JPH051100A - 腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法 - Google Patents
腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法Info
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- JPH051100A JPH051100A JP3195083A JP19508391A JPH051100A JP H051100 A JPH051100 A JP H051100A JP 3195083 A JP3195083 A JP 3195083A JP 19508391 A JP19508391 A JP 19508391A JP H051100 A JPH051100 A JP H051100A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は新規な腫瘍壊死因子活性抑制
物質を提供することにある。 【構成】 腫瘍壊死因子の殺細胞効果を抑制し、分子量
が約３４ＫＤａであり、Ｎ末端から１〜１１番目のアミ
ノ酸がVal-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Ala-Pro-Thr
である新規腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法
である。
物質を提供することにある。 【構成】 腫瘍壊死因子の殺細胞効果を抑制し、分子量
が約３４ＫＤａであり、Ｎ末端から１〜１１番目のアミ
ノ酸がVal-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Ala-Pro-Thr
である新規腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は腫瘍壊死因子の活性を抑
制しうる新しい物質及びその物質の単離、精製に関す
る。
制しうる新しい物質及びその物質の単離、精製に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はＣＤ−１ Sw
iss マウスにBacillus Calmette-Guerin（ＢＣＧ）菌を
投与し、その２週間後に細菌内毒素（エンドトキシン）
を投与した際に血中に現われる生理活性物質として発見
され、１９７５年にCarswellらが報告［E.A. Carswell
ら、Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 72, 3666 (1975)］
した生理活性蛋白質で、そのアミノ酸配列は１９８５年
にAggarwalら［B.B. Aggarwal ら、J. Biol. Chem. 26
0,2345 (1985) ］により明らかにされている。
iss マウスにBacillus Calmette-Guerin（ＢＣＧ）菌を
投与し、その２週間後に細菌内毒素（エンドトキシン）
を投与した際に血中に現われる生理活性物質として発見
され、１９７５年にCarswellらが報告［E.A. Carswell
ら、Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 72, 3666 (1975)］
した生理活性蛋白質で、そのアミノ酸配列は１９８５年
にAggarwalら［B.B. Aggarwal ら、J. Biol. Chem. 26
0,2345 (1985) ］により明らかにされている。
【０００３】またPennica ら、ShiraiらおよびWangらに
よって、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列および遺伝子配列が
明らかにされた［Pannica ら、Nature 312, 724 (198
5), Shiraiら、Nature 313, 803 (1985), Wangら、Scie
nce 288, 149 (1985) ］。当初その抗腫瘍活性から、癌
治療薬としての開発が進められていたＴＮＦは、最近種
々の生理活性が明らかにされ、生体内での諸機能が解明
されつつある。
よって、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列および遺伝子配列が
明らかにされた［Pannica ら、Nature 312, 724 (198
5), Shiraiら、Nature 313, 803 (1985), Wangら、Scie
nce 288, 149 (1985) ］。当初その抗腫瘍活性から、癌
治療薬としての開発が進められていたＴＮＦは、最近種
々の生理活性が明らかにされ、生体内での諸機能が解明
されつつある。
【０００４】例えば、細菌感染によるエンドトキシンシ
ョックの生態内のメディエイターとしての活性［B. Beu
tlerら、Science, 229, 869 (1985)］、血管内皮細胞へ
の炎症反応の惹起［J.R. Gamble ら、Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 82, 8667 (1985)］、発熱作用［C.A. Di
narelloら、J. Exp. Med. 163,1443 (1986) ］、炎症の
起因物質のひとつであるインターリウキン１［P.P. Naw
rothら、J.Exp. Med. 163, 1363 ］などとの関係が明ら
かにされつつある。
ョックの生態内のメディエイターとしての活性［B. Beu
tlerら、Science, 229, 869 (1985)］、血管内皮細胞へ
の炎症反応の惹起［J.R. Gamble ら、Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 82, 8667 (1985)］、発熱作用［C.A. Di
narelloら、J. Exp. Med. 163,1443 (1986) ］、炎症の
起因物質のひとつであるインターリウキン１［P.P. Naw
rothら、J.Exp. Med. 163, 1363 ］などとの関係が明ら
かにされつつある。
【０００５】また、ある種の病気の患者の体液中にはＴ
ＮＦが通常より多く含まれており、そのＴＮＦの含有量
とその患者の病態には深い関係があることが明らかにな
りつつある。すなわち、ＴＮＦの過剰産生により、病態
の悪化が生じていると考えられる疾患が多く存在する。
このような疾患に対して、抗ＴＮＦ作用を有する物質を
投与することにより、病態の改善が行なえうることは、
容易に推察ができる。事実、エンドトキシンショックに
対しては、抗ＴＮＦ作用を有する物質として、抗ＴＮＦ
抗体の投与が、動物を用いて行なわれ、顕著な効果を示
したことが報告されている［B. Beutlerら、Science, 2
99, 869(1985)]。
ＮＦが通常より多く含まれており、そのＴＮＦの含有量
とその患者の病態には深い関係があることが明らかにな
りつつある。すなわち、ＴＮＦの過剰産生により、病態
の悪化が生じていると考えられる疾患が多く存在する。
このような疾患に対して、抗ＴＮＦ作用を有する物質を
投与することにより、病態の改善が行なえうることは、
容易に推察ができる。事実、エンドトキシンショックに
対しては、抗ＴＮＦ作用を有する物質として、抗ＴＮＦ
抗体の投与が、動物を用いて行なわれ、顕著な効果を示
したことが報告されている［B. Beutlerら、Science, 2
99, 869(1985)]。
【０００６】しかし、現在のところ、抗ＴＮＦ抗体はヒ
ト以外の動物由来のものしか作成されておらず人体に対
する投与にはこのような抗体では大きな問題があると考
えられる。さらに、ＴＮＦが関与していると考えられる
急性、慢性の炎症反応においては、免疫複合体の形成
が、少なくとも病状を悪化させる要因のひとつであるこ
とが広く知られており、このような疾患に対して、抗Ｔ
ＮＦ作用を有する物質として、抗ＴＮＦ抗体を治療のた
めに用いることは難しいと考えられる。
ト以外の動物由来のものしか作成されておらず人体に対
する投与にはこのような抗体では大きな問題があると考
えられる。さらに、ＴＮＦが関与していると考えられる
急性、慢性の炎症反応においては、免疫複合体の形成
が、少なくとも病状を悪化させる要因のひとつであるこ
とが広く知られており、このような疾患に対して、抗Ｔ
ＮＦ作用を有する物質として、抗ＴＮＦ抗体を治療のた
めに用いることは難しいと考えられる。
【０００７】そこで、ヒトの体液中に天然に存在しうる
抗ＴＮＦ作用物質を用いることができれば、ＴＮＦが関
与している疾患に対して、充分、有効かつ安全な治療薬
として使用しうるものであると推察されるようになっ
た。
抗ＴＮＦ作用物質を用いることができれば、ＴＮＦが関
与している疾患に対して、充分、有効かつ安全な治療薬
として使用しうるものであると推察されるようになっ
た。
【０００８】かかるＴＮＦ活性抑制物質（ＴＮＦインヒ
ビターともいう）に関しては、C. Peetre ら［Eur. J.
Haematol, 41, 414 (1988), 42, 270 (1989)］、P. Sec
kingerら［J. Exp. Med. 167, 1551 (1988), J. Biol.
Chem. 264,11966 (1989) ］及び、H. Engelmannら［J.
Biol. Chem. 264, 11974 (1989)］により、尿から精製
が行なわれたことが報告されている。これらの物質はそ
のＮ末端アミノ酸配列と、その後、アミノ酸配列が決定
されたＴＮＦリセプター［T.J. Schall ら、Cell 61, 3
61 (1990), H. Loetscher ら、Cell 61, 351(1990)］の
アミノ酸配列とが一致し、ＴＮＦリセプターの一部が切
断されて尿中に存在したものであろうと考えられてい
る。
ビターともいう）に関しては、C. Peetre ら［Eur. J.
Haematol, 41, 414 (1988), 42, 270 (1989)］、P. Sec
kingerら［J. Exp. Med. 167, 1551 (1988), J. Biol.
Chem. 264,11966 (1989) ］及び、H. Engelmannら［J.
Biol. Chem. 264, 11974 (1989)］により、尿から精製
が行なわれたことが報告されている。これらの物質はそ
のＮ末端アミノ酸配列と、その後、アミノ酸配列が決定
されたＴＮＦリセプター［T.J. Schall ら、Cell 61, 3
61 (1990), H. Loetscher ら、Cell 61, 351(1990)］の
アミノ酸配列とが一致し、ＴＮＦリセプターの一部が切
断されて尿中に存在したものであろうと考えられてい
る。
【０００９】また、H. Engelmannらは特定のＮ末端配列
を有する分子量約３万の２つの物質を尿より単離してい
る（H. Engelmann et al, J. Biol. Chem. 265, 1531
(1990))。また、C.A. Smithらも、かかる物質について
そのアミノ酸配列を開示している（C.A. Smith et al,
Science 248, 1019, 1990 ）。
を有する分子量約３万の２つの物質を尿より単離してい
る（H. Engelmann et al, J. Biol. Chem. 265, 1531
(1990))。また、C.A. Smithらも、かかる物質について
そのアミノ酸配列を開示している（C.A. Smith et al,
Science 248, 1019, 1990 ）。
【００１０】そこで本発明者は、新規なＴＮＦ活性抑制
物質を探索すべく、研究を進めた結果、本発明に到達し
た。
物質を探索すべく、研究を進めた結果、本発明に到達し
た。
【００１１】
【発明の目的】本発明は新規なＴＮＦ活性抑制物質、そ
れを含有する組成物及び該物質の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
れを含有する組成物及び該物質の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
【００１２】
【発明の構成】本発明は下記発明を包含する。すなわち
本発明は、（ａ）腫瘍壊死因子のＬ929 細胞への殺細胞
効果を抑制し、（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量
が還元状態で３４Ｋ±１ＫＤａであり、（ｃ）Ｎ末端か
ら１〜１１番目までのアミノ酸が配列番号１に示される
アミノ酸配列で表わされる物質である。
本発明は、（ａ）腫瘍壊死因子のＬ929 細胞への殺細胞
効果を抑制し、（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量
が還元状態で３４Ｋ±１ＫＤａであり、（ｃ）Ｎ末端か
ら１〜１１番目までのアミノ酸が配列番号１に示される
アミノ酸配列で表わされる物質である。
【００１３】本発明の物質は、Ｎ末端から１１番目のア
ミノ酸が配列番号１で示されるアミノ酸配列であること
を特徴とする。
ミノ酸が配列番号１で示されるアミノ酸配列であること
を特徴とする。
【００１４】本発明の物質は、C. Peetre ら［Eur. J.H
aematol. 41, 414 (1988)］記載の物質とは、その分子
量において、彼らの報告しているものが約５０ＫＤａ、
本発明の物質が３４Ｋ±１ＫＤａという点で相違する。
aematol. 41, 414 (1988)］記載の物質とは、その分子
量において、彼らの報告しているものが約５０ＫＤａ、
本発明の物質が３４Ｋ±１ＫＤａという点で相違する。
【００１５】また、P. Seckingerら［J. Exp. Med. 16
7, 1551 (1988), J. Biol. Chem. 264, 11966 (1989)
に記載されている物質とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける
分子量はほぼ等しいものである。しかし、最終精製に用
いている逆相カラムからの溶出アセトニトリル濃度が、
カラムが異なるという条件を考慮しても、大きく異なる
という点で相違する。
7, 1551 (1988), J. Biol. Chem. 264, 11966 (1989)
に記載されている物質とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける
分子量はほぼ等しいものである。しかし、最終精製に用
いている逆相カラムからの溶出アセトニトリル濃度が、
カラムが異なるという条件を考慮しても、大きく異なる
という点で相違する。
【００１６】また、H. Engelmannら［J. Biol. Chem. 2
64, 11974 (1989)］に記載されている物質とは、その分
子量及びＮ末端からのアミノ酸配列に全く相同性がない
という点で異なる。
64, 11974 (1989)］に記載されている物質とは、その分
子量及びＮ末端からのアミノ酸配列に全く相同性がない
という点で異なる。
【００１７】また、H. Engelmannら［J. Biol. Chem. 2
65, 1531, 1990］に記載されている物質ＴＢＰＩとは、
Ｎ末端からのアミノ酸配列が全く異なる。
65, 1531, 1990］に記載されている物質ＴＢＰＩとは、
Ｎ末端からのアミノ酸配列が全く異なる。
【００１８】また、ＴＢＰIIとは、彼らが報告している
ようなＮ末端アミノ酸の多様性が認められず、かつ、分
子量も若干異なる。
ようなＮ末端アミノ酸の多様性が認められず、かつ、分
子量も若干異なる。
【００１９】本発明においてＴＮＦとは、Aggarwalら
［J. Biol. Chem. 260, 2345 (1985)］やShiraiら［Nat
ure 313, 803 (1985)］により報告されているＴＮＦ−
αであり、天然ＴＮＦ及びリコンビナントＴＮＦを含
む。
［J. Biol. Chem. 260, 2345 (1985)］やShiraiら［Nat
ure 313, 803 (1985)］により報告されているＴＮＦ−
αであり、天然ＴＮＦ及びリコンビナントＴＮＦを含
む。
【００２０】本発明において、Ｌ９２９細胞とは、マウ
スfibrosarcoma由来の樹立細胞株であり、ＡＴＣＣ株番
号はＣＣＬ−１、名称Ｌ９２９（ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ
９２９）として登録されている細胞である。
スfibrosarcoma由来の樹立細胞株であり、ＡＴＣＣ株番
号はＣＣＬ−１、名称Ｌ９２９（ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ
９２９）として登録されている細胞である。
【００２１】本発明の物質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおける分子量が還元状態で３４Ｋ±１ＫＤａの物質
である。ここでＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元状態と
は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行な
う以前に、サンプルを適当な還元剤、例えば、２−メル
カプトエタノール、ジチオスレイトール等の存在下に
て、１００℃、数分間の処理を行なって、タンパク中の
ジスルフィド結合を開裂させた後、電気泳動を行なうこ
とをいう。
Ｅにおける分子量が還元状態で３４Ｋ±１ＫＤａの物質
である。ここでＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元状態と
は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行な
う以前に、サンプルを適当な還元剤、例えば、２−メル
カプトエタノール、ジチオスレイトール等の存在下に
て、１００℃、数分間の処理を行なって、タンパク中の
ジスルフィド結合を開裂させた後、電気泳動を行なうこ
とをいう。
【００２２】本発明は、該腫瘍壊死因子活性抑制物質を
含有する組成物を包含する。
含有する組成物を包含する。
【００２３】本発明の物質は尿を精製することにより得
ることができる。特に、膜性増殖性糸球体腎炎患者の尿
を精製することにより得ることができる。
ることができる。特に、膜性増殖性糸球体腎炎患者の尿
を精製することにより得ることができる。
【００２４】膜性増殖性糸球体腎炎は、臨床的には、腎
糸球体への免疫複合体の沈着が認められ、さらに血中補
体価の低下、糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム細胞の
増殖等が認められる腎疾患である。本症発症原因はいま
だ不明であるが、最近、メサンギウム細胞増殖型腎炎に
はサイトカイン類、特にインターロイキン６の関与が示
唆されている［実験医学２，１１（１９８９）］。イン
ターロイキン６の産生は、ＴＮＦやインターロイキン１
によって誘導されることが、多くの細胞で報告されてお
り［実験医学２，２１（１９８９），現代免疫学９３
（１９８８）］本疾患においてもＴＮＦの産生亢進がお
こっていることが推測される。
糸球体への免疫複合体の沈着が認められ、さらに血中補
体価の低下、糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム細胞の
増殖等が認められる腎疾患である。本症発症原因はいま
だ不明であるが、最近、メサンギウム細胞増殖型腎炎に
はサイトカイン類、特にインターロイキン６の関与が示
唆されている［実験医学２，１１（１９８９）］。イン
ターロイキン６の産生は、ＴＮＦやインターロイキン１
によって誘導されることが、多くの細胞で報告されてお
り［実験医学２，２１（１９８９），現代免疫学９３
（１９８８）］本疾患においてもＴＮＦの産生亢進がお
こっていることが推測される。
【００２５】本発明者は、種々の腎疾患患者の血中ＴＮ
Ｆ含量を測定したところ、膜性増殖性糸球体腎炎患者血
中に高濃度のＴＮＦが含有されていることを明らかとし
た。さらに、本疾患患者尿を用いて、ＴＮＦの活性抑制
能を検討したところ、高いＴＮＦ活性抑制能があること
を見出したものである。
Ｆ含量を測定したところ、膜性増殖性糸球体腎炎患者血
中に高濃度のＴＮＦが含有されていることを明らかとし
た。さらに、本疾患患者尿を用いて、ＴＮＦの活性抑制
能を検討したところ、高いＴＮＦ活性抑制能があること
を見出したものである。
【００２６】精製はイオン交換、逆相カラム、ＴＮＦ固
定化カラム等の精製操作を組み合わせることにより行な
うことができる。
定化カラム等の精製操作を組み合わせることにより行な
うことができる。
【００２７】すなわち本発明は、腫瘍壊死因子活性抑制
物質の製造方法であって、（ａ）尿をイオン交換カラム
及び／又は逆相カラムへの吸着及び溶出によって精製
し、（ｂ）腫瘍壊死因子固定化カラムへの吸着及び溶出
によって腫瘍壊死因子に結合する画分を分取し、（ｃ）
腫瘍壊死因子のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制する
画分を選択することからなる製造方法を包含する。
物質の製造方法であって、（ａ）尿をイオン交換カラム
及び／又は逆相カラムへの吸着及び溶出によって精製
し、（ｂ）腫瘍壊死因子固定化カラムへの吸着及び溶出
によって腫瘍壊死因子に結合する画分を分取し、（ｃ）
腫瘍壊死因子のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制する
画分を選択することからなる製造方法を包含する。
【００２８】以下、本発明を詳述する。
【００２９】検体尿の調製
尿は、初尿、蓄尿、スポット尿のいずれを用いてもかま
わない。好ましくは、後に、バイオアッセイを行なうた
めに、できるだけ無菌もしくは無菌に近い状態で採取さ
れたものがよい。採取した尿は、すみやかに冷凍保存
し、使用直前に融解して用いることが望ましい。カビや
バクテリアの繁殖を抑えるために、ＮａＮ３ や抗生物
質、また、プロテアーゼによる分解を防ぐためにプロテ
アーゼインヒビター等を、尿採取直後に添加してもかま
わないが、尿採取後、速やかに冷凍保存に移行すればこ
れらの添加物は不要である。それらの添加物を添加した
場合には、適当な操作、例えば、透析、限外濾過、ゲル
濾過等の操作により、バイオアッセイを行なう前に充
分、添加物を除去する必要がある。
わない。好ましくは、後に、バイオアッセイを行なうた
めに、できるだけ無菌もしくは無菌に近い状態で採取さ
れたものがよい。採取した尿は、すみやかに冷凍保存
し、使用直前に融解して用いることが望ましい。カビや
バクテリアの繁殖を抑えるために、ＮａＮ３ や抗生物
質、また、プロテアーゼによる分解を防ぐためにプロテ
アーゼインヒビター等を、尿採取直後に添加してもかま
わないが、尿採取後、速やかに冷凍保存に移行すればこ
れらの添加物は不要である。それらの添加物を添加した
場合には、適当な操作、例えば、透析、限外濾過、ゲル
濾過等の操作により、バイオアッセイを行なう前に充
分、添加物を除去する必要がある。
【００３０】検体尿からの精製
精製は、通常のタンパク質の精製法に従って行なえばよ
い。尿原液では、通常、低い活性しか認められないの
で、まず濃縮を行なうことが好ましい。濃縮法として
は、限外濾過、凍結乾燥、塩析等の通常の生化学実験法
に基づいて行なえばよいが、限外濾過、塩析等を行なう
場合には、目的とする物質の分子量や、沈殿を開始する
塩濃度等をあらかじめ調べておく必要がある。
い。尿原液では、通常、低い活性しか認められないの
で、まず濃縮を行なうことが好ましい。濃縮法として
は、限外濾過、凍結乾燥、塩析等の通常の生化学実験法
に基づいて行なえばよいが、限外濾過、塩析等を行なう
場合には、目的とする物質の分子量や、沈殿を開始する
塩濃度等をあらかじめ調べておく必要がある。
【００３１】濃縮後は、適当な精製操作、例えばイオン
交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、
等電点電気泳動、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー等を組み合わせて、精製を進めることがで
きる。
交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、
等電点電気泳動、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー等を組み合わせて、精製を進めることがで
きる。
【００３２】本発明の物質は、上記濃縮操作の後、ＴＮ
Ｆがカップリングしたカラムに吸着させることにより分
離精製を行ない、その後、逆相カラムによる溶出により
特定のアセトニトリル濃度の画分中に含まれる物質であ
る。アセトニトリル濃度は使用するカラム、アセトニト
リル濃度勾配によって異なるが、Protein Ｃ４，ＶＹＤ
ＡＣ社、０．４６×２５cmを使用し、１５０分間の１８
〜３７％のアセトニトリル直線勾配を行なった場合はア
セトニトリル濃度２７〜２８％のものである。
Ｆがカップリングしたカラムに吸着させることにより分
離精製を行ない、その後、逆相カラムによる溶出により
特定のアセトニトリル濃度の画分中に含まれる物質であ
る。アセトニトリル濃度は使用するカラム、アセトニト
リル濃度勾配によって異なるが、Protein Ｃ４，ＶＹＤ
ＡＣ社、０．４６×２５cmを使用し、１５０分間の１８
〜３７％のアセトニトリル直線勾配を行なった場合はア
セトニトリル濃度２７〜２８％のものである。
【００３３】ＴＮＦ活性抑制能の測定
ＴＮＦ活性の抑制能の測定法としては、既に知られてい
るＴＮＦ活性の測定を行なう系に、被験サンプルを添加
すればよい。すなわち、ＴＮＦのアッセイ法として知ら
れているｉｎ ｖｉｔｒｏの種々の腫瘍細胞に対する殺
細胞効果、細胞増殖抑制効果、脂肪細胞の脂肪酸代謝抑
制効果、正常線維芽細胞の増殖促進効果やＩＬ−６産生
誘導効果、好中球の内皮細胞への付着促進効果や、スー
パーオキサイド分泌促進効果、血管内皮細胞の凝固活性
亢進効果、骨細胞への破骨効果、種々の細胞でのＩＬ−
１やプロスタグランディン類の誘導効果を測定する系が
利用できる。特にＬ９２９細胞への殺細胞効果で測定す
ることが好適である。また、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても
ある種の癌細胞に対する出血壊死効果、エンドトキシン
ショックの誘導効果、発熱効果を測定する系を利用する
ことができる。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性や、多
くのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、ＴＮＦ以外の物質で
も誘導しうる反応が多くあるため、できるだけ単純で、
かつ、ＴＮＦ以外の物質の影響を受けない系、例えば、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの癌細胞に対する殺細胞活性を測定す
る系を用いることが望ましい。
るＴＮＦ活性の測定を行なう系に、被験サンプルを添加
すればよい。すなわち、ＴＮＦのアッセイ法として知ら
れているｉｎ ｖｉｔｒｏの種々の腫瘍細胞に対する殺
細胞効果、細胞増殖抑制効果、脂肪細胞の脂肪酸代謝抑
制効果、正常線維芽細胞の増殖促進効果やＩＬ−６産生
誘導効果、好中球の内皮細胞への付着促進効果や、スー
パーオキサイド分泌促進効果、血管内皮細胞の凝固活性
亢進効果、骨細胞への破骨効果、種々の細胞でのＩＬ−
１やプロスタグランディン類の誘導効果を測定する系が
利用できる。特にＬ９２９細胞への殺細胞効果で測定す
ることが好適である。また、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても
ある種の癌細胞に対する出血壊死効果、エンドトキシン
ショックの誘導効果、発熱効果を測定する系を利用する
ことができる。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性や、多
くのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、ＴＮＦ以外の物質で
も誘導しうる反応が多くあるため、できるだけ単純で、
かつ、ＴＮＦ以外の物質の影響を受けない系、例えば、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの癌細胞に対する殺細胞活性を測定す
る系を用いることが望ましい。
【００３４】本発明の腫瘍壊死因子活性抑制物質は、各
種のＴＮＦ関連疾患の治療剤として使用される。そのた
めの医薬組成物としては、本発明の腫瘍壊死因子活性抑
制物質を有効活性成分として含み、その他製薬学的に許
容しうる担体を含むものであればよい。
種のＴＮＦ関連疾患の治療剤として使用される。そのた
めの医薬組成物としては、本発明の腫瘍壊死因子活性抑
制物質を有効活性成分として含み、その他製薬学的に許
容しうる担体を含むものであればよい。
【００３５】医薬組成物を調製する場合、有効活性成分
として使用する腫瘍壊死因子活性抑制物質の抗原性の低
減あるいは生理活性の増強などを目的として、例えばポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン又はポ
リ−ＤＬ−アラニンなどの公知のポリマーによって修飾
することもできる。
として使用する腫瘍壊死因子活性抑制物質の抗原性の低
減あるいは生理活性の増強などを目的として、例えばポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン又はポ
リ−ＤＬ−アラニンなどの公知のポリマーによって修飾
することもできる。
【００３６】医薬組成物の形態としては、注射用組成
物、坐剤その他が挙げられるが、注射用組成物としては
特に静注用組成物として使用するのが好ましい。
物、坐剤その他が挙げられるが、注射用組成物としては
特に静注用組成物として使用するのが好ましい。
【００３７】注射用組成物の場合は、本発明の腫瘍壊死
因子活性抑制物質の薬学的有効量及び製薬学的に許容し
うる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、糖類、
セルロース誘導体、ポリビニルピロリドン類、無機化合
物類などの一般的に注射用組成物に添加される賦活剤を
用いることもできる。それらの具体例をあげると、アミ
ノ酸類としては、グリシン、アルギニン、アラニン及び
それらの薬学的に許容できる塩等があげられる。糖類と
しては、マンニトール、イノシトール、キシリトール、
乳糖、グルコース等があげられる。セルロース誘導体と
してはカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチル
セルロース等があげられる。ポリビニルピロリドン類と
しては分子量１０，０００〜１，０００，０００のポリ
ビニルピロリドンがあげられる。
因子活性抑制物質の薬学的有効量及び製薬学的に許容し
うる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、糖類、
セルロース誘導体、ポリビニルピロリドン類、無機化合
物類などの一般的に注射用組成物に添加される賦活剤を
用いることもできる。それらの具体例をあげると、アミ
ノ酸類としては、グリシン、アルギニン、アラニン及び
それらの薬学的に許容できる塩等があげられる。糖類と
しては、マンニトール、イノシトール、キシリトール、
乳糖、グルコース等があげられる。セルロース誘導体と
してはカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチル
セルロース等があげられる。ポリビニルピロリドン類と
しては分子量１０，０００〜１，０００，０００のポリ
ビニルピロリドンがあげられる。
【００３８】有機酸類としては、アスコルビン酸、クエ
ン酸類等及びそれらの塩があげられる。無機化合物類と
してはリン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢
酸ナトリウムなどがある。
ン酸類等及びそれらの塩があげられる。無機化合物類と
してはリン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢
酸ナトリウムなどがある。
【００３９】これら賦形剤を溶解させる液としては、注
射用蒸留水、注射用生理食塩水又は注射用リンゲル液が
ある。
射用蒸留水、注射用生理食塩水又は注射用リンゲル液が
ある。
【００４０】その他注射液中には、安定剤、界面活性
剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、緩衝剤などが必要に
応じて添加される。これらの具体例を示すと、安定剤と
してはピロ亜硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸等の
抗酸化剤；ＥＤＴＡ、チオグリコール剤等のキレート剤
等があげられる。界面活性剤としては、ポリソルベー
ト、ポリオキシエチレン誘導体等の非イオン性界面活性
剤等があげられる。等張化剤としては塩化ナトリウム等
が挙げられる。
剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、緩衝剤などが必要に
応じて添加される。これらの具体例を示すと、安定剤と
してはピロ亜硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸等の
抗酸化剤；ＥＤＴＡ、チオグリコール剤等のキレート剤
等があげられる。界面活性剤としては、ポリソルベー
ト、ポリオキシエチレン誘導体等の非イオン性界面活性
剤等があげられる。等張化剤としては塩化ナトリウム等
が挙げられる。
【００４１】無痛化剤としてはベンジルアルコール、キ
シロカイン、プロカイン等が挙げられる。
シロカイン、プロカイン等が挙げられる。
【００４２】防腐剤としてはパラベン類、クロロブタノ
ール、塩化ベンザルコニウム、チメロサール（Thimeros
al）等が挙げられる。
ール、塩化ベンザルコニウム、チメロサール（Thimeros
al）等が挙げられる。
【００４３】緩衝剤としては、クエン酸、酢酸、リン酸
等のナトリウム塩等が挙げられる。
等のナトリウム塩等が挙げられる。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制する新規な物質を
提供し、ＴＮＦが関与していると考えられる疾患、例え
ば、エンドトキシンショックや火傷時のショック、急性
肝不全、腎不全や多臓器不全、リウマチ、ＳＬＥ、ベー
チェット病等の多くの自己免疫疾患、臓器移植時の拒絶
反応、川崎病、ＤＩＣ等の凝固異常の治療、診断等に利
用できる。また上記物質の効率的な製造方法を提供する
ことが可能となった。
のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制する新規な物質を
提供し、ＴＮＦが関与していると考えられる疾患、例え
ば、エンドトキシンショックや火傷時のショック、急性
肝不全、腎不全や多臓器不全、リウマチ、ＳＬＥ、ベー
チェット病等の多くの自己免疫疾患、臓器移植時の拒絶
反応、川崎病、ＤＩＣ等の凝固異常の治療、診断等に利
用できる。また上記物質の効率的な製造方法を提供する
ことが可能となった。
【００４５】
【実施例】以下、実施例を掲げて本発明について詳細に
説明するが本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。。
説明するが本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。。
【００４６】尿中ＴＮＦ活性抑制物質の精製
（１）限外濾過による濃縮
膜性増殖性糸球体腎炎患者尿（サンプル１）２９．５リ
ットルをペリコン（ミリポア社）による限外濾過で分子
量１万以上の画分を２９０mlまで濃縮、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ８．０にバッファー交換した（サンプル
２）。
ットルをペリコン（ミリポア社）による限外濾過で分子
量１万以上の画分を２９０mlまで濃縮、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ８．０にバッファー交換した（サンプル
２）。
【００４７】（２）ＤＥＡＥ−Sepharose カラムによる
精製 濃縮尿サンプルを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０にて
平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−Sepharose カラムに
かけた。流速４００ml／hrにて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０で洗った後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌｐＨ８．０にて、溶出を行ない、４００ml
ずつフラクションを集めた。
精製 濃縮尿サンプルを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０にて
平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−Sepharose カラムに
かけた。流速４００ml／hrにて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０で洗った後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌｐＨ８．０にて、溶出を行ない、４００ml
ずつフラクションを集めた。
【００４８】各フラクションの１mlをセントリコン１０
（アミコン社）による限外濾過で、ＰＢＳにバッファー
交換した後、各フラクションのＯＤ280 と、Ｌ９２９細
胞に対するＴＮＦの殺細胞効果の抑制能を測定し、活性
画分をプールし、ペリコンにより分子量１万以上の画分
を濃縮し、タンパク濃度１７．８mg／mlの粗精製品１０
３mlを得た（サンプル３）。サンプル３のＬ９２９細胞
に対するＴＮＦの殺細胞効果の抑制能を測定した（表１
に示す）。
（アミコン社）による限外濾過で、ＰＢＳにバッファー
交換した後、各フラクションのＯＤ280 と、Ｌ９２９細
胞に対するＴＮＦの殺細胞効果の抑制能を測定し、活性
画分をプールし、ペリコンにより分子量１万以上の画分
を濃縮し、タンパク濃度１７．８mg／mlの粗精製品１０
３mlを得た（サンプル３）。サンプル３のＬ９２９細胞
に対するＴＮＦの殺細胞効果の抑制能を測定した（表１
に示す）。
【００４９】（３）逆相カラムによる精製
次にＤＥＡＥ粗精製品（サンプル３）１０mlを、０．１
％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）にて平衡化した逆相カラ
ム（Protein Ｃ４、ＶＹＤＡＣ社、２×２５cm）にか
け、４０分間のアセトニトリル１６％から、４０％の直
線勾配で、流速５ml／min にて溶出を行ない、５ml／フ
ラクションにて、分取を行なった。この操作を９回繰り
返した後、各フラクションを凍結乾燥した。各フラクシ
ョンを１mlのＰＢＳに融解した後、同じ溶出時間のフラ
クションをプールし、ＯＤ280 とＬ９２９細胞に対する
ＴＮＦの殺細胞効果の抑制能を測定した。ＴＮＦ活性を
抑制する活性は主に２つのピーク（ピークＩ，ピークI
I）に認められた（図１に示す）。これらのＬ９２９細
胞に対するＴＮＦの殺細胞効果を表１に示す。
％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）にて平衡化した逆相カラ
ム（Protein Ｃ４、ＶＹＤＡＣ社、２×２５cm）にか
け、４０分間のアセトニトリル１６％から、４０％の直
線勾配で、流速５ml／min にて溶出を行ない、５ml／フ
ラクションにて、分取を行なった。この操作を９回繰り
返した後、各フラクションを凍結乾燥した。各フラクシ
ョンを１mlのＰＢＳに融解した後、同じ溶出時間のフラ
クションをプールし、ＯＤ280 とＬ９２９細胞に対する
ＴＮＦの殺細胞効果の抑制能を測定した。ＴＮＦ活性を
抑制する活性は主に２つのピーク（ピークＩ，ピークI
I）に認められた（図１に示す）。これらのＬ９２９細
胞に対するＴＮＦの殺細胞効果を表１に示す。
【００５０】ピークＩの画分は、この後、ＴＮＦアフィ
ニティカラム、逆相カラムによる精製をさらに行ない、
Ｎ末端アミノ酸配列を決定したところ、Asp-Ser-Val-X-
Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-X-Asn-Ser-Ile
（Ｘは４７７Ａ型プロテインシークエンサーでピークが
認められなかった残基）という配列が得られ、公知のＴ
ＮＦインヒビター、あるいはＴＮＦリセプター断片であ
ると推測された［I. Olsson ら、Eur. J. Haematol, 4
2, 270 (1989), H. Loetscherら、Cell 61, 351(1990),
T.J. Schallら、Cell 61, 361 (1990) ］。
ニティカラム、逆相カラムによる精製をさらに行ない、
Ｎ末端アミノ酸配列を決定したところ、Asp-Ser-Val-X-
Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-X-Asn-Ser-Ile
（Ｘは４７７Ａ型プロテインシークエンサーでピークが
認められなかった残基）という配列が得られ、公知のＴ
ＮＦインヒビター、あるいはＴＮＦリセプター断片であ
ると推測された［I. Olsson ら、Eur. J. Haematol, 4
2, 270 (1989), H. Loetscherら、Cell 61, 351(1990),
T.J. Schallら、Cell 61, 361 (1990) ］。
【００５１】（４）ＴＮＦアフィニティーカラムによる
精製 次に、１８ml得られた逆相カラム粗精製品（ピークII）
のうち７mlを、１mgのＴＮＦがカップリングした０．４
mlのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に通
した。ここで用いたＴＮＦは比活性３．３×１０7 Ｕ／
mgのリコンビナントＴＮＦであり、そのアミノ酸配列
は、Shiraiらの文献［Nature 313, 803 (1985)］に記載
されているものと同一である。ＰＢＳ−０．０２％Ｎａ
Ｎ３ を流して、充分、非特異的吸着成分を除去した
後、２５ｍＭクエン酸１００ｍＭ ＮａＣｌ−０．０２
％ＮａＮ３ ｐＨ２．５により溶出を行なった。
精製 次に、１８ml得られた逆相カラム粗精製品（ピークII）
のうち７mlを、１mgのＴＮＦがカップリングした０．４
mlのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に通
した。ここで用いたＴＮＦは比活性３．３×１０7 Ｕ／
mgのリコンビナントＴＮＦであり、そのアミノ酸配列
は、Shiraiらの文献［Nature 313, 803 (1985)］に記載
されているものと同一である。ＰＢＳ−０．０２％Ｎａ
Ｎ３ を流して、充分、非特異的吸着成分を除去した
後、２５ｍＭクエン酸１００ｍＭ ＮａＣｌ−０．０２
％ＮａＮ３ ｐＨ２．５により溶出を行なった。
【００５２】（５）逆相カラムによる精製
溶出直後に、溶出液１．２mlを０．１％ＴＦＡ−１８％
アセトニトリルで平衡化した逆相カラム（Protein Ｃ
４、ＶＹＤＡＣ社、０．４６×２５cm）にかけ、１５０
分間の１８％から３７％のアセトニトリル直線勾配によ
り、溶出を行なった。アセトニトリル濃度２７〜２８％
において、２１５nmの吸収でメインピークが１つ認めら
れその画分を分取した。これを最終精製品Ａとよぶ。こ
の最終精製品ＡのＬ９２９細胞に対するＴＮＦの殺細胞
効果の抑制能を表１に示す。
アセトニトリルで平衡化した逆相カラム（Protein Ｃ
４、ＶＹＤＡＣ社、０．４６×２５cm）にかけ、１５０
分間の１８％から３７％のアセトニトリル直線勾配によ
り、溶出を行なった。アセトニトリル濃度２７〜２８％
において、２１５nmの吸収でメインピークが１つ認めら
れその画分を分取した。これを最終精製品Ａとよぶ。こ
の最終精製品ＡのＬ９２９細胞に対するＴＮＦの殺細胞
効果の抑制能を表１に示す。
【００５３】ＴＮＦ活性抑制物質のアッセイ
ＴＮＦ活性抑制能のアッセイは、Ｌ９２９細胞を用い
て、ＴＮＦ活性を測定するRuff & Giffordの系［J.Immu
nol,125, 1671 (1980)］に、ＴＮＦと同時にサンプルを
添加することにより行なった。すなわち、９６ウエルプ
レートに４×１０5 cells ／mlのＬ９２９細胞を、２μ
ｇ／mlのアクチノマイシンＤと混合し、１００μｌ／ウ
エルで播種、５％ＣＯ２ ，３７℃にて２時間培養す
る。この細胞に限外濾過、透析、もしくは凍結乾燥、再
融解等により、バッファーをＰＢＳに置換したサンプル
５０μｌを加え、直後に２．６ng／mlのＴＮＦ溶液（比
活性３．３×１０7 Ｕ／mg）５０μｌをさらに添加し、
５％ＣＯ２ ，３７℃にて１８時間培養を行なった。培
養後、クリスタルバイオレットによる生細胞の染色を行
ない、染色された細胞を０．５％ＳＤＳにて溶解し、５
９５nmの吸光度を測定した。 得られた５９５nmの吸光
度をもとに、ＴＮＦ−Inhibition rate を算出した。Ｔ
ＮＦ−Inhibition rate の算出式は、以下に示すとおり
である。
て、ＴＮＦ活性を測定するRuff & Giffordの系［J.Immu
nol,125, 1671 (1980)］に、ＴＮＦと同時にサンプルを
添加することにより行なった。すなわち、９６ウエルプ
レートに４×１０5 cells ／mlのＬ９２９細胞を、２μ
ｇ／mlのアクチノマイシンＤと混合し、１００μｌ／ウ
エルで播種、５％ＣＯ２ ，３７℃にて２時間培養す
る。この細胞に限外濾過、透析、もしくは凍結乾燥、再
融解等により、バッファーをＰＢＳに置換したサンプル
５０μｌを加え、直後に２．６ng／mlのＴＮＦ溶液（比
活性３．３×１０7 Ｕ／mg）５０μｌをさらに添加し、
５％ＣＯ２ ，３７℃にて１８時間培養を行なった。培
養後、クリスタルバイオレットによる生細胞の染色を行
ない、染色された細胞を０．５％ＳＤＳにて溶解し、５
９５nmの吸光度を測定した。 得られた５９５nmの吸光
度をもとに、ＴＮＦ−Inhibition rate を算出した。Ｔ
ＮＦ−Inhibition rate の算出式は、以下に示すとおり
である。
【００５４】
ＴＮＦ−Inhibition rate ＝
｛（［ＯＤ595 ］ＴＮＦ＋サンプル−［ＯＤ595 ］ＴＮＦ）
／（［ＯＤ595 ］ＴＮＦなし−［ＯＤ595 ］ＴＮＦ）｝×１００（％）
各サンプルは１／２稀釈系列によりアッセイを行ない、
それぞれＴＮＦ−Inhibition rate を算出した。３０％
のＴＮＦ−Inhibition rate を与えるサンプルの最大稀
釈の逆数を１ユニット（Ｕ）と規定し、尿中ＴＮＦ活性
抑制物質の各精製ステップにおけるＴＮＦ抑制活性を示
したものが表１である。
それぞれＴＮＦ−Inhibition rate を算出した。３０％
のＴＮＦ−Inhibition rate を与えるサンプルの最大稀
釈の逆数を１ユニット（Ｕ）と規定し、尿中ＴＮＦ活性
抑制物質の各精製ステップにおけるＴＮＦ抑制活性を示
したものが表１である。
【００５５】
【表１】
【００５６】尿中ＴＮＦ活性抑制物質の分子量
最終精製品Ａ３５０μｌを凍結乾燥し、２３０μｌのＰ
ＢＳに再溶解した。このサンプル９μｌに１０μｌの２
×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，１０％ Sucrose, １０％Ｓ
ＤＳ，０．２５mg／mlブロモフェノールブルー）、１μ
ｌの２−メルカプトエタノールを加え、１００℃、５分
間、加熱した後、１０〜２０％のＳＤＳポリアクリルア
ミド勾配ゲル（第一化学、ＳＤＳ−ＰＡＧ ＰＬＡＴＥ
１０／２０）に全量をのせ、３０ｍＡ定電流にて、１２
０分間、泳動を行なった。分子量マーカーとしてはＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ社Molecular WeightStandards-Lowを用い
た。電気泳動終了後、銀染色を行なった（図２にそのス
ケッチを示す）。サンプルをのせたレーンには、分子量
３４Ｋ±１ＫＤａのシングルバンドのみが認められ、尿
中のＴＮＦ活性抑制物質は、還元状態でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上での分子量は、３４Ｋ±１ＫＤａであることが確
認された。
ＢＳに再溶解した。このサンプル９μｌに１０μｌの２
×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，１０％ Sucrose, １０％Ｓ
ＤＳ，０．２５mg／mlブロモフェノールブルー）、１μ
ｌの２−メルカプトエタノールを加え、１００℃、５分
間、加熱した後、１０〜２０％のＳＤＳポリアクリルア
ミド勾配ゲル（第一化学、ＳＤＳ−ＰＡＧ ＰＬＡＴＥ
１０／２０）に全量をのせ、３０ｍＡ定電流にて、１２
０分間、泳動を行なった。分子量マーカーとしてはＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ社Molecular WeightStandards-Lowを用い
た。電気泳動終了後、銀染色を行なった（図２にそのス
ケッチを示す）。サンプルをのせたレーンには、分子量
３４Ｋ±１ＫＤａのシングルバンドのみが認められ、尿
中のＴＮＦ活性抑制物質は、還元状態でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上での分子量は、３４Ｋ±１ＫＤａであることが確
認された。
【００５７】Ｎ末アミノ酸配列の決定
最終精製品Ａ１mlを凍結乾燥にて、約１００μｌまで、
濃縮を行なった後、Applied Bio Systems 社製、４７７
Ａ型プロテインシークエンサーで、Ｎ末アミノ酸配列の
分析を行なった。
濃縮を行なった後、Applied Bio Systems 社製、４７７
Ａ型プロテインシークエンサーで、Ｎ末アミノ酸配列の
分析を行なった。
【００５８】２回の分析で、Ｎ末端より１１番目のアミ
ノ酸まで、同一の配列が同定され、これは配列番号１に
示されるアミノ酸配列を有していた。
ノ酸まで、同一の配列が同定され、これは配列番号１に
示されるアミノ酸配列を有していた。
【００５９】配列番号：１
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
【図１】ＤＥＡＥ粗精製品を逆相カラムにかけた時の溶
出プロファイルである。
出プロファイルである。
【図２】最終精製品Ａの還元状態下におけるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果を示したものである。
ＡＧＥの結果を示したものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 市川 弥太郎
東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人
株式会社東京研究センター内
Claims (4)
- 【請求項１】（ａ）腫瘍壊死因子の、Ｌ９２９細胞への
殺細胞効果を抑制し、（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける
分子量が還元状態で３４Ｋ±１ＫＤａであり、（ｃ）Ｎ
末端から１〜１１番目までのアミノ酸が次の配列 Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Ala-Pro-Thr で表わされる物質。 - 【請求項２】 尿を精製することにより得られる請求項
１記載の物質。 - 【請求項３】 尿が膜性増殖性糸球体腎炎患者由来のも
のである請求項２記載の物質。 - 【請求項４】 腫瘍壊死因子活性抑制物質の製造方法で
あって、（ａ）尿をイオン交換カラム及び／又は逆相カ
ラムへの吸着及び溶出によって精製し、（ｂ）腫瘍壊死
因子固定化カラムへの吸着及び溶出によって腫瘍壊死因
子に結合する画分を分取し、（ｃ）腫瘍壊死因子のＬ９
２９細胞への殺細胞効果を抑制する画分を選択すること
からなる製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3195083A JPH051100A (ja) | 1990-07-11 | 1991-07-10 | 腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18148890 | 1990-07-11 | ||
| JP2-181488 | 1990-07-11 | ||
| JP3195083A JPH051100A (ja) | 1990-07-11 | 1991-07-10 | 腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH051100A true JPH051100A (ja) | 1993-01-08 |
Family
ID=26500649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3195083A Pending JPH051100A (ja) | 1990-07-11 | 1991-07-10 | 腫瘍壊死因子活性抑制物質及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH051100A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08510727A (ja) * | 1993-05-17 | 1996-11-12 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | レチノン酸による腫瘍壊死因子および五酸化二窒素の生産の抑制方法 |
-
1991
- 1991-07-10 JP JP3195083A patent/JPH051100A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08510727A (ja) * | 1993-05-17 | 1996-11-12 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | レチノン酸による腫瘍壊死因子および五酸化二窒素の生産の抑制方法 |
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