PT77472B

PT77472B - Process for preparing a glycosidic linkage related antigen and of anticancer agents containing the same as effective component

Info

Publication number: PT77472B
Application number: PT77472A
Authority: PT
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1982-10-08
Filing date: 1983-10-07
Publication date: 1986-02-12
Also published as: EP0106285A2; NO833655L; PH23701A; ES8700056A1; FI833652A; FI80711C; FI80711B; ES8600692A1; ES526622A0; CA1236016A; DK463283A; FI833652A0; PT77472A; DK463283D0; ES544306A0; EP0106285A3

Description

Descrição Pormenorizada da Invenção:

0 A-GRA da presente invenção pode ser obtido a partir de células cáncerosas contendo GRA , como células cancerosas humanas ou animais cultivadas, células cancerosas transplantadas, células cancerosas espontâneas, células cancerosas induzidas química ou viralmente ou células cancerosas originadas em tecido ope ratório, pela maneira indicada a seguir. A saber, separa-se primeiro um componente da membrana da célula a partir das células cancerosas descritas antes e trata-se depois este com um anticorpo

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, de GRA , para ligar A-GRA e isolar o complexo A-GRA-anticorpo de GRA . Pode ainda separar-se o A-GRA , tratando-o com uma lectina capaz de se ligar 4 galactose terminal e/ou 4 N-acetilgalactosamina terminal para o ligar 4 lectina.

Os exemplos de lectina que pode ligar-se espeeificamente 4 galactose terminal são: lectina de amendoínf (PNA), lectina de semente de rícino ("Ricinus Communis") e lectina de soja (SBA), etc. ("J. B. C." 250, 8518-8523 (1975): "Biochetn. Biophys. Res. Comm." 62, 144 (1975); »Z. Immunitaetsforch." 138, 423-433 (1969); "Br.

J. Exp. Pathol¹¹, 27, 228-236 (1946); "Proc. Nat. Acad. Sei.¹¹U.S.A., 75, No. 5, 2215-2219 (1978); "Biochemistry" 13, 196-2o4 (1974); e "Carbohydrate Research", 51. 107-118 (1976).

Os exemplos de lectina que pode ligar-se espeeificamente à N-acetilgalactosamina terminal são lectina de feijão "Dolichos" (DBA), lectina "braid orange", lectina de "fílix pomatia", lectina de "lima bean", SBA, lectina de feijão "Bauhinia", etc.

Como anticorpo de GRA , pode utilizar-se qualquer material, se tiver a propriedade de se ligar ao receptor de lectina. Por exemplo, é possível utilizar auto-anticorpos dojtpaciente com cancro, anti-soroS' de animais obtidos mediante imunização dos animais, pela maneira convencional, com um receptor de lectina como um antigénio, e anticorpos monoclonais obtidos por um processo conhecido Z~por exemplo, o processo descrito em "Nature", 256,495-497 (1975)-7 a partir de células de baço imunizadas com células cancerosas positivas ao receptor de lectina, seus componentes da membra na celular ou Um receptor de lectina como um antigénio.

Os auto-anticorpos de pacientes com cancro podem ser obtidos como um anti-soro que é isolado, de acordo com o processo convencional, a partir de pacientes com anticorpo de GRA-positivo, e pode ser utilizado tal qual ou como uma fracção de imunoglobulina obtida mediante purificação ou eliminação de sais, etc.

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Como receptor de lectina, pode utilizar-se u- que seja obtido mediante separação de um componente, que tenha a propriedade de se ligar a uma lectina que seja capaz de se ligar ã gaJactose terminal e/ou 1 M-acetilgalactosamina terminal, a partir do componente da membrana da célula cancerosa, de acordo com o processo de produção de A-GRA da presente invenção. Os ma-íferos que podem ser submetidos a imunização não são especialmente limitados. De uma maneira geral, utiliza-se coelhos, murganhos, ratos e similares e pode efectuar-se a imunização por um método convencional. Por exemplo, dilui-se o receptor de lectina descrito antes com soro fisiológico, etc., de maneira a obter-se uma concentrarão apropriada e administra-se a um animal mediante injecção intradérmiea, sob a forma de uma suspensão com um adjuvante de Freund . F preferível efectuar a administraçao por diversas vezes de uma e·" uma semana ou de duas em duas semanas de maneira que a dosage· total seja de 1 ytg a 20 mg no caso de, por exemplo, coelhos, e separa-se o anticorpo de GRA sob a forma de um soro.

Como anticorpo monoclonal, pode utilizar-se um que seja obtido por um método que consiste e-> seleccionar u~a série de células de hibridoma que produza o anticorpo desejado a partir do hibridoma, obtida mediante junção de células do baço de. um animal imunizado como se descreveu antes com células de mieioma conhecidas como HS-1, P3, P3-U1, FPC-li, SP2, XÓ3 .6.5.3, fite., e pi separá-la sob a forma da porção sobrenadarte do -v.lo de cultura em que as células de hibridoma citadas foram cultivadas, ou em -uitiplicar as células de hibridoma administrando-as a um animal que seja compatível com elas e em separá-las a partir da ascite.

A separação do componente da membrana da célula cancerosa pode efectuar-se por -étodos conhecidos, como um método de homogeneização ou um método de solubilizeção utilizando um agente de solubilização. F preferível efectuá-la por um -'étodo que consiste

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Sli

em homogeneizar células cancerosas em soro fisiológico ou em una solução-tampão apropriada, em separar o precipitado mediante centrifugação, etc., em dissolver o precipitado em soro fisiológico ou em uma solução-tampão, na presença de um agente de solubilização, e em separar o líquido sobrenadante mediante centrifugação, etc.

Como agentes de solubilização podem ser utilizados diversos agentes tensioactivos que são conhecidos por solubilizarem as membranas das células, por exemplo agentes tensioactivos não-ióni cos como "Triton X-100" (produzido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd), "wp-Mo" (produzido por Shell Co.), digitonina ou ureia, etc., e agentes tensioactivos aniónicos como dodecilsulfato de sódio (SDS), etc.

A separação do A-GRA que pode ligar-se ao anticorpo de GRA a partir do componente da membrana celular pode efectuar-se mediante processos fisicoquímicos ou bioquímicos convencionais utilizando as propriedades do A-GRA. Os exemplos desses processos são: cromatografia de afinidade que utiliza um veículo da coluna contendo o anticorpo descrito antes, um processo de imuno-precipir

tação, um processo de filtração sobre gel, um processo electroforético, um processo de precipitação física que utiliza urn agente de precipitação glicoproteico como polietilenoglicol ou acetona, etc. e processos de associações adequadas dos mesmos. 1? preferível utilizar a cromatografia de afinidade que utiliza um veículo de coluna que contém o anticorpo, 0 veículo de coluna pode ser ob tido facilmente fixando o anticorpo citado sobre um suporte insolú vel. A fixação do anticorpo sobre o suporte insolúvel pode efectuar-se por métodos conhecidos de fixação de materiais vivos.

Entre eles, é preferível fazer a fixação por um método que utiliza um polissacárido activado com brometo de cianogénio e por um método que utiliza um ester de N^hidroxi-succinimida. 0 método que

utiliza um polissacárido activado com brometo de cianogénio con siste em tratar um suporte insolúvel com brometo de cianogénio e em juntar o material activado resultante com um anticorpo de GRA, sob condições moderadas, para fixar o anticorpo de GRA no suporte. Ao efectuar-se o tratamento do suporte insolúvel com brometo de cianogénio, pode tratar-se o suporte em água ou acetonitrilo, h temperatura ambiente, mantendo o pH entre 7,5 e 12 com U" composto alcalino como hidróxido de sódio ou carbonato de hidrogénio e sódio, etc., ou em uma soluçao-ta^pão de pH 7,5-12 como u-"a soluçáo-tampão de 01M de carbonato de hidrogénio e sódio, de pH cerca de 8,7, ou U”ia solução-tampão de Ο,ΟΙΜ de ácido fosfórico, de pH cerca de 7,7, etc., durante cerca de 1 a 12 minutos. A quantidade de brometo de cianogénio utilizado é, de um modo geral, praticamente igual à do suporte ir-solúvel. Como suporte insolúvel, pode utilizar-se qualquer suporte insolúvel que apresente uma fraca adsorção não-específica em relação a materiais vivos de um modo geral e tenha uma porosidade elevada, que tenha um grupo funcional capaz de fixar os materiais vivos sob condições moderadas e sejam suficientemente estabilizados sob os pontos de vista químico e físico. Os exemplos de suportes insolúveis são: suportes celulósicos como aminoetil-celulose, carboximetil-celulose, bromoacetil-celulose ou p-anilino-celulose, etc., suportes de dextrano reticulado como Sephadex ou CM-Sephadex (produzido por Pharmacia Co.), etc. e suportes de agarose como Sepharose 2B, Sepharose 4b ou Sepharose 6B (produzido por Pharmacia Co.), etc. Quando se efectua a associação do suporte resultante, activado com brometo de cianogénio, com o an ticorpo de GRA, o suporte activado com brometo de cianogénio é utilizado em uma quantidade de 30 a 80 vezes, em peso, a do anticorpo de GRA e realiza-se a reacção a uma temperatura de uma maneira geral compreendida entre 0° e 4o^aC, de preferência entre 2 e 8°C, durante cerca de 10 a 20 horas, no seio de um dissolvente apropria8

do, por exemplo, uma solução aquosa 0,lM de carbonato de hidrogénio e sédio (contendo 0,5K de cloreto de sédio, pH 8,4). Pode pre parar, desta maneira, o veículo para a cromatografia de afinidade.

De acordo com a cromatografia que utiliza o veículo descrito antes para a cromatografia de afinidade contendo anticorpo de GRA , o A-GRA desejado pode ficar retido na coluna ficando ligado ao anticorpo de GRA no veículo mencionado antes. Depois, obtém-se o A-GRA mediante uma reacção de permuta, fazendo passar, através da coluna, uma substância capaz de se ligar ao anticorpo de GRA ou fazendo passar ura separador de adsorção (solução de eluição) como uma solução de um sal de concentração elevada, uma solução aquosa de tiocianato de potássio, uma solução-tampão de ácido bórico ou uma solução-tampão de ácido clorídrico-glicina (pH 2,7), etc., atra vés da coluna, para separar o A-GRA.

Como substâncias capazes de se ligarem ao anticorpo de GRA, utilizadas na reacção de permuta anteriormente descrita, pode raencionar-se as substâncias que se ligam a lectina que pode ligar-se a galactose, como galactose, dissacáridos cora galactose terminal ou oligossacáridos com galactose terminal, etc. e substâncias que se ligara a lectina capaz de se ligar a w-acetilgalactosamina, como H-acetilgalactosamina, dissacáridos com N-acetilgalactosaraina termi nal ou oligossacáridos com N-acetilgalactosamina terminal.

0 A-GRA da presente invenção pode ser separado, tratando com lectina capaz de se ligar k galactose terminal e/ou n-acetilgalactosamina terminal para se ligar k lectina citada. 0 tratamento com lectina pode efectuar-se de acordo cora a cromatografia de afinidade descrita antes, utilizando o veículo da coluna que contém lectina. Como veículos da coluna, podem utilizar-se os existentes no comércio e os obtidos pelo mesmo método como o descrito antes de fixação do anticorpo de GRA sobre o suporte insolúvel. Além disso, a cromatografia que utiliza um veículo de cromatografia de afinida9

de contendo a lectina pode efectuar-se de maneira análoga a da cromatografia de afinidade, descrita antes, do anticorpo de GRA.

Dissocia-se o A-GRA adsorvido sobre o veículo mediante uma reacção de permuta ou com um separador de adsorção. Efectua-se a reacção de permuta utilizando as substâncias descritas antes que podem ligar-se a uma lectina capaz de se ligar à galactose quando se utiliza como veículo, lectina capaz de se ligar à gj lactose ou utilizando as substâncias descritas antes que podem li gar-se a uma lectina capaz de se ligar â N-acetilgalactosamina, quando se Utiliza^ como veículo, a lectina capaz de se ligar â "-acetilgalactosamina. Na produção do A-GRA descrito antes, obtém -se Um componente que pode ligar-se a uma lectina (receptor de leç tina) a partir de membranas de células cancerosas, tratando, como se descreveu antes, com lectina e tratando depois com anticorpo de GRA, para se obter o A-GRA desejado.

0 A-GRA da presente invenção, obtido como se descreveu antes, conte™ glicoproteínas, glicolípidos e/ou sacáridos tendo, cada Um deles, galactose e/ou N-acetilgalactosamina terminal.

Se necessário, este A-GRA pode ser purificado ou liofilizado por

Γ

um método convencional.

0 receptor de lectina pode ser obtido, separando o componente anteriormente descrito que tem a propriedade de se ligar a u™a lectina capaz de se ligar a galactose terminal e/ou à N-acetilgalactosamina terminal, a partir do componente da membrana de células cancerosas mencionado antes, de acordo com o processo an teriormente descrito para a produção de A-GRA, de preferência mediante cromatografia de afinidade, utilizando o veículo de coluna descrito antes que contém essa lectina. Este receptor de lectina contém glicoproteínas, glicolípidos e/ou sacáridos tendo, cada Um deles, galactose terminal e/ou N-acetilgalactosamina terminal, e, se necessa'rio, pode ser liofilizado ou purificado depois por uma

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técnica de separação convencional. Por exemplo, há um processo que consiste em isolar o receptor de lectina separado com uma lec tina capaz de se ligar ã galactose e/ou com uma lectina capaz de se ligar k N-acetilgalactosamina, ou um processo que consiste em isolar o receptor de lectina resultante com uma lectina capaz de se ligar k N-acetilgalactosamina e/ou com uma lectina capaz de se ligar k galactose.

Além disso, descobriu-se, pela primeira vez, no anticorpo de GRA da presente invenção, que o anticorpo mencionado antes está presente, como auto-anticorpo, no fluído do corpo de pacientes com cancro. Este anticorpo é confirmado (medido) pelo processo descri to a seguir e é separado, a partir de pacientes de anticorpo-positivo, como se descreveu antes.

A presente invenção proporciona ainda um método de aval ia ção do anticorpo de GRA descrito antes. 0 método de avaliação po de ser utilizado na diagnose do cancro, na resistência ao tratamento médico e no parecer sobre o prognóstico.

0 método de avaliação mencionado antes pode efectuar-se, observando um anticorpo que possa ser ligado ks^células cancerosas de receptor. de lectina-positivo por um método de roseta indireeto que utiliza as células cancerosas de receptor de lectina-pp sitivo, de preferência as mesmas células cancerosas que não expri mem o complexo de histocompatibilidade principal (Μ. H. C.). Asa ber, suspende-se as células cancerosas mencionadas antes em Um meio que é utilizado para a cultura convencional de células, como meio RPMl-lóho, etc., de maneira a conseguir-se uma população apro priada, geralmente 3 ^x 10 células/ml de meio de cultura, adiciona-se soro de um paciente com cancro k suspensão de células resultante e efectua-se uma reacção a uma temperatura compreendida entre M e 37°C, durante 30 minutos a *+ horas. Depois de suficiente mente lavadas as células cancerosas com o meio anteriormente cita

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_tdo, adiciona-se glóbulos vermelhos (eritrocitos) como glóbulos vermelhos bovinos (ORBC), etc., proteína A ligada a pérolas de poliestireno ou a látex ou anticorpo de imunoglobulina anti-huma no ligado a pérolas de poliestireno ou a látex e faz-se reagir a uma temperatura compreendida entre 4 e 37°C, durante alguns minu tos a 30 minutos, mediante centrifugação (cerca de 1000 rpm).

As células são fixadas e coradas por um método convencional e examina-se visualmente as células que formam roseta, podendo deste modo confirmar-se a existência de anticorpo de ORA no soro do paciente. A saber, quando se utiliza um soro de pacientes de anticorpo de GRA-positivo, observa-se a formação de rosetas nas células cancerosas e avalia-se a velocidade de formação como um valor de anticorpo de GRA.

Como anticorpo de GRA utili2ado no processo descrito antes para a produção de A-GRA, prefere-se o isolado a partir do soro de um paciente com um valor de anticorpo elevado.

A desnaturação tónica do GRA resultante constituído por A-GRA e/ou o receptor de lectina efectua-se sob as condições con vencionais para a desnaturação de proteínas. Rpr exemplo, efectua-se a desnaturação aquecendo GRA em U” dissolvente como água, soro fisiológico ou uma solução-tampão de ácido fosfórico, a uma temperatura compreendida entre cerca de 6o e 12O°C, de preferência entre cerca de 90 e 110°C, durante 5 a 6o minutos, de preferência 10 a 20 minutos.

0 GRA termicamente desnaturado da presente invenção é Uma glicoproteína constituída por uma estrutura teninal de sacárido de galactose e/ou K-acetilgalactosamina e uma proteína desnaturada termicamente.

Quando os linfócitos são sensibilizados com o A-GRA ou com o GRA desnaturado termicamente da presente invenção, são produzidas células-assassinas..

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Os linfócitos aqui utilizados não são especialmente limitados, podendo utilizar-se quaisquer linfócitos do homem ou de ou tros animais, normais ou portadores de cancro. Os exemplos daque les são os provenientes do sangue periférico, da medula óssea,dos nodos lirfáticos, do baço, das amigdalas e do timo, etc. Estes linfócitos podem ser isolados, por exemplo, mediante um processo físico ou químico ou Um processo de membrana de superfície e podem ser utilizados no processo de produção de células-assassinas.

Pode efectuar-se a sensibilização de linfócitos com A-GRA, cultivando os linfócitos em um meio que contém A-GRA durante 1 a 3 dias, de preferência 2 dias.

A sensibilização de linfócitos com GRA desnaturado termieamente pode efectuar-se de um modo análogo, incubando-os durante algumas horas a 10 dias, de preferência 1 a 5 dias.

Como meio de cultura, pode utilizar-se diversos tipos de meios habitualmente usados para incubação de células deste tipo mas é preferível utilizar, por exemplo, meio RPRI l64o e meio MEM de Eagle a que se adiciona soro humano, soro de feto de vitela (FCS), soro de vitela ou soro de cavalo, etc. 0 A-GRA ou o GRA desnaturado termicamente a ser adicionado ao meio de cultura deve sê-lo, de preferência, em Uma quantidade compreendida entre 0,1 e 1000 ng/ml, de preferência entre 1 e 500 ng/ml, sob a forma de uma proteína calculada em relação a 1 x 10^ linfócitos/ml, quando se utiliza A-GRA; e entre 1 e 2000 ng/ml, de preferência entre 50 e ffco ng/ml sob a forma de sacárido, quando se utiliza GRA desnaturado termicamente.

A incubação é efectuada, por exemplo, a uma temperatura de 37°C e a pH 7)2, de acordo com o método convencional.

As células-assassinas assim obtidas podem ser multiplicadas sem qualquer restrição no meio de cultura descrito antes que conte nha factor de crescimento da célula T (TCGF IL-2). Neste caso, a

incubação selectiva para clonagem de celulas-assassinas pode efec tuar-se por um método de diluição limitada convencional. As célu las-assassinas podem manter-se estáveis durante um intervalo de tempo prolongado se forem conservadas, por exemplo, em azoto líquido.

As celulas-assassinas resultantes sao linfocitos substancialmente normais, que são caracterizados por terem uma citotoxicidade específica em relação a GRA. Estas células-assassinas podem ser fornecidas em estado de utilização, pela Requerente.

0 A-GRa e o GRA desnaturado termicamente de acordo com a presente invenção, obtidos pela maneira descrita antes, podem ser utilizados como agentes anticancerosos. 0 A-GRA e o GRA desnaturado termicamente podem ser utilizados sozinhos como ingrediente activo. Podem ser associados a outros agentes antimicrobianos e/ou agentes anticancerosos. 0 agente anticanceroso que contenha A-GRA ou GRA desnaturado termicamente de acordo com a presente invenção, eo-^o ingrediente activo, pode apresentar-se sob qualquer forma se contiver eficazmente A-GRA ou GRA desnaturado termicamente como ingrediente activo principal, no entanto, é geral^ente administrado mediante injecção intravenosa, injecção subcutânea ou injecção intramusclar sob a forma de uma solução, uma suspensão ou u^a emulsão, etc. Pode ser fornecido em estado seco que pode passar a estado líquido mediante adição de um veículo apropriado, antes da sua utilização. Esses agentes líquidos podem conter agentes de sus pensão como metilcelulose, emuisionantes como lecitina, antissépticos como p-hidroxibenzoato de metilo e estabilizantes ou compostos-tampão que não exerçam Uma influência adversa sobre uma função imune do homem e de outros animais, etc. Pode também utilizar-se soro fisiológico como meio aquoso e óleos vegetais como óleo de sésamo, etc., óleos mi_nerais como parafina, etc., óleos de natureza vegetal e animal como esqualeno, etc., e propilenoglicol, etc. como

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meio não aquoso. Esse agente líquido pode ainda conter adjuvantes apropriados para promoção de imunidade, por exemplo, adjuvante completo de Freund, saponina para os animais hidróxido de alumínio para o homem, etc.

0 agente anticanceroso descrito antes pode ser administrado a pacientes com cancro de uma só vez ou diversas vezes durante um intervalo de tempo prolongado com o fim de curar clinicamente a doença e pode ser administrado a indivíduos que estejam em perigo de ter um cancro com o fim de impedir o desenvolvimento do mesmo.

Gomo, tanto o A-GRA como o GRA desnaturado termicamente têm ma toxicidade tão fraca que a DL^ _{(quanao a<hlnlEtI}._{ada por via}

intraperitoneal a um murgannbo) é de 500 mg/kg ou mais sob a forma de sacárido, eles podem ser administrados em uma quantidade compre endida em um intervalo grande. Por conseguinte, a quantidade de A-GRA ou de GRA desnaturado termicamente no agente anticanceroso não é especialmente limitada mas está, de um modo geral, compreendida entre 0,001 e 100yòg/ml sob a for^a de sacárido. A quantidade a administrar depende do grau da doença, da iiiade e do sexo, sendo preferível· administrá-la, em uma õu mais vezes, em uma quantidade compreendida entre 0,001 e 1000^/tg/kg/dia.

Alem disso, as células-assassinas, obtidas pela maneira descrita antes, podem também ser utilizadas como agente anticanceroso. Esse agente anticanceroso é utilizado, de preferência, sob a forma de uma composição para injecção juntamente com um veículo utilizado com este tipo de agentes do sangue. Embora o veículo não seja especialmente crítico, é preferível utilizar os que têm a mesma toxicidade que o sangue, de preferência soro fisiológico.

Ao efectuar a produção do agente, é preferível que, depois de as células-assassinas serem suficientemente lavadas com soro fisiológico para remover o meio de cultura anteriormente citado, sejam

suspensas en um veículo.

A concentração de células-assassinas no agente mencionado antes não é especialmente limitada mas, de um modo geral, é

j 5 9,

preferível que esteja compreendida entre 10 ⁷ e 10⁷ células/ml. Além disso, não se observa toxicidade das células-assassinas

g

quando elas são administradas em uma quantidade de 10 células/ /murganho (por via intraperitoneal). A dosagem depende do grau da doença, da idade e do sexo mas é preferível administrá-la, de uma só vez ou em diversas vezes, em Uma quantidade compreendida entre 10^ e células/kg/dia.

A presente invenção é ilustrada, a seguir, em relação com exemplos, exemplos de referência, exemplos experimentais e exemplos comparativos mas não é limitada por eles.

Exemplo de referência 1

(Localização de GRA)

(1) Produção de lectina marcada com FITC (PNA-FITC):

Dissolve-se 10 mg de lectina de amendo í-R (PUA, produzida por Ki Co.) em 2 ml de uma solução-tampão de fosfato Ο,ΟΙΜ (pH 7,2) contendo 0,35 % de cloreto de sódio. Dissolve-se 2 ”g de FITC (produzido por Sigma Co.) em 1 ml de u™a solução-tampão de bicarbonato 0,5P (pH 9,0) e adiciona-se 0,5 ml da solução resultante à solução-tampão contendo PHA descrita antes. Após agita cão á temperatura ambiente durante 2 horas, efectua-se a separação com Sephadex G2 5 (10 mm x jOO mm, produzido por Pharmacia Co .) para se obter um primeiro máximo.

Relação F/P = 1,0.

(2) Produção de lectina marcada com FITC (DJA-FITC):

Obtém-se DoA-FITC utilizando DBA produzido por EY Co. )

pela mesma maneira descrita antes em (1) Relação F/P =0,9·

(3) Localização de GRA em diversos tipos de células cancerosas: 6

Lava-se 1 x 10 células de diversos tipos de células can cerosas, três vezes, com uma solução-tampão de ácido clorídrico 0,0^?-tris (pH 7,2) contendo 0,85 % de cloreto de sódio mediante centrifugação, adiciona-se depois 100 ^/A-litros de P^A-FITC ob tido antes em (1) ou de DBA-FITC obtido antes em (2) ou de SBA-FITC (produzido por BY Co.) (200 ytg/ml e deixa-se ficar a mistura resultante b temperatura ambiente, durante 30 minutos, para que a reacção se produza. Terminada a reacção, lava-se as células, três vezes, com uma solução-tampão de fosfato 0,011'

(pH 7,2) contendo 0,85 $ ãe cloreto de sódio. Põe-se as células sobre Uma lâmina de vidro e examina-se aquelas em Um microscópio de fluorescência.

Os resultados obtidos estão indicados no Quadro 1.

As amostras das células cancerosas eram todas elas conhecidas e foram adquiridas na Primeira Secção de Patologia, Departamento 1'édico, Universidade de Niigata.

Quadro 1

Positividade de GRA (Ό DBA-FITC

PNA.FITC (SBA-FITC)

Especimen.de células cancerosas

Raji	(Linfoma de Burkitt)	98,3	1,4
Daudi	(Linfoma de Burkitt)	93,1	5,2
BT-1	(Linfoma de Burkitt)	50,1	0
P-12	(Linfoma da célula T)	^4,3	6,7
MOLT	(Leucemia da célula T)	o, 6	4,8
Fujimaki	(Linfoma da célula B)	19,1	5,3

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Oda	(mieloma IgD)	0,6	10,0
qg-56	(Cancro do pulmão sq.)	70,4	2,0
PC-l	(Cancro do pulmão sq.)	78,4	0,4
PC-3	(Cancro do pulmão adeno.)	77,1	0
QG-90	(células pequenas do cancro do pulmão)	68,0	0
PC-13	(células grandes do cancro do pulmão)	17,0	0
MK-2	(cancro do estômago por.)	63,7	0,1
KATO-III	(cancro do estômago, sig.)	57,3	0
	(cancro do estômago, por.)	1,0	4o,3
νϊ?^τ-1	(cancro do estômago, adsq.)	4,6	o,4
yK?^T-23	(cancro do estômago, tubi )	0,4	0,1
MKV-74	(cancro do estômago, tubi)	o,5	0
MGH-U1	(cancro da bexiga ca. )	37,4	o
K.U-2	(cancro da bexiga ca.)	4,5	21/1
T-24	(cancro da bexiga ca.)	14,6	0
NBT-2	(cancro da bexiga ca.)	13,1	1,0
"TRC-12	(cancro do rim )	23,9	0
KU-1	(cancro do rim)	3,3Γ	0,6
Kuramochi	(cancro do ovário)	80,0	0
UB-l	(neuroblastoma)	50,9	1,7
YT-nu	(neuroblastoma)	3,6	0,5
TGW-nU-I	(neuroblastoma)	5,1	0
TGW-nu-II	(neuroblastoma)	2,0	1,0
GOTO	(neuroblastoma)	o,5	0
ITO	(carcinoma do embrião)	96,9	12,3
"EC-8	(carcinoma do embrião)	44,6	0
SCH	(criocarcinoma do estômago)	14,6	3,1
GCH	(criocarcinoma do útero)	5Λ	0
Y’>T-1	(rabdomiosarcoma)	5,7	1,7

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Χ5563 (mieloma do murganho) 92,0 0

(90,6)

MH13*+ (cancro do fígado com ascite

no murganho) 18,6 o

(6,4)

(4) Localização de GRA em diversos tipos de células cancerosas (amostra operada):

Deixou-se passar um tecido canceroso, obtido a partir de uma amostra proveniente de um paciente operado, através de um peneiro de aço inoxidável de 150 malhas para se obter uma suspensão de células. Lava-se duas vezes com Uma solução-tampão de Ο,ΟΙΜ tris-ácido clorídrico (pH 7,4) contendo 2 mM de cloreto de cálcio, 2 mM de cloreto de magnésio e 0,85 % de cloreto de sódio. Suspen deu-se 5 ^x 10' células em 100 /tl da solução-tampao mencionada antes e adicionou-se 100 β,Ί de PUA-FITC ou DBA-FITC (200 ytg/ml), incubando depois ã temperatura ambiente durante 20 minutos. Concluída a reacção, lavou-se as células, três vezes, com uma solução -tampão de Ο,ΟΙΜ de fosfato (pH 7,2) contendo 0,85 % de cloreto de sódio (de aqui em diante designado por "PBS"). Fm seguida, colocou-se as células sobre uma lâmina de vidro e examinou-se sob um microscópio de fluorescência. Os resultados estão indicados no Quadro 2. As amostras provenientes de pacientes com cancro opera dos foram obtidas em Kansei Medicai College. Mo Quadro 2, indica-se a localização de GRA.

Qua12

Quadro 2

	Localizae	ão de GRA
Especimen de tecido canceroso	PNA-FITC	DBA-FITC
Cancro do estômago		+
cancro do estômago	+	+
cancro do estômago	-	-
cancro do estômago		-
cancro do estômago	+	+
cancro do estômago	+	-
Mastocarcinoma	+	-
mastocarcinoma		-
mastocarcinoma		-
mastocarcinoma	+	+
Cancro do cólon	+	+
cancro do cólon	-	+
Cancro do esófago	+	-
Cancro do fígado	-

Exemplo de referência 2

Produção de receptor de lectina:

(1) Produção de lectina insolúvel (P^A-Sepharose)

Depois de suficientemente lavados 3 g de Sepharose hB activado com brometo de cianogénio (produzido por Fharmacia Co.) com 1 mp HCl, suspende-se aqueles em 200 ml de uma solução O,1M de carbonato de hidrogénio e sódio (pH 8,5). Adiciona-se 5 ml de uma solução-tampão de fosfato 0,01}-S (pF 7,7) contendo 20 mg de PNA e efectuou-se a reacção a 25°C durante 2 horas, agitando de vez em quando, para se obter P^TTA-Sepharose.

20

(2) Obteve-se DBA-Sepharose pelas mesmas técnicas descritas antes em (1), mas utilizando DBA em vez de PíTA.

O

(3) Lavou-se 1,3 * 10° células de BT-1 (linfoma de Burkitt),

três vezes, com soro fisiológico e adicionou-se depois 30ml de uma so lução-tampão de Ο,ΟΐΜ-tris-ácido clorídrico (pH 7,4) contendo 2 ? de "Triton X-100" (produzido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0,85 % de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de cal cio e 2 mM de cloreto de magnésio. Agitou-se a mistura resultan te a 4°C durante 15 minutos. Submeteu-se depois a mistura a ultracentrifugação a 100.000 xg durante 2 horas. Dos 28 i>l do líquido sobrenadante da ultracentrifugação, submeteu-se uma porção de l4 ml a cromatografia de afinidade (diâmetro; 0,5 cm; comprimento; 1 cm) com pérolas de PNA-agarose (produzido por Maruzen Co.) equilibrada com uma solução-tampão de tris-ácido clorídrico (pH 7,4) contendo 0,1 $ de Triton X-100, 0,85 % de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de cálcio e 2 mM de cloreto de magnésio. Após lavagem com a solução-tampão referida antes, efectuou-se a eluição com uma solução-tampão 0,01M de tris-ácido clorídrico (pH 7,4) contendo 0,lM de lactose,‘“O, 5 % de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de cálcio, 2 mM de cloreto de magnésio e 0,1 $ de TritaiX-lOO e dialisou-se o líquido eluído contra uma solução-tampão Ο,ΟΙΜ de tris-ácido clorídrico conten do 0,85 % de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de magnésio e 2 mM de cloreto de cálcio, durante 48 horas, para se obter 17 ml de uma solução de receptor de lectina. Gomo resultado da determinação da quantidade da sua proteína pelo método de Folin-Lowry e da quantidade dos seus sacáridos pelo ^étodo do sulfato de fenol, verlficou-se que a quantidade de proteína era de 644 ^.tg e que a quantidade de sacarido era de 120 ylg. De aqui em diante, será designado por "Receptor 1".

21

(4) lavou-se 1 x 10^° células de mastocarcinoma C^H do murganho (MMT), três vezes, com soro fisiológico. Adicionou-se depois 30 ml de uma soluçao-tampao 0,01M de tris-acido clorídrico (pH 7,4) contendo 2 % de Triton X-100, 0,85 % de cloreto de sodio,

✓ r

2 mM de cloreto de cálcio e 2 mM de cloreto de magnésio e agitou-se a mistura a 4°C durante 30 minutos. Em seguida, apos ultraIW Z

centrifugação a 100.000 x g durante 2 horas, dialisou-se o liquido sobrenadante resultante durante uma noite contra uma solução-tampao 0,01M de tris-acido clorídrico (pH 7,4) contendo 0,85 % de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de cálcio e 2 mM de cloreto de magnésio. Concentrou-se o líquido dialisado resultante ate

3 ml utilizando ultrafiltros imersiveis CX (produzidos por

Millipore Co.) e submeteu-se 1 ml do liquido concentrado a cromatografia de afinidade com PHA-Sepharose equilibrada com uma solução- tampao de tris-ácido clorídrico (plí 7,4) contendo 0,005 % de Triton X-100, 0,85 / de cloreto de sodio, 2 mM de cloreto de cálcio e 2 mM de cloreto de magnésio (diâmetro: 0,5 cm; compri* Z

mento: 2 cm). Apos lavagem suficiente com a mesma soluçao-tampao eluiu-se com uma solução-tampao 0,01M de tris-ácj(âo clorídrico (pH 7,4) contendo O,1M de lactose, 0,85 % de cloreto de sodio, 2 mM de cloreto de cálcio, 2 mM de cloreto de magnésio e 0,005 % de Triton X-100 e dialisou-se o liquido eluido, durante 48 horas, contra uma solução-tampão 0,01 M de tris-acido cloridrico (pH 7,4) contendo 0,85 % de cloreto de sodio, 2 mH de cloreto de cálcio e 2 mM de cloreto de magnésio para se obter 2 ml de uma solução de receptor de lectina. A quantidade da sua proteína foi de 156e a quantidade do seu sacárido foi de 94y^tóg. De aqui em diante, será designado por "Receptor M-l".

(5) Homogeneizou-se cerca de 120 g (peso húmido) de células KATO-III em 100 ml de PBS ern um moinho (misturador Waring: fabricado por Nippon Seiki Co., Itd). Adicionou-se o precipitado obti22

do mediante separação por centrifugação (100,000 x g, 1 hora) a 100 ml de uma solução-tampão 0,01M de tris-ácido clorídrico (pH 7»6) contendo 2 % de Triton X-100 e 0,15M de cloreto de sodio, com agitação. Submeteu-se o líquido sobrenadante obtido mediante separação por centrifugação (100.000 g x 1 hora) a cromatografia de afinidade (diâmetro: 0,8 cm; comprimento: 15 cm) com PHA-Sepharose equilibrada com uma solução-tampão Ο,ΟΙΜ de tris-ácido clorídrico (pH 7,6) contendo 0,015 % de Triton X-100 e 0,15 M de cloreto de sódio. Após lavagem com 50 ml da mesma solução-tampão, realizou-se a eluição com a mesma solução-tampão contendo O,1M de lactose e dialisou-se o líquido eluído contra uma solução aquosa de cloreto de sódio a 0,85 % para se obter uma solução de receptor de lectina. Concentrou-se com Sephadex (fabricado por Pharmacia Co.) e conservou-se a -20°C. Quantidade de proteína 2,0 mg. Quantidade de sacaridos: 0,8 mg. De aqui em diante, será designado por "Receptor 2".

(6) Os receptores de lectina indicados no Quadro 3 foram obtidos pela mesma maneira que em (5), respectivamente.

	Quadro 3	V
Receptor	Matéria-prima		Quantidade de proteína (mg)	Quantidade de sacarid (mg)
3	BT-1, 33 g		0,5	0,09
4	Mas t o c arcinoma
	(amostra operada)	, 5 g	0,24	0,5
5	QG-56	24 g	0,6	0,38
6	QG-90	26 g	1,0	0,54
7	Raji	29 g	0,78	0,45
14-2	MMT	200 g	11,3	28,4
M-3	Cancro do pulmão (llC)	de lewis 14,4 g	0,06	0,07
1-5-4	Oancro do fígado (MH134),	com ascite 85 g 0,65	0,35
14-5	Mieiorna (X5563),	25 g	0,56	0,23

23

(7) Obteve-se um receptor de lectina de acordo com a mesma téç nica descrita antes em (5), mas utilizando cerca de 29 g de MKN-45 em vez de KATO-III, uma coluna de DBA-Sepharose em vez da coluna de PWA-Sepharose e efectuando a eluição com ^M-acetilgalactosamina em vez de lactose. Quartidade de proteína: 0,03 mg. Quantidade de sacárido: 0,01 mg. D_p aqui em diante será designado por "Receptor 8".

(8) Submeteu-se 5 "Ί do Receptor 3 obtido antes em (ó) a croma tografia em 'J⁷ⁱa coluna de DBA-Sepharose e efectuou-se a eluirgo com uma solução-ta vão Ο,ΟΙΜ de tris-ácido clorídrico contendo 0,015 % de Triton X-100, 2 mM de cloreto de magnésio, 2 ml·’ de cloreto de cálcio e 0,85 / de cloreto de sódio para se obter porções de 4 ml. Elui-se depois com a solução-tampão descrita antes contendo 0,lM de w-acetilgalactosamina, obtendo-se u^a solução de re ceptor de lectina. De aqui em diante será designado por "Receptor 3-0". Também as fraeções N²s 1 a 3 descritas antes serão designadas por "Receptor 3-A" e as fraeções N^ss 4 a 12 serão designadas por "Receptor 3-B".

r

(9) Efectua-se a electroforese do gel de dodecil-sulfato de só dio de cada receptor de lectina obtido pela maneira descrita antes, de acordo com o processo de Fairbanks e colab. Z” "Biochemistry", Vol. 10, pág 26o6 (1971).7. Os resultados estão indicados nas

Figuras 1 a	5.
uos	desenhos, cada número representa 0 seguinte
Nas Figuras	1 e 2:
1.	Padrão
2.	Receptor M-3
3.	Receptor 7
4.	Receptor 1
5.	Rpceptor 2

Na Figura 3:

1 .

2.

3.

4.

Ma Figura 4;

1.

2.

3.

Ma Figura 5:

1.

2.

3.

4.

Padrão Receptor M-2 Receptor 6 Receptor 5

Receptor M-4 Receptor M-5 Padrão

Receptor 3 Receptor 3-A Receptor 3-B Receptor 3-C

Além disso, as Figuras 1 e 5 são desenhos que representam o diagrama electroforético detectado por uma reacção de colo ração da proteína mediante um método de C.B.B. Z" "Biochemistry" , Vol. 10, pág. 2606 (1971)J e as Figuras 2 a 4 representam desenhos do diagrama electroforético detectado por uma reacção de coloração de saeáridos mediante Um método de Pas. /""Anal. Biochem. Vol. 30, 148 (1962)/⁷.

Em cada desenho utilizou-se, coio padrão

terlais-padrão produzidos

200	(K daltons)
116	(	11	)
925	(	tl	)
662	(	11	)
4?	(	It	)
215	(	11	)

por Biorad Lab. Co. (U Miosina [3-Glucosidase Fosforilase

BSA

Ovalbumina

Inibidor da tripsina da

os seguintes ma S.A.):

soja.

Apresenta-se ainda, como Figuras 1 A a 4 A, as fotogra25

fias correspondentes as Figuras 1 a 4.

Exemplo de referência 3

(ORBC-Proteína A)

Lavou-se eritrocitos (ORoC) três vezes, mediante centrifugação (2000 rpm, 10 minutos) com urna solução Ο,ΟΙΚ de fosfato

9

(pH 7,2) contendo 0,85 / de cloreto de sódio para se obter 5 ^χ10⁷células mediante precipitação. Adicionou-se 1 mg/ml de soro fisj. ológico contendo 0,45 ml de Proteína A (Pharmacia Co.) e 1 mg/ml de soro fisiológico contendo 0,5 ml de cloreto de crómio (CrClj, 6h₂0) e agita-se a "istura k temperatura ambiente durante 10 minutos. Depois de lavadas as células, duas ou três vezes, com meio

Q

RP^vI-l64o, suspendeu-se aquelas em 25 ml do resmo meio (2 x 10° células/ml) e manteve-se a 4°C.

Exemplo de referência 4

(Avaliação do anticorpo de GRA)

r

Apos incubação, lavou-se células cancerosas, Laudi, mediante centrifugação (1.000 rpm, 10 minutos), duas vezes, com o meio RPMI-1640, preparou-se a amostra de maneira a ter 3 ^x 10 células/ml no mesmo -eio. Introduziu-se 100 y.tl da amostra em um tubo de ensaio, adicionou-se 100 de soro de Um paciente com can cro e efectuou-se a reacção a 4°C durante uma hora. Depois de se la var duas vezes as células com o mesmo meio, adicionou-se, ao precipitado, 100 yCtl de eritrocitos (ORBC )-Proteína A obtida no exemplo de referência 3· Após agitação, subm_eteu-se a centrifugação a 1.000 rpm durante 5 minutos. Em seguida, agitou-se ligeiramente e fixou-se e corou-se com glutaraldeído e Azul brilhante Coo-assie (CBB). Determinou-se a formação de rosetas de eritrocito (ORBC)26

-Proteína A em relação bs células incubadas. Qs resultados estão indicados no Quadro 4.

Quadro 4

Amostra Formação de roseta

N2 Cancro (#)

1	Cancro do esófago	7Ó
2	Mastocarcinoma	23
3	II	10
4	H	1
5	n	10
6	tf	90
7	II	85
8	Cancro do recta	50
9	11	15
10	Cancro do recto	97
11	Cancro do estômago	65
12	11	*+5
13	n	!V 45
14	n	20
15	II	5
16	u	35
17	Cancro do cólon	20

Células normais (10 homens) 0

Exemplo de referência 5

Determinou-se a formação de rosetas pela ^esma maneira que no exemplo de referência 4, mas utilizando em vez de Daudi, diversos tipos de células cancerosas tendo, cada uma delas, uma propriedade diferente de ligação b lectina. Como soro de pacien

27

te, utilizou-se o do TfQ 11 no quadro 4. Os resultados estão indicados na Figura 6. Deverá ^ntender-se, a partir disto, que o anticorpo reage fortemente com os receptores de PNA .

Exemplo de referência 6

Administrou-se receptor 1 obtido no exemplo de referência. 2, em uma quantidade de 5 como proteína juntamente com um adjuvante de Freund completo, por via subcutânea, a um coelho (2 a 3 kg), uma vez de duas em duas semanas, para imunizar o ani mal. Após três imunizações, colheu-se o sangue e separou-se o anti-soro mediante centrifugação para se obter um anticorpo de GRA (anticorpo-I).

Exemplo de referência 7

(1) Colheu-se sangue do paciente 10 tendo uma elevada for mação de rosetas no exemplo de referência 4 e separou-se um anti-soro mediante centrifugação para se obter um anticorpo de GRA (anticorpo-II).

I

(2) A 9 "Ι de Anticorpo-II obtida antes em (1), adicionou-se, gota a gota, 6 ml de uma solução saturada de sulfato de amónio. Após agitação h temperatura a-biente durante 1 hora, centrifugou-se a mistura (3-000 rpm, durante 30 minutos), ohtendo-se um precipitado. Dissolveu-se este precipitado em 6 "Ί de solução-tampão de fosfato (PBS), dialisou-se com 5 litros de uma solução-tam pão de fosfato (PBS) a 4°C, durante 24 horas, obtendo-se um anticorpo de GRA (Anticorpo III) que contem 12 mg de proteína/ml.

R_ye^w’28

Exemplo de referência 8

(Reactividade do anticorpo de GRA)

(a) Utilizando, como antigénio, o Receptor 2 obtido no exem pio de referência 2, avaliou-se a sua reactividade com o anticorpo de GRA (Anticorpo-II), ootido no exemplo de referência 7, por um método imuno-electroforético. Isto é, coloeou-se 1? yol do antigénio (l6o yíg de proteína/ml) em uma cavidade de uma placa de Agarose a 1 % para efectuar a electroforese a 70 V durante 6o minutos. Põe-se 200 ytl de Anticorpo-II em uma ranbura para que reaja a temperatura ambiente e h humidade a^bi«nte, durante 24 horas. 0 resultado foi o indicado na Figura 7, em que se observa uma linha de sedimentação, wa figura 7, o número 1 indica uma cavidade e o número 2 uma ranhura.

(b) Determinou-se a reactividade do mesmo antigénio com o anticorpo, como se indicou em (a), por um método d.e precipitação utilizando um tubo capilar 77 referência a "Hyojun Rinsho Kensaho"

Igakushoin, 2a edição, pág. 3^2-345 (1967)_7. Isto é, pôs-se o

5'·'

Receptor 2 em um tubo capilar e colocou-se, sobre aqu-le, Anticorpo-II. Deixou-se ficar h temperatura ambiente durante 24 horas. Como resultado, observou-se um. precipitado na face que esta belece 0 limite entre 0 antigénio e o anticorpo. Quando se utili za um soro de uma pessoa normal era vez do anticorpo, não se obser va precipitado.

(c) Ensaio de Bloqueamento (PUA)

Introduziu-se 100 ^íLl de Uma solução de P’^TA em uma solu ção-tampão de fosfato (PBS) com uma concentração apropriada em tu bo de ensaio que continha BT-1 (3 ^x Kr células/ml de RPMl-l64o) para incubar a 4°C, durante 20 minutos. Depois de lavadas duas

29

vezes, mediante centrifugação, com o meio RPMI-164O (1.000 rpm, durante 20 minutos), suspendeu-se as células novamente em 100 ytl do meio descrito antes. Após adição, 'a suspensão, de 100 ytl de uma solução do Anticorpo-II obtido no exemplo de referência 7, di luída 10 vezes com soiução-tampão de fosfato (PBS), incubou-se a 4°C, durante 1 hora e lavou-se três vezes com o meio anteriormente citado. Suspendeu-se as células novamente em 100 /il do meio

✓

referido antes e adicionou-se, 4 suspensão, luO ^1 de eritrocitos (ORBC)-proteína A. Depois, avaliou-se a for-acao de rosetas pela mesma maneira indicada no exemplo de referência 4. Os resultados estão referidos no Quadro 5, fi” que se observa um efei to bloqueador para a ligação com PWA .

Quadro 5

Concentração de

PNA ( ytg/ml) 0 2 50 500 1000

Formação de roseta ($) 78,5 62,3 42,4 23,3

(d) Ensaio de bloqueio (Receptor de lectina)

Γ

A O ,1 mole de um PBS de Receptor 1 obtido no exemplo de referência 2, tendo uma concentração apropriada, adicionou-se 0,1 ml de uma solução diluída com PBS contendo 10 /tg/ml de Anticorpo III obtido no exemplo de referência 7. Após reacqão a 37°C durante 1 hora, adicionou-se 3 ^x IO⁵ células Daudi/0,1 mole de RPPl-l64o e ineubou-se a 4°C durante 1 hora. Lavou-se três vezes as células mediante centrifugação (1.000 rpm, 10 mi_nutos) com RPKI-164O. Suspendeu-se de novo as células resultantes em lOOytl do meio descrito antes e avaliou-se a formação de rosetas pela mesma maneira que no exe”plo de referência 4. os resultados estão indicados no Quadro 6, em que se observa um efeito bloqueador para a ligação ao receptor de lectina.

Quadro 6

Concentração do receptor

de Lectina (ytg/ml) 0 2,2 4,4 8,8

Formação de rosetas (%) 43,5 4,0 1,9 0,2

(e) Utilizando o Receptor 1 obtido no exemplo de referência 2 como antigénio, apreciou-se a reactividade de Anticorpo-! pela mesma maneira mencionada antes em (a). Os resultados estão indi eados na Figura 8. Ho desenho, o número 1 indica uma concavidade, o número 2 indica uma ranhura para o Anticorpo-I e o número 3 indica uma concavidade para um soro de um coelho normal. Como se mostra no desenho, observa-se uma linha de sedimentação apenas r>o Anticorpo-I.

(f) Avaliou-se a formação de rosetas pela nes^a ”’aneira que

no exemplo de referência 4, mas utilizando 100 ytl de Articorpo-I diluído quatro vezes com solução-tampão de fosfato (PBS) em vez do soro do paciente. Os resultados obtidos estão indicados na Figura 9. _)<v

(g) Adicionou-se 100 ytl de uma solução de Anticorpo-I diluída 700 vezes com uma solução-tampão de fosfato (PBS) a 100 yul de uma solução, em PBS, de Receptor 1 obtido no exemplo de referência 2 tendo uma concentração apropriada. Após reacção a 37°C durante 90 minutos, adicionou-se 3 * 10 células Daudi/ΰ,Ι ml de meio RPMI-l64o e ef ectuou- se a incubação à temperatura ambiente durante 60minutos.Lavou-se as células, tres vezes, mediante centrifugação (1.000 rpm, 10 minutos) com o meio RPUI-l64o. Suspendeu-se as células novamente em 100 ytl do meio referido antes e avaliou-se a formação de rosetas pela mesma maneira que no εχθηρίο de referência 4. Os resultados estão indicados na Figura 10, em que se ob31

, serva um efeito bloqueador da ligação com o receptor

de lectina.

Exemplo de referência 9

(a) A 2 ml de Anticorpo-ΙΠ obtido no exemplo de referência 7, adicionou-se Uma solução aquosa 0,4' de carbonato de hidrogénio e sódio contendo 5 g/l5 •"l de bromocyan Sepharose (Pharmacia Co.) e 0,5M de cloreto de sódio (pH 8,3) e agitou-se a mistura resultante, durante 2 horas, para se obter um veículo insolúvel de anticorpo de GRA .

(b ) Obteve-se u·” veículo ins j1úv<"1 de anticorpo de GRA pela mesma maneira descrita antes e- (a) utilizando Anticorpo-I obtido no exemplo de referência 6.

Exemplo 1

(1) Homogeneizou-se cerca de 4-0 g (peso ''lívido) de células KATO-III em 50 ml de solução-tampão de fosfato (PbS) utilizando um moinho (misturador Naring). Adicionou-se o precipitado obtido mediante separação centrífuga (100.000 x g, 1 hor^¹), agitando a 50 ml de uma solução-tampão Ο,ΟΙΜ de tris-ácido clorídrico (pll 7>6) contendo 2 % de Triton 1-100 e 0,5 ml de cloreto de sódio. Introduziu-se o líquido sobrenadante, obtido ™ediante separação centrífuga (100.000 x g, 1 hora), em uma coluna (diâmetro. 0,8 cm; comprimento: 15 cm) de anticorpo de GRA-Gepharose Z~o veículo obtido no exemplo de referência 9-(a)_7 equilibrada com uma so ução-tampao Ο,ΟΙΜ de tris-ácido clorídrico (pH 7,6) contendo 0,015 de Triton X-100 e 0,l5M de cloreto de sódio. Após lavagem cora a mesma solução-tampão, ciui-se com a -es-a solução-tampão contendo O,1M

z

de lactose e dialisou-se o liquido eluido com uma solução aquosa de clore to de sídio a 0,85 λ para se obter U”a solução de A-GRA. Quantidade de proteína; 0,45 mg.

Quantidade de sacáridos: 0,12 mg, De

aqui em diante, sera designado por "GRA-l".

(2) Obteve-se uma solução de A-GRA de acordo com a mesma técnica descrita antes em (l), mas utilizando 20 g de células BT-1 em vez das células EATO-III e um veiculo obtido no exemplo de referência 9-(b) como coluna de anticorpo de GRA-Sepharose. Quantidade de proteína: 230 ytg. Quantidade de sacarido: 40ytg. De anui em diante, será designado por "GRA-2”.

(3) Depois de lavada uma coluna de 5 ml de um excipiente obtido no exemplo de referência 9“(a) com uma solução-tampão 0,01M de tris-acido clorídrico (solução de lavagem tendo pH 7,6) que contem 0,015 % de Triton X-100, deixou-se escorrer o receptor 2 obtido no exemplo de referência através dela em uma quantidade de 350 ytg

X Z

como proteina para efectuar a cromatografia de afinidade. Apos lavagem com uma solução de lavagem, deixa-se escoar 30 ml de lacto

Z λ» « X

se através da coluna. A fracçao eluida e de aqui em diante, designada por GRA-3 (quantidade de proteina: 164 y^tg) . Apos lavagem ulterior, elui-se com uma solução-tampão de 0,2F de ácido clorídrico-glicina (pH 2,7). A fracção eluida é, de aqui em diante, designada por GRA-4 (quantidade de proteína: 97 Jztg).

Os modelos de electroforese de dodecil-sulfato de sódio (SDS) de cada fracçao obtida como se descreveu antes, realizados pela mesma maneira descrita nos exemplos de referência 2 a 9, estão indicados na Figura 11.

A Figura 11 mostra modelos de coloração por um método de Azul Brilhante de Coomassie (O.B.B.), em que cada numero tem o significado seguinte:

1 - Receptor 2

2 - GRA-3

3 - GRA-4

Exemplo 2

En um banho-Maria fervente, aqueceu-se ε 100°C, durante 10 minutos, soro fisiológico contendo 100 ytg, como proteína, do Receptor M-3, obtido no exemplo de referência 2, para se obter um antigénio termicamente desnaturado. De aqui em diante, será desig nado por "GRA-M-3-H". Ajustou-se o antigénio de maneira a ter uma concentração de 10 ^tt-g de proteína/ml e manteve-se a 4°C.

Exemplo^ 3 a 13

Obteve-se o GRA desnaturado termicamente indicado no Quadro 7 a seguir pela mesma maneira referida no exemplo 2, mas utilizando, em vez de Receptor-M-3, os receptores de lectina obtidos no exemplo de referência 2 e o A-GRA obtido no exemplo 1.

Quadro 7

Exemplo

M³ Matéria-prima

Condições de aquecimento

Antigénio Desnaturado Termicamente

3	Receptor	1	100°C,	20	minutos	GRA-1 -H-l
4	It	1	1OO°C,	10	minutos	GRA-l-H-2
5	n	2	90°C,	20	minutos	GRA-2-H
6	u	4	120°C,	5	minutos	GRA-4-H
7	II	6	1OO°C,	10	minutos	GRA-6-H
8	K	8	100°c,	10	-inutos	GRA-8-H
9	11	3-c	110°G ,	10	minutos	GRA-3-C-H
10	GRA-1		100^úc,	10	minutos	GRA 1-HA
11	GRA-2		100°C,	10	minutos	GRA-2-HA
12	GRA-3		100°c,	10	minutos	GRA-3-HÁ
13	gra-4		I2o°c,	5	minutos	GRA-4-RA.

Exemplo de referência 10

(Preparação de Linfócitos)

(1) Linfócitos de sangue periférico humano (PBI, humano)

Submeteu-se, a centrifugação com "Ficollpack" (fabricado por Pharmacia Japan Co.), 5° ml de cada uma das amostras de sangue obtidas mediante recolha, com heparina, a partir de uma pessoa saudável ou de pacientes com diversos tipos de cancro para se

π

obter 5 x 10 células de linfócitos de sangue periférico.

(2) Linfócitos do baço do murganho

Retirou-se o baço de um murganho C57BL/6 (macho, seis semanas) e lavou-se, duas vezes, com o meio RPMI-'ι 64o. Depois de desfeito com uma agulha de injecção, o baço foi filtrado através de um peneiro de aço inoxidável (vo ÍOO) para eliminar os fragmentos grandes. Após separação das células mediante filtração, lavou-se estas duas vezes com o meio referido antes e centrifugou-se a

1.200 x g, durante 10 minutos, para se obter 4 x 10? linfócitos do F

baço. ’

Exemplo de referência 11

(1) Ajustou-se os linfócitos de baço de murganho obtidos no exemplo de referência 10-(2) com 0 meio do RPMl-lóko contendo lí> % de FCS de maneira a obter-se 2 x 10° eélulas/ml, e adicionou-se o GRA-M-3-H obtido no exemplo 2 até se atingir um teor de proteína final de 5, 25, 50, 100, 2^0, 500 ou 1.000 ng/ml. Após incubação a 37°C em um incubador com anidrido carbónico gasoso durante 24 horas, lavou-se as células, duas vezes, com o meio citado antes para se obter células-assassinas. Ajustou-se depois com o meio anteriormente referido até se obter uma concentração de 2 x 10 células/ml.

(2) Determinou-se acitotoxicidade das células-assassinas obtidas antes e· (1), en relação a células cancerosas, de acordo com "Single Cell Cytotoxic Assay" Z" "The Journal of Immunology", Vol.

128, 6, pág. 2514-2521 (1982),7. Isto é, utilizou-se células

4.

LLC como células-alvo. Depois de lavadas, misturou-se 5 x 10 de.s ç

tas células e 2,5 x 10 células das celulas-assassinas anteriormen te descritas (E/T - 5) com 0,2 ml do meio RPFl-lõ4o contendo 10 % de FCS. Após incubação a temperatura ambiente durante 5 minutos, centrifugou-se a mistura a 1.JO0 rpm, durante 5 minutos, e adiciortou-se 1 ^a de Agarose de maneira a conseguir-se u^a concentração final de 0,5 /· Sobre Uma caixa de Petri contendo 1 ^e! de Agarose, colocou-se as células referidas antes, misturou-se ligeira-ente e incubou-se a 37°C durante 1 hora. Após adição de 0,5 ml de Azul Trypan a 0,2 /, deixou-se ficar e - repouso durante 10 minutos e, em seguida, lavou-se duas vezes com soro fisiológico. Contou-se o númpro de células-alvo mortas a que estava ligada a célula-assasina (A) em ura microscópio de contraste de fase inversa e calculou-se a citotoxicidade 'das células-assassinas em Relação ãs células cancerosas a partir da fórmula seguinte;

Citotoxicidade (/) -___^A ____

número total de células-alvo

Os resultados estão indicados na Figura 12. *’esta Figura 12, a ordenada indica a citotoxicidade e a abcissa indica a quantidade de proteína (concentração) de JRA-F-3-H utilizada quando se produz as células-assassinas. Indica-se ainda, como testn-urLa, os resultados obtidos em uma determinação e” que se utiliza linfócitos obtidos pela® mesmas técnicas que (1) sem _Se utilizar uRA-'"-3-H. A citotoxicidade da testemunha foi de 10,7 /.

Como se mostra na Figura 12, o antigénio desnaturado ter36

_ micamente de acordo com a presente invenção é eficaz entre limites muito afastados porque depende pouco da concentração quando forma imunidade mediada por células (indução de células-assassinas) e deverá entender-se que tem Um efeito considerável.

Exemplo de referência 12

(1) Adicionou-se soro fisiológico a GRA-M-3-P de maneira a obter-se um teor de proteína de 100 mg/"·!. De aqui e” diante, será designado por "Agente Anti-canceroso wa i".

h.

(2) Injectou-se 1 x 10 células TLC provenientes de um murganho C57BL/6 em um outro murganho C57BL/6 (Charles River, macho, 5 semanas), na veia da cauda. Depois de 3, 6 ou 0 dias a partir da injecção, administrou-se o Agente Anticanceroso pa 1 descrito antes, ao animal, em Uma quantidade de 1 ml/murganho/dia, através de uma veia da cauda, durante 3 dias. Após 22 dias a injecção das células LLC, retirou-se o pulmão e observou-se visualmente a presença ou a ausência de LLC implantadas sobre o pulmão e pesou-se este. Como testemunhas, utilizou-se um grupo a que não se administrou o

Γ

agente anti-canceroso e murganhos normais. Os resultados estão indicados no Quadro 8. Confirmou-se, a partir do Quadro 8, que a administração do antigénio desnaturado termicamente, de acordo com a presente invenção, causa nitidamente a rejeição do tumor ou a supressão do seu crescimento.

QuaQuadro 8

Dia da

administração

(dia)

^Henhuma administração

3, 4, 5

6, 7, 8

>, 10, 11

Normal

Murganho ”8	Peso do Pulmão	Presença ou ausência de I/plantação
	(g)
3.	0,42j		+
2	0,305		+
3	0,215		+
4	0,239		+
5	0, 571		+
1	0,194		-
2	0,182		-
1	0,177		-
4	0,3 59		+
5	0,176		-
1	0,273		-
2	0,319		+
3	0,238		-
4	0,199	r	-
5	0,225	+
1	0,203		-
2	0,174		-
3	0,185		-
4	0,200		-
5	0,192		-
1	0,181		-
2	0,183		-
3	0,170		-
4	0,177		-
5	0,175		-

38

Exemplo de referência 13

(1) Ajustou-se linfócitos de sangue periférico obtidos pela mesma maneira que no exemplo de referência 10-(1) a partir de um paciente (células pequenas do cancro do pulmão, homem, 67 anos de idade), com 0 meio RPMI-l64o contendo 15 % de FC8, de maneira a obter-se uma concentração de 2 x 10 células/ml e adicionou-se GRA-ó-H obtido no exemplo 7 até um teor final de proteína de

100 ng/ml. Após incubação a 37°C, em um incuoador de anidrido carbónico gasoso, durante 24 horas, lavou-se os lirfócitos, duas vezes, com o meio referido antes para se obter céluias-assassinas* Adicionou-se o mesmo meio 4s células de maneira a obter-se uma população de 2 x 10^ células/ml.

(2) Avaliou-se a citotoxieidade das células-assassinas mencionadas antes em relação a células carcerosas, utilizando QG90, que é uma estirpe incubada de u^a célula pequera do cancro do pul mão do mesmo tipo do do paciente, co-o células-alvo. Isto é, in cubou-se QG90 sobre uma microplaca com 96 cavidades de fundo plano para que se multiplique até formar uma. mono-pímada que é utilizada como células-alvo. A estas células, adicionou-se lentamente, gota a gota, 100 μΧ das célules-assassinas referidas antes e efeç tua-se a incubação durante 1 hora. Após eliminação do líquido sobrenadante, adicionou-se 5 ytl de uma solução de ^osina a 5 * para secar as células que são depois deixadas em repouso durante 3 minu tos. Após coloração, lavou-se as células, 5 vezes, com 0 meio RPMI-l64o contendo 10 / de FCS_t Depois, contou-se 0 número de células cancerosas mortas por cada cavidade mediante observação microscópica. Os resultados estão mencionados na Fisura 13 em que a ordenada indica o número de células cancerosas mortas. Utiliza-se ainda, co^o testemunha, linfócitos obtidos pelas mesmas técnicas descritas antes em (1) sem se utilizar GRA-6-F.

39

Pode observar-se, a partir da Figura 13, que o antigénio termicamente desnaturado de acordo com a presente invenção tem uma aetividade de indução muito elevada para as células-assassinas.

Fxemplo de referência 14

Apreciou-se a capacidade de formação de imunidade mediada por células (indução de células-assassinas) do anti-énio desnaturado termicamente de acordo com a presente inverção no corpo vivo, utilizando "^b'acaca fuscata" que é o primata mais próximo de "Homo sapiens".

A saber, administrou-se GRA-ó-H a um macaco Z "Facaca fuscata" (^TTippon Primates Co.)_7, por via intradérmica, em uma dosagem de 200 ng de proteína/macaco. Após 3, 6, 24, 48 e 72 horas a partir da administração, colheu-se 5 ml de sangue de Umg veia femural do macaco, utilizando uma seringa tratada com heparina. Separou-se depois os linfócitos por diferença de densidades, utilizando uma solução de separação de densidades SMF (produzida por JIMRO) e ajustou-se com o meio RPMl-l64í) de maneira a obter-se 2 x 10^ cé lulas/ml. Avaliou-se depois a citotoxicidade doB linfócitos em relação b célula cancerosa. Ffectuou-se este ensaio de aetividade, utilizando células-alvo (QG90) obtidas pela mesma maneira descrita no exemplo 13-(2). Adicionou-s^ igualmpnte, gota a gota, 200 de cada uma das soluções de linfócitos. Após incubação a 37°C em um incubador de anidrido carbónico gasoso, lurante oo mir.utos, efectuou-se a coloração com Fosina e contou-se o nú-ero de células mor tas. 0s resultados estão referidos no Quadro 9 a seguir,no qual o numero de células ~>_ort£s é indicado como uma média + IG por cavidade. Além disso, o tempo de passagem: 0 hora significa uma teste munha em que se utilizou linfócitos que foram colhidos justamrnte artes da administração de GRA-6-H.

Quadro 9

Tempo de passagem (horas)

0

3

6

24

48

72

Niímero de células m

0

37,6 + 10,4 6o, 5 + 13,7 13,0 + 8,8

15,5 + 4,6

s ^úmero de cavi _ dades

3

3 6 6

4 6

Observa-se, a partir do quadro 9, que se forma uma forte imunidade mediada pelas células, no corpo vivo, ^mediante sensibilização com o antigénio desnaturado termicamente de acordo com e presente invenção.

Exemplo de referência 15

Uo exemplo de referência 11-(1), utilizou-se, GRA-8-H, GRA-l-IíA, GRA-2-HA, GRA-3-HA ou GRA-4-TIA, em ve^. de 11A-N-3-H de maneira a ter-se uma quantidade final de 250 ng de proteína/ml e a produzir células-assassinas, respectivamente. São submetidas ao Ensaio Citotoxico de células simples pela mesma maneira referida no exemplo de referência 11-(2) para se avaliar a citotoxicidade da célula cancerosa. Os resultados estão indicados no Q_Ua^_ro iq.

Qua-

Quadro 10

Célula-assassina Citotoxicidade

Sensibilizada com	GRA-8-H	(/) 21,5
n	GRA-1-HA	25,4
H	GRA-2-HA	20,3
n	GRA-3-HA	22,0
ir	GRA-4-Ha	18, ,
Testemunha		10,7

Exemplo de referência 16

(1) Ajustou-se linfócitos de sangue periférico obtidos a par tir de um indivíduo adulto saudável, mediante separação centrífuga em um "Ficollpack" (Pharmacia Co.), com o m_fii₀ Rpl'I-l64o con tendo 10 / de FCS de maneira a obter-se uma concentração de

1,5 x X)6 células/ml. A 10 ml dos linfócitos, adicionou-se GRA-3 para se obter uma concentração de 5, 2 5 ou JO mg de protrína/ml e efectuou-se a incubação a J7°C em u·" incubador JSm anidrido carbónico gasoso, durante 48 horas, para se obter células-assassinas.

Utilizando GRA-4 ou Receptor-2 em vez de GRA-3, obtém-se igualmente células-assassinas. Também se obtém células-assassinas sem utilizar qualquer GRA (Testemunha).

(2) Após duas lavagens das células-assassinas, obtidas antes em (1), com o meio ίϊΓΊ’I-164ϋ (1.000 rpm, lo minutos), ajustou-se aquelas com o mesmo melo contendo 10 % de FCS de maneira a ter-se uma concentracão de 1,5 x 10 células/ml, o que será designado por "células eficazes" (?,.). como células-alvo (l), utilizou-se as que foram obtidas ajustando células Daudi, lavadas duas vezes com

o meio descrito antes, com □ mesmo meio contendo 10 de FCS de ma neira a obter-se uma concentração de 1,5 x 10^ células/ml.

42

Misturou-se 100 yíl de E descrita antes e 100 yd de T. Incubou-se a mistura a 37°c durante 1 hora, pôs-se um tubo de en saio que continha a mistura em água e gelo para Interromper a reacção e contou-se o número de células sobreviventes, efectuando a coloração com Azul Trypan a 0,2 %. Calculou-se a aetividade destruidora de E a partir da fórmula seguinte:

Aetividade destruidora (/) = /7 (Numero de células quando se utiliza E da testemunha)-(Número de células do produto ensaiado) 7 / (E’ + Τ')

em que E' representa o número de células sobreviventes após Incubação de 100 £1 de E a 37°C durante 1 hora. Τ' representa o nú mero de células sobreviventes após incubação de 100 yil de T a 37°C durante 1 hora. Os resultados estão indicados no Quadro 11.

Quadro 11

Aetividade destruidora (Ό

Concentração (ng proteína/ml)

Célula	Eficaz	50	25	r;	^;'édia
Grupo de	GRA-3	10,7	20,4	29,5	20,2
Grupo de	GRA-4	18,5	13,1	2,4	11,3
Grupo de	Receptor-2	i5,o	10,3	15,3	13,2

(3) Dopois de avaliada a aetividade destruidora das células assassinas induzidas com GRA-1 e com GRA-2, pela mesma maneira dejs crita antes em (1) e (2), observa-se praticamente a resma actividade que antes.

Exemplo de referência 17

(1)

Dilui-se o GRA-1 obtido no exemplo 1*(1) com soro fisioló-

gico de maneira a obter-se Uma concentração de 15 ytg de proteína/ /ml, que β designado por "Agente Anticanceroso ^>T3 2".

(2) Cortou-se uma massa de tumor de WI, em condições assépticas, para se obter cubos de 5 mm de lado. Implantou-se estes sobre a derme das costas de 10 murgarhos C3H/He (machos, 7 semanas de idade), respectivamente. Decorridos 7 dias, observou-se o desen volvimento e a fixação do tumor. Em 5 murganhos, o Agente Antican ceroso »iõ 2 obtido antes em (1) foi introduzido, -“diante administração por via subcutânea, em uma quantidade de 300 ydl por dia,de 2 em 2 dias,Os outros 5 murganhos foram utilizados como testemunhas rão-tratadas.

Apos 10 dias a seguir a primeira administração, removeu-se os tumores mediante operação e determinou-se o seu volume médio. Como resultado, verificou-se que o grupo-testemunha tinha um volume médio de 142, 5 mm3 enquanto o grupo de administração tir,ha um volume médio de 18,7 mm3, confirmando-se,deste modo, um efeito de redução dos tumores.

Rei-

Claims

Reivindicações

1, - Processo de preparação de um antigénio associado a

uma cadeia glucosídica, termicamente desnaturado, derivado de células cancerosas, que contêm um receptor de lectina isolado a partir da membrana da célula cancerosa, o qual pode ligar-se a uma lectina com ligação à galactose terminal e/ou à N-acetilgalactosamina terminal, e/ou um componente da membrana de uma célula cancerosa que tem a propriedade de se ligar a um anticorpo capaz de se ligar ao receptor de lectina, estando o receptor de lectina e o componente da membrana de uma célula cancerosa termicamente desnaturados, contendo o antigénio associado a uma cadeia glucosídica termicamente desnaturado uma porção proteica termicamente desnaturada e uma porção sacarídica não desnaturada termicamente, caracterizado pelo facto de se separar um componente da membrana celular de células cancerosas com uma lectina ligada ã galactose terminal e/ou ã N-acetilgalactosamina terminal para se obter um receptor de lactina, ou com um anticorpo capaz de se ligar a um receptor de lectina isolado a partir da membrana da célula cancerosa que pode ligar-se a uma lectina com ligação â galactose terminal e/ou à N-acetilgalactosamina Jterminal para se obter uma fracção que tem afinidade com um reagente da ligação à galactose terminal e/ou à N-acetilgalactosamina terminal, de se isolar o receptor de lectina e/ou a fracção para se obter um antigénio associado a uma cadeia glucosídica e de se aquecer o antigénio associado a uma cadeia glucosídica assim obtido.
2. - Processo de preparação de um componente que tem a propriedade de se ligar a um anticorpo que ê capaz de se ligar a um receptor de lectina capaz de se ligar a uma lectina ligada â galactose terminal e/ou â N-acetilgalactosamina terminal, caracterizado pelo facto de se tratar um componente da membrana e uma célula cancerosa com um anticorpo que é capaz de se ligar a um receptor de lectina capaz de se ligar a uma lectina com ligação ã galactose terminal e/ou ã N-acetilgalactosamina terminal.
3.Processo para a preparaçao de um agente anticanceroso, caracterizado pelo facto de se combinar um antigénio associado a uma cadeia glucosídica termicamente desnaturado, derivado de células cancerosas, que contém um receptor de lectina isolado a partir da membrana da célula cancerosa, o qual pode ligar-se a uma lectina com ligação ã galactose terminal e/ou à N-acetilgalactosamina terminal, e/ou um componente da membrana de uma célula cancerosa que tem a propriedade de se ligar a um anticorpo capaz de se ligar ao receptor de lectji na, sendo o receptor de lectina e o componente da membrana da célula cancerosa desnaturados termicamente, e contendo o antigénio associado ã cadeia glucosídica termicamente desnaturado uma porção proteica termicamente desnaturada e uma porção sacarídica não desnaturada térmica mente, como ingrediente activo, com os agentes auxiliares de formulação apropriados e, eventualmente, com outros agentes antimicrobianos e/ou anticancerosos.