WO2023101349A1 - 신규 엔테로코커스 패시움 lcm001 균주 및 이의 용도 - Google Patents

신규 엔테로코커스 패시움 lcm001 균주 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023101349A1
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lcm001
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enterococcus faecium
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강세찬
이영근
이희주
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주식회사 엠바이옴쎄라퓨틱스
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Definitions

  • the present invention relates to a novel Enterococcus faecium LCM001 strain and uses thereof.
  • Cancer is a disease that has not been conquered so far, and is a disease that is incurable depending on the degree of metastasis and recurrence, and causes many casualties worldwide. In Korea, the mortality rate due to cancer is steadily increasing every year. There were an estimated 14.1 million new cases of cancer worldwide in 2012, and an estimated 8.5 million deaths from cancer (Ferlay et al., 2013). According to the 2019 National Statistical Office's 'Statistical Results on Causes of Death', cancer is reported as the most threatening disease, ranking first in mortality. and metastases to other organs and develops into severe symptoms (WHO, 2006).
  • chemotherapy refers to a method of treating cancer using an anticancer agent.
  • Research on new types of anticancer drugs that can overcome the side effects of existing anticancer drugs caused by the diversity of cancer itself and the diversification of pathogenesis is being conducted.
  • cancer is still one of the diseases that are difficult to conquer completely.
  • treatment is performed through surgery, radiation therapy, chemotherapy, etc., but there is a problem in that it is difficult to completely remove microscopic lesions that have infiltrated into surrounding tissues or metastasized to lymph nodes.
  • the present invention aims to provide a novel Enterococcus faecium LCM001 strain (Accession Number: KCTC 14669BP).
  • the present invention provides a composition for the treatment of cancer comprising Cyclo (L-Pro-L-Tyr) and its derivatives isolated from Enterococcus faecium LCM001 strain (Accession Number: KCTC 14669BP) culture medium or cell-free supernatant as an active ingredient intended to provide
  • the present invention provides a novel Enterococcus faecium LCM001 strain (Accession Number: KCTC 14669BP).
  • the strain is characterized by having the 16s RNA nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 1];
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant exhibits a cancer cell killing effect.
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant is EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR or DDR2 gene expression in cancer cells It can be suppressed, but is not limited thereto.
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant is characterized in that it specifically kills cancer cells without killing normal cells.
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell-free supernatant may inhibit the EGFR/KRAS/PI3K pathway in cancer cells, but is not limited thereto.
  • Enterococcus faecium LCM001 strain accession number: KCTC 14669BP
  • providing a composition for preventing or treating cancer comprising a culture medium or cell free supernatant of the strain as an active ingredient do.
  • the culture medium or cell free supernatant of the above strain can suppress the expression of any one gene of EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR or DDR2 in cancer cells. , but is not limited thereto.
  • composition for preventing or treating cancer comprising a compound represented by Formula 1 as an active ingredient
  • R1 is independently H or OH.
  • the compound represented by [Formula 1] may be isolated from the culture solution of Enterococcus faecium LCM001 strain (Accession Number: KCTC 14669BP), but is not limited thereto.
  • the compound represented by [Formula 1] may inhibit the expression of any one gene of EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR or DDR2 in cancer cells, but is limited thereto It is not.
  • the compound may be any one of the following [Formula 2] to [Formula 6], but is not limited thereto;
  • Enterococcus faecium LCM001 strain accession number: KCTC 14669BP
  • KCTC 14669BP culture medium or cell free supernatant of the strain for prevention or improvement of cancer
  • food containing as an active ingredient A composition or health functional food is provided.
  • a food composition or health functional food for preventing or improving cancer comprising a compound represented by Formula 1 as an active ingredient;
  • R1 is independently H or OH.
  • the cancer is cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, colon cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, cervical cancer, skin melanoma, intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, liver cancer, brain tumor , bladder cancer, blood cancer, stomach cancer, perianal cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, Soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary gland It may be one or more from the group consisting of adenomas, but is not limited
  • the novel Enterococcus faecium LCM001 strain (accession number: KCTC 14669BP) culture medium of the present invention is EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR or DDR2 in cancer cells any one gene By suppressing the expression, it can suppress the survival of human cancer cells and induce apoptosis, so the novel Enterococcus faecium LCM001 strain (accession number: KCTC 14669BP) culture medium can be usefully used as a cancer prevention and treatment agent.
  • Figure 1 shows the results of genetic phylogenetic tree analysis of the novel Enterococcus faecium LCM001 strain (accession number: KCTC 14669BP).
  • the microorganism belongs to Enterococcus, and showed 85% homology with Enterococcus faecium .
  • Figure 2A is a graph showing the cell viability of lung cancer cells (A549) and normal lung cells (Wi38) using the cell-free supernatant of Enterococcus faecium LCM001 strain, specifically inhibiting the growth of only lung cancer cells (A549) Apoptosis was induced.
  • Figure 2B is a cell-free supernatant of Enterococcus faecium LCM001 strain colon cancer cells (HCT-15), liver cancer cells (Sk-hep-1), pancreatic cancer cells (PANC-1) and breast cancer cells (MCF-7) As a graph showing cell viability, apoptosis was induced by inhibiting the growth of other cancer cells like lung cancer cells (A549).
  • Figure 3 is a picture showing the mechanism of inducing cell proliferation inhibition and apoptosis according to the inhibition of EGFR / KRAS.
  • Figure 4 is a graph showing the fold change compared to the control after normalizing the mRNA expression rate to ⁇ -actin by targeting the genes in Table 1, which are major biomarkers for human non-small cell lung cancer as therapeutic targets.
  • Figure 5 is a graph showing the HFA (Hollow fiber assay) results according to the cell-free supernatant of Enterococcus faecium LCM001 strain, it can be confirmed that the proliferation of lung cancer cells is inhibited.
  • HFA Hollow fiber assay
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating a simple process of separating the active ingredient (Cyclo (L-Pro-L-Tyr)) of the cell-free supernatant of Enterococcus faecium LCM001 strain.
  • Figure 7 shows Cyclo (L-Pro-L-Tyr) isolated from cell-free supernatant of Enterococcus faecium LCM001 strain.
  • Embodiments according to the present invention can be applied with various changes and can have various forms, so specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the present specification or application. However, this is not intended to limit the embodiments according to the concept of the present invention to a specific disclosed form, and should be understood to include all changes, equivalents, or substitutes included in the spirit and technical scope of the present invention.
  • the present invention provides a novel Enterococcus faecium LCM001 strain.
  • the present inventors identified and identified microorganisms having excellent anticancer activity, and found that the culture medium or cell-free supernatant of the novel Enterococcus faecium LCM001 strain had an excellent cell killing effect on cancer cells.
  • the present inventors analyzed the 16s rRNA nucleotide sequence of the novel Enterococcus faecium LCM001 strain and analyzed the genetic phylogenetic tree. As a result, it belongs to Enterococcus and has 85% homology with Enterococcus faecium It was confirmed that, Enterococcus Faecium LCM001 strain was deposited with the Center for Biological Resources (KCTC) on August 23, 2021 as accession number KCTC 14669BP.
  • KCTC Center for Biological Resources
  • the 16s rRNA base sequence of the Enterococcus faecium LCM001 strain is as [SEQ ID NO: 1];
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant inhibits the growth of cancer cells and exhibits an apoptotic effect.
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant is EGFR (epidermal growth factor receptor), ALK, KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), ROS1 (ROS) in cancer cells Proto-Oncogene 1, Receptor Tyrosine Kinase), HER2 (Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2), RET (Ret Proto-Oncogene), MET (MET Proto-Oncogene, Receptor Tyrosine Kinase), BRAF (serine/threonine-protein kinase B) -Raf), PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha), NTRK1 (Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1), FGFR (Fibroblast Growth Factor Re
  • the cancer is cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, colon cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, cervical cancer, skin melanoma, intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, liver cancer, brain tumor , bladder cancer, blood cancer, stomach cancer, perianal cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, Soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary gland
  • One or more may be selected from the group consisting of adenomas, but is
  • the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant showed an apoptotic effect on various cancer cells, but no apoptotic effect on normal lung cells.
  • composition for preventing or treating cancer comprising Enterococcus faecium LCM001 strain (Accession Number: KCTC 14669BP), a culture medium or cell free supernatant of the strain as an active ingredient provides
  • the present inventors isolated an active ingredient exhibiting a cancer cell killing effect from the Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium or cell free supernatant, and the compound may be represented by the following [Formula 1];
  • R1 is independently H or OH.
  • the present inventors confirmed that the cancer cell killing effect is excellent as the number of -OH groups decreases.
  • composition for preventing or treating cancer comprising the compound represented by Formula 1 as an active ingredient is provided.
  • the present inventors isolated Cyclo (L-Pro-L-Tyr) as an active ingredient exhibiting a cancer cell killing effect from the culture medium or cell free supernatant of the Enterococcus faecium LCM001 strain.
  • the Cyclo (L-Pro-L-Tyr) has a chemical structure of [Formula 2];
  • composition for preventing or treating cancer comprising the compounds represented by [Formula 2] to [Formula 6] as an active ingredient is provided.
  • the cancer is cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, colon cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, cervical cancer, skin melanoma, intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, liver cancer, brain tumor , bladder cancer, blood cancer, stomach cancer, perianal cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, Soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary gland
  • One or more may be selected from the group consisting of adenomas, but is
  • composition for preventing or treating cancer is composed of one or more pharmaceutically acceptable compounds in an effective amount of the Enterococcus faecium LCM001 strain of the present invention, its culture medium or its cell-free supernatant, and the compound represented by [Formula 1] as the main component.
  • a conventional carrier or one or two or more additives may be selected to prepare a composition in a conventional dosage form.
  • One or two or more carriers may be selected from diluents, lubricants, binders, disintegrants, sweeteners, stabilizers, and preservatives, and one or two or more additives may be selected from among flavoring agents, vitamins, and antioxidants. and can be used.
  • diluents include lactose monohydrate, trehalose, cornstarch, and soybean oil.
  • microcrystalline cellulose or mannitol D-mannitol
  • magnesium stearate or talc is preferable as a lubricant
  • polyvinyl pyrrolidone PVP
  • polyvinyl pyrolidone PVP
  • HPC hydroxypropylcellulose
  • the disintegrant is preferably selected from carboxymethylcellulose calcium (Ca-CMC), sodium starch glycolate, polacrylin potassium, or cross-linked polyvinylpyrrolidone.
  • White sugar, fructose, sorbitol, or aspartame is selected as the sweetener, and carboxymethylcellulosesodium (Na-CMC), beta-cyclodextrin, and white wax are used as the stabilizer.
  • bee's wax) or xanthan gum preservatives include methyl p-hydroxy benzoate (methylparaben), propylp-hydroxybenzoate (propylparaben), or potassium sorbate It is preferable to select from, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a patient as a single dose, or may be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time.
  • 'pharmaceutically effective amount' refers to an amount that exhibits a higher response than that of the negative control group, and preferably refers to an amount sufficient to prevent or treat inflammatory diseases.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed according to various factors such as the disease and its severity, the patient's age, weight, health condition, sex, administration route and treatment period.
  • composition of the present invention can be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with the pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable means a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not inhibit the action of the active ingredient when administered to humans and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders and dizziness or similar reactions.
  • the composition of the present invention may be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with the pharmaceutically acceptable carrier. The route of administration is not limited thereto, but may be administered orally or parenterally.
  • Enterococcus faecium LCM001 strain accession number: KCTC 14669BP
  • a food composition for preventing or improving cancer comprising a culture medium or cell free supernatant of the strain as an active ingredient
  • Enterococcus faecium LCM001 strain (accession number: KCTC 14669BP), health function for preventing or improving cancer comprising a culture medium or cell free supernatant of the strain as an active ingredient provide food.
  • the present invention provides a food composition or health functional food for preventing or improving cancer containing the compound represented by Formula 1 as an active ingredient;
  • R1 is independently H or OH.
  • the health functional food of the present invention includes beverages (including tea or alcoholic beverages) including the above food composition, fruits and processed foods thereof (eg, canned fruits, bottled fruits, jams, marmalades, etc.), fish, meat, and processed foods thereof. (e.g. ham, sausage, corned beef, etc.), breads and noodles (e.g. udon, buckwheat noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juice, various drinks, cookies, taffy, dairy products (e.g. butter, cheese, etc.), It may be edible vegetable oil, margarine, vegetable protein, retort food, frozen food, and various seasonings (eg, soybean paste, soy sauce, sauce, etc.).
  • fruits and processed foods thereof eg. canned fruits, bottled fruits, jams, marmalades, etc.
  • fish meat, and processed foods thereof.
  • breads and noodles e.g. udon, buckwheat noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc
  • the health functional food of the present invention may be formulated into tablets, pills, powders, granules, powders, capsules, liquid formulations, and the like. They may be formulated further comprising one or more of carriers, diluents, excipients and additives.
  • carrier examples include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, erythritol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, water, sugar syrup, methylcellulose, methyl hydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate And at least one selected from the group consisting of mineral oil is preferably used.
  • Example 1 Cancer cell killing effect of Enterococcus faecium LCM001 strain
  • the microorganism Enterococcus faecium LCM001 was inoculated with a single colony in TSB (Tryptic soy broth) autoclaved at 121 ° C for 15 minutes and then cultured at 150 rpm in a 37 ° C incubator for 24 hours.
  • TSB Traptic soy broth
  • TSA medium Teryptic soy agar
  • KCCM Korea Center for Microbial Conservation
  • the present inventors confirmed the effect of killing cancer cells using microorganisms isolated from human feces, and selected microorganisms having excellent cancer cell killing effects.
  • the 16s rRNA base sequence of the selected strain it has the base sequence of [SEQ ID NO: 1], and as a result of analyzing the genetic phylogenetic tree, it belongs to Enterococcus, Enterococcus faecium and 85 It was confirmed that showing % homology (FIG. 1).
  • the present inventor named the strain as Enterococcus Faecium LCM001, and deposited it with the Center for Biological Resources (KCTC) on August 23, 2021, accession number KCTC 14669BP.
  • NSCLC Human non-small cell lung cancer
  • HCT-15 colorectal cancer cells were supplemented with RPMI medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin, and Sk-hep-1 liver cancer cells and PANC-1 pancreatic cancer cells were supplemented with DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
  • DMEM fetal calf serum
  • MCF-7 breast cancer cells were cultured in EMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
  • MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] assay.
  • lung cancer cells A549, 7x10 3 cells/well
  • colon cancer cells HCT-15, 5x10 3 cells/well
  • liver cancer cells Sk-hep-1, 5x10 3 cells/well
  • pancreatic cancer cells PANC- 1, 5x10 3 cells/well
  • breast cancer cells MCF-7, 2x10 3 cells/well
  • MTT reagent 10 uL of MTT reagent at a concentration of 5 mg/ml was treated per well, and then reacted for 4 hours at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere. Then, after dissolving the cells in dimethyl sulfoxide (DMSO, 100 ⁇ l/well), cell viability was measured at an absorbance of 570 nm using a microplate reader.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Cell viability (%) (absorbance of sample treatment group/absorbance of control group) ⁇ 100.
  • Enterococcus faecium LCM001 cell-free supernatant shows the effect of killing human non-small cell lung cancer cells (A549) in a concentration-dependent manner, whereas for human normal fibroblast lung cells (Wi38), except for 10X , did not show apoptotic effect.
  • Enterococcus faecium LCM001 cell-free supernatant is also against colon cancer cells (HCT-15), liver cancer cells (Sk-hep-1), pancreatic cancer cells (PANC-1) and breast cancer cells (MCF-7) It was confirmed that the cell death effect was the same as that of non-small cell lung cancer cells (A549).
  • lung cancer cells (A549, 1.2 ⁇ 10 6 cells/well) were repeatedly dispensed twice in a 6-well culture plate, and then maintained at 37°C in 5% RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS. It was incubated overnight under a CO 2 atmosphere. After that, the medium was properly diluted with various sample concentrations in RPMI 1640 medium from which fetal bovine serum (FBS) was removed, and then replaced with 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18 , 20, 24 hours after treatment with RNase and transferred to a tube.
  • FBS fetal bovine serum
  • the centrifugation When the centrifugation is completed, the supernatant is removed, and the precipitate is washed with 75% ethanol, and then centrifuged at 7,500 rpm for 5 minutes while maintaining 4°C. After centrifugation is complete, the supernatant is removed and the precipitate is dried. When the 75% ethanol was completely dried, the finally purified total RNA dissolved in the DEPC solution was quantified by measuring absorbance at 260 nm and 280 nm using a NanoQuant Plate TM , and then used for RT-PCR.
  • cDNA synthesis was performed according to the manufacturer's manual using PrimeScript TM 1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa, Japan) using 2ug of extracted total RNA as a template. The finally synthesized cDNA was used for qRT-PCR.
  • Genes specifically overexpressed in human non-small cell lung cancer and mutant genes causing translocation were selected as major predictive biomarkers, and the present invention was started. specified.
  • the expression rate of the gene was confirmed using cDNA to confirm mRNA expression.
  • the mRNA expression level of lung cancer cells (A549) was normalized to ⁇ -actin, and then expressed as a fold change compared to the control group.
  • the microbial culture medium and the cell-free supernatant all reduced the expression of the genes in [Table 1].
  • Sterilized 1.0mm PVDF hollow fiber membrane (500kD) was cut at intervals of 2cm in length and parallelized in RPMI1640 medium containing 20% fetal bovine serum in a 37°C CO 2 5% incubator for 12 hours. Then, using human non-small cell lung cancer A549, make a 1x10 6 cells/ml suspension using RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, fill the inside of HF by aseptic manipulation, heat seal the tip of the fiber, and then heat-seal for stabilization. Incubate for 24 hours in a 37°C 5% CO 2 incubator. The experiment was conducted with a total of 5 groups (control, 500mg/kg, 1000mg/kg, 2000mg/kg, 3000mg/kg), 3 animals/cage. Nude mice (BALB/c) were used.
  • mice were anesthetized with Isoflurance inhalation anesthesia, and then HF was implanted into the left abdominal cavity and sutured.
  • HF was cultured for 7 days in a 37°C 5% CO 2 incubator.
  • cell-free supernatant was orally administered for 7 days at each concentration.
  • HF was recovered, washed in PBS, and reacted in pre-warmed RPMI1640 medium for 30 minutes in a 37°C incubator.
  • Example 2 Enterococcus faecium LCM001 strain culture medium active ingredient Confirmation of lung cancer cell killing effect of Cyclo(L-pro-L-tyr) and its derivatives
  • Enterococcus faecium LCM001 was 121 °C 15 minutes autoclaved TSB (Tryptic soy broth) 3L fermenter at 37 °C, 100 rpm. It was cultured for 24 hours under pH 6.9-7.2 conditions. After the culture was completed, the culture solution in which the microorganisms were cultured was centrifuged to obtain a cell-free supernatant, which was concentrated under reduced pressure, dissolved in 100% MeOH, and undissolved suspended matter was removed. An equal amount of CH 2 Cl 2 was added to the MeOH fractionation layer to obtain a CH 2 Cl 2 fractionation layer.

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Abstract

본 발명은 신규 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP) 배양액은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제하여, 인간 암세포 생존을 억제하고 세포자살을 유도할 수 있어, 암 예방 및 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 및 이의 용도
본 발명은 신규 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
암(cancer)은 현재까지 정복되지 않은 질병으로, 전이 정도 및 재발 여부에 따라 치료가 불가능해 세계적으로 많은 사상자를 낳고 있는 질병으로, 국내에서도 매년 암으로 인한 사망률은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 2012년 전 세계적으로 1,410만 건의 암의 새로운 사례가 발생하였고, 850만 명이 암으로 사망한 것으로 추정된다(Ferlay et al., 2013). 국내의 2019년 통계청 ‘사망원인통계결과’에 따르면, 암은 사망률 1위를 차지할 만큼 가장 위협적인 질병으로 보고되고 있으며, 여러 장기 및 뼈 또는 림프절 등을 포함하는 신체 여러 부분에 발병하며, 주변 조직 및 다른 기관으로 이동하여 전이를 일으켜 심각한 증상으로 발전한다 (WHO, 2006).
현재, 암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있다. 이 중에서, 화학요법은 항암제를 이용하여 암을 치료하는 방법을 말한다. 오늘날에는 약 60여 종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 최근 암 발생 및 암세포의 특성에 관한 지식이 많이 알려짐에 따라, 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
항암 화학치료에 있어 많은 환자들은 항암제의 부작용에 의하여 고통을 받고 있으며, 특히 항암제의 독성으로 인하여 제한적인 투여가 이루어지고 있다. 임상에서 사용되고 있는 항암물질은 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미치며 투여횟수가 반복되면서 치료에 실패하는 등 부작용 및 항암제 내성과 같은 문제점을 가지고 있다. 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 야기되는 기존항암제의 부작용을 극복할 수 있는 새로운 형태의 항암제 치료물질 연구가 진행되고 있다.
과거에 비해서는 현재의 암 치료율은 상당히 높아졌다고 하지만 여전히 암은 완벽한 정복이 어려운 질병 중 하나다. 특히 암이 발생하면 외과적 수술과 방사선 요법, 화학요법 등을 통해 치료가 진행되는데 이를 통해서도 주위 조직 속에 침윤하거나 림프선에 전이한 현미경적 병소를 완전히 제거하는 것은 힘들다는 문제점이 있다.
본 발명은 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 배양액 또는 무세포 상등액을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP) 배양액 또는 무세포 상등액으로부터 분리된 Cyclo(L-Pro-L-Tyr) 및 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP)를 제공한다.
상기 균주는 [서열번호 1]의 16s RNA 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다;
[서열번호 1]
GAGATAGACCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCAGATGTCGGTGAGGTAACC.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포 사멸 효과를 나타낸다.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 정상세포는 사멸시키지 않고 암세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 특징으로 한다.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액은 암세포에서 EGFR/KRAS/PI3K pathway를 저해할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다;
[화학식 1]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000001
,
여기서 R1은 독립적으로 H 또는 OH이다.
상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP)의 배양액으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화합물은 하기 [화학식 2] 내지 [화학식 6] 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다;
[화학식 2]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000004
[화학식 5]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000005
[화학식 6]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000006
.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용, 식품 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용, 식품 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다;
[화학식 1]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000007
,
여기서 R1은 독립적으로 H 또는 OH이다.
상기 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 대장암, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 간암, 뇌종양, 방광암, 혈액암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP) 배양액은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제하여, 인간의 암세포 생존을 억제하고 세포자살을 유도할 수 있어, 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP) 배양액은 암 예방 및 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP)의 유전학적 계통수 분석 결과를 도시한다. 상기 미생물은 엔테로코커스(Enterococcus)에 속하며, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)과 85％ 상동성을 나타내었다.
도 2A는 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 무세포 상등액을 이용하여 폐암 세포(A549) 및 일반 폐세포(Wi38)의 세포 생존율을 그래프로 나타낸 것으로, 폐암 세포(A549)만을 특이적으로 생장을 저해하여 세포 자멸사를 유도하였다.
도 2B는 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 무세포 상등액을 이용하여 대장암세포(HCT-15), 간암 세포(Sk-hep-1), 췌장암 세포(PANC-1) 및 유방암 세포(MCF-7)의 세포 생존율을 나타낸 그래프로, 폐암 세포(A549)와 마찬가지로 다른 암세포의 생장을 저해하여 세포 자멸사를 유도하였다.
도 3은 EGFR/KRAS의 저해에 따른 세포 증식 억제 및 세포 자멸사를 유도하는 메카니즘을 나타낸 그림이다.
도 4는 인간 비소세포폐암을 치료적 타겟으로 하는 주요 바이오 마커인 표 1의 유전자를 타겟으로 하여, mRNA 발현율을 ß-actin에 normalization한 다음, 대조군과 비교해 폴드 변화로 나타내어 그래프화한 것이다.
도 5은 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 무세포 상등액에 따른 HFA(Hollow fiber assay) 결과를 나타내는 그래프로, 폐암 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있다.
도 6는 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 무세포 상등액의 유효성분(Cyclo(L-Pro-L-Tyr))을 분리하는 과정을 간단하게 도식화한 그림이다.
도 7은 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 무세포 상등액으로부터 분리된 Cyclo(L-Pro-L-Tyr)을 나타낸다.
도 8는 유효성분인 Cyclo(L-pro-L-tyr)의 유도체 및 이를 이용하여 MTT assay를 수행한 후 얻어진 IC50의 값을 나타낸 그래프이다.
본 명세서 또는 출원에 개시되어 있는 본 발명의 실시 예들에 대해서 특정한 구조적 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명에 따른 실시 예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명에 따른 실시 예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서 또는 출원에 설명된 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명에 따른 실시 예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미이다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미인 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주를 제공한다. 본 발명자들은 우수한 항암 활성 효과를 가지는 미생물을 동정하여 규명하였으며, 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 배양액 또는 무세포 상등액이 암세포에 대하여 우수한 세포 사멸 효과가 있음을 발견하였다.
이에 본 발명자들은 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석하고, 유전학적 계통수를 분석한 결과, 엔테로코커스(Enterococcus)에 속하며, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)과 85％ 상동성을 나타내는 것을 확인하였으며, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주는 2021년 8월 23일자로 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 14669BP로 기탁되었다.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 16s rRNA 염기서열은 [서열 번호 1]과 같다;
[서열 번호 1]
GAGATAGACCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCAGATGTCGGTGAGGTAACC.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포의 생장을 저해하여 세포 사멸 효과를 나타낸다.
본 발명자의 실험에 의하면, 상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포에서 EGFR(epidermal growth factor receptor), ALK, KRAS(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), ROS1(ROS Proto-Oncogene 1, Receptor Tyrosine Kinase), HER2(Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2), RET(Ret Proto-Oncogene), MET(MET Proto-Oncogene, Receptor Tyrosine Kinase), BRAF(serine/threonine-protein kinase B-Raf), PIK3CA(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha), NTRK1(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1), FGFR(Fibroblast Growth Factor Receptor 1) 또는 DDR2(Discoidin Domain Receptor Tyrosine Kinase) 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제하고, 따라서 EGFR/KRAS/PI3K pathway를 저해하여 암세포의 사멸을 활성화시키는 것을 확인하였다.
상기 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 대장암, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 간암, 뇌종양, 방광암, 혈액암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 다양한 암세포에 대해서는 세포 사멸 효과를 나타내었으나, 일반 폐세포에 대하여 세포 사멸 효과가 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자는 상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)으로부터 암세포 사멸 효과를 나타내는 유효 성분을 분리하였으며, 그 화합물은 하기의 [화학식 1]로 표시될 수 있다;
[화학식 1]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000008
,
여기서 R1은 독립적으로 H 또는 OH이다.
나아가, 본 발명자는 -OH기의 개수가 적을수록 암세포 사멸 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, [화학식 1]로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
구체적으로 본 발명자는 상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)으로부터 암세포 사멸 효과를 나타내는 유효 성분으로 Cyclo(L-Pro-L-Tyr)를 분리하였다. 상기 Cyclo(L-Pro-L-Tyr)는 [화학식 2]의 화학구조를 갖는다;
[화학식 2]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000009
뿐만 아니라, 본 발명자는 [화학식 3] 내지 [화학식 6]으로 표시되는 Cyclo(L-Pro-L-Tyr)의 유도체를 이용하여 암세포 사멸 효과를 확인한 결과, [화학식 3] 내지 [화학식 6]으로 표시되는 화합물 모두 암세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다;
[화학식 2]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000010
[화학식 3]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000011
[화학식 4]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000012
[화학식 5]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000013
[화학식 6]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000014
.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, [화학식 2] 내지 [화학식 6]으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 대장암, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 간암, 뇌종양, 방광암, 혈액암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 주성분인 본 발명의 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액 및 [화학식 1]로 표시되는 화합물의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitol)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐 피롤리돈(PVP:polyvinyl pyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linkedpolyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulosesodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methylparaben), 파라옥시안식향산프로필(propylp-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 유효한 양' 이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 염증성 질환의 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다. 또한, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, [화학식 1]로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용, 식품 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다;
[화학식 1]
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000015
,
여기서 R1은 독립적으로 H 또는 OH이다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 식품 조성물을 포함한 음료(차 또는 알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지, 콘드비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 액제 제형 등으로 제형화된 것일 수도 있다. 이들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 제형화될 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주의 암세포 사멸 효과
<미생물 배양>
상기 미생물 엔테로코커스 패시움 LCM001은 121℃ 15분 고압증기멸균된 TSB(Tryptic soy broth)에 단일 colony를 접종한 후 24시간 동안 37℃ 배양기에서 150rpm으로 배양되었다.
<미생물 동정>
암세포의 생존율을 저해시킨 미생물을 동정하기 위해서, TSA 배지(Tryptic soy agar)를 petri-dish에 분주하여, 미생물을 도말한 후 37℃ 배양기에 24시간 배양하였다. 상기 미생물은 한국미생물보존센터(KCCM, Korea)에 진화적으로 매우 안정되어 있어서 종의 진화적 유연관계를 분석하는데 사용되는 16S RNA 염기서열을 의뢰하여 분석하여, 유전학적 계통수를 분석하였다.
본 발명자는 암세포에 대한 사멸 효과를 갖는 균주를 선정하고자, 인체 분변으로부터 분리된 미생물을 이용하여 암세포의 사멸 효과를 확인하였고, 이 중 우수한 암세포 사멸효과를 가지고 있는 미생물을 선정하였다. 선정된 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석한 결과, [서열 번호 1]의 염기서열을 가지며, 유전학적 계통수를 분석한 결과, 엔테로코커스(Enterococcus)에 속하며, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)과 85％ 상동성을 나타내는 것을 확인하였다(도 1).
본 발명자는 상기 균주를 엔테로코커스 패시움 LCM001로 명명하고, 생물자원센터(KCTC)에 2021년 08월 23일, 기탁번호 KCTC 14669BP로 기탁되었다.
<세포 배양>
인간 비-소세포 폐암(NSCLC, Non-small cell lung cancer) A549 세포는 10％ 소태아 혈청(FBS, fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 인큐베이터를 이용하여 37℃ 5％ CO2 조건하에 배양하였으며, 인간 노말 섬유아 폐세포(Normal fibroblast lung cell) Wi38의 세포는 10％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다.
HCT-15 대장암세포는 10％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 배지, Sk-hep-1 간암세포 및 PANC-1 췌장암세포는 10％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지, MCF-7 유방암세포는 10％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 EMEM 배지에서 배양하였다.
<세포 생존율 분석>
세포 생존율은 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide] 분석을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 폐암세포(A549, 7x103 cells/well), 대장암세포(HCT-15, 5x103 cells/well), 간암 세포(Sk-hep-1, 5x103 cells/well), 췌장암 세포(PANC-1, 5x103 cells/well) 및 유방암 세포(MCF-7, 2x103 cells/well)를 96-웰(well) 배양 플레이트에 3회 반복하여 분주한 후, 10％ FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃ 5％ CO2 대기하에 밤 동안 배양하였다. 그 후 무세포 상등액을 1X, 2X, 5X, 10X의 농도로 각 웰당 100uL씩 3반복으로 처리한 후 37℃ 5％ CO2 대기하에 24시간 동안 배양하였다.
세포 사멸효과를 확인하기 위하여 5mg/ml농도의 MTT 시약을 Well당 10uL씩 처리한 후 4시간 동안 37℃ 5％ CO2 대기하에 반응시켰다. 그 다음, dimethyl sulfoxide(DMSO, 100 ㎕/well)에서 세포를 용해시킨 후, 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 흡광도 570nm에서 세포 생존율을 측정하였다.
하기 [수학식 1]을 이용하여 세포의 생존율을 백분율로 나타내었다. 이러한 세포 독성 시험은 3회 반복하여 실시하였으며, 그 값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
[수학식 1 ]
세포 생존율(％) = (시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) Х 100.
도 2를 참고하면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 무세포 상등액은 농도 의존적으로 인간 비소세포폐암 세포(A549)를 사멸하는 효과를 나타내는 반면, 인간 노말 섬유아 폐세포(Wi38)에 대해서는, 10X를 제외하고, 세포 사멸 효과가 나타나지 않았다.
도 3을 참고하면, 엔테로코커스 패시움 LCM001 무세포 상등액은 대장암세포(HCT-15), 간암 세포(Sk-hep-1), 췌장암 세포(PANC-1) 및 유방암 세포(MCF-7)에 대해서도 비소세포폐암 세포(A549)와 동일하게 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<Total RNA 추출>
Total RNA 추출을 위하여 폐암 세포(A549, 1.2 Х 106 cells/well)를 6-웰(well) 배양 플레이트에 2회 반복하여 분주한 후, 10％ FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃ 5％ CO2 대기하에 밤 동안 배양하였다. 그 후 상기 배지는 소태아 혈청(FBS, fetal bovine serum)이 제거된 RPMI 1640 배지에 다양한 샘플 농도로 알맞게 희석하여 교체한 후, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 24시간에 맞게 RNase를 처리하여 tube에 옮겨 담았다.
이후에 클로로포름 250㎕를 추가적으로 넣고, 세게 섞어 준다. 원심분리기를 사용하여 12,000rpm 4℃를 유지하면서 15분 원심분리한다. 원심분리가 완료되면, 상등액을 소량 얻어 동량의 아이소프로판올(isoprophanol)을 넣어 주고 천천히 섞어주면서 10분 정도 반응시킨 후, 12,000rpm에 4℃를 유지하며 10분 원심분리한다.
원심분리가 완료되면 상층액을 제거한 후 침전물을 75％ 에탄올(Ethanol)로 씻어낸 다음 원심분리 7,500rpm 5분 4℃를 유지하면서 원심분리해준다. 원심분리가 완료되면 상층액을 제거한 후 침전물을 말려준다. 75％ 에탄올이 다 마르면, DEPC 용액에 녹여 최종적으로 정제된 total RNA는 NanoQuant PlateTM를 이용하여 260nm 와 280nm에서 흡광도를 측정하여 정량 한 후 RT-PCR에 사용되었다.
<RT-PCR>
추출한 total RNA 2ug을 주형으로 PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit(TaKaRa, Japan)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA 합성을 수행하였다. 최종적으로 합성된 cDNA는 qRT-PCR에 사용되었다.
<qRT-PCR 분석>
인간 비소세포폐암에 특이적으로 과발현되는 유전자 및 전좌를 일으키는 돌연변이 유전자들을 주요 예측 바이오 마커로 선정하여 본 발명에 착수하였으며, 인간 비소세포폐암을 치료적 타겟으로 하는 주요 바이오 마커를 [표 1]에 명시하였다.
Gene Alteration Adenocarcinoma frequency(10%)
EGFR Mutation 10
KRAS Mutation 25-35
ROS1 Rearrangement 1-2
HER2 Mutation 1.6-4
RET Rearrangement 1-2
MET Amplification 4
BRAF Mutation 1-3
PIK3CA Mutation 2
NTRK1 Rearrangement 3
FGFR Amplification 3
DDR2 Mutation 0.5
Human gene Forward (5’ → 3’) Reverse (5’ → 3’)
EGFR TGCATACAGTGCCACCCAGAG GCACACTGGATACAGTTGTCTGGTC
KRAS CAGTAGACACAAAACAGGCTCAG TGTCGGATCTCCCTCACCAATG
ROS1 GCTCAAGAACCCGACCAAAG CACATCGCCATCTTCACCTTC
HER2 GGAAGTACACGATGCGGAGACT ACCTTCCTCAGCTCCGTCTCTT
RET GTCCTCTTGCTCCACTTCAACG CCTGGCAGTTTTCCACACAGAC
MET TGCACAGTTGGTCCTGCCATGA CAGCCATAGGACCGTATTTCGG
BRAF AACGAGACCGATCCTCATCAGC GGTAGCAGACAAACCTGTGGTTG
PIK3CA GAAGCACCTGAATAGGCAAGTCG GAGCATCCATGAAATCTGGTCGC
NTRK1 GACCCCATCCCTGACACTAAC AGGAAGAGGCAGGCAAAGAC
FGFR1 GCACATCCAGTGGCTAAAGCAC AGCACCTCCATCTCTTTGTCGG
DDR2 AACGAGAGTGCCACCAATGGCT ACTCACTGGCTTCAGAGCGGAA
[표 2]를 토대로 mRNA 발현 확인을 위해 cDNA를 이용하여 유전자의 발현율을 확인하였다. 또한 폐암 세포(A549)의 mRNA 발현 수치는 ß-actin에 normalization한 다음 대조군과 비교해 폴드 변화로 나타냈다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 미생물의 배양액 및 무세포 상등액은 [표 1]의 유전자 발현을 모두 감소시켰다.
구체적으로 비소세포폐암에서 가장 높은 변이를 일으키는 EGFR의 발현을 감소시켰으며, EGFR의 하위조절인자인 KRAS/PI3K의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
<Hollow fiber assay>
멸균된 1.0mm PVDF Hollow fiber membrane(500kD)을 길이 2cm 간격으로 잘라 20% 우태아혈청이 포함된 RPMI1640 배지에 37℃ CO2 5% 배양기에 12시간 동안 평행화 시킨다. 이후, 인간 비소세포폐암 A549를 사용하여 10% 우태아혈청이 포함된 RPMI1640 배지를 사용하여 1x106 cells/ml 부유액을 만들어 무균조작으로 HF 내부를 채운 다음 fiber 끝선단을 가열 밀봉한 다음 안정화를 위하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한다. 실험군은 총 5군(control, 500mg/kg, 1000mg/kg, 2000mg/kg, 3000mg/kg) 3마리/cage로 실험을 진행하였으며, 마우스는 생후 5주령의 평균 체중 23.24±1.33g의 수컷 무흉선 누드마우스(BALB/c)를 사용하였다.
실험에 착수하기 전에 Isoflurance 흡입 마취하여 마우스를 마취시킨 후, 좌측 복부 복강 내에 HF를 이식하고 봉합하였다. 대조군으로 동일한 HF를 37℃ 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하였다. 7일 동안 무세포 상등액을 농도별로 7일간 경구 투여하였다. 7일 후에 HF를 회수하여 PBS에 세척한 후 pre-warmed RPMI1640 배지에 30분간 37℃ 배양기에서 반응시켰다.
이후 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide] 1mg/ml 농도에서 37℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후 4℃에서 24시간 2.5% protamin sulfate가 포함된 용액에 고정 시킨 후 HF를 절단하여 fiber 내 세포를 추출한 후 건조시킨 후 DMSO 250ul를 첨가하여 4시간 동안 Room temperature에서 shaking하여 반응시킨 후 540nm 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5에 그래프화하여 나타내었다.
도 5를 참고하면, 상기 세포 생존율 실험 결과와 마찬가지로 농도 의존적으로 비소세포폐암 세포의 증식이 억제되는 효과를 나타내었다.
실시예 2. 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 유효성분인 Cyclo(L-pro-L-tyr) 및 그 유도체의 폐암 세포 사멸 효과 확인
<활성 물질 분리>
엔테로코커스 패시움 LCM001을 121℃ 15분 고압증기멸균된 TSB(Tryptic soy broth) 3L 발효조에 37℃, 100rpm. pH 6.9-7.2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 미생물이 배양된 배양액을 원심분리하여 무세포 상등액을 확보한 후 감압 농축하여 100% MeOH에 용해 시킨 후 녹지 않은 부유물을 제거하였다. MeOH 분획 층에서 CH2Cl2를 동량 첨가하여 CH2Cl2 분획층을 얻었고 SiO2 resin, volume 105ml, CM 5:1로 흘려 준 후 CMH 50:3:1로 elution 하여 10개의 fraction을 얻었다. 이후 7,8번 fraction을 sephadex LH-20 column으로 정제하여 6개의 fraction을 얻었고, 2번 fraction을 prep SiO2 TLC방법으로 최종 5개의 분획으로 나눴으며, 4번 분획에서 1번째 밴드에서 유효성분인 Cyclo(L-pro-L-tyr)을 최종적으로 얻었다. 유효성분 분리에 따른 세부 공정은 도 6에 간략하게 나타내었으며, 도 7에 엔테로코커스 패시음 LCM001의 유효성분인 Cyclo(L-pro-L-tyr)의 화학식 및 물리화학적 특성을 나타내었다.
<세포 생존율 분석>
엔테로코커스 패시음 LCM001의 유효성분인 Cyclo(L-pro-L-tyr) 뿐만 아니라 Cyclo(L-pro-L-tyr) 유도체의 폐암 세포 사멸 효능을 확인하기 위하여 본 발명자는 Cyclo(L-pro-L-tyr), Cyclo(L-Phe-L-pro), Cyclo(L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro), Cyclo(L-Pro-D-Phe) 및 Cyclo(Tyr-Hpro)에 대하여 인간 비소세포폐암 A549세포의 MTT assay를 수행하고, IC50 값을 계산하였다.
도 8a-e를 참고하면, 엔테로코커스 패시음 LCM001의 유효성분인 Cyclo(L-pro-L-tyr)는 IC50 값이 99.56ug/ml로 확인되었으며, Cyclo(L-Phe-L-pro), Cyclo(L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro), Cyclo(L-Pro-D-Phe) 및 Cyclo(Tyr-Hpro)는 각각 IC50 값이 26.1ug/ml, 57.58ug/ml, 94.56ug/ml 및 119ug/ml로 확인되었다.
상기 결과를 종합하면, -OH가 하나도 없는 Cyclo(L-Phe-L-pro)가 가장 높은 세포 사멸 효능을 나타내었으며, -OH를 두 개 포함하고 있는 Cyclo(Tyr-Hpro)가 가장 낮은 세포 사멸 효능을 나타내었다. 결과적으로 -OH의 수가 적을수록 폐암 세포 사멸 효능에 뛰어난 활성을 나타낸다고 할 수 있다.
본 명세서에서는 본 발명을 한정된 실시 예를 중심으로 설명하였으나, 본 발 명의 사상적 범위 내에서 다양한 실시 예가 가능하다. 또한 설명되지는 않았으나, 균등한 수단도 또한 본 발명에 그대로 결합되는 것이라 할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 하기 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
Figure PCTKR2022018994-appb-img-000016

Claims (15)

  1. 신규한 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 [서열번호 1]의 16s RNA 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포 사멸 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 대장암, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 간암, 뇌종양, 방광암, 혈액암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 하나 이상인 것을 특징으로 하는 균주.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)은 정상세포는 사멸시키지 않고 암세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주 배양액 또는 무세포 상등액은 암세포에서 EGFR/KRAS/PI3K pathway를 저해하는 것을 특징으로 하는 균주.
  8. 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 유효성분은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물;
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000017
    ,
    여기서 R1은 독립적으로 H 또는 OH이다.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP)의 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 암세포에서 EGFR, ALK, KRAS, ROS1, HER2, RET, MET, BRAF, PIK3CA, NTRK1, FGFR 또는 DDR2 중 어느 하나의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 [화학식 2] 내지 [화학식 6] 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물;
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000018
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000019
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000020
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000021
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000022
    .
  14. 엔테로코커스 패시움 LCM001 균주(기탁번호: KCTC 14669BP), 상기 균주의 배양액 또는 무세포 상등액(cell free supernatant)을 유효성분으로 포함하는 암 예방용 건강기능식품.
  15. 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방용 건강기능식품;
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022018994-appb-img-000023
    ,
    여기서 R1은 독립적으로 H 또는 OH이다.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180081509A (ko) * 2015-11-20 2018-07-16 4디 파마 리서치 리미티드 박테리아 균주를 포함하는 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRIFFIN MATTHEW E., ESPINOSA JULIEL, BECKER JESSICA L., LUO JI-DUNG, CARROLL THOMAS S., JHA JYOTI K., FANGER GARY R., HANG HOWARD : "Enterococcus peptidoglycan remodeling promotes checkpoint inhibitor cancer immunotherapy", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 373, no. 6558, 27 August 2021 (2021-08-27), US , pages 1040 - 1046, XP093069126, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.abc9113 *
HERNÁNDEZ-PADILLA LAURA, VÁZQUEZ-RIVERA DOLORES, SÁNCHEZ-BRIONES LUIS A., DÍAZ-PÉREZ ALMA L., MORENO-RODRÍGUEZ JOSÉ, MORENO-EUTIMI: "The Antiproliferative Effect of Cyclodipeptides from Pseudomonas aeruginosa PAO1 on HeLa Cells Involves Inhibition of Phosphorylation of Akt and S6k Kinases", MOLECULES, vol. 22, no. 6, 20 June 2017 (2017-06-20), pages 1024, XP093069124, DOI: 10.3390/molecules22061024 *
PAUDEL BABITA, MAHARJAN RUKUSHA, RAJBHANDARI PRAJWAL, ARYAL NIRAJ, AZIZ SAEFUDDIN, BHATTARAI KESHAB, BARAL BIKASH, MALLA RAJANI, B: "Maculosin, a non-toxic antioxidant compound isolated from Streptomyces sp. KTM18", PHARMACEUTICAL BIOLOGY, SWETS AND ZEITLINGER, LISSE,, NL, vol. 59, no. 1, 1 January 2021 (2021-01-01), NL , pages 931 - 934, XP093069125, ISSN: 1388-0209, DOI: 10.1080/13880209.2021.1946091 *
VÁZQUEZ-RIVERA DOLORES, GONZÁLEZ OMAR, GUZMÁN-RODRÍGUEZ JAQUELINA, DÍAZ-PÉREZ ALMA L., OCHOA-ZARZOSA ALEJANDRA, LÓPEZ-BUCIO JOSÉ, : "Cytotoxicity of Cyclodipeptides from Pseudomonas aeruginosa PAO1 Leads to Apoptosis in Human Cancer Cell Lines", BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL, HINDAWI PUBLISHING CORPORATION, vol. 2015, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 1 - 9, XP093069123, ISSN: 2314-6133, DOI: 10.1155/2015/197608 *

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