JP3176604B2 - Ｘａ因子インヒビターおよびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents
Ｘａ因子インヒビターおよびそれを含有する医薬組成物Info
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- A—HUMAN NECESSITIES
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、医用ひる（蛭）ヒルド・メディシナリス
（Hirudo medicinalis）の唾液由来の新規抗凝血因子、
それを含む血液凝固改善用医薬組成物及びそれによる血
液凝固改善方法に関する。
（Hirudo medicinalis）の唾液由来の新規抗凝血因子、
それを含む血液凝固改善用医薬組成物及びそれによる血
液凝固改善方法に関する。
更に詳しくは、本発明は医用蛭ヒルド・メディシナリ
スの唾液由来の新規抗凝血因子に関する。この因子は、
ウシX a因子を特異的に阻害するが、トロンビンを阻害
しない。上記唾液中の主抗凝血因子は、トロンビンを阻
害するが、下記で明らかなようにウシX a因子を阻害し
ないヒルジンとは異なる。
スの唾液由来の新規抗凝血因子に関する。この因子は、
ウシX a因子を特異的に阻害するが、トロンビンを阻害
しない。上記唾液中の主抗凝血因子は、トロンビンを阻
害するが、下記で明らかなようにウシX a因子を阻害し
ないヒルジンとは異なる。
本発明の対象の新規画分のもう１つの重要な特性は、
それが穏やかなインヒビターであることであって、ヒル
ジンと対照的であり、しかも抗トロンビン作用を促進し
現在治療に用いられているヘパリンとも対照的である。
単離された因子のこの性質は調節作用（modulating cat
ion）と呼ばれ、更に制御可能な又は更に穏やかな血液
凝固阻害が望まれる場合において治療用の可能性を開く
であろう。この新規因子が血液凝固の穏やかなインヒビ
ター又はモジュレーターであるということは、それがヘ
パリン及び抗トロンビンにより誘導されるウシX a因子
の不活性を減速しうるということを意味する。
それが穏やかなインヒビターであることであって、ヒル
ジンと対照的であり、しかも抗トロンビン作用を促進し
現在治療に用いられているヘパリンとも対照的である。
単離された因子のこの性質は調節作用（modulating cat
ion）と呼ばれ、更に制御可能な又は更に穏やかな血液
凝固阻害が望まれる場合において治療用の可能性を開く
であろう。この新規因子が血液凝固の穏やかなインヒビ
ター又はモジュレーターであるということは、それがヘ
パリン及び抗トロンビンにより誘導されるウシX a因子
の不活性を減速しうるということを意味する。
この新規因子が本質的にヒルジンと異なるという立証
は、過剰のウシトロンビンで処理された蛭唾液が適切な
基質に対するウシX a因子の作用を阻害しかつ補足的チ
ェックとして過剰のウシX a因子で処理された唾液がウ
シトロンビンを阻害することを意味するが、その場合に
ヒルジンの作用はトロンビンに特異的である。
は、過剰のウシトロンビンで処理された蛭唾液が適切な
基質に対するウシX a因子の作用を阻害しかつ補足的チ
ェックとして過剰のウシX a因子で処理された唾液がウ
シトロンビンを阻害することを意味するが、その場合に
ヒルジンの作用はトロンビンに特異的である。
新規因子の単離は同様の原理に基づいており、即ち適
切に固定されたウシX a因子へのその吸着及びしかる後
の溶出からなる。更に詳しくは、適切な吸着剤はX a因
子で平衡化されたアフィゲル（Affi−Gel）であり、溶
出液としてはpH約2.9の弱酸が適切である。物質は塩酸
で溶出されるが、但し高酸性で急速に分解される。酢酸
が更に適している。本発明の抗凝血因子の分子量は、10
〜30kDである。この物質はカットオフ点（cut−off poi
nt）30kDの限外フィルターを通過し、カットオフ点10kD
の限外ファルターに実質上留まるからである。
切に固定されたウシX a因子へのその吸着及びしかる後
の溶出からなる。更に詳しくは、適切な吸着剤はX a因
子で平衡化されたアフィゲル（Affi−Gel）であり、溶
出液としてはpH約2.9の弱酸が適切である。物質は塩酸
で溶出されるが、但し高酸性で急速に分解される。酢酸
が更に適している。本発明の抗凝血因子の分子量は、10
〜30kDである。この物質はカットオフ点（cut−off poi
nt）30kDの限外フィルターを通過し、カットオフ点10kD
の限外ファルターに実質上留まるからである。
本方法によれば、pNA（ｐ−ニトロアニリド）のよう
な発色原性末端基を有する合成基質が用いられることが
好ましい。分光測定器法により凝血の進行を容易にモニ
ターすることができるからである。用いた気質は、特
に、Ｎ−メトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシル−Gl
y−Gly−Ｌ−Arg−pNA（CHG）〔スイスのペンタファー
ム社（Pentapharm Ltd.）及び西独のベーリンガー・マ
ンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）〕、Tos−Gly
−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA〔クロモジムTH（Chromozym T
H），各CZTH〕（スイスのペンタファーム社及び西独の
ベーリンガー・マンハイム社）及びＤ−lle−Ｌ−Pro−
Ｌ−Arg＋pNA〔Ｓ−2288,スウェーデンのカビ・ペプタ
イド・リサーチ（Kabi Peptide Research）〕（pNAはｐ
−ニトロアラニンを表す）であった。反応はコンピュー
ターに接続された分光測定器により405nmでモニターさ
れ、動力学的パラメーターがジャクソン−バノウスキー
（Jackson−Labanowski）一次回帰プログラムにより適
切な吸光係数から計算された。測定は、使い捨てポリス
チレンキュベット中pH7.8、温度25℃で行われた。パラ
メーターKm及びkcatに関する公知の値〔ロッテンバー
グ,R.（Lottenberg,R.）ら，ビオキミカ・エト・ビオフ
ィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），
第874巻,1986年，第326−335頁；ロッテンバーグ,R.
ら，前掲，第742巻,1983年，第539−557頁（ウシトロン
ビン）〕が、X a因子、トロンビン及びそれらの阻害性
の測定のために用いられた。
な発色原性末端基を有する合成基質が用いられることが
好ましい。分光測定器法により凝血の進行を容易にモニ
ターすることができるからである。用いた気質は、特
に、Ｎ−メトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシル−Gl
y−Gly−Ｌ−Arg−pNA（CHG）〔スイスのペンタファー
ム社（Pentapharm Ltd.）及び西独のベーリンガー・マ
ンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）〕、Tos−Gly
−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA〔クロモジムTH（Chromozym T
H），各CZTH〕（スイスのペンタファーム社及び西独の
ベーリンガー・マンハイム社）及びＤ−lle−Ｌ−Pro−
Ｌ−Arg＋pNA〔Ｓ−2288,スウェーデンのカビ・ペプタ
イド・リサーチ（Kabi Peptide Research）〕（pNAはｐ
−ニトロアラニンを表す）であった。反応はコンピュー
ターに接続された分光測定器により405nmでモニターさ
れ、動力学的パラメーターがジャクソン−バノウスキー
（Jackson−Labanowski）一次回帰プログラムにより適
切な吸光係数から計算された。測定は、使い捨てポリス
チレンキュベット中pH7.8、温度25℃で行われた。パラ
メーターKm及びkcatに関する公知の値〔ロッテンバー
グ,R.（Lottenberg,R.）ら，ビオキミカ・エト・ビオフ
ィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），
第874巻,1986年，第326−335頁；ロッテンバーグ,R.
ら，前掲，第742巻,1983年，第539−557頁（ウシトロン
ビン）〕が、X a因子、トロンビン及びそれらの阻害性
の測定のために用いられた。
ヘパリン及びヒルジンのような他の公知の抗凝血物質
と区別される本発明の因子対象の重要な特徴は、その用
量依存性作用様式である。天然及び更には特にトロンビ
ンで処理された双方の唾液が次第に増量しながらウシX
a因子に加えられた場合、その活性は最初急激に落ち、
しかる後漸近的に50〜60％で横ばい状態に移行する傾向
があった。この効果は、本質的にはトロンビン処理唾液
と同様である。効果は添付された第１図で図示されてい
る。既に前記された本発明の対象因子の重要な特徴は、
ヘパリン−抗トロンビンによるウシX a因子不活化速度
の減速である。第２図は、唾液の非存在及び存在下にお
けるヘパリン−抗トロンビンによるBXaの不活化の比較
プロットによってこれを示している。この現象の重要性
は、既に前記されている。
と区別される本発明の因子対象の重要な特徴は、その用
量依存性作用様式である。天然及び更には特にトロンビ
ンで処理された双方の唾液が次第に増量しながらウシX
a因子に加えられた場合、その活性は最初急激に落ち、
しかる後漸近的に50〜60％で横ばい状態に移行する傾向
があった。この効果は、本質的にはトロンビン処理唾液
と同様である。効果は添付された第１図で図示されてい
る。既に前記された本発明の対象因子の重要な特徴は、
ヘパリン−抗トロンビンによるウシX a因子不活化速度
の減速である。第２図は、唾液の非存在及び存在下にお
けるヘパリン−抗トロンビンによるBXaの不活化の比較
プロットによってこれを示している。この現象の重要性
は、既に前記されている。
本発明のインヒビター／モジュレーター（以後、XaM
と呼ばれる）は混合タイプインヒビターであって、この
ことは酵素−インヒビター複合体（EI）が基質と反応す
るか又は酵素−基質複合体（ES）がインヒビター（Ｉ）
と反応することを意味する。このことは、適切なカラム
に固定されたウシX a因子に結合されたインヒビター／
モジュレーターがX a因子に対して高アフィニティー（K
m46.9μＭ）及び低触媒速度定数（kcat0.681s-1）を有
するＤ−Phe−ピペコリル−Ｌ−Arg−pNA（S2238−カビ
・ペプチド）で溶出されないという事実により強化され
る。
と呼ばれる）は混合タイプインヒビターであって、この
ことは酵素−インヒビター複合体（EI）が基質と反応す
るか又は酵素−基質複合体（ES）がインヒビター（Ｉ）
と反応することを意味する。このことは、適切なカラム
に固定されたウシX a因子に結合されたインヒビター／
モジュレーターがX a因子に対して高アフィニティー（K
m46.9μＭ）及び低触媒速度定数（kcat0.681s-1）を有
するＤ−Phe−ピペコリル−Ｌ−Arg−pNA（S2238−カビ
・ペプチド）で溶出されないという事実により強化され
る。
本発明のインヒビター／モジュレーターは、ウシX a
因子が固定されたアフィゲルカラムへの吸着及びしかる
後酢酸での溶出によって唾液から単離される。ヒルジン
は上記ゲルに吸着されなかった。アフィゲル10が用いら
れるが、これはＮ−ヒドロキシスクシンイミドにエステ
ル化された10原子スペーサーアーム（spacer arm）を有
するように誘導された架橋アガロースである。このゲル
の能力は10μM/mlである。
因子が固定されたアフィゲルカラムへの吸着及びしかる
後酢酸での溶出によって唾液から単離される。ヒルジン
は上記ゲルに吸着されなかった。アフィゲル10が用いら
れるが、これはＮ−ヒドロキシスクシンイミドにエステ
ル化された10原子スペーサーアーム（spacer arm）を有
するように誘導された架橋アガロースである。このゲル
の能力は10μM/mlである。
本発明のインヒビター／モジュレーターを単離するた
めの一例では、下記工程を実施する。
めの一例では、下記工程を実施する。
1.カップリング：ミニカラム中の洗浄されたアフィゲル
10の1mlにpH7.5の0.05Mヘペス（Hepes）/0.1M NaCl緩
衝液中の透析されたBXa溶液（40nmol）2mlを加えた。カ
ラムは室温で２時間振盪した。次いで、上澄をカラムか
ら除去したが、これは乾燥させなかった。BXa充填物の9
4％がゲルに結合された。
10の1mlにpH7.5の0.05Mヘペス（Hepes）/0.1M NaCl緩
衝液中の透析されたBXa溶液（40nmol）2mlを加えた。カ
ラムは室温で２時間振盪した。次いで、上澄をカラムか
ら除去したが、これは乾燥させなかった。BXa充填物の9
4％がゲルに結合された。
2.残留Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基の中和:pH8のエ
タノールアミン４部及びpH7.8の0.01Mトリス（Tris）/
0.01Mへペス/0.1M NaCl/0.1％ポリエチレングリコール
緩衝液６部の混合物1mlを加えた。室温で１時間の振盪
後、同一緩衝液で３回洗浄した。
タノールアミン４部及びpH7.8の0.01Mトリス（Tris）/
0.01Mへペス/0.1M NaCl/0.1％ポリエチレングリコール
緩衝液６部の混合物1mlを加えた。室温で１時間の振盪
後、同一緩衝液で３回洗浄した。
3.XaMのアフィニティー結合：蛭唾液（40ml、XaM305pmo
l）がpH8の1Mトリス１％v/vを加えることによりpH7.9に
調節し、カラムに通した。XaMの92％がゲルに結合され
た。ヒルジンは結合されなかった。
l）がpH8の1Mトリス１％v/vを加えることによりpH7.9に
調節し、カラムに通した。XaMの92％がゲルに結合され
た。ヒルジンは結合されなかった。
4.XaMの溶出：カラムは連続1mlの0.1M酢酸（pH2.9）と
共に振盪し、溶出時1M NH4OHで中和した。結合XaMの回
収率は、72.5％（203pmol）であった。
共に振盪し、溶出時1M NH4OHで中和した。結合XaMの回
収率は、72.5％（203pmol）であった。
本発明のインヒビター／モジュレーター因子は、凝血
酵素を阻害しかつ同時に他の抗凝血物質の不活化速度を
減速して、これら２つのバランスを維持するというその
作用のおかげで、血栓塞栓症の治療に有用である。現在
最も汎用されている抗凝血物質であるヘパリンにない利
点は、ヘパリンが出血のリスクを高めかつ血小板の機能
を妨げるということである。本X aモジュレーターは、
ツジンスキー（Tuszynski）、ゲーシック（Gasic）及び
ゲーシック〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Journal of Biological Chemistry），第262
巻，第20号,1987年，第9718−23頁〕がメキシコ蛭ヘメ
ンテリア・オフィシナリス（Haementeria offcinalis）
から単離した抗転移性インヒビターの抗スタシンと強い
類似性を有している。双方のタンパク質は、分子量、X
aに対するそれらの特異性及び用量応答曲線が残留BXa活
性約50％で横ばい状態になるという事実に関して類似し
ている。しかしながら、これら２種の蛭種は分類上異な
る目に属する。ヘメンテリア及びヒルド属間の関係は下
記表で最もよく示される〔ロイ・T.ソイヤー（Roy T.Sa
wyer），“蛭生物学及び挙動（Leech Biology and Beha
viour），第２巻",オックスフォード・サイエンス・パ
ブリケーションズ,1986年〕： 網：ヒルジネア（Hirudinea） 目：リンコブデリダ アリンコブデリダ （Rynchobdellida） （Arynchobdellida） （突出物） （咽頭、無吻、有又は無顎） 科：グロッシフォニイダエ ヒルジニダエ （Glossiphoniidae） （Hirudiniidae） （有顎） 属：ヘメンテリア ヒルド （Heamenteria） （Hirudo） 上記の異なる目に属する蛭由来のタンパク質は、同一
性及び性質の双方において異なる。
酵素を阻害しかつ同時に他の抗凝血物質の不活化速度を
減速して、これら２つのバランスを維持するというその
作用のおかげで、血栓塞栓症の治療に有用である。現在
最も汎用されている抗凝血物質であるヘパリンにない利
点は、ヘパリンが出血のリスクを高めかつ血小板の機能
を妨げるということである。本X aモジュレーターは、
ツジンスキー（Tuszynski）、ゲーシック（Gasic）及び
ゲーシック〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Journal of Biological Chemistry），第262
巻，第20号,1987年，第9718−23頁〕がメキシコ蛭ヘメ
ンテリア・オフィシナリス（Haementeria offcinalis）
から単離した抗転移性インヒビターの抗スタシンと強い
類似性を有している。双方のタンパク質は、分子量、X
aに対するそれらの特異性及び用量応答曲線が残留BXa活
性約50％で横ばい状態になるという事実に関して類似し
ている。しかしながら、これら２種の蛭種は分類上異な
る目に属する。ヘメンテリア及びヒルド属間の関係は下
記表で最もよく示される〔ロイ・T.ソイヤー（Roy T.Sa
wyer），“蛭生物学及び挙動（Leech Biology and Beha
viour），第２巻",オックスフォード・サイエンス・パ
ブリケーションズ,1986年〕： 網：ヒルジネア（Hirudinea） 目：リンコブデリダ アリンコブデリダ （Rynchobdellida） （Arynchobdellida） （突出物） （咽頭、無吻、有又は無顎） 科：グロッシフォニイダエ ヒルジニダエ （Glossiphoniidae） （Hirudiniidae） （有顎） 属：ヘメンテリア ヒルド （Heamenteria） （Hirudo） 上記の異なる目に属する蛭由来のタンパク質は、同一
性及び性質の双方において異なる。
本発明は、適切な薬学上許容される担体又は希釈剤と
共に活性成分として本発明の抗凝血／モジュレーター因
子を含む医薬組成物にも関する。更に詳しくは、本発明
の医薬組成物は、血液凝固改善用である。更に一層詳し
くは、本発明の医薬組成物は、血栓塞栓症に伴う血液凝
固改善用である。
共に活性成分として本発明の抗凝血／モジュレーター因
子を含む医薬組成物にも関する。更に詳しくは、本発明
の医薬組成物は、血液凝固改善用である。更に一層詳し
くは、本発明の医薬組成物は、血栓塞栓症に伴う血液凝
固改善用である。
本発明の製剤は、所望の慣用的な無毒性の薬学上許容
される担体、希釈剤、アジュバント及びビヒクルを含む
投薬単位処方剤として経口又は非経口投与される。本明
細書で用いられる“非経口”という用語は、皮下、静脈
内、間接内及び鞘内注射並びにインフュージョン技術を
含む。投薬単位製剤は、本発明の精製組成物の１日所要
量又は所望用量とするためその分割量を含有している。
いずれの個々の患者の具体的治療有効量レベルも、用い
られる活性物質、年齢、体重、一般的健康度、性別、食
事、投与時間、投与経路、排出速度等を含めた様々なフ
ァクターに依存している。
される担体、希釈剤、アジュバント及びビヒクルを含む
投薬単位処方剤として経口又は非経口投与される。本明
細書で用いられる“非経口”という用語は、皮下、静脈
内、間接内及び鞘内注射並びにインフュージョン技術を
含む。投薬単位製剤は、本発明の精製組成物の１日所要
量又は所望用量とするためその分割量を含有している。
いずれの個々の患者の具体的治療有効量レベルも、用い
られる活性物質、年齢、体重、一般的健康度、性別、食
事、投与時間、投与経路、排出速度等を含めた様々なフ
ァクターに依存している。
本明細書で用いられる“薬学上許容される担体”とい
う用語は、本発明の活性成分と反応しない不活性の無毒
性固体もしくは液体フィラー、希釈剤又はカプセル化用
物質を意味する。これらの担体は、当業者に公知であ
る。保湿剤及び乳化剤、並びに放出剤、コーティング剤
及び保存剤が、本発明の製剤中に存在していてもよい。
単一投薬形を得るために担体物質と混合される活性成分
の量は、治療される患者及び具体的投与方式に応じて変
動する。
う用語は、本発明の活性成分と反応しない不活性の無毒
性固体もしくは液体フィラー、希釈剤又はカプセル化用
物質を意味する。これらの担体は、当業者に公知であ
る。保湿剤及び乳化剤、並びに放出剤、コーティング剤
及び保存剤が、本発明の製剤中に存在していてもよい。
単一投薬形を得るために担体物質と混合される活性成分
の量は、治療される患者及び具体的投与方式に応じて変
動する。
上記医薬製剤のいずれかを患者に投与することによ
る、更に詳しくは血栓塞栓症に伴う血液凝固を改善しか
つ上記病状を治療及び予防する方法も、本発明により提
供される。
る、更に詳しくは血栓塞栓症に伴う血液凝固を改善しか
つ上記病状を治療及び予防する方法も、本発明により提
供される。
第１図は、天然及びトロンビン処理唾液によるウシX a
因子活性の阻害を示すグラフである。 第２図は、唾液の非存在及び存在下におけるヘパリン−
抗トロンビンによるウシX a因子不活化の経時的変化を
示すグラフである。
因子活性の阻害を示すグラフである。 第２図は、唾液の非存在及び存在下におけるヘパリン−
抗トロンビンによるウシX a因子不活化の経時的変化を
示すグラフである。
フロントページの続き (73)特許権者 999999999 アメリカン、ナショナル、レッド、クロ ス アメリカ合衆国ワシントン、ディーシ ー、セブンティーンス、アンド、ディ ー、ストリーツ、エヌダブリュ （番地 なし) (72)発明者 メイア、リグビ イスラエル国イエルサレム、ハバロン、 ハーシュ、ストリート、18 (72)発明者 クレイグ、ジャクソン アメリカ合衆国ミシガン州、グロス、ポ イント、ファームズ、オルブルック、レ ーン、22 (56)参考文献 特開 昭63−146900（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−138300（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，1987，Ｖｏｌ．262，Ｎｏ．20，ｐ. 9718−9723
Claims (3)
- 【請求項１】ヒルド・メディシナリス（Hirudo medicin
alis）の蛭X a因子インヒビターであって、（１）該イ
ンヒビターをウシX a因子が固定されているアフィゲル
（Affi−Gel）カラムにpH7.9で結合させ、（２）該イン
ヒビターをpH2.9の0.1M酢酸でカラムから溶出し、
（３）を溶出液を1M NH4OHで中和することによって単
離することができるインヒビターであり、上記インヒビ
ターがウシX a因子を特異的に阻害するがウシトロンビ
ンを阻害せず、10〜30kDの範囲の分子量を有し、かつ固
定化されたウシX a因子を含む適切なカラムで吸着され
る場合に、Ｄ−phe−ピペコリル−Ｌ−Arg−pNAで溶出
されない混合タイプのインヒビターであるインヒビタ
ー。 - 【請求項２】活性成分として請求項１に記載されたイン
ヒビター及び薬学上許容される担体を含む、血液凝固改
善用医薬組成物。 - 【請求項３】活性成分として請求項１に記載されたイン
ヒビター及び薬学上許容される担体を含む、血栓塞栓症
治療における血液凝固改善用医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL86856 | 1988-06-24 | ||
| IL86856A IL86856A0 (en) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | Bovine xa factor and pharmaceutical compositions containing the same |
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