WO2018048007A1 - 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2018048007A1
WO2018048007A1 PCT/KR2016/010759 KR2016010759W WO2018048007A1 WO 2018048007 A1 WO2018048007 A1 WO 2018048007A1 KR 2016010759 W KR2016010759 W KR 2016010759W WO 2018048007 A1 WO2018048007 A1 WO 2018048007A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
bone
pharmaceutically acceptable
composition
acceptable salt
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/010759
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조창수
Original Assignee
농업회사법인 휴림황칠(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 농업회사법인 휴림황칠(주) filed Critical 농업회사법인 휴림황칠(주)
Publication of WO2018048007A1 publication Critical patent/WO2018048007A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
    • C07C69/12—Acetic acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/37—Esters of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
    • C07C69/12—Acetic acid esters
    • C07C69/14—Acetic acid esters of monohydroxylic compounds
    • C07C69/145—Acetic acid esters of monohydroxylic compounds of unsaturated alcohols
    • C07C69/15—Vinyl acetate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention

Definitions

  • the present invention is a novel dinoic acid methyl ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a method for preparing the compound, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone diseases, including the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, bone
  • the present invention relates to a method for treating bone diseases in animals other than humans, the method comprising administering to the quasi-drug composition, nutraceutical composition, cosmetic composition, and the suspected bone disease subject for prevention or improvement of the disease.
  • Bone remodeling occurs continually in life to maintain bone in response to mechanical stress and hormonal regulation. To maintain normal bone mass, bone is reabsorbed by osteoclasts and new bone matrix is accumulated by osteoblasts through a closely coupled process. As seen in many common bone diseases, imbalances in this process can lead to excessive bone resorption by osteoclasts and increased bone fragility.
  • Osteoclasts are known to differentiate from hematopoietic progenitors or myeloid progenitors by hormones secreted from T-cells, fibroblasts, osteoblasts, and the like.
  • signal transduction by RANKL plays an important role.
  • RANKL is produced in osteoblasts, activated T cells and stromal cells, and activates osteoclast morphology, survival and bone resorption with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • TRAF6 TRAF6
  • NF- ⁇ B and JNK c-Jun N-terminal kinase
  • p38 p38 MAP kinase
  • mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways including extracellular signal-regulated kinase (ERK)
  • Activated NF- ⁇ B induces the expression of c-Fos and NFATc1 downstream, which are known to play a key role in osteoclast differentiation by RANKL.
  • the osteoclast differentiation process is known to be promoted by inflammatory cytokines such as IL-1, Il-3, PGE.
  • differentiated osteoclasts have the form of multi-nulceated cells and bind to the site where bones are absorbed to form sealing zones using actin and vinculin. Sealed with the surroundings. Later, by pumping hydrogen ions, the pH is lowered to dissolve the hydroxyapatite component and secrete proteolytic enzymes such as MMP-9 or Kadipsin K to break down the collagen component, which accounts for about 10% of bone.
  • the differentiated osteoclasts are known to specifically express phosphatase (tartrate-resistant acid phosphatase: TRAP), which is active in the presence of tartaric acid.
  • TRAP phosphatase
  • osteoclast differentiation can be confirmed by measuring the activity of TRAP.
  • osteoclasts play an important role in bone metabolism in vivo, but when excessively differentiated by various causes, it may cause disorders or destroy diseases of bone tissues. Growth stage development, fractures, osteoporosis due to bone resorption of excessive osteoclasts, rheumatoid arthritis, periodontal disease, Paget disease, metastatic bone cancers Etc. can be mentioned.
  • the therapeutic agents for this include largely bone resorption inhibitors and stimulating bone formation.
  • a bone disease treatment agent such as a bone resorption inhibitor or a bone stimulating agent should be less toxic because it should be administered to patients for a long time, and it is preferable that oral administration is possible to solve the hassle of administration. It is true.
  • bone stimulating agents that promote bone formation by activating osteoblasts among the bone disease treatments is being actively conducted, but bone mineralization by bone stimulating agents does not necessarily mean reduction of fractures.
  • osteoclasts that inhibit the activity of osteoclasts currently used include Denosumab (Denosumab; Prolia TM, Amgen ® ), and various other drugs have been developed.
  • Denosumab Desnosumab
  • Prolia TM Prolia TM
  • Amgen ® various other drugs have been developed.
  • Adverse events have not been fully validated, and the exact mechanisms of osteoclasts are still unknown.
  • administering a pharmaceutical composition, quasi-drug composition, nutraceutical composition, cosmetic composition and the pharmaceutical composition that can be usefully used for the prevention, treatment or improvement of bone disease through the new compound to the suspected bone disease
  • a pharmaceutical composition, quasi-drug composition, nutraceutical composition, cosmetic composition and the pharmaceutical composition that can be usefully used for the prevention, treatment or improvement of bone disease through the new compound to the suspected bone disease
  • the present invention for solving the above problems is 16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-dinoic acid methyl ester (16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid methyl ester) compound Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound is preferably represented by the following formula (10).
  • the compound according to the present invention is (9Z, 16S) -16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-dinoic acid methyl ester ((9Z, 16S) -16-acetyl-9,17-octadecadiene -12,14-diynoic acid methyl ester).
  • the present inventors have completed the present invention after confirming that the compound of Formula 10 is excellent in inhibiting osteoclast differentiation even at a significantly smaller concentration than other natural extracts known to be effective for bone diseases or other compounds isolated therefrom. It was. That is, the compound of Chemical Formula 10 was confirmed to have about 10 times better effect than other compounds isolated from the Hwangchil extract (Compound 1 below, see FIG. 3) (FIG. 10).
  • the compound of Chemical Formula 10 is 16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-dinoic acid (16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid, according to the following scheme) ) Can be obtained by methylation.
  • the 16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-dinoic acid was isolated from the extract by the present inventors, and methylated to obtain the compound of formula 10 according to the present invention. That is, the compound of Formula 1 is contained in the yellow lacquer or its extract, but the compound of the formula (10) is not contained in the yellow lacquer or its extract is completely new.
  • the present inventors have obtained from the compound of Formula 1, wherein the compound of Formula 10 has been separated from the yellow lacquer, but the present invention is not limited thereto.
  • the compound of Formula 10 may be prepared by a chemical synthesis method, or may be obtained from an artificially synthesized compound of Formula 1.
  • acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid may be useful.
  • Organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, and hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and citric acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, metalsulfonic acid may be used as the organic acid.
  • Acetic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, citric acid, aspartic acid, and the like can be used.
  • the addition salt according to the present invention is a conventional method, i.e., a compound of formula 10 is dissolved in a water miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile, and an equivalent or excess organic acid is added or an acid aqueous solution of an inorganic acid is added. It can be prepared by addition, followed by precipitation or crystallization, or by evaporation of the solvent or excess acid followed by suction filtration of the dried or precipitated salt.
  • a water miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile
  • the present invention may include all of the compounds of Formula 10 and their pharmaceutically acceptable salts as well as possible solvates, hydrates and stereoisomers that may be prepared therefrom within the scope of the invention.
  • the present invention provides a method for producing a yellow lacquer extract, comprising: (a) extracting a yellow lacquer with an extractant, filtration and concentrating to obtain a yellow lacquer extract; (b) fractionating the hwangchil extract of (a) with an organic solvent and performing column chromatography to obtain a fraction; And (c) separating the compound by performing high performance liquid chromatography from the fraction of (b); And (d) methylating the compound of (c).
  • the step (a) is a step of extracting the yellow lacquer with an extraction solvent, filtration and concentration to obtain a yellow lacquer extract.
  • the term "hwangchil” is a dicotyledonous plant that grows in the southern coastal region of Korea and Jeju Island, etc., an evergreen arborescent tree of the family Elmaceae (Dendropanax morbifera) is a tree that does not have deciduous leaves even in winter, and yellow leaves
  • the resin solution comes out is called Hwangchil.
  • Physiological activities such as anticancer activity and antioxidant activity of Hwangchil-tree extract have been reported to some extent, and have been used in foods such as food additives and health functional supplements (Kim HR, et al .. Chemical characteristics of the leaves and the seeds Vietnamese dendropanax (. dendropanax morvifera Lev) J.
  • the hwangchil can be used without limitation, such as cultivated or commercially available, can be used both above ground, root, seed.
  • the extraction solvent may use an extraction solvent commonly used in the art, but is not limited thereto, and preferably water, alcohols having 1 to 6 carbon atoms, or a mixed solvent thereof may be used.
  • the alcohol may be ethanol, methanol or butanol.
  • the extraction solvent is not limited thereto, but may preferably be added 2 to 20 times the amount of water loss, more preferably 4 to 10 times, and even more preferably 5 times.
  • the extraction method is not limited thereto, but preferably, hot water extraction, hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, or ultrasonic extraction may be used, and more preferably, hot water extraction or cold needle extraction may be used. .
  • the temperature of the extraction solvent at the time of extraction is not limited thereto, but may be preferably 20 to 100 ° C, more preferably room temperature.
  • Extraction time is not limited thereto, but may preferably be 12 hours to 10 days, more preferably 5 to 8 days, even more preferably 7 days.
  • Extraction frequency is not limited thereto, but may be preferably 1 to 5 times, more preferably 3 times.
  • step (b) is a step of obtaining the fraction by fractionating the yellow lacquer extract of (a) with an organic solvent and performing column chromatography.
  • the organic solvent is a liquid organic compound that can dissolve solids, gases, and liquids, and organic solvents commonly used in the art may be used, and preferably methanol, chloroform, acetate, hexane, dichloromethane, acetone, acetonitrile , Benzene or a mixed solvent thereof can be used.
  • the column chromatography is a chromatographic method in which the stationary phase granules are filled into columnar columns in a chromatographic tube, and can be carried out several times by selecting an appropriate filler as necessary.
  • the filler is silica gel, Sephadex, RP. -18, polyamide, toyopearl or XAD resin can be used to isolate and purify.
  • step (c) is a step of separating the compound by performing high performance liquid chromatography from the fraction of (b).
  • the high performance liquid chromatography is a chromatographic method that enables high-speed and high-performance separation by improving and improving a column, a fixed bed filler filled in a column, and an apparatus.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 may be prepared. Can be.
  • step (d) is a step of methylating the (c) sulfide.
  • Methods and conditions for methylation are not particularly limited and may include all methods known in the art.
  • the compound of Formula 1 may be reacted with diazomethane and MeOH at 0 ° C. to obtain 16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-dinoic acid methyl ester (Formula 10).
  • the compound of Formula 10 according to the present invention can be obtained, and the compound of Formula 10 has a remarkably excellent osteoclast differentiation inhibitory effect, and the above method prepares the compound of Formula 10 according to the present invention.
  • Useful methods are as follows.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone diseases comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized by comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound according to the present invention is excellent in inhibiting osteoclast differentiation even at a significantly smaller concentration than other extracts or compounds known to be effective in bone diseases, and thus can be usefully used for the prevention, treatment or improvement of bone diseases. It works.
  • bone disease refers to a condition or disease caused by excessive production and / or migration of osteoclasts, and includes bone loss diseases.
  • the bone loss lowering disease refers to a condition or a disease in which a decrease in bone mass accompanied by symptoms such as a decrease in bone density and deterioration of bone tissues, and bone loss caused by osteoclasts activated by cancer cells may be included in the scope of the present invention. have.
  • the bone disease is not limited to this, but the growth stage of development, fracture, osteoporosis (osteoprosis) due to excessive absorption of osteoclasts, rheumatoid arthritis, periodontal disease (periodontal disease), Paget disease (Paget disease) And it may be one or more diseases selected from the group consisting of metastatic bone cancers.
  • the composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of osteoporosis or osteopenia.
  • osteoporosis used in the present invention refers to a state in which bone fracture may occur due to a decrease in bone mass and qualitative changes
  • osteoporosis refers to an early symptom of osteoporosis. Generally, it is classified as osteopenia in case of -1.0 to -2.5 and osteoporosis in case of -2.5 or more based on bone density (T).
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the development of bone disease by administration of the composition
  • treatment refers to any action that improves or benefits the symptoms of bone disease by administration of the composition. it means.
  • compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. which are commonly used. Solid preparations for oral administration may include tablet pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose ( lactose), gelatin and the like can be mixed.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solution solutions, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories It can have any one formulation selected from.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in its dosage, and may vary according to body absorption, weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, and severity of disease. have.
  • the daily dose may preferably be from 0.1 to 100 mg / kg, more preferably from 30 to 80 mg / kg, even more preferably from 50 to 60 mg, based on the amount of the hwangchil extract / kg.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in consideration of the effective amount range, and the unit dosage form formulated in this way may be formulated using a specialized dosage method according to the judgment of a professional who monitors or observes the administration of the drug as required and the needs of the individual. It can be used or administered several times at regular time intervals.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for the prevention or improvement of bone diseases comprising the compound.
  • the compound is as described above, and may include a pharmaceutically acceptable salt thereof. More specifically, the composition of the present invention can be added to the quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving bone diseases.
  • the term "quasi drug” refers to a fiber, a rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a human or animal, has a weak action on the human body or does not directly act on the human body, Or non-machinery and the like, or any of the agents used for sterilization, insecticide and similar purposes for the purpose of preventing infection, for the purpose of diagnosing, treating, reducing, treating or preventing human or animal diseases.
  • Means the goods used are not instruments, machines or devices, and the items used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of humans or animals except those which are not devices, machines or devices.
  • composition of the present invention when used as an quasi-drug additive, the composition may be added as it is or used with other quasi-drugs or quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use.
  • the quasi-drug composition of the present invention is not limited thereto, but may preferably be a disinfectant cleaner, a shower foam, a gagreen, a wet tissue, a detergent soap, a hand wash, a humidifier filler, a mask, an ointment, or a filter filler.
  • the present invention provides a nutraceutical composition for the prevention or improvement of bone diseases comprising the compound.
  • the compound is as described above, and may include a pharmaceutically acceptable salt thereof. More specifically, the composition of the present invention can be added to the nutraceutical composition for the purpose of preventing or improving bone diseases.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a nutraceutical additive, the composition may be added as it is or used with other nutraceutical or nutraceutical ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use.
  • the composition of the present invention may be added in the amount of preferably 15 parts by weight or less, more preferably 10 parts by weight or less based on the raw material in the manufacture of food or beverage.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of stability, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • dietary supplement of the present invention There is no particular limitation on the type of dietary supplement of the present invention.
  • health functional foods to which the composition can be added include meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, teas, Drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like, may include all of the health functional foods in the conventional sense, may include foods used as feed for animals.
  • the health functional food composition of the present invention when used in the form of a beverage, it may contain various sweetening agents, flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in the usual beverage.
  • the natural carbohydrate can be glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol.
  • the ratio of the natural carbohydrate is not limited thereto, but may be preferably about 0.01 to 0.04 g, more preferably 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the sweetener may be a natural sweetener such as taumartin, stevia extract and a synthetic sweetener such as saccharin, aspartame.
  • the nutraceutical composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin , Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. Others may contain pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the present invention provides a cosmetic composition for the prevention or improvement of bone diseases comprising the compound.
  • the compound is as described above, and may include a pharmaceutically acceptable salt thereof. More specifically, the composition of the present invention can be added to the cosmetic composition for the purpose of preventing or ameliorating bone diseases.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared in the form of general emulsion formulations and solubilized formulations.
  • the emulsified formulations include nutrient cosmetics, creams, essences, etc.
  • the solubilized formulations include soft cosmetics.
  • Suitable formulations include, but are not limited to, solutions, gels, solid or pasty anhydrous products, emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionics (liposomes) obtained by dispersing an oil phase in an aqueous phase, for example
  • a vesicle dispersant may be in the form of a cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or cone stick. It may also be in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • the cosmetic composition additionally contains fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, blowing agents, fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metals Commonly used adjuvants such as ion blockers, chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles or any other ingredients commonly used in cosmetic compositions It may contain.
  • the present invention provides a method for treating bone diseases in animals other than humans, comprising administering the pharmaceutical composition to a suspected bone disease subject.
  • the subject suspected of bone disease refers to any animal including a human having or may develop a bone disease, and a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a subject suspected of a bone disease.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a subject suspected of a bone disease.
  • the term "administration" refers to the introduction of the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suspected of bone disease in any suitable manner, and the route of administration is through various routes, oral or parenteral, as long as the target tissue can be reached. May be administered.
  • the method of treatment of the present invention may comprise administering a pharmaceutical composition comprising said compound in a pharmaceutically effective amount.
  • Suitable total daily doses may be determined by the treating physician within the scope of good medical judgment and may be administered once or in divided doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular animal is determined by the specific composition, animal age, weight, general health, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
  • the compound according to the present invention is excellent in inhibiting osteoclast differentiation at a significantly smaller concentration than other extracts to compounds known to be effective in the bone disease. That is, the compound according to the present invention has an effect about 10 times better than the compound separated from the hwangchil extract. Thus, the compound according to the present invention has an effect that can be usefully used for the prevention, treatment or improvement of bone diseases.
  • administering a pharmaceutical composition, quasi-drug composition, nutraceutical composition, cosmetic composition and the pharmaceutical composition that can be usefully used for the prevention, treatment or improvement of bone disease through the new compound to the suspected bone disease It can provide a method for treating bone diseases in animals other than humans, including.
  • Figure 1 A shows the image observed by TRAP staining the effect of inhibiting osteoclast differentiation by concentration of the Hwangchil wood extract according to the present invention.
  • 1 B is a graph showing the effect of inhibiting osteoclast differentiation according to the concentration of Hwangchil-tree extract according to the present invention.
  • Figure 2 A shows the image observed by TRAP staining effect of the fraction of Hwangchil-tree extract according to the present invention to inhibit osteoclast differentiation by concentration.
  • 2B is a graph showing the effect of inhibiting osteoclast differentiation by fractions of the extract of Hwangchil-tree according to the present invention.
  • Figure 3 shows the chemical formula of the compounds 1 to 9 isolated from the hwangchil wood extract according to the present invention.
  • Figure 4 shows the image observed by TRAP staining the effect of inhibiting osteoclast differentiation according to the concentration of compounds 1 to 9 are separated from the Hwangchil wood extract according to the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of inhibiting osteoclast differentiation by the concentration of compounds 1 to 9 isolated from the extract of Hwangchil-tree according to the present invention.
  • Figure 6 A shows the image observed by TRAP staining the effect of inhibiting osteoclast differentiation according to the concentration of compounds 1 and 2 are separated from the Hwangchil wood extract according to the present invention.
  • 6B is a graph showing the effect of inhibiting osteoclast differentiation according to the concentrations of Compounds 1 and 2 separated from the Hwangchil-tree extract according to the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the cytotoxicity of the compounds 1 and 2 isolated from the Hwangchil wood extract according to the present invention.
  • the obtained second fraction (20 g) was subjected to silica gel column chromatography again (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate (50: 1 to 1: 1)) to 5 fractions (21 fractions to 25 fractions). Divided. Of this, the 21st fraction was recrystallized (solvent: n-hexane) to obtain a white powder, which was subjected to silica gel column chromatography (mobile phase: dichloromethane / methanol (40: 1)) to give compound 3 (10.0 mg). Compound 4 (14.5 mg) was isolated.
  • the 22th fraction was recrystallized (solvent: n-hexane) to obtain Compound 5 (120.0 mg), and the mother liquor remaining after recrystallization was again subjected to silica gel column chromatography (solvent: n-hexane / ethyl acetate (50: 1 to 1). (1)) and divided into five small fractions (221 fractions-225 fractions).
  • the 224th fraction was recrystallized (solvent: n-hexane) to obtain a white powder, which was confirmed to be a mixture (490.7 mg) of compound 6 and compound 7 in a ratio of 1: 3.5 by 1 H NMR and 13 C NMR.
  • the obtained third fraction (34 g) was subjected to silica gel column chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate (10: 1 to 1: 1)) to 5 fractions (31 fractions to 35 fractions). Divided. Of this, the 32nd fraction was purified two more times by silica gel column chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate (30: 1 ⁇ 5: 1)) to obtain 70.0 mg of white powder, and 1 H NMR and 13 C Through NMR, it was confirmed that the compound 8 and the compound 9 were mixed at a ratio of 1: 1.
  • the 34th fraction was subjected to silica gel column chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate (20: 1 to 1: 1)), and then separated / purified by reverse phase column chromatography with 70% methanol (mobile phase) to obtain Compound 1 ( 201.0 mg) and Compound 2 (112.0 mg) were obtained, and Compound 1 was identified as a novel compound.
  • Each of the isolated compounds was identified by 1 H-NMR and 13 C-NMR.
  • Bone marrow cells were obtained by purchasing 5 week old male ICR mice, taking the femur and tibia and washing them with ⁇ -MEM containing antibiotics (100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin). ) was obtained. The bone marrow cells were cultured in ⁇ -MEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) for 10 days. Non-adherent myeloid cells were dispensed into Petri dishes and incubated for 3 days in the presence of M-CSF (30 ng / ml).
  • FBS fetal bovine serum
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • BMM cells were prepared in DMSO or in Example 1 from Hwangchil extract or fractions thereof in concentrations (1, 3 and 10 ⁇ g / ml) in the presence of RANKL (10 ng / ml) and M-CSF (30 ng / ml). Treated and incubated for 4 days.
  • the negative control group used cells not treated with RANKL and Example 1.
  • Multinucleated osteoclasts were fixed with 3.7% formalin for 10 minutes and treated with 0.1% Triton X-100 for 10 minutes to ensure permeability. Cells were stained with TRAP solution (Sigma-Aldrich).
  • Multinucleated osteoclasts were visualized by TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) staining and shown in FIG. 1A (extract result) and FIG. 2A (fraction result). This is shown in FIG. 1B (extract result) and FIG. 2B (fraction result).
  • TRAP heartrate resistant acid phosphatase
  • Hwangchil wood extract of Example 1 and its fractions can be confirmed in Figure 1 and 2 to inhibit the production of osteoclasts in a concentration-dependent manner.
  • the methanol extract of Hwangchil tree significantly inhibited the production of osteoclasts from the concentration of 3 ⁇ g / ml
  • the ethyl acetate fraction and the n-butanol fraction of the Hwangchil methanol extract were significantly inhibited from the concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • the inhibitory effect of the ethyl acetate fraction was noticeably better than the n-butanol fraction.
  • the significance test was carried out through the student t-test, the significance * compared to the RANKL treatment group * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** *** p ⁇ 0.001. ### represents the significance (p ⁇ 0.001) when comparing the negative control group and RANKL treatment group.
  • LDH cytotoxicity assay was performed. The higher the level of cellular damage, the higher the level of LDH.
  • BMM cells were dispensed into 96-well plates at a concentration of 1 ⁇ 10 5 / ml using a medium containing 30 ng / ml M-CSF and 10 ng / ml RANKL, and then Compounds 1 and 2 were respectively 0.1, The wells were treated at concentrations of 0.3, 1, 3, 10, 30 ⁇ M and incubated for 4 days.
  • Raw264.7 cell lines were dispensed into 96 well plates at 1 ⁇ 10 4 cells / well, 100 ⁇ l / well, and then cultured in 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After 2 hours, 100 ng / ml RANKL and the cell differentiation medium containing the compound 1 of Example 2 and the compound 10 of Example 3, respectively, were incubated in 37 ° C. and 5% CO 2 incubator for 5 days. Then, the images were observed for each compound using a microscope.
  • the experimental group treated with the compound of Formula 1 and Formula 10 unlike the negative control group (100ng / mL) cell type was similar to the normal control group (No RANKL).
  • the compound of formula 10 (bottom photo of FIG. 10) showed a similar cell morphology at a low concentration of about 1/10 compared to the compound of formula 1 (top photo of FIG. 10). That is, the compound of Formula 10 was superior to the osteoclast differentiation inhibitory effect, even at a significantly smaller concentration than the compound of Formula 1, was found to have an excellent effect about 10 times.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물에 대한 것으로, 특히 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 메틸 에스테르(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid methyl ester) 화합물은 기존에 골 질환에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 추출물 내지 화합물보다 현저히 작은 농도에서도 파골세포 분화 억제 효과가 우수하기 때문에, 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있는 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법을 제공할 수가 있다.

Description

신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 상기 화합물의 제조방법, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법에 관한 것이다.
골의 재형성은 기계적 스트레스와 호르몬 조절에 반응하여 골을 유지하도록 살아가면서 지속적으로 발생한다. 통상적인 골량을 유지하기 위하여, 밀접하게 결합된 과정을 통해 골은 파골세포에 의하여 재흡수되고 새로운 골기질이 조골세포에 의해 축적된다. 많은 일반적인 골 질환에서 보듯이, 이러한 과정에서의 불균형은 파골세포에 의한 과다한 골 재흡수 및 골의 연약성의 증가를 유도할 수 있다.
파골세포는 그의 주위에 존재하는 T-cell, fibroblast, osteoblast 등에서 분비 되는 호르몬에 의해 조혈모전구체 또는 골수성전구체로부터 분화되는 것으로 알려져 있다. 파골세포의 분화과정에 있어서, RANKL에 의한 신호 전달과정이 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. RANKL은 조골세포, 활성화된 T세포 및 기질세포에서 생성되고, M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)와 함께 파골세포의 형태변화, 생존 및 골 흡수를 활성화 시킨다. RANKL이 수용체인 RANK에 결합되면, RANK의 세포질 도메인으로 TRAF6(TNF receptor-associated factor 6)가 모여들고, 이에 따라 NF-κB와 JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38(p38 MAP kinase), 및 ERK(extracellular signal-regulated kinase)를 포함하는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호전달 경로가 활성화된다. 활성화된 NF-κB는 하류에 있는 c-Fos와 NFATc1의 발현을 유도하는데, 이들은 RANKL에 의한 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 아울러, 이러한 파골세포의 분화과정은 IL-1, Il-3, PGE 등의 염증성 사이토카인에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있다.
최종적으로 분화된 파골세포는 다핵화 세포(multi-nulceated)의 형태를 띄고, 뼈를 흡수할 부위에 결합하여 액틴(actin), 빈컬틴(vinculin) 등을 이용하여 실링존(sealing zone)을 형성하여 주위와 밀폐하게 된다. 이후 이곳에 수소 이온을 펌핑하여 pH를 낮추어 하이드록시아파타이드 성분을 녹이게 되고 뼈의 10% 정도를 차지하는 콜라겐 성분을 분해하기 위해서 MMP-9 혹은 카뎁신 K와 같은 단백질분해효소를 분비하게 된다. 이같이 최종 분화된 파골세포는 타르타르산이 있는 조건에서 활성을 보이는 phosphatase(tartrate-resistant acid phosphatase: TRAP)를 특이적으로 발현하는 것으로 알려져 있으므로, TRAP의 활성을 측정함으로써 파골 세포분화를 확인할 수 있다.
상술한 바와 같은, 파골세포는 생체내의 골대사에 있어서 중요한 역할을 수행하지만, 다양한 원인에 의하여 과다하게 분화될 경우, 골조직의 장애를 초래하거나 또는 골조직을 파괴하는 질환이 유발될 수 있는데, 이러한 질환으로는 성장기 발육부진, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease), 전이성 골암(metastatic bone cancers) 등을 들 수 있다.
상기와 같은 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하며, 따라서 이에 대한 치료제로는 크게 골흡수 억제제 및 골형성 자극제가 있다. 일반적으로 상기 골흡수 억제제 또는 골형성 자극제 등의 골 질환 치료제는 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적어야 하며, 투여의 번거로움을 해결하기 위하여 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로, 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다. 한편, 상기 골 질환 치료제 중 조골세포를 활성화 시킴으로써 골형성을 촉진하는 골형성 자극제에 대한 연구가 보다 활발하게 진행되고 있으나, 골형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않는다. 한편 현재 사용되고 있는 파골세포의 활성을 억제하는 골 질환 치료제로는 데노수맙(Denosumab; Prolia™, Amgen®) 등이 있으며 이외에도 다양한 약물들이 개발되고 있으나, 약물치료는 장기간 지속되어야 함을 고려할 때 아직 부작용 등이 충분히 검증되지 않았으며, 파골세포의 정확한 메커니즘은 아직까지 밝혀지지 않은 상태이다.
또한, 기존에 골 질환에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 추출물 내지 화합물보다 더욱 우수한 효과를 갖는 화합물에 대한 필요성은 항시 존재하고 있는 실정이다.
본 발명은 기존에 골 질환에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 추출물 내지 화합물보다 현저히 작은 농도에서도 파골세포 분화 억제 효과가 우수한 새로운 화합물을 제공하는 것이 목적이다.
또한, 이러한 새로운 화합물을 통하여 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있는 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 메틸 에스테르(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid methyl ester) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
구체적으로, 상기 화합물은 하기 화학식 10로 표시되는 것이 바람직하다.
[화학식 10]
Figure PCTKR2016010759-appb-I000001
즉, 본 발명에 따른 화합물은 (9Z, 16S)-16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 메틸 에스테르((9Z, 16S)-16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid methyl ester)일 수 있다.
본 발명자들은 상기한 화학식 10의 화합물이 기존에 골 질환에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 천연 추출물 또는 그로부터 분리한 다른 화합물보다 현저히 작은 농도에서도 파골세포 분화 억제 효과가 우수하다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다. 즉, 상기 화학식 10의 화합물은 황칠 추출물에서 분리된 다른 화합물(아래 화학식 1의 화합물, 도 3 참조)보다 약 10배 정도 우수한 효과를 가지는 것으로 확인되었다(도 10).
상기 화학식 10의 화합물은 아래와 같은 반응식에 따라, 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid, 화학식1)을 메틸레이션(methylation) 시켜서 얻을 수가 있다.
Figure PCTKR2016010759-appb-I000002
상기 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산은 본 발명자가 황칠 추출물로부터 분리해 낸 것이고, 이것을 메틸화시켜서 본 발명에 따른 화학식 10의 화합물을 얻었다. 즉, 상기 화학식 1의 화합물은 황칠 또는 그 추출물에 포함되어 있는 것이지만, 상기 화학식 10의 화합물은 황칠이나 그것의 추출물에도 포함되어 있지 전혀 새로운 것이다.
본 발명자들은 상기 화학식 10의 화합물을 황칠로부터 분리해 낸 화학식1의 화합물로부터 얻었지만, 본 발명은 여기에 제한되지 않는다. 상기 화학식 10의 화합물은 화학적 합성 방법에 의하여 제조할 수도 있고, 인위적으로 합성된 화학식 1의 화합물로부터 얻는 것도 가능하다.
상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 화학식 10의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 10의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물 및 입체이성질체도 모두 발명의 범주 내로 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 황칠을 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 황칠 추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 (a)의 황칠 추출물을 유기용매로 분획하고, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 분획물로부터 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 (c)의 화합물을 메틸화시키는 단계를 포함하는, 화합물 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 황칠을 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 황칠 추출물을 수득하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "황칠"은 우리나라의 남부해안 지역과 제주도 등에서 자생하는 쌍떡잎 식물이며, 두릅나무과의 상록교목인 황칠나무(Dendropanax morbifera)는 겨울에도 낙엽이지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠이라고 한다. 황칠나무 추출물의 항암 활성 및 항산화 활성 등의 생리활성은 일부 제한적으로 보고 되어 있고, 식품 첨가제 및 건강기능성 보조 식품 등 식품에 이용되고 있다(Kim H.R., et al.. Chemical characteristics of the leaves and the seeds of Korean Dendropanax (Dendropanax morvifera Lev.). J. Korean Soc . Agric . Chem . Biotechnol. 43: 63-66(2000), Park S.N., et al.. Cellular antioxidant activity and whitening effects of dendropanax morbifera leaf extracts, 한국미생물생명공학회지, 41(4):407-415,2013). 본 발명에서 상기 황칠은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 지상부, 뿌리, 종자를 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 추출용매는 당업계에서 통상적으로 사용하는 추출용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 부탄올일 수 있다. 상기 추출용매는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 감수 분량의 2 내지 20배 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 내지 10배 첨가할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 5배 첨가할 수 있다. 상기 추출의 방법은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 열탕 추출, 열수추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출의 방법을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 열탕 추출 또는 냉침 추출 방법을 사용할 수 있다. 추출 시 추출용매의 온도는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 20 내지 100℃일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상온일 수 있다. 추출시간은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 12시간 내지 10일일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5일 내지 8일일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 7일일 수 있다. 추출횟수는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 1 내지 5회일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3회일 수 있다. 상기와 같은 추출의 조건을 이용하여 황칠을 추출, 여과하고, 여과액을 농축 및 동결건조하여 황칠 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 상기 (a)의 황칠 추출물을 유기용매로 분획하고, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계이다.
상기 유기용매는 고체, 기체, 액체를 녹일 수 있는 액체 유기 화합물로서, 당업계에서 통상적으로 사용하는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 클로로포름, 아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 아세톤, 아세토니트릴, 벤젠 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다.
상기 컬럼 크로마토그래피는 고정상 알갱이를 크로마토관에 기둥 모양으로 채워서 넣고 진행하는 크로마토그래피법으로서, 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으며, 바람직하게는 상기 충진제는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(toyopearl) 또는 XAD 수지를 사용하여 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명에서 상기 (c) 단계는 상기 (b)의 분획물로부터 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하는 단계이다.
상기 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)는 컬럼, 컬럼에 채우는 고정상의 충진제 그리고 장치의 개선, 개량에 의해 고속 및 고성능의 분리가 가능해진 크로마토그래피 방법으로서, 최종적으로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 (d)단계는 상기 (c) 화화물을 메틸화시키는 단계이다. 메틸화시키는 방법 내지 조건은 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 알려진 모든 방법을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 화학식 1의 화합물을 diazomethane, MeOH과 함께 0℃에서 반응시켜 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 메틸 에스테르(화학식 10)를 수득할 수 있다.
이와 같은 과정을 통하여, 본 발명에 따른 화학식 10의 화합물을 얻을 수 있고, 상기 화학식 10의 화합물은 현저히 우수한 파골세포 분화 억제 효과를 가지는 바, 상기한 방법은 본 발명에 따른 화학식 10의 화합물을 제조하기에 유용한 방법이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 화합물은 기존에 골 질환에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 추출물 내지 화합물보다 현저히 작은 농도에서도 파골세포 분화 억제 효과가 우수하기 때문에, 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "골 질환"은 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동으로 인해 나타나는 상태 또는 질병을 의미하는 것으로, 골량 저하 질환을 포함한다. 상기 골량 저하 질환이란 골밀도의 저하, 골조직의 열화 등의 증상을 수반하는 골량의 저하가 나타나는 상태 또는 질환을 의미하는 것으로, 암세포에 의해 활성화되는 파골세포에 의한 골손실도 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 상기 골 질환은 이에 한정되지 않으나, 성장기 발육부진, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질병일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 골다공증 또는 골감소증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 사용된 용어, "골다공증"은 골량이 감소하고 질적인 변화로 인해 골절이 일어날 가능성이 있는 상태를 의미하며, "골감소증"이란 골다공증의 초기 증세를 의미한다. 일반적으로 골밀도 수치(T 수치)를 기준으로 -1.0 내지 -2.5인 경우 골감소증, -2.5 이상인 경우 골다공증으로 분류한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 골 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 골 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로, 일일 투여량은 바람직하게는 황칠 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 100 mg/kg일 수 있으며, 보다 바람직하게는 30 내지 80 mg/kg일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 화장료 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 골 질환 의심 개체는 골 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 골 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 골 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 골 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 동물에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 동물의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 기존에 골 질환에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 추출물 내지 화합물보다 현저히 작은 농도에서도 파골세포 분화 억제 효과가 우수하다. 즉, 본 발명에 따른 화합물은 황칠 추출물에서 분리된 화합물보다 약 10배 정도 우수한 효과를 가진다. 그래서, 본 발명에 따른 화합물은 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 이러한 새로운 화합물을 통하여 골 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있는 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 상기 약학적 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법을 제공할 수가 있다.
도 1의 A는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 1의 B는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2의 A는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 분획물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 2의 B는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 분획물이 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 9의 화학식을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 9가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 9가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6의 A는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 및 2가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 TRAP 염색으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 6의 B는 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 및 2가 농도별로 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 및 2의 세포 독성 여부를 나타내는 그래프이다.
도 8 및 도 9는 본 발명에 따른 메틸화를 통해 얻은 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익 메틸 에스테르의 NMR 분석 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익 메틸 에스테르의 파골세포 분화 억제 효과를 확인한 이미지이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 - 황칠나무 추출물 및 이의 분획물의 제조 >
실시예 1 : 황칠나무 추출물 및 이의 분획물의 제조
건조된 황칠나무(Dendropanax morbifera) 지상부 5 kg을 추출용기에 넣고, 70% 메탄올을 50 L 가하여 7일 동안 냉침시켜 추출하고 여과하였다. 상기 수득한 추출액은 진공회전증발기를 이용하여 감압농축 하였다. 상기 추출 및 농축 과정을 2회 반복하여 황칠나무 추출물을 950 g 수득하였다.
상기 수득한 황칠나무 메탄올 추출물을 5 L의 증류수에 현탁시킨 후, 동량의 에틸아세테이트로 추출하는 과정을 3회 반복하였고, 얻어진 추출액을 감압 농축하여 258 g의 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다. 상기 추출 과정으로부터 수득한 여액을 동량의 n-부탄올로 3회 반복하여 추출하고 추출액을 감압 농축하여 부탄올 분획물 159 g을 얻었다.
실시예 2: 황칠나무 추출물로부터 유효성분의 분리 및 동정
상기 실시예 1로부터 제조한 황칠나무 추출물로부터 9종의 화합물을 분리하였으며, 이들 화합물의 구조식과 명칭을 도 3에 나타내었다.
구체적으로는, 상기 수득한 분획물 중 에틸아세테이트 분획물 220 g을 취하여, 디클로로메탄/메탄올 혼합 용액을 이동상으로 흘려주되 디클로로메탄/메탄올 혼합비를 100:1로부터 1:1까지 순차적으로 증가시키는 농도구배 용출방식으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 총 4개의 분획 (제1분획~제5분획)을 획득하였다.
수득한 제2분획 (20 g)을 재차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (50:1~1:1))를 실시하여 5개의 분획 (제21분획~제25분획)으로 나누었다. 이 중, 제21분획을 재결정 (용매: n-헥산)하여 흰색 분말을 얻었고 이 분말을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: 디클로로메탄/메탄올 (40:1))를 실시하여 화합물 3 (10.0 mg)과 화합물 4 (14.5 mg)를 분리하였다. 또한, 제22분획을 재결정 (용매: n-헥산)하여 화합물 5 (120.0 mg)을 얻었으며, 재결정 후 남은 모액은 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (용매: n-헥산/에틸아세테이트(50:1~1:1))를 실시하여 5개의 소분획 (제221분획~제225분획)으로 나누었다. 제224분획을 재결정 (용매: n-헥산)하여 흰색 분말을 얻었고, 1H NMR과 13C NMR을 통하여 화합물 6과 화합물 7이 1:3.5의 비율로 섞여있는 혼합물 (490.7 mg)임을 확인하였다.
상기 수득한 제3분획 (34 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (10:1~1:1))를 실시하여 5개의 분획 (제31분획~제35분획)으로 나누었다. 이 중, 제32분획을 재차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (30:1~5:1))로 두 차례 더 정제하여 흰색분말 70.0 mg을 얻었고, 1H NMR과 13C NMR을 통하여 화합물 8과 화합물 9가 1:1 의 비율로 섞여있는 혼합물임을 확인하였다. 제34분획은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (이동상: n-헥산/에틸아세테이트 (20:1~1:1))를 실시한 뒤, 70% 메탄올 (이동상)로 역상 컬럼 크로마토그래피로 분리/정제하여 화합물 1 (201.0 mg) 및 화합물 2 (112.0 mg)를 각각 얻었고, 화합물 1은 신규화합물임을 확인하였다. 분리된 각각의 화합물들은 1H-NMR 및 13C-NMR을 사용하여 구조를 확인하였다.
실시예 3 : 디노익산 메틸 에스테르(화학식 10) 화합물의 제조
상기 실시예 2로부터 얻은 화합물 1(16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid))을 0℃에서 diazomethane 및 MeOH과 함께 반응시켜서, 새로운 화합물을 얻었다.
그 결과는 도 8 및 도 9의 NMR 분석 그래프에 나타난 바와 같이, 상기 새로운 화합물은 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 메틸 에스테르(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic methyl ester)로 확인되었고, 화학식 10의 구조를 갖는 것을 알 수 있었다.
< 실험예 >
실험예 1 : 황칠나무 추출물 및 이 분획물의 파골세포의 생성 억제 효과
5주령의 수컷 ICR 마우스를 구입하여 대퇴골(fermur) 및 경골(tibia)을 취하고 항생제(100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM으로 세척하여 골수세포(bone marrow cell)를 획득하였다. 상기 골수세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/ml)를 포함하는 α-MEM에 1일간 배양하였다. 비부착(non-adherent) 골수세포를 페트리접시에 분주하고 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 3일간 배양하였다. 비부착세포를 세척한 후 부착세포(adherent cell)를 골수-유래 마크로파지(bone marrow-derived macrophage; BMM)로 사용하였다. BMM 세포를 RANKL(10 ng/ml) 및 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 DMSO 또는 실시예 1로부터 제조한 황칠나무 추출물 또는 이의 분획물을 농도별(1, 3 및 10 μg/ml)로 처리하여 4일간 배양하였다. 음성대조군은 RANKL 및 실시예 1을 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 다핵성 파골세포(multinucleated osteoclast)를 3.7% 포르말린으로 10분간 고정하고 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 세포를 TRAP 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 다핵성 파골세포를 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 염색으로 가시화하여 이를 도 1의 A(추출물 결과), 및 도 2의 A(분획물 결과)에 도시하였고, 황칠나무 추출물 농도에 따른 TRAP 활성을 측정하여 이를 도 1의 B(추출물 결과), 및 도 2의 B(분획물 결과)에 나타냈다.
실시예 1의 황칠나무 추출물 및 이의 분획물은 모두 농도 의존적으로 파골세포의 생성을 억제하는 것을 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있다. 황칠나무 메탄올 추출물은 3 ㎍/㎖의 농도부터 매우 유의적으로 파골세포의 생성을 억제하였고, 황칠나무 메탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물 및 n-부탄올 분획물은 10 ㎍/㎖ 농도부터 유의적으로 억제하였으며, 에틸 아세테이트 분획물의 억제효과가 n-부탄올 분획물보다 눈에 띄게 더 좋았다.
상기 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, RANKL처리군에 대비한 유의성 *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다. ###은 음성대조군과 RANKL처리군을 비교하였을 때 나타난 유의성(p <0.001)을 나타낸다.
실험예 2 : 황칠나무 추출물 유래 화합물의 파골세포의 생성 억제 효과
<2-1> 화합물 1~9의 파골세포 생성 억제 효과
실시예 2에서 분리된 화합물 1~9의 파골세포 생성 억제 효과를 확인하고자, 상기 실험예 1과 동일한 방법을 사용하였고, 화합물 1~9는 각각 10 μM, 30 μM의 농도로 처리하였다. TRAP 염색 결과는 도 4에, TRAP 활성 측정 결과는 도 5에 기재하였다. 도 4에서 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 및 7은 파골세포 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있지만, 다른 화합물들은 유의적으로 억제하지 못하므로 파골세포 생성 억제 효과가 없다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 5에서 화합물 1, 2 및 3은 10 μM, 30 μM 농도 모두에서 유의적으로 파골세포 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있고, 특히 화합물 1 및 2의 파골세포 생성 억제효과가 매우 유의적으로 우수한 것을 확인할 수 있다.
유의성 검정은 상기 실험예 1의 검정 방법과 동일하게 실시하였다.
<2-2> 화합물 1 및 2의 파골세포 생성 억제 효과
상기 실시예 2에서 분리된 화합물 1 및 2의 파골세포 생성 억제 효과를 더 자세히 확인하고자 농도를 세분화하여 실험을 재실시하였다. 상기 실험예 1과 동일한 방법을 사용하였고, 화합물 1 및 2는 각각 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM 의 농도로 처리하였다. TRAP 염색 결과는 도 6의 A에 도시하였고, TRAP 활성 측정 결과는 도 6의 B에 도시하였다.
화합물 1(화학식 1) 및 2(화학식 2)는 상기 실험예 2-1의 결과와 동일하게 농도 의존적으로 파골세포 형성을 억제하였고, 상기 두 화합물은 모두 1 μM 농도부터 유의적으로 파골세포 형성을 억제하였다. 또한, 50% 활성 억제 농도(IC50)는 화합물 1 및 2가 각각 2.41μM, 3.11μM 인 것으로 산출되었다.
실험예 3 : 화합물 1 및 2의 세포 독성 여부
화합물 1 및 2의 세포 독성 여부를 확인하기 위해, LDH cytotoxicity assay를 수행하였다. LDH는 세포손상도가 클수록 그 수치가 높다. BMM 세포를 30 ng/ml의 M-CSF와 10 ng/ml의 RANKL이 포함된 배지를 이용하여 1 X 105/㎖의 농도로 96웰 플레이트에 분주한 후, 화합물 1 및 2를 각각 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM의 농도로 상기 well에 처리하여 4일 동안 배양하였다. 그 후, 배지 상층액 50 ㎕와 LDH 기질용액(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega) 50 ㎕를 30분간 실온에서 반응시킨다. 반응을 정지시키기 위해 stop solution(1M acetic acid)을 50 ㎕씩 첨가한 다음, Microplate ELISA reader로 490nm 파장에서 흡광도를 측정하여 화합물의 세포독성 유무를 확인하였고, 그 결과를 도 7에 도시하였다.
상기 도 7에서, 화합물 1 및 2는 모든 농도에서 대조군과 유사한 LDH 활성을 보이는바, 세포 독성이 없다는 것을 알 수 있다.
실험예 4 : 디노익산 메틸 에스테르(화합물 10)의 파골세포 분화 억제효과
Raw264.7 세포주를 96 well plate에 1 X 104 cells/well, 100 ㎕/well 이 되도록 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에 배양하였다. 2시간 후에 100 ng/ml RANKL과 상기 실시예 2의 화합물 1과 상기 실시예 3의 화합물 10이 각각 포함된 세포분화배지로 교환해준 뒤 5일동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양하였다. 그리고, 현미경을 이용하여 화합물별로 이미지를 관측하였다.
그 결과는 도 10에 나타난 바와 같이, 화학식 1과 화학식 10 화합물을 처리한 실험군은, 음성대조군(100ng/mL)과 달리 세포형태가 정상대조군(No RANKL)과 유사하였다.
또한, 화학식 10의 화합물(도 10의 아래쪽 사진)은 화학식 1의 화합물(도 10의 위쪽 사진)과 비교하여, 약 1/10의 낮은 농도에서 유사한 세포형태를 보였다. 즉, 화학식 10의 화합물은 화학식 1의 화합물보다 현저히 작은 농도에서도 파골세포 분화 억제 효과가 우수하였고, 약 10배 정도 우수한 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

Claims (10)

16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산 메틸 에스테르(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid methyl ester) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 10으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
[화학식 10]
Figure PCTKR2016010759-appb-I000003
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 화합물은 황칠(Dendropanax morbifera)로부터 분리한 16-아세틸-9,17-옥타데카디엔-12,14-디노익산(16-acetyl-9,17-octadecadiene-12,14-diynoic acid)을 메틸화시킨 것임을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
(a) 황칠을 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 황칠 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a)의 황칠 추출물을 유기용매로 분획하고, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b)의 분획물로부터 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c)의 화합물을 메틸화시키는 단계를 포함하는, 제1항 또는 2항의 화합물의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 골 질환은 성장기 발육부진, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
제1항 또는 제2항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항 또는 제2항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제5항의 조성물을 골 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 골 질환 치료 방법.
PCT/KR2016/010759 2016-09-08 2016-09-26 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2018048007A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0115415 2016-09-08
KR1020160115415A KR101854144B1 (ko) 2016-09-08 2016-09-08 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018048007A1 true WO2018048007A1 (ko) 2018-03-15

Family

ID=61562556

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/010759 WO2018048007A1 (ko) 2016-09-08 2016-09-26 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101854144B1 (ko)
WO (1) WO2018048007A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030075999A (ko) * 2002-03-22 2003-09-26 주식회사 디피바이오텍 경조직 재생 및 증식 효과를 가지는 황칠 추출물, 황칠분획물 및 이를 함유한 약학 조성물
KR20090039162A (ko) * 2007-10-17 2009-04-22 한국화학연구원 폴리아세틸렌계 화합물을 함유하는 유해 조류 방제용조성물
KR20150028185A (ko) * 2014-06-09 2015-03-13 재단법인 전남생물산업진흥원 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 암 예방 또는 개선용 건강 기능 식품

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030075999A (ko) * 2002-03-22 2003-09-26 주식회사 디피바이오텍 경조직 재생 및 증식 효과를 가지는 황칠 추출물, 황칠분획물 및 이를 함유한 약학 조성물
KR20090039162A (ko) * 2007-10-17 2009-04-22 한국화학연구원 폴리아세틸렌계 화합물을 함유하는 유해 조류 방제용조성물
KR20150028185A (ko) * 2014-06-09 2015-03-13 재단법인 전남생물산업진흥원 황칠나무 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 암 예방 또는 개선용 건강 기능 식품

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAWAZU, K. ET AL.: "Two New Antifungal Compounds from Dendropanax Trifidus", TETRAHEDRON LETTERS, 1973, pages 3 131 - 3132 *
LEE, J. -W. ET AL.: "Dendropanoxide Induces Autophagy throughERK1/2 Activation in MG -63 Human Osteosarcoma Cells and Autophagy Inhibition Enhances Dendrop Anoxide-induced Apoptosis", PLOS ONE, vol. 8, no. 12, 2013, pages 1 - 8, XP055497454 *
PARK, B. -Y. ET AL.: "Isolation and Anticomplement Activity of Compounds from Dendropanax Morbifera", JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY, vol. 90, no. 2, 2004, pages 403 - 408, XP018004797 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101854144B1 (ko) 2018-05-04
KR20180028571A (ko) 2018-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101621856B1 (ko) 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2012070890A2 (en) Pharmaceutical composition comprising extract of lonicera japonica for prevention and treatment of gastroesophageal reflux disease
KR101668845B1 (ko) 황칠나무 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018194309A1 (ko) 인디루빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
WO2014058142A1 (ko) 섬쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2017014502A1 (ko) 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 il-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101509554B1 (ko) 골질환의 예방 및/또는 치료용 의약 조성물, 그 조성물을 함유하는 기능성 식품 또는 건강 식품, 그리고 그 조성물을유효 성분으로 하는 의약 제제
WO2015108394A1 (ko) 히드록시 피라논 유도체 화합물을 포함하는 지방세포 분화 촉진용 화장료 조성물
WO2012008788A2 (ko) 세린을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도 {composition for the prevention and treatment of fatty liver diseases containing serine as an active ingredient and the use thereof}
WO2021080129A1 (ko) 하이드란제놀 또는 필로둘신을 유효성분으로 하는 피부장벽 강화 및 아토피 피부염 개선용 조성물
KR20160068721A (ko) 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 ｉｌ-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018038313A1 (ko) 신규한 디노익산 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2014098306A1 (ko) 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2017082478A1 (ko) 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR102022279B1 (ko) 신선초 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
WO2019209061A1 (ko) 총백을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물
WO2022173116A1 (ko) 골질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
WO2015034247A1 (ko) 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2018048007A1 (ko) 신규한 디노익산 메틸 에스테르 화합물 및 이를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019031655A1 (ko) 티몰을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019083132A1 (ko) 사이토칼라신 d 또는 sag를 포함하는 항노화용 조성물 및 항노화 물질 스크리닝 방법
WO2016003120A1 (ko) 알피나 골무꽃 추출물을 포함하는 미백용 조성물
KR101925420B1 (ko) 요산 배출용 디노익산 화합물 및 이의 유도체, 및 이를 포함하는 조성물
WO2019208914A1 (ko) 마치현을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물
KR20200143105A (ko) 씀바귀 지상부 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 구강 건조증 예방 및 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16915802

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 27/06/2019)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16915802

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1