CN110945020A

CN110945020A - 重组蛋白及其片段、生产所述重组蛋白的方法、合成基因以及重组蛋白的用途

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Publication number: CN110945020A
Application number: CN201880033430.XA
Authority: CN
Inventors: A·M·储德金斯基-塔瓦希; M·B·戈德费得; A·伊克巴尔
Original assignee: Fundacao Butantan
Current assignee: Fundacao Butantan
Priority date: 2017-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: JP2020511164A; AU2018240836A1; BR112018071701B1; BR102017005783A2; AU2018240836B2; EP3604329A1; EP3604329A4; BR112018071701A2; CN110945020B; US20230151079A1; AU2018240836B9; WO2018170568A1

Abstract

本发明属于生物化学、分子生物学、遗传学、药学和药物化学领域，与生物化学和代谢过程有关。更具体地，本发明提供了在蜱的唾液腺的转录组学分析中鉴定出的抑制凝血酶的一类新型蛋白，具体地是来自sculptin的修饰的直接的凝血酶抑制剂，以及其片段和重组蛋白，其可以用作抗凝剂和用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病。

Description

重组蛋白及其片段、生产所述重组蛋白的方法、合成基因以及重组蛋白的用途

技术领域

本发明描述了一种新型的凝血酶抑制剂蛋白，特别是凝血酶的直接抑制剂，以及其可以用作抗凝血剂的片段和重组蛋白。本发明属于生物化学、分子生物学、遗传学、药学、药物化学领域，与生物化学和代谢过程有关。

背景技术

凝血酶是在凝血级联反应中具有主要功能的多功能酶。其功能调节会导致正常的血液凝固或病症，如血栓形成。因此，识别新的强且特异性的凝血酶抑制剂非常重要。

血液凝固是一个动态过程，其涉及酶原级联反应，导致酶的下游激活。在正常情况下，它会导致体内平衡。血栓出血平衡在体内通过复杂而有争议的机制而被保持是至关重要的。然而，其失调可能导致出血或血栓形成。凝血酶是一种37kDa的异质二聚体，是凝血级联反应中的核心酶。凝血酶是一种多功能酶，通过纤维蛋白原裂解作用作为促凝剂，激活凝血因子类(V、VIII、XI和XIII)并诱导血小板凝集。另一方面，凝血酶可以通过血栓调节蛋白的结合作为抗凝剂并激活蛋白C。此外，它在动脉和静脉血栓形成、弥散性血管内凝血(DIC)、癌症、炎性脑病、伤口愈合和动脉粥样硬化中起着至关重要的作用。为了克服其有害作用，可以通过阻断凝血酶的三个结构域(即活性位点和外部位点1 和2)中的一个或两个直接或间接抑制该凝血酶。传统上，未分级肝素 (UFH)和低分子量肝素(LMWH)已被用作抗凝血剂，其通过同时与抗凝血酶和凝血酶的外部位点2连接来间接抑制凝血酶。但是，肝素(UFH和LMWH)会产生血纤蛋白-凝血酶桥并增加血栓形成，并可能引起肝素诱导的血小板减少。直接凝血酶抑制剂(DTI)是不需要辅助因子的一组抗凝剂，它们直接与凝血酶的活性位点结合并阻断其活性。 DTI比间接抑制剂具有优势，因为DTI是更加可预测的抗凝剂，因为它们没有抗血小板的作用，并且它们不会导致免疫介导的血小板减少。包括重组水蛭素(hirudin)及其水蛭肽(hirulog)的几种DTI被批准为用作抗凝剂。水蛭素是一种65个氨基酸的多肽(7kDa)，是一种直接的凝血酶抑制剂，首先是从药用水蛭(Hirudo medicinalis)的唾液中分离出来的。接下来，产生了重组水蛭素形式，由于没有被硫酸化的Tyr残基，其不同于天然水蛭素。这种差异稍微降低了重组水蛭素的活性。但是，重组水蛭素对凝血酶的抑制是不可逆的，并会产生抗水蛭素抗体，从而导致药物累积。当前，没有用于逆转重组水蛭素后果的解毒剂。此外，还开发了几种合成的水蛭肽并对其凝血酶的抑制剂活性进行了测试，但这些抑制剂的活性几乎是重组水蛭素的1/800。在所有水蛭肽中，比伐卢定(bivalirudin)是一种FDA批准的抗凝剂，是直接的凝血酶抑制剂，但半衰期短。几乎所有此类抗凝剂都涉及副作用，例如水蛭素- 凝血酶复合物的不可逆形成，水蛭肽的半衰期短，应密切监测其剂量。大多数此类凝血酶抑制剂来自蛭类，并且已被广泛研究。另一方面，来自蜱的凝血酶特异性抑制剂被完全遗忘，尽管已经对Kunitz型抑制剂进行了详细研究。

由于这些事实，令人感兴趣的是开发可以用作抗凝血剂的一类新型直接的凝血酶抑制剂及其片段和重组蛋白。

在科学和专利文献中的现有技术的检索中，发现了以下接近该主题的文件：

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因此，从检索到的文献中得出的结论是，没有文件预示或暗示本发明的教导，从而使得本文提出的解决方案相对于现有技术具有新颖性和创造性。

本文提出的解决方案解决了缺乏克服抗血栓治疗的局限性或用于治疗或预防血栓栓塞性疾病的替代方法的问题。

发明内容

因此，本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，通过开发具有抗血栓形成特性或用于治疗或预防血栓栓塞性疾病的新型蛋白和/或其片段，起着直接并特异性抑制凝血酶的作用。

表达载体中使用的核苷酸序列与天然发现的序列不同。通过分析蜱 (tick)唾液腺的cDNA文库已鉴定出氨基酸序列，但是，还进行了密码子优化、限制性位点和组氨酸尾的添加，以纯化表达载体中使用的核苷酸序列，这使得能够开发利用细菌大肠杆菌(E.coli)大规模获得重组蛋白(最初存在于蜱唾液腺中的sculptin的修饰物)的方法，并且在所有研究中仅使用了这种重组蛋白。

这样获得的分子以竞争的方式选择性地抑制凝血酶。它被凝血酶和 Xa因子缓慢裂解。基于质谱和埃德曼(Edman)分析，提出了凝血酶活性位点的结合肽，与药用水蛭中的经典水蛭素相比，仅具有很少的保守残基，但具有相同的强度。收集的数据得出结论，该分子具有成为抗血栓形成药物的潜力，并可能与经典水蛭素及其类似物竞争。

本发明的第一个目的是重组蛋白，其包含与以下序列具有至少60％的同一性的一个序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。SEQ IDNO：1与重组蛋白有关，而SEQ ID NO：2至16 与其片段有关。在一个实施方案中，重组蛋白包含具有以下序列的一个序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、 SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

本发明的第二个目的是一种方法，该方法用于从蜱卡延钝眼蜱 (Amblyomacajennense)的唾液腺cDNA中获得所述重组蛋白和/或其片段。

本发明的第三个目的是合成基因，其包含与SEQ ID NO：17具有至少60％的同一性的一个序列。在一个实施方案中，合成基因包含具有SEQ ID NO：17的一个序列。

在第四个目的中，本发明提供了sculptin或重组蛋白在制备用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病的药物或药物组合物中的用途。

在第五个目的中，本发明提供了sculptin或重组蛋白在预防或治疗血栓栓塞性疾病中或作为直接和特异性的凝血酶抑制剂的用途。

在第六个目的中，本发明提供了包含本发明中描述的合成基因的表达载体、基因构建体或质粒。

在第七个目的中，本发明提供了一种治疗或预防血栓栓塞性疾病的方法，该方法包括施用有效剂量的本发明的sculptin或重组蛋白和/或其片段。

本领域技术人员和对该领域感兴趣的公司将迅速意识到本发明的这些和其他目的，并且将在下面的描述中足够再现的详细程度描述这些和其他目的。

附图说明

图1示出了sculptin的系统发育分析。从数据库Swiss-Prot/TrEMBL(www.uniprot.org)中检索蜱和水蛭的凝血酶抑制剂的蛋白序列，并使用嵌入MEGA 7.0的邻接(Neighbor-Joining)法确定系统发育谱。 Bootstrap一致性为100，密集树(condensedtree)的阈值为损坏的 Bootstrap的60％复制(请参阅实验过程)。给予每个序列的访问号，查询位置以红色突出显示。在系统发育构建过程中考虑了sculptin的单个结构域。

图2示出了重组蛋白对凝血酶的特异性及其剂量依赖性、以及抑制凝血酶的IC₅₀。(A)通过重组蛋白抑制丝氨酸蛋白酶。将丝氨酸蛋白酶 (100pM；凝血酶、纤溶酶、胰蛋白酶或Xa因子)与重组蛋白(1、100和200nM)在含有150mM NaCl和0.1％PEG 6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中于37℃孵育6小时。在添加对应于反应混合物的生色底物之后，在405nm下监测其水解。对于Xa因子的活性，缓冲液中含有50μM磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱。(A)中所示的图示出了用于实验的纯化重组蛋白(SEQ ID NO：1)的SDS-PAGE。(B)在含有150mMNaCl和0.1％PEG 6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 中，在不存在(迹线a)或存在重组蛋白(迹线b，15pM；迹线c，30 pM；迹线d，60pM；迹线e，100pM)下，于37℃，由0.1nM凝血酶水解生色底物S-2238(15μM)的典型曲线。(C)在增加浓度的重组蛋白存在下凝血酶的残留活性。(D)重组蛋白对凝血酶抑制的剂量-响应曲线。将凝血酶抑制的百分比相对于重组蛋白的浓度记录作图。(C) 和(D)的实验条件与(B)相同。

图3示出了重组蛋白对凝血酶的抑制动力学。(A)在含有150mM NaCl和0.1％PEG6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，在不存在(迹线a)或存在重组蛋白(迹线b，20pM；迹线c，40pM；迹线 d，60pM；迹线e，80pM)下，于37℃，由0.1nM凝血酶水解生色底物S-2238的典型进度曲线。通过向包含重组蛋白和S-2238的混合物中添加凝血酶来开始反应。(B)使用等式(1)的重组蛋白对凝血酶抑制的Lineweaver–Burk图。在不同底物浓度下，在不存在(迹线a)和存在重组蛋白(迹线b，20pM；迹线c，40pM和迹线d，60pM)的情况下，凝血酶抑制的初始速度的倒数。(C)将从(B)获得的表观Km 相对于各自的浓度作图，用于获得Ki。(D)使用等式(2)的竞争性抑制的非线性回归。在不同底物浓度下，在不存在(迹线a)和存在重组蛋白(迹线b，20pM；迹线c，40pM；迹线d，60pM和迹线e，80pM) 的情况下，凝血酶抑制的初始速度。(B)、(C)和(D)的实验条件与 (A)相同。

图4示出了表观一级速率与重组蛋白的紧密结合抑制剂的浓度之间的关系。(A)在含有150mM NaCl和0.1％PEG 6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，在不存在(迹线a)和存在重组蛋白(迹线b， 10pM；迹线c，30pM；迹线d，70pM；迹线e,100pM；迹线f，200 pM和迹线g，500pM)下，于37℃，由0.1nM凝血酶水解生色底物 15μM S-2238的典型进度曲线。通过向含有重组蛋白和S-2238的混合物中添加凝血酶开始反应。(B)凝血酶相对于重组蛋白浓度的平衡速率。(C)解离速率常数的计算。使用非线性回归拟合来计算表观一级速率的常数，其中截距和斜率分别为kon和koff。(B)和(C)的实验条件与(A)相同。

图5示出了丝氨酸蛋白酶对重组蛋白的降解及其对凝血酶抑制的活性。在含有150mM NaCl和0.1％的PEG 6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，在具有或不具有1μM丝氨酸蛋白酶(凝血酶、纤溶酶、胰蛋白酶或Xa因子)下，于37℃，将重组蛋白(10μM)孵育4、 6、7或18小时。通过SDS-PAGE分离反应混合物(20μl)。(A)孵育 6小时后，丝氨酸蛋白酶水解重组蛋白的SDS-PAGE(15％)。(B)与丝氨酸蛋白酶一起孵育6小时后重组蛋白对凝血酶抑制的百分比(参见实验步骤)。(C)孵育18小时后，由丝氨酸蛋白酶水解重组蛋白的 SDS-PAGE(15％)。(D)与丝氨酸蛋白酶一起孵育18小时后重组蛋白对凝血酶抑制的百分比(参见实验步骤)。(B)和(D)的编号分别对应于(A)和(C)的编号，并且重组蛋白对照由CTRL表示。重组蛋白(泳道1)；凝血酶(泳道2)以及凝血酶和重组蛋白(泳道3)；纤溶酶(泳道4)以及纤溶酶和重组蛋白(泳道5)；胰蛋白酶(泳道6) 以及胰蛋白酶和重组蛋白(泳道7)；Xa因子(泳道8)以及Xa因子和重组蛋白(泳道9)、以及蛋白质标记(泳道10；在A中)。(E)在孵育7小时后鉴定重组蛋白中凝血酶的切割位点。(F)在孵育4小时后鉴定重组蛋白中Xa因子的切割位点。重组蛋白序列中凝血酶和Xa因子的切割位点示于图S1和S2。(C)、(D)、(E)和(F)的实验步骤与(A) 和(B)相同，不同之处在于孵育时间和所用丝氨酸蛋白酶的类型。

图6示出了由Xa因子产生的重组蛋白片段的凝血酶抑制活性。在含150mM NaCl、50μM磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，在具有或不具有1μM Xa因子下，于37℃孵育重组蛋白(10μM)18小时。(A)通过反相HPLC柱C-18分离反应混合物。(B)对聚集的峰(H1-H5)进行MALDI-TOF MS和凝血酶抑制测试(相应的肽序列，参见表1)。(C)在含有150mM的NaCl和0.1％的PEG 6000的50mM缓冲液(pH 7.4)，在不存在(迹线对照)和存在100pM重组蛋白片段(迹线H1和H3)或完整的重组蛋白(迹线 Scpt)的情况下，于37℃，由0.1nM凝血酶水解15μM生色底物S-2238 的典型进度曲线。(D)重组蛋白及其片段对凝血酶的抑制作用的百分比。从(C)获得凝血酶抑制的百分比的反应条件。

图7示出了结合凝血酶的重组蛋白和水蛭素的代表性设计(实心条)。棕色和青色分别代表凝血酶的重链和轻链。(A)与凝血酶结合的绿色表示的重组蛋白，(B)与凝血酶结合的蓝色表示的水蛭素。来自抑制剂的残基赖氨酸(lys)显示为黄色，来自凝血酶活性位点的Ser195 残基显示为红色。

图8示出了蛋白质序列的分析。(A)从sculptin修饰的重组蛋白序列，其是通过对蜱唾液腺的转录组分析鉴定的。假定的肽信号带有下划线。灰色和黄色交替显示重组蛋白内的四个肽重复。(B)重组蛋白与来自卡延钝眼蜱(Amblyomma cajennense)、具尾扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)和药用水蛭(Hirudo medicinalis)的水蛭素的多重比对。保守的残基以灰色突出显示。来自药用水蛭的水蛭素的PKP结合的活性位点被修饰为sculptin的PKM。Xa因子和凝血酶的切割位点分别通过星号和井号标记来标识。

图9示出重组蛋白的表达和纯化。将重组蛋白的合成基因克隆到表达载体pET28a中，并在37℃在液体培养基中的大肠杆菌BL21(DE3) 中表达重组蛋白。通过SDS-PAGE(15％)分析了未诱导培养或诱导培养(IPTG 0.5mM)的全细胞裂解物。(A)重组蛋白的诱导SDS-PAGE。泳道M、NI和I分别代表非IPTG诱导的蛋白质标记。(B)重组蛋白表达后来自大肠杆菌的细胞裂解物的SDS-PAGE。泳道M、TE、IN、 SO分别对应于蛋白标记物、全提取物、不溶级分和可溶级分。(C)通过亲和色谱法纯化重组蛋白。通过0.45μm膜过滤可溶级分，并将其应用于His标签的Ni螯合亲和柱中。用咪唑洗脱结合的蛋白质，并通过 SDS-PAGE分析15μl每个级分。(D)来自亲和色谱法级分的 SDS-PAGE。泳道TE、E、M和U分别代表全提取物、洗脱的蛋白级分、蛋白标记物和非结合的蛋白级分。(E)通过离子交换色谱法纯化重组蛋白。插入的图像显示了来自纯化的重组蛋白条带的SDS-PAGE。

图10示出了重组蛋白(凝血酶特异性抑制剂)的纯化。(A)使用常规色谱方法的来自纯化的重组蛋白的SDS-PAGE(参见实验步骤和图 S2)。(B)来自纯化的重组蛋白的MALDI-TOF MS谱。

图11示出了在与不同浓度的重组蛋白一起孵育的分离的人血浆中的APTT、PT和TT的体外评估。从健康人类志愿者的血液中获取血浆，并与不同浓度的重组蛋白一起孵育。如在实验步骤那样确定APTT、PT 和TT。(A)活化部分凝血活酶时间(B)凝血酶原时间和(C)凝血酶时间。对照指血浆，盐水指血浆和盐水。

具体实施方式

在此，将描述一类新型的凝血酶抑制剂，特别是直接和特异性的凝血酶抑制剂，其是由在蜱唾液腺的转录组分析中鉴定的sculptin修饰而成的。它由168个残基组成，具有四个完全相似的重复序列，并呈现出与经典水蛭素的进化差异。重组蛋白是竞争性的、特异性的且可逆的凝血酶抑制剂，K为18.5±2.2pM。它会被凝血酶缓慢消化，并失去其抑制活性。因此，重组蛋白被Xa因子水解，并且每个多肽片段能够以独立的方式抑制凝血酶。重组蛋白的一个单一结构域仅保留约45％的抑制活性，已提出以二价方式与凝血酶结合。通过结合来自重组蛋白结构域的活性位点的残基形成类似于螺旋/小转角的结构，会使其成为与水蛭肽相比效力最高的凝血酶抑制剂。另外，重组蛋白通过其外在和内在的代谢途径延长了凝血。连同数据一起考虑，人们认为，重组蛋白及其独立结构域具有成为治疗性抗血栓形成化合物或对血栓栓塞性疾病进行新颖治疗的强大潜力。

本发明具有与其几个目的共有的发明构思，即凝血酶抑制剂，特别是直接的凝血酶抑制剂及其片段。

在第一目的中，本发明示出了一种重组蛋白，其包含与以下序列具有至少60％的同一性的一个序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。在一个实施方案中，重组蛋白包含与以下序列具有至少70％、更优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的同一性的一个序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16 或它们的组合。

在一个实施方案中，重组蛋白由与以下序列具有至少60％的同一性的一个序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。在一个实施方案中，重组蛋白由与以下序列具有至少70％、更优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的同一性的一个序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16或它们的组合。

在一个实施方案中，重组蛋白包含具有以下序列的一个序列：SEQ ID NO:1或SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

在一个实施方案中，重组蛋白由具有以下序列的序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

本发明的第二目的是一种方法，该方法用于从蜱卡延钝眼蜱的唾液腺cDNA中获得所述重组蛋白和/或其片段。

在第三目的中，本发明示出了一种包含与SEQ ID NO：17具有至少60％的同一性的一个序列的合成基因。在一个实施方案中，合成基因包含与SEQ ID NO：17具有至少70％、更优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的同一性的一个序列。

在一个实施方案中，合成基因由与SEQ ID NO：17具有至少60％的同一性的一个序列组成。在一个实施方案中，合成基因由与SEQ ID NO：17具有至少70％、更优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的同一性的一个序列组成。

在一个实施方案中，合成基因包含具有SEQ ID NO：17的一个序列。

在一个实施方案中，合成基因由具有SEQ ID NO：17的一个序列组成。

在第四目的中，本发明示出了sculptin或重组蛋白在制备用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病的药物或药物组合物中的用途。

在第五目的中，本发明示出了sculptin或重组蛋白在预防和/或治疗血栓栓塞性疾病和/或作为直接和特异性的凝血酶抑制剂中的用途。

在第六目的中，本发明示出了包含本发明中描述的合成基因的表达载体、基因构建体或质粒。

在第七目的中，本发明示出了用于治疗和/或预防血栓栓塞性疾病的方法，该方法包括施用有效剂量的本发明的sculptin或重组蛋白和/ 或其片段。

在本发明的上下文中，“血栓栓塞性疾病”可以理解为与局部形成的血块或全身循环中递送的血栓引起的血管、动脉或静脉的凝结或阻塞有关的疾病，例如，血栓形成、心脏病发作、中风、心绞痛(包括不稳定型心绞痛)、血管成形术或冠状动脉搭桥术后的再闭塞和再狭窄、外周动脉闭塞性疾病、短暂性缺血发作、肺栓塞、深静脉血栓形成或弥散性血管内凝血(DIC)。

因此，本发明在健康相关领域做出了贡献，公开了新型凝血酶抑制剂，特别是高度明确的可用于治疗或预防血栓栓塞性疾病的直接和特异性的凝血酶抑制剂。

实施例-实施方案

本文中所示的实施例仅仅旨在示出实施本发明的几种方式中的一种，而绝不限制其范围。

通过对来自蜱Amblyoma cajennense(目前为Amblyoma sculptum) 的唾液腺的cDNA文库的分析鉴定了sculptin的氨基酸序列。

根据文库中鉴定的氨基酸序列，使用来自大肠杆菌的密码子使用表通过软件BLAST-X(NCBI)进行反向翻译，从而得到用于重组蛋白的编码DNA序列，从而用于异源系统(大肠杆菌BL21(DE3)中的蛋白质表达。

根据sculptin的编码核苷酸序列，设计了合成基因(在SEQ ID NO： 17中描述)，其在5'末端掺入了限制性内切酶NcoI的切割位点以及并在3'末端掺入组氨酸尾(HIS6)的编码序列和限制性内切酶XhoI的切割位点。接下来，将合成基因序列发送给GenOne

em Biotecnologia公司(里约热内卢，巴西)，通过专有算法进行密码子优化，基因合成并克隆到大肠杆菌的表达载体pET-28a中(Novagen，Merck Biosciences，Dramstadt，德国)。

由GenOne公司合成和提供的质粒用于通过氯化钙的方法转化大肠杆菌菌株OneShot BL21(DE3)(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。

将10ng质粒pET28a-Sculptin在冰中与50μL感受态细胞悬浮液 BL21(DE3)孵育30分钟。接下来，通过在42℃孵育30分钟使细胞经受热休克，然后在冰中孵育10分钟。之后，添加1mL的LB培养基，并将悬浮液在37℃孵育1小时。

之后，将细胞铺板在含有100μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基中，并将板在37℃孵育过夜。第二天，分离菌落，并用于接种到含有 100μg/mL氨苄青霉素的10mL LB培养基中，37℃过夜。第二天，将 50％的甘油加入培养物中，将悬浮液分配在试管中，每管含有1mL悬浮液，并将其在-80℃冷冻，从而得到主种子批。

重组蛋白在大肠杆菌中表达的实验总是从一瓶种子批开始，接种在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，并保持在37℃以240rpm 搅拌过夜，其组成预接种物。

第二天，以1体积的预接种物比100体积的培养基的比例，将足够量的预接种物用于接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。将培养物保持在37℃，并以240rpm搅拌约2小时，直至达到0.5-0.6 的光密度(OD600)。当达到这样的光密度时，以1mM的终浓度添加 IPTG诱导剂，并且将培养物再次在37℃孵育4小时。

孵育后，通过以6000rpm离心30分钟来收获细胞，并且当离心结束时，丢弃上清液。将细胞以每1mL溶液比8g湿细胞质量的比例重悬于NaCl盐水溶液(150mM)中(从这一步骤开始，在所有过程中，对于每8克湿质量使用1mL冰溶液的比例)。如上再次将细胞离心并重悬于裂解缓冲液中。将溶菌酶以终浓度0.25mg/mL添加到悬浮液中，以用于每个细胞壁破碎，并在37℃以80rpm搅拌保持孵育30分钟。接下来，以70％的强度对悬浮液进行4次超声循环，以用于细胞破碎和基因组DNA的片段化。

将悬浮液在16000rpm(4℃)离心1小时，以将不溶材料与可溶材料分离。

重组蛋白(SEQ ID NO：1)在细菌细胞质中表达，因此，可溶级分用于通过亲和色谱法，使用色谱系统AKTA AVANT(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州，美国)和HisTrap FF柱纯化包含组氨酸尾的蛋白质。将可溶材料应用于柱中，从而固定重组蛋白。随后，用10CV(柱体积)的裂解缓冲液进行洗涤。通过线性梯度(10CV)从零到100％的缓冲液B进行蛋白质洗脱。将收获的含有部分纯化的蛋白质的级分在脱盐柱(HiPrep 26/10)中进行缓冲液交换，并通过使用与上述相同的洗涤和线性梯度洗脱步骤，在CaptoQ柱中进行离子交换色谱法，从而进行重组蛋白的第二纯化步骤。将包含纯化蛋白的级分合并在池中，并通过脱盐柱(HiPrep 26/10)将缓冲液交换为PBS缓冲液。

通过这种方法获得的纯形式的重组蛋白(SEQ ID NO：1)用于本文所述的所有实验中。

Sculptin序列和系统发育的分析

在来自卡延钝眼蜱的唾液腺的转录组谱中鉴定出了sculptin序列。 sculptin是一种168个氨基酸的多肽，由一个单一的肽和四个完全相似的34个氨基酸的重复序列组成(图8A)。来自药用水蛭的经典水蛭素的多重比对仅显示出很少的相似性，甚至与凝血酶活性位点结合的残基也不保守。从单个sculptin重复序列的结构域到其他丝氨酸蛋白酶抑制剂的系统发育分析表明，它与水蛭水蛭素的变体具有相同的祖先，但进化时间不同。实际上，在进化树中，sculptin比来自水蛭的经典水蛭素更接近于安替斯塔辛(antistassin)家族(即hirustasin、guamerin、 bdellastasin、theromin和therostasin)的丝氨酸蛋白酶抑制剂。正如预期的那样，sculptin属于与来自蜱水蛭素的那些相似的同一序列家族(图 1)。

重组蛋白的纯化

将不具有信号肽并且具有一个C-末端多组氨酸尾的重组蛋白的合成构建体克隆到表达载体pET28a中。重组蛋白表达良好，主要存在于可溶级分中(图9)。重组蛋白通过常规的亲和和离子交换色谱法纯化 (图9)。质谱分析表明纯化形式的重组蛋白(SEQ ID NO：1)的质量为16990.90Da，但是在SDS-PAGE中，其刚好位于20kDa的标记条带之上(图10A和图10B)。纯化的重组蛋白用于其他实验(图2A中插入的图像)。

重组蛋白是凝血酶特异性抑制剂

进行的第一个实验是重组蛋白对丝氨酸蛋白酶的抑制作用的测试。为此，选择了凝血酶、胰蛋白酶、纤溶酶和Xa因子。在存在和不存在重组蛋白的情况下，通过分光光度计的方式监测了丝氨酸蛋白酶对生色底物的水解。浓度为1nM的重组蛋白降低约97％的凝血酶的残留活性 (图2A)。另一方面，重组蛋白(1、100、200nM)不抑制Xa因子、胰蛋白酶和纤溶酶(图2A)。

重组蛋白对凝血酶残留活性的抑制作用以及IC₅₀值的计算

凝血酶是重组蛋白抑制的唯一酶。另外，通过增加浓度的重组蛋白来分析对凝血酶的抑制作用。数据表明，重组蛋白浓度的增加降低了凝血酶的残留活性(图2B-D)。以等式1的剂量响应函数调节了抑制百分比对浓度对数的图，计算出IC₅₀值为86.6±1.9pM(图3D)。

重组蛋白对凝血酶的抑制动力学

为了评估重组蛋白对凝血酶进行的抑制类型，测定了在重组蛋白存在下凝血酶水解生色底物S-2238的动力学参数。为了这个目的，使用以下进行了一些测试：(i)固定浓度的底物和增加浓度的重组蛋白；以及(ii)固定浓度的重组蛋白和增加浓度的S-2238。在图3A中给出了凝血酶对S-2238的典型水解曲线。在重组蛋白存在下凝血酶水解生色底物S-2238的起始速度已使用等式2调整为Lineweaver-Burk图。与不存在重组蛋白的反应相比，Lineweaver-Burk图显示了恒定的Vmax和变化的Km，这是竞争性抑制的特征(图3B)。绘制了每种抑制剂浓度的表观Km相对于相应的抑制剂浓度的曲线，并使用等式3计算了Ki。所获得的重组蛋白对凝血酶抑制的Ki值为18.5±2.2pM(图3C)，这甚至可以通过使用等式3和4将数据拟合至用于竞争性酶抑制的非线性回归来进行证实(图3D)。通过这种方法获得的Ki值为18.1±1.7pM，与先前计算的相似(图4D)。

重组蛋白与凝血酶的结合动力学

为了结合动力学，将预混合的底物和重组蛋白浓度添加到已经含有凝血酶的反应混合物中(参见实验步骤)。抑制的迹线是直线并且从反应开始就一直是分开的线，因此表明重组蛋白与凝血酶之间的快速紧密结合(图4A)。另外，使用莫里森紧密结合(Morrisontight binding)的等式5绘制级分速度相对于抑制剂浓度的图，并且数据与等式极为匹配(图4B)。通过莫里森紧密结合的等式计算出Ki为19.5±3.5pM，这与通过用于竞争性酶抑制的非线性回归确定的值相似。此外，绘制使用等式6计算的k_obs相对于重组蛋白浓度的图。从该图计算k_on和k_off，分别得出4.04±0.03×10⁷M^-1s^-1和0.65±0.04×10^-3s^-1(图4C)。使用公式7计算出抑制常数(Ki)为16.1±1.4pM。

丝氨酸蛋白酶降解重组蛋白

之后，确定丝氨酸蛋白酶(如凝血酶、纤溶酶、Xa因子和胰蛋白酶)是否水解重组蛋白。为此，在含有150mM NaCl和0.1％PEG、pH 7.4的50mM磷酸盐缓冲液中，在含有或不含1μM丝氨酸蛋白酶(凝血酶、纤溶酶、胰蛋白酶或Xa因子)下，将重组蛋白(10μM)于37℃孵育6h或18h。孵育6小时后，反应混合物的SDS-PAGE表明，与重组蛋白对照条带相比，20kDa的条带强度(对应于未消化的重组蛋白) 减少，并且由凝血酶孵育的重组蛋白中出现了较低分子量的条带(图 5A)。另一方面，孵育6小时后，由纤溶酶和胰蛋白酶孵育的重组蛋白中的20kDa条带完全消失(图5A)。相应地，在相同的孵育时间后， Xa因子也将重组蛋白转化为片段(图5A)。为了测试凝血酶的抑制，将相同样品稀释10万倍，以使重组蛋白的终浓度达到100pM，并向反应混合物中进一步补充100pM凝血酶。加入生色底物S-2238后，以分光光度计的方式监测凝血酶对其的水解。数据显示，在没有丝氨酸蛋白酶的情况下孵育6小时的重组蛋白以与对照(对照是100pM的新鲜重组蛋白；图5B)相似的方式抑制了凝血酶。另一方面，与凝血酶一起孵育的重组蛋白的抑制活性降低了20％，与纤溶酶或胰蛋白酶一起孵育6h的重组蛋白的抑制活性降低了80％(图5B)。有趣的是，用Xa 因子消化的重组蛋白保留了其凝血酶抑制活性(图5B)。之后，检查了与丝氨酸蛋白酶一起孵育18小时的重组蛋白。对应于重组蛋白单体的 20kDa的条带从与丝氨酸蛋白酶一起孵育的重组蛋白的反应混合物中完全消失(图5C)。以相同的方式，为了测试凝血酶的抑制，将样品稀释10万倍，并进一步补充100pM凝血酶。如预期的那样，在没有丝氨酸蛋白酶的情况下孵育18h的重组蛋白以与对照新鲜重组蛋白类似的方式抑制凝血酶(图5D)。但是，与凝血酶、纤溶酶和胰蛋白酶一起孵育的重组蛋白不能抑制凝血酶(图5D)。有趣的是，由Xa因子孵育的重组蛋白甚至抑制了凝血酶活性(图5D)。

凝血酶水解的重组蛋白的N端测序

如上所述，凝血酶降解重组蛋白。在下文中，我们的下一步是确定重组蛋白序列中凝血酶的切割位点。为此，与凝血酶一起孵育重组蛋白7小时，并通过反相色谱法分离水解过程中产生的肽。收集各个峰并进行埃德曼(Edman)N端测序。第一个峰的测序得到的残基是GKPQG，是重组蛋白的前五个残基(图5E)。接下来的三个峰(第二、第三和第四峰)的测序得到的残基为MPKGG，基本上是由凝血酶产生的重组蛋白肽的N端残基(图5E)。对保留时间等于对照的最后一个峰(第5 个)进行了测序，其N端具有MPKGG和GKPQG残基，表明该峰已保留并部分降解了重组蛋白(图5E)。还对级分进行了质谱分析，它们与埃德曼测序的数据一致(表1)。肽的理论和实验质量列于表1。

表1：由凝血酶产生的重组蛋白片段。

在含有150mM NaCl和0.1％PEG 6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中于37℃与1μM凝血酶一起孵育重组蛋白(10μM)4小时。通过反相HPLC柱C-18分离反应混合物。对级分进行埃德曼测序或质谱 MALDI-TOF。

Xa因子水解的重组蛋白的N端测序

还确定了重组蛋白中Xa因子的切割位点。将与Xa因子一起孵育重组蛋白4小时产生的肽通过反相色谱法分离。埃德曼测序表明，第一个峰的N末端残基是GKPQG，是重组蛋白的前五个残基(图5F)。接下来的两个峰(第2个和第3个)的测序得到的残基为SDAVH，实际上是由Xa因子产生的重组蛋白肽的N端残基(图5F)。保留时间等于对照的最后一个峰(第4个)被测序为具有N端残基MPKGG和SDAVH，表明该峰已保留并部分降解重组蛋白(图5F)。接下来，对收集的峰进行质谱分析，这与来自埃德曼测序的数据一致(表2)。表2列出了肽的理论质量和实验质量。

表2：Xa因子产生的重组蛋白片段。

在含有150mM NaCl和50μM PS/PC的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，于37℃与1μM的Xa因子一起孵育重组蛋白(10μM)4小时。通过反相HPLC柱C-18分离反应混合物。对级分进行埃德曼测序或质谱MALDI-TOF。

由Xa因子产生的重组蛋白片段保留了凝血酶抑制活性

此外，与Xa因子一起孵育重组蛋白18小时，并通过反相色谱法分离所得的肽(图6A)。收集峰(分别命名为H1、H2、H3、H4和H5)，并进行质谱MALDI-TOF(图6B)。根据质谱分析，H1对应于平均质量5153.57Da，H2对应于平均质量3667.50Da和4582.40Da，以及H3 对应于平均质量8220.55Da和6770.60Da。同样，H4对应于平均质量 7299.61Da和12427.54Da，以及H5对应于16990.90、12427.54Da和 11843.17Da(图6B，表1)。另外，对级分(H1、H2、H3和H4)进行凝血酶抑制试验(图6C)。级分H1、H2、H3和H4保留的凝血酶抑制活性分别为完整的未水解的重组蛋白的约50％、45％、70％和80％ (图6D)。H5峰具有基本完整的重组蛋白，因此其未被考虑用于对凝血酶的抑制测试。

重组蛋白对aPTT、PT和TT的作用

最后，在健康人类志愿者的与重组蛋白孵育3分钟后的分离血浆中评估了PT、aPTT和TT。数据显示重组蛋白以浓度依赖的方式延长了aPTT和PT(图11A和11B)。在12nM之后获得了aPTT的最大测试读数，而对于PT则在6nM重组蛋白之后获得了最大测试读数(图11A 和11B)。另一方面，重组蛋白在峰-摩尔范围内延长了TT(图11C)。

表3：凝血酶抑制剂的生化特性比较。

^a直接的凝血酶抑制剂

^b在健康人类志愿者血浆中的半衰期。

^c在离体血浆中和在含有1μM凝血酶、10μM重组蛋白和150mM NaCl 和0.1％PEG6000的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中于37℃、4小时的半衰期。

ND，未确定的

^d二价的凝血酶抑制剂，占据活性位点和外部位点1。

^e建议的抑制剂可以是二价(单一结构域)或三价(完整的分子)

本领域技术人员会理解本文提出的教导，并且可以在所附的权利要求的范围内的提供的实施方案和其他变化方案来再现本发明。

序列表

<110> 布坦坦基金会

<120> 重组蛋白及其片段、生产所述重组蛋白的方法、合成基因以及sculptin或重组蛋白在制备用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病中的药物或药物组合物或作为直接和特异性的凝血酶抑制剂的用途

<130> Sculptin

<150> PCT/BR2018/050076

<151> 2018-03-21

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(157)

<223> Sculptin重组蛋白

<400> 1

Gly Lys Pro Gln Gly His Pro His Asp Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp

1 5 10 15

Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly

20 25 30

Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg

35 40 45

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly Leu

50 55 60

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu

65 70 75 80

Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly

85 90 95

Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala

100 105 110

Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro

115 120 125

Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu

130 135 140

Arg Ala Leu His Ala Leu Glu His His His His His His

145 150 155

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(24)

<223> 由凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 2

Gly Lys Pro Gln Gly His Pro His Asp Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp

1 5 10 15

Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys

20

<210> 3

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 3

Gly Lys Pro Gln Gly His Pro His Asp Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp

1 5 10 15

Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly

20 25 30

Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg

35 40 45

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys

50 55

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(34)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 4

Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val

20 25 30

Pro Lys

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(31)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 5

Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Arg Ala Leu His Ala Leu Glu His His His His His His

20 25 30

<210> 6

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(65)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 6

Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val

20 25 30

Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile

35 40 45

Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu His Ala Leu Glu His His His His His

50 55 60

His

65

<210> 7

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(68)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 7

Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val

20 25 30

Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly Leu Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile

35 40 45

Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr

50 55 60

Ala Val Pro Lys

65

<210> 8

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(99)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 8

Met Pro Lys Gly Gly Leu Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val

20 25 30

Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile

35 40 45

Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr

50 55 60

Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile

65 70 75 80

Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu His Ala Leu Glu His His His

85 90 95

His His His

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(133)

<223> 通过凝血酶产生的Sculptin片段

<400> 9

Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val

20 25 30

Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly Leu Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile

35 40 45

Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr

50 55 60

Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile

65 70 75 80

Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp Ala Val

85 90 95

His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly Phe Glu

100 105 110

Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu His Ala Leu Glu His

115 120 125

His His His His His

130

<210> 10

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(48)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 10

Gly Lys Pro Gln Gly His Pro His Asp Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp

1 5 10 15

Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly

20 25 30

Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg

35 40 45

<210> 11

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(34)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 11

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His

1 5 10 15

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu

20 25 30

Ala Arg

<210> 12

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(41)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 12

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His

1 5 10 15

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu His

20 25 30

Ala Leu Glu His His His His His His

35 40

<210> 13

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(75)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 13

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His

1 5 10 15

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu

20 25 30

Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly

35 40 45

Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala

50 55 60

Leu His Ala Leu Glu His His His His His His

65 70 75

<210> 14

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(63)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 14

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His

1 5 10 15

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu

20 25 30

Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly

35 40 45

Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg

50 55 60

<210> 15

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(68)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 15

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His

1 5 10 15

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu

20 25 30

Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly

35 40 45

Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala

50 55 60

Leu Glu Ala Arg

65

<210> 16

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(116)

<223> 通过Xa因子产生的Sculptin片段

<400> 16

Gly Lys Pro Gln Gly His Pro His Asp Ala Leu Glu Ala Arg Ser Asp

1 5 10 15

Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly His Gly Gly

20 25 30

Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg

35 40 45

Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly Gly Leu

50 55 60

Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala Leu Glu

65 70 75 80

Ala Arg Ser Asp Ala Val His Thr Ala Val Pro Lys Met Pro Lys Gly

85 90 95

Gly His Gly Gly Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Tyr Asp Glu Arg Ala

100 105 110

Leu Glu Ala Arg

115

<210> 17

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> GENE

<222> (1)..(477)

<223> 编码sculptin的合成基因

<400> 17

atgggtaagc ctcaagggca tccacacgac gcactggagg cccgtagcga cgcagtgcat 60

accgctgtcc ctaagatgcc gaagggcggc cacggtgggt ttgaaccgat cccgattgat 120

tatgacgaac gcgcactgga agctcgcagt gacgcggtac atactgctgt gcctaaaatg 180

ccaaaagggg gcctgggggg tttcgagccg atcccgattg attatgacga gcgcgcactg 240

gaagctcgta gcgacgcagt acatactgct gtaccaaaaa tgcctaaagg gggtcacggg 300

gggtttgaac cgattccgat cgattacgac gaacgtgcgc tggaagcgcg ttctgatgcc 360

gtccatacgg cggtgccaaa aatgcctaaa ggcggtcatg gtggcttcga acctattcca 420

atcgattacg acgaacgtgc cctgcacgca ctcgagcacc accaccacca ccactga 477

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含以下序列表示的一个序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由以下序列表示的一个序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。

3.一种获得权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，从蜱卡延钝眼蜱(Amblyoma cajennense)的唾液腺cDNA中获得所述重组蛋白。

4.一种合成基因，其特征在于，所述合成基因包含SEQ ID NO：17表示的一个序列。

5.根据权利要求4所述的合成基因，其特征在于，所述合成基因由SEQ ID NO：17表示的一个序列组成。

6.Sculptin或权利要求1所述的重组蛋白的用途，其特征在于，所述sculptin或重组蛋白用于制备预防和/或治疗血栓栓塞性疾病的药物或药物组合物。

7.Sculptin或权利要求1所述的重组蛋白的用途，其特征在于，所述sculptin或重组蛋白用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病和/或作为直接和特异性的凝血酶抑制剂。

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含与以下序列具有至少60％的同一性的一个序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由与以下序列具有至少60％的同一性的一个序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含具有以下序列的一个序列：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由具有以下序列的序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或它们的组合。

5.一种获得权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，从蜱卡延钝眼蜱(Amblyoma cajennense)的唾液腺cDNA中获得所述重组蛋白。

6.一种合成基因，其特征在于，所述合成基因包含与SEQ ID NO：17具有至少60％的同一性的一个序列。

7.根据权利要求6所述的合成基因，其特征在于，所述合成基因由与SEQ ID NO：17具有至少60％的同一性的一个序列组成。

8.根据权利要求6所述的合成基因，其特征在于，所述合成基因包含具有SEQ ID NO：17的一个序列。

9.根据权利要求6所述的合成基因，其特征在于，所述合成基因由具有SEQ ID NO：17的一个序列组成。

10.Sculptin或权利要求1所述的重组蛋白的用途，其特征在于，所述sculptin或重组蛋白用于制备预防和/或治疗血栓栓塞性疾病的药物或药物组合物。

11.Sculptin或权利要求1所述的重组蛋白的用途，其特征在于，所述sculptin或重组蛋白用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病和/或作为直接和特异性的凝血酶抑制剂。