompromised markers PD-L1 and IL-10 were confirmed by immunohistochemical staining.
  • SD217 a novel compound of the present invention, specifically kills gastric cancer cells and effectively inhibits the expression of PD-L1, a surface protein expressed by gastric cancer cells to evade the human immune response, thereby killing gastric cancer cells.
  • PD-L1 a surface protein expressed by gastric cancer cells to evade the human immune response
  • the tumor size was suppressed.
  • the diversity of the intestinal flora was reduced in gastric cancer patients, and it was confirmed that the composition ratio of the intestinal flora was different from that of healthy adults and patients with benign tumors.
  • the immune function was lowered, and the immune function of the patient was lowered as the gastric cancer progressed.
  • butanoic acid inhibits tumor growth and reduces the expression of tumor markers and immunocompromised markers in an avatar animal model of a gastric cancer patient in which the patient's immune status is reflected and a gastric cancer cell line is transplanted. Therefore, it was confirmed that immune anticancer drugs and personalized medicine can be realized by diagnosing intestinal flora colony collapse and immunosuppression in the gastric cancer patient group, and confirming the effect of increasing immunity and restoring intestinal flora according to the treatment with the active substance of the present invention.

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Abstract

본 발명은 위암 환자 장내균총 분석을 통한 면역 저하 진단과 장내균총을 이용한 테라그노시스 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 신규한 화합물인 SD217은, 위암 세포를 특이적으로 사멸시키고, 위암 세포가 인체 면역반응을 회피하기 위하여 발현하는 표면 단백질인 PD-L1의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하여, 위암 세포를 사멸시키는 것을 확인하였다. 또한, 위암 종양 동물모델에서, 종양의 크기를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자에서, 장내 균총의 다양성이 감소된 것을 확인하였으며, 장내 균총의 조성비가 건강한 성인 및 양성종양 환자와 차이가 나는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자군에서, 면역 기능이 저하되어있으며, 위암의 진행에 따라 환자의 면역기능이 저하되는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자군에서 감소된 것으로 확인된 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주 및 이의 대사체인 부탄산(Butyrate)를 환자 유래의 대식세포에 처리하면, 면역저하로 증가된 PD-L1 및 IL-10이 효과적으로 억제된 것을 확인하였다. 또한, 위암 세포주에 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주 및 이의 대사체인 부탄산(Butyrate)을 처리하면, 효과적으로 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 환자의 면역상태가 반영되고 위암 세포주가 이식된 위암환자 아바타 동물모델에서도, 부탄산이 종양 성장을 억제하고, 종양 마커 및 면역 저하 마커의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 위암 환자군의 장내균총 군집붕괴 및 면역저하를 진단하고, 이에 따라 본 발명의 유효물질 처리에 따른 면역증가 및 장내균총 회복 효과를 확인하여, 면역항암제 및 개인별 맞춤의학 실현이 가능한 것을 확인하였다.

Description

위암 환자 장내균총 분석을 통한 면역 저하 진단과 장내균총을 이용한 테라그노시스 조성물
본 발명은, 위암 환자 장내균총 분석을 통한 면역 저하 진단과 장내균총을 이용한 테라그노시스 조성물에 관한 것이다.
암을 치료하고자 전세계의 연구자들이 암세포의 세포 내 신호기전 및 전이, 약물의 부작용 등에 관한 다양한 주제에 대하여 수많은 연구들을 진행하고 있으며, 매년 새로운 신약들이 개발되어 많은 암환자들에게 치료효과를 기대하게 하는 임상시험들이 실시되고 있다. 수술로 인한 종양 조직 제거와 방사선 치료 외에, 항암치료에 사용되고 있는 현재의 항암제들은 각 암 종에 따라 다르게 적용이 되고 있다. 일반적으로 암환자들에게 처방되고 있는 화학항암제들은 암세포를 표적으로 하는 것으로, 암세포를 죽이는 효과를 가지고 있으나 정상세포들에게도 영향을 미쳐 환자들에게서 탈모, 발열, 면역력 저하 등의 부작용이 발생되고 있다. 이후, 암에 대한 유전적인 연구 등을 바탕으로 각 암종에서 발생되는 유전변이를 타겟으로 하는 표적 항암제가 개발되어 기존의 화학항암제에 의해 발생하는 부작용은 이 개선되었으나, 환경에 따른 적응이 매우 빠른 암세포가 표적 항암제의 공격으로부터 벗어나고자 항암제 내성을 유발하게 되어, 표적항암제에 의한 지속적인 암 치료효과를 100% 기대할 수 없다는 문제점이 있다. 근에는 항암제와 종양미세환경에 대한 연구가 활발히 이루어져 항암 효과는 유지하면서, 환자의 면역력을 조절하는 여러 면역 관문 억제제에 대한 면역항암제가 개발되어 환자들에게 치료제로 사용되고 있다. 그 중, PD-1/PD-L1에 대한 치료는 피부암, 폐암 등의 환자들에게 높은 치료 반응을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 면역항암제는 종양미세환경 내에서 면역 세포들의 기능을 조절함으로써 암세포의 증식 억제 및 면역 세포의 활성을 높이는 기능을 가지고 있다. 그러나, 면역항암제 또한 모든 환자들에게서 동일한 항암 효과를 나타내지 못하고, 면역항암제에 대한 biomarker가 뚜렷이 밝혀져 있지 않으며, JAK-STAT 유전자변이에 의한 항암제 내성이 발생하거나, 항체 합성물의 특성으로 인한 자가면역질환을 초래할 수 있으며, 고가의 치료비용이 발생하는 등의 문제점들이 존재한다.
한편, 마이크로바이옴(Microbiome)이란 인체에 서식하는 미생물을 일컫는 말로 장내 미생물이 이에 해당된다. 마이크로바이옴의 수는 순수한 인체의 세포수보다 두 배 이상 많고 유전자 수는 100배 이상 많다. 따라서 미생물을 빼놓고 인간의 유전자를 논할 수 없을 정도이기에 제2의 게놈(Second Genome)이라 부르기도 한다. 마이크로바이옴은 유익균과 유해균이 생성되는 원리와 질병간의 연관성 등을 분석할 수 있어 신약 개발 및 불치병 치료법 연구에 폭넓게 활용될 수 있는 분야다. 또한 마이크로바이옴은 식품, 화장품, 치료제 개발에 쓰인다.
차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)의 기술이 발전함에 따라, 인체의 생리와 면역조절에 있어서, 장내미생물의 중요성이 부각되고 있어, 인간의 장내 마이크로바이옴의 구조를 직접 조절할 수 있는 프로바이오틱스(probiotics)의 중요성이 대두되고 있다. 최근 많은 연구들을 통해 프로바이오틱스는 인간 마이크로바이옴과 깊은 연관성이 있는 것으로 알려지면서, 장내 환경을 변화시키는 조절제로서의 기능에 대해 주목을 받고 있다. 프로바이오틱스의 섭취는 마이크로바이옴 조절기능을 통해 소화 촉진은 물론, 염증성 장질환, 감염성 질환이나 유해세균의 억제 기능을 하는 것으로도 알져여 있으며, 특히 숙주의 면역시스템을 증진시켜, 아토피, 류마티스 등을 포함하는 다양한 면역관련 질환 및 암(Cancer)에도 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있다.
또한, 프로바이오틱스 분야가 크게 성장하면서, 프리바이오틱스(prebiotics), 신바이오틱스(synbiotics) 및 포스트바이오틱스(postbiotics)에 대해서도 많은 관심이 집중되고 있다, 프리바이오틱스는 `숙주의 미생물 중에서 건강에 도움을 주는 유익균에 의해 선택적으로 이용되는 물질`로 정의되며, 유산균의 먹이가 되는 식이섬유와 올리고당이 대표적인 예이다. 신바이오틱스는 프로바이오틱스와 프리바이오틱스가 함께 포함되어 있는 형태를 말한다. 한편 최근 주목받고 있는 포스트바이오틱스는 프로바이오틱스가 생산하는 유용한 대사산물과 미생물의 구성성분을 포함하는 소재로서 `숙주의 건강에 유익한 미생물의 살아있지 않은 형태 또는 그 미생물의 성분이 포함된 제형`으로 명확하게 정의되었으며, 포스트바이오틱스는 기존 프로바이오틱스 소재가 갖는 안전성(safety), 기능성(function), 안정성(stability)의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대안 소재로 주목받고 있다.
이에 본 발명자들은 신규한 화합물이, 암세포 표면 단백질인 PD-L1의 발현을 억제하고, 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 것을 확인하여, 암세포의 면역반응 회피를 억제하고, 면역 세포의 활성을 증가시키는 것을 확인였다. 또한, 암 환자군에서, 군집의 다양성 및 분류군이 감소된 마이크로바이옴을 확인하고 선별하였으며, 선별된 균주들이 암 환자군의 면역을 개선시키고, 균주의 대사산물 또한 면역반응을 개선시키는 것을 확인하여, 면역 항암제로서 효과가 우수함을 확인한 바, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023001123-appb-img-000001
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현이 증대된 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 약학적으로 유효한양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 페칼리박테리움 속(Faecalibacterium sp.) 균주를 증가시키고, 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(Phylum) 균주를 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 T 세포 기능 및 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)의 기능을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴의 약학적으로 유요한양을, 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023001123-appb-img-000002
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현이 증대된 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 약학적으로 유효한양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 페칼리박테리움 속(Faecalibacterium sp.) 균주를 증가시키고, 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(Phylum) 균주를 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 T 세포 기능 및 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)의 기능을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴의 약학적으로 유요한양을, 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 화합물인 SD217은, 위암 세포를 특이적으로 사멸시키고, 위암 세포가 인체 면역반응을 회피하기 위하여 발현하는 표면 단백질인 PD-L1의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하여, 위암 세포를 사멸시키고, 면역 기능을 증진시키는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자에서, 장내 균총의 다양성이 감소된 것을 확인하였으며, 장내 균총의 조성비가 건강한 성인 및 양성종양 환자와 차이가 나는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자군에서, 면역 기능이 저하되어있으며, 위암의 진행에 따라 환자의 면역기능이 저하되는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자군에서 감소된 것으로 확인된 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주 및 이의 대사체인 부탄산(Butyrate)를 환자 유래의 대식세포에 처리하면, 면역저하로 증가된 PD-L1 및 IL-10이 효과적으로 억제된 것을 확인하였다. 또한, 위암 세포주에 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주 및 이의 대사체인 부탄산(Butyrate)을 처리하면, 효과적으로 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 환자의 면역상태가 반영되고 위암 세포주가 이식된 위암환자 아바타 동물모델에서도, 부탄산이 종양 성장을 억제하고, 종양 마커 및 면역 저하 마커의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 위암 환자군의 장내균총 군집붕괴 및 면역저하를 진단하고, 이에 따라 본 발명의 유효물질 처리에 따른 면역증가 및 장내균총 회복 효과를 확인하여, 개인별 맞춤의학 실현이 가능한 것을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 SD217의 처리에 따른 위암 세포주의 세포자멸사(Apoptosis)를 유세포분석으로 확인한 도이다(A: 유세포분석 결과, B: 분석 결과 정량화).
도 2는 본 발명의 SD217의 처리에 따른 위암 세포주의 표면 단백질인 PD-L1의 발현을 유세포분석으로 분석한 도이다(A: 유세포분석 결과, B: 분석 결과 정량화).
도 3은 본 발명의 SD217을 위암 종양 마우스에 투여하여, 종양 성장 억제를 확인한 도이다(A: 종양 성장 억제 확인, B: 종양 부피 정량화).
도 4는 본 발명의 SD217의 초기 및 후기 세포자멸사를 정량화한 도이다.
도 5는 위암 환자 및 건강한 성인에서의 장내균총 다양성을 비교한 도이다(A: 장내 균총 다양성 비교, B: 감소된 장내 균총 비교).
도 6은 위암 환자 및 건강한 성인에서의 장내 균총의 다양성을 α-diversity 및 β-diversity로 분석한 도이다(A: Observed OTU 및 Chao1 분석 결과, B: PCoA plot 및 bray curstis distance 분석 결과).
도 7은 위암 환자 및 양성종양 환자에서의 장내균총 조성비를 비교한 도이다(A: 장내 균총 조성비 비교, B: 페칼리박테리움 속 조성 비교)
도 8은 위암 환자 및 양성종양 환자에서, T 세포의 면역력 저하 인자의 발현을 비교한 도이다(A: IL-10 발현 확인, B: IL-17 발현 확인, C: INF-γ 발현 확인).
도 9는 위암 환자 및 양성종양 환자에서, T 세포의 면역력 저하 마커인 PD-1의 발현을 비교한 도이다(A: CD4 + 세포 비교, B: CD8 + 세포 비교).
도 10은 위암 환자 및 양성종양 환자에서, 항원 제시 세포의 면역력 저하 인자인 PD-L1의 발현을 비교한 도이다(A: CD68 + 세포 비교, B: CD11 + 세포 비교).
도 11은 위암 환자 및 양성종양 환자에서, 항원 제시 세포의 면역력 저하 인자인 IL-10의 발현을 비교한 도이다(A: CD68 + 세포 비교, B: CD11 + 세포 비교).
도 12는 초기 위암 환자 및 후기 위암 환자에서의, T 세포의 면역력 저하 인자인 PD-1 및 CTLA-4의 발현을 비교한 도이다(A: PD-1 발현 비교, B: CTLA-4 발현 비교).
도 13은 초기 위암 환자 및 후기 위암 환자에서의, 항원 제시 세포의 면역력 저하 인자인 PD-L1 및 IL-10의 발현을 비교한 도이다(A: PD-L1 발현 비교, B: IL-10 발현 비교).
도 14는 위암 환자의 위암 경과에 따른, 항원 제시 세포의 면역력 저하 인자인 PD-L1의 발현을 비교한 도이다(A: CD68 + 세포 비교, B: CD11 + 세포 비교).
도 15는 위암 환자의 위암 경과에 따른, 위암 조직 에서의 면역력 저하 인자인 PD-L1 및 IL-10의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 도이다(A: 분석 결과, B: 분석 결과 정량화).
도 16은 위암 환자의 대식세포에 부탄산(Butyrate)의 처리에 따른 PD-L1 및 IL-10의 발현을 비교한 도이다(A: PD-L1 발현 비교, B: IL-10 발현 비교).
도 17은 위암 환자의 대식세포에 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 처리에 따른 PD-L1의 발현을 비교한 도이다.
도 18은 위암 환자의 대식세포에 부탄산(Butyrate) 또는 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 처리에 따른 면역 저하 마커의 발현을 확인한 도이다(A: 대식세포 내 마커 발현 정량화, B: 배양액 내 마커 발현 정량화, C: 페칼리박테리움 프로스니치 처리에 따른 마커 발현 정량화).
도 19는 위암 세포주에, 본 발명의 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 처리에 따른 세포자멸사(Apoptosis)를 유세포분석으로 확인한 도이다(A: 유세포분석 결과, B: 분석 결과 정량화).
도 20은 위암 세포주에 부탄산(Butyrate)의 처리에 따른 세포자멸사(Apoptosis)를 유세포분석으로 확인한 도이다(A: 유세포분석 결과, B: 분석 결과 정량화).
도 21은 위암 세포주에 부탄산(Butyrate)의 처리에 따른 세포 생존율을 흡광도를 이용하여 확인한 도이다.
도 22는 위암 환자 면역 모사 아바타 동물모델에서, 부탄산의 처리에 따른 종양 성장 억제를 확인한 도이다(A: 종양 성장 억제 결과, B: 종양 부피 정량화).
도 23은 위암 환자 면역 모사 아바타 동물모델에서, 부탄산의 처리에 따른 종양 조직 내 종양 마커 및 면역 저하 마커의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인한 도이다(A: 염색 결과, B: 염색 결과 정량화).
본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
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본 발명의 용어 "SD217 화합물"은 상기 화학식 1로 표현되는 화합물(1-(2,4-difluorophenyl)biguanide)일 수 있으며, 구체적인 제조 방법은 하기 제조예 1에 기재되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 포함할 수 있으며, 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 암세포의 아폽토시스(Apoptosis)를 증가시키는 것일 수 있고, 상기 아폽토시스는 초기(early) 또는 후기(late) 아폽토시스인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 암세포의 성장을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 암세포의 표면 단백질인 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명의 "PD-L1" 및 "PD-1"은 암세포 또는 조혈세포 표면 단백질 및 T 세포 표면 단백질로서, T 세포 표면 단백질인 PD-1과 PD-L1이 결합하면, 암세포가 T 세포의 면역 반응을 회피할 수 있도록 유도하는 단백질로서, 암세포 및 항원 제시 세포를 포함하는 조혈세포에서 PD-L1 과발현 되고, T 세포 에서 PD-1이 과발현 하여, PD-L1 및 PD-1 복합체의 발현이 증가하면, T 세포의 암세포 특이성이 낮아져, 결과적으로 면역기능을 저하시키게 되는 단백질이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 암인 것일 수 있고, 바람직하게는 위암이나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 "항암 보조제"는 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제로서, 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않으나 항암제와 함께 사용될 경우, 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제일 수 있다. 또한, 농도의존적인 항암활성을 나타내는 제제를 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않은 수준으로 항암제와 함께 사용할 경우, 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제일 수 있다.
항암 보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항암 보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 항암 보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 암의 예방 또는 치료 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현이 증대된 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, PD-L1의 발현을 감소시키는 것일 수 있고, PD-L1의 발현을 감소시키는 것은, 면역 세포의 암특이적 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 약학적으로 유효한양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 일일 투여량은 본 발명의 약학조성물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 다만, 각 유효성분의 복용량 또는 투여량이 각 유효성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명의 재조합 펩타이드 또는 재조합 벡터는, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "마이크로바이옴"은 인체에 서식하는 미생물의 유전정보 전체나, 미생물 자체를 일컫는 것으로, 인간의 몸에 서식하며 공생하는 미생물인 마이크로바이오타(microbiota)와 게놈(genome)의 합성어이며, 인체 마이크로바이온의 수는 순수한 인체의 세포수보다 두 배 이상 많고 유전자 수는 100배이상 많은 것으로 알려져 있으며, 마이크로 바이옴은 유익균과 유해균이 생성되는 원리와 질병간의 연관성 등을 분석할 수 있어, 신약 개발 및 불치병 치료와 같은 인체내 미생물 환경의 연구에 폭넓게 활용될 수 있는 분야를 뜻한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 마이크로바이옴은, 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 면역기능을 증가시키는 것일 수 있고, 면역 저하 인자인 IL-10, IL-17 및 INF-γ의 발현을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 면역기능을 증가시키는 것은, T 세포의 programmed cell death-1(PD-1) 또는 CTLA-4의 발현을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 면역기능을 증가시키는 것은, 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC) 또는 암조직에서의 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1) 및 IL-10의 발현을 억제시키는 것일 수 있으며, 상기 항원 제시 세포는 대식세포(Macrophage) 또는 수지상세포(Dendritic cell)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 암세포의 세포자멸사(Apoptosis)를 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 바람직하게는 위암이나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 페칼리박테리움 속(Faecalibacterium sp.) 균주를 증가시키고, 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(Phylum) 균주를 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 T 세포 기능 및 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)의 기능을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴의 약학적으로 유요한양을, 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<제조예 1> SD217의 합성 및 제조
본 발명의 신규한 화합물인 SD217을 제조하기 위하여, 아닐린(aniline)을 아세토 나이트릴에 녹인 후 진한 염산을 1당량만큼 첨가하였다. 그리고 다이사이아노 다이아마이드(dicyano diamide)를 첨가한 후, 반응물을 175℃까지 가열 후, 결정상태의물질을 걸러내었다.
결정상태로 걸러진 물질의 화학 구조를 확인하여, 화학식 1로 표시하였으며, 이를 SD217(1-(2,4-difluorophenyl)biguanide)로 명명하였다.
[화학식 1]
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<실시예 1> 위암 세포주에서의 SD217의 Apoptosis 증가 확인
본 발명의 신규한 화합물인 SD217이 위암 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 위암 세포주인 AGS 세포주를 2x105을 6well plate에 접종한 후 오버나잇 후에 본 발명의 신규한 화합물인 SD217을 0.2 mM의 농도로 처리하고 48시간 후에 Annexin/PI 염색 후에 Apoptosis 세포를 분석하기 위하여 유세포분석으로 분석하였다. 대조군으로는 동량의 PBS를 처리한 Vehicle 군을 이용하였다. 그 후 초기 아폽토시스 세포(Early apoptosis cell)을 확인하고, 후기 아폽토시스(Late apoptosis)/괴사 세포(Necrotic cell) 비(ratio)를 확인하여, 위암 세포주의 사멸을 확인하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 SD217이 처리된 군에서는 Vehicle 군과 비교하여, Apoptosis가 유의적으로 증가한 것을 확인하여, 본 발명의 SD217이 위암 세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 확인하였다.
<실시예 2> 위암 세포주에서의 SD217의 위암세포 면역저하 마커 발현 확인
본 발명의 신규한 화합물인 SD217이 위암세포의 면역저하 마커인 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1) 단백질의 발현을 확인하고자 하였다. PD-L1 단백질은 위암세포의 표면 단백질로서, PD-L1은, 활성화된 T 세포의 표면 단백질인 programmed cell death-1(PD-1)과 결합하여, T 세포의 면역 반응을 회피하는 단백질로서, 본 발명의 SD217이 PD-L1의 발현을 억제시키는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 위암 세포주인 AGS 세포에 SD217을 0.2, 0.5, 1, mM을 처리하여 반응시켰다. 그 후 PD-L1 양성 세포를 유세포분석으로 분석하였다. 대조군으로는 PBS를 처리한 Vehicle 군을 이용하였으며, 양성 대조군으로는 Metformin을 1 mM 처리하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 SD217 화합물이 처리된 위암세포에서는, Vehicle 군과 비교하여, PD-L1 양성세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인하였다.
<실시예 3> 위암 종양 성장 억제 확인
본 발명의 신규한 화합물인 SD217이 종양 성장을 억제하는지 확인하였다. 구체적으로, 6-8주령의 면역결핍 마우스(NSG)에 위암 세포주인 AGS 세포주 5x106를 피하 주사하여, 위암 이식 동물모델을 제작하였다. 그 후 SD217을 50 mg/kg의 농도로 매일 경구 투여 하였다. AGS 세포 주입 및 SD217 투여 후 매주 종양의 크기를 켈리퍼스(calipers)를 이용하여 3회 측정하였으며, 종양의 장축(long axis) 및 단축(short axis)의 길이를 하기 수학식 1에 대입하여, 종양의 부피(Tumor volume)를 계산하였다. 대조군으로는 동량의 PBS를 주입한 Vehicle 군을 이용하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2023001123-appb-img-000005
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, SD217을 투여한 군에서는 종양 성장이 유의적으로 억제되었으며, 종량 부피가 현저히 감소한 것을 확인하여, SD217이 종양 성장을 억제하는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 위암 세포주에서의 세포자멸사 유도 확인(초기-후기 자멸사)
본 발명의 신규한 화합물인 SD217이 위암 세포주의 초기 및 후기 세포 자멸사(apoptosis)를 유도하는지 확인하였다. 구체적으로 위암 세포주인 AGS 세포주를 2x105을 6well plate에 접종한 후 오버나잇 후에 본 발명의 신규한 화합물인 SD217을 1, 5, 10, 20 및 50 mM의 농도로 처리하고 48시간 후에 Annexin/PI 염색 후에 Apoptosis 세포를 분석하기 위하여 유세포분석으로 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 본 발명의 SD217이 처리된 군에서는, 농도의존적으로 초기 및 후기 세포자멸사(apoptosis)를 유도하는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 위암 환자 및 건강한 성인의 장내균총 비교
<5-1> 장내균총 다양성 비교(위암환자 및 정상인 비교)
위암(gastric cancer, GC) 환자와, 정상인(healthy control, HC)을 비교하고, 위암(gastric cancer, GC)환자와, 양성 종양 환자 (Benign tumor, BT)를 비교하여, 장내균총의 다양성에 변화가 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 건강한 성인과 위암 환자 및 양성 종양 환자와 위암환자의 장내균총을 비교하였다. 정상인과 양성종양환자, 위암 환자의 fecal을 수집후 -70도에 분석 전까지 보관하였다. 메타지놈 분석을 위해 박테리아 genomic DNA 분리, 미생물 특이적인 16S rRNA 유전자 증폭, 차세대 염기서열 분석 (Next Generation Sequencing, NGS), 장내균총 분석 및 프로파일링으로 분석 하였다. 분리한 gDNA는 박테리아 특이적인 16S rRNA 유전자 서열 중 variant region 의 V3와 V4 부분을 포함할 수 있는 부위에서 제작된 프라이머로 유전자를 증폭시키고, 샘플을 구별할 수 있는 인덱스 서열을 부착하여 라이브러리를 제작하기 위해 2번의 PCR을 수행 한후 Illumina社의 Miseq을 이용하여 염기서열 해독을 진행하였다. 해독된 서열은 생물정보학적 분석 toold인 Quantitative Insights into Microbioal Ecology 2 (QIIME 2)과 Lefse, 통계처리는 Prism과 R을 이용하여 장내균총 프로파일링을 수행하였다. 그 후 각 군의 균총의 풍부도를 확인하기 위하여, α-diversity 분석 및 각 군간의 유사도 분석을 위하여 β-diversity 분석을 시행하였다. α-diversity 분석으로는 Observed OTUs 및 Chao1 분석을 시행하였으며, β-diversity 분석으로는 bray curstis distance에 기반하여 PCoA plot분석을 시행하였다. 그 후 각군의 문(Phylum), 과(Family), 속(Genus)의 조성비를 확인하였다.
그 결과, 위암 환자군(GC)에서는 건강한 성인(HC)와 비교하여, 장내 균총 중 Proteobacteria 문이 증가되었으며, Actinobacteria 문이 감소되어 있는 것을 확인하였으며, 위암 환자군에서는 페칼리박테리움(Faecalibacterium) 종(species) 및 상위 과(Family)에서도 유의적인 감소가 확인되었다(도 5).
또한, α-diversity 분석에서 Observed OTUs 레벨이 GC 군과 H 군에서 유의적으로 차이나는 것을 확인하였으며, Chao1 분석에서 GC 군의 Chao1 레벨이 감소한 것을 확인하였다(도 6A). β-diversity 분석에서, HC 군과 GC 군은 permutational multivariate analysis of variance(PERMANOVA) 에서 유의적으로 차이가 나는 것을 확인하였으며, bray curstis distance 분포시 HC와 GC의 각 군 내의 차이보다 HC-GC 간의 차이가 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(도 6B).
<5-2> 장내균총 조성 비교(위암 환자 및 양성종양 환자 비교)
위암 환자 및 양성종양 환자의, 장내균총의 조성에 차이가 있는지 확인하였다. 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로, 위암 환자군(GC)과 양성종양 환자군(BT)의 장내 균총의 조성 차이를 문(Phylum)과 속(Genus) 수준까지 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 위암 환자군(GC)에서는 양성종양 환자(BT)와 비교하여, 장내 균총 중 Proteobacteria 문이 증가되었으며, Actinobacteria 문이 감소되어 있는 것을 추가로 확인하였으며, 페칼리박테리움(Faecalibacterium) 속(Genus)이 유의적으로 감소되어 있는 것을 확인하였다. 상기 실시예 5-1 및 5-2의 결과를 바탕으로, 위암 환자에서는 장내균총이 군집붕괴(dysbiosis) 된 것을 확인하였다.
<실시예 6> 위암 환자 및 양성종양 환자의 면역력 비교
<6-1> T 세포 면역력 저하 확인
위암 환자 및 양성종양 환자에서 T 세포의 면역력이 차이가 있는지 비교하고자 하였다. 구체적으로, 위암 환자 및 양성종양 환자으로부터, 혈액을 수득한 후, 면역력 저하와 관련된 IL-10, IL-17 및 IFN-γ의 발현을 ELISA로 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 위암 환자군(GC)에서는 양성종양 환자(BT)과 비교하여, 면역력 저하와 관련된 분자인 IL-10이 유의적으로 증가하였으며, IFN-γ는 유의하게 감소되어 있는 것을 확인하였다.
<6-2> T 세포 면역력 저하 마커 확인
위암 환자 및 양성종양 환자에서 T 세포의 면역력이 차이가 있는지 비교하고자, 면역력 저하되면 T 세포에서 발현되는 programmed cell death-1(PD-1)을 확인하고자 하였다. 구체적으로는 PD-1 CD4+ 세포 및 PD-1 CD8+ 세포의 발현을 유세포분석으로으로 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 위암 환자군(GC)에서는 양성종양 환자(BT)와 비교하여 PD1 CD4+ 세포 및 PD-1 CD8+ 세포의 발현이 유의적으로 증가되어 있는 것을 확인하였다.
<6-3> 항원 제시 세포의 면역 저하 마커 확인
위암 환자 및 양성종양 환자에서의 면역 상태를 비교하고자, 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에서, 면역 저하로 발현되는 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현을 확인하고자 하였다. 구체적으로 환자로부터 분리된 혈액에서, 대식세포(Macrophage) 및 수지상세포(Dendritic cell)에서의 면역 억제 단백질인 PD-L1의 발현을 면역조직화학염색으로 확인하였다. 또한, 면역력 저하와 관련된 IL-10의 발현을 상기와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 위암 환자군(GC)에서는 양성종양 환자(BT)와 비교하여, APC에서의 PD-L1의 발현이 증가된 것을 확인하였다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 위암 환자군(GC)에서는 양성종양 환자(BT)와 비교하여, APC에서의 IL-10의 발현 역시 증가되어 있는 것을 확인하여, 상기의 결과를 토대로, 위암 환자군에서는 APC가 T 세포의 면역의 활성을 억제(suppression)시키는 상태인 것을 확인하였다.
<실시예 7> 위암 진행에 따른 면역력 비교
<7-1> T 세포 면역력 저하 확인
위암 환자에서 위암의 진행 정도에 따라, 면역력이 저하되는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로, 초기 위암 환자(Early gastric cancer, EGC/stage 0~1a 까지) 및 후기 위암 환자(Advanced gastric cancer, AGC/stage 1b 이후)의 T 세포에서의 PD-1 및 면역 저하 마커인 CTLA-4의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 초기 위암 환자(EGC)와 비교하여, 후기 위암 환자(AGC)에서는 T 세포에서, 면역 저하 마커인 PD-1 및 CTLA-4의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
<7-2> 항원 제시 세포의 면역 저하 마커 확인
위암 환자에서 위암의 진행 정도에 따라, 면역력이 저하되는지 확인하고자, 상기 실시예 6-3과 동일한 방법으로, 초기 위암 환자(Early gastric cancer, EGC/stage 0~1a 까지) 및 후기 위암 환자(Advanced gastric cancer, AGC/stage 1b 이후)의 APC에서 PD-L1 및 IL-10의 발현을 비교하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 초기 위암 환자(EGC)와 비교하여, 후기 위암 환자(AGC)에서는, APC의 면역 저하 마커인 PD-L1 및 IL-10이 증가된 것을 확인하였다.
<7-3> 위암 진행정도에 따른 항원 제시 세포의 면역 저하 마커 확인
위암 환자에서 위암의 진행 정도가 증가함에 따라서, 항원 제시 세포에서의 면역 저하 마커의 발현이 증가하는지 확인하고자 하였다. 상기 실시예 7-2와 동일한 방법으로, 양성종양 환자(BT), 1기 위암 환자(stage 1, I), 2기 위암 환자(stage 2, II), 3기 위암 환자(stage 3, III) 및 4기 위암 환자(stage 4, IV)의 혈액을 수집하고, 이로부터 대식세포(Macrophage) 및 수지상세포(Dendritic cell)에서 PD-L1의 발현을 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 양성종양 환자(BT)와 비교하여, 위암 환자군에서는 대식세포(Macrophage) 및 수지상세포(Dendritic cell)에서의 PD-L1이 모두 증가하였으며, 위암의 진행 단계(stage)가 증가함에 따라, PD-L1 또한 증가하는 경향을 확인하였다.
<7-4> 위암 진행에 따른 위암 조직 내 면역 저하 마커 발현 확인
위암 환자에서 위암의 진행 정도에 따라, 면역력이 저하되는지 확인하고자, 위암 조직에서의 면역력 저하 마커의 발현을 공초점 현미경으로 확인하였다. 구체적으로 초기 위암 환자(Early gastric cancer, EGC/stage 0~1a 까지) 및 후기 위암 환자(Advanced gastric cancer, AGC/stage 1b 이후)의 위암 조직에서 PD-L1 및 IL-10의 발현을 비교하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 초기 위암 환자(EGC)와 비교하여, 후기 위암 환자(AGC)에서는, 위암 조직에서의 면역 저하 마커인 PD-L1 및 IL-10이 유의적으로 증가된 것을 확인하였다.
<실시예 8> 소듐 부티레이트(Sodium butyrate) 및 Faecalibacterium prausnitzii 의 처리에 따른 면역 증가 확인
상기 실시예 5 내지 실시예 7의 결과를 바탕으로, Faecalibacterium의 대사체인 부탄산(Butyrate)이, 면역력을 증가시키는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 6-3에서 환자로부터 분리된 말초단핵구세포에, 부탄산을 0.5 및 1 mM의 농도로 처리한 후 3일간 배양 후에, 면역 저하와 관련된 PD-L1 및 IL-10의 발현이 억제되는지 유세포분석을 통해 확인하였다. 대식세포의 마커는 CD68 마커로 염색하였다. 대조군으로는 분리된 말초단핵구 세포에 PBS를 처리한 Vehicle 군을 이용하였다. 또한, 위암 환자군에서 감소한 것으로 나타난 Faecalibacterium 속 균주인 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 처리에 따른 PD-L1의 발현 변화를 추가로 확인하였다. 또한, 무처리 대조군인 Nil 군, 환자로부터 분리된 말초단핵구 세포에, PBS를 처리한 Vehicle 군 및 부탄산을 처리한 군을 비교하여, PD-L1, IL-10 발현 대식세포의 활성을 분석하고, 배양액 내의 IL-10의 발현을 추가로 확인하였으며, 페칼리박테리움 프로스니치의 처리에 따른 PD-L1 및 IL-10 발현 대식세포의 활성을 분석하였다.
그 결과 도 16에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 부탄산(Butyrate)을 처리한 군에서는 농도의존적으로 대식세포(Macrophage) 마커인 CD68 양성 세포에서 PD-L1 및 IL-10의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 처리에 의하여도, 대식세포(Macrophage)에서의 PD-L1의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 17).
또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, Nil 군과 비교하여, Vehicle 군에서는 대식세포에서의 면역 저하 마커인 PD-L1 및 IL-10의 발현이 증가하였으며, 배양액 내의 IL-10이 유의적으로 증가하였으나, 부탄산(Butyrate)를 처리한 군에서는 증가된, PD-L1 및 IL-10 및 배양액 내의 IL-10이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 18A 및 B). 또한, 페칼리박테리움 프로스니치의 처리에 의하여, 증가된 PD-L1 및 IL-10의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하여(도 18C), 본 발명의 부탄산 또는 페칼리박테리움 프로스니치의 처리가, 위암 환자의 대식세포의 면역을 증가시키는 것을 확인하였다.
<실시예 9> 페칼리박테리움 프로스니치( Faecalibacterium prausnitzii ) 및 대사체의 위암 세포 사멸 효과 확인
<9-1> 페칼리박테리움 프로스니치( Faecalibacterium prausnitzii )의 세포사멸 효과 확인
본 발명에서 위암 환자에서 감소된 것으로 확인된 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)가, 위암 세포주를의 세포자멸사(Apoptosis)를 유도하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 위암세포주인 AGS cell을 배양하고, 배양된 AGS 세포에, 본 발명의 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)를 10 μg/ml의 농도로 처리하고, Apoptosis가 유도된 세포를 유세포분석으로 분석하였다. 대조군으로는 동량의 PBS를 처리한, Vehicle 군을 이용하였다.
그 결과 도 19에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)를 처리한 군에서는 Apoptosis cell이 증가하는 것을 확인하였다.
<9-2> 페칼리박테리움 프로스니치( Faecalibacterium prausnitzii )의 대사체의 세포사멸 효과 확인
본 발명의 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 대사체인 부탄산(Butyrate)가 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)와 동일하게, 세포자멸사를 (Apoptosis)를 유도하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 상기 실시예 9-1과 동일하게, AGS 세포주에, 부탄산을 0.5, 1 및 1.5 mM의 농도로 처리하고, Apoptosis가 유도되는 세포를 유세포분석으로 분석하였다. 또한, 위암 세포주에서, 부탄산(Butyrate)의 세포 사멸 효과를, 세포 생존율을 450 nm의 파장으로 흡광도를 측정하여, 확인하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 부탄산(Butyrate)이 처리된 군에서는 농도의존적으로 Apoptosis가 유도되는 것을 확인하였다.
또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 부탄산(Butyrate)가 처리된 군에서는 농도의존적으로, 흡광도가 감소하는 것을 확인하여, 위암 세포주의 세포 사멸이 유도된 것을 확인하였다.
<실시예 10> 위암 환자 모사 아바타 모델에서의 부탄산의 종양 억제 확인
<10-1> 위암 환자 모사 아바타 모델의 제작 및 부탄산의 종양 성장 억제 확인
본 발명의 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 대사체인 부탄산(Butyrate)이 종양을 억제하는지 확인하기 위하여, 위암 환자 모사 아바타 모델을 제작하였다. 구체적으로 6-8주령의 면역결핍 마우스(NSG)에 위암 환자 유래의 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)을 5x106/mice로 혈관 내 주사하였다. PBMC 주입 1주일 후, 위암 세포주인 AGS 세포주 5x106를 피하 주사하여, 위암 환자 모사 아바타 모델(AGS+PBMC, Vehicel(PBMC))을 제작하였다. 또한, 위암 세포주의 생착에서, 위암 환자 유래의 PBMC 주입 효과를 확인하기 위하여, 대조군으로는 AGS만 투여한 군(AGS only)을 이용하였다. AGS 세포 주입 3주 후 부탄산을 200 mg/kg의 농도로 매일 경구 투여하였다. AGS 세포 주입 후 매주 종양의 크기를 켈리퍼스(calipers)를 이용하여 3회 측정하였으며, 종양의 장축(long axis) 및 단축(short axis)의 길이를 상기 수학식 1에 대입하여, 종양의 부피(Tumor volume)를 계산하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, AGS only 군과 비교하여, 환자 유래의 PBMC를 주입한 군에서는 종양 성장이 유의적으로 증가하여, 종양 부피가 증가하여, 환자의 면역 상태가 반영된 것을 확인하였으며, 부탄산(Butyrate)을 처리한 군에서는 증가된 종양 부피가 유의적으로 감소한 것을 확인하여, 부탄산의 종양 억제 효과를 확인하였다.
<10-2> 위암 환자 모사 아바타 모델에서의 종야 마커 및 면역 저하 마커 발현 확인
본 발명의 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)의 대사체인 부탄산(Butyrate)이 종양 마커 및 면역 저하 마커의 발현을 조절하는지 확인하였다. 구체적으로 상기 실시예 10-1의 각 군의 마우스를 인도적으로 희생한 후, 이식된 종양 조직을 수득하였다. 그 후 수득된 조직을 절편화한 후 종양 마커인 NF-κb 및 STAT3와 면역 저하 마커인 PD-L1 및 IL-10의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, AGS only 군과 비교하여, Vehicle 군에서는 종양 마커 및 면역 저하 마커인 NF-κb, STAT3, PD-L1 및 IL-10의 발현이 현저히 증가한 것을 확인하였으나, 부탄산(Butyrate)가 처리된 군에서는 증가된 종양 마커 및 면역 저하 마커가 유의적으로 감소된 것을 확인하여, 부탄산이 환자의 면역상태가 반영된 아바타 모델에서도, 종양 억제 및 면역 조절 효과가 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신규한 화합물인 SD217은, 위암 세포를 특이적으로 사멸시키고, 위암 세포가 인체 면역반응을 회피하기 위하여 발현하는 표면 단백질인 PD-L1의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하여, 위암 세포를 사멸시키는 것을 확인하였다. 또한, 위암 종양 동물모델에서, 종양의 크기를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자에서, 장내 균총의 다양성이 감소된 것을 확인하였으며, 장내 균총의 조성비가 건강한 성인 및 양성종양 환자와 차이가 나는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자군에서, 면역 기능이 저하되어있으며, 위암의 진행에 따라 환자의 면역기능이 저하되는 것을 확인하였다. 또한, 위암 환자군에서 감소된 것으로 확인된 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주 및 이의 대사체인 부탄산(Butyrate)를 환자 유래의 대식세포에 처리하면, 면역저하로 증가된 PD-L1 및 IL-10이 효과적으로 억제된 것을 확인하였다. 또한, 위암 세포주에 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주 및 이의 대사체인 부탄산(Butyrate)을 처리하면, 효과적으로 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 환자의 면역상태가 반영되고 위암 세포주가 이식된 위암환자 아바타 동물모델에서도, 부탄산이 종양 성장을 억제하고, 종양 마커 및 면역 저하 마커의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 위암 환자군의 장내균총 군집붕괴 및 면역저하를 진단하고, 이에 따라 본 발명의 유효물질 처리에 따른 면역증가 및 장내균총 회복 효과를 확인하여, 면역항암제 및 개인별 맞춤의학 실현이 가능한 것을 확인하였다.

Claims (28)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001123-appb-img-000006
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 암세포의 아폽토시스(Apoptosis)를 증가시키는 것인, 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 아폽토시스는 초기(early) 또는 후기(late) 아폽토시스인 것인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 암세포의 성장을 억제시키는 것인, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 암세포의 표면 단백질인 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현을 억제시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 위암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 암인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001123-appb-img-000007
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암(cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001123-appb-img-000008
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)의 발현이 증대된 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001123-appb-img-000009
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 조성물은, PD-L1의 발현을 감소시키는 것인, 암(cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 PD-L1의 발현을 감소시키는 것은, 면역 세포의 암특이적 활성을 증가시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 약학적으로 유효한양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001123-appb-img-000010
  13. 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 마이크로바이옴은, 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)인 것인, 조성물.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 조성물은, 면역기능을 증가시키는 것인, 조성물.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 면역기능을 증가시키는 것은, 면역 저하 인자인 IL-10, IL-17 및 INF-γ의 발현을 억제시키는 것인, 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 면역기능을 증가시키는 것은, T 세포의 programmed cell death-1(PD-1) 또는 CTLA-4의 발현을 억제시키는 것인, 조성물.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 면역기능을 증가시키는 것은, 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC) 또는 암조직에서의 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1) 및 IL-10의 발현을 억제시키는 것인, 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 항원 제시 세포는 대식세포(Macrophage) 또는 수지상세포(Dendritic cell)인, 조성물.
  20. 제 13항에 있어서,
    상기 조성물은, 암세포의 세포자멸사(Apoptosis)를 증가시키는 것인, 조성물.
  21. 제 13항에 있어서,
    상기 암은 위암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  22. 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는, 암(Cancer)의 예방 또는 개선용 식품조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 마이크로바이옴은, 페칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)인 것인, 조성물.
  24. 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 페칼리박테리움 속(Faecalibacterium sp.) 균주를 증가시키고, 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(Phylum) 균주를 감소시키는 방법.
  25. 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 암(Cancer) 환자군의 T 세포 기능 및 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)의 기능을 증가시키는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 T 세포의 기능 증가는, T 세포의 programmed cell death-1(PD-1) 또는 CTLA-4의 발현을 억제시키는 것인, 방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    항원 제시 세포의 기능을 증가는, 항원 제시 세포의 Programmed Death-Ligand 1(PD-L1) 및 IL-10의 발현을 억제시키는 것인, 방법.
  28. 부탄산(Butyrate) 또는 마이크로바이옴의 약학적으로 유요한양을, 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 치료 방법.
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