ES2426196T3

ES2426196T3 - Uso de TSG-6 para el tratamiento de la osteoporosis

Info

Publication number: ES2426196T3
Application number: ES07712838T
Authority: ES
Inventors: Afsie Sabokbar; Anthony Day; Caroline Milner
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd; University of Manchester
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd; University of Manchester
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2013-10-21
Anticipated expiration: 2027-03-06
Also published as: EP2001499B1; JP5346216B2; DK2001499T3; EP2001499A2; WO2007101988A3; JP2009532334A; GB0604460D0; US9066908B2; WO2007101988A2; US20090099084A1

Abstract

Un polipéptido TSG-6, o un polinucleótido que codifica un polipéptido TSG-6, para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevención de la osteoporosis, en el que el polipéptido TSG-6 o polinucleótido no se administra con pentraxina larga 3 (PTX3).

Description

Uso de TSG-6 para el tratamiento de la osteoporosis.

Campo de la Invenci6n [0001] La presente invencion se refiere a tratar o prevenir la osteoporosis.

Antecedentes de la Invenci6n [0002] El gen 6 estimulado por el factor de la necrosis tumoral (TNF) (TSG-6) es una proteina inducida por inflamacion con funciones protectoras en la artritis. TSG-6, el producto secretado -35 kDa del gen 6 estimulado por TNF, se expresa en respuesta a mediadores inflamatorios y factores de crecimiento, donde se cree que tiene poca o ninguna expresion constitutiva de la proteina en tejido sanos (Milner & Day (2003) J. Cell Sci. 116, 1863-1873). [0003] Hay una creciente evidencia de que TSG-6, mientras que se induzca en respuesta a la inflamacion, tiene propiedades antiinflamatorias y condroprotectoras, convirtiendola en un inhibidor endogeno de la destruccion articular. A este respecto, se ha descubierto que TSG-6 tiene diversos actividades biologicas, tales como la inhibicion de la migracion de neutrofilos, la regulacion por disminucion de la actividad de la plasmina, y la reticulacion de las cadenas de hialuronano (HA), que suelen contribuir a sus propiedades condroprotectores (Wisniewski y col. (1996) J. Immunol. 156, 1609-1615; y Milner y col., (2006) Biochem. Soc. Trans. 34, 446-450). [0004] TSG-6, que esta compuesta casi en su totalidad de dominios Link y CUB C contiguos, se une a una diversidad de proteinas y ligandos de glicosaminoglicanos (incluyendo HA, condroitin-4-sulfato, agrecano, inter-ainhibidor (IaI), pentraxina 3, trombospondina-1, fibronectina y heparina/sulfato de heparano), donde la mayoria de estas interacciones estan mediadas a traves de su dominio del modulo Link. Estudios sobre mutagenesis han revelado que hay presentes al menos tres superficies de union a ligando no solapantes en el modulo Link (Mahoney y col. (2005) J. Biol. Chem. 280, 27044-27055; y Kuznetsova y col. (2005) J. Biol. Chem. 280, 30899-30908). Hasta la fecha, el unico ligando identificado para el dominio CUB C es la fibronectina (DJ Mahoney & AJ Day, datos no publicados). Ademas, este dominio contiene un sitio de union a cation divalente (Rugg y col. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25674-25686). [0005] Se ha detectado TSG-6 en el contexto de enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide (AR), donde esta presente en el liquido sinovial, el cartilago y la sinovia. Es probable que TSG-6 se produzca localmente en tejidos articulares, ya que su expresion puede inducirse en condrocitos humanos cultivados por TNF, IL-1, IL-6, TGF-1 y PDGF y se expresa constitutivamente por los sinoviocitos de pacientes con AR, donde su produccion se potencia adicionalmente por el tratamiento con IL-1, TNF y IL-17 (Milner y col., (2006) Biochem. Soc. Trans. 34, 446450). [0006] De forma importante, varios estudios recientes han revelado que TSG-6 tiene una funcion protectora en modelos experimentales de artritis. Por ejemplo, en un modelo de artritis inducida por colageno (AIC; una poliartritis autoinmune con una histopatologia similar a la AR humana), hubo una aparicion tardia de los sintomas y una reduccion de tanto la incidencia de la enfermedad como de la inflamacion/destruccion articular en ratones transgenicos TSG-6 o ratones no manipulados tratados sistemicamente con TSG-6 humana recombinante (Mindrescu y col. (2000) Arthritis Rheum. 43, 2668-2677; y Mindrescu y col. (2002) Arthritis Rheum. 46, 2453-2464). En animales transgenicos TSG-6, se observo un efecto de mejora comparable a un tratamiento con anticuerpos anti-TNF. Ademas, en ratones transgenicos TSG-6 especifico de cartilago, la instigacion de artritis inducida por antigeno (AIA; un modelo de artritis monoarticular) dio como resultado un dano del cartilago tardio comparado con los controles, con una degradacion reducida de agrecano por MMP y agrecanasa, y hubo evidencia de regeneracion del cartilago, 4-5 semanas despues de la aparicion de la enfermedad en estos animales (Glant y col. (2002) Arthritis Rheum. 46, 2207-2218). Se observaron efectos condroprotectores similares en ratones no manipulados en los que se inyecto TSG-6 murina recombinante TSG-6 directamente en la articulacion afectada en AIA o por via intravenosa en artritis inducida por proteoglicano (AIP; un modelo de AR humana) (Bardos y col. (2001) Am. J. Pathol. 159, 17111721).

[0007] Los efectos antiinflamatorios y condroprotectores de TSG-6 observados en estos estudios se deben probablemente a mas de un mecanismo. Sobre todo, TSG-6 es un potente inhibidor de la extravasacion de neutrofilos in vivo y tambien esta implicado en la inhibicion de la red de proteasa a traves de su potenciacion de la actividad anti-plasmina de IaI, donde la plasmina es un regulador clave de la proteolisis durante la inflamacion, por ejemplo, a traves de su activacion de MMP (Wisniewski y col. (1996) J. Immunol. 156, 1609-1615; y Getting y col.

(2002) J. Biol. Chem. 277, 51068-51076). A este respecto, los ratones que carecen de TSG-6 desarrollan una forma acelerada y mucho mas grave de AIP, con una degradacion del cartilago y erosion osea rapida y extensa (Szanto y col. (2004) Arthritis Rheum. 50, 3012-3022). Se sugirio el aumento de la infiltracion de neutrofilos y la actividad de la plasmina para tener en cuenta estos efectos en los ratones TSG-6-/-.

Resumen de la invenci6n

[0008] Los presentes inventores han mostrado que TSG-6 inhibe la resorcion osea por osteoclastos. Los osteoclastos son celulas multinucleadas grandes que se obtienen a partir del linaje de monocitos/macrofagos y degradan la matriz osea y los minerales en el proceso de resorcion osea. Los presentes inventores tambien han mostrado que la ausencia de TSG-6 en ratones con genes manipulados TSG-6 conduce a un aumento de la resorcion osea por osteoclastos. Los presentes inventores han mostrado que TSG-6 es util en el tratamiento y la prevencion de una enfermedad o afeccion osea asociada con la resorcion osea por osteoclastos. Los presentes inventores tambien han demostrado que la administracion de osteoprotegerina (OPG) en combinacion con TSG-6 da como resultado un efecto sinergico. Una combinacion de TSG-6 y OPG inhibe la resorcion osea por osteoclastos en mayor medida que la suma de cada factor en solitario.

[0009] De acuerdo con la presente invencion, se proporciona de este modo un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la osteoporosis en el que el polipeptido TSG-6 o polinucleotido no se administra con pentraxina larga 3 (PTX3). En una realizacion preferida, el polipeptido TSG-6 o polinucleotido se administra en combinacion con una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG.

[0010] La presente invencion tambien proporciona el uso de un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de la osteoporosis, en el que el polipeptido TSG-6 o polinucleotido no se administra con pentraxina larga 3 (PTX3). En una realizacion preferida, el medicamento se administra al sujeto en combinacion con una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG.

[0011] La invencion proporciona adicionalmente:

-: un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, y un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la osteoporosis; y

-: un producto que contiene:

(a): un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6; y

(b): un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG;

para su uso simultaneo, separado o secuencial en el tratamiento o prevencion de la osteoporosis.

[0012] Una ventaja de la presente invencion es que el polipeptido TSG-6 o polinucleotido puede tener efectos antiinflamatorios y/o condroprotectores ademas de inhibir la resorcion osea por osteoclastos. Estos efectos antiinflamatorios y/o condroprotectores pueden resultar de la inhibicion de la migracion de neutrofilos, la regulacion por disminucion de la actividad de la plasmina y/o la reticulacion mediada por TSG-6 de cadenas de HA.

Breve Descripci6n de las Figuras

[0013]

La figura 1 muestra el efecto de TSG-6 en la osteoclastogenesis. Se determino la formacion de osteoclastos humanos mediada por sRANKL/M-CSF en ausencia (barras claras en el lado derecho) y en presencia (barras oscuras en el lado izquierdo) de TSG-6 humana recombinante (25 ng/ml (0,8 nM)). Los datos (n = 8 laminas de dentina) se expresan como los valores medios ± E.S. de 2 experimentos independientes, de 4 replicas cada uno.

La figura 2 muestra el efecto inhibidor de TSG-6 sobre la resorcion lacunar en un intervalo de concentraciones de TSG-6. Los datos (n = 8 laminas de dentina) se expresan como los valores medios ± E.S. de 2 experimentos independientes, de 4 replicas cada uno.

La figura 3 muestra una comparacion de las actividades resortivas oseas de los osteoclastos derivados de la medula osea de ratones no manipulados (NM, barras del lado izquierdo) y TSG-6-1-(KO, barras del lado derecho). Los datos (n = 4 laminas de dentina) se expresan como los valores medios ± E.S. de 2 experimentos independientes, de 4 replicas.

La figura 4 muestra la interaccion de TSG-6 con sRANKL. TSG-6 de longitud completa, Link TSG6 o CUB C TSG6 se cubrieron en placas de microtitulacion a un intervalo de concentraciones y se determino la union de sRANKL (5 pmol/pocillo) usando un anticuerpo especifico de RANKL. Todos los datos se representan como los valores de absorbancia media (405 nm) (n = 8) ± E.S.

La figura 5 muestra la cuantificacion de TSG-6 y OPG en el liquido sinovial de pacientes con diversos trastornos oseos. Los niveles de proteinas en diversos trastornos oseos se determinaron usando ensayos ELISA "disenados en el laboratorio". Los niveles de TSG-6 se muestran en las barras claras en el lado izquierdo. Los niveles de OPG se muestran en las barras oscuras en el lado derecho. Esta figura indica la variacion en los niveles de TSG-6 y OPG dependiendo de la gravedad y fase de las enfermedades oseas osteoartritis (OA), artropatia por pirofosfato (PPA), artritis reumatoide (AR) y gota. Cada muestra se evaluo por triplicado y se proporciona el numero de muestras de liquido sinovial para cada afeccion (numero N). Los valores se expresan como la media ± error tipico de la media para cada grupo.

La figura 6 muestra una comparacion entre los niveles de TSG-6 y OPG en las muestras de liquido sinovial de pacientes con osteoartritis (OA) (n = 20). Estos datos demuestran que la variabilidad en los niveles de TSG-6, en comparacion con los niveles de OPG, podria contribuir a la extension y la gravedad de la enfermedad.

Breve Descripci6n de las Secuencias

[0014] La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de acidos nucleicos que codifica la variante alotipica Q144 de longitud completa de TSG-6 humana.

[0015] La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia aminoacidica de variante alotipica Q144 de longitud completa de TSG-6 humana. Esta variante alotipica tiene un residuo de glutamina (Q) en la posicion 144. Es la variante alotipica mas comun y se encuentra en aproximadamente el 86% de la poblacion caucasica (Nentwich y col. (2002) 277, 15354-15362).

[0016] La SEQ ID NO: 3 (residuos 18-277 de la SEQ ID NO: 2) muestra la secuencia aminoacidica de la variante alotipica Q144 de TSG-6 humana sin la secuencia senal.

[0017] La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de acidos nucleicos que codifica la variante alotipica R144 de longitud completa de TSG-6 humana.

[0018] La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia aminoacidica de variante alotipica R144 de longitud completa de TSG-6 humana. Esta variante alotipica tiene un residuo de arginina (R) en la posicion 144. Es la variante alotipica menos comun y se encuentra en aproximadamente el 14% de la poblacion caucasica (Nentwich y col. (2002) 277, 15354-15362).

[0019] La SEQ ID NO: 6 (residuos 18-277 de la SEQ ID NO: 5) muestra la secuencia aminoacidica de la variante alotipica R144 de TSG-6 humana sin la secuencia senal.

[0020] La SEQ ID NO: 7 (residuos 37-128 de las SEQ ID NOs: 2 y 5) muestra la secuencia aminoacidica de el modulo Link de TSG-6 humana.

[0021] La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de acidos nucleicos que codifica el Link TSG6 usado en los Ejemplos (Day y col. (1996) Protein Expr. Pruif. 8, 1-16).

[0022] La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia aminoacidica del Link TSG6 usado en los Ejemplos. Los residuos 3-95 de la SEQ ID NO: 9 corresponden a la SEQ ID NO: 7 (residuos 37-128 de las SEQ ID NOs: 2 y 5). La metionina de iniciacion (Met-1) se elimina en la expresion de Link TSG6 (Day y col. (1996) Protein Expr. Pruif. 8, 1-16).

[0023] La SEQ ID NO: 10 (residuos 129-277 de la SEQ ID NO: 2) muestra la secuencia aminoacidica del dominio CUB C de la variante alotipica Q144 de TSG-6 humana.

[0024] La SEQ ID NO: 11 (residuos 129-277 de la SEQ ID NO: 5) muestra la secuencia aminoacidica del dominio CUB C de la variante alotipica R144 de TSG-6 humana.

[0025] La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de acidos nucleicos que codifica el CUB C TSG6 usado en los Ejemplos.

[0026] La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia aminoacidica del CUB C TSG6 usado en los Ejemplos. Los residuos 2-150 de la SEQ ID NO: 13 corresponden a la SEQ ID NO: 11 (residuos 129-277 de la SEQ ID NO: 5). La metionina de iniciacion (Met-1) se elimina en la expresion de CUB C TSG6 (AJ Day, datos no publicados).

[0027] La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de acidos nucleicos que codifica la OPG humana de longitud completa.

[0028] La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia aminoacidica de OPG humana de longitud completa.

Descripci6n Detallada de la Invenci6n

[0029] La presente invencion proporciona un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la osteoporosis, en el que el polipeptido TSG-6 o polinucleotido no se administra con pentraxina larga 3 (PTX3). En una realizacion preferida, la invencion comprende adicionalmente administrar al sujeto una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG.

Polipeptidos TSG-6

[0030] El polipeptido TSG-6 es preferiblemente TSG-6 humana, o una variante o fragmento de TSG-6 humana que retiene la actividad de union a RANKL. El polipeptido TSG-6 tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos. La variante puede ser un polipeptido TSG-6 de otro organismo, tal como un primate, un raton o una rata.

[0031] El polipeptido TSG-6 comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2 o 5;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2 o 5 y que tiene un receptor activador de la actividad de union del ligando NFKB (RANKL); o

(c): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL. [0032] Preferiblemente, el polipeptido comprende, o consiste en, la secuencia de SEQ ID NO: 2 o 5. [0033] El polipeptido TSG-6 puede carecer adicionalmente de una secuencia senal. Por consiguiente, el

polipeptido TSG-6 comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 3 o 6;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 3 o 6 y que tiene actividad de union a RANKL; o

(c): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL.

[0034] El polipeptido TSG-6 consiste preferiblemente en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3 o 6.

[0035] El polipeptido TSG-6 puede carecer adicionalmente del dominio CUB C. El dominio CUB C corresponde a los residuos 129-277 de las SEQ ID NOs: 2 y 5. El polipeptido TSG-6 puede comprender unicamente el modulo Link de TSG-6 humana. El modulo Link corresponde a los residuos 37-128 de las SEQ ID NOs: 2 y 5 y se muestra en la SEQ ID NO: 7. El modulo Link es responsable de la actividad de union a hialuronano (HA), actividad de union a condroitin-4-sulfato, actividad de union a agrecano, actividad de union a inter-a-inhibidor (IaI), actividad de union a bicunina, actividad de union a versicano, actividad de union a dermatan sulfato, actividad de union a pentraxina 3, actividad de union a trombospondina-1, actividad de union a heparina/sulfato de heparano y la actividad de union a RANKL de TSG-6. Por consiguiente, el polipeptido TSG-6 comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 7;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 7 y que tiene actividad de union a RANKL; o

(c): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL. [0036] El polipeptido TSG-6 consiste preferiblemente en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 7. [0037] La SEQ ID NO: 9 muestra un polipeptido recombinante que incluye el modulo Link de TSG-6 (Link TSG6).

Por consiguiente, el polipeptido TSG-6 usado en la invencion comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 9;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 9 y que tiene actividad de union a RANKL; o

(c): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL.

[0038] El polipeptido TSG-6 consiste preferiblemente en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 9.

[0039] El polipeptido TSG-6 puede carecer adicionalmente del modulo Link. El modulo Link corresponde a los residuos 37-128 de las SEQ ID NOs: 2 y 5. El polipeptido TSG-6 puede comprender unicamente el dominio CUB C de TSG-6 humana. El dominio CUB C corresponde a los residuos 129-277 de las SEQ ID NOs: 2 y 5 y se muestra en las SEQ ID NOs: 10 y 11. El modulo CUB tambien es responsable de la actividad de union a fibronectina de TSG6 y de la actividad de union a RANKL de TSG-6. Por consiguiente, el polipeptido TSG-6 comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 10 u 11;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 10 u 11 y que tiene actividad de union a RANKL; o

(c): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL. [0040] El polipeptido TSG-6 consiste preferiblemente en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 10 u 11. [0041] La SEQ ID NO: 13 muestra un polipeptido recombinante que incluye el dominio CUB C de TSG-6

(CUB C TSG-6). Por consiguiente, el polipeptido TSG-6 usado en la invencion comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 13;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 13 y que tiene actividad de union a RANKL; o

(c): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL.

[0042] El polipeptido TSG-6 consiste preferiblemente en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 13.

[0043] Los polipeptidos variantes son aquellos para los que la secuencia aminoacidica varia de la que hay en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13, pero que retiene la funcion de TSG-6. Por lo tanto, los polipeptidos variantes inhiben la resorcion osea por osteoclastos. Los polipeptidos variantes se unen a RANKL.

[0044] Los polipeptidos variantes tipicamente tambien se unen a HA, condroitin-4-sulfato, agrecano, inter-ainhibidor (IaI), bicunina, versicano, dermatan sulfato, pentraxina 3, trombospondina-1, heparina/sulfato de heparano y/o fibronectina. Los polipeptidos variantes tambien pueden tener efectos antiinflamatorios y/o condroprotectores.

[0045] La activacion de union de los polipeptidos variantes puede modificarse para producir diferentes efectos en un sujeto tratado de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, un polipeptido variante que es incapaz de unirse al intera-inhibidor (IaI) puede no producir efectos antiinflamatorios en el sujeto. Como alternativa, un polipeptido variante que es incapaz de unirse a HA puede no producir efectos condroprotectores en el sujeto.

[0046] Tipicamente, los polipeptidos con mas de aproximadamente el 50%, 55% o el 65% de identidad, preferiblemente al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y particularmente preferiblemente al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 99% de identidad, con la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 se consideran variantes de la proteina TSG-6. Dichas variantes incluyen variantes alelicas y la delecion, modificacion o adicion de aminoacidos individuales o grupos de aminoacidos en la secuencia de la proteina, siempre que el peptido mantenga la funcionalidad basica de TSG-6. La identidad de variantes de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 puede medirse sobre una region de al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 150, al menos 200 o al menos 250 o mas aminoacidos contiguos de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13, o mas preferiblemente sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13.

[0047] Las variantes de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 contienen preferiblemente los residuos que se muestran esenciales para la union a hialuronano en Mahoney y col. (2001) J. Biol. Chem. 276, 22764-22771 y Blundell y col. (2003) J. Biol. Chem. 278, 49261-49270. Las variantes de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2 o 5 contienen preferiblemente los residuos Lys-46 y/o Tyr-47 y/o Tyr-94 y/o Phe-105 y/o Tyr-113 de SEQ ID NO: 2 o 5. Mucho mas preferiblemente, la variante de SEQ ID NO: 2 o 5 contiene cada uno de los residuos Lys-46, Tyr-47, Tyr-94, Phe-105 y Tyr-113 de SEQ ID NO: 2 o 5.

[0048] Las variantes de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 3 o 6 contienen preferiblemente los residuos Lys-29 y/o Tyr-30 y/o Tyr-77 y/o Phe-88 y/o Tyr-96 de SEQ ID NO: 3 o 6. Mucho mas preferiblemente, la variante de SEQ ID NO: 3 o 6 contiene cada uno de los residuos Lys-29, Tyr-30, Tyr-77, Phe-88 y Tyr-96 de SEQ ID NO: 3 o 6.

[0049] Las variantes de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 7 contienen preferiblemente los residuos Lys10 y/o Tyr-11 y/o Tyr-58 y/o Phe-69 y/o Tyr-77 de SEQ ID NO: 7. Mucho mas preferiblemente, la variante de SEQ ID NO: 7 contiene cada uno de los residuos Lys-10, Tyr-11, Tyr-58, Phe-69 y Tyr-77 de SEQ ID NO: 7.

[0050] Las variantes de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 9 contienen preferiblemente los residuos Lys12 y/o Tyr-13 y/o Tyr-60 y/o Phe-71 y/o Tyr-79 de SEQ ID NO: 9. Mucho mas preferiblemente, la variante de SEQ ID NO: 9 contiene cada uno de los residuos Lys-12, Tyr-13, Tyr-60, Phe-71 y Tyr-79 de SEQ ID NO: 9.

[0051] La identidad aminoacidica puede calcularse usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homologia (por ejemplo usado en su configuracion predeterminada) (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homologia o alinear secuencias (tal como identificando secuencias equivalentes o correspondientes (tipicamente en su configuracion predeterminada), por ejemplo, como se describe en Altschul (1993) J Mol Evol 36, 290-300; Altschul, y col. (1990) J Mol Biol 215, 403-10.

[0052] El software para realizar analisis BLAST esta a disposicion del publico a traves del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuacion (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de busqueda que coinciden o satisfacen alguna puntuacion umbral de valor positivo T al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuacion de una palabra vecina (Altschul y col., anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que la puntuacion de alineacion acumulativa pueda aumentarse. Las extensiones para los exitos de palabras en cada direccion se detienen cuando: la puntuacion de alineacion acumulativa esta dentro de la cantidad X de su valor maximo conseguido; la puntuacion acumulativa va hasta cero o menor, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuacion negativa; o se llega al final de cada secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLAST usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparacion de ambas hebras.

[0053] El algoritmo BLAST realiza un analisis estadistico de la similitud entre dos secuencias, vease, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la que tendra lugar por casualidad una correspondencia entre dos secuencia de de polinucleotidos o aminoacidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a la otra secuencia si la menor probabilidad de suma en la comparacion

5 de la primera secuencia con respecto a la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferiblemente menos de aproximadamente 0,1, mas preferiblemente menos de aproximadamente 0,01, y mucho mas preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.

[0054] Las secuencias variantes tipicamente difieren en al menos 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 o mas mutaciones (que

10 pueden se sustituciones, deleciones o inserciones de aminoacidos). Por ejemplo, pueden hacerse de 1 a 50, de 2 a 30, de 3 a 20 o de 5 a 10 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoacidos. El polipeptido modificado generalmente retiene la union a RANKL. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas, por ejemplo de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoacidos del mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la mima linea en la tercera columna pueden sustituirse entre si:

ALIFATICO: No Polar GAP

ILV

Polar - descargado: CSTM

NQ

D E

Polar - cargado: KR

AROMATICO: HFWY

[0055] El fragmento del polipeptido TSG-6 usado en la invencion retiene la funcion de TSG-6. Por lo tanto, los polipeptidos de fragmentos inhiben la resorcion osea por osteoclastos. Los polipeptidos de fragmentos se unen a RANKL.

20 [0056] Los polipeptidos de fragmentos tipicamente tambien se unen a HA, condroitin-4-sulfato, agrecano, inter-ainhibidor (IaI), bicunina, versicano, dermatan sulfato, pentraxina 3, trombospondina-1, heparina/sulfato de heparano y/o fibronectina. Los polipeptidos de fragmentos tambien pueden tener efectos antiinflamatorios y/o condroprotectores.

25 [0057] La actividad de union de los polipeptidos de fragmentos puede modificarse para producir diferentes efectos en un sujeto tratado de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, un polipeptido de fragmento que es incapaz de unirse a inter-a-inhibidor (IaI) puede no producir efectos antiinflamatorios en el sujeto. Como alternativa, un polipeptido de fragmentos que es incapaz de unirse a HA puede no producir efectos condroprotectores en el sujeto.

30 [0058] El fragmento del polipeptido TSG-6 usado en la invencion es tipicamente al menos 10, por ejemplo al menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o mas aminoacidos de longitud, hasta 100, 150, 200 o 250 aminoacidos de longitud, siempre que retenga la actividad de union a RANKL de TSG-6. Preferiblemente, el fragmento del polipeptido TSG-6 incluye la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 7. Los fragmentos de la secuencia aminoacidica

35 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 contienen preferiblemente los residuos que se muestra que son esenciales para la union de hialuronano en Mahoney y col. (2001) J. Biol. Chem. 276, 22764-22771 y Blundell y col. (2003) J. Biol. Chem. 278, 49261-49270. Los fragmentos de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2 o 5 contienen preferiblemente los residuos Lys-46 y/o Tyr-47 y/o Tyr-94 y/o Phe-105 y/o Tyr-113 de SEQ ID NO: 2 o 5. Mucho mas preferiblemente, el fragmento de la SEQ ID NO: 2 o 5

40 contiene cada uno de los residuos Lys-46, Tyr-47, Tyr-94, Phe-105 y Tyr-113 de SEQ ID NO: 2 o 5.

[0059] Los fragmentos de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 7 contienen preferiblemente los residuos Lys10 y/o Tyr-11 y/o Tyr-58 y/o Phe-69 y/o Tyr-77 de SEQ ID NO: 7. Mucho mas preferiblemente, el fragmento de la SEQ ID NO: 7 contiene cada uno de los residuos Lys-10, Tyr-11, Tyr-58, Phe-69 y Tyr-77 de SEQ ID NO: 7.

45 [0060] Los fragmentos de la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 9 contienen preferiblemente los residuos Lys12 y/o Tyr-13 y/o Tyr-60 y/o Phe-71 y/o Tyr-79 de SEQ ID NO: 9. Mucho mas preferiblemente, el fragmento de la SEQ ID NO: 9 contiene cada uno de los residuos Lys-12, Tyr-13, Tyr-60, Phe-71 y Tyr-79 de SEQ ID NO: 9.

50 [0061] Un fragmento preferido para su uso en la invencion es los residuos 36-133 de la SEQ ID NO: 1.

[0062] Los polipeptidos TSG-6 usados en la invencion pueden modificarse quimicamente, por ejemplo, modificarse postraduccionalmente. Por ejemplo, pueden glicosilarse, fosforilarse o pueden comprender residuos aminoacidicos modificados. Pueden modificarse por la adicion de residuos de histidina para facilitar su purificacion o mediante la adicion de una secuencia senal para promover la insercion en la membrana celular. Dichos polipeptidos modificados entran dentro del alcance del termino "polipeptido" usado en este documento.

[0063] La actividad de union a RANKL puede determinarse por medio de un ensayo adecuado. Por ejemplo, la actividad de union a RANKL de un polipeptido TSG-6 puede determinarse usando el procedimiento que se describe en los Ejemplos. Se conocen bien en la tecnica ensayos adecuados para determinar la capacidad de un polipeptido TSG-6 para unirse a HA, condroitin-4-sulfato, agrecano, inter-a-inhibidor (IaI), bicunina, versicano, dermatan sulfato, pentraxina 3, trombospondina-1, heparina/sulfato de heparano y fibronectina (Getting y col. (2002) J. Biol. Chem. 277, 51068-51076; Mahoney y col. (2005) J. Biol. Chem. 280, 27044-27055; Salustri y col. (2004) Development 131, 1577-1586; Parkar y col. (1997) FEBS Lett. 410, 413-417; Parkar y col. (1998) FEBS Lett. 428, 171-176; Mahoney y col. (2001) J. Biol. Chem. 276, 22764-22771; Nentwich y col. (2002) J. Biol. Chem. 277, 15354-15362; y Kuznetsova y col. (2005) J. Biol. Chem. 280, 30899-30908).

[0064] Los polipeptidos TSG-6 para su uso de acuerdo con la invencion muestran la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos. La actividad inhibidora osteoclastica puede determinarse por medio de un ensayo adecuado. Por ejemplo, la actividad inhibidora osteoclastica de un polipeptido TSG-6 puede determinarse usando cualquiera de los procedimientos descritos en el Ejemplo que se indica a continuacion.

[0065] Los polipeptidos TSG-6 para su uso en la invencion pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entendera que el polipeptido puede mezclarse con vehiculos o diluyentes que no interferiran con los fines pretendidos del polipeptido y aun se consideraran como sustancialmente aislados. Un polipeptido para su uso en la invencion tambien puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprendera generalmente el polipeptido en una preparacion en la que mas del 50%, por ejemplo mas del 80%, 90%, 95% o el 99%, en peso del polipeptido en la preparacion es un polipeptido de la invencion.

[0066] Los polipeptidos TSG-6 para su uso en la presente invencion pueden ser polipeptidos naturales. Los polipeptidos pueden aislarse a partir de cualquier organismo adecuado que exprese un polipeptido TSG-6. El polipeptido TSG-6 puede aislarse a partir de un ser humano u otro mamifero adecuado, tal como primates, ratas o ratones. Los polipeptidos para su uso en la invencion tambien pueden prepararse en forma de fragmentos de dichos polipeptidos aislados.

[0067] Adicionalmente, los polipeptidos TSG-6 tambien pueden prepararse sinteticamente o por medios recombinantes. Por ejemplo, un polipeptido TSG-6 recombinante puede producirse transfectando celulas en un cultivo con un vector de expresion que comprende una secuencia nucleotidica que codifica el polipeptido unido de forma operativa a secuencias de control adecuadas, cultivando las celulas, extrayendo y purificando el polipeptido TSG-6 producido por las celulas. Se conocen bien en la tecnica procedimientos para la produccion recombinante de polipeptidos (por ejemplo, Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edicion, Cold Harbour Laboratory Press).

[0068] La secuencia aminoacidica de polipeptidos TSG-6 para su uso en la invencion puede modificarse para incluir aminoacidos sinteticos o para aumentar la estabilidad del compuesto. Cuando los polipeptidos se producen por medios sinteticos, dichos aminoacidos pueden introducirse durante la produccion. Los polipeptidos tambien pueden modificarse siguiendo una produccion sintetica o recombinante.

[0069] Los polipeptidos TSG-6 para su uso en la invencion tambien pueden producirse usando D-aminoacidos. En tales casos, los aminoacidos se uniran en la secuencia inversa en la orientacion C a N. Esto es habitual en la tecnica para producir dichos polipeptidos.

[0070] Se conocen en la tecnica varias modificaciones de cadenas laterales y pueden hacerse a las cadenas laterales de los polipeptidos TSG-6, con la condicion de que los polipeptidos retengan la actividad inhibidora osteoclastica.

Polinucleotidos TSG-6

[0071] De acuerdo con la invencion, se usa un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, una variante o fragmento para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos. En particular, el polinucleotido preferiblemente comprende o consiste en: (a) la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12; (b) una secuencia que se degenera como resultado del codigo genetico con respecto a la secuencia como se define en (a); (c) una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a una secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL; o (d) un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a), (b) o (c) que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL. El polinucleotido preferiblemente comprende o consiste en: (a) la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12; (b) una secuencia que se degenera como resultado del codigo genetico con respecto a la secuencia como se define en (a); (c) una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a una secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipeptido que tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos;

o (d) un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a), (b) o (c) que codifica un polipeptido que tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos.

[0072] Tipicamente, el polinucleotido TSG-6 es ADN. Sin embargo, el polinucleotido puede ser un polinucleotido de ARN. El polinucleotido puede ser monocatenario o de doble cadena, y puede incluir en su interior nucleotidos sinteticos o modificados.

[0073] Un polinucleotido de la invencion puede hibridar tipicamente con la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 a un nivel significativamente por encima del nivel de fondo. Por ejemplo, la hibridacion de fondo puede tener lugar debido a otros ADN presentes en una biblioteca de ADN. El nivel de senal generado por la interaccion entre un polinucleotido de la invencion y la secuencia codificante o complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 es tipicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 100 veces, tan intensa como las interacciones entre otros polinucleotidos y la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12. La intensidad de la interaccion puede medirse, por ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo con 32P. La hibridacion selectiva se consigue tipicamente usando condiciones de media a alta rigurosidad. Sin embargo, dicha hibridacion puede realizarse bajo cualquier condicion adecuada conocida en la tecnica (vease, Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edicion, Cold Harbour Laboratory Press). Por ejemplo, si se requiere una alta rigurosidad, las condiciones adecuadas incluyen de 0,1 a 0,2 x SSC a 60 DC hasta 65 DC. Si se requiere una rigurosidad inferior, las condiciones adecuadas incluyen 2 x SSC a 60 DC.

[0074] La secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 puede modificarse por sustituciones de nucleotidos, por ejemplo de 1, 2 o 3 a 10, 25, 50, 100, 150 o 200 sustituciones. El polinucleotido de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 puede modificarse alternativa o adicionalmente por una o mas inserciones y/o deleciones y/o por una extension en uno o ambos extremos. Tambien pueden incluirse secuencias adicionales, tales como secuencias senal. El polinucleotido modificado codifica un polipeptido que tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos. El polinucleotido modificado codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL. El polinucleotido modificado puede codificar cualquiera de las variantes o fragmentos que se han analizado anteriormente. Pueden hacerse sustituciones degeneradas y/o pueden hacerse sustituciones que daran como resultado una sustitucion aminoacidica conservativa cuando la secuencia modificada se traduzca, por ejemplo como se muestra en la Tabla que se ha indicado anteriormente.

[0075] Una secuencia nucleotidica que es capaz de hibridar selectivamente con el complemento de la secuencia codificante de ADN de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 tendra generalmente al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 sobre una region de al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, al menos 60, mas preferiblemente al menos 100 nucleotidos contiguos, o mucho mas preferiblemente sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12, o la longitud de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12 que codifica un polipeptido que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, 5, 9 o 13. La identidad de secuencia puede determinarse mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo como se ha descrito anteriormente.

[0076] Puede usarse cualquier combinacion de los grados de identidad de secuencia y los tamanos minimos que se han mencionado anteriormente para definir polinucleotidos de la invencion, siendo preferidas las condiciones mas rigurosas (es decir, una identidad de secuencia superior sobre longitudes mayores). Por lo tanto, por ejemplo, un polinucleotido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia sobre 20, preferiblemente sobre 30 nucleotidos, forma un aspecto de la invencion, al igual que un polinucleotido que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia sobre 40 nucleotidos.

[0077] Los fragmentos de polinucleotidos tendran preferiblemente al menos 10, preferiblemente al menos 15 o al menos 20, por ejemplo al menos 25, al menos 30 o al menos 40 nucleotidos de longitud. Tipicamente tendran hasta 40, 50, 60, 70, 100 o 150 nucleotidos de longitud. Los fragmentos pueden ser mayores de 150 nucleotidos de longitud, por ejemplo hasta 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleotidos de longitud, o incluso hasta unos pocos nucleotidos, tales como cinco, diez o quince nucleotidos, cortos de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12.

[0078] Los polinucleotidos para su uso en la invencion pueden producirse de forma recombinante, sinteticamente o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la tecnica. Tambien pueden clonarse mediante tecnicas convencionales. Los polinucleotidos se proporcionan tipicamente de forma aislada y/o purificada.

[0079] En general, se produciran polinucleotidos cortos por medios sinteticos, que implica una fabricacion paso a paso de la secuencia de acidos nucleicos deseada, un nucleotido a la vez. Las tecnicas para realizar esto usando tecnicas automatizadas estan facilmente disponibles en la tecnica.

[0080] Los polinucleotidos mas grandes generalmente se produciran usando medios recombinantes, por ejemplo, usando tecnicas de clonacion por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa). Esto implicara elaborar un par de cebadores (por ejemplo de 15-30 nucleotidos) para una region del gen TSG-6 que se desea clonar, poner en contacto los cebadores con el ADN obtenido de una celula bacteriana, realizar una reaccion en cadena de la polimerasa en condiciones que dan lugar a la amplificacion de la region deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo mediante purificacion de la mezcla de reaccion sobre un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden disenarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion adecuados de manera que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonacion adecuado.

[0081] Dichas tecnicas pueden usarse para obtener toda o parte de la secuencia del gen TSG-6 que se describe en este documento. Aunque en general las tecnicas que se mencionan en este documento se conocen bien en la tecnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edicion, Cold Harbour Laboratory Press.

[0082] Los polinucleotidos TSG-6 como se describe en este documento, tienen utilidad en la produccion de los polipeptidos para su uso en la presente invencion, que puede tener lugar in vitro, in vivo o ex vivo. Los polinucleotidos pueden usarse en forma de agentes terapeuticos en su propio derecho o pueden estar implicados en la sintesis de proteinas recombinantes.

[0083] Los polinucleotidos para su uso en la invencion se incorporan tipicamente en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar el acido nucleico en una celula huesped compatible. Por lo tanto, pueden elaborarse polinucleotidos para su uso en la invencion introduciendo un polinucleotido TSG-6 en un vector replicable, introduciendo el vector en una celula huesped compatible y madurando la celula huesped en condiciones que dan lugar a la replicacion del vector.

[0084] Preferiblemente, el vector es un vector de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido TSG-6. Dichos vectores de expresion se construyen rutinariamente en la tecnica de la biologica molecular y pueden, por ejemplo, implicar el uso de ADN plasmidico e iniciadores, promotores, potenciadotes y otros elementos adecuados, tales como, por ejemplo, senales de poliadenilacion, que pueden ser necesarias y que se posicionan en la orientacion correcta con el fin de permitir la expresion de la proteina. Otros vectores adecuados seran evidentes para los expertos en la tecnica. A modo de ejemplo adicional a este respecto, se hace referencia a Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edicion, Cold Harbour Laboratory Press.

[0085] Preferiblemente, un polinucleotido para su uso en la invencion en un vector esta unido de forma operativa a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresion de la secuencia codificante por la celula huesped, es decir, el vector es un vector de expresion. La expresion "unido de forma operativa" se refiere a la una yuxtaposicion en la que los componentes descritos estan en una relacion que los permite funcionar en su forma pretendida. Una secuencia reguladora, tal como un promotor, "unida de forma operativa" a una secuencia codificante se posiciona de tal forma que la expresion de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

[0086] Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plasmidicos, viricos o de fagos dotados de un origen de replicacion, opcionalmente un promotor para la expresion de dicho polinucleotido y opcionalmente un regulador del promotor. El vector se adapta tipicamente a su uso in vivo.

[0087] Pueden seleccionarse promotores y otras senales de regulacion de la expresion que sean compatibles con la celula huesped para cuya expresion esta disenada. Pueden usarse promotores de mamifero, tales como promotores de 1-actina. Se prefieren especialmente promotores especificos de tejidos. Tambien pueden usarse promotores virales, por ejemplo repeticion terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, promotores HSV (tal como el promotor IE HSV), o promotores HPV, particularmente la region reguladora en la direccion 5' de HPV (URR). Estan disponibles facilmente en la tecnica promotores virales.

[0088] El vector puede incluir adicionalmente secuencias que fanquean el polinucleotido dando lugar a polinucleotidos que comprenden secuencias homologas a las secuencias genomicas eucariotas, preferiblemente genomicas de mamiferos. Esto permitira la introduccion de los polinucleotidos de la invencion dentro del genoma de celulas eucariotas mediante recombinacion homologa. En particular, se puede utilizar un vector plasmido que comprende el casete de expresion fanqueado por secuencias virales para preparar un vector viral adecuado para liberar los polinucleotidos de la invencion en celulas de mamifero. Otros ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores del virus herpes simplex y de retrovirus, que incluyen lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus HPV. Las tecnicas de transferencia genetica utilizando estos virus son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores de retrovirus para integrar de forma estable al polinucleotido dando lugar al polinucleotido en el genoma del huesped. En contraste, los vectores de adenovirus de replicacion defectuosa permanecen episomales y, por lo tanto, permiten la expresion transitoria.

Polipeptidos OPG

[0089] En una realizacion preferida de la invencion, un polipeptido OPG se administra en combinacion con TSG-6 para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos. El polipeptido OPG es preferiblemente OPG humana, o una variante o fragmento de OPG humana que retiene la actividad de union a RANKL. El polipeptido OPG tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos. La variante puede ser un polipeptido OPG de otro organismo, tal como un primate, un raton o una rata.

[0090] El polipeptido OPG comprende preferiblemente:

(a): la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 15;

(b): una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 15 y que tiene un receptor activador de actividad de union a RANKL; o

(d): un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL.

[0091] Preferiblemente, el polipeptido OPG comprende, o consiste en, la secuencia de SEQ ID NO: 15.

[0092] Tipicamente, los polipeptidos con mas de aproximadamente el 50%, 55% o el 65% de identidad, preferiblemente al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y particularmente preferiblemente al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 99% de identidad, con la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 15 se consideran variantes de la proteina OPG. Dichas variantes incluyen variantes alelicas, y la delecion, modificacion o adicion de aminoacidos individuales o grupos de aminoacidos en la secuencia de la proteina, siempre que el peptido mantenga la funcionalidad basica de OPG. La identidad de variantes de SEQ ID NO: 15 puede medirse sobre varias regiones de la SEQ ID NO: 15 como se ha analizado anteriormente para TSG-6. Las secuencias variantes tipicamente difieren de la SEQ ID NO: 15 en una o mas mutaciones, como se ha analizado anteriormente para TSG

6.

[0093] El fragmento del polipeptido OPG usado en la invencion retiene la funcion de OPG. Por lo tanto, los polipeptidos de fragmentos inhiben la resorcion osea por osteoclastos. Los polipeptidos de fragmentos se unen a RANKL.

[0094] La actividad de union de los polipeptidos de fragmentos puede modificarse como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0095] El fragmento del polipeptido OPG usado en la invencion es tipicamente de al menos 10 aminoacidos de longitud como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0096] Los polipeptidos OPG usados en la invencion pueden modificarse quimicamente como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0097] La actividad de union a RANKL y la actividad inhibidora osteoclastica del polipeptido OPG pueden determinarse como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0098] Los polipeptidos OPG para su uso en la invencion pueden estar en una forma sustancialmente aislada como se ha analizado anteriormente para TSG-6. Pueden ser polipeptidos naturales o estar hechos sinteticamente o mediante medios recombinantes como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0099] La secuencia aminoacidica de los polipeptidos OPG para su uso en la invencion puede modificarse como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

Polinucleotidos OPG

[0100] En una realizacion preferida de la invencion, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG, una variante o fragmento se administra en combinacion con TSG-6 para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos. En particular, el polinucleotido preferiblemente comprende o consiste en: (a) la secuencia codificante de SEQ ID NO: 14; (b) una secuencia que se degenera como resultado del codigo genetico con respecto a la secuencia como se define en (a); (c) una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a una secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL; o (d) un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a), (b) o (c) que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL. El polinucleotido preferiblemente comprende o consiste en: (a) la secuencia codificante de SEQ ID NO: 14; (b) una secuencia que se degenera como resultado del codigo genetico con respecto a la secuencia como se define en (a); (c) una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a una secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipeptido que tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos; o (d) un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a), (b) o (c) que codifica un polipeptido que tiene la capacidad de inhibir la resorcion osea por osteoclastos.

[0101] Tipicamente, el polinucleotido OPG es ADN. Sin embargo, el polinucleotido puede ser un polinucleotido de ARN. El polinucleotido puede ser monocatenario o de doble cadena, y puede incluir en esta nucleotidos sinteticos o modificados.

[0102] Un polinucleotido OPG puede hibridar tipicamente con la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 14 como se ha analizado anteriormente para TSG-6. La secuencia codificante de SEQ ID NO: 14 puede modificarse como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0103] Una secuencia nucleotidica que es capaz de hibridar selectivamente con el complemento de la secuencia codificante de ADN de SEQ ID NO: 14 tendra generalmente al menos el 60% de identidad con respecto a la secuencia codificante de SEQ ID NO: 14 sobre una region de al menos 20 nucleotidos contiguos, o mucho mas preferiblemente sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 14 o la longitud de la SEQ ID NO: 14 que codifica un polipeptido que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0104] Los fragmentos de polinucleotidos seran preferiblemente de al menos 10 nucleotidos de longitud como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0105] Los polinucleotidos OPG para su uso en la invencion pueden producirse mediante cualquier medio que se ha analizado anteriormente para TSG-6. Tambien pueden usarse para producir polipeptidos OPD como se ha analizado anteriormente para TSG-6.

Mimeticos OPG

[0106] En una realizacion preferida de la invencion, un mimetico OPG se administra en combinacion con TSG-6 para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos. Un mimetico OPG es un factor que inhibe la resorcion osea por osteoclastos mediante la union a e inhibiendo RANKL.

[0107] El mimetico OPG puede ser un polipeptido, tal como un anticuerpo. El mimetico OPG es preferiblemente AMG-162, que es un anticuerpo monoclonal de Amgen que se une a e inhibe RANKL. Como alternativa, el mimetico OPG puede ser un polinucleotido que codifica un polipeptido que inhibe la resorcion osea por osteoclastos mediante la union a e inhibiendo RANKL.

Enfermedades y Afecciones

[0108] De acuerdo con la invencion, el polipeptido TSG-6, o polinucleotido, se usa para tratar o prevenir la osteoporosis. La resorcion osea por osteoclastos es la destruccion de la matriz y el mineral oseo por celulas de osteoclastos. Una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos es una enfermedad o afeccion en la que la velocidad de resorcion osea por osteoclastos es anormal. Una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos es una enfermedad o afeccion en la que los osteoclastos reabsorben (destruyen) el hueso a mayor velocidad que la velocidad de la resorcion osea (destruccion) observada en sujetos comparables en ausencia de la enfermedad o afeccion. La enfermedad o afeccion implica un aumento de la velocidad de resorcion osea por osteoclastos.

[0109] La enfermedad o afeccion puede implicar una velocidad de resorcion osea que sea mayor que la velocidad 5 de la formacion osea en el mismo sujeto. Por lo tanto, la enfermedad o afeccion puede implicar una perdida osea neta. Como alternativa, la enfermedad o afeccion puede implicar una velocidad de resorcion osea que sea la misma

o menor que la velocidad de la formacion osea en el mismo sujeto. La enfermedad o afeccion puede implicar que no haya perdida osea neta. La enfermedad o afeccion puede implicar una ganancia osea neta. La enfermedad o afeccion puede implicar una velocidad menor de la ganancia osea neta en comparacion con la velocidad de la

10 ganancia osea neta observada en sujetos comparables sin la enfermedad o afeccion.

[0110] Otras enfermedades o afecciones desveladas en este documento son osteoartritis, cancer oseo, una lesion osea asociada con cancer metastasico, enfermedad de Paget, enfermedad de Gorham Stout, hiperparatiroidismo primario, enfermedad periodontal, una fractura de hueso y/o aflojamiento aseptico de protesis articulares. El cancer

15 oseo puede ser sarcoma de Ewing, mieloma multiple, osteosarcoma (tumor gigante del hueso) y/o osteoclastoma. El cancer metastasico que da como resultado una lesion osea puede ser cancer de mama, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de pulmon y/o leucemia de linfocitos T del adulto.

[0111] El sujeto es tipicamente un sujeto mamifero, tal como un raton, una rata o un primate (por ejemplo, un titi o

20 mono). El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano. Cuando el sujeto es un animal de laboratorio, tal como un raton, una rata o un primate, el animal puede tratarse para inducir una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos. La siguiente Tabla resume si existe un modelo de animal para una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos o como puede inducirse una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos en un modelo animal.

(Tabla sigue en página siguiente)

[0112]

Enfermedad o afecci6n: ModelolInducci6n

Osteoartritis: Meniscectomia lateral parcial en las rodillas de conejos/ratones o modelo de raton STR/ort

Osteoporosis: Ovariectomizacion de roedores, tales como ratas

Sarcoma de Ewing: Inyeccion de celulas tumorales primarias en ratones inmunodeprimidos, por ejemplo NOD o SCID

Mieloma multiple: Modelo de raton 52TMM

Osteosarcoma: Inyeccion de la linea celular de osteosarcoma TE-85 en tibias de ratones atimicos

Cancer de mama: Implantacion de celulas de cancer de raton 4T1/luc en la almohadilla de grasa mamaria, o inyeccion de la linea celular de cancer de mama MDA-MB-231 humana en ratones sin pelo

Rinon: Inyeccion de la linea celular de cancer renal RBM1 en ratones sin pelo

Pulmon: Inyeccion de la linea celular POS-1 en ratones C3H/He

Prostata: Inyeccion de celulas de cancer de prostata 22Rv1 en ratones SCID

Leucemia de linfocitos T del adulto: Modelo de raton transgenico HTLV-1 Tax

Hiperparatiroidismo primario: Expresion en exceso dirigida a PTH de ciclina D1 en ratones transgenicos

Enfermedades periodontales: Modelo de perro Beagle de periodontitis de origen natural

Fractura osea: Modelo de rata Wistar de fractura femoral

Aflojamiento aseptico de protesis articulares: Modelo de chincheta de rata con peso sostenido

Terapia y Profilaxis

5 [0113] La presente invencion proporciona el uso de polipeptidos TSG-6 y polinucleotidos para tratar o prevenir la osteoporosis. El tratamiento puede ser terapeutico o profilactico.

[0114] El polipeptido TSG-6 o polinucleotido puede administrarse a un individuo para prevenir la aparicion de uno

o mas sintomas de la enfermedad o afeccion. En esta realizacion, el sujeto puede ser asintomatico. El sujeto puede

10 tener una predisposicion genetica a la enfermedad. Se administra una cantidad profilacticamente eficaz del polipeptido o el polinucleotido a tal individuo. Una cantidad profilacticamente eficaz es una cantidad que impide la aparicion de uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion.

[0115] Una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido TSG-6 o polinucleotido es una cantidad eficaz para 15 mejorar uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion. Preferiblemente, el individuo a tratar es un ser humano.

[0116] El polipeptido TSG-6 o polinucleotido puede administrarse al sujeto mediante cualquier medio adecuado. El polipeptido o polinucleotido puede administrarse por via enteral o parenteral, tal como por via oral, bucal, anal, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intraarticular, topica u otras vias de administracion

20 apropiadas.

[0117] El polipeptido TSG-6 o polinucleotido puede administrarse al sujeto de tal forma que se dirija la terapia a un sitio particular. Por ejemplo, el polipeptido TSG-6 puede inyectarse por via local sobre la superficie del hueso. El polipeptido TSG-6 puede conjugarse con reactivos que se unen al hueso o los osteoclastos especificamente. Para

25 los polinucleotidos TSG-6, pueden usarse vectores de expresion que codifican el polipeptido TSG-6 para dirigir la expresion de TSG-6 a un tejido particular, por ejemplo usando promotores especificos de tejidos o ARNi.

[0118] La formulacion de cualquiera de los polipeptidos y polinucleotidos mencionados en este documento dependera de factores tales como la naturaleza del polipeptido o el polinucleotido y la afeccion a tratar. El

30 polipeptido o polinucleotido puede administrarse en una diversidad de formas de dosificacion. Puede administrarse por via oral (por ejemplo, comprimidos, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o granulos), por via parenteral, subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, transdermica o por tecnicas de infusion. El polipeptido o polinucleotido tambien puede administrarse en forma de supositorios. Un especialista podra determinar la via de administracion requerida para cada paciente particular.

35 [0119] Tipicamente, el polipeptido o polinucleotido se formula para su uso con un vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable, y puede realizarse usando procedimientos rutinarios en la tecnica farmaceutica. El vehiculo o diluyente farmaceutico puede ser, por ejemplo, una solucion isotonica. Por ejemplo, las formas orales solidas pueden contener, junto con el ingrediente activo, diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidon de maiz o almidon de patata; lubricantes, por ejemplo, silice, talco, acido estearico, estearato magnesico o calcico, y/o polietilenglicoles; agentes aglutinantes; por ejemplo, almidones, gomas arabigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinilpirrolidona; agentes disgregantes, por ejemplo, almidon, acido alginico, alginatos o glicolato sodico de almidon; mezclas efervescentes; pigmentos; edulcorante; agentes humectantes, tales como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; y, en general, sustancias no toxicas y farmacologicamente inactivas usadas en formulaciones farmaceuticas. Dichas preparaciones pueden fabricarse de una manera conocida, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, granulado, compresion, revestimiento con azucar o revestimiento con pelicula.

[0120] Las dispersiones liquidas para administracion oral pueden ser jarabes, emulsiones y suspensiones. Los jarabes pueden contener como vehiculos, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con glicerina y/o manitol y/o sorbitol.

[0121] Las suspensiones y emulsiones pueden contener como vehiculo, por ejemplo, una goma natural, agar, alginato sodico, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o alcohol polivinilico. Las suspensiones o soluciones para inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el ingrediente activo, una vehiculo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, agua esteril, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles, por ejemplo, propilenglicol y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaina.

[0122] Las soluciones para administracion intravenosa o infusiones pueden contener como vehiculo, por ejemplo, agua esteril o, preferiblemente, pueden estar en forma de soluciones esteriles, acuosas, salinas isotonicas.

[0123] Para los supositorios, los aglutinantes y vehiculos convencionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente del 1% al 2%.

[0124] Las formulaciones orales incluyen tales excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, formulaciones de liberacion sostenida o polvos y contienen del 10% al 95% de ingrediente activo, preferiblemente del 25% al 70%. Cuando la composicion farmaceutica se liofiliza, el material liofilizado puede reconstituirse antes de la administracion, por ejemplo, una suspension. La reconstitucion se realiza preferiblemente en un tampon.

[0125] Las capsulas, comprimidos y pildoras para administracion oral a un paciente pueden proporcionarse con un revestimiento enterico que comprende, por ejemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa o hidroxipropilmetil celulosa.

[0126] Tambien pueden usarse composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion por inyeccion sin aguja, por ejemplo, por via transdermica.

[0127] Se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de polipeptido o polinucleotido. La dosis puede determinarse de acuerdo con diversos parametros, especialmente de acuerdo con el polipeptido o polinucleotido usado; la edad, el peso y la condicion del paciente que se va a tratar; la ruta de administracion; y el regimen requerido. De nuevo, un especialista podra determinar la ruta de administracion requerida y la dosificacion para cualquier paciente particular. Una dosis diaria tipica es de aproximadamente 0,1 a 50 mg por kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, de acuerdo con la actividad del inhibidor especifico, la edad y las condiciones del sujeto que se va a tratar, el tipo y gravedad de la enfermedad y la frecuencia y ruta de administracion. Preferiblemente, los niveles de dosificacion diarios son de 5 mg a 2 g.

[0128] Las secuencias nucleotidicas TSG-6 que se han descrito anteriormente y los vectores de expresion que contienen dichas secuencias tambien pueden usarse como formulaciones farmaceuticas como se ha representado anteriormente. Preferiblemente, el acido nucleico, tal como ARN o ADN, en particular ADN, se proporciona en forma de un vector de expresion, que puede expresarse en las celulas del individuo que se va a tratar. Las vacunas pueden comprender secuencias nucleotidicas al desnudo o estar en combinacion con lipidos cationicos, polimeros o sistemas de direccion. Las vacunas pueden administrarse mediante cualquier tecnica disponible. Por ejemplo, el acido nucleico puede introducirse por inyeccion con aguja, preferiblemente por via intradermica, por via subcutanea

o por via intramuscular. Como alternativa, el acido nucleico puede administrarse directamente a traves de la piel usando un dispositivo de administracion de acido nucleico, tal como una entrega del gen mediada por particulas. El acido nucleico puede administrarse por via topica a la piel, o a las superficies mucosales, por ejemplo, mediante administracion intranasal, oral, intravaginal o intra-rectal.

[0129] La captacion de construcciones de acido nucleico puede mejorarse mediante varias tecnicas de transfeccion conocidas, por ejemplo las que incluyen el uso de agentes de transfeccion. Los ejemplos de estos agentes incluyen agentes cationicos, por ejemplo, fosfato calcico y DEAE-Dextrano y lipofectantes, por ejemplo, lipofectam y transfectam. La dosificacion del acido nucleico que se va a administrar puede alterarse. Tipicamente, el acido nucleico se administra en el intervalo de 1 pg a 1 mg, preferiblemente de 1 pg a 10 !g de acido nucleico por administracion del gen mediada por particulas y de 10 !g a 1 mg para otras rutas.

[0130] Tambien se describe en este documento un procedimiento de tratamiento, ex vivo, de sangre tomada de un paciente que padece una enfermedad o afeccion asociada con la resorcion osea por osteoclastos que comprende poner en contacto la sangre con un polipeptido TSG-6. Por lo tanto, TSG-6 puede usarse para un tratamiento extracorporeo de sangre. La TSG-6 puede usarse para tratar uno o mas componentes de la sangre, tales como plasma o suero. El procedimiento ex vivo que se describe en este documento puede practicarse en sangre que ya se ha extraido del cuerpo de un paciente. La sangre o el producto de sangre puede devolverse opcionalmente al paciente despues de estar en contacto con un polipeptido TSG-6.

Terapia de combinacion

[0131] El polipeptido TSG-6 o polinucleotido puede administrarse solo o en combinacion con otros agentes farmaceuticamente activos. En una realizacion, el polipeptido TSG-6 o polinucleotido no se administra en combinacion con pentraxina larga 3 (PTX3). En la misma realizacion, el medicamento fabricado de acuerdo con la invencion no comprende PTX3.

[0132] En una realizacion preferida, el procedimiento comprende adicionalmente administrar al sujeto una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG. En la misma realizacion, el medicamento se administra en combinacion con una cantidad terapeutica

o profilacticamente eficaz de un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG.

[0133] El TSG-6 y el OPG actuan sinergicamente. En otras palabras, la administracion de TSG-6 y OPG en combinacion tiene un mayor efecto en la inhibicion de la resorcion osea por osteoclastos que la suma del efecto de cada uno en solitario.

[0134] A cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido OPG, polinucleotido o un mimetico OPG es una cantidad eficaz para mejorar uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion. Una cantidad profilacticamente eficaz es una cantidad que impide la aparicion de uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion.

[0135] El TSG-6 y el OPG pueden administrarse simultaneamente, por separado o secuencialmente. Si se administran simultaneamente, el TSG-6 y el OPG pueden estar presentes en el mismo medicamento o en diferentes medicamentos. Si se administran por separado o secuencialmente, el TSG-6 y el OPG pueden administrarse en cualquier orden.

[0136] Tipicamente, un polipeptido TSG-6 y un polipeptido OPG se administran juntos, o un polinucleotido TSG-6 y un polinucleotido OPG se administran juntos. Sin embargo, en algunas realizaciones, el TSG-6 puede ser un polipeptido, mientras que el OPG es un polinucleotido, y viceversa.

[0137] El polipeptido OPG, el polinucleotido OPG o el mimetico OPG pueden administrarse al sujeto por cualquier medio, en cualquier formulacion y a cualquier dosis que se ha analizado anteriormente para TSG-6.

[0138] Los siguientes Ejemplos ilustran la invencion:

Ejemplos

[0139] Los siguientes estudios muestran que TSG-6 es un inhibidor novedoso de la resorcion osea.

Ejemplo 1 - Inhibici6n de osteoclastos por TSG-6

[0140] El alotipo Q144 de la proteina TSG-6 humana de longitud completa (como se muestra en la SEQ ID NO: 1) se expreso en celulas S2 de Drosophila como se describe en Nentwich y col. (2002) J. Biol. Chem. 277, 1535415362. Se determino el efecto de esta proteina recombinante sobre la diferenciacion de osteoclastos in vitro. Se diferenciaron monocitos humanos en osteoclastos y se desarrollo un fenotipo de resorcion osea durante un periodo de 21 dias. La actividad osteoclastica se midio determinando el alcance de la resorcion lacunar sobre laminas de dentina. Se cultivaron monocitos humanos en presencia de sRANKL (receptor activador soluble del ligando NFKB; 30 ng/ml) y/o M-CSF (25 ng/ml) y la actividad resortiva osea se midio en presencia o ausencia de TSG-6 recombinante. La adicion de TSG-6 a este sistema de cultivo medio una reduccion sustancial en la erosion de la dentina (figura 1), y este efecto es dependiente de la dosis (figura 2). Por lo tanto, TSG-6 inhibe la resorcion osea por osteoclastos.

Ejemplo 2 - Actividad osteoclastica en ratones con genes inactivados de TSG-6

[0141] Tambien se realizo el mismo experimento que en el Ejemplo 1 usando precursores de osteoclastos de huesos largos de ratones TSG-6-1--. Cuando se cultivaron en presencia de sRANKL o M-CSF y sRANKL, los osteoclastos mostraron un marcado aumento de la resorcion lacunar in vitro en comparacion con las celulas procedentes de animales de control no manipulados (figura 3). Estos resultados son coherentes con los sintomas mas graves (por ejemplo, la erosion osea) observados en animales con deficiencia de TSG-6 tras la induccion de PGIA. Estos estudios indican que TSG-6 es un inhibidor novedoso e importante de la osteoclastogenesis y/o la activacion de osteoclastos.

Ejemplo 3 - Uni6n de TSG-6 a RANKL

[0142] RANKL y su receptor RANK son reguladores clave de la remodelacion osea y se han implicado especificamente en la perdida osea que tiene lugar en la AR. RANKL es un ligando de la superfamilia de TNF unido a membrana que se produce por los osteoblastos y otras celulas estromales, mientras que RANK, una molecula de senalizacion transmembrana, se expresa sobre las superficies de los precursores de los osteoclastos mononucleares. RANKL se une a RANK, en respuesta a factores calciotropicos, tales como PGE2, IL-1 y TNF, donde esta interaccion no solo induce la diferenciacion osteoclastica, sino que tambien estimula la actividad resortiva osea de osteoclastos maduros (revisado en Tanake y col. (2005) Immunol. Rev. 208, 30-49). De hecho, RANKL (en combinacion con M-CSF), es el factor principal que regula la diferenciacion osteoclastica (Quinn y col. (1998) Endocrinology 139, 4424-4427).

[0143] En el presente, la osteoprotegerina (OPG), un receptor senuelo soluble para RANKL, es el unico inhibidor de la interaccion RANKL/RANK que puede inhibir de forma eficaz la maduracion y la activacion osteoclastica in vitro (Simonet y col. (1997) Cell 89, 309-319), y un imitador de la actividad OPG (AMG 162) esta actualmente en ensayos clinicos para el tratamiento de la osteoporosis.

[0144] RANKL tambien se expresa sobre las superficies de los linfocitos T efectores sinoviales de pacientes con AR y estudios en ratas con AIA (que tiene muchas caracteristicas en comun con la AR humana) mostraron que RANKL era el mediador clave del dano articular y la erosion osea debido a la acumulacion de osteoclastos, donde el tratamiento con OPG proporciono proteccion frente a estos efectos (Kong y col. (1999) Nature 402, 304-309).

[0145] Dados los efectos de TSG-6 en la resorcion osea que se han descrito en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, se investigo la interaccion de TSG-6 directamente con RANKL. El TSG-6 recombinante de longitud completa se expreso como se ha descrito en el Ejemplo 1. El dominio del modulo Link aislado (Link TSG-6; SEQ ID NO: 9) se expreso en

E. coli como se describe en Day y col. (1996) Protein Express. Purif. 8, 1-16. El dominio CUB C (CUB C TSG6; SEQ ID NO: 13) se expreso en E. coli (DJ Mahoney y AJ Day, no publicado). TSG-6 de longitud completa, Link TSG6 o CUB C TSG6 se cubrieron en placas de microtitulacion a un intervalo de concentraciones y la union de sRANKL (5 pmol/pocillo) se determino usando un anticuerpo especifico de RANKL.

[0146] Los resultados de los ensayos de union en placas indican que TSG-6 de longitud completa, si dominio del modulo Link aislado (Link TSG6; SEQ ID NO: 9) y el dominio CUB C aislado (CUB C TSG6; SEQ ID NO: 13) se unen a sRANKL, pero que el TSG-6 de longitud completa tiene una afinidad de union mayor que los dominios aislados (figura 4). Estos datos sugieren que TSG-6 puede inhibir la osteoclastogenesis inducida por RANKL/activacion osteoclastica mediante su union directa a RANKL, potencialmente de una manera similar a OPG.

Ejemplo 4 - Sinergia entre TSG-6 v OPG

[0147] Los datos (no mostrados) indican que TSG-6 en combinacion con OPG (un inhibidor conocido de RANKL) tiene un efecto sinergico sobre la inhibicion de la formacion osteoclastica segun se determina por el numero de osteoclastos multinucleados con fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP+) formados en el cultivo (es decir, hay mas inhibicion de la formacion osteoclastica en presencia tanto de TSG-6 como de OPG en comparacion con los experimentos en los que estan presentes las proteinas individuales). Un posible mecanismo que podria explicar la accion sinergica de TSG-6 y OPG es que estas dos proteinas pueden unirse simultaneamente a RANKL formando un complejo ternario estable.

Ejemplo 5 - Los dominios Link v CUB C de TSG-6 inhiben la osteoclastogenesis

[0148] Ademas, los datos (no mostrados) tambien muestran que los dominios Link y CUB C aislados son inhibidores de la osteoclastogenesis, aunque con menos actividad que la proteina de longitud completa. Esto indica que estos fragmentos de TSG-6 pueden usarse como la base para el diseno de inhibidores de la resorcion osea.

Ejemplo 6 - Niveles de TSG-6 v OPG en el liguido sinovial.

[0149] Se han medido altos niveles de TSG-6 (que varian de 0-200 ng/ml) en el liquido sinovial de pacientes con diversos trastornos oseos [por ejemplo, osteoartritis (OA), artritis reumatoide (AR), artropatia por gota y pirofosfato (PPA); vease la figura 5). Los analisis ELISA de los niveles de TSG-6 y OPG en muestras sinoviales de OA han mostrado que hay mas variacion de paciente a paciente en los niveles de proteina TSG-6 en comparacion con OPG (vease la figura 6). Esto sugiere que la ausencia/niveles bajos de TSG-6 podria contribuir a la extension y gravedad de las enfermedades osteoliticas.

LISTA DE SECUENCIAS

[0150]

<110> ISIS INNOVATION LIMITED

<120> TRATAMIENTO

<130> N.97312A

<160> 15

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1440

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (77)..(910)

<400> 1

<210> 2

<213> Homo sapiens

<400> 2 5 <210> 3

<211> 260

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1440

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (77)..(910)

<400> 4

<210> 5

<213> Homo sapiens

<400> 5 5 <210> 6

<211> 260

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 6 5

<210> 7

<211> 93

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 7 <210> 8

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Link TSG-6 10

<220>

<221> CDS

<222> (14)..(313)

15 <400> 8 <210> 9

<211> 99

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Link TSG-6

10 <400> 9

<210> 10 15 <211> 149

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10 20 <210> 11

<211>: 149 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211>: 471 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: CUB C TSG6 10

<220>

<221> CDS

<222> (14)..(463)

<210> 13

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: CUB C TSG6 10

15 <400> 12 <400> 13 <210> 14

<211> 1356 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (95)..(1300)

<400> 14

<210> 15

<213> Homo sapiens

<400> 15

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la osteoporosis, en el que el polipeptido TSG-6 o polinucleotido no se administra con pentraxina larga 3 (PTX3).
2.

Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho polipeptido TSG-6 comprende:

(a)

la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2 o 5;

(b)

una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 2 o 5 y el receptor activador de la actividad de union del ligando NFKB (RANKL); o

(c)

un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL.
3.

Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que dicho polipeptido consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2, 5, 9, 10 u 11.
4.

Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho polinucleotido comprende:

(a)

la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12;

(b)

una secuencia que se degenera como resultado del codigo genetico con respecto a la secuencia como se define en (a);

(c)

una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a una secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL; o

(d)

un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a), (b) o (c) que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL.
5.

Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho polinucleotido consiste en la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1, 4, 8 o 12.
6.

Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipeptido TSG-6 o polinucleotido se administra en combinacion con una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un polipeptido de osteoprotegerina (OPG), un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG.
7.

Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el polipeptido OPG:

(a)

comprende, o consiste en, la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 15;

(b)

comprende una variante de la misma que tiene al menos el 50% de identidad con respecto a la secuencia aminoacidica de SEQ ID NO: 15 y que tiene actividad de union a RANKL; o

(c)

comprende un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de union a RANKL.
8. Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el polinucleotido OPG comprende:

(a)

la secuencia codificante de SEQ ID NO: 14;

(b)

una secuencia que se degenera como resultado del codigo genetico con respecto a la secuencia como se define en (a);

(c)

una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a una secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL; o

(d)

un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a), (b) o (c) que codifica un polipeptido que tiene actividad de union a RANKL.

5 9. Un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, y un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG para su uso en un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la osteoporosis.
10. Un polipeptido TSG-6 o polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que (a) el

10 polipeptido TSG-6 o el polinucleotido y (b) el polipeptido, polinucleotido o mimetico OPG se administran simultaneamente, por separado o secuencialmente.
11. Uso de un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6, en la fabricacion

de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de la osteoporosis, en el que el polipeptido TSG-6 o 15 polinucleotido no se administra con pentraxina larga 3 (PTX3).
12. Un producto que contiene:

(a) un polipeptido TSG-6, o un polinucleotido que codifica un polipeptido TSG-6; y 20

(b) un polipeptido OPG, un polinucleotido que codifica un polipeptido OPG o un mimetico OPG;

para su uso simultaneo, separado o secuencial en el tratamiento o prevencion de la osteoporosis.