JP2840443B2 - 血小板産生刺激薬剤のためのｉｌ―７の使用 - Google Patents
血小板産生刺激薬剤のためのｉｌ―７の使用Info
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- JP2840443B2 JP2840443B2 JP2504021A JP50402190A JP2840443B2 JP 2840443 B2 JP2840443 B2 JP 2840443B2 JP 2504021 A JP2504021 A JP 2504021A JP 50402190 A JP50402190 A JP 50402190A JP 2840443 B2 JP2840443 B2 JP 2840443B2
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- JP
- Japan
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- cells
- mammalian
- platelet
- cell
- platelet production
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5418—IL-7
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般的には血液学および血液成長因子の分子
生物学に関するものであり、詳しくは、巨核球分化を誘
導するための薬剤調製にインターロイキン−７を使用す
ることに関するものである。
生物学に関するものであり、詳しくは、巨核球分化を誘
導するための薬剤調製にインターロイキン−７を使用す
ることに関するものである。
巨核球は細胞の血小板の基となるものであり、全ての
造血細胞系列を生じさせる共通骨髄前駆細胞に由来する
ものである。共通前駆細胞は、多能性造血細胞（plurip
otential hematopoietic stem cell,PHSC）として知ら
れており、in vitroでIL−３および腫瘍誘導性ホルボー
ルエステル（例えば、ホルボールミリステートアセテー
ト、PMA）に反応するバースト形成ユニット巨核球（BFU
−MK）を生じ、巨核球（MK）の巨大な多フォーカス性コ
ロニーの発達が誘導される。BFU−MKはMKコロニー形成
細胞（CFU−MK）に分化し、in vitroでIL−３、GM−CS
F,EPO,G−CSF,IL−６、あるいはIL−４に反応してコロ
ニーを形成するが、後ろ４つに関しては議論の余地があ
る。CFU−MKは、マウス中でアセチルコリンエステラー
ゼで染色される形態学的に識別可能な小さなMKを生じる
（SAChE＋細胞）。これらの細胞に増殖能が残っている
かどうかは不明である。SAChE＋細胞は続いて一連の細
胞質性および核性成熟過程（倍数体化）を行い、最終的
にMKを産生する血小板となる。In vivoの結果から、MK
コロニー産生細胞のレベルの増殖過程と血小板産生に至
る成熟過程とは、異なるサイトカインによって独立に制
御されていると考えられている。
造血細胞系列を生じさせる共通骨髄前駆細胞に由来する
ものである。共通前駆細胞は、多能性造血細胞（plurip
otential hematopoietic stem cell,PHSC）として知ら
れており、in vitroでIL−３および腫瘍誘導性ホルボー
ルエステル（例えば、ホルボールミリステートアセテー
ト、PMA）に反応するバースト形成ユニット巨核球（BFU
−MK）を生じ、巨核球（MK）の巨大な多フォーカス性コ
ロニーの発達が誘導される。BFU−MKはMKコロニー形成
細胞（CFU−MK）に分化し、in vitroでIL−３、GM−CS
F,EPO,G−CSF,IL−６、あるいはIL−４に反応してコロ
ニーを形成するが、後ろ４つに関しては議論の余地があ
る。CFU−MKは、マウス中でアセチルコリンエステラー
ゼで染色される形態学的に識別可能な小さなMKを生じる
（SAChE＋細胞）。これらの細胞に増殖能が残っている
かどうかは不明である。SAChE＋細胞は続いて一連の細
胞質性および核性成熟過程（倍数体化）を行い、最終的
にMKを産生する血小板となる。In vivoの結果から、MK
コロニー産生細胞のレベルの増殖過程と血小板産生に至
る成熟過程とは、異なるサイトカインによって独立に制
御されていると考えられている。
巨核球過少性血小板減少症の患者由来の尿、血清およ
び血漿は、in vitroで骨髄単核細胞によってCFU−MKの
産生が促進されることが示されている。カワキタ他、B
r.J.Haematol.,52:429;ホフマン（Hoffman）他、N.Eng
l.J.Med.,305:533（1981）；メスナー（Messner）他、
J.Cell.Physiol.Supp.,1:45（1982）；およびキムラ
他、J.Cell.Physiol.118:87−96等を参照されたい。こ
れらの予想される因子のなかでかなりの程度までに精製
されたものはない。
び血漿は、in vitroで骨髄単核細胞によってCFU−MKの
産生が促進されることが示されている。カワキタ他、B
r.J.Haematol.,52:429;ホフマン（Hoffman）他、N.Eng
l.J.Med.,305:533（1981）；メスナー（Messner）他、
J.Cell.Physiol.Supp.,1:45（1982）；およびキムラ
他、J.Cell.Physiol.118:87−96等を参照されたい。こ
れらの予想される因子のなかでかなりの程度までに精製
されたものはない。
ホフマン他、J.Clin.Invest.75:1174（1985）は巨核
球過少性血小板減少症患者の血清からMeg−CSFと呼ばれ
る巨核球コロニー刺激因子の精製を報告した。硫酸アン
モニウム沈澱、DEAE−セルロースクロマトグラフィー、
レクチンアフィニティークロマトグラフィー、およびRP
−HPLCにより、分子量が約46,000ダルトン（Da）で骨髄
アッセイでCSF−MK分化を刺激する糖タンパク質性物質
が得られた。この物質のクローニングや塩基配列決定は
まだ行われておらず、また、in vivoでは穏やかな効果
しか報告されていない。
球過少性血小板減少症患者の血清からMeg−CSFと呼ばれ
る巨核球コロニー刺激因子の精製を報告した。硫酸アン
モニウム沈澱、DEAE−セルロースクロマトグラフィー、
レクチンアフィニティークロマトグラフィー、およびRP
−HPLCにより、分子量が約46,000ダルトン（Da）で骨髄
アッセイでCSF−MK分化を刺激する糖タンパク質性物質
が得られた。この物質のクローニングや塩基配列決定は
まだ行われておらず、また、in vivoでは穏やかな効果
しか報告されていない。
ローゼンベルグ（Rosenberg），ヨーロッパ特許出願
第260,918号は、ヒト胎児腎臓細胞によって産生され、
巨核球系列細胞の特異的造血素と仮定される“巨核球刺
激因子”を開示している。この参考文献で開示されてい
る精製画分は、部分精製された巨核球画分とラット前巨
核球芽細胞によってタンパク質合成が決定されるアッセ
イにおいて、見かけの分子量が約15,000の“酸性タンパ
ク質”であった。in vivoの研究は報告されておらず、
この因子のクローニングまたは塩基配列決定に関するそ
れ以降の成果に関する文献は発表されていない。
第260,918号は、ヒト胎児腎臓細胞によって産生され、
巨核球系列細胞の特異的造血素と仮定される“巨核球刺
激因子”を開示している。この参考文献で開示されてい
る精製画分は、部分精製された巨核球画分とラット前巨
核球芽細胞によってタンパク質合成が決定されるアッセ
イにおいて、見かけの分子量が約15,000の“酸性タンパ
ク質”であった。in vivoの研究は報告されておらず、
この因子のクローニングまたは塩基配列決定に関するそ
れ以降の成果に関する文献は発表されていない。
インターロイキン−７（IL−７）はまた、リンホポエ
チン−１としても知られ、最初に単離されたリンパ球生
成成長因子であり、骨髄においてＢおよびＴ細胞前駆細
胞の増殖刺激能を利用してクローニングされた。1988年
10月19日に提出されたPCT出願US88/03747および1988年1
0月24日に提出されたヨーロッパ特許出願第88309977.2
号（USSN07/113,556号も参照のこと）は、組み換えDNA
技術によって哺乳類IL−７タンパク質を産生するための
DNA、ベクター、およびそれに関連した過程を開示して
いる。これらの特許出願の関連した開示もここに参考と
して含める。マウスIL−７のクローニングはナーメン
（Namen）他、Nature 333:571（1988）によって、ヒトI
L−７のクローニングはグッドウィン（Goodwin）他、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA（印刷中）によって、最初に報告
された。トランスフォームした骨髄間質細胞系の上清か
らのマウスIL−７の精製から、見かけの分子量が約25,0
00daであることが示唆された。ナーメン他、J.Exp.Med.
167:988（1988）を参照されたい。ナーメンとグッドウ
ィンによって報告されたクローニングされたDNAは、グ
ルコシル化を除いて、マウスおよびヒトIL−７分子の最
小分子量はそれぞれ14,897および17,387ダルトンである
ことを示している。
チン−１としても知られ、最初に単離されたリンパ球生
成成長因子であり、骨髄においてＢおよびＴ細胞前駆細
胞の増殖刺激能を利用してクローニングされた。1988年
10月19日に提出されたPCT出願US88/03747および1988年1
0月24日に提出されたヨーロッパ特許出願第88309977.2
号（USSN07/113,556号も参照のこと）は、組み換えDNA
技術によって哺乳類IL−７タンパク質を産生するための
DNA、ベクター、およびそれに関連した過程を開示して
いる。これらの特許出願の関連した開示もここに参考と
して含める。マウスIL−７のクローニングはナーメン
（Namen）他、Nature 333:571（1988）によって、ヒトI
L−７のクローニングはグッドウィン（Goodwin）他、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA（印刷中）によって、最初に報告
された。トランスフォームした骨髄間質細胞系の上清か
らのマウスIL−７の精製から、見かけの分子量が約25,0
00daであることが示唆された。ナーメン他、J.Exp.Med.
167:988（1988）を参照されたい。ナーメンとグッドウ
ィンによって報告されたクローニングされたDNAは、グ
ルコシル化を除いて、マウスおよびヒトIL−７分子の最
小分子量はそれぞれ14,897および17,387ダルトンである
ことを示している。
これまでに、IL−７はin vivoで血小板産生（血小板
形成）を顕著に刺激する能力を有することが示されてい
る。IL−７のこの性質により、例えば多様な癌の化学療
法や放射線療法の結果として起こった急性血小板減少症
患者の治療において有用な補助を与えるはずである。現
在のところ、このような患者は血小板生成が不可能な状
態にまで循環血小板レベルが下がると、非常に危険な状
態となる。生命を脅かす急性血小板減少症の通常の治療
法は、生成した血小板の反復注入によるものである。
形成）を顕著に刺激する能力を有することが示されてい
る。IL−７のこの性質により、例えば多様な癌の化学療
法や放射線療法の結果として起こった急性血小板減少症
患者の治療において有用な補助を与えるはずである。現
在のところ、このような患者は血小板生成が不可能な状
態にまで循環血小板レベルが下がると、非常に危険な状
態となる。生命を脅かす急性血小板減少症の通常の治療
法は、生成した血小板の反復注入によるものである。
発明の概要 本発明は血小板が必要な哺乳動物において血小板産生
を誘導するための薬剤を供給する際のIL−７の使用に関
するものである。組成物の面では、本発明は血小板産生
の誘導のための組成物を供給し、これは薬剤学的に受容
し得る希釈剤、担体、または賦形剤との混合物中の効果
的な量のIL−７を含むものであり、また本発明は血小板
産生を誘導するための薬剤組成物を調製する際にIL−７
を用いる方法も含むものである。
を誘導するための薬剤を供給する際のIL−７の使用に関
するものである。組成物の面では、本発明は血小板産生
の誘導のための組成物を供給し、これは薬剤学的に受容
し得る希釈剤、担体、または賦形剤との混合物中の効果
的な量のIL−７を含むものであり、また本発明は血小板
産生を誘導するための薬剤組成物を調製する際にIL−７
を用いる方法も含むものである。
図面の簡単な説明 第１図は、正常なマウスにIL−７が投与された場合に
見られる血小板数の増加を示している。
見られる血小板数の増加を示している。
第２図は、照射マウスにIL−７を投与した場合に見ら
れる血小板レベルの回復の促進を示している。第２図に
おいて水平な点線はコントロールの正常マウスにおける
血小板レベルを示す（ｎ＝14）。
れる血小板レベルの回復の促進を示している。第２図に
おいて水平な点線はコントロールの正常マウスにおける
血小板レベルを示す（ｎ＝14）。
発明の望ましい態様の詳細な説明 本発明の方法にしたがって使用するために、例えばIL
−７タンパク質に関する上述の参照特許出願で述べられ
ているような哺乳類細胞系での発現などの、通常の方法
によって産生することが可能である。ヒトおよびマウス
IL−７のアミノ酸配列を表１および表２に示す。
−７タンパク質に関する上述の参照特許出願で述べられ
ているような哺乳類細胞系での発現などの、通常の方法
によって産生することが可能である。ヒトおよびマウス
IL−７のアミノ酸配列を表１および表２に示す。
前述のタンパク質の生物学的に活性のある多様な類似
物質も本発明の方法および組成物に使用可能である。し
たがって、ここで用いる場合に“IL−7"という語は天然
の哺乳類IL−７と実質的に同一のアミノ酸配列および、
例えば標準的バイオアッセイやIL−７レセプター結合ア
フィニティーアッセイにおいて同等の生物活性を有する
タンパク質を意味する。組み換えタンパク質は昆虫細
胞、酵母、細菌、その他の細胞を用いても適当なプロモ
ーターの制御下でも産生されるが、哺乳類IL−７を産生
するには哺乳動物細胞内で発現させる方法が望ましい。
細菌、菌類、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いるの
に適したクローニングおよび発現ベクターは、パウエル
ス（Pouwels）他、Cloning Vectors:A Laboratory Manu
al,（エルセヴィアー、ニューヨーク、1985）に記載さ
れており、その関連した開示をここに参考として含め
る。多様な哺乳動物細胞培養系を組み換えタンパク質の
発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例として
は、グルツマン（Gluzman）、Cell 23:175（1981）に報
告されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS−７系、および
その他の互換性のあるベクターを発現できる細胞系、例
えばC127,3T3,CHO,HeLaおよびBHK細胞系が含まれる。哺
乳類発現ベクターは、複製開始部位、適当なプロモータ
ーおよびエンハンサー、およびその他の５′または３′
隣接非転写配列、および必須のリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライシングのドナーおよびアク
セプター部位、および終結配列などの５′または３′非
翻訳配列を含むことができる。SV40複製開始部位、初期
プロモーター、エンハンサー、スプライシング、および
ポリアデニル化部位などのSV40ウイルスゲノム由来のDN
A配列を、外来性のDNA配列の発現に必要な他の遺伝子要
素を付与するために用いることができる。組み換え哺乳
類IL−７を産生するための哺乳類高発現ベクターの使用
に関する詳細は以下に示す。典型的なベクターは、岡山
とバーグ（Berg）,Mol.Cell.Biol.3:280（1983），コス
マン（Cosman）他、Nature 312:768（1984），コスマン
他、Mol.Immunol.23:935（1986），あるいは、クラーク
（Clark）他、米国特許第4,675,285号で記述されている
ように構築することができる。
物質も本発明の方法および組成物に使用可能である。し
たがって、ここで用いる場合に“IL−7"という語は天然
の哺乳類IL−７と実質的に同一のアミノ酸配列および、
例えば標準的バイオアッセイやIL−７レセプター結合ア
フィニティーアッセイにおいて同等の生物活性を有する
タンパク質を意味する。組み換えタンパク質は昆虫細
胞、酵母、細菌、その他の細胞を用いても適当なプロモ
ーターの制御下でも産生されるが、哺乳類IL−７を産生
するには哺乳動物細胞内で発現させる方法が望ましい。
細菌、菌類、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いるの
に適したクローニングおよび発現ベクターは、パウエル
ス（Pouwels）他、Cloning Vectors:A Laboratory Manu
al,（エルセヴィアー、ニューヨーク、1985）に記載さ
れており、その関連した開示をここに参考として含め
る。多様な哺乳動物細胞培養系を組み換えタンパク質の
発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例として
は、グルツマン（Gluzman）、Cell 23:175（1981）に報
告されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS−７系、および
その他の互換性のあるベクターを発現できる細胞系、例
えばC127,3T3,CHO,HeLaおよびBHK細胞系が含まれる。哺
乳類発現ベクターは、複製開始部位、適当なプロモータ
ーおよびエンハンサー、およびその他の５′または３′
隣接非転写配列、および必須のリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライシングのドナーおよびアク
セプター部位、および終結配列などの５′または３′非
翻訳配列を含むことができる。SV40複製開始部位、初期
プロモーター、エンハンサー、スプライシング、および
ポリアデニル化部位などのSV40ウイルスゲノム由来のDN
A配列を、外来性のDNA配列の発現に必要な他の遺伝子要
素を付与するために用いることができる。組み換え哺乳
類IL−７を産生するための哺乳類高発現ベクターの使用
に関する詳細は以下に示す。典型的なベクターは、岡山
とバーグ（Berg）,Mol.Cell.Biol.3:280（1983），コス
マン（Cosman）他、Nature 312:768（1984），コスマン
他、Mol.Immunol.23:935（1986），あるいは、クラーク
（Clark）他、米国特許第4,675,285号で記述されている
ように構築することができる。
発現ベクターは、成熟タンパク質のＮ末端残基をコー
ドするコドンに近接した部位でcDNAクローンを切断する
ことによって容易に構築される。例えば、マウスcDNAは
Nde IまたはCla Iで、ヒトcDNAはCla Iで切断して実質
的に全コード領域を含む断片を生成することができる。
そして、合成オリゴヌクレオチドを用いて、コード領域
の欠失した部分を“再付加”し、発現ベクター中の適当
な読み枠でコード領域の連結のための連結配列を与え、
さらに任意に開始メチオニンを特定するコドンを付加す
ることもできる。
ドするコドンに近接した部位でcDNAクローンを切断する
ことによって容易に構築される。例えば、マウスcDNAは
Nde IまたはCla Iで、ヒトcDNAはCla Iで切断して実質
的に全コード領域を含む断片を生成することができる。
そして、合成オリゴヌクレオチドを用いて、コード領域
の欠失した部分を“再付加”し、発現ベクター中の適当
な読み枠でコード領域の連結のための連結配列を与え、
さらに任意に開始メチオニンを特定するコドンを付加す
ることもできる。
ヒトIL−７の他の哺乳動物細胞発現系は、選択マーカ
ーを含む安定な哺乳動物発現ベクターにIL−７構造を挿
入し、それをハムスター乳児腎臓細胞（BHK）に導入す
ることによって作成される。発現ベクターは以下のよう
に構築される。Sma I−Hinc II cDNA断片を、PCT出願US
88/03747号およびヨーロッパ特許出願第88309977.2号
（上述）に記載されているプラスミドpDC201/hIL−2R/h
IL−７から切り出し、マウス メタロチオネイン プロ
モーター（MT−１）に付加されたSV40複製開始部位とウ
イルスエンハンサー配列を含む哺乳動物発現ベクターpN
PV1の修復された（クレノーポリメラーゼによる）BamH
I部位にクローニングする。このバイブリッドプロモー
ターは多数の哺乳動物細胞型において高レベルの安定
な、構造的発現を示す。pNPV1はまた、このプラスミド
を含有する哺乳動物細胞のメトトレキセート選択を可能
にする正常なジヒドロ葉酸リダクテース（DHFR）DNA配
列を含む。このような細胞におけるDHFR配列増幅現象
は、メトトレキセート濃度の上昇によって選択可能であ
る。このようにして、近接したDNA配列も一般的に増幅
し、発現の増強を行うことができる。
ーを含む安定な哺乳動物発現ベクターにIL−７構造を挿
入し、それをハムスター乳児腎臓細胞（BHK）に導入す
ることによって作成される。発現ベクターは以下のよう
に構築される。Sma I−Hinc II cDNA断片を、PCT出願US
88/03747号およびヨーロッパ特許出願第88309977.2号
（上述）に記載されているプラスミドpDC201/hIL−2R/h
IL−７から切り出し、マウス メタロチオネイン プロ
モーター（MT−１）に付加されたSV40複製開始部位とウ
イルスエンハンサー配列を含む哺乳動物発現ベクターpN
PV1の修復された（クレノーポリメラーゼによる）BamH
I部位にクローニングする。このバイブリッドプロモー
ターは多数の哺乳動物細胞型において高レベルの安定
な、構造的発現を示す。pNPV1はまた、このプラスミド
を含有する哺乳動物細胞のメトトレキセート選択を可能
にする正常なジヒドロ葉酸リダクテース（DHFR）DNA配
列を含む。このような細胞におけるDHFR配列増幅現象
は、メトトレキセート濃度の上昇によって選択可能であ
る。このようにして、近接したDNA配列も一般的に増幅
し、発現の増強を行うことができる。
選択と発現は、ウェヒター（Waechter）他、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 79:1106（1982）およびタラベラ（Tala
vera）他、J.Cell Physiol.92:425（1977）によって報
告されている接着性BHKtk−ts 13細胞（ATCC CRL 163
2）を用いて行われる。これらの細胞は、高マンノース
および複合オリゴ糖タンパク質修飾の双方が可能であ
る。Sal Iによる発現ベクターの直鎖状化の後、DNAを30
0ボルト、960マイクロファラッドでのエレクトロポレー
ションによってBHK細胞に導入する。適当なエレクトロ
ポレーション法は、アウスベル（Ausbel）他編集、Curr
ent Protocols in Molecular Biology（ウィリー−イン
ターサイエンス、メディア、PA,USA）の9.3.1に記載さ
れている。48時間後、１マイクロモルのメトトレキセー
トを培地に加え、耐性のコロニーを２週間後に選択す
る。典型的なクローンに対して、培養液の上清画分への
hIL−７の分泌に関してバイオアッセイを行う。最も高
い発現を示したクローンに関して、10、20、および50マ
イクロモルのメトトレキセートを用いてさらに選択を行
った。耐性のコロニーをさらに解析して高発現レベルの
クローンを単離する。この方法を用いて選択したBHK細
胞系は接着性細胞であり、ビーズを用いた懸濁液培養ま
たはホローファイバー技術を用いたバイオリアクターで
の培養を用いて大規模合成を行わせることができる。BH
K細胞は懸濁細胞としての培養に容易に適合させること
ができる。
l.Acad.Sci.USA 79:1106（1982）およびタラベラ（Tala
vera）他、J.Cell Physiol.92:425（1977）によって報
告されている接着性BHKtk−ts 13細胞（ATCC CRL 163
2）を用いて行われる。これらの細胞は、高マンノース
および複合オリゴ糖タンパク質修飾の双方が可能であ
る。Sal Iによる発現ベクターの直鎖状化の後、DNAを30
0ボルト、960マイクロファラッドでのエレクトロポレー
ションによってBHK細胞に導入する。適当なエレクトロ
ポレーション法は、アウスベル（Ausbel）他編集、Curr
ent Protocols in Molecular Biology（ウィリー−イン
ターサイエンス、メディア、PA,USA）の9.3.1に記載さ
れている。48時間後、１マイクロモルのメトトレキセー
トを培地に加え、耐性のコロニーを２週間後に選択す
る。典型的なクローンに対して、培養液の上清画分への
hIL−７の分泌に関してバイオアッセイを行う。最も高
い発現を示したクローンに関して、10、20、および50マ
イクロモルのメトトレキセートを用いてさらに選択を行
った。耐性のコロニーをさらに解析して高発現レベルの
クローンを単離する。この方法を用いて選択したBHK細
胞系は接着性細胞であり、ビーズを用いた懸濁液培養ま
たはホローファイバー技術を用いたバイオリアクターで
の培養を用いて大規模合成を行わせることができる。BH
K細胞は懸濁細胞としての培養に容易に適合させること
ができる。
投与のためのIL−７は細胞培養液上清から以下のよう
にして精製することができる。上清は、市販のタンパク
質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon;登録商
標）（W.R.グレース社、ダンバース、MA,USA）やペリコ
ン（Pellicon;登録商標）（ミリポア社、ベッドフォー
ド,MA,USA）限外濾過ユニットを用いて濃縮する。濃縮
過程に続いて、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）基
が付加しているマトリックスまたは基剤などの、適当な
陰イオン交換樹脂に濃縮液をとおす。マトリックスは、
アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロー
ス、あるいはその他のタンパク質精製に通常用いられて
いるものを使用することができる。望ましいマトリック
スはDEAEセファセル（登録商標；ファルマシア社）であ
る。DEAE基を含むマトリックスを用いる場合には、IL−
７を含む抽出液を弱い塩基性pH（pH8など）とし、塩化
ナトリウム濃度（あるいは他の適当な塩）を約100mMと
する。多くの混在しているタンパク質はイオン交換樹脂
に結合するが、IL−７は非結合画分として回収される。
陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて、陽イオン交
換過程を行う。この過程では、IL−７を含む画分を弱
酸、低イオン濃度（例えばpH5,100mM NaCl）で陽イオン
交換樹脂にかける。IL−７は交換樹脂に結合し、高塩濃
度および弱塩基性pHにおいて、より高度に精製された形
で溶出される。適当な陽イオン交換樹脂には、スルフォ
プロピル基またはカルボキシメチル基を含む多様な不溶
性マトリックスが含まれる。スルフォプロピル基を用い
るのが望ましい。IL−７精製に有用なものは、SP−トリ
スアクリル（登録商法；ファルマシア−LKB）である。
陽イオン交換クロマトグラフィーに続いて、ブルーダイ
リガンドを有するマトリックスを用いるアフィニティー
精製過程を行うのが有効であることが示されている。適
当なダイリガンドは、ブルーＢであり、これはアガロー
スとの複合体として入手できる（ブルーＢアガロー
ス）。その他の同等のダイリガンドも使用可能である。
最後に、疎水性RP−HPLC物質、例えばメチル基などの疎
水性基を付加しているシリカゲルなどを用いて、１回以
上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）過
程を行い、さらにIL−７組成物を精製することができ
る。上記の精製過程のいくつかまたは全てを、さまざま
な組み合わせで行い、薬剤処方に適した均一な組み換え
タンパク質を与えることも可能である。
にして精製することができる。上清は、市販のタンパク
質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon;登録商
標）（W.R.グレース社、ダンバース、MA,USA）やペリコ
ン（Pellicon;登録商標）（ミリポア社、ベッドフォー
ド,MA,USA）限外濾過ユニットを用いて濃縮する。濃縮
過程に続いて、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）基
が付加しているマトリックスまたは基剤などの、適当な
陰イオン交換樹脂に濃縮液をとおす。マトリックスは、
アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロー
ス、あるいはその他のタンパク質精製に通常用いられて
いるものを使用することができる。望ましいマトリック
スはDEAEセファセル（登録商標；ファルマシア社）であ
る。DEAE基を含むマトリックスを用いる場合には、IL−
７を含む抽出液を弱い塩基性pH（pH8など）とし、塩化
ナトリウム濃度（あるいは他の適当な塩）を約100mMと
する。多くの混在しているタンパク質はイオン交換樹脂
に結合するが、IL−７は非結合画分として回収される。
陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて、陽イオン交
換過程を行う。この過程では、IL−７を含む画分を弱
酸、低イオン濃度（例えばpH5,100mM NaCl）で陽イオン
交換樹脂にかける。IL−７は交換樹脂に結合し、高塩濃
度および弱塩基性pHにおいて、より高度に精製された形
で溶出される。適当な陽イオン交換樹脂には、スルフォ
プロピル基またはカルボキシメチル基を含む多様な不溶
性マトリックスが含まれる。スルフォプロピル基を用い
るのが望ましい。IL−７精製に有用なものは、SP−トリ
スアクリル（登録商法；ファルマシア−LKB）である。
陽イオン交換クロマトグラフィーに続いて、ブルーダイ
リガンドを有するマトリックスを用いるアフィニティー
精製過程を行うのが有効であることが示されている。適
当なダイリガンドは、ブルーＢであり、これはアガロー
スとの複合体として入手できる（ブルーＢアガロー
ス）。その他の同等のダイリガンドも使用可能である。
最後に、疎水性RP−HPLC物質、例えばメチル基などの疎
水性基を付加しているシリカゲルなどを用いて、１回以
上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）過
程を行い、さらにIL−７組成物を精製することができ
る。上記の精製過程のいくつかまたは全てを、さまざま
な組み合わせで行い、薬剤処方に適した均一な組み換え
タンパク質を与えることも可能である。
組成物と使用法の面において、本発明は、効果的な量
の本発明の哺乳類IL−７タンパク質のいずれかおよび適
当な希釈剤あるいは担体を含む治療用組成物、および効
果的な量の上述の組成物のいずれかを投与することを含
む、ヒトを含む哺乳動物の巨核球分化を刺激する方法ま
たは、血小板産生を修飾あるいは増大させる方法を与え
るものである。他のリンホカイン、例えば、IL−1a,IL
−1b,IL−2,IL−3,IL−4,IL−5,IL−6,CSF−1,GM−CSF,
G−CSF,EPO,IFN−a,IFN−b,またはIFN−ｇとの同時使用
または混合物での使用も予想される。
の本発明の哺乳類IL−７タンパク質のいずれかおよび適
当な希釈剤あるいは担体を含む治療用組成物、および効
果的な量の上述の組成物のいずれかを投与することを含
む、ヒトを含む哺乳動物の巨核球分化を刺激する方法ま
たは、血小板産生を修飾あるいは増大させる方法を与え
るものである。他のリンホカイン、例えば、IL−1a,IL
−1b,IL−2,IL−3,IL−4,IL−5,IL−6,CSF−1,GM−CSF,
G−CSF,EPO,IFN−a,IFN−b,またはIFN−ｇとの同時使用
または混合物での使用も予想される。
治療用に用いる場合には、指示に適した方法で哺乳動
物の治療のために精製したIL−７を投与する。したがっ
て、例えば、血小板産生または機能の刺激剤として投与
される哺乳動物IL−７組成物は、ボーラス注射（bolus
injection）、連続的注入、移植片からの持続的放出、
またはその他の適当な技術によって与えることができ
る。典型的にはIL−７治療用組成物は、病理学的に受容
できる担体、賦形剤または希釈剤との混合物で精製タン
パク質を含む組成物の形で投与される。中性緩衝化生理
食塩水または同種の血清アルブミンと混合した生理食塩
水は典型的に好適な希釈剤である。望ましくは、産生物
は好適な賦形剤溶液（例えばサッカロース）を希釈剤と
して用いた凍結乾燥物として調製される。適当な投与量
は試行で決定される；一般に、10ngから100μg/kg/日、
望ましくは100ngから１μg/kg/日で１−20日間の投与
が、生物学的効果を誘導すると期待される。例えば、血
小板産生の刺激剤として１μg/kgのボーラス注射を４日
ごとにすることができる。
物の治療のために精製したIL−７を投与する。したがっ
て、例えば、血小板産生または機能の刺激剤として投与
される哺乳動物IL−７組成物は、ボーラス注射（bolus
injection）、連続的注入、移植片からの持続的放出、
またはその他の適当な技術によって与えることができ
る。典型的にはIL−７治療用組成物は、病理学的に受容
できる担体、賦形剤または希釈剤との混合物で精製タン
パク質を含む組成物の形で投与される。中性緩衝化生理
食塩水または同種の血清アルブミンと混合した生理食塩
水は典型的に好適な希釈剤である。望ましくは、産生物
は好適な賦形剤溶液（例えばサッカロース）を希釈剤と
して用いた凍結乾燥物として調製される。適当な投与量
は試行で決定される；一般に、10ngから100μg/kg/日、
望ましくは100ngから１μg/kg/日で１−20日間の投与
が、生物学的効果を誘導すると期待される。例えば、血
小板産生の刺激剤として１μg/kgのボーラス注射を４日
ごとにすることができる。
以下の実施例は本発明の方法と組成物の使用を例示す
るものである。
るものである。
実施例1:IL−７によるMK成熟の誘導 EST−IUと呼ばれるヒト骨髄細胞系が急性リンパ性白
血病と縦隔生殖細胞腫瘍患者から誘導された。患者の骨
髄が肺繊維芽細胞フィーダー層上の培養液中に置かれ、
最終的にフィーダー細胞から離脱された。細胞を各細胞
継代時に液体窒素で凍結させ、このような各継代の子孫
を以下の実験に用いた。細胞は多倍数性を含む、ヒトMK
と一致する表現形質を示す。PMAで細胞を処理すること
で、より高い倍数性となり、血小板を産生するMK表現形
質への成熟と一致する血小板関連抗原の発現が促進され
る。
血病と縦隔生殖細胞腫瘍患者から誘導された。患者の骨
髄が肺繊維芽細胞フィーダー層上の培養液中に置かれ、
最終的にフィーダー細胞から離脱された。細胞を各細胞
継代時に液体窒素で凍結させ、このような各継代の子孫
を以下の実験に用いた。細胞は多倍数性を含む、ヒトMK
と一致する表現形質を示す。PMAで細胞を処理すること
で、より高い倍数性となり、血小板を産生するMK表現形
質への成熟と一致する血小板関連抗原の発現が促進され
る。
IL−７効果を評価するために、培地のみ、５×10-8M
PMA、あるいは3000U/ml（プレＢ細胞増殖アッセイ）の
精製マウスIL−７を含む液体培地で３日間培養したEST
−IU細胞を準備した。用いた培地は10％V/Vウシ胎児血
清を添加したRPMI 1640である。細胞を1mlの培地に２×
105細胞の濃度で懸濁した。３日後、細胞を回収し、洗
浄して飽和濃度のマウス抗ヒト血小板糖タンパク質Ib
（GpIb）と反応させ、つづいてヤギ抗マウスフルオレセ
インイソチオシアネート（FITC）結合抗IgG（Fab断片）
と反応させた。完全に洗浄した後、細胞をフローサイト
メトリーで解析した。GpIbは比較的成熟したMK細胞では
発現しているが、MKとして認識される最も初期の細胞で
は存在しない。結果から、期待された通り、PMA処理後
はGpIbの発現が培地コントロール細胞中の21％から67％
陽性に誘導されたことがわかった。IL−７処理細胞はGp
Ib発現が61％陽性まで誘導された。
PMA、あるいは3000U/ml（プレＢ細胞増殖アッセイ）の
精製マウスIL−７を含む液体培地で３日間培養したEST
−IU細胞を準備した。用いた培地は10％V/Vウシ胎児血
清を添加したRPMI 1640である。細胞を1mlの培地に２×
105細胞の濃度で懸濁した。３日後、細胞を回収し、洗
浄して飽和濃度のマウス抗ヒト血小板糖タンパク質Ib
（GpIb）と反応させ、つづいてヤギ抗マウスフルオレセ
インイソチオシアネート（FITC）結合抗IgG（Fab断片）
と反応させた。完全に洗浄した後、細胞をフローサイト
メトリーで解析した。GpIbは比較的成熟したMK細胞では
発現しているが、MKとして認識される最も初期の細胞で
は存在しない。結果から、期待された通り、PMA処理後
はGpIbの発現が培地コントロール細胞中の21％から67％
陽性に誘導されたことがわかった。IL−７処理細胞はGp
Ib発現が61％陽性まで誘導された。
実施例2:正常マウス中の循環血小板へのIL−７の効果 正常なC57B1/6マウスに１日に２回、20ng若しくは100
ngのIL−７を、または、コントロールとしてマウス血清
アルブミン（MSA）を５日間注射した。治療開始後１か
ら４日の心臓血の血小板数を顕微鏡で、ウノペット（Un
opette;登録商標）システムで決定した。循環血小板数
は、治療後１日のMSA処理したコントロールよりもIL−
７処理したマウス（１グループあたり４−５匹）の方が
顕著に（ｐ＝0.001）多く、４日目には正常レベルに戻
った。結果は第１図に模式的に示してある。
ngのIL−７を、または、コントロールとしてマウス血清
アルブミン（MSA）を５日間注射した。治療開始後１か
ら４日の心臓血の血小板数を顕微鏡で、ウノペット（Un
opette;登録商標）システムで決定した。循環血小板数
は、治療後１日のMSA処理したコントロールよりもIL−
７処理したマウス（１グループあたり４−５匹）の方が
顕著に（ｐ＝0.001）多く、４日目には正常レベルに戻
った。結果は第１図に模式的に示してある。
実施例3:準致死的に照射したマウスへのIL−７の効果 正常なC57B1/6マウスを０日目に137Cs源を用いて750r
adのレベルまで照射し、毎日1mgのIL−７またはMSAを注
射した（２×500ngを注射）。次に、心臓血または後眼
窩血の血小板数をMSAコントロール、IL−７処理、およ
び非照射コントロール群に関して決定し、このとき処理
群あたり４−10マウスおよびヒト照射コントロール群に
関しては14マウスを調べた。結果は第２図に示してあ
り、IL−７は照射誘導性の急性血小板減少症の発病を遅
らせ、11日目の最低レベルから血小板レベルの回復を促
進することが示唆された。IL−７およびMSA処理群間の
平均血小板数は、８日目と11日目を除いた全ての日に統
計学的に顕著に異なっていた。
adのレベルまで照射し、毎日1mgのIL−７またはMSAを注
射した（２×500ngを注射）。次に、心臓血または後眼
窩血の血小板数をMSAコントロール、IL−７処理、およ
び非照射コントロール群に関して決定し、このとき処理
群あたり４−10マウスおよびヒト照射コントロール群に
関しては14マウスを調べた。結果は第２図に示してあ
り、IL−７は照射誘導性の急性血小板減少症の発病を遅
らせ、11日目の最低レベルから血小板レベルの回復を促
進することが示唆された。IL−７およびMSA処理群間の
平均血小板数は、８日目と11日目を除いた全ての日に統
計学的に顕著に異なっていた。
本発明は上記の特定の態様に制限されるものではな
く、以下の請求の範囲内の全ての組成物および方法が含
まれる。
く、以下の請求の範囲内の全ての組成物および方法が含
まれる。
Claims (5)
- 【請求項１】哺乳類IL−７を含む、血小板が必要な哺乳
動物内で血小板産生を刺激するための薬剤。 - 【請求項２】哺乳類IL−７がヒトIL−７である、請求項
１に記載の薬剤。 - 【請求項３】IL−1a、IL−1b、IL−３、IL−４、IL−
６、EPO、GM−CSFおよびＧ−CSFからなる群から選択さ
れる１種以上のサイトカインとの組み合わせでIL−７を
含む、請求項２に記載の薬剤。 - 【請求項４】適当な賦形剤または担体と共に哺乳類IL−
７を調製することを含む、哺乳動物中で血小板産生を刺
激するための薬剤を調製する方法。 - 【請求項５】IL−７がヒトIL−７である、請求項４に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/312,546 US5032396A (en) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | IL-7 to stimulate platelet production |
| US312,546 | 1989-02-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501421A JPH04501421A (ja) | 1992-03-12 |
| JP2840443B2 true JP2840443B2 (ja) | 1998-12-24 |
Family
ID=23211955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504021A Expired - Lifetime JP2840443B2 (ja) | 1989-02-17 | 1990-02-06 | 血小板産生刺激薬剤のためのｉｌ―７の使用 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5032396A (ja) |
| EP (1) | EP0412149B1 (ja) |
| JP (1) | JP2840443B2 (ja) |
| AT (1) | ATE129899T1 (ja) |
| AU (1) | AU628943B2 (ja) |
| CA (1) | CA2026783C (ja) |
| DE (1) | DE69023416T2 (ja) |
| DK (1) | DK0412149T3 (ja) |
| ES (1) | ES2081366T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990009194A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714585A (en) * | 1987-10-26 | 1998-02-03 | Sterling Winthrop, Inc. | Antibodies that are immunoreactive with interleukin-7 |
| US5260417A (en) * | 1989-04-03 | 1993-11-09 | Genetics Institute, Inc. | Megakaryocyte growth promoting activity protein |
| US5229115A (en) * | 1990-07-26 | 1993-07-20 | Immunex Corporation | Adoptive immunotherapy with interleukin-7 |
| CA2089553C (en) * | 1990-08-29 | 2000-06-27 | Paul Schendel | Multidomain hematopoiesis stimulators |
| US5474769A (en) * | 1991-03-08 | 1995-12-12 | Sterling Winthrop Inc. | Treatment of microbial infection by monocyte stimulation with interleukin-7 |
| US5250732A (en) * | 1991-07-18 | 1993-10-05 | Genentech, Inc. | Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia |
| AU4190893A (en) * | 1992-07-17 | 1994-01-20 | Suntory Limited | Megakaryocyte differentiation factor |
| JP3657980B2 (ja) * | 1992-12-16 | 2005-06-08 | ヘキシマ・リミテッド | プロテイナーゼインヒビター、その前駆体およびそれをコードする遺伝子配列 |
| US5498599A (en) * | 1994-01-21 | 1996-03-12 | Amgen Inc. | Methods for stimulating platelet production |
| US5547931A (en) * | 1994-02-23 | 1996-08-20 | Immtech International Inc. | Methods of stimulatory thrombocytopoiesis using modified C-reactive protein |
| US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
| US5795569A (en) * | 1994-03-31 | 1998-08-18 | Amgen Inc. | Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation |
| RO115788B1 (ro) * | 1994-03-31 | 2000-06-30 | Amgen Inc. | Polipeptidă mgdf, derivat de polipeptidă mgdf, polipeptidă mgdf mono-pegilată şi procedee de obţinere a acestora |
| EP0801076A4 (en) * | 1994-11-30 | 1999-12-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | THROMBOCYTOTIC FACTOR |
| EP0721780A3 (en) * | 1994-12-16 | 1997-12-17 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Agent for promoting platelet and/or leukocyte production |
| FR2745185B1 (fr) * | 1996-02-28 | 1998-05-15 | Sanofi Sa | Utilisation de l'il-7 dans le traitement des maladies auto-immunes, en particulier le diabete mellitus insulinodependant |
| AU3877800A (en) | 1999-03-30 | 2000-10-16 | Trustees Of Boston University | Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes |
| ES2367891T3 (es) | 2000-09-29 | 2011-11-10 | Schering Corporation | Interleucina-10 pegilada. |
| AU2002307497A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-11-05 | The Regents Of The University Of California | Methods of using interleukin-7 to modulate physiological processes in mammalian pulmonary fibroblasts |
| DE602004022427D1 (de) * | 2003-09-10 | 2009-09-17 | Cell Biosciences Inc S | Zusammensetzungen basierend auf T-4 Immunstimulierender-Faktor ("TISF") zur Behandlung von Mangel and roten Blutkörperchen, Granulocyten un Blutplättchen |
| EP2468293B1 (en) | 2006-09-28 | 2014-10-22 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Use of pegylated il-10 to prevent metastasis of a cancer or tumor to the lung |
| RU2679889C2 (ru) | 2013-04-18 | 2019-02-14 | Армо Байосайенсиз, Инк. | Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств |
| CA2914837A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Armo Biosciences, Inc. | Method for assessing protein identity and stability |
| WO2015070060A1 (en) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| CN106573072A (zh) | 2014-06-02 | 2017-04-19 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 降低血清胆固醇的方法 |
| CN107106655A (zh) | 2014-10-22 | 2017-08-29 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法 |
| WO2016126615A1 (en) | 2015-02-03 | 2016-08-11 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| EP3302547A1 (en) | 2015-05-28 | 2018-04-11 | Armo Biosciences, Inc. | Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer |
| AU2016312510A1 (en) | 2015-08-25 | 2018-03-08 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894440A (en) * | 1986-09-17 | 1990-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor |
| ZA887773B (en) * | 1987-10-26 | 1989-07-26 | Immunex Corp | Interleukin-7 |
-
1989
- 1989-02-17 US US07/312,546 patent/US5032396A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-02-06 DK DK90904051.1T patent/DK0412149T3/da active
- 1990-02-06 WO PCT/US1990/000679 patent/WO1990009194A1/en active IP Right Grant
- 1990-02-06 JP JP2504021A patent/JP2840443B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 AU AU51645/90A patent/AU628943B2/en not_active Expired
- 1990-02-06 DE DE69023416T patent/DE69023416T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 EP EP90904051A patent/EP0412149B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 AT AT90904051T patent/ATE129899T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-06 ES ES90904051T patent/ES2081366T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-06 CA CA002026783A patent/CA2026783C/en not_active Expired - Lifetime
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| US5032396A (en) | 1991-07-16 |
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