WO2019190137A1 - 1,2-디아실글리세롤 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to 1,2-diacylglycerol compounds, and more particularly, to inhibit the overexpression of chemokine CXCL8 associated with the movement of various inflammatory cytokines such as IL-4, IL-6 or inflammatory cells, inflammation
- the present invention relates to novel 1,2-diacylglycerol compounds useful for ameliorating, preventing or treating related diseases, methods for their preparation, and immunomodulators containing the same as active ingredients.
- Immunity protects the living body from various pathogens.
- Immunodeficiency is the occurrence of defects in some components of the immune system. As a result, the immune response does not occur against many types of antigens.
- the immune deficiency is largely divided into congenital or primary immunodeficiency and acquired or secondary immunodeficiency.
- Innate immune deficiency is immune to immune cells such as B cells and T cells, and is a therapeutic method that can only be used for treatments such as gene therapy, antibody injection, and bone marrow transplantation.
- acquired immunodeficiency can improve the immune deficiency state by enhancing the function of the immune component because the immune component itself is present but an abnormality occurs in the immune response process caused by them.
- the compound represented by the formula (1) is a cell damage caused by autoimmune action such as arthritis, atopy, dementia, sepsis, as well as prevention and treatment of diseases caused by various functions of the immune system, various cancers, autoimmune diseases It is known to have efficacy in suppression, prevention and treatment.
- Another object of the present invention is to provide novel 1,2-diacylglycerol compounds having an immunomodulatory function similar to that of 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol (EC-18), which is a conventional immunomodulatory substance; It is to provide a manufacturing method.
- EC-18 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol
- the present invention provides a 1,2-diacylglycerol compound represented by the following formula (2).
- R 1 is a fatty acid group having 8 to 18 carbon atoms
- R 3 is a fatty acid group having 4 to 18 carbon atoms
- R 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
- R4 is an aliphatic or aromatic hydrocarbon group having 2 to 8 carbon atoms
- ego Represents a coupling part.
- the present invention provides an immunomodulator and a health functional food composition for immunomodulation comprising the 1,2-diacylglycerol compound represented by Formula 2 as an active ingredient.
- the present invention provides an immunomodulation method comprising the step of administering an immunomodulatory agent comprising a 1,2-diacylglycerol compound represented by Formula 2 as an active ingredient to a non-human individual.
- novel 1,2-diacylglycerol compounds according to the present invention have an immunomodulatory function similar to 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol (EC-18), which is a conventional immunomodulatory substance,
- EC-18 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol
- IL-4, IL-6, IL-8 By inhibiting the overexpression of various inflammatory cytokines such as IL-4, IL-6, IL-8, it can be usefully used for the improvement, prevention or treatment of inflammation-related diseases.
- 1 and 2 are graphs showing the effect of reducing IL-6 secretion of the glycerol derivative compounds of the prior art and the present invention.
- 3 and 4 are graphs showing the effect of reducing the STAT3 activity of the glycerol derivative compounds of the prior art and the present invention.
- FIG. 6 is a graph showing the effect of reducing the migration of glycerol derivative compounds of the conventional and the present invention HL-60 cell line.
- FIG. 7 and 8 are graphs and photographs showing the results of the infection inhibition experiment of bacterial pulmonary infection animal model of the glycerol derivative compound of the present invention.
- 9 and 10 are graphs showing the effect of reducing the STAT6 activity of the glycerol derivative compounds of the prior art and the present invention.
- 11 and 12 are graphs showing the effect of reducing IL-4 secretion of the glycerol derivative compounds of the prior art and the present invention.
- the present invention provides a novel 1,2-diacylglycerol compound represented by the following formula (2).
- R 1 is a fatty acid group having 8 to 18 carbon atoms
- R 3 is a fatty acid group having 4 to 18 carbon atoms
- R 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
- R4 is an aliphatic or aromatic hydrocarbon group having 2 to 8 carbon atoms
- the fatty acid group refers to an acyl group in which a hydroxyl group (-OH) is removed from a chain or branched and saturated or unsaturated fatty acid.
- R1 may be a fatty acid group having 8 to 16 carbon atoms, for example, octanoyl, lauroyl, decanoyl, palmitoyl, Palmitoyl, etc.
- R3 May be butyryl, 2-Methylbutyryl, Pivaloyl, Linoleoyl, and the like.
- R 2 may be a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an isopropyl group.
- R 4 may be a chain, branched or cyclic and saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 8 carbon atoms or an aromatic group having 6 to 8 carbon atoms.
- the cyclic saturated aliphatic hydrocarbon group may be a cyclopropyl group, a cyclohexyl group, and the like, and the aromatic group may be a phenyl group.
- 1,2-diacylglycerol compound represented by the formula (2) is a racemic or optically active.
- Preferred examples of the 1,2-diacylglycerol compound represented by Formula 2 include a compound in which R 1 in Formula 2 is palmitoyl, R 2 is 2-methylbutyryl, and R 3 is linoleoyl (hereinafter, EC-A20) or A compound (hereinafter EC-A21) in which R1 is palmitoyl, R2 is isopropyl and R3 is linoleoyl can be exemplified.
- the 1,2-diacylglycerol compound represented by Chemical Formula 2 may be glycidyl chloride (Clycidyl chloride, C 3 H 5 ClO, molecular weight: 92.52) or solketal, C 6 H 12 O 3 , molecular weight: 132.16 It can be prepared using as a starting material. Synthesis using glycidyl chloride as starting material can be carried out according to the following schemes 1-3.
- the 1,2-diacylglycerol compound of the present invention is similar to the monoacetyldiacylglycerol derivative (EC-18) represented by the formula (1), which is conventionally effective in various acute and chronic inflammatory diseases as an immunomodulatory and anticancer agent. It can be used as an immunomodulator by regulating the expression of inflammatory cytokines of the corresponding macrophages early in human infection. Specifically, the 1,2-diacylglycerol compound of the present invention can inhibit the overexpression of the inflammatory cytokine IL-6 and reduce the STAT3 activity, which is an IL-6 expression regulator, and thus, various sudden chronic inflammatory diseases and It can be used as an agent for improving, preventing and treating diseases related to immune diseases.
- the monoacetyldiacylglycerol derivative (EC-18) represented by the formula (1) which is conventionally effective in various acute and chronic inflammatory diseases as an immunomodulatory and anticancer agent. It can be used as an immunomodulator by regulating the expression of inflammatory cytok
- the 1,2-diacylglycerol compound of the present invention the expression of IL-4 expressed in T hepler 2 type (Th2) T cells that affect various allergic and autoimmune diseases and cancer microenvironment It is effective in reducing and reducing STAT6 activity, which is an expression regulator of these cytokines, and can be used as a prophylactic and therapeutic agent for Th2-related chronic diseases and cancer.
- the 1,2-diacylglycerol compound of the present invention regulates and decreases the expression of CXCL8 (IL-8) and eventually reduces excessive neutrophil migration, thereby preventing infection in animal models of acute bronchial acute infection.
- the 1,2-diacylglycerol compounds of the present invention inhibit the overexpression of one or more inflammatory cytokines selected from the group consisting of IL-4, IL-6 and CXCL8 (IL-8), thereby improving inflammation related diseases. It can be usefully used for prevention or treatment.
- immune-related diseases examples include various bacterial and viral infectious diseases, acute inflammatory lung diseases, pneumonia, autoimmune diseases, allergic diseases, Cancer and the like can be exemplified.
- prevention refers to any action that inhibits overexpression of immunity by administration of the compound
- treatment refers to any action by which the compound improves or advantageously changes the symptoms caused by an immune-related disease. do.
- the 1,2-diacylglycerol compound of the present invention is used alone as an immunomodulator without mixing with other substances, or as a immunomodulator in the form of a pharmaceutical composition comprising the 1,2-diacylglycerol compound as an active ingredient.
- a pharmaceutical composition comprising the 1,2-diacylglycerol compound as an active ingredient.
- it may include suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
- the content of the 1,2- diacylglycerol compound included in the composition is not particularly limited, but may be included in 0.0001 to 100.0% by weight, specifically 0.001 to 95.0% by weight based on the total weight of the composition.
- the content of 1,2-diacylglycerol compound in the composition may be included in 0.01 to 50% by weight, more specifically 1 to 20% by weight.
- the content of 1,2-diacylglycerol compound in the composition may be included in 50 to 100% by weight, more specifically 50 to 95% by weight.
- the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilizers and suppositories. It can have a formulation of, and can be a variety of oral or parenteral formulations. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
- Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
- Liquid preparations for oral administration include suspensions, solution solutions, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included. have.
- Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
- non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
- base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
- composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
- pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type and severity, age, sex, disease of the individual. It may be determined according to the type, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
- the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations.
- the preferred dosage of the composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration of time, and the suitable total daily dosage can be determined by the practitioner within the correct medical judgment. Generally, an amount of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg, may be administered once to several times daily.
- the compound or composition is not particularly limited as long as it is an object for the purpose of preventing immunosuppression, promoting immunity or treating an immune disease, and any individual may be applied.
- any individual such as non-human animals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, marmots, rats, mice, cows, sheep, pigs, goats, humans, birds, and fish, and the mode of administration is in the art.
- Any conventional method may be used without limitation.
- it may be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
- the present invention provides a dietary supplement for immunomodulation comprising a 1,2-diacylglycerol compound represented by the formula (1) as an active ingredient.
- a 1,2-diacylglycerol compound of the present invention may be included in the nutraceutical composition for the purpose of preventing immune overexpression, enhancing immune function, preventing or improving immune related diseases.
- the term "improvement" refers to any action by which the composition improves or benefits the symptoms of a suspected and onset individual of an immune related disease.
- the composition of the present invention When the composition of the present invention is used in a health functional food, the composition may be added as it is or used with other health functional foods or health functional food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
- the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use.
- the composition of the present invention may be added in the amount of preferably 15 parts by weight or less, more preferably 10 parts by weight or less based on the raw material in the manufacture of food or beverage.
- the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of stability, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
- health functional food may include the composition of the present invention
- specific examples include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, and ice cream.
- Dairy products, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, etc. may include all of the health functional foods in the conventional sense, and may include foods used as feed for animals.
- the health functional food composition of the present invention when used in the form of a beverage, it may contain various sweetening agents, flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in the usual beverage.
- the natural carbohydrate may be glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol.
- the ratio of the natural carbohydrate is not limited thereto, but may be preferably about 0.01 to 0.04 g, more preferably 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
- the sweetener may be a natural sweetener such as taumartin, stevia extract and a synthetic sweetener such as saccharin, aspartame.
- the nutraceutical composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin , Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. Others may contain pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
- the present invention provides a method of immunomodulation or preventing or treating an immune related disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject suspected of immune overexpression or an immune related disease.
- the subject of suspicion of immune overexpression or immune-related disease means all animals, including humans, who may or may develop an immune-related disease, and include a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- the term "administration" refers to the introduction of the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suspected of an immune related disease by any suitable method, and the route of administration is directed to various oral or parenteral routes as long as the target tissue can be reached. It can be administered through.
- the method of treatment of the present invention may include administering a pharmaceutical composition comprising the 1,2-diacylglycerol compound of Formula 1 in a pharmaceutically effective amount.
- Suitable total daily doses may be determined by the practitioner within the correct medical judgment and are generally in amounts of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / The amount of kg may be administered once to several times daily.
- the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health of the patient, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
- R1 palmitoyl
- R2 ethyl
- 4-dimethylaminopyridine 4-dimethylaminopyridine, DMAP, 0.1eq.
- Overnight was maintained at 25 ° C. 0.16 ml of purified water was added thereto, stirred for 2 hours, 14 ml of purified water was added thereto, and the layers were separated.
- reaction temperature is cooled to 18-19 ° C., propionyl chloride (0.3eq) dissolved in methylene chloride is added dropwise, the temperature is cooled to 13-15 ° C., propionyl chloride (0.5 eq) is added dropwise and then again The temperature was cooled to 5-10 ° C, propionyl chloride (0.5eq) was added dropwise and stirred for 1 hour.
- 20 ml of purified water was added at the same temperature, and 6 ml of c-HCl was added thereto to adjust the pH to 1-2.
- the layers were separated and the organic layer was concentrated by neutralization with K 2 CO 3 , MgSO 4 , and dehydration. Concentrate with hexane to remove residual methylene chloride.
- Step B N- (t-butoxycarbo Nyl) glycine (N- (tert-Butoxycarbonyl) glycine, Boc-glycine, 1.2eq.), DCC (N, N'-Dicyclohexylcarbodiimide, 1.2eq.) And DMAP (0.2eq.) Were added at 25 ° C and 18 hours Stirred. After the reaction was completed, the mixture was filtered and extracted three times with purified water and brine solution.
- RAW264.7 cells which are mouse macrophage cells
- DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium, Hyclone, Thermo Scientific
- LPS lipopolysaccaride
- the compounds of A15, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A57, and A70-1 reduce the secretion of IL-6 cytokine by 30% to 80% in RAW264.7 cells.
- Inhibited IL-6 expression similarly or better than EC-18 (PLAG).
- HEK-Blue TM IL-6 cells were used to confirm STAT3 activity by expression of STAT3 induced secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP).
- SEAP STAT3 induced secreted embryonic alkaline phosphatase
- Incubated HEK-Blue TM IL-6 cells were cultured at 1 ⁇ 10 5 cells / well, treated with glycerol derivative compounds of the type shown in Table 4 for 1 hour, and then IL-6 (5ng / ml) for STAT3 activity.
- the pGL4.47 [luc2P / SIE / Hygro] vector containing sis-Inducible Element binding to STAT3 was injected into RAW264.7 cells to confirm the STAT3 activity.
- RAW264.7 cells were incubated at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml in DMEM (Hyclone, Thermo Scientific) medium with 10% Fetal Bovine Serum and maintained at 37 ° C. in a 5% CO 2 wet incubator. .
- the cultured RAW264.7 cells were inoculated in 48 well plates at 1 ⁇ 10 5 cells / well and stabilized for 18 hours.
- pGL4.47 [luc2P / SIE / Hygro] vector containing sis-Inducible Element was mixed with Attractene to induce complex formation at room temperature for 15 minutes.
- the complex was treated with cells and further cultured for 18 hours. After further incubation, each well was treated with a glycerol derivative compound of the type as shown in Table 5 for 1 hour, and then treated with LPS (1 ⁇ g / ml) for STAT3 activity and further incubated for 18 hours. After 18 hours, the culture supernatant per well was removed, and the remaining cells were lysed with Cell lysis buffer and cell lysate was recovered. 10 ⁇ l of the recovered cell lysate was mixed with 90 ⁇ l of luciferase reagent, and the fluorescence was checked using a luminometer. The results are shown in Table 5 and FIG. 4.
- THP-1 cells which are human macrophage cells
- RPMI Hyclone, Thermo Scientific
- THP-1 cells which are human macrophage cells
- the culture solution was treated with the glycerol derivative compounds of the type shown in Table 6 for 1 hour.
- Gemcitabine (2 ⁇ g / ml) was treated as a cell stimulator and further incubated for 24 hours.
- CXCL8 (IL-8) levels in the recovered supernatants were measured according to the manual provided in the human IL-8 ELISA set (BD Biosciences).
- IL-8 capture antibody antibody
- BSA Bovine Serum Albumin
- THP-1 cells which are human macrophage cells
- RPMI Hyclone, Thermo Scientific
- Fetal Bovine Serum a medium of RPMI (Hyclone, Thermo Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum
- THP-1 cells which are human macrophage cells
- the incubated THP-1 cells were first inoculated into 12 well plates at 1 ⁇ 10 6 cells / ml and stabilized for 30 minutes, as shown in Table 7 below. It was treated with the same kind of glycerol derivative compound for 1 hour.
- HL-60 cells cultured in RPMI1640 medium containing 10% Fetal Bovine Serum were dispensed at 5 ⁇ 10 4 cells / chamber, and the THP-1 culture supernatant prepared in advance in the lower chamber. 150 ⁇ l each was added. After incubation for 24 hours, the upper chamber was removed and cells were attached to the bottom of the lower chamber by centrifuge and the supernatant was removed. After adding the cell dissociation / Calcein-AM solution and reacting for 1 hour, the value obtained using a fluorescence spectrometer was calculated by converting it into a cell number. Results of reduced migration of HL-60 cells are shown in Table 7 and FIG. 6.
- Bacterial bacterial infection mice models were purchased from Koatech Corporation (South Korea) 12-week-old Balb / c male mice and maintained in specific pathogen free facilities under moderate temperature and light cycles. Bacterial bacteria for inducing lung infection were incubated overnight at 37 ° C. in aeruginosa K (PAK), Psuedomonas, in LB broth or LB agar plates, and then centrifuged at 13,000 ⁇ g for 2 minutes. Isolation gave bacterial pellets.
- PAK aeruginosa K
- Psuedomonas Psuedomonas
- the bacterial pellet is then suspended in phosphate buffered saline (PBS), and the optical density of the serial dilutions is measured and plated onto agar plates to provide bacterial inoculations with a certain colony forming unit (CFU).
- CFU colony forming unit
- Four of the PAK-administered groups were orally administered 250 mg / kg of the compound of the present invention (EC_A21) and PBS was administered to the control group.
- BALF bronchial alveolar lavage fluid
- bacterial CFU in BALF rapidly increased at 4 hours after PAK administration.
- bacterial CFU in the washing solution was significantly lower than the PAK alone administration group at 4 hours. The results show that the glycerol derivative compounds of the present invention promote bacterial clearance early in infection in PAK infected mice.
- A549 cells were passaged at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml and maintained at 37 ° C. in a 5% CO 2 wet incubator. The cultured A549 cells were inoculated in 48 well plates at 1 ⁇ 10 5 cells / well and stabilized for 18 hours. Then, the pGL4-STAT6 reporter vector containing the STAT6 binding promoter was mixed with Attractene to induce complex formation at room temperature for 15 minutes. The complex was treated with cells and further incubated for 24 hours.
- DMEM Hyclone, Thermo Scientific
- each well was treated with a glycerol derivative compound of the type as shown in Tables 9 and 10 for 1 hour, followed by 20 hours of IL-4 (2 ng / ml or 10 ng / ml) for STAT6 activity. Further incubation. After 20 hours, the culture supernatant was removed from each well, and the remaining cells were lysed with Cell lysis buffer, and cell lysate was recovered. 10 ⁇ l of the recovered cell lysate was mixed with 90 ⁇ l of luciferase reagent, and the degree of fluorescence was confirmed using a luminometer. The results are shown in Table 9, Table 10, FIG. 9 and FIG.
- EL-4 cells In DMEM (Hyclone, Thermo Scientific) medium supplemented with 10% Fetal Bovine Serum, EL-4 cells, mouse lymphoma cells, were passaged at a concentration of 1x10 5 cells / ml and wetted with 5% CO 2. It was kept at 37 ° C. in the incubator. After culturing EL-4 cells were inoculated in 48 well plates at 5 ⁇ 10 4 cells / mL for 30 minutes, and then treated with a glycerol derivative compound of the type shown in Tables 11 and 12 for 2 hours. After 2 hours, 0.5 ⁇ g / ml of PKC activator (p10, PMA) was treated as a cell stimulator and further incubated for 18 hours.
- PKC activator p10, PMA
- IL-4 levels in the recovered supernatants were measured according to the manual provided in Mouse IL-4 ELISA set (BD Biosciences). The day before ELISA, IL-4 capture antibody was diluted in phosphate buffered saline, coated on microwells, and stored overnight at 4 ° C. Each well was washed three times with buffer and then blocked with 2% Bovine Serum Albumin (BSA) for 1 hour at room temperature.
- BSA Bovine Serum Albumin
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Abstract
IL-4, IL-6 등의 각종 염증 사이토카인 또는 염증세포의 이동에 연관된 키모카인 CXCL8의 과발현을 억제하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제가 개시된다. 상기 1,2-디아실글리세롤 화합물은 명세서 내에 화학식 2로 표시된다.
Description
본 발명은 1,2-디아실글리세롤 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, IL-4, IL-6 등의 각종 염증 사이토카인 또는 염증세포의 이동에 연관된 키모카인 CXCL8의 과발현을 억제하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제에 관한 것이다.
면역은 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어하는 것으로, 면역결핍이란 면역계의 일부 구성요소에 결함이 발생하는 것이다. 그 결과, 많은 종류의 항원에 대하여 면역반응이 일어나지 않게 되는데, 이러한 면역 결핍은 크게 선천성 면역결핍(congenital or primary immunodeficiency)과 후천성 면역결핍(acquired or secondary immunodeficiency)으로 나뉘어 진다. 선천성 면역결핍은 B 세포, T 세포 등 면역세포가 원래부터 존재하지 않는 것으로 유전자 치료나 항체주입, 골수 이식 등의 치료법으로만이 가능한 치료법이다. 그에 반해, 후천성 면역결핍증은 면역 구성 요소 자체는 원래 존재하나 이들에 의해 나타나는 면역반응 과정에 이상이 생긴 것이므로 면역 구성요소의 기능을 증진시킴으로써 면역결핍상태를 개선할 수 있다.
근래 면역기능의 이상 증가로 발생하는 면역질환이 많이 발생하고 있으며, 주로 면역억제제를 사용하여 이러한 면역질환을 치료하고 있다. 그러나, 면역억제제를 사용하는 경우, 신체 전체의 면역력을 떨어뜨려 다른 문제를 야기하는 경우가 많다. 최근 면역기능의 작용기전이 알려지면서 전세계적으로 면역기능을 증진 또는 억제할 수 있는 면역조절 물질을 개발하려는 시도가 진행되고 있다. 이러한 시도는 면역조절물질을 통하여 면역 세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진 또는 억제 등 조절함으로써, 질병요인으로부터 생체의 방어력을 증진시킴과 동시에 면역 기능의 과발현에 의한 부작용을 최소화시키는 것이다. 이와 같은 면역 조절 물질로서, 대한민국 특허공개 10-2006-0047447호에는 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물이 개시되어 있다. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물은 1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤로서, 통상 EC-18 또는 PLAG로 알려져 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 각종 면역체계의 기능 저하에 의해 발생하는 질환, 각종 암에 대한 예방 및 치료 뿐만 아니라, 관절염, 아토피, 치매, 패혈증 등 자가면역작용에 의한 세포손상(자가면역질환)의 억제, 예방 및 치료에 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종래의 면역 조절 물질인 1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤(EC-18)과 유사한 면역 조절 기능을 가지는 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, IL-4, IL-6 등의 각종 염증 사이토카인 또는 염증세포의 이동에 연관된 키모카인 CXCL8의 과발현을 억제하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 제공한다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에서, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이고, R3은 탄소수 4 내지 18의 지방산기이며, R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, 
(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기), 
또는 
이고, 
는 결합부를 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절제 및 면역조절용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물은, 종래의 면역 조절 물질인 1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤(EC-18)과 유사한 면역 조절 기능을 가지며, IL-4, IL-6, IL-8 등의 각종 염증 사이토카인의 과발현을 억제하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 2는 종래 및 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 IL-6 분비 감소 효과를 보여주는 그래프.
도 3 및 4는 종래 및 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 STAT3 활성 감소 효과를 보여주는 그래프.
도 5는 종래 및 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 CXCL8 (IL-8) 발현 감소 효과를 보여주는 그래프.
도 6은 종래 및 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 HL-60 세포주의 이동 감소 효과를 보여주는 그래프.
도 7 및 도 8은 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 박테리아균 폐감염 동물 모델의 감염 억제 실험 결과를 보여주는 그래프 및 사진.
도 9 및 10은 종래 및 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 STAT6 활성 감소 효과를 보여주는 그래프.
도 11 및 12는 종래 및 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 IL-4 분비 감소 효과를 보여주는 그래프.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 신규한 1,2-디아실글리세롤 화합물을 제공한다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에서, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이고, R3은 탄소수 4 내지 18의 지방산기이며, R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, 
(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기), 
(2-Aminoacetyl) 또는 
(1-Methoxyethyl)이고, 
는 결합부를 나타낸다.
상기 화학식 2에 있어서, 지방산기는 사슬형 또는 가지형 및 포화 또는 불포화 지방산에서 히드록시기(-OH)가 제거된 아실기를 의미한다. 상기 화학식 2에서, R1은 탄소수 8 내지 16의 지방산기일 수 있고, 예를 들면, 옥타노일(octanoyl), 라우로일(lauroyl), 데카노일(Decanoyl), 팔미토일(Palmitoyl) 등일 수 있으며, R3은 부티릴(butyryl), 2-메틸부티릴(2-Methylbutyryl), 피발로일(Pivaloyl), 리놀레오일(Linoleoyl) 등일 수 있다. R2는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 이소프로필기일 수 있다. R4는 탄소수 2 내지 8의 사슬형, 가지형 또는 고리형 및 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 6 내지 8의 방향족기일 수 있다. 예를 들어, 상기 고리형 포화 지방족 탄화수소기는 싸이클로프로필기, 싸이클로헥실기 등일 수 있고, 상기 방향족기는 페닐기일 수 있다. 상기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물은 라세믹체 또는 광학활성체이다. 상기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물의 바람직한 예로는 화학식 2의 R1이 팔미토일이고, R2가 2-메틸부티릴이며, R3이 리놀레오일인 화합물(이하, EC-A20) 또는 R1이 팔미토일이고, R2가 이소프로필이며, R3이 리놀레오일인 화합물(이하, EC-A21)을 예시할 수 있다.
상기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물은 글리시딜 클로라이드(Glycidyl chloride, C3H5ClO, 분자량: 92.52) 또는 솔케탈(Solketal, C6H12O3, 분자량: 132.16)을 출발물질로 사용하여 제조할 수 있다. 출발물질로서 글리시딜 클로라이드를 이용하는 합성법은 다음 반응식 1 내지 3에 따라 수행할 수 있다.
[반응식 1]
먼저, 상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 글리시딜 클로라이드와 지방산(R1-OH, R1은 화학식 2에서 정의한 바와 같다)을 반응시켜, 화합물 A를 얻는다.
[반응식 2]
다음으로, 상기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 화합물 A와 R2-OH (R2는 화학식 2에서 정의한 바와 같다)를 반응시켜, 화합물 B를 얻는다.
[반응식 3]
다음으로, 상기 반응식 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 B와 지방산(R3-OH, R3은 화학식 2에서 정의한 바와 같다)을 반응시켜, 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 얻을 수 있다.
한편, 출발물질로서 솔케탈(Solketal)을 이용하는 합성법은, 먼저, 하기 반응식 4 및 5로 표시되는 반응을 수행하여 화합물 B를 얻는다.
[반응식 4]
먼저, 상기 반응식 4에 나타낸 바와 같이, 솔케탈과 지방산(R1-OH, R1은 화학식 2에서 정의한 바와 같다)을 반응시켜, 화합물 C를 얻고, 화합물 C를 가수분해 반응시켜, 화합물 D를 얻는다.
[반응식 5]
다음으로, 상기 반응식 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 D와 R2-OH (R2는 화학식 2에서 정의한 바와 같다)를 반응시켜, 화합물 B를 얻는다. 이와 같은 얻은 화합물 B를 출발물질로 사용하고, 반응식 3의 반응을 수행하면 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물은, 기존에 면역조절 및 항암제로서 다양한 급,만성 염증 질환에서 효과를 나타내는 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 유도체(EC-18)와 유사하게, 인체 감염시 초기 대응하는 대식세포들의 염증 사이토카인의 발현을 조절하여, 면역조절제로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물은, 염증 사이토카인인 IL-6의 과발현을 억제하고, IL-6 발현 조절 인자인 STAT3 활성을 감소시킬 수 있으므로, 각종 급 만성 염증 질환 및 면역질환 관련 질병의 개선, 예방 및 치료제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물은, 각종 알러지 및 자가면역질환, 그리고 암의 미세환경에 영향을 미치는 T hepler 2 type (Th2)의 T 세포에서 발현하는 IL-4의 발현을 조절하여 감소시키고 이들 사이토카인의 발현조절인자인 STAT6 활성을 감소시키는 효과가 있어, Th2 관련 만성질환 및 암 예방 및 치료제로서도 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물은, CXCL8 (IL-8)의 발현을 조절하여 감소시키고, 결국 과도한 호중구 이동을 경감하여, 동물모델에서 기관지내 균 급성 감염 모델에서의 감염을 억제하는 효과가 있어, 과도한 호중구 이동에 따른 염증반응을 조절하는 면역조절제 또는 초기 감염에 대응하는 치료제로서, 각종 급 만성 염증 질환 및 면역질환 관련 질병의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물은 IL-4, IL-6 및 CXCL8 (IL-8)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 사이토카인의 과발현을 억제하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물의 투여로 인하여 예방 또는 치료될 수 있는 면역 관련 질환의 예로는 각종 박테리아 및 바이러스 감염질환, 급ㅇ만성 염증 폐질환, 폐렴, 자가면역질환, 알러지 질환, 암 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서 용어, "예방"은 상기 화합물의 투여로 면역의 과발현을 억제하는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 화합물에 의해 면역 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물은 다른 물질과의 혼합없이 단독으로 면역조절제로 사용되거나, 상기 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 형태로 면역조절제로 사용될 수 있다. 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물이 약학적 조성물에 사용될 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 1,2-디아실글리세롤 화합물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 100.0 중량%, 구체적으로는 0.001 내지 95.0 중량% 포함될 수 있다. 예를 들면, 조성물 중 1,2-디아실글리세롤 화합물의 함량은 0.01 내지 50 중량%, 더욱 구체적으로는 1 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 조성물 중 1,2-디아실글리세롤 화합물의 함량은 50 내지 100 중량%, 더욱 구체적으로는 50 내지 95 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 화합물 또는 조성물은 면역 저하 예방, 면역 증진 또는 면역 질환의 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 면역조절용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 1,2-디아실글리세롤 화합물을 면역 과발현의 방지, 면역 기능의 증진, 면역 관련 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 포함시킬 수 있다. 여기서, 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 면역 관련 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04 g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03 g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 면역 과발현 또는 면역 관련 질환의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 조절 방법 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 상기 면역 과발현 또는 면역 관련 질환의 의심 개체는 면역 관련 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 면역 관련 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 면역 관련 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 방법은 상기 화학식 1의 1,2-디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 글리시딜 클로라이드를 이용한 1,2-디아실글리세롤 화합물의 합성(EC-A14)
A. 하기 반응식 1a에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 1.5ml의 PE(petroleum ether)에 글리시딜 클로라이드(832.68mg, 9.0mmol, 1.8eq.), R1-OH(1eq., R1= 팔미토일(palmitoyl)), NaOH(1.8eq.) 및 촉매로서 n-Bu4NBr (0.05 eq.)을 넣고, 50℃로 승온하고 5 시간 동안 교반하였다. 반응물을 30ml의 PE로 묽힌 후, 여과하였다. 유기층을 Na2SO4로 탈수하고, 여과한 후 농축한 다음, 플래시 칼럼(flash column, PE:EA(에틸아세테이트)=50:1)으로 정제하여 목적 화합물 A(R1= 팔미토일)를 얻었다(수율 = 63.65%).
[반응식 1a]
B. 하기 반응식 1b에 나타낸 바와 같이, ACN(아세토니트릴) 2ml에 상기 단계 A에서 얻은 화합물 A 200mg(640mmol, 1eq.), R2-OH(0.8eq. R2= 에틸), 촉매로서 n-Bu4NBr(0.1eq.)을 넣고, 100℃로 승온하고 18 시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축하고, 플래시 칼럼(PE:EA= 20.:1, Rf=0.18)으로 정제하여 목적 화합물 B를 얻었다(R1= 팔미토일, R2= 에틸, 수율= 25.03%).
[반응식 1b]
C. 하기 반응식 1c에 나타낸 바와 같이, 헥산(Hex) 18ml에 R3-OH(1.02eq., R3= 리놀레오일(linoleoyl)) 및 피발로일 클로라이드(pivaloyl chloride, 1eq.)을 넣고, 5 ℃ 이하로 냉각한 후, 트리에틸아민(TEA, 2eq.)을 10~15 ℃로 유지하면서 천천히 적가한 후, 동온도에서 30분간 교반하였다. 단계 B에서 얻은 화합물 B 2.284g(6.37mmole, 1eq. R1= 팔미토일, R2= 에틸)와 4-디메틸아미노피리딘(4-(Dimethylamino)pyridine, DMAP, 0.1eq.)을 투입한 후, 20~25 ℃를 유지하면서 밤샘 유지(overnight)하였다. 정제수 0.16ml를 넣고, 2시간동안 교반한 후, 정제수 14ml를 넣고, 층분리하였다. 메탄올(MeOH) 9.13ml, 정제수 4.5ml, KOH 0.25mg을 섞은 용매로 2번 층분리하고, 메탄올 13ml, 정제수 0.7ml를 섞은 용매로 2번 층분리한 다음, 정제수 14ml에 c-HCl 42mg을 섞은 용매로 층분리하고, 정제수 14ml에 NaHCO3 6.8mg을 섞은 용매로 층분리하였다. 유기층에 MgSO4 1.16g, 활성 클레이(activated clay) 2.9g, 활성 탄소(activated carbon) 2.9g을 넣고, 10~15 ℃에서 1시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 냉각 헥산으로 세척하고, 농축하여 화학식 1로 표시되는 목적 화합물(EC-A14, R1= 팔미토일, R2= 에틸, R3= 리놀레오일)을 얻었다(수율= 22.03%).
[반응식 1c]
[실시예 2] 솔케탈을 이용한 1,2-디아실글리세롤 화합물의 합성(EC-A78)
A. 하기 반응식 2a에 나타낸 바와 같이, 메틸렌클로라이드(MC) 33ml에 트리에틸아민(TEA, 2.09eq.)과 R1-OH(1eq., R1= 팔미토일)을 용해시킨 후, 반응 온도를 5~15 ℃까지 냉각하고, 피발로일 클로라이드(1.05eq.)을 15 ℃이하를 유지하면서 투입하고, 30분간 교반하였다. 반응액에 솔케탈(solketal) 2.54ml (20.47 mmole, 1.05eq.)을 빠르게 투입하고, DMAP(0.01eq.)을 넣고 20~25℃에서 1시간 교반하였다. 반응이 완결되면 정제수 12.5ml를 넣고, 층분리한 후, 다시 정제수 12.5ml를 넣고, c-HCl 0.3ml를 넣어 pH를 7~8로 맞추었다. 유기층을 분리한 후, 농축하여 오일(oil)상의 화합물을 얻었다. 여기에 메탄올(MeOH) 15ml, 정제수 1.75ml를 투입하고, 온도를 22~23℃로 맞춘 후, c-HCl 2ml를 천천히 적가하고, 온도를 25 ℃이하로 유지하면서 2~2.5 시간 동안 교반하면, 흰색고체가 서서히 석출된다. 여기에 헥산 13ml 및 정제수 16ml를 넣은 후, 25℃를 유지하면서 피리딘(pyridine) 1.9ml를 넣고, pH 4~5로 조정한 후, 15℃까지 냉각 후 여과하였다. 헥산으로 세척하고, 건조하여 목적 화합물 D를 얻었다(R1= 팔미토일, 수율= 85%).
[반응식 2a]
B. 다음으로, 하기 반응식 2b에 나타낸 바와 같이, 메틸렌클로라이드(MC) 30ml에 피리딘 8.53ml, 단계 A에 얻은 화합물 D 5g (R1= 팔미토일, 15.13mmol, 1eq.)과 DMAP(0.02eq.)을 넣고, 25~30℃에서 용해시킨 후, 온도를 20℃까지 냉각하고, 프로피오닐 클로라이드(propionyl chloride, 0.2eq)를 천천히 적가하였다. 반응 온도를 18 내지 19 ℃로 냉각하고, 메틸렌클로라이드에 용해된 프로피오닐 클로라이드(0.3eq)을 적가하고, 온도를 13 내지 15 ℃로 냉각하고, 프로피오닐 클로라이드(0.5 eq)을 적가한 다음, 다시 온도를 5 내지 10 ℃로 냉각하고, 프로피오닐 클로라이드(0.5eq)을 적가한 후 1시간 교반하였다. 동온도에서 정제수 20ml를 넣고, c-HCl 6ml를 투입하여 pH 1~2로 조절하였다. 층분리하여 유기층을 K2CO3, MgSO4로 중화 및 탈수하여 농축하였다. 잔존 메틸렌클로라이드를 제거하기 위하여 헥산으로 농축하였다. 헥산 15ml를 넣은 후, 온도를 18~20℃로 냉각하고, seeding하여 결정을 석출시켰다. 온도 13 내지 15 ℃에서 반응물을 석출시킨 후, 다시 10℃로 냉각하고, 냉각된 헥산으로 세척하고 건조하여 목적 화합물 B를 얻었다(R1= 팔미토일, R2= 프로피오닐, 수율= 71.23%),
[반응식 2b]
이와 같이 얻은 화합물 B(1eq. R1= 팔미토일, R2= 프로피오닐)를 이용하여, 실시예 1의 반응식 1c에 따라, 화학식 2로 표시되는 목적 화합물(EC-A78, R1= 팔미토일, R2= 프로피오닐, R3= 리놀레오일)을 얻었다.
[실시예 3] 1,2-디아실글리세롤 화합물의 합성(EC-A16)
A. 하기 반응식 3a에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 아세토니트릴(ACN) 10 ml에 실시예 1의 단계 A의 목적 화합물 A 2.24g(7.18mmol, 1eq.), 리노레산(1eq.) 및 촉매로서 n-Bu4NBr(0.1eq.)을 15℃에서 한 번에 투입하고 교반한 후, 100℃로 승온하고 16 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 0℃로 냉각하고, 20ml NH4Cl 용액을 넣어 반응을 종결하였다. 물층을 메틸렌클로라이드(MC) 125ml 로 3회 추출하고, brine 용액으로 수세하고, Na2SO4로 탈수하여 농축하였다. 플래시 칼럼(PE:EA= 20.:1)으로 정제하여 목적 화합물 E를 얻었다(R1= 팔미토일, R3= 리놀레오일, 수율= 5.58%).
[반응식 3a]
B. 하기 반응식 3b에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 메틸렌클로라이드 3ml에 상기 단계 A의 목적 화합물 E 60mg(101.19μmole, 1eq.), 벤조산(Benzoic acid, 1.2eq.), DCC(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, 1.2eq.) 및 DMAP(0.1eq.)을 0℃에서 넣고, 15분간 교반하였다. 반응물을 20℃로 승온하고 48시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 여과하고, 정제수와 brine 용액으로 3회 추출하고, 추출한 유기층을 Na2SO4로 탈수하여 농축하였다. 플래시 칼럼(PE:EA= 10.:1)으로 정제하여 목적 화합물 F를 얻었다(EC-A16, R1= 팔미토일, R3= 리놀레오일, R2= 벤조일, 수율= 26.94%).
[반응식 3b]
[실시예 4] 1,2-디아실글리세롤 화합물의 합성(EC-A57)
A. 하기 반응식 4a에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 메틸렌클로라이드 4ml에 실시예 3, 단계 B의 목적 화합물 E 800mg(1.35mmole, 1eq.), N-(t-부톡시카보닐)글리신 (N-(tert-Butoxycarbonyl)glycine, Boc-glycine, 1.2eq.), DCC(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, 1.2eq.) 및 DMAP(0.2eq.)을 25℃에서 넣고, 18 시간 교반하였다. 반응이 완료되면 여과하고, 정제수와 brine 용액으로 3회 추출하였다. 추출한 유기층을 Na2SO4로 탈수하여 농축한 다음, 플래시 칼럼(PE:EA= 50:1)으로 정제하여 목적 화합물 G를 얻었다(R1= 팔미토일, R3= 리놀레오일, 수율= 46.91%).
[반응식 4a]
B. 하기 반응식 4b에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 메틸렌클로라이드 1ml에 상기 단계 A의 목적 화합물 G 100mg(133.32μmole, 1eq.) 및 TFA(Trifluoroacetic acid, 20eq.)를 0℃에서 투입하고, 10분간 교반하였다. 반응이 완결되면 반응물을 농축하고, 플래시 칼럼(PE:EA=50:1)으로 정제하여 목적 화합물 H를 얻었다(EC-A57, 수율= 52.51%).
[반응식 4b]
[실시예 5] 1,2-디아실글리세롤 화합물의 합성(EC-A70-1)
A. 하기 반응식 5a에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 메틸렌클로라이드 5ml에 1,1-디메톡시에탄 50mg (1,1-Dimethoxyethane, 554.82μmole, 1eq.), 2,4,6-트리메틸피리딘 (2,4,6-trimethylpyridine, 2,4,6-collidine, 3eq.), 및 트리메틸실릴 트리플로로메탄설포네이트(Trimethylsilyl trifluoromethane sulfonate, TMSOTf, 2eq.)을 0℃에서 넣고 2시간 동안 교반하여, 목적 화합물 I를 얻었다. 얻어진 반응액을 work-up 및 정제없이 바로 다음 반응에 사용하였다.
[반응식 5a]
B. 하기 반응식 5b에 나타낸 바와 같이, 질소 분위기(N2-purge)에서 상기 단계 A의 반응액에 실시예 3, 단계 A의 목적 화합물 E 250mg(421.63μmole, 1eq.)을 넣고, 28℃에서 20시간 교반하였다. 반응이 완결되면 정제수 20ml를 넣어 반응을 종결하고, 메틸렌클로라이드 20ml로 2회 추출하고, 추출한 유기층을 Na2SO4로 탈수하고 농축하였다. 플래시 칼럼(PE:EA= 10:1)으로 정제하여 목적 화합물 J를 얻었다(EC-A70-1, R1= 팔미토일, R3= 리놀레오일, 수율= 20.77%).
[반응식 5b]
[실시예 6 내지 33] 1,2-디아실글리세롤 화합물의 합성
실시예 1 내지 5와 실질적으로 동일한 방법으로, 하기 표 1에 나타낸 1,2-디아실글리세롤 화합물을 합성하였으며, 최종 합성 단계의 수율과 함께 표 1에 나타내었다.
| 실시예번호 | 화합물 | R1 group | R2 group | R3 group | 수율 (%) |
| 1 | EC-A14 | Palmitoyl | Ethyl | Linoleoyl | 22.03 |
| 2 | EC-A78 | Palmitoyl | Propionyl | Linoleoyl | 71.23 |
| 3 | EC-A16 | Palmitoyl | Benzoyl | Linoleoyl | 26.94 |
| 4 | EC-A57 | Palmitoyl | 2-Aminoacetyl | Linoleoyl | 52.51 |
| 5 | EC-A70-1 | Palmitoyl | 1-Methoxyethyl | Linoleoyl | 20.77 |
| 6 | EC-A13 | Palmitoyl | Methyl | Linoleoyl | 10.98 |
| 7 | EC-A15 | Palmitoyl | Propyl | Linoleoyl | 15.76 |
| 8 | EC-A17 | Palmitoyl | Butyryl | Linoleoyl | 24.07 |
| 9 | EC-A18 | Palmitoyl | Valeroyl | Linoleoyl | 68.97 |
| 10 | EC-A19 | Palmitoyl | Isobytyryl | Linoleoyl | 39.86 |
| 11 | EC-A20 | Palmitoyl | 2-Methylbutyryl | Linoleoyl | 62.58 |
| 12 | EC-A21 | Palmitoyl | Isopropyl | Linoleoyl | 16.32 |
| 13 | EC-A22 | Palmitoyl | Pivaloyl | Linoleoyl | 69.96 |
| 14 | EC-A79 | Palmitoyl | Cyclopropanecarbonyl | Linoleoyl | 25.13 |
| 15 | EC-A83 | Palmitoyl | Enanthic | Linoleoyl | 43.06 |
| 16 | EC-A84 | Palmitoyl | Pelargonyl | Linoleoyl | 30.89 |
| 17 | EC-A85 | Octanoyl | Butyryl | Linoleoyl | 69.64 |
| 18 | EC-A86 | Octanoyl | Valeroyl | Linoleoyl | 54.92 |
| 19 | EC-A87 | Octanoyl | Propionyl | Linoleoyl | 53.30 |
| 20 | EC-A88 | Octanoyl | Isobytyryl | Linoleoyl | 39.37 |
| 21 | EC-A89 | Octanoyl | Pivaloyl | Linoleoyl | 54.35 |
| 22 | EC-A91 | Lauroyl | Propionyl | Linoleoyl | 51.04 |
| 23 | EC-A92 | Lauroyl | Butyryl | Linoleoyl | 39.33 |
| 24 | EC-A93 | Lauroyl | Valeroyl | Linoleoyl | 59.19 |
| 25 | EC-A94 | Lauroyl | Isobytyryl | Linoleoyl | 61.10 |
| 26 | EC-A95 | Lauroyl | Pivaloyl | Linoleoyl | 53.58 |
| 27 | EC-A96 | Lauroyl | 2-Methylbutyryl | Linoleoyl | 63.86 |
| 28 | EC-A97 | Decanoyl | Propionyl | Linoleoyl | 52.10 |
| 29 | EC-A98 | Decanoyl | Butyryl | Linoleoyl | 41.27 |
| 30 | EC-A99 | Decanoyl | Valeroyl | Linoleoyl | 49.25 |
| 31 | EC-A100 | Decanoyl | Isobytyryl | Linoleoyl | 63.79 |
| 32 | EC-A101 | Decanoyl | Pivaloyl | Linoleoyl | 58.21 |
| 33 | EC-A102 | Decanoyl | 2-Methylbutyryl | Linoleoyl | 64.92 |
[실험예 1] LPS로 유도된 IL-6 분비 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, 마우스 macrophage 계열의 세포인 RAW264.7 세포를 1x105 cells/㎖ 농도로 배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 배양하던 RAW264.7 세포를 5x104 cells/㎖ 로 48 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 15시간 안정화 시킨 후, 하기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 동안 배양액을 처리하였다. 1시간 후, 세포 자극원으로 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccaride, LPS)를 1㎍/㎖ 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양 상층액 0.5 ㎖을 회수하여 원심분리기(3000 rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 IL-6 수준을 Mouse IL-6 ELISA set (BD Biosciences)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 측정하였다. ELISA 시행 전날 IL-6 capture 항체 (antibody)를 인산 완충 용액(phosphate buffered saline)에 희석하여 microwell에 코팅한 후 4 ℃에서 밤샘(overnight) 보관하였다. 각 well을 완충용액으로 3회 세척한 후, 2% Bovine Serum Albumin (BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 이후 완충용액으로 3회 세척한 다음, 각 well에 100㎕씩 sample을 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후, 워싱 완충용액으로 3회 세척하고, 희석한 검출 항체(Detection antibody)를 각 well에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 실온 방치한 후, 2차 HRP conjugated 항체를 30분간 실온에서 반응시킨 후, 완충용액으로 3회 세척하고 각 Well 당 50㎕ Stop 용액을 처리한 후 ELISA microplate leader 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, IL-6 발현 감소율(IL-6 concentration)을 하기 표 2, 표 3, 도 1 및 도 2에 나타내었다.
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | IL-6 농도 (㎍/㎕, 평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 0.045 ± 0.001 |
| 2 | DMSO | 0 | 0.045 ± 0.004 |
| 3 | LPS | 1 | 0.262 ± 0.008 |
| 4 | EC-18 | 100 | 0.194 ± 0.011 |
| 5 | EC_A13 | 100 | 0.266 ± 0.024 |
| 6 | EC_A14 | 100 | 0.277 ± 0.002 |
| 7 | EC_A15 | 100 | 0.125 ± 0.003 |
| 8 | EC_A16 | 100 | 0.238 ± 0.008 |
| 9 | EC_A17 | 100 | 0.154 ± 0.001 |
| 10 | EC_A18 | 100 | 0.147 ± 0.003 |
| 11 | EC_A19 | 100 | 0.204 ± 0.014 |
| 12 | EC_A20 | 100 | 0.055 ± 0.001 |
| 13 | EC_A21 | 100 | 0.176 ± 0.002 |
| 14 | EC_A22 | 100 | 0.174 ± 0.011 |
| 15 | EC_A57 | 100 | 0.120 ± 0.002 |
| 16 | EC_A70-1 | 100 | 0.144 ± 0.028 |
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | IL-6 농도 (pg/㎕, 평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 0.073 ± 0.001 |
| 2 | DMSO | 0 | 0.071 ± 0.000 |
| 3 | LPS | 1 | 0.738 ± 0.057 |
| 4 | EC-18 | 100 | 0.491 ± 0.063 |
| 5 | EC_A78 | 100 | 0.708 ± 0.086 |
| 6 | EC_A79 | 100 | 0.652 ± 0.145 |
| 7 | EC_A83 | 100 | 0.658 ± 0.070 |
| 8 | EC_A84 | 100 | 0.799 ± 0.025 |
| 9 | EC_A85 | 100 | 0.741 ± 0.071 |
| 10 | EC_A86 | 100 | 0.796 ± 0.045 |
| 11 | EC_A87 | 100 | 0.705 ± 0.158 |
| 12 | EC_A88 | 100 | 0.792 ± 0.086 |
| 13 | EC_A89 | 100 | 0.736 ± 0.097 |
| 14 | EC_A91 | 100 | 0.752 ± 0.068 |
| 15 | EC_A92 | 100 | 0.800 ± 0.038 |
| 16 | EC_A93 | 100 | 0.765 ± 0.055 |
| 17 | EC_A94 | 100 | 0.702 ± 0.079 |
| 18 | EC_A95 | 100 | 0.777 ± 0.020 |
| 19 | EC_A96 | 100 | 0.788 ± 0.006 |
| 20 | EC_A97 | 100 | 0.745 ± 0.015 |
| 21 | EC_A98 | 100 | 0.619 ± 0.036 |
| 22 | EC_A99 | 100 | 0.666 ± 0.075 |
| 23 | EC_A100 | 100 | 0.749 ± 0.054 |
| 24 | EC_A101 | 100 | 0.645 ± 0.057 |
| 25 | EC_A102 | 100 | 0.738 ± 0.070 |
상기 표 2, 표 3, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, RAW264.7 세포에 염증유발인자인 LPS를 처리하면, 음성대조군에 비해 약 6-10배 정도 염증 사이토카인인 IL-6 분비가 증가되는데(실험 번호 3), 이미 염증사이토카인의 발현을 저해하는 물질인 EC-18(1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤, PLAG) 화합물이 첨가되면 LPS 처리군보다 IL-6 발현이 약 30% 정도 감소한다(실험 번호 4). 한편, 본 발명의 화합물 중, A15, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A57, A70-1의 화합물은 RAW264.7 세포에서 30% 내지 80%의 IL-6 사이토카인 분비를 감소시키므로, EC-18(PLAG)와 유사하거나 우수하게 IL-6 발현을 저해하였다.
[실험예 2] IL-6로 유도된 STAT3 활성 감소
HEK-BlueTM IL-6 세포를 이용하여 STAT3 유도 SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase) 발현으로 STAT3 활성을 확인하였다. 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, HEK-BlueTM IL-6 세포를 1x105 cells/㎖ 농도로 배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 배양하던 HEK-BlueTM IL-6 세포를 1x105 cells/well로 접종하고, 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 처리한 후, STAT3 활성을 위하여 IL-6 (5ng/ml)을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양 상층액을 회수하여 원심분리기(3000 rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 SEAP 발현 수준을 Quanti blue reagent와 상층액을 1:10 비율로 섞어 약 30분간 37 ℃에서 방치한 후 분광기(Spectrophotometer)를 이용해 650nm 파장에서 SEAP 농도를 확인하였고, 그 결과(STAT3 활성 저해능)를 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | STAT3 activity_SEAP expression (%) (평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 100 |
| 2 | IL-6 | 5 ng/ml | 228.8 ± 17.0 |
| 3 | EC_18 | 100 | 173.0 ± 7.9 |
| 4 | EC_A13 | 100 | 167.2 ± 8.4 |
| 5 | EC_A14 | 100 | 185.0 ± 30.0 |
| 6 | EC_A15 | 100 | 232.0 ± 50.4 |
| 7 | EC_A16 | 100 | 171.1 ± 17.5 |
| 8 | EC_A17 | 100 | 185.4 ± 19.3 |
| 9 | EC_A18 | 100 | 166.2 ± 29.6 |
| 10 | EC_A19 | 100 | 162.9 ± 33.2 |
| 11 | EC_A20 | 100 | 196.7 ± 35.1 |
| 12 | EC_A21 | 100 | 224.1 ± 22.4 |
| 13 | EC_A22 | 100 | 169.5 ± 10.5 |
| 14 | EC_A57 | 100 | 243.0 ± 29.5 |
| 15 | EC_A70-1 | 100 | 259.5 ± 28.4 |
상기 표 4 및 도 3에 나타난 바와 같이, HEK-BlueTM IL-6 세포에 IL-6 사이토카인을 처리하면 음성대조군에 비해 STAT3 활성이 약 2.3배 증가되는데(실험 2), EC-18 (PLAG) 처리군은 IL-6 사이토카인 처리군에 비해 약 25% 정도 STAT3 활성이 감소되었다(실험 3). 한편, 본 발명의 화합물 중, A13, A16, A17, A18, A18, A22 화합물은 대부분 약 25 % 정도 STAT3 활성을 감소시키므로, EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 STAT3 활성을 감소시킴을 확인하였다.
[실험예 3] IL-6로 유도된 STAT3 활성 감소
STAT3와 결합하는 sis-Inducible Element를 포함하는 pGL4.47 [luc2P/SIE/ Hygro] 벡터를 RAW264.7 세포에 주입하여 STAT3 활성 정도를 확인하였다. 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, RAW264.7 세포를 1x105 cells/㎖ 농도로 배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 배양하던 RAW264.7 세포를 1x105 cells/well로 48 well plate에 접종하여 18시간 안정화시켰다. 이후 sis-Inducible Element를 포함하는 pGL4.47 [luc2P/SIE/Hygro] 벡터를 Attractene과 함께 섞어 실온에서 15분간 복합체 형성을 유도시켰다. 이 복합체를 세포에 처리한 후 18시간 추가 배양하였다. 추가 배양 이후, 각 well에 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 처리한 후, STAT3 활성을 위하여 LPS(1㎍/ml)를 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 18시간 후, 각 well 당 배양 상층액을 제거하고 남아있는 세포를 Cell lysis 버퍼로 용해(lysis)시킨 후 cell lysate를 회수하였다. 회수한 cell lysate 10㎕에 luciferase reagent 90㎕를 섞어 Luminometer를 사용하여 형광 정도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 5 및 도 4에 나타내었다.
| 시료 | 농도(㎍/㎖) | STAT3 activity_Luciferase activity (평균 ± 편차) | |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 405.7 ± 81.6 |
| 2 | DMSO | 372.7 ±25.1 | |
| 3 | LPS | 1 | 879 ± 292.7 |
| 4 | EC-18 | 100 | 491.5 ± 41.7 |
| 5 | EC_A78 | 100 | 912.5 ± 214.2 |
| 6 | EC_A79 | 100 | 1183.5 ± 51.6 |
| 7 | EC_A83 | 100 | 510.2 ± 27.2 |
| 8 | EC_A84 | 100 | 780 ± 27.5 |
| 9 | EC_A85 | 100 | 1126.7 ± 32.1 |
| 10 | EC_A86 | 100 | 866.2 ± 15.2 |
| 11 | EC_A87 | 100 | 1312 ± 34.6 |
| 12 | EC_A88 | 100 | 1171.5 ± 146.3 |
| 13 | EC_A89 | 100 | 1087.7 ± 257.7 |
| 14 | EC_A91 | 100 | 746.5 ± 26.1 |
| 15 | EC_A92 | 100 | 820 ± 448.3 |
| 16 | EC_A93 | 100 | 536.2 ± 222.3 |
| 17 | EC_A94 | 100 | 640 ± 275.7 |
| 18 | EC_A95 | 100 | 663 ± 61.5 |
| 19 | EC_A96 | 100 | 1136.7 ± 63.9 |
| 20 | EC_A97 | 100 | 573.2 ± 146.7 |
| 21 | EC_A98 | 100 | 370.7 ± 35.0 |
| 22 | EC_A99 | 100 | 353.2 ± 83.0 |
| 23 | EC_A100 | 100 | 572.2 ± 60.4 |
| 24 | EC_A101 | 100 | 581.7 ± 8.1 |
| 25 | EC_A102 | 100 | 602 ± 11.3 |
상기 표 5 및 도 4에 나타난 바와 같이, RAW264.7 세포에 LPS를 처리하면 음성대조군에 비해 STAT3 활성이 약 2.2배 증가되는데(실험 3), EC-18 (PLAG) 처리군은 음성대조군과 거의 유사할 정도로 STAT3 활성이 감소되었다. 한편, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물 중, A83, A93, A97, A98, A99, A100, A101, A102 화합물은 대부분 음성대조군 및 EC-18(PLAG)과 유사하게 STAT3 활성이 감소됨을 확인하였다.
[실험예 4] THP-1 세포에서의 CXCL8 (IL-8) 발현 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, 인간 macrophage 계열의 세포인 THP-1 세포를 1x105 cells/㎖ 의 농도로 배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 배양하던 THP-1 세포를 1x106 cells/㎖로 12 well plate에 접종하여 30분간 안정화시킨 후, 하기 표 6에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 상기 배양액을 처리하였다. 1시간 후, 세포 자극원으로 Gemcitabine (2㎍/㎖)을 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양 상층액 1.5㎖을 회수하여 원심분리기(3000rpm , 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 CXCL8 (IL-8) 수준을 human IL-8 ELISA set (BD Biosciences)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 측정하였다. ELISA 시행 전날 IL-8 capture 항체 (antibody)를 인산완충용액(phosphate buffered saline)에 희석하여 micro well에 코팅한 후 4 ℃에서 밤샘 보관하였다. 각 well을 3회 완충용액으로 세척한 후에 2% Bovine Serum Albumin (BSA)으로 1시간동안 실온에서 blocking 하였다. 이후 완충용액으로 3회 세척한 다음, 각 well에 100㎕씩 sample을 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후, 완충용액으로 3회 세척하고 희석한 Detection antibody를 각 well 에 분주하고 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 1시간 실온 방치한 후, 2차 HRP conjugated 항체를 30분간 실온에서 반응시킨 후, 완충용액으로 3회 세척하고 각 Well 당 50㎕ Stop 용액을 처리한 후 ELISA microplate leader 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 CXCL8 (IL-8) 발현 증가율을 하기 표 6 및 도 5에 나타내었다.
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | CXCL8 [IL-8] concentration (pg/㎕, 평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 7.9 ± 0.0 |
| 2 | Gemcitabine | 2 | 104.6 ± 1.5 |
| 3 | EC_18 | 100 | 79.6 ± 6.0 |
| 4 | EC_A13 | 100 | 96.6 ± 0.2 |
| 5 | EC_A15 | 100 | 73.8 ± 0.0 |
| 6 | EC_A16 | 100 | 135.1 ± 2.3 |
| 7 | EC_A17 | 100 | 110 ± 0.2 |
| 8 | EC_A18 | 100 | 84.0 ± 1.8 |
| 9 | EC_A19 | 100 | 277.9 ± 3.1 |
| 10 | EC_A21 | 100 | 86.2 ± 0.7 |
| 11 | EC_A22 | 100 | 105.3 ± 3.6 |
| 12 | EC_A43 | 100 | 100.7 ± 0.7 |
| 13 | EC_A70-1 | 100 | 200.1 ± 1.0 |
| 14 | EC_A78 | 100 | 108.5 ± 4.9 |
| 15 | EC_A79 | 100 | 108.7 ± 8.3 |
| 16 | EC_A83 | 100 | 107.7 ± 3.9 |
| 17 | EC_A84 | 100 | 110.5 ± 6.8 |
| 18 | EC_A85 | 100 | 94.4 ± 3.4 |
| 19 | EC_A86 | 100 | 99.2 ± 4.9 |
| 20 | EC_A87 | 100 | 134.4 ± 10.7 |
| 21 | EC_A88 | 100 | 91.4 ± 3.4 |
| 22 | EC_A89 | 100 | 123.1 ± 0.0 |
| 23 | EC_A91 | 100 | 96.1 ±3.6 |
| 24 | EC_A92 | 100 | 105.1 ± 0.2 |
| 25 | EC_A93 | 100 | 110.9 ± 0.0 |
| 26 | EC_A96 | 100 | 103.7 ± 5.4 |
| 27 | EC_A97 | 100 | 96.2 ±0.2 |
| 28 | EC_A98 | 100 | 105 ± 2.0 |
| 29 | EC_A99 | 100 | 102.0 ± 19.3 |
| 30 | EC_A100 | 100 | 115.1 ± 3.9 |
| 31 | EC_A101 | 100 | 118.1 ± 2.8 |
| 32 | EC_A102 | 100 | 102.5 ± 4.4 |
상기 표 6 및 도 5에 나타난 바와 같이, THP-1 세포에 항암제의 일종인 Gemcitabine을 처리하면 음성대조군에 비해 약 13배 정도 호중구 세포 모집인자인 CXCL8(IL-8) 케모카인의 분비를 증가시키는데(실험 2), EC-18 (PLAG)을 처리하면 약 20% 정도 CXCL8 발현을 감소시킨다(실험 3). 한편, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물 중, A15, A18, A21 화합물은 EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 CXCL8(IL-8) 케모카인의 분비를 20% 정도 감소시켰다.
[실험예 5] HL-60 세포주의 이동 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI (Hyclone, Thermo Scientific)배지에, 인간 macrophage 계열의 세포인 THP-1 세포를 1x105 cells/㎖ 의 농도로 계대배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. Transmigration assay 시 하부 well에 처리할 THP-1 세포 배양액을 준비하기 위하여, 우선 배양하던 THP-1세포를 1x106 cells/㎖ 로 12 well plate에 접종하여 30분간 안정화시킨 후, 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 처리하였다. 1시간 후, 세포 자극원으로 Gemcitabine (2㎍/㎖)을 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양 상층액 1.5㎖을 회수하여 원심분리기(3000rpm , 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 Cultrex 96 well Laminin Cell Invasion assay에서 제공하는 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. 본 실험인 Transmigration assay를 수행하기 하루 전날 상부의 Invasion Chamber에 1 x Lamin I 용액을 처리하여 코팅하였다. 24시간 후, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI1640 배지에 배양한 HL-60 세포를 5x104 cells/chamber로 분주하고, 하부 챔버(chamber)에는 미리 준비한 THP-1 배양 상층액을 150㎕ 씩 넣어 주었다. 24시간 동안 배양한 후, 상부 챔버를 제거하고 원심분리기로 세포를 하부 챔버 바닥에 부착하고 상층액은 제거하였다. Cell dissociation/Calcein-AM 용액을 넣어서 1 시간 반응시킨 후 형광 분광기를 이용하여 나온 값을 세포수로 환산하여 계산하였다. HL-60 세포의 이동 감소 결과는 하기 표 7 및 도 6에 나타내었다.
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | Transwell을 통하여 이동한 HL-60 세포수 (Cell Number) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 2582.6 |
| 2 | Gemcitabine | 2 | 5022.9 |
| 3 | EC_18 | 100 | 2697.2 |
| 4 | EC_A13 | 100 | 8679.7 |
| 5 | EC_A15 | 100 | 28884.8 |
| 6 | EC_A16 | 100 | 26348.9 |
| 7 | EC_A17 | 100 | 30692.8 |
| 8 | EC_A18 | 100 | 9891.6 |
| 9 | EC_A19 | 100 | 14882.8 |
| 10 | EC_A21 | 100 | 1986.3 |
| 11 | EC_A22 | 100 | 1181.1 |
| 12 | EC_A43 | 100 | 6189.2 |
| 13 | EC_A70-1 | 100 | 4047.1 |
| 14 | EC_A78 | 100 | 23396.6 |
| 15 | EC_A79 | 100 | 12527.5 |
| 16 | EC_A83 | 100 | 7316.6 |
| 17 | EC_A84 | 100 | 2197.8 |
| 18 | EC_A85 | 100 | 7687.7 |
| 19 | EC_A86 | 100 | 18542.0 |
| 21 | EC_A87 | 100 | 7198.0 |
| 22 | EC_A88 | 100 | 17552.5 |
| 23 | EC_A89 | 100 | 6969.9 |
| 24 | EC_A91 | 100 | 9429.8 |
| 25 | EC_A92 | 100 | 2891.6 |
| 26 | EC_A93 | 100 | 6828.6 |
| 27 | EC_A96 | 100 | 15110.8 |
| 28 | EC_A97 | 100 | 7440.6 |
| 29 | EC_A98 | 100 | 11056.8 |
| 30 | EC_A99 | 100 | 7164.9 |
| 31 | EC_A100 | 100 | 8947.2 |
| 32 | EC_A101 | 100 | 4848.9 |
| 33 | EC_A102 | 100 | 8091.5 |
상기 표 7 및 도 6에서 나타난 바와 같이, THP-1 세포에 항암제의 일종인 Gemcitabine을 처리하면 음성대조군에 비해 약 2배 정도 호중구 세포이동이 증가하였고(실험 2), EC-18(PLAG)을 처리하면 음성대조군과 유사하게 HL-60 세포의 이동이 감소하였다(실험 3). 한편, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물 중, A21, A22, A84, A92 화합물은 EC-18(PLAG)과 유사하거나 더 많이 세포이동을 감소시켰으며, 특히, A22 화합물은 EC-18보다 2배 정도 더 세포이동을 감소시킴을 확인하였다.
[실험예 6] 박테리아균 폐감염 동물 모델의 감염 억제 시험
박테리아 균 폐감염 생쥐 모델은 12 주령 Balb/c 수컷 생쥐를 Koatech Corporation (South Korea)에서 구입하여, 적당한 온도 및 빛 사이클 하의 특정 병원체 부재 시설에서 유지하였다. 폐감염을 유도하기 위한 박테리아균은 슈도모나스(Psuedomonas)속인 아에루기노사(aeruginosa) K (PAK)를 LB 브로스 또는 LB 아가 플레이트에 37 ℃로 밤새 배양한 후, 배양액을 2 분 동안 13,000 x g에서 원심분리하여 박테리아 펠렛을 수득하였다. 그 후, 박테리아 펠렛을 PBS (phosphate buffered saline)에 현탁하고, 계열 희석액의 광학 밀도를 측정하여 아가(agar) 플레이트에 플레이팅함으로써 일정 집락형성단위 (colony forming unit; CFU)를 갖는 박테리아 접종액을 얻었다. 20 ㎕당 1x105 CFU 농도의 감염용 박테리아 접종액을 준비하고, 준비한 PAK 박테리아 접종액 (20 ㎕ PBS 내에 마우스 당 1 x 105 CFU)을 총 8마리의 12주령 Balb/c 마우스에 비강 주사로 투여하였다. PAK 투여군 중 4마리에는 본 발명의 화합물(EC_A21)을 250 mg/kg으로 경구투여하였고 대조군에는 PBS를 투여하였다.
4시간 경과한 후, P. 아에루기노사 감염 마우스의 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 샘플을 수집한 후, 수집한 BALF 샘플을 PBS로 1:1000 으로 희석하고, 희석된 샘플을 LB 아가 상에 플레이팅한 후, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트 계수법 (plate count method)으로 생존한 박테리아의 수를 측정하여 BALF 내 CFU 수준을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 8, 도 7 및 도 8에 나타내었다.
| 실험 No. | 음성대조군 | PAK 감염군 (103 CFU/㎖) | PAK + 글리세롤 유도체 A21 처리군 (103 CFU/㎖) |
| 1 | 0 | 112.0 | 19.0 |
| 2 | 0 | 246.0 | 20.0 |
| 3 | 0 | 220.0 | 14.0 |
| 4 | 0 | 60.0 | 8.0 |
| 평균 ± 편차 | 0 | 160.0 ± 88.0 | 14.0 ± 6.0 |
상기 표 8, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, PAK 투여 4 시간 째에 페포세척액(BALF) 내 박테리아 CFU가 급격히 상승하였다. 반면, 본 발명의 글리세롤 유도체 중, 호중구 이동을 많이 감소시킨 A21 유도체와 PAK를 함께 투여하면, 4시간째에 페포 세척액 내 박테리아 CFU가 PAK 단독 투여군보다 현저히 낮았다. 상기 결과는 PAK 감염된 마우스에서 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물이 감염 초기에 박테리아 제거를 촉진시킴을 보여준다.
[실험예 7] IL-4로 유도된 STAT6 활성 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, A549 세포를 1x105 cells/㎖ 농도로 계대배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 배양하던 A549 세포를 1x105 cells/well로 48 well plate에 접종하여 18시간 안정화시켰다. 이후 STAT6 결합 promoter 부분을 포함하는 pGL4-STAT6 reporter 벡터를 Attractene과 함께 섞어 실온에서 15분간 복합체 형성을 유도시켰다. 이 복합체를 세포에 처리한 후 24시간 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 각 well에 하기 표 9 및 10에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 처리한 후, STAT6 활성을 위하여 IL-4 (2 ng/ml 또는 10 ng/ml)을 20시간 동안 추가로 배양하였다. 20시간 후에 각 well 당 배양 상층액을 제거하고 남아있는 세포를 Cell lysis 버퍼로 용해(lysis)시킨 후, cell lysate를 회수하였다. 회수한 cell lysate 10㎕에 luciferase reagent 90㎕를 섞어 Luminometer를 사용하여 형광 정도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 9, 표 10, 도 9 및 도 10에 나타내었다.
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | STAT6 activity_Luciferase activity (평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 8.5 ± 1.2 |
| 2 | IL-4 | 2 | 982.0 ± 38.7 |
| 3 | EC_18 | 100 | 462.5 ± 161.7 |
| 4 | EC_A13 | 100 | 1150.2 ± 44.9 |
| 5 | EC_A14 | 100 | 539.2 ± 40.3 |
| 6 | EC_A15 | 100 | 707.5 ± 51.3 |
| 7 | EC_A16 | 100 | 964.5 ± 170.3 |
| 8 | EC_A17 | 100 | 476.2 ± 113.4 |
| 9 | EC_A18 | 100 | 1189.2 ± 174.7 |
| 10 | EC_A19 | 100 | 898.7 ± 115.9 |
| 11 | EC_A20 | 100 | 609.5 ± 197.0 |
| 12 | EC_A21 | 100 | 880.0 ± 50.0 |
| 13 | EC_A22 | 100 | 645.5 ± 111.4 |
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | STAT6 activity_Luciferase activity (평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 11.5 ± 6.8 |
| 2 | IL-4 | 10 | 22846.2 ± 2157.3 |
| 3 | EC_18 | 100 | 18878.0 ± 500.8 |
| 4 | EC_A78 | 100 | 19208.7 ± 2129.6 |
| 5 | EC_A79 | 100 | 20037.7 ± 786.0 |
| 6 | EC_A83 | 100 | 18788.2 ± 2805.4 |
| 7 | EC_A85 | 100 | 19878.2 ± 4338.5 |
| 8 | EC_A86 | 100 | 18158.0 ± 3182.4 |
| 9 | EC_A87 | 100 | 17258.7 ± 3007.1 |
| 10 | EC_A88 | 100 | 17409.5 ± 1849.8 |
| 11 | EC_A89 | 100 | 18635.5 ± 846.4 |
| 12 | EC_A91 | 100 | 22036.0 ± 4089.4 |
| 13 | EC_A92 | 100 | 17237.2 ± 317.7 |
| 14 | EC_A93 | 100 | 15562.5 ± 900.7 |
| 15 | EC_A94 | 100 | 14677.5 ± 2168.7 |
| 16 | EC_A95 | 100 | 13649.0 ± 7369.3 |
| 17 | EC_A96 | 100 | 14593.2 ±2168.7 |
| 18 | EC_A97 | 100 | 16787.0 ± 4102.6 |
| 19 | EC_A98 | 100 | 14727.2 ± 129.2 |
| 20 | EC_A99 | 100 | 17407.0 ±1347.6 |
| 21 | EC_A100 | 100 | 14212.0 ± 1008.8 |
| 22 | EC_A101 | 100 | 19438.7 ± 580.2 |
| 23 | EC_A102 | 100 | 18719.2 ± 2558.5 |
상기 표 9, 표 10, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, A549 세포에 IL-4를 처리하면 음성대조군에 비해 STAT6 활성이 IL-4 처리량에 따라 약 120배에서 2000배까지 증가되는데(실험 2), EC-18 (PLAG)을 처리하면 약 20% 내지 50% 까지 STAT6 활성이 감소된다(실험 3). 한편, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물 중, A14, A15, A17, A20, A21, A22, A78, A79, A83, A85, A86, A87, A88, A89, A92, A93, A94, A95, A96, A97, A98, A99, A100, A101, A102 화합물은 EC-18 처리군과 유사하게 STAT6 활성을 감소시킴을 확인하였다.
[실험예 8] PKC activator로 유도된 IL-4 분비 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, 마우스 lymphoma 계열의 세포인 EL-4 세포를 1x105 cells/㎖ 농도로 계대배양하고, 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 배양하던 EL-4 세포를 5x104 cells/㎖ 로 48 well plate에 접종하여 30분간 안정화시킨 후, 하기 표 11 및 표 12에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 2시간 배양액을 처리하였다. 2시간 후, 세포 자극원으로 PKC activator (p10, PMA 일종) 0.5 ㎍/㎖을 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 18시간 후에 각 well 당 배양 상층액 0.5 ㎖을 회수하여 원심분리기(3000 rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 IL-4 수준을 Mouse IL-4 ELISA set (BD Biosciences)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 측정하였다. ELISA 시행 전날 IL-4 capture 항체 (antibody)를 인산 완충 용액(phosphate buffered saline)에 희석하여 microwell에 코팅한 후 4 ℃에서 밤샘 보관하였다. 각 well을 완충용액으로 3회 세척한 후에 2% Bovine Serum Albumin (BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 이후 완충용액으로 3회 세척한 다음, 각 well에 100㎕씩 sample을 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후, 완충용액으로 3회 세척하고 희석한 Detection antibody를 각 웰(well)에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 실온 방치한 후, 2차 HRP conjugated 항체를 30분간 실온에서 반응시킨 후, 완충용액으로 3회 세척하고 각 Well 당 50㎕ Stop 용액을 처리한 후 ELISA microplate leader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 발현 감소율 결과를 하기 표 11, 표 12, 도 11 및 도 12에 나타내었다.
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | IL-4 concentration (pg/㎕, 평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | 1.5 ± 1.2 |
| 2 | PKC activator | 1 | 910.6 ± 25.7 |
| 3 | EC-18 | 100 | 662.4 ± 42.4 |
| 4 | EC_A20 | 100 | 194.2 ± 47.5 |
| 5 | EC_A21 | 100 | 488.8 ± 46.2 |
| 6 | EC_A57 | 100 | 745.6 ± 8.35 |
| 7 | EC_A70-1 | 100 | 865.6 ± 127.9 |
| 실험 | 시료 | 농도(㎍/㎖) | IL-4 concentration(pg/㎕, 평균 ± 편차) |
| 1 | 음성대조군 | 0 | -12.5 ± 3.2 |
| 2 | PKC activator | 1 | 628.8 ± 0.0 |
| 3 | EC-18 | 100 | 429.2 ± 7.0 |
| 4 | EC_A78 | 100 | 557 ± 11.5 |
| 5 | EC_A79 | 100 | 527 ± 17.9 |
| 7 | EC_A83 | 100 | 637.9 ± 14.1 |
| 8 | EC_A84 | 100 | 615.6 ± 25.0 |
| 9 | EC_A85 | 100 | 485.1 ± 19.2 |
| 10 | EC_A86 | 100 | 476.0 ± 2.5 |
| 11 | EC_A87 | 100 | 511.0 ± 0.6 |
| 12 | EC_A88 | 100 | 654.7 ± 0.6 |
| 13 | EC_A89 | 100 | 620.1 ± 22.4 |
| 14 | EC_A91 | 100 | 446.0 ± 16.7 |
| 15 | EC_A92 | 100 | 498.3 ±45.6 |
| 16 | EC_A93 | 100 | 507.9 ± 3.85 |
| 17 | EC_A94 | 100 | 523.8 ± 62.3 |
| 18 | EC_A95 | 100 | 680.1 ± 12.2 |
| 19 | EC_A96 | 100 | 582.9 ± 17.3 |
| 20 | EC_A97 | 100 | 541.5 ± 20.5 |
| 21 | EC_A98 | 100 | 584.2 ± 50.1 |
| 22 | EC_A99 | 100 | 553.3 ± 39.8 |
| 23 | EC_A100 | 100 | 539.7 ± 6.4 |
| 24 | EC_A101 | 100 | 634.7 ± 3.21 |
| 25 | EC_A102 | 100 | 775.1 ± 11.5 |
상기 표 11, 표 12, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 마우스 EL-4 세포에 PKC activator를 처리하면 음성대조군에 비해 급격하게 IL-4 사이토카인의 분비가 증가되는데(실험 2), EC-18(PLAG)을 처리하면 약 20% 내지 60% 정도 IL-4 발현을 감소시킨다(실험 3). 한편, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물 중, A85, A86, A87, A91, A92, A93 화합물은 EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 IL-4 케모카인의 분비를 약 20 %까지 감소시켰다. 특히, A20 및 A21 화합물은 EC-18 보다도 훨씬 강하게 최대 80% 까지 IL-4 발현을 감소시킴을 확인하였다.
Claims (11)
- 하기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물.[화학식 2]
상기 화학식 2에서, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이고, R3는 탄소수 4 내지 18의 지방산기이며, R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기,(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기),
또는
이고,
는 결합부를 나타낸다.
- 제1항에 있어서, R1은 옥타노일(octanoyl), 라우로일(lauroyl), 데카노일(Decanoyl) 또는 팔미토일(Palmitoyl)이며, R3은 부티릴(butyryl), 2-메틸부티릴(2-Methylbutyryl), 피발로일(Pivaloyl), 또는 리놀레오일(Linoleoyl)이며, R2는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 이소프로필기인 것인, 1,2-디아실글리세롤 화합물.
- 제1항에 있어서, R2는(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족, 또는 방향족 탄화수소기),
또는
인 것인, 1,2-디아실글리세롤 화합물.
- 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 글리시딜 클로라이드와 지방산(R1-OH, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이다)을 반응시켜, 화합물 A를 얻는 단계,[반응식 1];
하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 화합물 A와 R2-OH (R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기,(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기),
또는
이고,
는 결합부를 나타낸다)를 반응시켜, 화합물 B를 얻는 단계,
[반응식 2]; 및
하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 B와 지방산(R3-OH, R3은 탄소수 4 내지 18의 지방산기이다)을 반응시키는 단계,[반응식 3];
를 포함하는 1,2-디아실글리세롤 화합물의 제조 방법. - 하기 반응식 4에 나타낸 바와 같이, 솔케탈과 지방산(R1-OH, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이다)을 반응시켜, 화합물 C를 얻고, 화합물 C를 가수분해 반응시켜, 화합물 D를 얻는 단계,[반응식 4];
하기 반응식 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 D와 R2-OH (R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기,(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기),
또는
이고,
는 결합부를 나타낸다)를 반응시켜, 화합물 B를 얻는 단계,
[반응식 5];
하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 B와 지방산(R3-OH, R3은 탄소수 4 내지 18의 지방산기이다)을 반응시키는 단계,[반응식 3];
를 포함하는 1,2-디아실글리세롤 화합물의 제조 방법. - 하기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절제.[화학식 2]
상기 화학식 2에서, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이고, R3은 탄소수 4 내지 18의 지방산기이며, R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기,(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기),
또는
이고,
는 결합부를 나타낸다.
- 제6항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세롤 화합물은 IL-4, IL-6 및 CXCL8 (IL-8)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 사이토카인의 과발현을 억제하는 것인, 면역조절제.
- 제6항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세롤 화합물은 박테리아 또는 바이러스 감염 질환, 급ㅇ만성 염증 폐질환, 폐렴, 자가면역질환, 알러지 질환 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환을 예방 또는 치료하는 것인, 면역조절제.
- 제6항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세롤 화합물의 함량은 0.0001 내지 100.0 중량%인 것인 면역조절제.
- 하기 화학식 2로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 건강기능식품 조성물.[화학식 2]
상기 화학식 2에서, R1은 탄소수 8 내지 18의 지방산기이고, R3은 탄소수 4 내지 18의 지방산기이며, R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬기,(R4는 탄소수 2 내지 8의 지방족 또는 방향족 탄화수소기),
또는
이고,
는 결합부를 나타낸다.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 면역조절제를 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절 방법.
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