KR20190012189A - 약동학이 개선된 글리코실화 vwf 융합 단백질 - Google Patents

약동학이 개선된 글리코실화 vwf 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주 단백질 및 하나 이상의 연장 펩티드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서, 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사하고, 및 상기 연장 펩티드는 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 포함한다. 상기 연장 펩티드는 상기 포유동물 단백질의 비-반복된 서열과 동일하고 및/또는 서열번호: 1과 동일하거나 또는 유사하다. 상기 주 단백질은 바람직하게 VWF이다. 상기 융합 단백질은 주 단백질과 비교하여 증가된 반감기를 가지며 또한 결합 파트너, 예컨대 FVIII의 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 융합 단백질에 의해 형성된 복합체, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

약동학이 개선된 글리코실화 VWF 융합 단백질
본 발명은 단백질, 구체적으로 인간 응고 인자 예컨대 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor: VWF) 및 인자 VIII (factor VIII: FVIII)의 반감기 연장 (half-life prolongation)에 관한 것이다.
혈우병 (Hemophilia)은 혈액을 응고 또는 응집시키는 신체의 조절 능력이 손상된 유전 질환 (hereditary genetic disorders) 그룹이다. 그의 가장 일반적인 형태인, 혈우병 A는 응고 인자 VIII (FVIII)이 결핍된 것이다. 혈우병 A는 남자 신생아 5,000-10,000명 중 약 1명에서 발생한다. 상기 FVIII 단백질은 다기능 특성을 갖는 혈액 응고에서 필수적인 보조인자 (cofactor)이다. 상기 FVIII의 결핍은 혈장-유래된 FVIII 농축물에 의해서 또는 재조합으로 생산된 FVIII에 의해서 치료될 수 있다. 상기 FVIII 농축물에 의한 치료는 혈우병 환자에게 정상적인 삶을 유도할 수 있다.
혈우병 A 환자는 요구에 따라 FVIII로 치료되고 또는 예방 요법으로 1주일에 수회 투여된다. 예방적 치료를 위해, 체중 1 kg당 FVIII의 15―25 IU를 1주일에 3회 투여하고, 이는 FVIII의 지속적인 필요성과 혈액계에서 그의 짧은 반감기로 인해 필요하고, 그의 반감기는 인간에서 약 11시간이다 (Ewenstein et al., 2004).
혈액에서, 정상 조건하에, 상기 FVIII 분자는 항상 그의 보조인자인 폰 빌레브란트 인자 (VWF)와 관련이 있고, 이는 다양한 형태의 변성 (degeneration)으로부터 FVIII 분자를 안정화시킨다. FVIII 및 VWF의 비-공유결합 복합체는 0.2-0.3 nM의 높은 결합 친화도 (binding affinity)를 갖는다 (Vlot et al., 1996).
역사적으로, 혈우병 A는 인간 혈장으로부터 기원된 FVIII로 치료되었다. 그러나, 1990년대 이래로, 다양하게 재조합으로 생산된 FVIII 단백질이 시판되었다. 그러나, 혈장-유래되거나 또는 재조합으로 생산된 FVIII 단백질 어느 것도 최적의 약동학 특성을 갖지 않았다. 많은 다른 치료 단백질 (therapeutic protein)과 마찬가지로, 이들은 펩티다제에 의해 대사 전환 (metabolic turnover)되어, 그의 인 비보 반감기를 유의하게 제한한다.
Tiede 등 (2015)에 의해 검토된 바와 같이, FVIII 반감기를 연장시키려는 시도는 Fc 융합 (Eloctate, Elocta, efmoroctocog alfa), 폴리에틸렌 글리콜의 부가 (turoctocog alfa pegol [N8-GP], BAY 94-9027, BAX 855), 및 단쇄 구조체 (CSL627)를 포함한다. 상기 모든 기술들은 FVIII 분자를 변화시켜서 대략 1.5배 반감기가 연장된 FVIII을 유도하였다.
또한 FVIII의 반감기 연장은 VWF 반감기를 제한한다. Yee 등에 의해 개시된 바와 같이, 인간 VWF D`D3 도메인은 혈장에서 FVIII을 안정시키기에 충분하다. 그러나, D´D3-Fc 융합 단백질은 VWF-/- 마우스에서만 FVIII 반감기를 연장할 수 있다. 혈우병 A 마우스에서, 상기 D'D3-Fc 구조체는 FVIII 결합에 대해 내인성 VWF와 단백질 단편의 비효율적인 경쟁으로 인해 FVIII 반감기 연장이 유도되지 않았다.
WO 2014/011819 A2에서는 VWF의 D`D3 도메인, IgG의 Fc 도메인 및 XTEN을 포함하는 FVIII 구조체의 성공적인 반감기 연장을 개시하였다. 상기 구조체는 내인성 VWF에 결합하지 않기 때문에, 동일한 반감기 연장 효과를 VWF/FVIII-이중 녹-아웃 (double knock-out: DKO) 및 혈우병 A 마우스 모두에서 볼 수 있다. 그러나, 인 비트로에서 충분히 기능적임에도 불구하고, 이는 인 비보에서 현저하게 감소된 활성을 나타내었다.
치료 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 다른 접근법으로는 상기 치료 단백질을 트란스페린 및 알부민과 같은 자연적으로 긴 반감기를 갖는 단백질, 또는 융모 생식샘자극호르몬 (chorionic gonadotropin: CG)의 C-말단 펩티드 (C-terminal peptide: CTP)와 같은 단백질 도메인으로의 유전적 융합을 포함한다.
CG는 황체형성 호르몬 (luteinizing hormone: LH), 난포-자극 호르몬 (follicle-stimulating hormone: FSH), 및 갑상선-자극 호르몬 (thyroid-stimulating hormone: TSH)을 포함하는 당단백질 호르몬 패밀리에 속한다. 상기 당호르몬 (glycohormones)은 헤테로이량체이고 또한 공통된 α-서브유닛과 그들의 상이한 활성을 부여하는 고유한 β-서브유닛으로 구성된다. 인간 CG (hCG)의 반감기는 그의 대응하는 LH, FSH 및 TSH의 반감기보다 유의하게 더 길다. 이는 hCG-β의 O-글리코실화 CTP가 상기 반감기 연장을 담당하는 것으로 나타났다. 상기 CTP는 서열 FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ로 구성되는 것으로 개시되어 있고, 이는 4개의 O-글리코실화 부위 (S*로 표시)를 포함한다 (Birken et al., 1977).
Strohl 등 (2015)에서 검토된 바와 같이, 치료 단백질 및 CTP의 다양한 융합 단백질이 개발되었고 현재 임상 시험 중에 있다. 상기 치료 단백질은 FSH (Elonva®), FVIIa, FIX, IFN-β 및 옥신토모듈린 (oxyntomodulin)을 포함한다.
본 발명은 그 중에서도, VWF의 단편에 O-글리코실화 아미노산의 클러스터 (전장 인간 VWF에 존재함)의 부가로 그의 반감기의 유의한 증가를 유도할 수 있다는 발견에 기반한다. 상기 융합 단백질의 반감기는 부가의 O-글리칸 클러스터가 존재하지 않는 VWF 단편과 비교하여 연장되었다.
그러므로, 제1 양상에 따르면, 본 발명은 주 단백질 (main protein) 및 적어도 하나의 연장 펩티드 (extension peptide)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서, 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 포유동물 단백질, 예컨대 VWF, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 유사하고, 및 상기 연장 펩티드는 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 포함한다.
흥미롭게도, VWF의 단편에 첨가되는 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 포함하는 연장 펩티드는 상기 정확한 단백질, 즉 VWF로부터 유래된다. 따라서, 본 출원인은 단백질의 반감기를 연장하기 위한 일반적인 원리를 확인하였다. 이러한 일반적인 원리는 단백질의 O-글리코실화 아미노산의 고유 클러스터를 상기 단백질 또는 그의 단편으로 첨가하는 것이다.
그러므로, 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드의 아미노산 서열은 상기 포유동물 단백질 또는 단편, 구체적으로 상기 주 단백질의 비-반복된 아미노산 서열 부분과 동일하거나 또는 유사하다.
본 발명자들의 발견으로부터의 부가의 결론은 서열번호: 1로 확인된 VWF의 O-글리코실화 아미노산의 클러스터가 반감기 연장 펩티드로 유용하다는 것이다.
반감기 연장 특성이 VWF로 한정되지 않기 때문에, 상기 제1 양상의 부가의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 VWF의 O-글리코실화 펩티드, 구체적으로 서열번호: 1에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 적어도 100 %의 서열 동일성을 갖는다.
제2 양상에서, 본 발명은 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
제3 양상에 따르면, 본 발명은 상기 제2 양상에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
제4 양상에서, 본 발명은 상기 제2 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 상기 제3 양상에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명자들은 VWF의 반감기뿐만 아니라 그의 결합 파트너인 FVIII의 반감기도 증가되는 것을 발견하였다. 그러므로, 제5 양상에 따르면, 본 발명은 제2 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질의 용도에 관한 것으로서, 상기 융합 단백질은 상기 제2 단백질에 결합할 수 있다.
그러므로, 상기 융합 단백질 및 상기 제2 단백질의 결과의 복합체 또는 조성물에서, 상기 제2 단백질은 또한 증가된 반감기를 갖는다.
그러므로, 제6 양상에서, 본 발명은 제1 단백질 및 제2 단백질의 조성물에 관한 것으로서, 상기 제1 단백질은 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질이고 또한 상기 제2 단백질에 결합할 수 있으며, 및 상기 제2 단백질은 제2 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 포함하는 치료 단백질이다.
또한 제7 양상에 따르면, 본 발명은 제1 단백질 및 제2 단백질의 복합체에 관한 것으로서, 상기 제1 단백질은 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질이고, 및 상기 제2 단백질은 제2 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는다.
마지막으로, 제8 양상에서, 본 발명은 또한, 출혈 질환 (bleeding disorder)의 치료 또는 예방에서, 바람직하게 PUPs의 치료, 또는 ITI의 치료 및 다른 관련된 출혈 질환 치료에서 사용하기 위한, 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질, 상기 제6 양상에 따른 조성물, 또는 상기 제7 양상에 따른 복합체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
도 1은 A) VWF 단편 OCTA 11, 및 B) 주 단백질로서 VWF 단편: OCTA 12를 갖는 본 발명에 따른 융합 단백질; C) 주 단백질로서 VWF 단편: OCTA14를 갖는 본 발명에 따른 융합 단백질; D) 주 단백질로서 VWF 단편: OCTA15를 갖는 본 발명에 따른 융합 단백질의 개략도를 나타낸다.
도 2는 FVIII/VWF 이중 녹 아웃 (double knock out: DKO) 마우스 혈장에서 다양한 VWF 단백질 또는 혈장-유래된 전장 VWF과 공동-제형화된 (co-formulated) FVIII의 정맥내 투여 후에 FVIII 활성의 시간-경과를 나타낸다. 상기 데이터 포인트 및 오차 막대는 5개 값의 평균 및 표준 편차 (standard deviation: SD)를 나타낸다. 크기가 작기 때문에 몇 개의 오차 막대는 식별할 수 없다.
도 3은 미니피그 (minipig) 혈장에서 OCTA 12와 공동-제형화된 100 U/kg FVIII의 피하 투여 후에 OCTA 12 항원 농도의 시간-경과를 나타낸다.
도 4는 미니피그 혈장에서 100 U/kg FVIII의 피하 및 정맥내 주사 또는 VWF-단백질 OCTA 12와 공동-제형화된 100 U/kg FVIII의 피하 주사 후에 FVIII 항원 농도의 시간-경과를 나타낸다.
명세서 및 청구범위에 대한 명료하고 일관된 이해와 그러한 용어가 주어지는 범위를 제공하기 위해서, 다음의 정의가 제공된다.
정의
본원에서 사용되는 "펩티드 (peptide)"는, 바람직하게는 펩티드 결합으로 연결되는, 임의 유형의 아미노산, 바람직하게는 자연적으로 발생하는 아미노산의 임의의 수로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 펩티드는 적어도 3개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 5, 적어도 7, 적어도 9, 적어도 12, 또는 적어도 15개의 아미노산을 포함한다. 더욱이, 펩티드의 길이에 대한 상한은 없다. 그러나, 바람직하게, 본 발명에 따른 펩티드는 500개의 아미노산 길이를 초과하지 않고, 더 바람직하게는 300개의 아미노산 길이를 초과하지 않으며; 보다 더 바람직하게는 250개의 아미노산 보다 길지 않다.
그러므로, 용어 "펩티드 (peptide)"는 일반적으로 2 내지 10개의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 나타내는 "올리고펩티드 (oligopeptides)", 및 일반적으로 10개 초과의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 나타내는 "폴리펩티드 (polypeptides)"를 포함한다.
본원에서 사용되는 "단백질 (protein)"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 갖는 단백질은 하나의 유전자로부터 하나의 폴리펩티드 사슬로 종종 발현되고 번역후에 절단된다. 그러므로, 상기 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 및 단백질은 화학적으로 합성되는 단백질뿐만 아니라 유전자에 의해 코딩되는 자연적으로 합성되는 단백질을 포함한다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 자연 출처, 예컨대 인간 혈액으로부터 수득되거나 또는 재조합 단백질과 같이 세포 배양물에서 생산될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 단백질 (therapeutic protein)"은 치료 효과를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드, 즉 활성 약학적 성분으로 사용되는 단백질과 관련이 있다.
본 발명에 따르면 용어 "단백질 전구체 (protein precursor)", "프로-단백질 (pro-protein)" 또는 "프로-펩티드 (pro-peptide)"는, 아미노산 서열 일부의 효소적 절단인 번역-후 변형에 의해 활성 형태로 전환될 수 있는 불활성 단백질 (또는 펩티드)과 관련이 있다.
2개의 아미노산 서열들 사이에서 또는 2개의 뉴클레오티드 서열들 사이에서 관련성은 "서열 동일성 (sequence identity)" 파라미터에 의해 개시된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열들 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상의 Needle 프로그램에서 수행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 파라미터들은 10의 갭 오픈 패널티 (gap open penalty), 0.5의 갭 익스텐션 패널티 (gap extension penalty), 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 행렬 (substitution matrix)이다. (간단한 옵션 없이 사용되어 수득된) "가장 긴 동일성 (longest identity)" 이라고 표시된 Needle의 출력은 동일성 퍼센트로 사용되며 다음과 같이 산출된다:
(동일한 잔기 x 100)/(얼라인먼트의 길이 - 얼라인먼트 중 갭의 총 수)
본 발명의 목적을 위해, 2개의 뉴클레오티드 서열들 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, supra), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상의 Needle 프로그램에서 수행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, supra)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 파라미터들은 10의 갭 오픈 패널티, 0.5의 갭 익스텐션 패널티, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. (간단한 옵션 없이 사용되어 수득된) "가장 긴 동일성 (longest identity)" 이라고 표시된 Needle의 출력은 동일성 퍼센트로 사용되며 다음과 같이 산출된다:
(동일한 데스옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(얼라인먼트의 길이 - 얼라인먼트 중 갭의 총 수)
펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 정의와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유사성 (similarity)" 및 "유사한 (similar)"은 참조 서열과 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 서열 동일성의 명시된 정도와 관련이 있다. 유사한 아미노산 서열은, 대상 서열에 대해 적어도 80　%, 85　%, 86　%, 87　%, 88　%, 89　%, 90　%, 91　%, 92　%, 93　%, 94　%, 95　%, 96　%, 97　%, 98　% 또는 심지어 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하도록 채택된다. 통상적으로, 유사한 서열은 활성 부위 잔기 또는 글리코실화 아미노산과 같은 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 기능과 관련된 위치에 동일한 잔기를 포함할 것이며, 그러나 임의의 수의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 유사한 뉴클레오티드 서열은, 대상 서열에 대해 적어도 80　%, 85　%, 86　%, 87　%, 88　%, 89　%, 90　%, 91　%, 92　%, 93　%, 94　%, 95　%, 96　%, 97　%, 98　% 또는 심지어 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 채택된다.
본원에서 사용되는 "동일한 (identical)"은 참조 서열에 대한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 동일성이 100　%인 것을 나타낸다.
세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용되는 용어 "재조합 (recombinant)"은 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 네이티브 (native) 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 또는 상기 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유래되는 것을 나타낸다. 그러므로, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 네이티브 (비-재조합) 형태내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 네이티브 유전자를 자연에서 발견되는 것과는 다른 수준 또는 다른 조건하에 발현한다.
본원에서 사용되는 용어 "반감기 (half-life)"는 분포의 의사-평형 (pseudo-equilibrium)이 도달된 후에 혈장/혈액 농도가 50%까지 감소하는데 필요한 시간이다 (Toutain et al., 2005에서의 정의에 따름). 상기 용어 "반감기"는 또한 "순환 반감기 (circulatory half-life)", "종말 반감기 (terminal half-life)" 또는 "제거 반감기 (elimination half-life)"를 나타낸다.
본원에서 사용되는, 세포와 관련하여 사용되는 용어 "형질전환된 (transformed)", "안정하게 형질전환된 (stably transformed)", 및 "유전자이식 (transgenic)"은, 상기 세포가, 그의 게놈에 통합되거나 또는 에피솜 (episome)으로 전달되어 여러 세대를 통해 유지되는, 비-네이티브 (예컨대 이종) 핵산 서열을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "단편 (fragment)"은 네이티브 또는 야생형 단백질과 비교하여, 하나 이상의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카르복시 말단이 결실되었지만 남은 아미노산 서열은 전장 cDNA로부터 유래된 아미노산 서열에서 해당하는 위치가 동일한 폴리펩티드를 나타낸다. 단편은 통상적으로 적어도 50개의 아미노산 길이이다.
본원에서 사용되는 용어 "글리코실화 (glycosylation)"는 분자, 예를 들어 단백질에 대한 글리칸의 부착을 나타낸다. 글리코실화는 효소 반응일 수 있다. 형성된 부착은 공유 결합을 통해 형성될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 글리코실화 폴리펩티드는 하나 또는 다수의 글리칸이 부착된 폴리펩티드이다. 문구 "고도의 글리코실화 (highly glycosylated)"는 이용가능한 글리코실화 부위, 예를 들어 O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 부위 모두 또는 거의 모두에서 글리코실화된 분자 예컨대 효소를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "글리칸 (glycan)"은 폴리사카리드 또는 올리고사카리드, 또는 당단백질 또는 글리코실화 폴리펩티드의 탄수화물 부분을 나타낸다. 글리칸은 모노사카리드 잔기들의 호모- 또는 헤테로폴리머일 수 있다. 이들은 직쇄형 또는 분지된 분자일 수 있다. 글리칸은 통상적으로 적어도 3개의 당 (sugars)을 포함하고, 또한 직쇄형 또는 분지될 수 있다. 글리칸은 천연 당 잔기 (예컨대, 글루코스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸 뉴라민산 (N-acetyl neuraminic acid), N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 만노스, 푸코스 (fucose), 아라비노스, 리보스, 크실로스 (xylose) 등) 및/또는 수식된 당 (modified sugars) (예컨대, 2'-플루오로리보스, 2'-데옥시리보스, 포스포만노스, 6'-술포-N-아세틸글루코사민 등)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "O-글리칸 (O-glycans)"은 일반적으로 포유동물 당단백질의 세린 및 트레오닌 잔기에 공유결합으로 연결되어 발견되는 글리칸을 나타낸다. O-글리칸은 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 통해 세린 또는 트레오닌의 -OH에 O-글리코시드 결합에 의해 α-연결될 수 있다. 다른 연결은 α-연결된 O-푸코스, β-연결된 O-크실로스, α-연결된 O-만노스, β-연결된 O-GlcNAc (N-아세틸-글루코사민), α- 또는 β-연결된 O-갈락토스, 및 α- 또는 β-연결된 O-글루코스 글리칸을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "O-글리코실화 클러스터", "O-글리칸 클러스터" 및 "O-글리코실화 아미노산의 클러스터"는 상호교환가능하게 사용되고 및 2 이상의 O-글리코실화 아미노산과 관련이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "시알일화 (sialylated)"는 시알산 또는 그의 유도체와 반응하는 분자 구체적으로 글리칸을 나타낸다.
전이부 용어 (transitional term) "포함하는 (comprising)"은 "포괄하는 (including)", "함유하는 (containing)", 또는 "특징으로 하는 (characterized by)"과 동의어이며, 포괄적이거나 또는 개방적 표현이며 (open-ended), 언급되지 않은 추가적인 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 전이부 용어 "구성되는 (consisting of)"은 청구범위에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분들을 배제하고, 통상 이와 관련된 불순물은 제외한다. 상기 문구 "구성하는 (consists of)"이 전제부 뒤에 바로 나타나기보다 청구범위의 본문 (body)의 절에 나타나면, 그 절에 명시된 요소만 제한하고; 다른 요소는 전체적으로 청구범위로부터 배제되지 않는다. 상기 전이부 문구 "필수적으로 구성되는 (consisting essentially of)"은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 물질 또는 단계들로 청구의 범위를 제한한다. 청구항 중 '필수적으로 구성되는 (consisting essentially of)'은 '구성되는 (consisting of)' 형식으로 작성된 폐쇄형 청구항과 '포함하는 (comprising)' 형식으로 작성된 완전 개방형 청구항 사이 중간 지점을 차지한다.
실제적인 이유로 본 발명의 문맥에서 용어 "글리코실화 단백질 (glycosylated protein)" 예컨대 융합 단백질은 단수 형태로 사용된다. 일반적으로 상기 단백질은 동일한 타입의 단백질 분자의 조성물의 형태로 나타난다. 그러나, 글리코실화 단백질의 경우에, 글리코실화는 상기 조성물의 모든 분자에서 동일하지는 않을 것이다. 예를 들어, 상기 조성물 중 개별 분자들 모두가 100 %로 글리코실화되는 것은 아니다. 더욱이, 특정 O-글리코실화 부위에 결합된 글리칸의 차이가 발생할 수 있다. 따라서, 본 출원에서 "융합 단백질"에 대한 참고는 또한 동일한 아미노산 서열을 갖지만 O-글리칸 구조에서 변화를 갖는 융합 단백질 분자들의 조성물과 관련이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 친화도 (binding affinity)" 또는 "친화도 (affinity)"는 2개의 분자, 구체적으로 리간드와 단백질 표적 사이의 결합 세기를 나타낸다. 결합 친화도는 2개의 분자들 사이의 비-공유 분자간 상호작용 예컨대 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 및 반 데르 발스 힘 (van der Waals forces)의 영향을 받는다.
본원에서 사용되는 면역 반응은 적응 (adaptive) 또는 선천 (innate) 면역 반응과 관련이 있다. 상기 선천 면역 반응은 체내에서 항원의 출현 즉시 또는 수 시간내에 활성화되는 비특이적 방어 기전을 나타낸다. 상기 기전은 물리적 장벽 예컨대 피부, 혈중 화학물질, 및 체내 외래 세포를 공격하는 면역계 세포를 포함한다. 상기 선천 면역 반응은 항원의 화학적 특성에 의해 활성화된다. 상기 적응 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응을 나타낸다. 이를 위해, 먼저 상기 항원은 처리되고 인식되어야 한다. 일단 항원이 인식되어지면, 적응 면역계는 상기 항원을 공격하도록 특이적으로 설계된 다량의 면역 세포를 형성한다.
융합 단백질
제1 양상에 따르면 본 발명은 주 단백질 및 적어도 하나의 연장 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사하고, 및 상기 연장 펩티드는 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 포함한다.
본 발명자들은 단백질의 변형으로, 즉 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 포함하는 연장 펩티드의 첨가로 반감기를 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 실시예에서 개시된 바와 같이, VWF의 단편에 연장 펩티드로서 인간 VWF의 O-글리코실화 클러스터 1의 융합으로 VWF 단편 (OCTA 11) 단독인 경우와 비교하여, 증가된 반감기를 갖는 융합 단백질 (OCTA 12)을 유도하였다.
상기 반감기 (t1/ 2)는 개별 혈장 농도-시간 곡선의 로그-선형 부분 (log-linear portion)의 선형 회귀 분석 (linear regression analysis) 또는 단일상 지수 기하감쇠 모델 (one-phase exponential decay model)을 사용하는 비-선형 회귀 (non-linear regression)에 의해 산출될 수 있다. 산출을 위한 예시되는 소프트웨어 프로그램은 GraphPad Prism 버전 6.07 (La Jolla, CA 92037 USA) 및 WinNonlin, 버전 6.4 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)이 있다.
산출은 하기 식에 기반한다:
Figure pct00001
Kel = 제거율 상수
t½ = 제거 반감기
c = 농도
t = 시간
그러므로, 일 구체예에 따르면, 상기 융합 단백질은 연장 펩티드가 존재하지 않는 주 단백질과 비교하여 증가된 반감기를 갖는다.
상기 VWF로부터 유래된 글리코실화 아미노산의 클러스터에 의해 VWF 단편의 반감기를 증가시킬 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 반감기 연장을 위한 새로운 원리를 확인하였다. 즉, 자연적으로 발생하는 단백질에서도 존재하는 O-글리코실화 아미노산 클러스터의 부가로 단백질 또는 단백질 단편의 반감기가 증가한다.
그러므로, 상기 융합 단백질의 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드의 아미노산 서열은 상기 포유동물 단백질의 섹션과 동일하거나 또는 유사하다. 상기 포유동물 단백질의 섹션은 구체적으로 비-반복된 아미노산 서열이다.
본원에서 사용되는 비-반복된 아미노산 서열은 본 발명에 따른 자연적으로 발생하는 포유동물 단백질에서 단 하나의 카피에서 발견되는 서열이다. 그러므로, 상기 비-반복된 아미노산 서열은 명시적으로 단백질에서 자연적으로 발생되는 임의의 반복되는 서열을 배제한다. 구체적으로 상기 서열이 20개 초과의 아미노산, 바람직하게 15개 초과의 아미노산, 더 바람직하게 10개 초과의 아미노산으로 구성되고, 또한 상기 포유동물 단백질이 상기 서열을 하나 초과로 포함하는 경우 서열은 반복되는 것으로 간주된다.
반복된 서열은 소위 가변 수 탠뎀 반복 (variable number tandem repeats)으로부터 유래될 수 있다. 가변 수 탠뎀 반복 (VNTR)은 짧은 뉴클레오티드 서열이 "탠뎀 반복"으로 정렬된 게놈내에 한 위치이다. 하나 이상의 뉴클레오티드 패턴이 반복되고 또한 그 반복이 서로 직접 인접해있다면 "탠뎀 반복"이 DNA에서 발생한다. VNTRs은 많은 염색체에서 발견되고, 및 종종 개체들 사이에서 길이가 다양하다. 탠뎀 반복이 단백질 코딩 DNA 서열에 위치하는 경우에, 이는 아미노산 서열 반복을 유도한다. 예로는 뮤신 단백질 패밀리의 모든 구성원에서 발견되는 탠뎀 반복이 있다. 뮤신 (Mucins)은 동물계의 대부분의 생물체에서 상피 조직에 의해 생산되는 고분자량의, 중질 글리코실화 단백질의 패밀리이다. 본 발명에 따른 비-반복된 아미노산 서열은 명시적으로 이러한 아미노산 서열 탠뎀 반복, 구체적으로 뮤신 탠뎀 반복을 배제한다.
상기 연장 펩티드는 상기 주 단백질과 동일한 포유동물 단백질로부터 유래될 뿐만 아니라 더 구체적으로 상기 주 단백질에 또한 존재하는 섹션을 포함할 수 있다. 그러므로, 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드의 아미노산 서열은 상기 주 단백질의 비-반복된 아미노산 서열 섹션과 동일하거나 또는 유사하다.
바람직하게, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 융모 생식샘자극호르몬 β-서브유닛 (CG-β)으로부터 유래되지 않는다. 상기 융모 생식샘자극호르몬 β-서브유닛의 C-말단 펩티드 (CTP)는 FSH, FVIIa, 및 FIX와 같은 다른 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 부가의 CTP, 즉 하나 초과의 CTP 카피를 갖는 hCG가 개시된 경우에, 이러한 단백질은 특히 본 발명의 주제로부터 배제된다. 그러므로, 구체적으로 상기 연장 펩티드는 CG-β의 CTP와 동일하거나 또는 유사하지 않다.
본 발명에 따르면, 아미노산 서열 중의 근접한 둘 이상의 O-글리코실화 아미노산은 클러스터로 간주된다. 그러므로, 상기 융합 단백질의 일 구체예에 따르면, 상기 적어도 하나의 연장 펩티드의 O-글리코실화 아미노산의 클러스터는 적어도 2개의 O-글리코실화 아미노산을 포함한다. 상기 클러스터는 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 O-글리코실화 아미노산을 포함할 수 있다.
이론에 따르면, 반감기 연장 효과는 O-글리칸의 네가티브 전하에 기반한다. 그러므로, 반감기 연장의 효과는 상기 클러스터 중에 O-글리코실화 아미노산의 수에 의해 증가할 것이다. 그러므로, 상기 클러스터는 바람직하게 적어도 3개의 O-글리코실화 아미노산을 포함한다. 실시예에서 개시된 바와 같이 유의한 반감기 전파 효과 (propagation effect)는 4개의 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 갖는 연장 펩티드에 의해 달성된다. 그러므로, 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 클러스터는 적어도 4개의 O-글리코실화 아미노산을 포함한다.
클러스터 중의 O-글리코실화 아미노산 이외에 또한 N-글리코실화 아미노산이 존재할 수 있다. 바람직하게 상기 O-글리코실화 클러스터 중에 N-글리코실화 아미노산은 없다.
하나 초과의 연장 펩티드가 존재하는 경우에, 상기 연장 펩티드의 클러스터는 상이한 수의 O-글리코실화 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질은 2개의 O-글리코실화 아미노산을 갖는 하나의 클러스터와 4개의 O-글리코실화 아미노산을 갖는 제2 클러스터를 포함할 수 있다. 또한, 하나의 클러스터는 3개의 O-글리코실화 부위 및 다른 것은 4개의 O-글리코실화 부위를 포함할 수 있다.
상기 연장 펩티드의 O-글리코실화 아미노산은 뮤신-타입 O-글리코실화 아미노산 세린 (Ser) 및 트레오닌 (Thr)일 수 있다. 그러나, 또한 O-글리코실화 티로신 (Tyr), 히드록시리신 (히드록시-Lys) 또는 히드록시프롤린 (히드록시-Pro)이 당분야에 알려져 있다. 그러므로, 상기 융합 단백질, 구체적으로 연장 펩티드 중에 하나 이상의 O-글리코실화 아미노산은 Ser, Thr, Tyr, 히드록시-Lys 및 히드록시-Pro로부터 선택될 수 있다.
OCTA 12에서 VWF 단편에 융합되는 연장 펩티드는, 상기 단편의 반감기 연장을 유도하고, O-글리코실화 트레오닌 잔기와 세린 잔기 둘 다를 포함한다. 그러므로, 상기 제1 양상의 일 구체예에 따르면, 상기 O-글리코실화 아미노산의 클러스터는 적어도 하나의 O-글리코실화 트레오닌을 포함한다. 바람직하게, 상기 클러스터는 O-글리코실화 아미노산으로서 트레오닌과 세린 둘 다를 포함한다. 흥미롭게도, 상기 OCTA 12의 연장 펩티드는 O-글리코실화되는 2개의 인접 트레오닌 잔기를 포함한다. 그러므로, 일 구체예에서 상기 연장 펩티드는 적어도 2개의 인접 O-글리코실화 트레오닌 잔기를 포함한다.
상기에서 설명된 바와 같이, O-글리칸에 의해 생성되는 단백질 표면의 네가티브 전하는 반감기 연장을 유도하는 것으로 사료된다. 이론에 국한되지 않고, 효과를 표명하기 위해, 근접한 둘 이상의 O-글리칸이 필요한 것으로 사료된다. 상기 O-글리칸 사이의 갭이 너무 커지면, 즉 15개의 아미노산 중에 1 미만의 O-글리코실화 아미노산을 가지면 그 효과는 약해지거나 또는 폐지될 수 있다. 그러므로, 상기 융합 단백질의 일 구체예에 따르면, 상기 적어도 하나의 연장 펩티드는 15개의 아미노산 중에 적어도 하나의 O-글리코실화 아미노산을 포함한다.
더 바람직하게, 상기 적어도 하나의 연장 펩티드는 10개의 아미노산 중에 적어도 하나의 O-글리코실화 부위를 포함한다. 실시예에서 개시된 바와 같이, 시험된 연장 펩티드는 8개의 아미노산 중에 하나의 O-글리코실화 부위를 갖는 클러스터를 포함한다. 그러므로, 바람직한 일 구체예에 따르면 상기 하나 이상의 클러스터는 8개의 아미노산 중에 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함한다.
상기 연장 펩티드의 길이는 2개의 상이한 양상에 의해 정의된다. 상기 연장 펩티드는 상기 O-글리코실화 아미노산의 글리코실화를 촉진하는 인식 부위를 포함하도록 충분히 길어야 한다. 그러므로, 상기 연장 펩티드는 길이가 적어도 10개의 아미노산이어야 한다. 한편, 상기 연장 펩티드가 더 짧아지면, 구조적 완전성 또는 활성을 방해하여 상기 주 단백질의 치료 효과가 떨어질 수 있다. 그러므로, 상기 연장 펩티드는 100개의 아미노산을 초과하지 않아야 한다. 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 15 내지 60개의 아미노산 범위의 길이를 갖는다. 상기 연장 펩티드내에서 4개의 아미노산이 O-글리코실화되도록 하기 위해, 상기 길이는 바람직하게 22 내지 40개의 아미노산 범위이다. 더 바람직하게, 상기 연장 펩티드의 길이는 OCTA 12에서 연장 펩티드의 길이, 즉 26 내지 36개의 아미노산 범위이다. 일 구체예에 따르면 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 약 31개의 아미노산의 길이를 갖는다.
본 발명자들의 발견은 단백질에 자연적으로 존재하는 O-글리코실화 펩티드의 하나 이상의 카피를 부가하여 동일한 단백질 또는 그의 단편의 반감기를 증가시키려는 원리의 결론을 유도하였다. 또한, 제시된 결과는, CTP와 유사하게 VWF의 특정 O-글리코실화 펩티드가 다른 단백질, 즉 일반적인 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다는 것을 확실하게 한다.
그러므로, 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 인간 VWF의 O-글리코실화 펩티드에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는다. 이러한 인간 VWF 유래된 연장 펩티드는 다른 포유동물 단백질 또는 그의 단편, 예컨대 FVIII에 융합될 수 있다. 상기 하나 이상의 연장 펩티드의 서열 동일성은 바람직하게 인간 VWF의 O-글리코실화 펩티드에 대해 적어도 95 %이다. 더 바람직하게 상기 서열 동일성은 적어도 98 %이다. 가장 바람직하게 상기 연장 펩티드의 서열은 인간 VWF의 O-글리코실화 펩티드와 동일하다.
인간 VWF의 O-글리코실화 펩티드는 바람직하게 VWF의 적어도 일부의 O-글리코실화 클러스터 2 (서열번호: 2의 아미노산 1238-1268): QEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH (서열번호: 1) 또는 그의 변형체를 포함한다. 그러므로, 일 구체예에 따르면, 상기 연장 펩티드는 서열번호: 1에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는다. 서열번호: 1에 대한 서열 동일성은 바람직하게 적어도 95 %이다. 더 바람직하게, 상기 연장 펩티드의 서열번호: 1에 대한 서열 동일성은 적어도 98 %이다. 가장 바람직하게, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 서열번호: 1에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는다.
상기 주 단백질은 포유동물 단백질에 기반하고, 즉 포유동물 단백질 또는 그의 단편과 유사하거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하다. 상기 포유동물 단백질은 구체적으로 인간 단백질이다.
상기 주 단백질의 아미노산 서열이 유사하거나 또는 동일한 포유동물 단백질은 글리코실화 단백질일 수 있다. 상기 융합 단백질의 일 구체예에 따르면, 상기 주 단백질은 상기 포유동물 단백질의 글리코실화 섹션을 포함한다. 다른 구체예에 따르면, 상기 주 단백질은 O-글리코실화 아미노산의 적어도 하나의 클러스터를 포함한다. 상기 O-글리코실화 아미노산의 클러스터는 연장 펩티드에서 O-글리코실화 아미노산의 클러스터와 동일할 수 있다.
상기 주 단백질에 기반한 포유동물 단백질은 더 바람직하게 혈액 단백질이다. 일 구체예에 따르면, 상기 포유동물 단백질은 인간 혈액 단백질이다.
상기 포유동물 혈액 단백질은 혈액 응고 인자, 수송 단백질 (transport protein), 프로테아제 저해제, 면역글로불린, 세포 관련 혈장 단백질 (cell related plasma protein), 아포지질단백질 (apolipoproteins), 보체 인자 (complement factor), 성장 인자, 항혈관형성 단백질 (antiangiogenic protein), 고도의 글리코실화 단백질, 혈액 인자 또는 다른 혈액 단백질일 수 있다.
상기 혈액 응고 인자, 구체적으로 인간 혈액 응고 인자는, 바람직하게 피브리노겐 (fibrinogen: FI), 프로트롬빈 (prothrombin: FII), 조직 인자 (FIII), FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII, VWF, 및 ADAMTS13으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
상기 응고 인자들 FI, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII은 불활성화된 형태이거나 또는 활성화된 형태일 수 있는 것으로 인정된다. 그러므로, 본 발명의 문맥에서, FI, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII에 대한 언급은, 명백하게 다르게 명시하지 않거나 또는 문맥으로부터 상기 활성화된 형태가 논리적으로 배제되지 않는 한, 각각 활성화된 형태들 FIa (피브린), FIIa (트롬빈), FVa, FIXa, FVIIa, FVIIIa, FXa, FXIa, FXIIa, 및 FXIIIa를 포함한다. 그러므로, 예컨대 본 문맥에서 FI, FII, FV, FIX, FVII, FVIII, FX, FXI, FXII, 및 FXIII은 FI/FIa, FII/FIIa, FV/FVa, FVII/FVIIa, FVIII/FVIIIa, FIX/FIXa, FX/FXa, FXI/FXIa, FXII/FXIIa, 및 FXIII/FXIIIa로 판독될 수 있다.
상기 수송 단백질, 구체적으로 인간 수송 단백질은 알부민, 트란스페린 (transferrin), 세룰로플라스민 (ceruloplasmin), 합토글로빈 (haptoglobin), 헤모글로빈 (hemoglobin), 및 헤모펙신 (hemopexin)으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 포유동물 단백질은 프로테아제 저해제, 구체적으로 인간 프로테아제 저해제이다. 이러한 프로테아제 저해제의 예로는 β-안티트롬빈 (β-antithrombin), α-안티트롬빈, 전잠재-안티트롬빈 (pre-latent-antithrombin), 산화된-안티트롬빈, 2-마크로글로불린 (2-macroglobulin), C1-저해제, 조직 인자 경로 저해제 (tissue factor pathway inhibitor: TFPI), 헤파린 보조인자 II, 단백질 C 저해제 (PAI-3), 단백질 C, 단백질 S, 및 단백질 Z이다.
면역글로불린의 예로는 가령 폴리클로날 항체 (IgG), 모노클로날 항체, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, IgM, IgE, IgD, 및 Bence Jones 단백질이다.
상기 세포 관련 혈장 단백질은 예를 들어, 피브로넥틴 (fibronectin), 트롬보글로불린 (thromboglobulin), 또는 혈소판 인자 4일 수 있다. 아포지질단백질의 예로는 아포 A-I, 아포 A-II, 및 아포 E이다.
본 발명에 따른 보체 인자는 예컨대 인자 B, 인자 D, 인자 H, 인자 I, C3b-불활성화제 (Inactivator), 프로페르딘 (properdin), C4-결합 단백질 등이다.
성장 인자의 예로는 혈소판 유래 성장 인자 (Platelet derived growth factor: PDGF), 표피 성장 인자 (Epidermal growth factor: EGF), 전환 성장 인자 알파 (Transforming growth factor alfa: TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 섬유모세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor: FGF) 및 간세포 성장 인자 (Hepatocyte growth factor)를 포함한다.
항혈관형성 단백질은 잠재-안티트롬빈 (latent-antithrombin), 전잠재-안티트롬빈 (prelatent-antithrombin), 산화된-안티트롬빈 및 플라스미노겐 (plasminogen)을 포함한다.
고도의 글리코실화 단백질의 예로는 알파-1-산 당단백질 (alfa-1-acid glycoprotein), 안티키모트립신 (antichymotrypsin), 인터-α-트립신 저해제 (inter-α-trypsin inhibitor), α-2-HS 당단백질 (α-2-HS glycoprotein), C-반응성 단백질 (C-reactive protein)이고, 혈액 인자는 예컨대, 에리트로포에이틴 (erythropoeitin), 인터페론 (interferon), 종양 인자, tPA, 또는 gCSF일 수 있다.
다른 인간 혈액 단백질은 히스티딘-풍부 당단백질, 만난 결합 렉틴 (mannan binding lectin), C4-결합 단백질, 피브로넥틴 (fibronectin), GC-글로불린, 플라스미노겐/플라스민, α-1 마이크로글로불린 (microglobulin), C-반응성 단백질을 포함한다.
상기 포유동물 단백질은 구체적으로 인간 vWF, 피브리노겐, 프로트롬빈, FIII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, ADAMTS13, 안티트롬빈, 알파-1 안티트립신, C1-저해제, 안티키모트립신, PAI-1, PAI-3, 2-마크로글로불린, TFPI, 헤파린 보조인자 II, 단백질 Z, 단백질 C, 및 단백질 S로부터 선택된다.
인간 인자 VIII은 6개의 액손 (axons)내에 187.000개의 염기쌍 (base pairs)을 포함하는 F8 유전자로 코딩된다. 전사된 mRNA는 9.029개의 염기쌍의 길이를 가지며 또한 19개의 아미노산이 제거된 2.351개의 아미노산을 갖는 단백질로 번역된다. 인간에서 FVIII 분자는 31개의 아미노산에서 글리코실화되고, 이는 25개의 N-글리코실화와 6개의 O-글리코실화를 갖는다 (Kannicht et al., 2013 참조).
번역 후에, 상기 아미노산 사슬은 특정 프로테아제에 의해 약 200　kDa의 중쇄 및 약 80　kDa의 경쇄의 형성을 유도하는 위치에서 절단된다. 상기 도메인 조직은 통상적으로 A1-A2-B-A3-C1-C2를 특징으로 한다. 상기 경쇄는 도메인 A3-C1-C2로 구성된다. 상기 중쇄는 원래 도메인 A1-A2-B로 이루어진다. 혈장에서 발견되는 중쇄는 분자량이 90 내지 200 kDa인 이질성 조성물 (heterogeneous composition)을 갖는다. 이에 대한 이유는 그의 글리코실화에서 이질성 (heterogeneity), 스플라이스 변이체 (splice variants)의 존재 및 단백질분해 산물 가령 B 도메인 결실된 중쇄 A1-A2의 존재에 있다. 전장 FVIII의 아미노산 서열은, 1986년 7월 21일의 UniProtKB의 P00451의 아미노산 20 내지 2.351, 서열 버전 1에 의해 확인되었다 (이후에 UniProtKB P00451.1).
일 구체예에 따르면 주 단백질이 유사 또는 동일한 포유동물 단백질은 UniProtKB P00451.1의 아미노산 20 내지 2.351로 확인된 인간 전장 FVIII이다. 다른 구체예에 따르면, 상기 주 단백질은 FVIII로, B-도메인의 적어도 일부가 결실된 FVIII이다. 이와 관련하여 전체 B-도메인이 결실될 수 있다. 상기 B-도메인의 결실 부분은 선택적으로 링커에 의해 대체된다. 상기 링커 서열은 구체적으로 하기 아미노산 서열 SFSQNSRHQAYRYRRG (서열번호: 12)을 갖는다. 상기 B-도메인이 링커로 대체되는 FVIII의 예는 Nuwiq® 또는 Vihuma®의 활성 성분인 시목토코그 알파 (Simoctocog alfa)이다. 시목토코그 알파는 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00002
vWF는 포유동물의 혈장내에 존재하는 다량체 부착 당단백질 (multimeric adhesive glycoprotein)이고, 이는 다수의 생리적 기능을 갖는다. 1차 지혈 (primary hemostasis) 중에, VWF는 혈소판 표면상의 특정 수용체와 세포외 매트릭스의 성분들 예컨대 콜라겐 사이의 매개체 (mediator)로 작용한다. 더욱이, VWF는 응혈원 인자 (pro-coagulant Factor) VIII에 대한 담체 및 안정화 단백질로 제공된다. VWF는 내피 세포 및 거핵구 (megakaryocytes)에서 2813개의 아미노산 전구체 분자로 합성된다.
상기 VWF의 도메인 조직은 통상적으로 Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-CK를 특징으로 한다.
상기 전구체 폴리펩티드인, 프리-프로-VWF (pre-pro-VWF)는 성숙한 혈장 폰 빌레브란트 인자에서 발견되는 22-잔기 시그날 펩티드, 741-잔기 프로-펩티드 (도메인 D1-D2) 및 2050-잔기 폴리펩티드로 구성된다 (Fischer et al., 1994). 전장 VWF는 UniprotKB의 엔트리 P04275에 의해 확인된다(2017년 4월 12일의 엔트리 버전 224).
본 발명에 따른 인간 VWF는 상기 UniprotKB P04275의 서열, 구체적으로 서열번호: 2 (이소형태 1)의 아미노산 서열을 갖는다. VWF는 O-글리코실화 아미노산의 2개의 클러스터를 포함한다. 상기 O-글리코실화 아미노산의 제1 클러스터는 서열번호: 2의 아미노산들 1238 내지 1268 사이에서 발견된다. 상기 제2 클러스터는 서열번호: 2의 아미노산 1468 내지 1487을 포함한다.
혈장으로 분비 시에, VWF는 다양한 분자 크기를 갖는 다양한 종의 형태로 순환한다. 상기 VWF 분자는 2050개의 아미노산 잔기의 성숙한 서브유닛의 올리고머 및 멀티머로 구성된다. VWF는 보통 혈장에서 대략 500 내지 20.000 kDa 크기 범위의 멀티머로 발견될 수 있다 (Furlan et al. 1996).
일 구체예에 따르면, 상기 주 단백질은 인간의 성숙한 VWF의 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에 따르면 상기 주 단백질은 인간 VWF의 단편의 서열과 유사하거나 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어, 인간 VWF의 단편에서 도메인들 A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, CK의 하나 이상이 인간의 성숙한 VWF (Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-CK)에 대해 결실될 수 있다. 상기 단편인 VWF 단편은, 예를 들어, Til3-D3-TIL4-A1, Til3-D3-TIL4-A1-A2, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2, 및 Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-CK로 구성된 그룹으로부터 선택된 도메인 조직을 갖는다.
이와 관련하여 인간 VWF의 단편은 구체적으로 서열번호: 2의 아미노산 764로 시작하는 단편이다. 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1035는 VWF의 FVIII 결합 도메인을 포함한다.
상기 주 단백질은 예를 들어 WO 2015/185758 A2에서 정의된 바와 같은 VWF의 단편을 포함할 수 있다. WO 2015/185758 A2에서 정의된 바와 같이, 이에 정의된 바와 같은 FVIII 및 VWF 단편의 복합체는 FVIII 단독과 비교하여 포스포리피드 막으로의 감소된 결합뿐만 아니라 FVIII 및 전장 VWF의 복합체와 비교하여 콜라겐 III 및 헤파린으로의 감소된 결합을 나타낸다.
바람직하게 서열번호 2의 아미노산 764로 시작하는 VWF의 단편은 바람직하게 1905 내지 2153 범위의 서열번호: 2의 아미노산으로 끝난다. 일 구체예에 따르면, 상기 VWF 단편은 서열번호: 2의 2030 내지 2153 범위의 VWF의 아미노산으로 끝난다. 부가의 구체예에 따르면, 상기 VWF 단편은 2100 내지 2153 범위의 서열번호: 2의 아미노산으로 끝난다.
일 구체예에 따르면 상기 주 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268과 유사하거나 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구체예에 따르면 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268에 대해 적어도 95 %의 동일성을 갖는다. 또한, 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268에 대한 상기 주 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 주 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1905와 유사하거나 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구체예에 따르면 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1905에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1905에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1905에 대한 상기 주 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1905에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
상기 융합 단백질은 임의의 수의 연장 펩티드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 연장 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질 OCTA 12는 상기 연장 펩티드의 2개의 카피를 포함하고 또한 VWF 단편 OCTA 11과 비교하여 반감기의 유의한 증가를 나타내었다. 그러므로, 일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질은 적어도 2개의 연장 펩티드를 포함한다.
현재 반감기 연장 효과는 연장 펩티드 중의 O-글리칸의 네가티브 전하에 적어도 일부 기반하는 것으로 이해된다. 그러므로, 상기 연장 펩티드의 카피 수의 증가는 반감기 연장 효과의 추가적 증가를 초래한다. 이는 상기 연장 펩티드의 4개의 카피를 포함하는 OCTA 14로 확인되었다. 그러므로, 일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질은 적어도 4개의 연장 펩티드를 포함한다.
한편, 상기 연장 펩티드의 카피 수에 의해, 상기 연장 펩티드는 구조적 완전성 또는 활성을 방해하여, 그 때문에 상기 주 단백질의 치료 효과를 방해할 기회가 증가한다. 그러므로, 일 구체예에 따르면 상기 연장 펩티드의 수는 11 이하이다.
상기 융합 단백질은 상기 주 단백질 및 연장 펩티드 이외에, 추가의 펩티드 성분을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 연장 펩티드 이외에, 상기 융합 단백질은 반감기를 연장하기 위한 추가의 펩티드, 예컨대 CTP, XTEN, 트란스페린 또는 그의 단편, 알부민 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
상기 주 단백질은 포유동물 단백질의 단편이고 및 상기 융합 단백질은 동일한 포유동물 단백질의 부가의 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 2개의 단편은 하나 이상의 연장 펩티드로 분리된다. 이러한 단백질의 예로는 OCTA 15이고, 이는 VWF의 아미노산 764 내지 1268, 서열 서열번호: 1을 갖는 2개의 연장 펩티드 및 서열번호: 2의 아미노산 2721 내지 2813으로 구성된 VWF의 "시스테인 노트 도메인 (cystein knot domain)"을 포함한다.
상기 융합 단백질에서, 하나 이상의 연장 펩티드는 상기 주 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질은 상기 주 단백질의 N-말단에 연결된 하나 이상의 연장 펩티드 및 상기 주 단백질의 C-말단에 연결된 하나 이상의 연장 펩티드를 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은 상기 주 단백질 및 하나 이상의 연장 펩티드 이외에 추가의 펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 연장 펩티드는 상기 주 단백질에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 이와 관련하여, "직접적으로 연결된 (directly linked)"은 상기 주 단백질과 연장 펩티드의 아미노산 서열들이 바로 인접해 있는 것을 의미한다. "간접적으로 연결된 (Indirectly linked)"은 상기 주 단백질과 상기 연장 펩티드 사이에 추가의 펩티드가 위치하는 것을 의미한다. 구체적으로, 링커 펩티드는 상기 주 단백질과 상기 연장 펩티드 사이에 위치할 수 있다. 상기 링커는 절단 부위를 포함할 수 있어서, 상기 주 단백질로부터 연장 펩티드를 절단가능하게 한다.
상기 주 단백질, 하나 이상의 연장 펩티드 및 선택적으로 추가의 펩티드는 이들을 코딩하는 유전자, cDNAs, 또는 서열의 결합으로 생산될 수 있다. 따라서, 상기 주 단백질, 하나 이상의 연장 펩티드 및 선택적으로 추가의 펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된다. 본 발명에 따르면, 상기 융합 단백질의 펩티드는 다른 링커 예컨대 화학적 링커 또는 글리코시드 결합 (glycosidic bonds)을 통해 연결될 수 있다. 바람직하게, 상기 융합 단백질의 펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된다.
일 구체예에 따르면 연장 펩티드는 상기 주 단백질의 C-말단에 직접 연결된다. 구체적으로, 상기 융합 단백질은 상기 주 단백질의 C-말단에 연결된 적어도 2개의 연속 연장 펩티드를 포함한다.
상기 융합 단백질은 2개의 하나 이상의 친화성 태그 (affinity tags)에 연결될 수 있다. 친화성 태그의 예로는 폴리히스티딘, 단백질 A, 글루타티온 S 트란스퍼라제, 물질 P, FLAG, 스트렙타비딘 (streptavidin), 및 면역글로불린 중쇄 불변 영역이 있다. 상기 친화성 태그는 일반적으로 전체 구조체의 아미노산 서열의 일부를 형성하지만, 상기 친화성 태그는 상기 융합 단백질의 일부로 간주되지 않는다. 상기 하나 이상의 친화성 태그는 바람직하게 상기 융합 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 연결된다. 상기 융합 단백질이 하나 이상의 친화성 태그에 연결되는 경우, 상기 융합 단백질은 바람직하게 상기 친화성 태그와 상기 단백질의 나머지 사이에 절단 부위를 포함하여 예컨대 프로테아제 절단에 의해 친화성 태그를 절단가능하게 한다.
일 구체예에 따르면, 하나의 연장 펩티드는 상기 융합 단백질의 N-말단을 형성한다. 상기에서 설명한 바와 같이 상기 연장 펩티드의 N-말단 아미노산은 선택적으로 친화성 태그에 연결된다. 일 구체예에 따르면, 하나의 연장 펩티드는 상기 융합 단백질의 C-말단을 형성한다. 상기에서 설명한 바와 같이 상기 연장 펩티드의 C-말단 아미노산은 친화성 태그에 선택적으로 연결된다.
일 구체예에 따르면 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 상기 주 단백질과 비교하여, 적어도 4, 바람직하게 적어도 8, 더 바람직하게 적어도 12개의 부가의 O-글리칸을 포함한다.
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질은 이량체화 도메인을 포함하고; 구체적으로 상기 주 단백질은 이량체화 도메인을 포함한다. VWF에서, 이량체는 CK-도메인들의 결합에 의해 형성된다. 그러므로, 상기 주 단백질이 VWF 단편인 경우에, 이는 바람직하게 CK-도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 대표적인 융합 단백질은 OCTA 12이다. OCTA 12는 하기 아미노산 서열을 갖는다 (서열번호: 3):
Figure pct00003
OCTA 12는 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268의 VWF 단편 및 서열번호: 2의 아미노산 1238 내지 1268로 구성된 C-말단에 결합된 연장 펩티드의 2개의 카피 (진하게)의 융합 단백질이다.
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 3에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 3에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 3에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 3에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
하기 서열 (서열번호: 4)은 추가 12개의 아미노산 시그날 펩티드 (진하게 및 밑줄)를 갖는 OCTA 12를 나타낸다. 본 펩티드의 표현은 OCTA 12의 단량체 형태를 제공한다. 상기 시그날 펩티드는 절단된다.
Figure pct00004
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 4에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 4에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 4에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 4에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 부가의 대표적인 융합 단백질은 OCTA 12 및 시그날 펩티드 (진하게 및 밑줄)를 갖는 프로펩티드 (진하게)를 포함하는 프로-OCTA 12이다. 프로-OCTA 12는 서열번호: 5로 확인된다:
Figure pct00005
프로-OCTA 12의 발현은 이량체의 형성을 유도한다. 상기 펩티드 이량체는 프로펩티드의 절단 후에 남아 있다.
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 5에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 5에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 5에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 부가의 대표적인 융합 단백질은 OCTA 14이다. OCTA 14는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00006
OCTA 14는 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268의 VWF 단편 및 서열번호: 2의 아미노산 1238 내지 1268로 구성된 C-말단에 결합된 연장 펩티드의 4개의 카피 (진하게)의 융합 단백질이다.
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 6에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 6에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 6에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 6에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
하기 서열 (서열번호: 7)은 추가 12개의 아미노산 시그날 펩티드 (진하게 및 밑줄)을 갖는 OCTA 14를 나타낸다. 상기 펩티드의 표현은 OCTA 14의 단량체 형태를 제공한다. 상기 시그날 펩티드는 절단된다.
Figure pct00007
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 7에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 7에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 7에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 7에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 부가의 대표적인 융합 단백질은 OCTA 14 및 시그날 펩티드 (진하게 및 밑줄)를 갖는 프로펩티드 (진하게)를 포함하는 프로-OCTA 14이다. 프로-OCTA 14는 서열번호: 8로 확인된다:
Figure pct00008
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 8에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 8에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 8에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 8에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 부가의 대표적인 융합 단백질은 OCTA 15이다. OCTA 15는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00009
OCTA 15는 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268의 VWF 단편, 서열번호: 2의 아미노산 1238 내지 1268로 구성된 C-말단에 결합된 연장 펩티드의 2개의 카피 (진하게) 및 서열번호: 2의 아미노산 2721 내지 2813으로 구성된 VWF의 "시스테인 노트 도메인"의 융합 단백질이다.
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 9에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 9에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 9에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 9에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
하기 서열 (서열번호: 10)은 추가 12개의 아미노산 시그날 펩티드 (진하게 및 밑줄)을 갖는 OCTA 15를 나타낸다. 상기 펩티드의 표현은 OCTA 15의 이량체 형태를 제공한다. 상기 시그날 펩티드는 절단된다.
Figure pct00010
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 10에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 10에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 10에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 10에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 부가의 대표적인 융합 단백질은 OCTA 15 및 시그날 펩티드 (진하게 및 밑줄)를 갖는 프로펩티드 (진하게)를 포함하는 프로-OCTA 15이다. 상기 서열의 표현은 다량체의 형성을 유도할 것이다. 프로-OCTA 15는 서열번호: 11로 확인된다:
Figure pct00011
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 11에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 11에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 11에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 11에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질은 상기 연장 펩티드의 둘 이상의 카피를 갖는 시목토코그 알파에 기반한 변형된 FVIII 단백질이다.
본 구체예에서, 상기 주 단백질은 바람직하게 FVIII의 중쇄, 구체적으로 UniprotKB P00451.1의 아미노산 20 내지 759와 동일하거나 또는 유사하다. 상기 FVIII의 중쇄, 구체적으로 UniprotKB P00451.1의 아미노산 20 내지 759와 동일하거나 또는 유사한 주 단백질을 갖는 융합 단백질은, 바람직하게 부가적으로 서열번호: 12와 유사하거나 또는 동일한 링커 및 UniprotKB entry P0045.1의 아미노산 1668 내지 2351로 확인되는 경쇄와 유사하거나 또는 동일한 추가의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 연장 펩티드는 경쇄의 C-말단에 융합될 수 있다. 대안으로서, 상기 연장 펩티드는 중쇄와 경쇄 사이에 위치한다. 이와 관련하여 상기 연장 펩티드는 상기 링커의 C-말단 또는 N-말단에 연결될 수 있다. 상기 연장 펩티드는 또한 상기 링커를 대체할 수 있다. 더욱이, 상기 링커 서열은 하나 이상의 연장 펩티드에 의해 중단될 수 있다. 또한 연장 펩티드는 중쇄와 경쇄 사이 및 상기 경쇄의 C-말단 둘 다에 위치할 수 있다.
바람직하게, 시목토코그 알파에 기반한 융합 단백질은, N-말단으로부터 C-말단까지, FVIII의 중쇄, 링커의 제1 부분, 둘 이상의, 바람직하게 3개의 연장 펩티드 (진하게), 링커의 제2 부분 (밑줄 및 진하게) 및 경쇄를 포함한다. 이러한 단백질의 예로는 서열번호: 14로 확인된 단백질이다:
Figure pct00012
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 14에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 14에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 14에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 14에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
대안으로서, 시목토코그 알파에 기반한 융합 단백질은 시목토코그 알파의 C-말단에 연결된 둘 이상의, 바람직하게 3개의 연장 펩티드 (진하게)를 포함한다. 이러한 단백질의 예로는 서열번호: 21로 확인된 단백질이다. 일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 21에 대해 적어도 90 %의 동일성을 갖는다. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열번호: 21에 대해 적어도 95 %의 동일성을 가질 수 있다. 또한, 서열번호: 21에 대한 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 동일성은 적어도 98 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 21에 대해 100 %의 동일성을 가질 수 있다.
폴리뉴클레오티드
제2 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제1 양상에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 DNA 분자, 구체적으로 cDNA 분자이다. 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리 또는 클로닝하는데 사용되는 기술은 당분야에 알려져 있고 및 게놈 DNA로부터의 단리, cDNA로부터의 제조, 또는 그의 조합을 포함한다. 이러한 게놈 DNA로부터 폴리뉴클레오티드의 클로닝은, 예컨대, 공유된 구조적 특성을 갖는 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위해 잘-알려져 있는 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 또는 발현 라이브러리의 항체 스크리닝 (antibody screening)을 사용하여 수행될 수 있다 (예컨대, Innis et al, 1990 참조) PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction: LCR), 결찰 활성화 전사 (ligation activated transcription: LAT) 및 폴리뉴클레오티드-기반 증폭 (polynucleotide-based amplification: NASBA)과 같은 다른 핵산 증폭 절차가 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드의 서열은 상기 주 단백질을 코딩하는 제1 부분 및 적어도 하나의 제2 부분 서열을 포함할 수 있다. 상기 제1 부분은 바람직하게 서열번호: 15와 유사하거나 또는 동일하다. 상기 제1 부분은 바람직하게 서열번호: 15에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성 정도를 갖는다.
상기 적어도 하나의 제2 부분은 바람직하게 서열번호: 16과 유사하거나 또는 동일하다. 상기 제2 부분은 바람직하게 서열번호: 16에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성의 정도를 갖는다.
상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 14 및 서열번호: 21로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 유사하거나 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자일 수 있다.
구체적으로, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자일 수 있다. 대안으로서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 90 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자일 수 있다. 더욱이, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 5에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자일 수 있다. 일 구체예에 따르면 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 7에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다. 일 구체예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 8에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다. 일 구체예에 따르면 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 10에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다. 일 구체예에 따르면 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 11에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다. 일 구체예에 따르면 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 14에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다. 일 구체예에 따르면 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 21에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다.
상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20 및 서열번호: 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 유사하거나 또는 동일한 서열을 갖는 DNA 분자일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드의 한 가닥은 서열번호: 17에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98　%, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 부가의 구체예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 18에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98　%, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 19에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98　%, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 20에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98　%, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 20에 대해 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98　%, 적어도 99 %, 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는다.
폴리뉴클레오티드 서열의 목록:
서열번호: 15 OCTA 11 (서열번호: 2의 AA 1-1268)을 코딩하는 DNA
서열번호: 16 연장 펩티드 (서열번호: 1)를 코딩하는 DNA
서열번호: 17 프로-OCTA 12 (서열번호: 5)를 코딩하는 DNA
서열번호: 18 프로-OCTA 14 (서열번호: 8)를 코딩하는 DNA
서열번호: 19 프로-OCTA 15 (서열번호: 11)를 코딩하는 DNA
서열번호: 20 링커 영역내에 3개의 연장 펩티드를 갖는 시목토코그 알파 (서열번호: 14)를 코딩하는 DNA
서열번호: 22 3개의 C-말단 연장 펩티드를 갖는 시목토코그 알파 (서열번호: 21)를 코딩하는 DNA 서열
발현 벡터
제3 양상에서 본 발명은 또한 본 발명의 제2 양상에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
상기 발현 벡터는 바람직하게 제어 요소 (control elements) 예컨대 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 시그날을 더 포함한다. 상기 제2 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 및 상기 제어 요소는 함께 결합하여 재조합 발현 벡터를 생산하고 이는 하나 이상의 제한 부위를 포함하여 상기 부위에서 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입 또는 치환될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 발현을 위한 적절한 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 상기 발현 벡터를 형성할 때, 상기 코딩 서열은 상기 발현 벡터내에 위치하여 상기 코딩 서열은 발현을 위해 적합한 제어 서열과 작동가능하게 연결된다.
상기 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차로 편리하게 처리될 수 있고 및 본 발명의 제4 양상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 초래할 수 있는 임의의 벡터 (예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 상기 발현 벡터의 선택은 통상적으로 상기 발현 벡터가 도입될 숙주 세포와 상기 발현 벡터의 적합성 (compatibility)에 의존할 것이다. 상기 발현 벡터는 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다.
상기 발현 벡터는 바람직하게 포유동물 세포에서 발현에 적합한다. 상기 발현 벡터는 자율 복제 벡터 (autonomously replicating vector), 즉 복제가 염색체 복제와 독립적인 염색체외 실체물, 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 (minichromosome), 또는 인공 염색체로 존재하는 벡터일 수 있다. 자율 복제의 경우, 상기 벡터는 문제의 숙주 세포에서 자율적으로 상기 벡터를 복제할 수 있는 복제 기원을 더 포함할 수 있다. 상기 복제 기원은 세포에서 기능하는 자율 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 복제인자일 수 있다. 용어 "복제 기원 (origin of replication)" 또는 "플라스미드 복제인자 (plasmid replicator)"는 플라스미드 또는 벡터가 인 비보에서 복제할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
상기 벡터는 바람직하게, 상기 숙주 세포로 도입될 때, 게놈으로 통합되고 상기가 통합되어진 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터이다. 상기 숙주 세포 게놈으로의 통합의 경우, 상기 발현 벡터는 상동 또는 비-상동 재조합에 의한 게놈으로의 통합을 위해 발현 벡터의 임의의 다른 요소에 의존할 수 있다. 대안으로서, 상기 벡터는 상기 염색체내 정확한 위치에서 숙주 세포의 게놈으로 상동성 재조합에 의해 통합을 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 바람직하게, 형질전환된, 형질감염된, 형질도입되는 등의 세포를 용이하게 선택하도록 하는 하나 이상의 (예컨대, 수 개의) 선별가능한 마커를 포함한다. 선별가능한 마커는 살생제 또는 바이러스 저항, 중금속에 대한 저항, 영양요구균주 (auxotrophs)에 대한 원영양성 (prototrophy)을 제공하는 유전자 산물이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위해 상기에 개시된 요소들을 결찰하는데 사용되는 절차는 당분야의 통상의 기술을 가진 자에게 잘 알려져 있다 (예컨대, Sambrook et al., 1989, supra 참조).
일 구체예에 따르면 상기 제3 양상에 따른 벡터의 벡터 백본 (backbone)은 pCDNA3, pCDNA3.1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, pIRES, 및 pSCAS로부터 선택된다.
숙주 세포
제4 양상에 따르면 본 발명은 본 발명의 제3 양상에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 제3 양상에 따른 발현 벡터를 숙주 세포로 도입하여 발현 벡터는 전술한 바와 같이 염색체 구성요소 (chromosomal integrant)로서 또는 자기-복제 염색체외 벡터 (self-replicating extra-chromosomal vector)로 유지된다. 상기 용어 "숙주 세포 (host cell)"는 복제 중에 발생하는 돌연변이에 의해 모체 세포와 동일하지 않은 모체 세포의 후손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 그의 출처에 크게 의존할 것이다.
일 구체예에 따르면 상기 융합 단백질은 포유동물 숙주 세포주에서 발현에 의해 생산된다. 상기 융합 단백질은 바람직하게 인간 숙주 세포주에서 생산된다. 일반적으로 임의의 인간 숙주 세포주는 상기 융합 단백질의 발현에 적합하다. 상기 융합 단백질의 유익한 글리코실화는 특히 인간 신장 세포주에 의해 수득된다. 바람직한 인간 신장 세포주는 HEK 세포-주, 구체적으로 HEK 293 세포주이다.
글리코실화 폴리펩티드의 생산을 위한 HEK 세포-주의 예로는 HEK 293 F, Flp-InTM-293 (Invitrogen, R75007), 293 (ATCC® CRL-1573), 293 EBNA, 293 H (ThermoScientific 11631017), 293S, 293T (ATCC® CRL-3216TM), 293T/17 (ATCC® CRL11268TM), 293T/17 SF (ATCC® ACS4500TM), HEK 293 STF (ATCC® CRL 3249TM), HEK-293.2sus (ATCC® CRL-1573TM)이다. 상기 폴리펩티드의 생산을 위한 바람직한 세포주는 HEK 293 F 세포주이다.
발현을 위해 숙주 세포로서 적합한 다른 세포주는 인간 골수성 백혈병 세포로부터 유래된 세포주를 포함한다. 숙주 세포의 특정 예로는 K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8- E6Q12, GT-2X, GT-5s 및 상기 숙주 세포들 중 어느 하나로부터 유래된 세포이다. K562는 American Type Culture Collection에 제출된 인간 골수성 백혈병 세포주 (ATCC CCL-243)이다. 나머지 세포주는 K562 세포로부터 유래되고 또한 특정 글리코실화 특성을 위해 선택되어 진다.
융합 단백질의 용도
실시예에서 개시되는 바와 같이, 상기 융합 단백질들 OCTA 12 및 OCTA 14에서 서열번호: 1의 연장 펩티드는, 상기 주 단백질, 즉 VWF 단편과 비교하여, 상기 융합 단백질의 증가된 반감기를 유도한다. 상기 융합 단백질들 OCTA 12 및 OCTA 14는, VWF의 결합 파트너인 FVIII과 함께 환자에게 투여될 때, FVIII 반감기의 증가를 유도하였다.
그러므로, 제5 양상에 따르면, 본 발명은 제2 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질의 용도를 제공하고, 상기 융합 단백질은 상기 제2 단백질에 결합할 수 있다.
상기 용도는 또한 치료 단백질에 의해 환자를 치료하는 방법과 같이 개시될 수 있고, 상기 방법은 치료 단백질, 예컨대 FVIII 단백질을 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질과 함께 투여하는 것을 포함한다.
조성물 및 단백질 복합체
따라서, 본 발명에 따른 개념, 즉 상기 연장 펩티드에 의해 제공된 반감기 연장은 상기 융합 단백질에 한정되지 않고, 부가로 상기 융합 단백질에 의해 결합되는 제2 단백질의 반감기가 연장될 수 있다.
그러므로, 제6 양상에 따르면 본 발명은 제1 단백질 및 제2 단백질의 조성물을 제공하고, 상기 제1 단백질은 제1 양상에 따른 융합 단백질이고 또한 상기 제2 단백질에 결합할 수 있고, 및 상기 제2 단백질은 제2 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 포함하는 치료 단백질이다.
상기 제1 단백질은 상기 제2 단백질에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 제1 단백질 및 제2 단백질의 복합체에 관한 것으로서, 상기 제1 단백질은 제1 양상에 따른 융합 단백질이고, 및 상기 제2 단백질은 제2 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 따라서, 상기 복합체는 상기 제1 단백질의 제2 단백질로의 비-공유 결합에 의해 형성된다.
일 구체예에 따르면 상기 제1 단백질은 제2 단백질에 공유결합으로 결합한다. 상기 제1 및 제2 단백질의 결합을 촉진하는 링커는 디술피드 브릿지 (disulfide bridge), 펩티드 결합, 화학적 링커, 또는 글리코시드 결합으로부터 선택될 수 있다.
대안으로서 상기 제1 단백질은 제2 단백질에 비-공유결합으로 결합한다. 비-공유 결합의 경우, 상기 제1 단백질은 구체적으로, 결합 도메인을 포함할 수 있고, 이는 상기 제2 단백질, 즉 제2 단백질 결합 도메인에 결합할 수 있도록 한다. 상기 제1 단백질의 서열에서 하나 이상의 연장 펩티드의 위치에 따라, 상기 제1 단백질의 다양한 위치들에 위치할 수 있다. 바람직하게, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 상기 단백질의 폴딩된 상태로 표면에 노출된 위치에 위치한다. 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 제2 단백질 결합 부위, 예컨대 결합 도메인에 대해 임의의 위치에 위치할 수 있다.
상기 조성물의 일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 제1 단백질의 제2 단백질로의 결합을 방해하지 않는 제1 단백질의 폴딩된 상태에서의 위치에 위치한다.
일 구체예에 따르면, 제1 단백질, 예컨대 VWF 단편에 결합된 제2 단백질, 예컨대 FVIII의 반감기는, 상기 제2 단백질, 예컨대 FVIII 단백질의 유리 형태 (free form)와 비교하여 증가된다.
바람직하게, 제1 단백질, 예컨대 OCTA 12에 결합된 제2 단백질, 예컨대 FVIII 단백질의 반감기는, 네이티브 포유동물 단백질, 예컨대 성숙한 VWF에 결합된 상기 제2 단백질과 비교하여 증가된다.
더 바람직하게, 제1 단백질, 예컨대 OCTA 12에 결합된 제2 단백질, 예컨대 FVIII 단백질은, 융합 펩티드가 존재하지 않는 주 단백질, 예컨대 OCTA 11에 결합된 상기 제2 단백질과 비교하여 증가된다.
상기 제2 포유동물 단백질은 상기 포유동물 단백질에 대해 확인된 것과 동일한 목록으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 상기 조성물 또는 복합체에서, 상기 제2 포유동물 단백질은 상기 제1 포유동물 단백질과 동일하지 않다.
일 구체예에 따르면 상기 제2 포유동물 단백질은 혈액 단백질, 구체적으로 인간 혈액 단백질이다. 바람직하게 상기 제2 포유동물 단백질은 응고 인자, 구체적으로 인간 응고 인자이다.
일 구체예에 따르면 상기 주 단백질이 유사하거나 또는 동일한 제2 포유동물 단백질은 UniProtKB P00451.1의 아미노산 20 내지 2,351로 확인된 인간 전장 FVIII이다. 다른 구체예에 따르면, 상기 주 단백질은 FVIII로, B-도메인의 적어도 일부가 결실된 FVIII이다. 이와 관련하여 전체 B-도메인이 결실될 수 있다. 상기 B-도메인의 결실 부분은 선택적으로 링커로 대체된다. 상기 링커 서열은 구체적으로 하기 아미노산 서열 SFSQNSRHQAYRYRRG (서열번호: 12)을 갖는다. 상기 B-도메인이 링커로 대체된 FVIII의 예로는, Nuwiq® 또는 Vihuma®의 활성 성분인 시목토코그 알파 (서열번호: 13)이다.
일 구체예에 따르면, 상기 FVIII 단백질은 환자에서 감소된 면역 반응을 갖는 인간 FVIII 단백질이다.
상기 FVIII 단백질의 감소된 면역 반응은 바람직하게 SIGLECs SIG-5, SIG-7, SIG-8 및 SIG-9로의 결합에 기반한다. 이론에 국한되지 않고, 항원 제시 세포 (가령 예컨대 수지상 세포) 상에 SIGLECS로의 결합은 전-염증성 (pro-inflammatory)의 하향-조절 (down-regulation) 및 세포 표면 상에 면역억제 수용체 발현의 상향 조절 (upregulation)을 유도한다. 또한, 상기 결합은 항-염증성 시토킨 생산의 증가, 전-염증성 시토킨 생산의 저하를 유도하고, 결과적으로 T-세포 증식 및 항체 생산을 저해한다. 그러므로 SIGLECs SIG-5, SIG-7, SIG-8 및 SIG-9의 결합은, 상기 글리코실화 폴리펩티드가 환자에게 투여될 때 감소된 면역 반응 또는 증가된 면역 관용 (immune tolerance)을 유도한다.
상기 SIGLEC 결합, 및 결과적으로, 상기 감소된 면역 반응은, 자연적으로 발생하는 인간 FVIII의 시알일화 코어 (sialylated core) 2 및/또는 연장된 코어 (extended core) 1 O-글리칸의 수와 비교하여, 상기 글리코실화 단백질 중에 시알일화 코어 2 및/또는 연장된 코어 1 O-글리칸의 증가된 수 또는 퍼센트에 기반한다.
그러므로, 일 구체예에 따르면 상기 FVIII 단백질은 자연적으로 발생하는 인간 FVIII의 시알일화 코어 2 및/또는 연장된 코어 1 O-글리칸의 수와 비교하여 상기 글리코실화 단백질 중에 시알일화 코어 2 및/또는 연장된 코어 1 O-글리칸의 증가된 수 또는 퍼센트를 나타낸다.
상기 제2 단백질이 FVIII 단백질인 경우에, 상기 제1 단백질의 주 단백질은 바람직하게, 상기 FVIII 단백질에 결합할 수 있도록 하는 FVIII 결합 도메인을 포함하는 VWF의 단편이다.
상기 조성물의 일 구체예에 따르면, 상기 제1 단백질은 서열번호: 3에 대해 적어도 95 %, 바람직하게 적어도 98 % 더 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 및 상기 제2 단백질은 서열번호: 13에 대해 적어도 95 %, 바람직하게 적어도 98 % 더 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 조성물의 일 구체예에 따르면, 상기 제1 단백질은 서열번호: 6에 대해 적어도 95 %, 바람직하게 적어도 98 % 더 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 및 상기 제2 단백질은 서열번호: 13에 대해 적어도 95 %, 바람직하게 적어도 98 % 더 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 조성물의 일 구체예에 따르면, 상기 제1 단백질은 서열번호: 9에 대해 적어도 95 %, 바람직하게 적어도 98 % 더 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 및 상기 제2 단백질은 서열번호: 13에 대해 적어도 95 %, 바람직하게 적어도 98 % 더 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
환자의 혈액에서 VWF의 단편, 구체적으로 OCTA 12를 포함하는 융합 단백질이 FVIII 단백질로의 결합을 위해 내인성 (endogenous) VWF와 경쟁하기 때문에, 상기 조성물은, 상기 FVIII 단백질과 비교하여, VWF의 단편, 구체적으로 OCTA 12를 몰 과량 (molar excess)으로 포함하는 융합 단백질을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기 제2 단백질에 대한 제1 단백질의 몰비 (molar ratio)는 0.1 내지 250의 범위, 바람직하게 0.5 내지 50의 범위 더 바람직하게 1 내지 25의 범위, 가장 바람직하게 2 내지 10의 범위이다.
안정한 비-공유적으로 결합된 복합체를 형성하여, 상기 제2 단백질의 반감기를 연장시키기 위해서, 평형 해리 상수 (KD)로 정의되는 상기 제1 단백질의 상기 제2 단백질로의 결합 친화도는 10 μM 이하이어야 한다. 바람직하게, 상기 FVIII 단백질에 대한 제1 단백질 중의 VWF 단편의 평형 해리 상수는 0.05 내지 3 nM의 범위에 있다.
상기 제1 및 제2 단백질은 별개의 재조합 발현에 의해 생산되고 이후에 결합될 수 있다. 대안으로서, 상기 제1 및 제2 단백질은 동일한 세포에서 재조합으로 발현된다. 이를 위해, 상기 제1 및 제2 단백질은 동일한 벡터 또는 2개의 상이한 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
실시예에서 사용되는 VWF 구조체, 즉 OCTA 12, OCTA 14 및 OCTA 15는 그들의 프로-단백질의 형태로 발현되어 이량체를 형성하거나 또는 OCTA 15의 경우에 다량체를 형성한다. 상기 이량체는 프로-펩티드의 절단 후 조차도 본래대로 남아있어서 결과적으로 상기 이량체의 VWF 구조체의 각 카피는 FVIII 단백질에 결합할 수 있다. 그러므로, 일 구체예에 따르면, 상기 복합체는 상기 제1 및 제2 단백질의 2개의 카피를 포함하고, 상기 제1 단백질의 2개의 카피는 이량체를 형성한다. 상기 제1 단백질의 이량체는 바람직하게 비-공유적으로 결합된 이량체이다.
약학적 조성물 및 의학적 용도
상기에 개시된 바와 같이, 본 발명의 제1 양상에 따른 융합 단백질, 제6 양상에 따른 조성물 및 제7 양상에 따른 복합체는 환자의 혈액 중에서 반감기를 증가시켜서, 환자에서 치료 효과를 증가시키는 이점을 갖는다. 그러므로, 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질, 상기 제6 양상에 따른 조성물, 및 상기 제7 양상에 따른 복합체는 구체적으로 의학적 치료를 위한 활성 성분으로 유용하다. 바람직하게, 상기는 출혈 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 본원에 개시된, 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질, 상기 제6 양상에 따른 조성물, 구체적으로 단백질 복합체는, 단독으로 또는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
그러므로, 제8 양상에 따르면, 본 발명은 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질, 상기 제6 양상에 따른 조성물 및 상기 제7 양상에 따른 복합체의 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 약학적 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체로 제형화된, 상기 제1 양상에 따른 융합 단백질, 상기 제6 양상에 따른 조성물 및 상기 제7 양상에 따른 복합체의 유효한 양을 포함할 수 있다. 상기 구체예들의 약학적 조성물은 약학 분야에 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조되고 피험체에게 투여될 수 있다. 예컨대 Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw―Hill Professional (10th ed., 2001); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins (20th ed., 2003); and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al. (eds), Lippincott Williams & Wilkins (7th ed., 1999) 참조한다. 또한, 상기 구체예들의 약학적 조성물은 다른 의학적으로 유용한 약물 또는 생물학적 작용제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 통상적으로 치료적으로 유효한 양의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 포함한다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 당 분야에 알려져 있거나 또는 확립된 임의의 담체이다. 예시되는 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 발열성 물질 제거수 (pyrogen-free water) 및 멸균 발열성 물질 제거 식염수 용액을 포함한다. 본 구체예에 이용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체의 다른 형태는, 제형의 사용 형태에 따라 통상적으로 사용되는, 결합제, 붕해제, 표면활성제, 흡수 촉진제, 수분 보유제, 흡수제, 윤활제, 충전제, 증량제 (extenders), 수분 부여제 (moisture imparting agents), 보존제, 안정화제, 유화제 (emulsiers), 가용화제 (solubilising agents), 삼투압을 조절하는 염, 희석제 예컨대 버퍼 및 부형제를 포함한다. 상기는 결과의 제형의 유닛 용량에 따라 선택적으로 선별 및 사용된다.
그러므로, 본 발명의 제9 양상은 또한 환자의 출혈 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 상기 제8 양상에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 "출혈 질환 (bleeding disorder)"은 정상적인 지혈이 손상된 질병 또는 병태를 나타낸다. 상기 출혈 질환은 예를 들어, 혈우병 A, 혈우병 B, 인자 VIII 결핍, 인자 XI 결핍, 폰 빌레브란트 질환, 글란츠만 혈소판기능저하증 (Glanzmann's Thrombasthenia), 버나드 슐리어 증후군 (Bernard Soulier Syndrome), 특발 저혈소판 자색반병 (idiopathic thrombocytopenic purpura), 뇌내 출혈 (intracerebral hemorrhage), 외상 (trauma), 외상성 뇌 손상 (traumatic brain injury) 등일 수 있다.
본원에서 사용되는, "혈우병 (hemophilia)"은 혈우병이 없는 건강한 개체에서의 혈액 응고 형성 시간과 비교하여, 증가된 혈액 응고 형성 시간과 관련된 출혈 질환 그룹을 나타낸다. 혈우병은, 결함 있는 인자 VIII의 생산을 유도하는 질환인 혈우병 A, 및 결함 있는 인자 IX의 생산을 유도하는 질환인 혈우병 B 둘 다와, 응고 인자 (F) VIII에 대해 자가항체 (autoantibody)에 의해 유발되는 희귀 출혈 질환인 후천성 혈우병 A를 포함한다.
상기 출혈 질환은 바람직하게 혈우병 A 또는 B이다. 상기 치료는 예를 들어 PUPS (Previously untreated patients)의 혈우병 치료 또는 면역 관용 유도 (immune tolerance induction: ITI) 치료 및/또는 혈우병 질환의 다른 관련된 치료일 수 있다.
인 비보 적용을 위해, 약학적 조성물은 환자에게 임의의 관습적인 투여 경로, 예컨대 경구, 비경구 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 (intraperitoneal injection), 근육내 주사, 액제 (liquid agents), 현탁액 (suspensions), 에멀젼 (emulsions) 및 점적제 (dripping agents)를 포함한다. 비경구 투여를 위해 상기 약학적 조성물은 주사가능한 제제 예컨대 액제 또는 현탁액이어야 한다.
다른 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 경구로 환자에게 투여된다. 상기 구체예에서, 약물의 형태는 고체 제형 예컨대 정제, 코팅된 정제, 분말 제제, 과립, 캡슐 및 환제 (pills), 액체 제형 예컨대 액제 (예컨대, 점안제, 점비제), 현탁액, 에멀젼 및 시럽, 흡입제 예컨대 에어로졸제, 분무제 및 네불라이저 (nebulizers), 및 리포좀 함입제를 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 글리코실화 폴리펩티드, 단백질 복합체 또는 약학적 조성물은 피험체의 기관 (trachea) 및/또는 폐를 표적으로 하기 위해 환자의 호흡기로 흡입에 의해 투여된다.
상기 제8 양상의 일 구체예에 따르면, 상기 사용은 정맥내 또는 비-정맥내 주사를 포함한다. 상기 비-정맥내 주사는 바람직하게 피하 주사이다.
본 개시내용에 인용된 모든 간행물 및 특허는 그 전체가 참고문헌으로 포함된다. 참고문헌에 포함된 물질이 본 명세서와 모순되거나 불일치하는 경우, 본 명세서는 상기 물질을 대신할 것이다.
실시예
실시예 1 - VWF 단백질의 재조합 발현
하기 재조합 VWF 단백질은 C-말단 Strep-태그를 갖는 HEK 세포주 293 F에서 일시적으로 발현되고 StrepTactin 친화도 크로마토그래피 (IBA GmbH)로 정제되었다:
- OCTA 11
- OCTA 12
OCTA 12는 본 발명에 따른 융합 단백질이다. OCTA 11은 비교 VWF 단편이다. 상기 VWF 단백질은 도 1에 개략적으로 도시되었다. 프로-단백질의 발현으로 이량체를 형성하였다. 상기 펩티드 이량체는 또한 상기 프로펩티드의 절단 후에도 남아 있다.
유전자 합성 및 클로닝
제1 단계로서, VWF 단백질의 프로-단백질을 코딩하는 유전자는 GeneArt로 합성되었다 (Thermo Fisher Scientific):
- 프로-OCTA 11
- 프로-OCTA 12
상기 프로-단백질을 코딩하는 유전자를 Twin-Strep-태그를 포함하는 pDSG 발현 벡터 (IBA GmbH)로 클로닝하였다. TOP10 이. 콜리 (TOP10 E.coli)의 개별 배양물 (IBA GmbH)을 벡터 구조물로 형질전환하였고 및 단일 클론은 암피실린-함유 LB-아가 플레이트상에서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 후에 선별하였다.
플라스미드 DNA 제조는 제조자의 권고에 따라 QIAamp DNA Mini 또는 Maxi 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행되었다. 시퀀싱 (sequencing)에 의해서, 상기 벡터의 완전성이 입증되었고, 구체적으로 프로-OCTA 11, 프로- OCTA 12를 코딩하는 유전자의 올바른 배향 및 완전성이 입증되었다.
단백질 발현
VWF 단백질의 진핵세포 발현을 위해, MEXi 형질감염-배지 (IBA GmbH)에서 성장한 MEXi-293 세포 (IBA GmbH)를, 4.5 mg/ml 25 kDa 선형 폴리에틸렌이민을 사용하여 1.5 mg/l의 구조체로 감염시켰다. 37 ℃, 5 % CO2 및 100-150 rpm에서 2-4시간 인큐베이션 후에, 상기 배양물을 MEXi 형질감염-배지로 1:2로 희석시켰고 및 배양은 세포 생존율이 75 %에 도달할 때까지 지속되었다.
그 다음에, 상층액을 4℃ 및 300 x g에서의 원심분리에 의해 세포로부터 분리시켰다. 세포 배양 배지에서 비오틴의 저해 효과를 최소화하고 및 pH를 조정하기 위해서, 0.1 부피의 버퍼 (1 M Tris-HCl, 1.5 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) 및 0.09 % (v/v) BioLock 용액 (IBA GmbH)을 상기 상층액에 첨가하였고 및 20분 동안 4 ℃에서 인큐베이트하였다.
단백질 정제
원심분리 후에, 상기 상층액을 Strep-Tactin XT 컬럼 (IBA GmbH)에 적용하였고, 세척 버퍼 (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)로 5회 세척하였고 및 결합된 Strep-태그 함유 단백질을 용출 버퍼 (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 데스티오비오틴 (desthiobiotin), pH 8.0)로 용출시켰다.
실시예 2 - FVIII / VWF 이중 녹 아웃 ( DKO ) 마우스에게 FVIII과 함께 병용-투여될 때 FVIII 반감기에 있어서 전장 VWF 또는 VWF 단백질의 영향
2.1 배경
본 실험에서, 실시예 1에 따라 생산된 VWF 단백질 및 전장 혈장 유래된 VWF (pdVWF)의 FVIII 반감기에 있어서의 영향을 시험하였다.
전장 VWF 및 FVIII은 결합 파트너로 비-공유결합 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 순환에서 FVIII의 반감기는 VWF의 순환 반감기에 의해 주로 결정된다.
혈청에서 내인성 VWF는 투여된 VWF 단백질 (단편)과 FVIII 결합을 위해 경쟁하기 때문에, 상기 경쟁은 FVIII 반감기에 있어서 투여된 VWF 단백질의 효과에 영향을 줄 수 있다.
그러므로, 본 실험에서 FVIII 및 VWF에 대해 이중 녹아웃된 C57Bl/6 마우스 (FVIII/VWF-DKO)를, FVIII 반감기에 있어서 VWF의 영향을 평가하기 위한 모델 생물체로 사용하였다.
2.2 실험 절차
2.2.1 FVIII -함유 산물
하기 FVIII-함유 산물이 생산되었다:
1) FVIII 단독
2) FVIII 및 OCTA 11
3) FVIII 및 OCTA 12
4) FVIII 및 pdVWF
상기 VWF 단백질들 OCTA 11 및 OCTA 12를 실시예 1에 개시된 바와 같이 생산하였다. 상기 pdVWF는 VWF 농축물 Wilate (Octapharma)이다. 상기 FVIII은 B-도메인 결실된 인간 세포주 FVIII (Nuwiq, Octapharma)이다. Nuwiq 산물은 하기 버퍼 조성을 포함한다:
아르기닌 HCl 25.6 mM
수크로스 15.8 mM
NaCl 308 mM
플루로닉 ( Pluronic ) F68 0.14 mM
소듐 시트레이트 3.6 mM
칼슘 클로리드 2.0 mM
FVIII 함유 산물들 2)-4) 중 VWF 단백질 대 FVIII의 몰비는 5:1이었다. 상기 VWF 단백질을 상기 Nuwiq 산물 (FVIII)에 첨가하였다.
2.2.2 FVIII / VWF - DKO 마우스 계통
FVIII 및 VWF에 대해 이중 녹아웃된 C57Bl/6 마우스 (FVIII/VWF-DKO)를 사용하였다.
2.2.3 산물의 투여
4개의 FVIII 함유 산물들을 20마리의 FVIII/VWF-DKO 마우스에게 240 IU FVIII/kg (~6 IU/마우스)의 용량으로 꼬리 정맥 인퓨젼 (tail vein infusion)에 의해 투여하였다.
2.2.4 시료채취 및 분석
상기 마우스의 혈액 시료를 FVIII 함유 산물로 처리한 후 5분 및 1, 4, 8, 12, 24, 36 및 48시간에 채취하였다. 상기 혈액 시료는 상기 마우스의 안와후신경얼기 (retro-orbital plexus)로부터 입수하였다. 각 시점에 대해, FVIII 함유 산물에 대해 5마리의 마우스로부터의 혈액 시료를 입수하였고 개별적으로 분석하였다. 각 마우스는 5분 시점 및 최대 2번의 추가의 시점에서 시료채취되었다.
각 혈액 시료들에서 FVIII 활성은 비색 분석 (chromogenic assay) (CHROMOGENIX)을 사용하여 분석되었다.
2.3 결과
상기 혈액 시료들 중에 FVIII 활성 값과 함께 각 FVIII 함유 산물에 대해 FVIII 활성의 시간 경과를 도 2에 개시한 바와 같이 결정하였다.
각 시점 및 FVIII 함유 산물에 대해, 5마리의 동물의 혈액 시료들을 측정하였고, 도 2의 다이아그램에서 각 데이터 점은 5개 값의 평균을 나타낸다.
더욱이, 개별 시점에 대한 FVIII 활성은 처리하고 5분 후에 FVIII 활성의 퍼센트로 제공되었고, 이는 각 FVIII 함유 산물에 대해 100 % 활성으로 정의된다.
5개의 산물에서 FVIII의 반감기는 개별 혈장 농도 - 시간 곡선의 로그-선형 부분의 선형 회귀 분석을 사용하는 곡선 피팅 (curve fitting)한 후 또는 단일상 지수 기하감쇠 모델을 사용한 비-선형 회귀에 의해 산출되었다. 산출을 위해 사용된 소프트웨어 프로그램은 GraphPad Prism 버전 6.07 (La Jolla, CA 92037 USA) 및 WinNonlin, 버전 6.4 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)이었다.
산출은 하기 식에 기반한다:
Figure pct00013
Kel = 제거율 상수
t½ = 제거 반감기
c = 농도
t = 시간
결과를 하기 표 1에 요약하였다.
DKO 마우스에서 FVIII의 종말 반감기
FVIII 함유 산물 t1/2 [h]
1)
Figure pct00014
FVIII 단독		 0.07
2) FVIII 및 OCTA 11 0.45
3) FVIII 및 OCTA 12 1.03
4) FVIII 및 flVWF 0.32
상기 수치로부터 임의의 VWF 단백질과 FVIII의 병용-투여로 반감기의 증가를 유도하는 것이 명백하다. pdVWF와 FVIII의 병용-투여로 FVIII 반감기의 ~4.6배 증가 (0.31)를 유도하였다.
VWF 단백질 OCTA 11과 FVIII 병용-투여는 0.45시간의 비교가능한 반감기를 보였다 (약 1.4배 증가).
현저하게, 상기 VWF 단백질 OCTA 12와의 병용-투여로 1.03시간의 FVIII 반감기를 제공하였고, 이는 flVWF와 비교하여 약 3.2배의 증가를 나타낸다. 상기 인자는 FVIII과 비교할 때 14.7-배이다.
상기 결과는 OCTA 12에 존재하는 부가의 O-글리칸 반복이 상기 VWF-단편 및 결국 상기 VWF/FVIII 복합체에 있어서 유의한 반감기 연장 효과를 유도하였음을 보여주었다. 더욱이, 상기 결과는 고유 O-글리칸 클러스터의 카피의 부가로 단백질을 반감기를 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 3 - 미니피그에서 IV 및 피하 ( SQ ) 투여 후에 FVIII 및 VWF OCTA 12의 약동학적 프로파일
3.1 배경
약물의 SQ 전달은 응고 인자의 분야에서 더욱 관심을 받고 있다. 그러나, 매우 낮은 회수율 (recovery)로 인해 상기 경로는 FVIII의 투여를 위해 아직 적용가능하지 않았다. 미니피그는 인간의 표피 구조와 매우 유사하기 때문에 약물의 SQ 투여를 시험하기에 가장 잘 알려진 동물 모델이다. 본 실험의 목적은 VWF OCTA 12 및 FVIII을, 단독으로 또는 5배 몰 과량의 OCTA 12와 함께, 미니피그에게 SQ 경로를 통해 투여하였을 때, 이들의 반감기를 평가하는데 있다. 또한, FVIII을 단독으로 종래의 IV 경로를 통해 투여하였을 때 이의 반감기를, VWF OCTA 12와 함께 또는 없이 SQ로 투여된 FVIII과 비교하였다.
3.2 실험 절차
연령이 10-14 개월인 9마리의 암컷 Aachener 미니피그를 본 연구에 사용하였다. 체중은 13.7 내지 19.5 kg이었다. IV 주사는 귀 측면 정맥에 수행하였고, SQ 주사는 서혜부 영역 (inguinal region)의 피부 아래에 수행하였다. 용량은 100 U FVIII/kg BW이었고, 그룹당 3마리의 동물을 각 산물로 처리하였다:
- 그룹 1: FVIII 단독 SQ
- 그룹 2: FVIII과 OCTA 12 SQ
- 그룹 3: FVIII 단독 IV
동물 및 시료채취 시간 당 2 Х 200 μL Na-시트레이트 혈장을 수득하기 위해, 하기의 시점에서 모든 동물들의 전경정맥 (vena jugularis)으로부터 충분한 혈액을 수집하였다: 각 투여 후에 0 (투여-전), 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96 및 120 시간.
항응고제로 소듐 시트레이트 (0.15 M)를 함유하는 튜브로 전혈을 샘플링하였고 및 IsoTherm-Rack 시스템 (Eppendorf)을 사용하여 즉시 냉각시켰다. 혈장을 혈액 회수하고 30분 내에 원심분리에 의해 분리시켰다. 원심분리 직후에, 상기 혈장 시료를 동결시켰고 선적할 때까지 ≤-20℃로 보관하였다.
각 시료를 FVIII 항원에 대해 Asserachrom 분석 키트 (Diagnostica Stago)를 사용하여 시험하였다. OCTA 12는 하기와 같이 ELISA 분석을 사용하여 정량화하였다; Strep-Tactin® XT 코팅된 마이크로플레이트 (IBA GmbH)를 블로킹 버퍼 (blocking buffer) (PBS 중 1% BSA)로 2시간 동안 RT에서 블로킹시켰다. 혈장 시료들을 블로킹 버퍼 중에서 1:15로 희석시켰고 및 상기 플레이트에 적용하였다. 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 상기 VWF 단편을 항 VWF pAb (Dako P0226)로 검출하였다. 각 인큐베이션 후에, 상기 플레이트를 PBS 중 0.1% Tween으로 3회 세척하였다.
분석 데이터의 약동학적 평가는 WinNonlin, 버전 6.4 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.
3.3 결과
도 3은 FVIII/VWF OCTA 12 혼합물의 SQ 투여 후에 미니피그 혈장에서 VWF OCTA 12 농도의 시간 경과를 나타내었다. 하기 표 2에서 요약한 바와 같이, OCTA 12는 219.31시간의 반감기로 순환하였다. 상기 반감기는 실시예 2에서 개시한 바와 같이 결정되었다.
미니피그에서 VWF OCTA 12 항원의 약동학적 파라미터. 값은 3마리 동물의 평균 +- SD를 나타낸다.
OCTA 12 항원의 약동학적 파라미터
그룹/
투여량/
경로 		　　 C max
[nM] 		　　 t max
[h] 		t 1/2
[h]
그룹 2:
100　U/ kg BW
FVIII과 OCTA 12
SQ.		 0.93
±0.38		 8.00
 219.31　
Cmax 최대 측정된 혈장 농도
tmax Cmax의 시간
t1/2 종말 반감기
폰 빌레브란트 질환 (VWD) 피그에서, 전장 재조합 인간 (rhVWF)의 반감기는 ~10 내지 16시간이었고, 및 혈장 유래된 돼지 (porcine) VWF의 반감기는 10 내지 18시간이었다 (Nichols et al.). 상기 FVIII 결합 도메인 만을 포함하는 VWF 단편의 반감기는, VWF 결핍 마우스에서 Yee　등에 의해 개시된 바와 같이, flVWF의 반감기보다 더 짧았다. 그러므로, OCTA 12 반감기는 피그 (pig)에서 rhVWF의 반감기보다 대략 14-22배 더 길었다.
더욱이, FVIII 반감기에 있어서 유의한 연장 효과가 또한 관찰되었다. 도 4에 개시되고 하기 표 3에서 요약된 바와 같이, FVIII을 OCTA 12와 함께 병용-투여할 때 이의 반감기는 25.3시간이었고, 이는 동일한 경로 (SQ)를 통해 FVIII 단독으로 투여했을 때와 비교하여 반감기가 6.7배 증가하였고 및 기존의 IV 경로를 통해 FVIII 단독으로 투여했을 때와 비교하여 반감기가 3.9배 향상되었다.
미니피그에서 FVIII 항원의 약동학적 파라미터. 값들은 3마리 동물의 평균 +- SD를 나타낸다.
FVIII 　항원의 약동학적 파라미터
그룹/
투여량/
경로 		　　 C max
[U/mL] 		　　 t max
[h] 		t 1/2
[h]
그룹 1:
100　U /kg BW
FVIII 단독
SQ		 0.03
±0.015		 8.00 3.78
±1.31
그룹 2:
100　U/ kg BW
FVIII과 OCTA 12
SQ		 0.178
±0.09		 8.00 25.30
±11.24
그룹 3:
FVIII 단독
IV		 2.56
±0.26		 1.00 6.45
±2.32
본원에 개시된 본 발명의 많은 변형 및 다른 구체예는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 상기 개시내용 및 관련된 도면에 제시된 교시의 이점을 가질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러므로, 본 발명은 개시된 특정 구체예들에 한정되지 않으며 변형들 및 다른 구체예들은 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 특정 용어가 사용되었지만, 이들은 제한적인 목적이 아닌 일반적이고 기술적인 의미로 사용된다.
Figure pct00015
Figure pct00016
SEQUENCE LISTING <110> Octapharma AG <120> vWF Peptides for improvement of FVIII Pharmacokinetics <130> 4830/P/1098-WO <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His 20 25 30 <210> 2 <211> 2813 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr 1235 1240 1245 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu 1265 1270 1275 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe 1280 1285 1290 Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg 1295 1300 1305 Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 1310 1315 1320 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser 1325 1330 1335 Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln 1340 1345 1350 Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile 1355 1360 1365 Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu 1370 1375 1380 Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val 1385 1390 1395 Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro 1400 1405 1410 Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile 1415 1420 1425 Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val 1430 1435 1440 Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys 1445 1450 1455 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met 1460 1465 1470 Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu 1475 1480 1485 Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu 1490 1495 1500 Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys 1505 1510 1515 Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp 1520 1525 1530 Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val 1535 1540 1545 Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 1550 1555 1560 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr 1565 1570 1575 Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser 1580 1585 1590 Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr 1595 1600 1605 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile 1610 1615 1620 Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu 1625 1630 1635 Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp 1640 1645 1650 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 1655 1660 1665 Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1670 1675 1680 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 1685 1690 1695 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe 1700 1705 1710 Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr 1715 1720 1725 Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val 1730 1735 1740 Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val 1745 1750 1755 Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala 1760 1765 1770 Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala 1775 1780 1785 Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val 1790 1795 1800 Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn 1805 1810 1815 Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala 1820 1825 1830 Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val 1835 1840 1845 Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu 1850 1855 1860 Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile 1865 1870 1875 Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp 1880 1885 1890 Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly 1895 1900 1905 Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu 1910 1915 1920 Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu 1925 1930 1935 Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser 1940 1945 1950 Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu 1955 1960 1965 Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp 1970 1975 1980 Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg 1985 1990 1995 Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser 2000 2005 2010 Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu 2015 2020 2025 Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr 2030 2035 2040 Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile 2045 2050 2055 Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser 2060 2065 2070 Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys 2075 2080 2085 Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val 2090 2095 2100 Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg 2105 2110 2115 Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val 2120 2125 2130 Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala 2135 2140 2145 Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys 2150 2155 2160 Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala 2165 2170 2175 Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp 2180 2185 2190 Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val 2195 2200 2205 Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn 2210 2215 2220 Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro 2225 2230 2235 Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala 2240 2245 2250 Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu 2255 2260 2265 Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys 2270 2275 2280 Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr 2285 2290 2295 Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg 2300 2305 2310 Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp 2315 2320 2325 Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly 2330 2335 2340 Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe 2345 2350 2355 Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro 2360 2365 2370 Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys 2375 2380 2385 Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val 2390 2395 2400 Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys 2405 2410 2415 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His 2420 2425 2430 Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys 2435 2440 2445 Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu 2450 2455 2460 Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg 2465 2470 2475 Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2480 2485 2490 Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly 2495 2500 2505 Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 2510 2515 2520 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu 2525 2530 2535 Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu 2540 2545 2550 Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser 2555 2560 2565 Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met 2570 2575 2580 Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp 2585 2590 2595 Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser 2600 2605 2610 Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro 2615 2620 2625 Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2630 2635 2640 Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile 2645 2650 2655 Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr 2660 2665 2670 His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2795 2800 2805 Arg Lys Cys Ser Lys 2810 <210> 3 <211> 566 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp 1 5 10 15 Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr 20 25 30 Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys 50 55 60 Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys 65 70 75 80 Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Gln Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr 85 90 95 Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr 100 105 110 Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr 115 120 125 Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile 130 135 140 Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys 145 150 155 160 Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly 165 170 175 Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val 180 185 190 Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser 195 200 205 Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr 210 215 220 Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln 225 230 235 240 Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val 245 250 255 Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 275 280 285 Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val 290 295 300 Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 305 310 315 320 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys 325 330 335 Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly 340 345 350 Lys Val Val Thr Trp 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His 565 <210> 4 <211> 588 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys 20 25 30 Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr 35 40 45 Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val 50 55 60 Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys 65 70 75 80 Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala 85 90 95 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Gln Asp 100 105 110 Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr 115 120 125 Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe 130 135 140 Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn 145 150 155 160 Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro 165 170 175 Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu 180 185 190 Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn 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agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctcccaga attcaagaca tcaggaacct ggcggactgg tggtgcctcc tacagatgcc 2340 cctgtgtccc ccaccaccct gtacgtggaa gatatcagcg agccccccct gcaccaggaa 2400 cctggcggac tggtggtgcc tcctacagac gctcctgtgt ctcctacaac actgtatgtg 2460 gaagatattt ccgagcctcc tctgcatcag gaaccagggg gcctggtggt gccaccaact 2520 gatgcaccag tgtctccaac tactctgtac gtggaagata tttctgaacc ccccctgcat 2580 caagcttatc gataccgtcg aggggaaata actcgtacta ctcttcagtc agatcaagag 2640 gaaattgact atgatgatac catatcagtt gaaatgaaga aggaagattt tgacatttat 2700 gatgaggatg aaaatcagag cccccgcagc tttcaaaaga aaacacgaca ctattttatt 2760 gctgcagtgg agaggctctg ggattatggg atgagtagct ccccacatgt tctaagaaac 2820 agggctcaga gtggcagtgt ccctcagttc aagaaagttg ttttccagga atttactgat 2880 ggctccttta ctcagccctt ataccgtgga gaactaaatg aacatttggg actcctgggg 2940 ccatatataa gagcagaagt tgaagataat atcatggtaa ctttcagaaa tcaggcctct 3000 cgtccctatt ccttctattc tagccttatt tcttatgagg aagatcagag gcaaggagca 3060 gaacctagaa aaaactttgt caagcctaat 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gcattcgcag cactcttcgc atggagttga tgggctgtga tttaaatagt 3900 tgcagcatgc cattgggaat ggagagtaaa gcaatatcag atgcacagat tactgcttca 3960 tcctacttta ccaatatgtt tgccacctgg tctccttcaa aagctcgact tcacctccaa 4020 gggaggagta atgcctggag acctcaggtg aataatccaa aagagtggct gcaagtggac 4080 ttccagaaga caatgaaagt cacaggagta actactcagg gagtaaaatc tctgcttacc 4140 agcatgtatg tgaaggagtt cctcatctcc agcagtcaag atggccatca gtggaccctc 4200 ttttttcaga atggcaaagt aaaggttttt cagggaaatc aagactcctt cacacctgtg 4260 gtgaactctc tagacccacc gttactgact cgctaccttc gaattcaccc ccagagttgg 4320 gtgcaccaga ttgccctgag gatggaggtt ctgggctgcg aggcacagga cctctaccag 4380 gaacctggcg gactggtggt gcctcctaca gatgcccctg tgtcccccac caccctgtac 4440 gtggaagata tcagcgagcc ccccctgcac caggaacctg gcggactggt ggtgcctcct 4500 acagacgctc ctgtgtctcc tacaacactg tatgtggaag atatttccga gcctcctctg 4560 catcaggaac cagggggcct ggtggtgcca ccaactgatg caccagtgtc tccaactact 4620 ctgtacgtgg aagatatttc tgaacccccc ctgcattga 4659

Claims (39)

  1. 주 단백질 (main protein) 및 하나 이상의 연장 펩티드 (extension peptides)를 포함하는 융합 단백질 (fusion protein)로서, 상기 주 단백질의 아미노산 서열은 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사하고, 및 상기 연장 펩티드는 O-글리코실화 아미노산의 클러스터를 포함하는 것인 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은, 연장 펩티드가 존재하지 않는 주 단백질과 비교하여, 증가된 반감기를 갖는 것인 융합 단백질.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드의 아미노산 서열은 상기 주 단백질 또는 단편의 비-반복된 아미노산 서열 섹션과 동일하거나 또는 유사한 것인 융합 단백질.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 융모 생식샘자극호르몬 β-서브유닛 (chorionic gonadotropin β-subunit: CG-β)으로부터 유래되지 않고, 구체적으로 CG-β의 C-말단 펩티드 (C-terminal peptide: CTP)와 동일하거나 또는 유사하지 않은 것인 융합 단백질.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장 펩티드의 O-글리코실화 아미노산의 클러스터(들)은 적어도 2개, 바람직하게 적어도 3개, 더 바람직하게 적어도 4개의 O-글리코실화 아미노산을 포함하는 것인 융합 단백질.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, O-글리코실화 부위의 클러스터는 적어도 하나의 트레오닌을 O-글리코실화 아미노산으로서 포함하고, 바람직하게 상기 클러스터는 트레오닌과 세린 둘 다를 O-글리코실화 아미노산으로서 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 10개의 아미노산 중에 적어도 하나의 O-글리코실화 부위, 바람직하게 8개의 아미노산 중에 적어도 하나의 O-글리코실화 부위를 포함하는 것인 융합 단백질.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 20 내지 60개의 아미노산, 바람직하게 22 내지 40개의 아미노산, 더 바람직하게 26 내지 36개 아미노산 범위의 길이를 갖는 것인 융합 단백질.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor: VWF)의 O-글리코실화 펩티드에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 것인 융합 단백질.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 VWF의 O-글리코실화 펩티드, 구체적으로 서열번호: 1에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 적어도 100 %의 서열 동일성을 갖는 것인 융합 단백질.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장 펩티드의 적어도 2개의 카피 (copy), 바람직하게 적어도 4개의 카피를 포함하는 것인 융합 단백질.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장 펩티드는 상기 주 단백질의 C-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 융합되는 것인 융합 단백질.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장 펩티드는 상기 융합 단백질의 C-말단을 형성하고, 상기 연장 펩티드의 C-말단 아미노산은 선택적으로 친화성 태그 융합 펩티드 (affinity tag fusion peptide)에 연결되는 것인 융합 단백질.
  14. 청구항 9 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주 단백질은 O-글리코실화 아미노산의 적어도 하나의 클러스터를 포함하는 것인 융합 단백질.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 이량체화 도메인을 포함하고, 구체적으로 상기 주 단백질은 이량체화 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 단백질은 인간 혈액 단백질, 바람직하게 응고 인자 또는 프로테아제 저해제이고, 더 바람직하게 VWF, 프로트롬빈 (prothrombin), 피브리노겐 (fibrinogen), FIII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, ADAMTS13, 안티트롬빈 (antithrombin), 알파-1 안티트립신 (alpha-1 antitrypsin), C1-저해제, 안티키모트립신 (antichymotrypsin), PAI-1, PAI-3, 2-마크로글로불린 (2-macroglobulin), TFPI, 헤파린 보조인자 II 단백질 Z, 단백질 C, 및 단백질 S로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 764 내지 1268에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 서열 동일성을 갖는 것인 융합 단백질.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 주 단백질과 비교하여, 적어도 4개, 바람직하게 적어도 8개, 더 바람직하게 적어도 12개의 부가의 O-글리칸을 포함하는 것인 융합 단백질.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 11로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100　%의 동일성을 갖는 것인 융합 단백질.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 포유동물 세포주, 바람직하게 인간 세포주, 더 바람직하게 인간 신장 세포주, 가장 바람직하게 인간 배아 신장 세포주 (embryonic kidney cell line), 구체적으로 HEK293 세포주 예컨대 HEK293F에서 발현에 의해 생산되는 것인 융합 단백질.
  21. 제1 단백질 및 제2 단백질의 조성물로서, 상기 제1 단백질은 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이고 또한 상기 제2 단백질에 결합할 수 있으며, 및 상기 제2 단백질은 제2 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 포함하는 치료 단백질 (therapeutic protein)인 것인 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 제1 단백질에 결합된 상기 제2 단백질의 반감기는 상기 제2 단백질의 유리 형태 (free form)와 비교하여 증가되고, 바람직하게 상기 제1 단백질에 결합된 상기 제2 단백질의 반감기는 네이티브 (native) 포유동물 단백질 또는 융합 펩티드가 존재하지 않는 주 단백질에 결합된 상기 제2 단백질과 비교하여 증가되는 것인 조성물.
  23. 청구항 21 또는 22에 있어서, 상기 제2 단백질에 대한 제1 단백질의 몰비 (molar ratio)는 0.1 내지 250의 범위, 바람직하게 0.5 내지 50의 범위, 더 바람직하게 1 내지 25의 범위, 가장 바람직하게 2 내지 10의 범위인 것인 조성물.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단백질에 대한 제1 단백질의 결합 친화도 (binding affinity)는 0.05 내지 3 nM의 범위인 것인 조성물.
  25. 청구항 21 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 포유동물 단백질은 혈액 단백질이고, 더 바람직하게 상기 제2 포유동물 단백질은 혈장 단백질이고, 가장 바람직하게 상기 제2 단백질은 응고 인자인 것인 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 제2 포유동물 단백질은 인간 단백질인 것인 조성물.
  27. 청구항 21 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단백질은 FVIII 단백질로, 전장 FVIII, B-도메인의 적어도 일부가 결실된 (missing) FVIII 단백질, 및 B-도메인의 적어도 일부가 연장 펩티드로 대체된 FVIII 단백질로부터 선택되고, 상기 연장 펩티드는 청구항 5 내지 10 중 어느 한 항에 따라 정의된 것인 조성물.
  28. 청구항 21 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 연장 펩티드는 상기 제1 단백질의 제2 단백질로의 결합을 방해하지 않는 제1 단백질의 폴딩된 상태 (folded state)의 위치에 위치하는 것인 조성물.
  29. 제1 단백질 및 제2 단백질의 복합체 (complex)로서, 상기 제1 단백질은 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이고, 및 상기 제2 단백질은 제2 포유동물 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는 것인 복합체.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 제1 단백질은 상기 제2 단백질에 비-공유적으로 결합되는 것인 복합체.
  31. 청구항 29 또는 30에 있어서, 상기 제1 및 제2 단백질의 2개의 카피를 포함하고, 상기 제1 단백질의 2개의 카피는 이량체, 바람직하게 비-공유적으로 결합된 이량체를 형성하는 것인 복합체.
  32. 청구항 29에 있어서, 상기 제1 단백질은 상기 제2 단백질에 공유 결합되고, 링커 (linker)는 펩티드 결합, 화학적 링커, 또는 글리코시드 결합 (glycosidic bond)으로부터 선택되는 것인 복합체.
  33. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  34. 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 및 서열번호: 14로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 더 바람직하게 적어도 98 %, 가장 바람직하게 100 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  35. 청구항 33 또는 34에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터 백본 (backbone)은 바람직하게 pCDNA3, pCDNA3.1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, pIRES, 및 pSCAS로부터 선택되는 것인 벡터.
  36. 청구항 33 또는 34에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 35에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 바람직하게 포유동물 세포, 바람직하게 인간 세포, 더 바람직하게 인간 신장 세포, 가장 바람직하게 인간 배아 신장 세포주, 구체적으로 HEK293 세포주 예컨대 HEK293F인 것인 숙주 세포.
  37. 제2 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 용도로서, 상기 융합 단백질은 상기 제2 단백질에 결합할 수 있는 것인 용도.
  38. 출혈 질환 (bleeding disorder)의 치료 또는 예방으로, 바람직하게 PUPs의 치료 및 ITI 치료 및/또는 관련된 출혈 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 청구항 21 내지 28 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 청구항 29 내지 32 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 약학적 조성물.
  39. 청구항 35에 있어서, 상기 사용은 정맥내 또는 비-정맥내 주사, 바람직하게 피하 주사를 포함하는 것인 약학적 조성물.
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