PT1425295E - Peptídeos mofificados e sua utilização no tratamento de doenças auto-imunes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PEPTÍDEOS MOFIFICADOS E SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTO-IMUNES"

Referência Cruzada a Aplicações Relacionadas O presente pedido de patente reivindica prioridade do pedido de patente provisório com o número de série 60/317,737, depositado em 6 de Setembro de 2001.

CAMPO DA INVENÇÃO O objecto da presente invenção encontra-se direccionado para composições e métodos de tratamento de doenças auto-imunes, principalmente de doenças em que é possível demonstrar que o processo de auto-imunidade contribui para a patogénese das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Doenças Auto-imunes É possível olhar para estas doenças como se formassem um espectro. Por um lado, temos "doenças específicas em órgãos" com auto-anticorpos específicos de órgãos. Um exemplo é a doença da tiróide de Hashimoto (tireoidite de Hashimoto). Nesta doença, regista-se uma lesão específica na tiróide, a qual envolve infiltração por células mononucleares (linfócitos, histiócitos e células plasmáticas), destruição de células foliculares e formação de centro germinal, acompanhada de produção de anticorpos circulantes com especificidade absoluta para determinados constituintes da tiróide. Mais para o centro do espectro encontram-se disfunções em que a lesão tende a localizar-se num único órgão, não sendo os anticorpos específicos do órgão. Um exemplo típico desta situação seria cirrose 2 biliar primária em que o pequeno dueto biliar é o alvo principal de infiltração de células inflamatórias. No entanto, os anticorpos do soro presentes, na sua maioria mitocondriais, não são específicos do fígado.

Lupus Eritematose Sistémico (LES)

Por outro lado, temos doenças "não específicas de órgãos" ou de "auto-imunidade sistémica" que pertencem, na sua maioria, à classe de doenças reumatológicas, exemplificadas pelo lúpus eritematose sistémico (LES), em que tanto as lesões como os anticorpos não se restringem a um único órgão.

As modificações patológicas são generalizadas e são primeiramente lesões do tecido conjuntivo com necroses fibrinóides. Estas são visíveis ao nível da pele (a lesão cutânea em forma de borboleta do "lúpus" que aparece na face é uma característica), dos glomérulos renais, das articulações, das membranas serosas e dos vasos sanguíneos. Mais ainda, os elementos que formam o sangue são frequentemente afectados por estas modificações. É encontrada uma colecção bizarra de auto-anticorpos, alguns dos quais reagem com o ADN e de outros constituintes nucleares, de toda as células do corpo. 0 LES afecta principalmente as mulheres e é mais comum entre os nativos de raça negra. Embora as taxas de sobrevivência tenham aumentado, mais de metade dos doentes com LES apresenta lesões permanentes em um ou mais órgãos. A artrite e manifestações cutâneas são as mais comuns. No entanto, as manifestações renais, hematológicas e neurológicas contribuem grandemente para a morbidade e mortalidade. 3 A patof isiologia do LES não é ainda entendida na sua totalidade. A produção de anticorpos anormais pelas células B continua a ser o sinal do LES.

Alguns dos auto-anticorpos, tais como anti-ADN de cadeia dupla e anti-Smith, são muito específicos para o LES. Outros anticorpos, incluindo o anti-RNP, o anti Rho e o anti-La, encontram-se igualmente presentes em outras doenças auto-imunes. Em que medida é que as próprias células B são intrinsecamente anormais ainda é objecto de pesquisas actuais. Um dos defeitos subjacentes do LES pode centrar-se na apoptose, ou morte celular programada. Em doentes com LES, os antigenes celulares expostos durante a apoptose incitam a uma resposta imune.

Exemplos de outras doenças importantes que se consideram como associadas à auto-imunidade incluem: mixedema primário, anemia perniciosa, doença de Addison, miastenia grave, diabetes juvenil, púrpura trombocitopénica idiopática, colite ulcerosa, esclerose múltipla, artrite reumatóide e esclerodermia.

Foi sugerida a existência de uma rede preexistente ligada a epitopos de antigenes específicos e o mau funcionamento da mesma. A técnica anterior apresenta peptídeos ou proteínas que sofrem modificações pós-translacionais tais como fosforilação (DD 205 340 A), acetilação (DD 240 831 A) ou acetilação e succinilação (US-A-5 527 688). 4 A técnica anterior apresenta a utilização de polipeptídeos modificados para o tratamento do LES. 0 pedido de patente internacional WO 00/20583 A explica que os peptídeos análogos aos resíduos 282-328 de aminoácido da proteína ribonuclease nuclear pequena UI humana de 70Kd (snRNP70) podem ser utilizados para o tratamento de doenças auto-imunes, tais como o LES. US-A-5 561 222 apresenta peptídeos derivados do snRNP70 que são auto-antigénicos para doentes com LES. US-A-5 541 291 explica que o snRNP70 é útil para o diagnóstico e tratamento de doenças auto-imunes, incluindo O LES. O pedido de patente internacional WO 95/25124 A explica que uma sequência de aminoácidos derivada do snRNP 70k é um auto-antigene, o qual pode ser utilizado numa composição farmacêutica no tratamento de doenças auto-imunes tais como o LES. Thiessen H et al. (EMBO J. 1986, vol. 5, no. 12, páginas 3209-3218) refere que os peptídeos antigénicos de snRNP70 são reconhecidos pelos anticorpos, sendo que estes são encontrados em doentes com LES. A técnica anterior apresenta a proteína ribonuclease pequena Ul 70 Kd, que contém uma sequência imunogénica RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY.

No entanto, nenhum destes documentos sugere a modificação da sequência imunogénica.

Uma desregulação de apoptose, por exemplo na fase de execução, ou na fase de eliminação de material apoptópico por fagócitos scavanger (macrófagos polimorfonucleares 5 neutrófilos), pode dar origem a uma predisposição, por parte dos doentes com história genética apropriada, para determinada intolerância relativamente aos antigenes associados às células e emergência de auto-imunidade. Uma questão importante é identificar qual(quais) o(s) antigenes(s) e qual(quais) o(s) epitopos que poderão ser relevantes no inicio do processo de auto-imunização. As proteínas que suportam estes auto-epitopos encontram-se presentes in vivo e é possível identificar as mesmas assim como o(s) epitopo(s) relevante(s).

Definições:

Peptídeo modificado: modificação química de um ou mais resíduos de aminoácidos que constituem o peptídeo tais como, mas não limitados a, fosforilação, acetilação e metilação; a modificação deve permitir o reconhecimento do peptídeo modificado como um antigene pelas células apresentadoras de antigene (antigen-presenting cells APC's), e, neste contexto, pelas células CD4+T auto-reactivas direccionadas para o peptídeo que ocorre naturalmente, ou que é possivelmente modificado naturalmente (se a modificação ocorrer de forma natural na posição aminoácida específica uma vez que o peptídeo existe na célula).

Ligantes de Peptideos Alterados (LPA): peptídeos reconhecidos como antigenes pelas APCs e, no contexto da presente invenção, pelas células CD4+T, com capacidade de produzir uma cascata de eventos diferentes dos que ocorrem de forma natural (por exemplo, estimular outras células, produzir citocinas diferentes, diferenciar o sinal, etc.); o que pode levar a uma diminuição significativa ou até a uma cessação completa da resposta auto-imune deleteriosa. 6 Lúpus eritematoso sistémico (LES) : síndrome de etiologia multifactorial caracterizado por inflamação generalizada nos seres humanos; no LES, as defesas naturais do corpo contra a infecção reagem contra o corpo através da produção de anticorpos contra as próprias células do corpo; estes anticorpos lutam contra as células sanguíneas, órgãos e tecidos, dando lugar a doenças crónicas.

Epitopo: aquela parte do antigene reconhecido por um receptor antigene.

Apoptose: forma de morte celular programada caracterizada por digestão endonuclear de ADN.

Foi proposta a existência de uma rede preexistente ligada aos epitopos de antigenes específicos, alertando para o facto de que o mau funcionamento desta rede pode produzir estados de doença auto-imune. Foram feitas sugestões em que os análogos de peptídeos que se irão ligar à molécula de MHC apropriada e bloquear a resposta a auto-antigenes podem ser utilizados para desligar uma resposta auto-imune em curso. Esta forma de procedimento apresenta algumas desvantagens, as quais incluem insuficiência de defesa microbiana e a necessidade de doses elevadas de peptídeos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Numa realização da presente invenção, esta apresenta um peptídeo modificado que correspondendo à SEQ ID NO: 1 RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 1], em que o S na posição 7 e/ou posição 10 é modificado por meio de fosforilação. 7

Numa outra realização alternativa, a presente invenção apresenta um peptídeo modificado tal como acima descrito, em que o S na posição 7 e/ou posição 10 é modificado por meio de fosforilação e o K na posição 8 e/ou posição 12 é modificado por meio de acetilação. A presente invenção apresenta o peptideo modificado tal como acima descrito, em que o S na posição 10 é modificado por meio de fosforilação.

Numa segunda realização, a presente invenção contempla uma composição farmacêutica em forma de dosagem unitária, que compreende, em combinação, um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz de pelo menos um peptideo modificado tal como acima definido. De preferência, o peptideo será RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 1] quimicamente modificado. Mais preferencialmente, o peptideo modificado de SEQ ID NO: 1 será quimicamente modificado por qualquer combinação da fosforilação de S em posição 7 e/ou posição 10, e da acetilação de K em posição 8 e/ou posição 12.

Alternativamente, a composição da presente invenção engloba um peptideo modificado de SEQ ID NO: 1 em que o peptideo é quimicamente modificado por meio de fosforilação na posição 10. Num aspecto desta realização, a presente invenção apresenta uma composição, a qual se encontra sob a forma de losangos, comprimidos, cápsulas de gelatina, gotas, pílulas, ou lipossomas.

Alternativamente, a composição encontra-se sob forma de uma solução. A invenção inclui igualmente a utilização de um peptideo modificado tal como acima descrito, para a preparação de uma medicina para o tratamento de doenças auto-imunes. Ainda numa outra realização alternativa, a presente invenção inclui um método para tratamento de doenças auto-imunes, o qual compreende a fase de administração, a um doente que necessite de tal tratamento, de uma composição farmacêutica que inclua um peptideo modificado preparado de acordo com a presente invenção em quantidade suficiente para se realizar o tratamento desejado. Mais ainda, a invenção envolve igualmente a utilização de um peptideo modificado tal como acima descrito, para a preparação de um medicamento para o tratamento do lúpus eritematoso sistémico. A presente invenção contempla um método para tratamento do lúpus eritematoso sistémico, o qual inclui a administração, a um doente que necessite de tal tratamento, de uma composição farmacêutica que inclua um peptideo modificado de acordo com os ensinamentos e explicações da presente invenção em quantidade suficiente para se realizar o tratamento em questão. A presente invenção apresenta igualmente um peptideo modificado que é o produto da modificação química de pelo menos um dos métodos seleccionados do grupo que consiste em fosforilação, acetilação ou metilação de RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO : 1].

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a prática da presente invenção, descobriu-se que é possível criar uma família de peptídeos modificados, em que os epítopos terapeuticamente relevantes dos peptídeos foram modificados de modo a transformar os peptídeos em "ligantes de peptídeos alterados" (LPAs). 9

Estes LPAs têm capacidade de actuar como armadilhas nas células T CD4+, deste modo reduzindo drasticamente a sua eficácia imunitária e, consequentemente, a resposta de auto-imune do organismo.

Os LPAs são criados por uma modificação química de um ou mais dos diversos residuos aminoácidos que constituem o peptideo, incluindo, sem limitações, e como forma de exemplo, fosforilação, acetilação e metilação. A modificação deve permitir o reconhecimento do peptideo modificado como um antigene pelas células apresentadoras de antigenes e, neste contexto, por células T CD4+ auto-reactivas direccionadas contra os peptideos que surgem naturalmente ou que são eventualmente modificados. A modificação serve para converter os peptideos em ligantes de peptideos alterados que são reconhecidos como antigenes pelas células apresentadoras de antigenes e, na prática da invenção, pelas células T CD4 +, que funcionam para reduzir, de forma significativa, ou eliminar completamente uma resposta auto-imune deleteriosa.

Mais especificamente, a presente invenção é orientada para um processo que inclui a modificação de um epítopo terapeuticamente relevante de um peptideo reconhecido como um antigene pelas células T CD4+, as quais são responsáveis pela indução de uma resposta auto-imune. Mais ainda, a presente invenção baseia-se nos peptideos sintéticos definidos como "modificados" dos seus epitopos naturais e com capacidade de demonstrar uma actividade eficaz contra doenças auto-imunes, e respectiva preparação. Em particular, a invenção compreende modificações, incluindo a fosforilação de S na posição 7 e/ou 10; a acetilação de K 10 na posição 8 e/ou 12; e qualquer combinação dai proveniente, do peptideo especifico RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY (SEQ ID NO: 1), cujo peptideo é um segmento de 21 aminoácidos da proteína snRNP de 70 kDa, correspondendo a resíduos 131 a 151. A partícula da proteína ribonuclease nuclear pequena U 1 (snRNP) pertence aos auto-antigenes mais complexos, conhecidos por serem reconhecidos nas doenças auto-imunes sistémicas. Esta partícula consiste numa cadeia principal de ARN e de onze proteínas associadas que são imunogenéticas em doentes que sofrem de lúpus eritematoso sistémico e de doença mista do tecido conjuntivo (DMTC). Os anticorpos direccionados contra a proteína de 70 kDa (também denominada Ul 70 kDa ou RNP-68) são específicos da síndrome de Sharp. Até 100% de todos os doentes que sofrem de doença mista do tecido conjuntivo apresentam estes anticorpos.

Para além da proteína 70 kDa e das proteínas Sm, o complexo Ul_snRNP contém igualmente as proteínas A e C. Os doentes que sofrem de LES e de DMTC apresentam anticorpos direccionados contra as proteínas A, C e 70 kDa. Os auto-anticorpos contra as proteínas Sm são de importância patognomónica no diagnóstico do LES. Um doente com um resultado anti- Sm positivo é confrontado com o diagnóstico de LES. No entanto, um resultado negativo não exclui a possibilidade de um diagnóstico de LES. Anti-Sm é detectado em 10% dos doentes caucasianos e 30% em doentes de raça negra e chineses com LES. A descoberta de anticorpos contra a Sm faz parte dos critérios para o diagnóstico do LES da American College of Rheumatology (ACR) publicado em 1982. 11

Mais ainda, as propriedades vantajosas das substâncias da invenção são acompanhadas de toxicidade baixa.

Estas substâncias são particularmente apropriadas para o desenvolvimento de composições farmacêuticas.

Outras caracteristicas e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes a partir do exemplo que se segue relativamente à preparação do peptideo modificado e ao estudo da sua actividade contra uma doença auto-imune. 0 lúpus sistémico apresenta um sintoma clinico fácil de seguir devido à grande quantidade de excreção proteica urinária que acompanha a doença, a qual resulta de uma condição renal associada, a glomerulonefrite. Os níveis da secreção de proteina foram acompanhados de forma a se avaliar da eficácia do peptideo modificado ao se atribuir a doença auto-imune subjacente.

Exemplo 1 0 peptideo específico RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY (SEQ ID NO: 1), o qual é uma sequência de 21 aminoácidos da proteína snRNP de 70 kDa, que corresponde aos resíduos 131-151, foi sintetizado na sua forma fosforilada (na posição 10 - PIO) . Esta auto-proteína, a qual é normalmente encontrada em cada célula, é reconhecida pelas células T e anticorpos de doentes e ratos com lúpus como um antigene, com o qual o sistema imunitário reage, gerando a denominada reacção auto-imune. Após múltiplas administrações (semelhantes a uma vacina) em ratos, o peptideo modificado deu lugar a uma melhoria significativa na taxa de sobrevivência (55% comparativamente a 0%), enquanto que a administração do 12 peptídeo natural (não-fosforilado), e administração do peptideo fosforilado na posição 7, não reflectiram uma melhoria significativa na taxa de sobrevivência. Dados preliminares do peptideo acetilado demonstraram uma actividade ainda mas forte. Mais ainda, o peptideo modificado PIO aumentou igualmente de forma significativa a produção de IL-2 (interleucina-2) pelas células T CD4+ e reduziu a excreção da proteína nos ratos tratados.

As composições farmacêuticas da invenção contêm uma quantidade eficaz de um peptídeo modificado em combinação com um veículo farmacêutico inerte.

Tendo em vista a sua capacidade para bloquear a resposta a auto-antigenes, as composições podem ser utilizadas no tratamento dessas doenças associadas à auto-imunidade, incluindo a artrite reumatóide, doença de Addison, esclerodermia, lúpus eritematoso, miastenia grave, diabetes juvenil e semelhantes.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas de formas diferentes e por vias diferentes, incluindo nasal, rectal, oral e por injecção. No caso de administração oral, recorrer-se-á, em particular, a losangos, comprimidos, cápsulas de gelatina, gotas, pílulas, lipossomas ou solução. Outras formas de administração incluem soluções estéreis ou esterilizadas que podem ser injectadas por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular.

No caso da administração em lipossoma, este método de apresentação pode ser utilizado como uma vantagem ao se encapsular o peptídeo modificado em lipossomas -resistentes 13 ao ácido, para que possa apenas entrar na via MHC de classe 1 e estimular as células T CD8+. Os antigenes existentes no interior dos lipossomas -sensíveis ao ácido acabam por se associar às moléculas tanto de classe I como de classe 11 e apresentam uma elevada eficácia de resposta. Deverá, por conseguinte, ser possível utilizar uma vacina em lipossoma numa única injecção com múltiplas potencialidades, a qual incorpora inúmeros peptídeos modificados, isto é, antigenes, adjuvantes diferentes e moléculas-alvo especializadas para se conseguir realizar o tratamento desejado.

Por motivos práticos e económicos, independentemente da via de administração seleccionada, deverá considerar-se o número mínimo de doses e a quantidade mínima do peptídeo modificado. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Zimmer, Robert <120> Peptídeos Modificados e Sua Utilização para o Tratamento de Doenças Auto-Imunes <130> 945595.015 <160> 1

<170> Patentln Versão 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 14

Arg He His Mec vai Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr 1 5 10 15

Ala Phe Ile Glu Tyr 20

Lisboa, 17 de Março de 2010

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um peptídeo modificado que corresponde a SEQ ID NO: 1 RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 1] em que S na posição 7 e/ou posição 10 é modificado por meio de fosforilação.

2. Um peptideo modificado de acordo com a reivindicação 1, em que S na posição 7 e/ou posição 10 é modificado por meio de fosforilação e K na posição 8 e/ou posição 12 é modificado por acetilação.

3. Um peptideo modificado de acordo com a reivindicação 1, em que S na posição 7 ou posição 10 é modificado por meio de fosforilação.

4. Um peptideo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que S na posição 10 é modificado por meio de fosforilação.

5. Composição farmacêutica em forma de dosaqem unitária, que compreende, em combinação, um veiculo farmaceuticamente aceitável e, pelo menos, um peptideo modificado de acordo com qualquer umas das reivindicações de 1 a 4.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, sob a forma de losangos, comprimidos, cápsulas de gelatina, gotas, pílulas, lipossomas ou solução.

7. Utilização de um peptideo modificado de acordo com qualquer um das reivindicações de 1 a 4, para a preparação de um medicamento para tratamento de uma doença auto-imune.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7 em que a doença auto-imune é o lúpus eritematoso sistémico. Lisboa, 17 de Março de 2010