JPH06507927A

JPH06507927A - 内皮結合のための化合物及び方法

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Publication number: JPH06507927A
Application number: JP4511410A
Authority: JP
Inventors: マグナーニ，ジョン　エル．; ブッチャー，ユージン　シー．; バーグ，エレン　エル．
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Current assignee: Individual
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-17
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2011-03-13
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】内皮結合のための化合物及び方法技術分野本発明は一般に、組織内への白血球の浸透に関連づけられる炎症及びその他の病原性条件に対する治療法を提供するための白血球帰巣の変調；及び内皮付着分子により媒介されるガン転移の阻害：さらに特定的に言うと、内皮に対するこのようなガン細胞結合を中断するサツカリド、複合糖質、抗体、酵素阻害物質及び酵素といったその他の作用物質を使用することによるこのような阻害に関する。

発明の背景血液流は、体内全体を通して移動して状態を監視する数多くの細胞のための経路である。リンパ球系及び骨髄単球性の系列の細胞は、病原体、異常細胞及びいくつかの化合物といった外来性物質を識別し、系からそれらを除去するべく作用する。これらの細胞は、外来性物質から宿主を保護するための様々なメカニズムを利用できるようにしている。これらのメカニズムのうちの多くはきわめて破壊性が高く、未変性組織の細胞障害作用、炎症、劣化などの結果をもたらす。メカニズムには、スーパーオキシドの産生、ツク−フォリンといったさまざまな分解性化合物の分泌、エンドサイト−シスなとが関与している。

数多くの状況において、これらの保護メカニズムは健康的なものであるものの、心筋炎、炎症性腸疾患、乾癖、アレルギー性接触性皮ふ炎、扁平苔癖、皮ふ内リンパ球様過形成、滑液炎症、再潅流損傷といった炎症性患部が関与する有害な効果をこれらのメカニズムがもたらすことがわかっている状況もある。

最近になって、移動細胞がその帰巣又は特定の部位に対して誘導されていることに関連した特異的表面膜タンパク質を有することが立証された。高い内皮細静脈を含む専門化された細静脈は、これらの細胞にとってのビーコンとして役立ち、「帰巣レセプタ」に結合する内皮白血球付着分子及びアトレシンと呼ばれるタンパク質、又は移動細胞の付着分子表面膜タンパク質を発現する。細静脈への結合の後、細胞は血管外遊出により未知のメカニズムによって炎症又は損傷部位まで移動する。炎症部位内への移動細胞の浸透と関連する又はこの浸透によって悪化する疾症の治療及び予防における現行のアプローチにおける問題点のため、当該技術分野においては、細胞の浸透を阻害するための改良された化合物及び方法に対するニーズが存在する。本発明はこのニーズを満たし、しかもさらにその他の関係する利点をも提供するものである。

このような関係利点の１つは、ガンに関わるものである。金銭的及び人的な資源の多大な投資にもかかわらず、ガンは、主要な死亡原因の１つであり続けている。現行のガン治療法は、悪性腫瘍か発生した患者の約５０パーセントしか治ゆしてくれない。はとんどのヒト悪性腫瘍において、転移が主要な死亡原因である。

転移というのは、離隔した部位における二次的な腫瘍コロニーの形成のことである。これは、腫瘍の侵入を早期事象とする多段階プロセスである。腫瘍細胞は、内皮基底膜といった宿主細胞内に局所的に侵入して、間隙性間質に達し、ここでこれらの細胞は、血管（「血行性転移Ｊ）又はリンパ流路に入ってさらに播種することができるようになる。血管壁の内皮層に侵入した後、循環する腫瘍細胞は循環内に追い出され、内皮細胞管腔表面又は露出された基底膜への付着によって標的器官の毛細血管前線静脈の中で阻止される。

腫瘍細胞は再び血管壁に侵入して器官の実質に入る。最後に、管外遊出した腫瘍細胞は、それが由来した場所とは異なる組織内で成長する。

はとんどのガン細胞は、循環内で生きのびることができず、通常、血管の被覆が腫瘍細胞の管外遊出の障壁として作用すると思われる。

内皮損傷又はその外乱は、腫瘍の転移を増大させる。さらに、サイトカインといったいくつかの因子が、インビトロでの治療された内皮に対するガン細胞の付着を実質的に増大させるということもわかっている。サイトカインであるインターロイキン１　（ＩＬ−］、）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は各々、ＥＬＡＭ−１（内皮白血球付着分子）と呼ばれる細胞表面レセプタの生合成及び発現を刺激する。ＥＬＡＭ−１は、ＬＥＣＡＭ−１及びＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭ又はＣＤ６２としても知られている）を含むセレクチン又はセレクチンとして知られているカルシウム依存性細胞付着レセプタの一群の仲間である。炎症性応答の間、内皮細胞上のＥＬＡＭ−１は、白血球のための「帰巣レセプタ」として機能する。

最近になって、内皮細胞上のＥＬＡＭ−１は、サイトカインで処理された内皮に対する結腸ガン細胞の付着の増大を媒介することがわかっている（Ｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ｂｅｕｉｌａｃｑｕａ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：１３０３−１３０６．１９８９）。

大部分のヒト悪性腫瘍において、遠隔転移は往々にして、−次腫瘍か治療される時点て検出されるにはあまりにも小さすぎる。その上、転移コロニーの広範にわたる初発は、通常、転移疾患の臨床的症状か明らかになる前に起こる。転移における大きさ及び年令の変動、その解剖学的散在性及びその異質組成が全て、外科的削除を妨げ、転移コロニーへと送り出されうる抗ガン剤の濃度を制限している要因である。例えば１９９１年には、米国のみで結腸直腸ガンだけから１５０．０００Å以上の新患６００００Å以上の死亡があるだろうと見積られている。

転移の治療及び予防に対する現行のアプローチの問題点のため、当該技術分野においては、内皮付着分子により媒介される転移を阻害するための改良型化合物及び方法に対するニーズが存在する。本発明はこのニーズを満たし、さらにその他の関係する利点を提供してくれるものである。

発明の要約簡単に言うと、本発明は、血液からの白血球退出部位としての内皮細胞に対するセレクチンが関与する白血球結合を変調するための化合物を提供する。これらの化合物は、セレクチンＥＬＡＭ刊又はその他のセレクチンに対する結合をその特徴とし、少なくとも部分的にポリペプチド以外のものであり例えば皮ふリンパ球関連抗原又はＬＥＣＡＭ−１などの帰巣レセプタと結びつけられた天然のポリペプチドを実質的に含んでいない。これらの化合物は、白血球特にリンパ球が炎症部位に帰巣するのを阻害するために特に使用される。

もう１つの態様においては、本発明は、白血球又は血小板の内皮細胞に対する結合を変調するための方法において、内皮細胞に対する白血球の結合を変調するのに充分な量で、セレクチン又はその炭水化物リガンドを発現する白血球及び内皮細胞を含む細胞の組合せに対して、セレクチンに対し結合する上でシアリル＝Ｌｅｘ、シアリル−Ｌｅ“又は皮ふ白血球関連抗原と交叉反応性及び／又は競合性をもつことのできる化合物を付加する段階を含み、前記セレクチンがＥＬＡＭ− ］である場合この化合物がシアリル−Ｌｅ”以外のものである方法を提供している。１つの実施態様においては、この化合物は、少なくとも２つの原子の配座的に制約された鎖を含む基に結合されたシアル酸及びフコピラノースを含んでいる。

もう１つの態様においては、本発明は、宿主の炎症部位内への白血球の浸透を阻害するための方法において使用するためＥＬＡＭ−１゜ＬＥＣＡＭｉ又はＧＭＰ −１４０に結合することのできるＸ及びｙのうち一方が３で他方が４である、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌβＬＸ　［Ｆｕｃα１−ｙｌＧｌｃＮＡｃを含むシアリル−Ｌｅ”以外の化合物又はその誘導体を提供する。もう１つの実施態様においては、本発明は、宿主の炎症部位内へのリンパ球の浸透を阻害するための方法において使用するための、セレクチンに対して結合することのできる、Ｘ及びｙのうちの一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３ＧａｌβＬｘ　［Ｆｕｃα１−ｙｌＧｌｃＮＡｃを含む化合物又はその誘導体を提供している。

さらにもう１つの態様においては、本発明は、内皮細胞に対する血小板の結合を阻止する方法において使用するための、セレクチンに対し結合することのできる、Ｘ及びｙの一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ　Ｂ　ｌ− Ｘ　［Ｆｕｃα１−ｙｌＧｌｃＮＡｃを含む化合物又はその誘導体を提供している。

関係する１つの態様においては、本発明は新規の化合物を提供している。１つの実施態様においては、この化合物は、配座的に制約された鎖を含む基に結合されたシアル酸及びフコピラノースを含む、天然に発生するシアリル−Ｌｅ’又はシアリルＬｅ”抗原以外の化合物を含んている。もう１つの実施態様においては、この化合物は、セレクチンに対して結合することのできる、Ｘ及びｙの一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａ　ｌβｌｘ　［ＦｕｃαＩ−ｙｌＧｌｃＮＡｃを含む、天然に発生するシアリル−Ｌｅ”又はシアリル−Ｌｅ” 抗原以外の化合物又はその誘導体を含んでいる。さらにもう１つの実施態様におし）ては、化合物は、Ｘ及びｙの一方が３で他方か４でありＲがす・ツカリド又はその誘導体といったリンカ−であるＮｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌβＬｘ（ＦＩＪＣαＩ−ｙ］Ｒを含み、拘束された環状化合物といった環状化合物を含み、セレクチンに対して結合できる、シアリル−Ｌｅ”又はシアＩＪルーＬｅ”抗原以外の化合物を含んでいる。

さらに本発明は、内皮細胞付着分子によって媒介されるガン転移の阻害のための化合物及び方法を提供している。１つの態様においては、本発明は、生物学的調製物の中で、ＥＬＡＭ−１といったセレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅ′″、ジ−シアリル−Ｌｅ・又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の結合；或いは又ＥＬＡＭ−１といったセレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅ’又はジ−シアリル−Ｌｅ’を発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法を提供する。一実施態様においては、この方法は、セレクチンを発現する内皮細胞に対する、シアリル−Ｌｅ’　、ジ−シアリル−Ｌｅ”又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の結合を阻害する少なくとも１つの作用物質を用いて生物学的調製物をインキュベートする段階を含み、ここでこの作用物質は、前記悪性細胞がシアリル−Ｌｅ”を発現する場合、シアリル−Ｌｅ”以外のものである。もう１つの実施態様においては、この方法は、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅ”　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル −Ｌｅ”を発現する悪性細胞の結合を阻害する少なくとも１つの作用物質を用いて生物学的調製物をインキュベートする段階を含み、ここでこの作用物質は、前記悪性細胞がシアリル−Ｌｅ”を発現する場合シアリル−Ｌｅ’以外のものである。もう１つの実施態様においては、この方法は、悪性細胞によるシアリル−Ｌｅ”又はジ−シアリル−Ｌｅ’の生合成を阻害する少なくとも１つの酵素阻害物質を用いて、シアリル−Ｌｅ’又はジ−シアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞をインキュベートする段階を含んでいる。さらにもう１つの実施態様においては、この方法は、前記悪性細胞がセレクチンに結合できなくなるようにこの悪性細胞のシアリル−Ｌｅ”又はジ−シアリル−Ｌｅ”を変性する少なくとも１つの酵素を用いて、前記悪性細胞をインキュベートする段階を含んでいる。

本発明は、もう１つの態様においては、定温動物において二次的部位へのシアリル−Ｌｅ’　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の広がりを阻害するための方法において使用するだめの化合物を提供する。一実施態様においては、この化合物は、セレクチンを発現する内皮細胞に対しシアリル−Ｌｅ“、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の結合を阻害する作用物質を含んでいる。血行性転移が関与するもう１つの実施態様においては、この化合物は、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅ’　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の結合を阻害する作用物質を含んでいる。１つの関係態様においては、化合物は、定温動物において二次的部位に対するシアリル−Ｌｅ”又はジ−シアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の広がりを阻害するための方法の中で使用するための化合物が提供される。一つの実施態様においては、この化合物は、悪性細胞によるシアリル−Ｌｅ“又はジ−シアリル−Ｌｅ’の生合成を阻害する酵素阻害物質を含んでいる。もう１つの実施態様においては、この化合物は、悪性細胞かセレクチンに対し結合できないようにシアリル−Ｌｅ’又はジ−シアリル−Ｌｅ’を発現する悪性細胞のシアリル−Ｌｅ“又はジ−シアリル−Ｌｅ”を変性する酵素を含んでいる。

もう１つの態様においては、生物学的調製物の中で、内皮細胞に対するシアリル −Ｌｅ’　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ’″を発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法が提供されている。

一つの実施態様において、この方法は、シアリル−Ｌｅ’及びシアリル−Ｌｅ” の両方と反応することのできる少なくとも１つの作用物質を用いて、セレクチンを発現する内皮細胞を含む生物学的調製物をインキュベートする段階を含んでいる。もう１つの実施態様においては、この方法は、シアリル−Ｌｅ”及びシアリル−Ｌｅ”の両方と反応することのできる少なくとも１つの作用物質を用いて、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞を含む生物学的試料をインキュベートする段階を含んでいる。

もう１つの関係態様においては、定温動物において二次的部位へのシアリル−Ｌｅ”　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞の広がりを阻害するための方法の中で使用するための化合物が提供されている。一実施態様においては、この化合物は、シアリル−Ｌｅ’及びシアリル−Ｌｅ”の両方と反応することのできる作用物質を含んでいる。血行性転移が関与するもう１つの実施態様においては、化合物は、シアリル−Ｌｅ”及びシアリル−Ｌｅ”の両方と反応することのできる作用物質を含んでいる。

本発明のこれらの及びその他の態様は、以下の詳細説明及び添付図面を参照することにより明確になると思われる。

図面の簡単な説明図１は、シアリル−Ｌｅｌ及びシアリル−ＬｅＨについてのモデルの図形表示である。

図２は、ヒトＥＬＡＭ−１でトランスフェクションされたマウス細胞のネオ糖タンパク質に対する結合を評価するのに用いられる細胞結合検定を絵画的に描いている。

図３は、成る種のネオ糖タンパク質に対するヒトＥＬＡＭ−１１−ランスフエクションを受けたマウス細胞の相対的結合をグラフで示している。

図４は、成る種のネオ糖タンパク質に対するヒトＥＬＡＭ−１）ランスフェクションを受けたマウス細胞の相対的結合をグラフで示している。

図５は、可溶性ソアリルーＬｅ”−ＩＳＡによる固定化されたシアリル−１ｅ’ 　ＩＳＡ（ヒト血清アルブミン）に対するヒトＥＬＡＭ−１）・ランスフェクンヨンを受けたマウス細胞の結合の阻害をグラフで示している。

図６は、可溶性シアリル−Ｌｅ’　−ＰＡによる固定化されたシアリル−Ｌｅ’ 　−ＰＡ　（ポリアクリルアミド）に対するヒトＥＬＡＭ−１トランスフェクションを受けたマウス細胞の結合の阻害をグラフで示している。

図７は、ネオ糖タンパク質に対するＬＥＣＡＭ−１）ランスフェクションを受けた細胞の選択的結合をグラフで示している。

図８は、ネオ糖タンパク質に対するリンパ球の結合をグラフで示している。

発明の詳細な説明発明について記述する前に、以下で使用するい（つかの用語の定義について記してお（のが発明を理解する上で有用と思われる。

Ｅ（、ＡＭ−１（ｒＥ−セレクチン」としても知られている）は、血管性セレクチンである。ＥＬＡＭ−１は急性炎症の間好中球を動員するが、慢任炎症中は皮ふ内に選択的に見い出され皮ふ帰巣リンパ球を結合する。すなわち、皮ふ血管アトレシンを倍増させる。

ＧＭＰ−１４０（ｒＧ−セレクチン」としても知られている）は、炎症の早期において好中球及び単球を結合する血管セレクチンである。

これは又、刺激を受けた血小板上でも発現される。

ＬＥＣＡＭ−］　（］ｒＬ−セレクチンとしても知られている）は、好中球、単球なと、急性炎症における管外遊出及び末梢リンパ節及びいくつかの慢性炎症部位に対するリンパ球の帰巣に関与する血管セレＬＥＣ，ＡＭ−１（Ｍｅｌ−１４抗原）と同し又は類似する構造モチーフをもつレクチンであるとして定義づけされる。

アトレシンは、リンパ球帰巣に関与する何らかの組織に特異的な血管付着分子と定義づけされる。末梢リンパ節アトレシン（ＰＬＮ）は、リンパ節帰巣レセプタ（レセクチン）　ＬＥＣＡＭ−１のための糖タンパク質（炭水化物リガンド）である。

本書中で用いている抗体は、モノクローナル及びポリクローナルの両方の抗体を含み、無傷分子、そのフラグメント又はその機能的等何物でありうる。抗体は、遺伝工学的に作ることができる。抗体フラグメントの例には、Ｆ（ａｂ’　）２．　Ｆａｂ’　、　Ｆａｂ及びＦｖがある。

本書で用いるサツカリドはオリゴ糖を含み、天然に誘導されたものでも、合成時に調製されたものでもよく、そのいずれかの一部分てあっても、又そのいずれかの誘導体であってもよい。

ここで使用する複合糖質というのは、脂質又はポリペプチドといった非サツカリド分子にリンケージされたサツカリドを含む。

上述のように、本発明は、１つの実施態様において、白血球特にリンパ球の炎症部位への帰巣の予防的及び治療的変調を提供している。化合物は、内皮細胞又は白血球レクチン付着分子に対する結合によって特徴づけられ、セレクチン群がシアリル−Ｌｅ’″及びシアリル−Ｌｅ・の少なくとも１つのエピトープと交叉反応性をもつ場合にはシアリル−Ｌｅ”以外のものであり、通常少なくとも約３つのサツカリド単１体単位が関与することになる。

利用できる化合物の活性構造は、約５０００以下の分子量を有し、約３０００以下の分子量であってもよく、一般には約８００以上の分子量である。化合物自体は、共通のバックボーン（ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、シクロデキストランなどと重合体鎖）、リポソームなどに結合された活性構造の複数のコピーを有していてよい。ＥＬＡＭ−１，ＬＥＣＡＭ−１又はＧＭＰ−１４０のうち少なくとも１つへの結合に際して前述の交叉反応性の特徴をもち、シアリル −Ｌｅ”又はそのタンパク質複合体以外のものであり、生理学的及び薬物動力学的に受容できるあらゆる化合物を利用することか可能である。これらの化合物は天然に発生するものであっても或いは又合成のものであってもよく、サツカリド、合成有機化合物などであってもよい。

特に有利なのは、糖類シアル酸（ノイラミン酸）、ガラクトース、フコース、又はその誘導体を組合わせてオリゴ糖誘導体を形成したものである。糖果量体は、シアル酸、グルコサミン、ガラクトース、グルコース、フコースなどの付加的な糖、メチル、エチルなとのアルキル基、アセチルなとのアシル基といったものを含んでいてよい、炭素、窒素又は酸素に結合された最高４つ通常は３つ以下の基を有することによってもさらに誘導体化されうる。置換部位は、自らの相補的レセプタ又はレクチンドメインに対する化合物の結合と干渉せず、薬物動力学的改善、安定性、合成の容易さ、毒性の減少、親和力強化などといった利点を提供することができる。

白血球又は内皮細胞かセレクチンを発現している組織へのその帰巣に関して変調されうる白血球には、好中球、Ｔ−リンパ球及びＢ−リンパ球、血小板などが含まれる。これらの細胞は、特に炎症に関連して、さまざまな損傷状態、罹患状態又はその他の病原性状態に帰巣することかわかっている。これらの細胞の浸透は、乾癖、アレルギー性接触性皮ふ炎、扁平苔癖、皮ふ内のリンパ球過形成、非特異的慢性皮ふ炎、急性痘癒状苔癖状ひこう疹、環状肉芽腫、皮ふ薬療、上孔性紅色ひこう疹、滑液炎症、再潅流損傷なとの条件と関連づけることがてきる。白血球が移動する部位には、末梢リンパ節、皮ふ、バイエル板、牌臓、腸間膜リンパ節（粘膜組織）、滑液及びその他のリンパ球及びリンパ法外組織及び炎症部位か含まれる。

当該化合物は、従来の方法に従って調製することもできるし、或いは又、牛乳といった天然の供給源から分離することもできる。シアリル−Ｌｅ”　、シアリル −Ｌｅ”　、この２つの化合物の共通部分すなわちＸ及びｙのうちの一方を３他方を４としてＮｅｕ５Ａｃ２．３ＧａｌβＸ（Ｆｕｃ　ａ　Ｉ−ｙ］ＧＩｃＮＡｃ及びその誘導体の調製についての説明は、Ｐａｕｌｓｅｎ。

（１９８２）Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　９４：１８４；Ｆｕｇｅｄｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８７）　Ｇｌｙｃｏモ盾氏| ｊｕｇａｔｅ　Ｊ、　４：９７；及び開本及び後藤、（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４６：５８３５；糖類の合成によって例示される。

本発明の化合物は、ヒトの細胞上に多糖標識として見い出される天然に発生するシアリル−Ｌｅ”又はシアリル−Ｌｅ”抗原以外のものである。化合物は、シアリル−Ｌｅ’及びシアリル−Ｌｅ”の両方と結びつけられた空間配座てフコピラノース及びシアル酸又はその誘導体を含む構造を含む又はこの構造と免疫学的に交叉反応する１つの構造を有することを特徴とする。かくして、２つの糖類、シアル酸及びフコピラノースは、糖類が適切な配位及び空間配座をとることかできるようにし好ましくはこのような配座を維持する上での拘束を提供する１つの鎖に対し結合されることになる。

バックボーン鎖は、炭素、窒素又は酸素であってよい１０〜２０通常は３〜８好ましくは３〜７、さらに好ましくは５〜６個の原子であってよく、脂環式、環式、複素環式又は芳香族単位又はその組合せが関与していてよい。糖がバックボーンの少なくとも１部分である場合、望ましくは、三糖類の非還元性末端糖としてシアル酸基が存在することになり、ここでもう１つの糖は好ましくはガラクトースであり、三糖類はフコピラノースから、約１〜４個好ましくは１〜３個、特に２個の通常は炭素選択的には酸素の原子によって分離されている。分離績として役立つ基は望ましくは、特に環式又は複素環式基として配座的に制約を受ける。

この基は、単数又は複数のすキシ（ヒドロキシを含む）基で置換することができる。環式基について配座的に制約されたというのは、３〜７、通常は５〜６個の環状構又は位置的に妨害された化合物又は鎖の原子が自由回転を阻害されているその他の構造の範囲のことである。シアリル及びフコピラノース基は、その空間的位置についてシスでもトランスでも、赤道でも極でもよいが、通常はトランスである。

はとんどの部分について、当該化合物は、そのコア構造として次のものを有する。

Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａ　ｌβｌ−ｘ　［Ｆｕｃα１−ｙｌＲなおＲはグルコース又は誘導体、例えばグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンなど及び制約された環式構造を含むその他の環状構造であり、ここでこのコア構造の位置はいずれもセレクチンに対する結合と干渉することなく置換され得る。置換のための部位には、窒素原子かアルキル化又はアシル化されていてよい、シアル酸、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、ノイラミン酸、フコース、その三糖類などの糖を特に伴う、ガラクトース、グルコース及びフコースの利用可能な位置なとが含まれる。

特に有利なのは、フコース及び非還元性末端糖としてノイラミン酸を伴う三糖類か結合されている環式基を含む化合物であり、ここてフコースと三糖類は２〜３個の特に炭素原子及び最適には１個の酸素原子によって分離されている。かくして、環式化合物は５〜７個の環状構特に６個の環状構で構成されていてよく、■ 、２−シクロヘキサンジオール、１．３−シクロヘキサンジアミン、１．２−シクロヘキサノールアミン、Ｉ、２−シクロベンタンジオール、２゜３−又は３，４−ジヒドロキシビランなどを含んでいてよい。位置はシスでもトランスでもよいが、好ましくはトランスである。

さまざまな目的のため、このサツカリド化合物は、脂質、通常的５　ｋＤａｌ以下の２〜３個の炭素原子のアルキレンを伴うポリアルキレンオキシ基といった非イオン洗剤などの洗剤、脂環式、芳香族、非環式又は複素環式でありうる、活性構造が約２　ｋＤａｌ以下である天然に発生するか又は合成の有機化合物、例えば約１００ｋＤに満たない又はそれ以上でありうるアクリレート、タンパク質などの生理学的に受容可能な重合体といった重合体化合物、といったその他の化合物に複合されうる。

キャリヤとして使用できるタンパク質としては、血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどが含まれる。複合体は、結合エピトープに特異的な抗血清又はモノクローナル抗体を産生ずるための免疫原として調製することができる。かくして、抗体を、例えば好中球、リンパ球又はその他の白血球の帰巣を阻害するのに使用することができる。リンパ球浸透を防ぐためセレクチンに対して結合エピトープと競合することになる抗イデオタイブ抗体を調製することも可能である。

当該化合物は直接キャリヤに複合することもできるが、さらに通常にはスペーサを通して複合する。タンパク質にリンケージするものとして知られているスペーサはさまざまあるが、特に、もう一つの官能基がカルボキシル酸、アルデヒド、メルカプタン、活性化すレフインなどでありうる１〜２個のアミノ基で置換されたフェニレンなどの芳香族基を内含するスペーサを挙げることができる。アミノ基を通してサツカリドにスペーサを結合させるにあたり、リンケージは、還元糖のアノマー形状の保持を提供することができ、或いは又還元性アミノ化を用いて結果としてアミノアルジトールを得ることもできる（Ｋａｌｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ、３：３１１．１９８６）。

コンピュータによる設計（ＣＡＤ）を用いた結合エピトープの形状に基づいて、アトレシンに対して結合エピトープと競合する合成存機化合物を案出することができる。

当該化合物は、化合物の特定の性質に応じて、適当なあらゆる方法で投与可能である。脱イオン水、食塩水、食塩加リン酸緩衝液、水性エタノールなどなどの生理学的に受容可能なさまざまな媒質を利用することかできる。化合物の性質に応じて、これは標準的には非経口又は経口的に、皮下、脈管内、局所的、腹腔内にて投与することができる。特定の用量は、投与頻度、投与方法、化合物の活性、治療対象の適応性などに応じて変化する。

上述のように、本発明は一般に、内皮付着分子によって媒介されるガン転移の阻害のための化合物及び方法にも関する。より特定的には、本発明の開示は、インビボ及びインビトロでのさまざまな目的のため内皮細胞に対する悪性細胞の結合を阻害するべく抗体、サツカリド、それからの複合糖質、酵素又は酵素阻害物質を使用することができる、ということを示している。

上述のように、転移は多段階プロセスである。転移の間、ガン細胞は微小血管及びリンパ系を通って循環し次に血管又はリンパ管の壁を通して移動して二次的器官部位で新しい攻撃的腫瘍を打ち立てる。転移プロセスにおける重要な段階は、血管又はリンパ管の壁の内皮被覆に対する循環ガン細胞の付着である。本発明において開示されているように、いくつかのガン細胞の表面で発現される炭水化物シアリル−Ｌｅ“及びジ−シアリル−Ｌｅ”は、内皮細胞の表面で発現されるＥＬＡＭ−１といったセレクチンに対するリガンド（すなわち結合パートナ−）として機能する。従ってこれらのガン細胞については、転移には、内皮細胞上の付着分子に対するガン細胞上のシアリル−Ｌｅ’及び／又はジ−シアリル−Ｌｅ” の結合を介しての内皮細胞に対するガン細胞の付着が関与している。その他のガン細胞は、卓越してシアリル−Ｌｅゞ又はシアリル−Ｌｅ”及びシアリル−Ｌｅ ’　（及び／又はジ−シアリル−Ｌｅ’　）を発現する。本発明は、ＥＬＡＭ− １といったセレクチンが悪性細胞上にシアリル−Ｌｅ”及びシアリル−Ｌｅ”の両方に共通の炭水化物ドメインを結合すること、従って両方に結合することのできる作用物質を生産することが可能であることを開示している。共通のドメインを有するその他のシアリル化された複合糖質も発現可能である。

本発明の方法によるセレクチンとシアリル化構造の間の初期結合事象の阻害は、血管又はリンパ管壁の内皮被覆に対する転移細胞の付着を防ぎ、かくして二次的器官に対する転移細胞の広がりを無くする。適切な遮断薬としては、ＥＬＡＭ− １といったセレクチン付着分子を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅ８、ジ−シアリル−Ｌｅ”、又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞（ジ−シアリル−Ｌｅ”を含む又は含まない）の結合を阻害するものが含まれる。代表的作用物質としては、抗体、サツカリド及びそこからの複合糖質、酵素及び酵素阻害物質が含まれる。

本発明において利用される抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。簡単に言うと、動物の免疫化とそれに続くその血清の収集によってポリクローナル抗体を産生ずることができる。免疫化は、例えば、皮下、牌臓内又は筋肉注射などによってウサギ、ラット又はマウスに全身投与することにより達成される。

一般に、血清収集に先立ち１回又は複数回追加免疫を初期免疫の後で行なうことが好ましい。このような方法は周知のものであり、数多くの参考文献中で説明されている。

本発明において適当なモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）には、マウス又はヒト由来のもの又はヒト及びマウスの両方の抗体の一部分を組合せるものといったキメラ抗体（すなわちマウスの抗体の抗原結合領域とヒト抗体の定常領域）が含まれる。ヒト及びキメラ抗体は、当業者にとって既知の方法を用いて産生できる。ヒト抗体及びキメラヒト−マウス抗体は、マウス抗体に比べて臨床的に投与された場合に抗抗体の産生をひき起こす可能性が低いことから、有利である。

ＭＡｂｓは一般にＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７゜１９７５；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、６　＋５１１−５１９．１９７６）によって産生される。簡単に言うと、シアリル−Ｌｅ’又はジ−シアリル−Ｌｅ’を含む分子で免疫化された動物のリンパ節及び／又は牌臓を骨髄腫細胞と融合させてハイブリッド細胞系統（「ハイブリドーマ」又は「クローン」）を形成する。各ハイブリドーマは、単一のタイプの免疫グロブリンを分泌し、骨髄腫細胞と同様に無限細胞分割の潜在力を有する。ハイブリドーマは、適切なネオ複合糖質をスクリーニングすることにより望まれる炭水化物構造を結合する抗体を産生ずるために選択される。ハイブリドーマを介してのＭＡｂｓの産生に対する代替的方法は、バクテリオファージ及び細菌を用いたＭＡｂ発現ライブラリの作製である（例、５ａｓｔｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：５７２８．１９８９：Ｈｕｓｅｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５，１９８９）、適当な特異性を示す抗体の選択は、当業者にとって明白なものであるさまざまな方法で行なうことかできる。標準的には、このような抗体は選択的に約１０７リツトル１モル以上の親和力で結合することになる。

本発明において適切なＭＡｂｓの代表的例としては、シアリル−Ｌｅ’についてはＮ−１９−９及びＨＥ　ＣＡ−４５２、ジ−シアリル−Ｌｅ″についてはＦ）（−７か含まれる。ＭＡｂ　Ｎ−１９−９はＡＴＣＣ（Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）からＡＴＣＣＨＢ８０５９として入手可能であり、又米国特許第４．４７１．０５７号（及びＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｎｅｔ、　５：いる通りに産生ずることができる。ＭＡｂ　ＨＥＣＡ−４５２は、Ｄｕ　ｉ　ｊｖｅＳ　ｔ　ｉ　ｊｎシアリル−Ｌｅ”　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ ”に結合できる抗体に加えて、サツカリド及びそれに基づく複合糖質も同様に内皮に対するシアリル−Ｌｅ’　、ジ−シアリル−Ｌｅ’又はシアリル−Ｌｅ”を発現する転移細胞の結合を阻害することができる。ここで用いる「シアリル−Ｌｅ’　Ｊ及び「ジ−シアリル−Ｌｅ’　Ｊ　という語は、以下のような構造Ｉ及び■をそれぞれ表わす：Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ βｌ−３ＧａｌＢ１−Ｒ（１”）ＦｕｃαＩＮｅｕ５Ａｃ　ａ　２ ■ Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａ　［βｌ−３ＧＩｃＮＡｃβｌ−３ＧａｌβＩ− Ｒ（ＩＩ）Ｆｕｃα１Ｎｅｕ５Ａｃはシアル酸を表わす・Ｇａｌはガラクトースを表わす；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−グルコサミンを表わす；　ＦｕｃはフコースをＲは標準的にはセラミド（グルコース残基が介在させられている）又はタンパク質を表わす。

シアリル−Ｌｅ”は、Ｇａ１−ＧＩｃＮＡｃリンケージかβ１４てＦｕｃ−ＧｌｃＮＡｃリンケージがα１−３であるシアリル−Ｌｅ’の異性体である。本発明において適当なサツカリドとしては、シアリル−Ｌｅ’又はジ−シアリル−Ｌｅ ’の炭水化物部分（すなわち式■又は■からＲを引いたもの）及び、シアリル− Ｌｅ“及びシアリル−Ｌｅ”の両方と交叉反応するものを含むいずれかの誘導体が含まれる。

これらの化合物の誘導体には、その他のサツカリド残基と及び／又はヒドロキシ基無しのヘギシル環といった非サツカリド分子との個々のサツカリド残基の置換か含まれる。例えば、内部ＧｌｃＮＡｃは、グルコース（Ｇｌｃ）といったもう１つのサツカリド残基で置換されうる。

代替的にはぐ又は置換に加えて、シアリル〜Ｌｅ’　、ジ−シアリル−１、ｅｏ又はその誘導体の炭水化物部分は、単数又は複数のサツカリド残基の欠失によって切形されうる。例えば、四糖類は、次の構造を用いて作り出すことができる。

ここで記述されている教示から見ると、当業者にとっては、その他のサツカリドも本発明において適切であるということが明確になるだろう。

す゛ツカリドは非サツカリド分子とカップリングして複合糖質を形成することかできる。例えば、ポリアクリルアミドに対してサツカリドをリンケージさせることもできる。代替的には、脂質にサツカリドをリンケージさせることもできる。

代表的脂質としてはセラミドすなわち、脂肪酸でアミン上でアシル化されたスフィンゴ脂質塩基か含まれる。代替的には、サツカリドは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質といったアミノ酸又はアミノ酸含有分子に結合されうる。サツカリドは天然には、セリン又はトレオニンアミノ酸残基のヒドロキシル基を介してアミノ酸又はアミノ酸含有分子にリンケージされているが、アミノ基といったその他の基を通しても、リンケージされうる。

本発明によって提供されるサツカリド及び複合糖質は、以下のような構造■及び ■によって表わすことができる。

Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａｌβ１−３ｘβ１−３ｙβ１−４Ｚβ１−Ｒ（ＩＩＩ）？ＦｕｃαＩＮｅｕ５Ａｃ　ａ　２Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａｌβ１−３ｘβ１−３ｙβ１−４ｚβｉＲ（ＩＶ）！ＦｕｃαｌなおＲは■］、ＯＨ１脂質、セラミド又は単数又は複数のアミノ酸を含む；ｘ、ｙ及びＺはサツカリドから独立して選択され、ｙ又はＺのいずれか又は両方が不在であってもよい。

サツカリド及び複合糖質を調製するための数多くの方法が当業者にとって周知のものである。サツカリドは、化学的及び／又は酵素による試薬及び技術を用いて合成的に調製することかできる。例えば、シアリル−Ｌｅ’は、酵素合成によって調製された（例、Ｐａ１ｃｉｅ化を介したサツカリドの４−アミノフェネチルアミン誘導体が関与している。簡単に言うと、まず糖類を、１５時間生の試薬の中で溶解させることによってアミノ試薬と反応させる。次にエタノール中の硼酸水素ナトリウムを付加する。５時間後、産物を、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィにより試薬から分離させる。その後、アミンとの反応性をもつ基を含む分子に誘導体をカップリングすることがてきる。同じアミン誘導体を、シアノ硼酸水素ナトリウムにＭｅｔｈ、　２５：３２３−３３５．１９７９）。簡単に言うと、水中に糖が溶解され、シアノ硼酸水素ナトリウムと合わせて（１０倍のモル余剰分）同量のアミン（１７０倍のモル余剰分）が付加される。還元はｐＨ８で４８時間行なわれ、ゲルクロマトグラフィにより産物が精製される。タンパク質といった異なる分子に対するカップリングは、イソチオシアン酸塩カップリング方法によって行なうことができる。

還元アミノ化による複合糖質の調製に適した試薬のもう１つの例はｐ−トリフルオロアセタミドアニリン（ＴＦＡＮ）である。還元アミノ化反応は、還元剤としてシアノ硼酸水素ナトリウムを用いてｐＨ５〜６で一晩、水溶液中で行なわれる。標準的には、ＴＦＡＮの５倍余剰分か用いられる。ＴＦＡＮ誘導体化されたサツカリドは一般にＮアセチル化例えば無水酢酸メタノールにより酸化から保護され、ＴＦＡｃ−誘導体を生み出す。複合に先立ち、Ｎ−）リフルオロアセタミド保護基は、３時間、０．５Ｍの水酸化ナトリウム又はアンモニア水を用いてＴＦＡｃ誘導体を処理することによって除去される。分子例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）といったタンパク質に対する誘導体の複合は、イソチオシアン酸塩カップリング方法によって達成されうる。適切な試薬及び反応の例としては、サツカリドのｐ−テトラデシルアニリン誘導体及び、硫酸セリウムアンモニウムでのサツカリドＴＦＡＮ誘導体の酸化によるアミノアルジトールの調製が含まれる（Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　８９：４３１−４３９．１９９０）。

多価炭水化物薬物候補は、塩化アクリルでグリコジルアミンをアシル化することによって産生されるＮ−アクリロールグリコジルアミンから調製されうる。Ｎ− アクリロールグリコジルアミンは、反応物のモル比によって置換度が決定される多価炭水化物重合体を産生ずるため水溶液中のラジカルイニシエータを用いてアクリルアミロ１１、１９８９）。この方法を用いて、シアリル−Ｌｅ’を共重合させて多価炭水化物ポリアクリルアミドを形成した（　ｒ　ＳＬｅ’　−ＰＡ　Ｊ例：図６）。この多価炭水化物薬物候補は、非毒性で水溶性をもつ。分子量及びハブテン密度は、反応物の比率と反応時間を変えることによって決定することができる。

内皮に対するシアリル−Ｌｅ”　、ジ−シアリル−Ｌｅ”又はシアリルは、タイプｌの炭水化物績であり（すなわち、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃポリラクトサミン単位構造を有する）、シアリル−Ｌｅ”はタイプ２の炭水化物績である（すなわち、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃポリラクトサミン単位構造をもつ）。結腸直腸ガン及びすい環ガンなどの数多くのガン細胞が、シアリル−Ｌｅ’及びジ− シアリル−Ｌｅ’を含むタイプｌの炭水化物績の優勢度を有する。乳ガン、肺ガン及び卵巣ガンなどのその他のガン細胞は、シアリル−Ｌｅ”を含むタイプ２の炭水化物績の優勢度を有する。

上述のようなインビトロ態様に関しては、本発明は、生物学的調製物内での内皮に対するガン細胞の結合を阻害する方法を提供する。

生物学的調製物の代表的例としては、悪性腫瘍と組合さった血管及び／又はリンパ管の内皮が含まれる。内皮と悪性腫瘍は、有機体から除去された組織又は細胞又は培養細胞の形をしている可能性がある。一つの実施態様においては、この方法は、上述のような抗体、サツカリド又は複合糖質などの少なくとも１つの有効量の作用物質を用いて、セレクチンを発現する内皮細胞及びシアリル−Ｌｅ＆、ジ−シアリル−Ｌｅ“又はシアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞を含む生物学的調製物をインキュベートする段階を含んでいる。もう１つの実施態様においては、この方法は、細胞によるシアリル−Ｌｅ“又はジ−シアリル−Ｌｅ’の生合成を阻害する少なくとも１つの酵素阻害物質を用いて悪性細胞をインキュベートする段階を含む。適当な酵素阻害物質には、グリコジルトランスフェラーゼの阻害物質が含まれる。グリコジルトランスフェラーゼに対する阻害物質の代表例には、フコシルトランスフェラーゼ（例えばＰａ１ｃｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　２６４　：１７１７４−１７１８１．１９８９に記載のもの）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（例えば、Ｐａ１ｃｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　２６５　：６７５９−６７６９．１９９０に記載のもの）、及びシアリルトランスフェラーゼ（例えばＢｒｏｑｕｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、５４：３８８−３９４゜１９９０、にａｒａｉｖａｎｏｖａ、ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１１：３１１−３１５゜１９９０に記載のもの）に対する阻害物質が含まれる。

もう１つの実施態様においては、この方法は、これらの細胞上の炭水化物がセレクチンを結合できなくする少なくとも１つの酵素を用いて、シアリル−Ｌｅ”又はジ−シアリル−Ｌｅ”を発現する悪性細胞をインキュベートする段階を含んでいる。適当な酵素としては、グリコシダーゼか含まれる。グリコシダーゼの代表例は、シアリダーゼ（Ｒｏｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　：１００５−１００７．１９８５）及びフコシダーゼ（Ｋｏｂａｔａ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　８３：６２５−６３１．１９８２）である。強化された特異性及び望ましい特性をもつ酵素は、適切なネオ糖タンパク質及び抗炭水化物抗体を使用して検出されうる。

本発明は同様に、ヒトといった定温動物における転移を阻害するだめの方法における上述の化合物の利用をも提供する。１つの実施態様においては、上述のような抗体、サツカリド又は複合糖質といった少なくとも１つの作用物質が、転移を阻害するのに用いられる。

もう１つの実施態様においては、この化合物は、悪性細胞によるシアリル−Ｌｅ ’又はジ−シアリル−Ｌｅ”の生合成を阻害する（上述のような少なくとも１つの酵素阻害物質を含んでいる。もう１つの実施態様では、この化合物は、悪性細胞がセレクチンに結合できないようにシアリル−Ｌｅ’又はジ−シアリル−Ｌｅ ’を発現する悪性細胞のシアリル−Ｌｅ”又はジ−シアリル−Ｌｅ’を変性する酵素を含んでいる。当業者であれば、（例えばヒト以外の動物におけるインビトロ及びインビボ研究に基づいて）特定の作用物質、酵素阻害物質又は酵素について最適有効用量をいかに決定するかということは明白であろう。さまざまな投与経路を用いることができる。標準的には、投与は、静脈内投与、腔内投与（例えば胸膜腔又は腹腔内）又は切除された腫瘍の層内投与である。

薬学的化合物としてすなわち生理食塩水といった薬学的に受容可能なキャリヤ又は希釈剤と組合せて、作用物質を投与することもできる。当業者であれば、作用物質及び化合物を無菌形態で調製することができるということがわかるだろう。

その上、免疫療法又は化学療法と組合せて作用物質を投与することも可能である。このような組合せが望ましい場合、各々の物質は、逐次的、同時又は組合せた形で単一の化合物として投与することができる。有効性を確認するため投与に先立って及び投与の後に、腫瘍用ＣＡＴスキャンといった診断技術を行なうこともできる。

本発明は同様に、シアリル−Ｌｅ’とシアリル−Ｌｅ”の両方と反応することのできる作用物質を含む化合物及びその利用方法をも提供する。このような作用物質には、抗体、微生物及び哺乳動物の炭水化物結合タンパク質、例えばレセプタ、アゾシン、トキシンサブユニット及び可溶性セレクチンが含まれる。

以下の例は、−例として挙げるものであり、いかなる制限的意味ももつものではない。

実施例例１複合糖質及び検定合成糖タンパク質（ネオ糖タンノくり質）ネオ糖タンパク質は、ウシ（ＢＳＡ）又はヒト（ＨＳＡ）の非グ１ノコシル化アルブミン１モルに対し１０〜２０モルの特異的オリゴ糖をイし学的（二カップリングすることによりＢｉｏＣａｒｂＡＢ（Ｌｕｎｄ、スウェーデン）が生産した。結果として得られた合成筒タンノくり質（ネオ糖タンノくり質）は同一の炭水化物配列の多重コピーを含んでおり、かくして炭水化物−タンパク質相互作用を研究するのにきわめて有効な充分（こ特徴づけされた多価の複合糖質が産生される。オリゴ糖のサイズ（こ応じて、オリゴ糖をタンパク質に力・ノブリングさせるの（こ３つの異なる化学スペーサアームが用いられた。潜在的結合部位（こ関与しつる還元糖のアノマー形態を保持することになること力為ら、アルブミン（二対し短かい方のオリゴ糖を力・ノブリングするため（こ（よ、１）ｐ−アミノフェニル（ＰＡＰ）　；　２　）アミノフェニルエチルアセチル、フェニレンジアミンが用いられた。還元アミノイヒによりタンパク質に対し大きい方の糖を力・ノブリングするのにＡＰＤ力（用ｐｓられ、こうして還元糖はアミノアルジトールに変換される。これらの還元された糖は、表１に示されたＡＰＤ複合体の中で力・ノコによって表わされている。

表１ＬＮＦ　ＩＩ　Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ７９　１−４（Ｇｌｃ）ＬＮＦ　ｍ　Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβｌ−３Ｇａｌβ１−４（Ｇｌｃ）ｓＬＮＦ　ＩＩ　Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａｌβ１−３Ｇ１ｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβｌ −４（Ｇｌｃ）ｓＬＮＦＩ［Ｉ　Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／３１−３Ｇａｌ　Ｂ　１−４（Ｇｌｃ）ＬＳＴａ　Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２ −３Ｇａ　ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｇｌｃ）ＬＳＴｅ　Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１− ４（ＧＩＣ）３　’　Ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ　Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ　Ｂ１−４（Ｇｌｃ）６　’　Ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ　Ｎｅｕ５Ａｃα ２−６Ｇａｌβ１−４（Ｇｌｃ）モノクローナル抗体利用されたモノクローナル抗体は、以下のものを含む。う・ノドＩｇＭである）ＩＥＣＡ−４５２　（抗−ＣＬＡ（Ｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４５　：３２４７−３２５５、１９９０））　；ラット１ｇＭ対照であるＭＥＣＡ−７９　（抗末梢すンノく節アトレシン（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　胆７　：１８５３−１８６２．１９８８））　；ラット１ｇＭ対照であるＲＢ６−２Ｃ２　（Ｃｏｆｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｍａｎ．　Ｊ．Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ．　１５３　：２６９，１９８１　）　；　Ｃ．Ｗａｙｎｅ　Ｓｍｉｔｈ　（Ｈｏｕｓｔｏｎ．ＴＸ）から供給を３４９ニア９６−７９９．　１９９１）　；　７ウスＩｇＧ＋であるＤｒｅｇ−５６　（抗−ヒトＬＥＣＡＭ−５２７９ −５２８６．　１９８４）　；　ＢｉｏＣａｒｂが開発したマウスＩｇＧ＋であるＩＨＩＯ　（抗４°Ｃで一晩、ｐＨ７．　４の０．１％のアジ化ナトリウム、Ｏ．ＯＩＭのリン酸ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム１００μｆ　（ＰＢＳ−アジ化物）の中の１００ｎｇのネオ糖タンパク質で各ウェルを充てんすることによってマイクロタイタブレート上に合成糖タンパク質をコーティングした。次に、ＩＯμｇ／ｄに希釈した適切な抗体を用いて固相炭水化物構造に対し、標準酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）を行なった。

ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡ　）ランスフエクションを受けた細胞系統の産生マウスのブレＢ細胞系統Ｌｌ−２の中にＥＬＡＭ−１遺伝子をトランスフェクションすることによってＬｌ−２／　ｐＭＲＢ１０７細胞（Ｌｌ−２ＫＬＡＮ−１）を調製した。（Ｇａｌｌａｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：３０− ３４．１９８３）ＥＬＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローンを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により活性化されたヒトさい静脈内皮細胞培養から作られたｃＤＮＡライブラリから得た。ＥＬＡＭ−１遺伝子を、ｐＭＲＢ１０１内のｈＣＭＶプロモータの下流Ｌ１−２細胞内に導入し、ミコフェノール酸に対する耐性について細胞を選択した。ＥＬＡＭ−１について明るく染色する細胞の個体群をＦＡＣＳで選択し、限界希釈法によりクローニングさせた。これらの細胞は、そのＥＬＡＭ−１の発現においてのみ親細胞系統又は対照ベクタートランスフェクタントと異なっている、ＥＬＡＭ−１　１，　ＬＦＡ−１””　ＣＤ４５” ＣＤ４４”’ＬＥＣＡＭ−１”１１である。Ｌｌ−２／ｐＭＲＢ１０１（Ｌｌ− ２’°＊＋ｅＱ細胞は、ｐＭＲＢ１０＋でトランスフェクションされＥＬＡＭ− １発現が欠如しているＬｌ−２の類似の要領で形質転換された誘導体である。

細胞結合検定食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．　２中の各合成複合糖質の１００マイクロリツトル試料を、ＲＴで２時間８チヤンバスライド（ＬａｂＴｅｋ）のガラスウェル上に吸収させた。いくつかの実験について、ガラスウェルには４°Ｃで一晩４００μｇ／ｍｌでウサギ抗ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて予備コーティングをほどこし、複合糖質の付加に先立ってこれをＰＢＳで洗浄した。５％のＮＢＳ／　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／ダルベツコ調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）　ｐＨ７．０（ＣＭ）での遮断の後、各ウェルに対してｔ，ｌ−　２　ｌ　Ｌ　Ａ　Ｎ　−　１又はＬ　１−２ｖ＠ｅ１６Ｆ細胞を適用した（ＣＭ中１．５＞（１０＠１０、１５ｍ７）。５０ｒｐｍで回転振どう装置上でＲＴにて２５分間インキュベーションした後、ウェルの上部を除去し、ＤＭＥＭ中で３回スライドを洗浄し、次に１．５％のグルタルアルデヒド（Ｋｏｄａｋ）／　ＤＭＥＭ内でのインキュベーションにより固定させた。３〜６の１００×フイールドを各データ点について計数した。

化合物によるＥＬＡＭ−１含有細胞の結合の阻害１００μｌの食塩加リン酸緩衝液中に溶解されたシアリル−Ｌｅ”　−ＨＳＡ又はシアリル−Ｌｅ’−ＩＳＡ１２０ナノグラムを、室温で２時間、８チャンバ付きガラス（ＬａｂＴｅｋ）スライドのウェル１つにつき吸収させた。この時間中、１０７細胞／ｉでシアリル− Ｌｅ’−ＩＳＡの濃度が増加していく状態で氷上で２０分間Ｌｌー２ＥＬＡＮー１細胞を予備インキュベーションに付した。完全培地（ＣＭ、　５％の正常ウシ血清、ｌｏｍＭのＨＥＰＥＳ　、　１）Ｈ７，０、ＤＭＥＭ）中でウェルを洗浄し遮断した後、化合物を用いて予備インキュベートしたＬｌ−２１１ＬＡＮ−１細胞を付加しくｌＸｌＯ７細胞／ｍｌ）　、ｌ０ｒｐＯＩで回転させながら室温にてインキュベートさせた。２５分後、スライドをダルベツコ調整イーグル培地（ＤＭεＭ）内で３回洗浄し、次に１．５％のグルタルアルデヒド／ＤＭＥＭ中にて固定した（図５）。上述の実験を、ウェルをコーティングするのにさらに高い濃度のシアリル−Ｌｅ’−ＩＳＡを用い（５００ｎｇ／　１００．ｃｚ　ｌ　）　、阻害のために異なる可溶性多価化合物（シアリル−Ｌｅ”−ＰＡ）を用いて反復した（図６）。

化合物による細胞間付着の阻害ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣＯ８細胞の一層の上に５０ｒｐｍで回転しながら室温で３０分間ＣＭ内で正常なヒト好中球又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（１〜２　ＸＩＯ＠／ｍｌ）をインキュベートする。

洗浄後、好中球の結合は、トランスフェクションを受けたＣＯ３細胞あたりの結合した好中球の数を直接計数することによって確認される。ＰＢＭＣについては、ＤＭＥＭでの洗浄により非付着細胞をとり除き、次に５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡのＰＢＳ中溶液での洗浄により付着細胞を除去する。単球の結合は、付着細胞と非付着細胞の数を計数し、ＦＡＣ３分析でのその明確な光散乱プロフィールにより単球の数を、又抗ＣＬＡｍＡｂＨＥＣＡ−４５２での染色によりＣＬＡゝリンパ球の数を決定することによって、評価される（Ｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３４９　ニア９６−７９９゜１９９１）。好中球及び／又はＰＢＭＣは、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡでのトランスフェクションを受けたＣＯ８細胞の層上でのインキュベーシヨンに先立ってノアリルーＬｅ”−ＩＳＡ又はその他の化合物と予備インキュベートされる。細胞間付着の阻害は、対照中の結合細胞数−試験中の結合細胞数×１００対照中の結合細胞数という式により計算される百分率として決定される。

高内皮細静脈と末梢リンパ節帰巣レセプタ（ＬＨＣＡＭ−１）の相互作用は、５０ｒｐｍで回転させながらリンパ球及び／又はＬＥＣＡＭ−１トランスフェクションを受けた細胞系統の懸濁液が７°Ｃで２０〜３０分間リンパ球組織の冷凍切片上でインキュベートされる凍結切片検定法においルデヒド固定の後、ＲＥＶあたりの結合細胞数を顕微鏡で測定する。

５ｉａｌｙｌ−Ｌｅ’−ＩＳＡ及びその他の化合物は、検定に先立ちＬＥＣＡＭ −１及びＥＬＡＭ−１でトランスフェクションされたＬｌ−２細胞を含むリンパ球又はトランスフェクションを受けた細胞系統でインキュベートされ、細胞間付着を阻害する化合物の能力が以上に記載のとおり決定される。

例２ＥＬＡＭ−１により認識される炭水化物構造例１で記述された感受性結合検定は、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡでのトランスフェクションを永久的に受けた細胞を用いる。ベクタ一対照ｃＤＮＡ、　Ｌｌ−２ｖｅｃｌ＋＋＋てはなく、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡでのトランスフェクションを受けた（Ｌｌ−２ＥＬＡＮ−１）マウスのブレＢ細胞系統Ｌｉ２は、きわめて高いレベルのＥＬＡＭ−１を発現する。これらの細胞によって発現されたＥＬＡＭ−１は、Ｌｌ〜２８ＬＡＮ−１細胞が好中球に対し付着性を有し、この付着性が抗−ＥＬＡＭ−１モノクローナル抗体によって遮断されることから、機能的である。さまざまな合成複合糖質でコーティングされたガラススライドに付加されたとき、Ｌｌ−２ＥＬＡＩ４−１細胞は、シアリル−Ｌｅ″及びシアルＬｅ”　ネオ糖タンパク質に対し選択的に結合したが、その他の一定数の複合糖質には結合しなかった（構造については表Ｉを参照のこと）。Ｌｌ−２ＥＬＡＮ−１細胞も、比較的弱くではあるが、Ｌｅ’ネオ糖タンパク質に結合した。２＠ＬＡＮ−１細胞かＬｅ”にほとんど結合せずＬＮＦ　Ｉといった構造的類似体を用いて調製された複合糖質に対しては全く結合しなかったことから、Ｌｅ’に対する結合は存意である。

＋、＋−２ＥＬＡＭ−１細胞が３　’　ＳＬ、６　’　ＳＬ、　ＬＳＴａ又はＬＳＴｃといったその他のモノシアリル化炭水化物に結合しなかったということは、すなわち、シアリル−Ｌｅ”及びシアリル−Ｌｅ”に対する結合が非特異的電荷効果によるものではなくむしろこれらのオリゴ糖の特異的構造特徴を反映しているということを立証している。Ｌｅ’に対するＥＬＡＭ−１トランスフ１クタントの結合が低レベルであることは、認識におけるフコースの主要な役割と一貫性をもつものの、ノイラミン酸（シアル酸としても知られている）も主要な役割を演じるということを示し溶解状態のオリゴ糖の配座モデルを、Ｈ３ＥＡ計算によって得た。酸素原子によってヒドロキシ基を表わす。グリコシドリンケージのためには１１７°の固定結合角度を用いた。Ｈ３ＥＡポテンシャルにより計算されたエネルギー（Ｂｏｃｋ、ＰｕｒｅＡｐｐｌ、Ｃｈｅｍ、５５：６０５−６２２．１９８３）を、二面角の同時変動（多次元二進チョップ）を用いて最小限にした。

このアルゴリズムは、第１及び第２の導関数を用いるその他の方法に比べて局所的最小の近くで緩慢な収束を示すが、配座空間の大きな初期サーチ部域を許容し、かくして最低の局所的最小を見出す可能性か増大するという利点をもつ。このプログラムのその他の応用１９８９）及びＷｒｅｓｌａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ、　７：８５−１００．１９９０）に記述されている。

ＥＬＡＭ−１依存性細胞間付着の結合を阻害する炭水化物構造溶解状態のシアリル−Ｌｅ’−ＩＳＡは、固定化されたシアリル−Ｌｅ’−ＩＳＡか又は固定化されたシアリル−Ｌｅ”−ＩＳＡのいずれかに対するＥＬＡＭ−１トランスフェクションを受けた細胞（Ｌｌ−２１ＡＭ−１）の結合を１０％遮断する。いずれかの炭水化物構造に対する結合がシアリル−Ｌｅ’−ＩＳＡによって遮断されるにつれて、シアリル−Ｌｅ’及びシアリル−Ｌｅ”の両方に共通の炭水化物ドメインを認識するわずか１つの炭水化物部位のみがＥＬＡＭ−１内に存在する。

ＥＬＡＭ−１に対する炭水化物エピトープの図形表示ＨＳＥＡ計算によって決定されたシアリル−Ｌｅ’及びシアリル−Ｌｅ’″六糖類についての二面角が表■ に示されている。これらは未変性配座の理論的近似であり、開示がこれらの結合角度に制限されるものではないということに留意すべきである。二面角は、それを構成する４つの原子の呼称によって特定される。これらの４文字呼称は、化学記号、単糖内の数に関する２文字（及び例えば同じ炭素に結合された同しタイプの原子を区分するための考えられる追加仕様）、及びオリゴ筒内の単糖類残基の数から成る、最後の数は、以下に規Ｎｅｕ５Ａｃ　ａ　２−３Ｇａｌβｌ”　ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ＃Ｆｕｃα１＊＝シアリルーＬｅ”の場合３；シアリル−Ｌｅ”の場合４＃＝シアリル−Ｌｅ ”の場合４ニジアリル−Ｌｅ”の場合３表■ Ｃ１１−Ｃ２１−０２１−Ｃ３２１８８，６２４０３８７１８９，０００１２２１Ｃ２１−０２１−Ｃ３２−）１３２　３５０．８７６３４２８　１４９．９９９９６９５旧２−　ＣＩ　２−０１２−　Ｃ”　３　５１．３７３９７７７　５３．２５０７８９６Ｃ１２−０１２−Ｃ”３−Ｈ”３　１５．３７２７６３６　８．８７４６４３３１４１３−　ＣＩ　３−０１３〜Ｃ３４５７，８７２２８７８５７，８７５５０３５Ｃ１３−０１３−Ｃ３４〜Ｈ３４３５０，６３０６４５Ｂ　３５０．６２４３５９１旧４−　Ｃ１４−０１４−Ｃ４５５５，３８２２５１７５５，４９９９６５７Ｃ１４−０１４−Ｃ４５−Ｈ４５２，６２６２２１７１，６２８３４４４Ｈ１６−ＣＩ　６−０１６−Ｃａ　３　４９．７５５８９３７　４９．８７４９１６１Ｃ１６−０１６−Ｃａ　３−　Ｈ＃　３　１８．８６３５３６８　２３．９９９４２４００９１−　Ｃ９１−Ｃ８］〜Ｃ７１１７８，１０１１２００１７８，２２４７７７２０８１−Ｃ８１−Ｃ７１−Ｃ６１２９９，６９７９０６５３００，０７２９６７５０７１−Ｃ７］　−Ｃ６１−Ｈ６１１８０，４１９６６２５１８２，０４４９３７１０６２−Ｃ６２−Ｃ５２−１（５２３０３，０７０３１２５３００，８２３３０３２０６３−Ｃ６３−Ｃ５３−Ｈ５３２８９，２５４０５８８２９４，３６８６５２３０６４−Ｃ６４−Ｃ５４− １イ５４３０６．４５２７２８３３０６．４４９１８８２０６５−　Ｃ６５−Ｃ５５−Ｈ５５２９６，１７７１８５１１７８，０５５１１３１１（６Ａ６−　Ｃ６６−Ｃ５６−８５６１７９，６２５７３２４１７９，８７９１０４６＊＝シアリル−Ｌｅ”の場合３．シアリル−Ｌｅ”の場合４＃＝ソアリルーＬｅ’の場合４ニジアリル−Ｌｅ”の場合３ＥＭＩＮ　（シアリル−Ｌｅ”　）　＝−１５，７６２８７４６ｋｃａ１１モルＥＭＩＮ　（シアリル−Ｌｅ”　）　＝−１４，９５２８７９０ｋｃａ１１モル対照目的で、完全なプログラム出力が示されているが、実験的データとの比較のための関連精度は角度について士より高いと期待することはできない。Ｈ３ＥＡエネルギー値の誤差は、ｋｃａ１１モル単位で与えられた場合小数第１位内にあると予想できる。これらのエネルギー値は、異なるポテンシャル関数などを比較する場合有利なものであるが、実験から決定されたエネルギーとの比較には向いていない。しかしながら大きい負の値は実際、ファンデルワース引力が計算を支配し、Ｈ３ＥＡ近似の使用に対する裏づけを与えている（正のエネルギーは、Ｆ（ＳＥＡでは一定と仮定されている結合長さ及び角度をゆがめられる強い立体障害力を表わす）。結果として得られる構造は図１に図形的に表示されている。

計算は、それぞれＮ−アセチルグルコサミンとフコース及びシアル酸残基の間の異なるリンケージを伴う結合においても、２つの構造について相応する二面角がかなり類似していることを示している。

還元末端（２９６，２°及び１７８．１°）でのグルコース残基の６位置におけるヒドロキシメチル基についての異なる二面角は、１２０度の回転の後のこの分子基に対するきわめて等価のエネルギーの結果である。

この基はシアリル−Ｌｅ’とシアリル−Ｌｅ”の間で異なるリンケージから遠く離れているため、その方向はこの領域における配座構造にとって全く重要性をもたない。構造のコンピュータ生成画像は、図１に図形的に示されている。配座は、構造がそれぞれ非還元及び還元末端部分の両方において高レベルの類似性を示すということを表わしている。特に、内部ＧｌｃＮＡｃ残基上のＮ−アセチル基まで（ただしこの基を含まず）の末端炭水化物配列の構造は高レベルの相似性を示し、ＥＬＡＭ−１及びモノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２の両方によって認識されたドメインを表わしうる。構造的相似性のこの部域は、可能性ある抗炎剤の設計にとって特に有用である。

タイプＩ及びタイプ２の連鎖異性体を認識するその他の炭水化物結合タンパク質の例としては、血液型Ｂ抗原を結合する抗体Ｅ、２３−４８及びＥ＋６６１８　（Ｈａｎｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　：４０９１．９７．１９８３）及びＬｅ１′及びＬｅ’抗原を両方共認識するレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｎ　（Ｓｐｏｈｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、　６３：２ｉ３４４−５２．１９８５）がある。

ＥＬＡＭ−１によるシアリル−Ｌｅ’抗原及びシアリル−Ｌｅ”抗原の認識は、病理的に重要性をもつものでありうる。これらの構造を含むムチンは、胃腸ガン、すい臓ガン及び乳ガンの患者を含むガン患者の血清の中で高められる（Ｍａｇｎａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７　：１４３６５− ３６９．１９８２；Ｍａｇｎａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅｒ、Ｒｅｓ、　４３：５４８１−９２．１９８３）。

予備実験は、いくつかのシアリル−Ｌｅ”−及びシアリル−Ｌｅ”含有ムチンかＥＬＡＭ−１１−ランスフェクタントによって認識されるというこ腫瘍によって分泌されたこれらのムチンは、ガン患者の免疫抑制状態に貢献することができる。

例３ＬＥＣＡＭ−１により認識された炭水化物構造ジョンすることによって、ヒトＬＥＣＡＭ−１ｃＤＮＡでのトランスフェクシーｓンを受ケタ細胞系統（Ｌｌ−２ＬＥｃＡ’−’）ヲ１ｍ製した。ＬＨＣＡＭ−１ヲ：ｌ−卜するｃＤＮＡクローンを、ポリメラーゼ連鎖反応増幅により末梢血リンパ球から作られたｃＤＮＡライブラリから得た。ｐＭＲＢｌｏｌ　（Ｅ、ｃｏｌｉ挿入した。ＤＮＡを電気穿孔法によりＬｌ−２細胞内に導入し、ミコフェノール酸に対する耐性について細胞を選択した。ＬＥＣＡＭ−１に対して明るく染色する細胞の個体群をＦＡＣ３により選択し、限界希釈法によりクローニングさせた。これらの細胞は、そのＬＥＣＡＭ−１の発現のみにおいて親細胞系統又は対照ベクタートランスフェクタントから異ナッテイ６　ＬＥＣＡＭ−１”、ＬＦＡ−１”’　ＣＤ４５”ＣＤ４４”’　テアル。Ｌｌ−２／ｐＭＲＢ１０１（Ｌｌ−２°ｅｃ＋ｅＱ細胞は、ｐＭＲＢｌｏｌ　ｒ　）ランスフエクションされたＬｌ−２の同様に形質転換された誘導体であり、ＬＥＣＡＭ−１発現が欠食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）　ｐＨ７，２中の各ネオ複合糖質の１００マイクロリツトル試料を、室温で２時間８チヤンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）のガラスウェル上に吸収させた。５％のＮＢＳ　、　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ダルベツコ調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）　、ｐＨ７，０（ＣＭ）での遮断の後、各ウェルに対してｌｌ１１−２ＬｔＣＡ＋　、　Ｌｌ−２“°…・又はＬｌ−２ＥＬル１細胞を適用した（０．１５ｄＣＭ中１．５Ｘ　１０＠の細胞）、膜間リンパ節から分離されたマウスリンパ球も同様に、０．１５−中３ＸＩＯ”個の細胞でテストされた。いくつかのケースにおいては、モノクローナル抗体ＭＥＬ−１４（Ｇａｌｌａｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３　、前出）を用いて、１５０ｔｔ　ｇ／ｒｎｌ！／１０”細胞で、細胞を予備インキュベートした。５０ｒｐｍで回転振どう装置上で室温で２５分間インキュベートした後、ウェルの上部を除去し、スライドをＤＭＥＭ中で３度洗浄し、次にＤＭＥＭ中の１．５％のグルタルアルデヒド（Ｋｏｄａｋ）内でのインキュベーションにより固定した。各データ点について３〜６の１００Ｘフイールドを計数し、平均及び標準誤差が報告されている。報告されたデータは、２〜５回行なって類似の結果を得た代表的な実験からのものである。

リンパ球は、ＬＥＣＡＭ−１を介してネオ複合糖質を含むシアリル−Ｌｅ’″及びシアリル−Ｌｅ′″に結合する。

ＬＨＣＡＭ−１かこれらのＥＬＡＭ−１リガンド（例１に記述されたもの）と交叉反応するということの確認は、ヒトＬＨＣＡＭ−１ｃＤＮＡ（ＬＸ−２””’ −’　）すらびに高レベルのマウスＬＨＣＡＭ−１を発現する正常なマウスリンパ球でのトランスフェクションを受けたＬｌ−２細胞を用いて、この付着性検定を反復することによって実施した。マウスリンパ球は、シアリル−Ｌｅ’及びシアリル−Ｌｅ“と結合したか、３′シアリルラクトース、６′シアリルラクトース又はＬＳＴａを含む、ＬＮＦＩ　、　Ｌｅ”　、　Ｌｅ”又はネオ複合糖質と結合しなかった。マウスリンパ球の結合は、抗−マウスＬＥＣＡＭ−Ｉ　ＭＡＩ３　ＭＥＬ−１４によって遮断され（Ｇａｌｌａｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８３、前出）、観察された付着性がＬＥＣＡＭ−１を介していることを立証している（図８）。１．１−２１−２ＬｆｆｉＣＡ細胞は全て、広範囲の細胞濃度にわたって複合体を含むシアリル−Ｌｅ”よりもシアリル−Ｌｅ’に対しての方かやや良好に結合する：　ＥＬＡＭ−１及びＬＥＣＡＭ−１は両方共、これら２つの炭水化物リガンド（図７）に対して類似の相対的結合能力を表わすように思われる。（図７）。

上述の結果から、白血球特にリンパ球の炎症部位への帰巣を変調するのに化合物を利用することができるということは明白である。

これらの化合物は、従来の方法で容易に調製することができ、予防及び治療の両方の形でさまざまな疾病の治療のために有効でありうる。

本明細書で言及されている全ての公報及び特許用願書は、各々の公報又は特許用願書が特定的かつ個別に参考として内含されるへきものであると表示されている場合と同じレベルで、本書に参考として内含される。

上述のことから、例示を目的とじてここては発明の特定の実施態様について記述してきたものの、本発明の精神及び範囲がら逸脱することなくさまざまな修正を加えることが可能であるということが明白となるだろう。

浄書（内容に変更なし）シフ　！ＪＪｔｚＬ　ｅ　”；”ｚＭ’３　シアリルＬｅ“六糟類ＦＱｕｒｅ　３！’ｉｇｕｒｅ　４ネオ糖タンパク質（ｕｇ／ｒｒＩθ ！ｉｇｕｒｅ　ｆ！ｉｇｕｒｅ　６ネオ糖タンパク質（ｕｑ／ｍｌ）Ａｇｕγｅｌ！手続補正書（方式）％式％１、　事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０３１９２Ｚ　発明の名称内皮結合のための化合物及び方法３、　補正をする者事件との関係　特許出願人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｌＯ号６、　補正の対象明細書、請求の範囲、要約書及び図面の翻訳文７、補正の内容明細書、請求の範囲、要約書及び図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録明細書、請求の範囲、要約書及び図面の翻訳文　各１通国際調査報告国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｄ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｈ１３１０６７８２２−４Ｃ１５／１０　７８２２−４ＣＣ１２Ｎ　９／２４　９３５９−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｚ　８３１０−２Ｊ（３１）優先権主張番号　７２１，１６０（３２）優先口　１９９１年６月２６日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ）（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ。

Ｉ（７２）発明者　マグナー二、ジョン　エル。

アメリカ合衆国、メリーランド　２０８５３゜ロックビル、ウッドラーク　ドライブ（７２）発明者　ブッチャー、ニージン　シー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０２５゜ボートーラ　バレー、コート　マデラ（７２）発明者　バーグ、エレン　エル。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５３６゜フレモント、モンタルバン　ドライブ　３９

Claims

【特許請求の範囲】

１．内皮細胞に対する白血球又は血小板の結合を調節するための方法において、 −内皮細胞に対する白血球の結合を調節するのに充分な量で、セレクチン又はその炭水化物リガンドを発現する白血球及び内皮細胞を含む細胞の組合せに対して、セレクチンに対し結合する上でシアリル−Ｌｅｘ、シアリル−Ｌｅａ又は皮ふ白血球関連抗原と交叉反応性及び／又は競合性をもつことのできる化合物を付加する段階を含み、前記セレクチンがＥＬＡＭ−１である場合この化合物がシアリル−Ｌｅｘ以外のものである方法。
２．前記化合物が、少なくとも２つの原子の配置的に制約された鎖を含む基に結合されたシアル酸及びフコピラノースを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
３．前記基には、ガラクトース、グルコース又はその誘導体のうち少なくとも１つが含まれている、請求の範囲第２項に記載の方法。
４．前記ガラクトースは、β−アノマーとしてグルコース、グルコサミン又はＮ −アセチルグルコサミンに結合させられている、請求の範囲第３項に記載の方法。
５．前記化合物がシアリル−Ｌｅａ又はその誘導体である、請求の範囲第４項に記載の方法。
６．宿主の炎症部位内への白血球の浸透を阻害するための方法において使用するためＥＬＡＭ−１，ＬＥＣＡＭ−１又はＧＭＰ−１４０に結合することのできる、ｘ及びｙのうち一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１− ｘ［Ｆｕｃαｌ−ｙ］ＧｌｃＮＡｃを含むシアリル−Ｌｅｘ以外の化合物又はその誘導体。
７．前記化合物が皮ふリンパ球関連抗原の多糖である、請求の範囲第６項に記載の化合物。
８．宿主の炎症部位内へのリンパ球の浸透を阻害するための方法において使用するためのセレクチンに対して結合することのできる、ｘ及びｙのうち一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−ｘ［Ｆｕｃαｌ−ｙ］ＣｌｃＮＡｃを含む化合物又はその誘導体。
９．内皮細胞に対する血小板の結合を阻害する方法において使用するための、セレクチンに対し結合することのできる、ｘ及びｙの一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−ｘ［Ｆｕｃαｌ−ｙ］ＧｌｃＮＡｃを含む化合物又はその誘導体。
１０．配置的に制約された鎖を含む基に結合されたシアル酸及びフコピラノースを含む、天然に発生するシアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘ抗原以外の化合物。
１１．前記基が、ガラクトース、グルコース又はその誘導体のうちの少なくとも１つを含み、前記シアル酸及びフコピラノースが少なくとも２個の炭素原子の鎖によって分離されている、請求の範囲第１０項に記載の化合物。
１２．セレクチンに対して結合することのできる、ｘ及びｙの一方が３で他方が４であるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−ｘ［Ｆｕｃαｌ−ｙ］ＧｌｃＮＡｃを含む、天然に発生するシアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘ抗原以外の化合物又はその誘導体。
１３．スペーサ基を通してキャリヤー分子に結合させられた、請求の範囲第１１項に記載の化合物。
１４．前記キャリヤー分子が重合体である、請求の範囲第１３項に記載の化合物。
１５．ｘ及びｙの一方が３で他方が４でありＲがサッカリド又は誘導体であるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−ｘ［Ｆｕｃαｌ−ｙ］Ｒを含み、セレクチンに対して結合することのできる、シアリル−Ｌｅｘ又はシアリル−Ｌｅａ抗原以外の化合物。
１６．前記Ｒがグルコース又は誘導体である、請求の範囲第１５項に記載の化合物。
１７．生物学的調製物内で、セレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル− Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において；−セレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害する少なくとも１つの作用物質を用いて生物学的調製物をインキュベートすることを含む方法であって、この悪性細胞がシアリル−Ｌｅｘを発現する場合この作用物質がシアリル−Ｌｅｘ以外のものである方法。
１８．作用物質が、セレクチンに対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘの結合を阻害するサッカリド、複合糖質又は抗体である、請求の範囲第１７項に記載の方法。
１９．生物学的調製物の中でＥＬＡＭ−１を発現する細胞に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘと発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、−ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害する少なくとも１つの作用物質を用いて生物学的調製物をインキュベートする段階を含み、この悪性細胞がシアリル−Ｌｅｘを発現する場合この作用物質がシアリル−Ｌｅｘ以外のものである方法。
２０．作用物質が、ＥＬＡＭ−１に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリルーＬｅａ又はシアリル−Ｌｅｘの結合を阻害するサッカリド、複合糖質又は抗体である、請求の範囲第１９項に記載の方法。
２１．生物学的調製物内でセレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、 −この悪性細胞によるシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａの生合成を阻害する少なくとも１つの酵素阻害物質を用いてこの悪性細胞をインキュベートする段階を含む方法。
２２．生物学的調製物の中で、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、前記悪性細胞によるシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａの生合成を阻害する少なくとも１つの酵素阻害物質を用いて前記悪性細胞をインキュベートする段階を含む方法。
２３．生物学的調製物においてセレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル −Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、前記悪性細胞がセレクチンに対し結合できなくなるようにこの悪性細胞のシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅｘを変性する少なくとも１つの酵素を用いてこの悪性細胞をインキュベートする段階を含む方法。
２４．生物学的調製物の中で、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、前記悪性細胞がＥＬＡＭ−１に対し結合できなくなるようにこの悪性細胞のシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅｘを変性する少なくとも１つの酵素を用いてこの悪性細胞をインキュベートする段階を含む方法。
２５．ｘがＧｌｃＮＡｃ、ｙがＧａｌ、ｚがＧｌｃである組合せでｘ，ｙ及びｚが存在しないということを条件として、ｘ，ｙ及びｚがサッカリドの中から独立して選択されるか或いは又ｙ又はｚ又はその両方が存在せず、ＲがＨ、ＯＨ、脂質、セラミド又は単数又は複数のアミノ酸であるものとして、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ｘβ１−３ｙβ１−４ｚβ１−Ｒ▲数式、化学式、表等があります▼ という式を有する化合物。
２６．ｘがＧｌｃＮＡｃ、ｙがＧａｌ、ｚがＧｌｃである組合せでｘ，ｙ及びｚが存在しないということを条件として、Ｘ，ｙ及びｚがサッカリドの中から独立して選択されるか或いは又ｙ又はｚ又はその両方が存在せず、ＲかＨ、ＯＨ、脂質、セラミド又は単数又は複数のアミノ酸であるものとして、 ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ｘβ１−３ｙβ１−４ｚβ１−Ｒ▲数式、化学式、表等があります▼ｌという式を有する化合物。
２７．定温動物において二次部位に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の広がりを阻害する方法において使用するための、前記悪性細胞がシアリル−Ｌｅｘを発現する場合にはシアリル −Ｌｅｘ以外のものである、セレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル− Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害する作用物質。
２８．前記作用物質は、セレクチンに対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル− Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘの結合を阻害する抗体、サッカリド又は複合糖質である、請求の範囲第２７項に記載の作用物質。
２９．定温動物において、二次的部位に対するシアリル−Ｌｅａ、ジーシアリル −Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の血行性転移による広がりを阻害する方法において使用するための、前記悪性細胞がシアリル−Ｌｅｘを発現する場合にはシアリル−Ｌｅｘ以外のものである、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害する作用物質。
３０．前記作用物質は、シアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ、又はシアリル−ＬｅｘのＥＬＡＭ−１に対する結合を阻害する抗体又はサッカリド又は複合糖質である、請求の範囲第２９項に記載の作用物質。
３１．定温動物において、二次的部位に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の広がりを阻害する方法において使用するための、シアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞によるシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａの生合成を阻害する酵素阻害物質。
３２．定温動物において、二次的部位に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の血行性転移による広がりを阻害する方法において使用するための、シアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞によるシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａの生合成を阻害する酵素阻害物質。
３３．定温動物において二次部位に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル− Ｌｅａを発現する悪性細胞の広がりを阻害するための方法において使用するための、前記悪性細胞がセレクチンに対し結合できなくなるようにシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞のシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを変性する酵素。
３４．定温動物において、二次的部位に対するシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞の血行性転移による広がりを阻害する方法において使用するための、前記悪性細胞がセレクチンに対して結合できなくなるようにシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを発現する悪性細胞のシアリル−Ｌｅａ又はジ−シアリル−Ｌｅａを変性する酵素。
３５．生物学的調製物の中で、セレクチンを発現する内皮細胞に対するシアリル −Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、シアリル−Ｌｅａ及びシアリル−Ｌｅｘの両方と反応することのできる少なくとも１つの作用物質を用いて生物学的調製物をインキュベートする段階を含む方法。
３６．生物学的調製物の中で、ＥＬＡＭ−１を発現する内皮細胞に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル−Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の結合を阻害するための方法において、シアリル−Ｌｅａ及びシアリル−Ｌｅｘの両方と反応することのできる少なくとも１つの作用物質を用いて生物学的調製物をインキュベートする段階を含む方法。
３７．定温動物において二次的部位に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル− Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の広がりを阻害するための方法において使用するための、シアリル−Ｌｅａとシアリル−Ｌｅｘの両方と反応することのできる作用物質。
３８．定温動物において二次的部位に対するシアリル−Ｌｅａ、ジ−シアリル− Ｌｅａ又はシアリル−Ｌｅｘを発現する悪性細胞の血行性転移による広がりを阻害するための方法において使用するためのシアリル−Ｌｅａ及びシアリル−Ｌｅｘの両方と反応することのできる作用物質。
３９．薬剤の製造において使用するための、請求の範囲第１０項乃至第１６項及び第２５項及び第２６項のいずれか１項に記載の化合物。