HU222398B1

HU222398B1 - Eljárás pallidipin, egy módosított, kollagénindukált vérlemezke-aggregációt gátló vegyület előállítására

Info

Publication number: HU222398B1
Application number: HU9701823A
Authority: HU
Inventors: Andreas Becker; Bernard Händler; Christiane Noeske-Jungblut
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-11
Publication date: 2003-06-28
Also published as: BG101226A; AU3565795A; CN1159828A; SK29297A3; FI971013A0; US5882887A; CA2199719A1; BR9508910A; EP0781334A1; NO971110L; MX9701720A; BG63276B1; JPH10505502A; SI9520093A; CZ76297A3; ZA957649B; AU701643B2; RU2186110C2; CN1075836C; NZ293261A

Abstract

A találmány tárgya eljárás emlősök trombocitáinak kollagén általindukált aggregációját gátló rekombináns Asp-Pal- lidipin fehérje –amely egy Pallidipin fehérjét és annak N-terminális végéhezpeptidkötéssel kapcsolódó aszpara- ginsavat tartalmaz,aminosavszekvenciája az 1., 2. vagy 3. azonosító számon megadott; vagyezeknek egy allél változata vagy muteinje, amelyek bármelyike adottesetben egy poszttranszlációs módosítást tartalmaz – előállítására ésa módosított Pallidipin. Az eljárást az jellemzi, hogy legalább egybaktériumot egy alkalmas vektorral transzfektálnak; a szignálpeptidetés az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérjét expresszáltatják; az Asp-Pallidipint a baktérium citoplazmájából a periplaz- mábatranszportálják, ennek során az előfehérjét legalább egy proteázzalhasítva megkapják az érett Asp-Pallidipint; ezt a periplazmábólextrahálják és tisztítják. A találmány szerinti Asp-Pallidipinttartalmazó gyógyszerkészítmények az atherosclerosis, trombózis és rákkezelésére használhatók. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás egy, a trombociták kollagén által indukált aggregációját (összetapadását) gátló módosított Pallidipin inhibitor előállítására. A találmány további tárgya a módosított Pallidipin.

A kollagén az emberi trombociták aggregációjának leghatásosabb induktora. Ha például megsértjük az ér falát, és kollagén hatásának tesszük ki, a trombociták gyorsan összetapadnak és aktiválódnak, amint azt H. R. Baumgartner [Thromb. Haemostas 37: 1-16 (1976)] és J. Hawiger [Humán Pathol. 18: 111-122 (1987)] ismerteti.

Tehát a trombociták kollagén által indukált aggregációja kockázatot jelent többek között azon páciensekre nézve, akik a véredényeket érintő eljárásokon, például érplasztikán vagy szepszisen esnek át, akik myocardialis infarktust (szívizomelhalás) szenvednek vagy myocardialis infarktusból gyógyulnak.

Bizonyos esetekben a trombociták kollagén által indukált aggregációját gátolni kell. Ismertek egyes vegyületek, amelyek ezt az aggregációt gátolják. Például Bevers és munkatársai [„Collagen Derived Octapeptide Inhibits Piatelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Thrombin” (A kollagéneredetű oktapeptid gátolja a kollagén és trombin együttes trombocitakoaguláló hatását), Thrombosis Research, 37: 365-370 (1985)]; Kamiguian és munkatársai [„Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the Platelet/Collagen Interaction” (Egy kollagéneredetű oktapeptid hatása a trombociták és a kollagén kölcsönhatásának különböző fokozataiban), Thrombosis Research, 32: 593-604 (1983)]; valamint Caen és munkatársai az EPA 0040149 számon közzétett európai szabadalmi bejelentésben leírják, hogy szintetikus oligopeptidek a trombocitákhoz kötődve gátolják az aggregációt.

A trombociták kollagén által indukált aggregációját gátló inhibitornak egy másik forrásaként Smith és munkatársai „Identification of 50 kDalton snake venom proteins wich specifically inhibit piatelet adhesion to collagen” (A trombocitáknak a kollagénhez való tapadását specifikusan gátló 50 kDalton méretű kígyóméregfehéijék azonosítása) című közleményük szerint [FEBS 283: 307-310 (1991)] azonosítottak egy inhibitort egy ismeretlen szerkezetű kígyóméregben.

Munro és munkatársai [„Calin - a platelet adhesion inhibitor from the sálivá of the medicinái leech” (Calin - a trombociták aggregációját gátló inhibitor az orvosi pióca nyálából), Blood Coagulation and Fibrinolysis 2: 179-184 (1991)] egy harmadik ilyen inhibitort ismertetnek, amely az orvosi pióca nyálából származik. Az 1992. április 15-én EP 0480651 számon közzétett európai szabadalmi leírás egy körülbelül 16 kDaltonos (kD), az emberi trombociták kollagén által indukált aggregációját gátolni képes fehérjét ismertet, amely a Haemeaentaria officinalis pióca nyálmirigyéből származik. Connoly és munkatársai [J. Bioi. Chem. 267: 6893-6898 (1992)] írták le a Haemeaentaria officinalis pióca nyálából származó 16 kD-os LAPP proteint. Waxman és Connoly [J. Bioi. Chem. 268: 5445-5449 (1993)] pedig a Moubatint.

A trombociták kollagén által indukált aggregációját gátló inhibitorok egy további típusa rovarokból nyerhető ki az EP 0530937 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés szerint. Az ilyen fehérjéket Pallidipineknek nevezik.

Az alkalikus foszfatáz (APase) egy E. coli fehérje, amely a periplazmikus térbe választódik ki. Az APase prekurzor fehérjeként szintetizálódik, van egy 21 aminosav hosszúságú leader (vezető) szekvenciája, ezt a bakteriális belső membránon át a periplazmikus térbe történő transzlokáció (áthelyeződés) során a leader peptidáz levágja, amint azt Y. Kikuchi és munkatársai [Nucl. Acids Rés. 9: 5671-5678 (1981)] leírják. Bioszintézisét a táptalaj foszfátkoncentrációja szabályozza; az APase promoter elejére helyezett heterológ gének termékeinek exportját C. Montheilet és munkatársai [Gene. 125: 223-228, (1993)] szerint alacsony foszfátkoncentráció segíti elő.

A Pallidipin fehérje természetes forrásai korlátozottak, ezért előállítására logikus megoldás a biotechnológiai módszerek alkalmazása. Az EP 0530937 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés szerint a fiatal hörcsögök veséje olyan kihozatallal termeli a Pallidipint, amelyet az ipari méretekben történő termeléshez növelni kell. Ezért szükséges egy javított termelési rendszer.

Tehát felmerült az igény a kollagén által indukált trombocitaaggregációt gátló rekombináns Pallidipin előállításának egy jobb módszerére, amely nagy kihozatalú, és reprodukálható módon lehetővé teszi a nagy tisztaságú fehérje kinyerését. Nem szabad, hogy az új eljárás károsan befolyásolja a kapott Pallidipin fehérje biológiai aktivitását.

Most azt találtuk, hogy ez a probléma megoldható egy, a rekombináns Pallidipin fehérje (Asp-Pallidipin) előállítására szolgáló eljárással - ahol az Asp-Pallidipin inhibiálja az emlősök trombocitáinak kollagén által indukált aggregációját, és az Asp-Pallidipin (i) egy, a Pallidipin fehérjék közül választott fehérjét (Pallidipin), és (ii) aszparaginsavat tartalmaz, és az aszparaginsav peptidkötéssel kapcsolódik a Pallidipin N-terminális végéhez; így az Asp-Pallidipin aminosavszekvenciája

a) aa) az 1. szekvencia-azonosítószámon; bb) a 2. szekvencia-azonosítószámon vagy cc) a 3. szekvencia-azonosítószámon megadott; vagy

b) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyikének egy alléi változata, módosulata vagy muteinje, amely variációk, modifikációk vagy mutációk a fehéqe aktivitását lényegében nem befolyásolják; vagy

c) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyike szerinti fehérje vagy annak a b) pont szerinti változatai vagy muteinjei, amelyek poszttranszlációs, a fehérje aktivitását lényegében nem befolyásoló modifikációkat tartalmaznak -, amely a következő lépésekből áll:

HU 222 398 Β1 aa) legalább egy baktérium transzfektálása egy alkalmas vektorral, amely vektor (i) egy, a rekombináns Asp-Pallidipint kódoló DNS-t vagy cDNS-t, (ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát, amelyet úgy hasítunk, hogy az aszparaginsav a Pallidipin felől nézve a +1 helyen legyen, és (iii) egy alkalmas promotert tartalmaz;

bb) az Asp-Pallidipint és a szignálszekvenciát tartalmazó előfehéije expressziója cc) az Asp-Pallidipin transzportálása a baktérium citoplazmájából a periplazmába, az előfehéije hasítása a transzport során legalább egy proteázzal, az Asp-Pallidipin előállítása dd) az Asp-Pallidipin izolálása a periplazma extrahálásával, és ee) Asp-Pallidipin tisztítása.

Az E. coli egy gyors expressziós rendszer például az eukariotikus fehérjék heterológ termeléshez. A géntermékek E. colival végzett expressziója során sok esetben gondot okoz a fehérjék nem pontosan kialakított másodlagos szerkezete, amely csökkent aktivitású expressziós termékeket eredményezhet. Sokkal nagyobb valószínűséggel alakul ki a pontos másodlagos szerkezet akkor, ha a fehéijét az E. coli sejtek periplazmájába transzportáljuk, mint akkor, ha a fehéije a citoplazmában marad. A periplazmába irányuló transzportot az érett fehérjékhez kapcsolt szignálpeptid-szekvenciák indukálják - ezeket az érett fehérjeszekvenciákkal együtt „előfehéijék”-nek nevezzük. Ahhoz, hogy az E. coliban érett eukariotikus fehérjék termelődjenek, az előfehérjét pontosan a szignálpeptid-szekvencia és az érett fehéije között kell hasítani; a szignálszekvencia és az érett fehéije szekvenciája befolyásolja a hasítás pontosságát. Ezért nem minden szignálpeptid-szekvencia kompatibilis (összeférhető) minden kódolószekvenciával.

Ismert, hogy az E. coli alkalikus foszfatáz szignálszekvencia hatásos az előfehéijék exportálásában. De azt is tudjuk, hogy egy adott szignálpeptid-szekvencia és egy érett fehérjeszekvencia kombinációja nem szükségszerűen eredményez jó előfehéije-termelést.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti gyártási eljárás 15-ször akkora kihozatalt ad, mint fiatal hörcsögök vesesejtjeit alkalmazó expressziós rendszer. Ezeket az eredményeket a példákban bemutatjuk. Az Asp-Pallidipin működését és aktivitását a találmány szerinti eljárás nem befolyásolja károsan a fiatal hörcsögök vesesejtjeit alkalmazó expressziós rendszerhez képest. Az eljárás további előnye, hogy az előfehéije hasításához szükséges proteázt (például leader peptidázt) maga az E. coli termeli.

Az érett Asp-Pallidipin tisztítása a találmány szerinti eljárással sokkal könnyebb, mint a baktériumok citoplazmájában termelt és tárolt expresszált fehérjéké. Az ozmózisnyomás elegendő a periplazmában felgyülemlett Asp-Pallidipin felszabadításához.

A találmány egyik előnyös megvalósításában a szignálpeptid-szekvenciát kódoló DNS kódolja az alkalikus foszfatáz (APase), előnyösen az E. coli APase szignálszekvenciájához szükséges aminosavakat.

A találmány oltalmi körébe tartozik egy olyan eljárás, amelyben az Asp-Pallidipin előállítására használt vektor az U. Boidol és munkatársai [Mól. Génét. 185: 510-512 (1982)] által leírt pSB94 vektorból származik.

Ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartozik egy fent említett vektor egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciával, egy alkalmas promoterrel és szükséges esetben egy enhancerrel (a gén transzkripcióját fokozó DNS-szakasz) együtt. A vektorok részletes leírása megtalálható a példák irodalmi részében, valamint az EP 0480651, az EP 0462632 és az EP 0173177 számú európai szabadalmi leírásban.

Gazdaszervezetként előnyösen alkalmazható az E. coli baktérium, alkalmasak más mikroorganizmusok is, például a Bacillus subtilis.

A találmány további tárgya egy rekombináns Pallidipin fehéije, amely az emlősök trombocitáinak kollagén által indukált aggregációját gátolja, és (i) egy, a Pallidipin fehérjék közül választott fehérjét (Pallidipin), és (ii) aszparaginsavat tartalmaz, ahol az aszparaginsav peptidkötéssel kapcsolódik a Pallidipin N-terminális végéhez; így az Asp-Pallidipin aminosavszekvenciája

b) az 1 -3. azonosító számú szekvenciák bármelyikének egy alléi változata, módosulata vagy muteinje, amely változatok, modifikációk vagy műiéinek aktivitása lényegében azonos az 1-3. szekvenciasorszámú Asp-Pallidipinével; vagy

c) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyike szerinti fehéije vagy annak a b) pont szerinti változatai vagy muteinjei, amelyek poszttranszlációs, az érett fehéije aktivitását lényegében nem befolyásoló módosításokat tartalmaznak.

A találmány további tárgya egy rekombináns Pallidipin fehéije - amely az emlősök trombocitáinak kollagén által indukált aggregációját gátolja, és (i) egy, a Pallidipin fehéijék közül választott fehérjét (Pallidipin), és (ii) aszparaginsavat tartalmaz, ahol az aszparaginsav peptidkötéssel kapcsolódik a Pallidipin N-teiminális végéhez; így az Asp-Pallidipin aminosavszekvenciája

b) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyikének egy alléi változata vagy muteinje, amely változatok vagy muteinek a fehéije aktivitását lényegében nem befolyásolják; vagy

c) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyike szerinti fehéije vagy annak a b) pont szerinti változatai vagy muteinjei, amelyek poszttranszlációs,

HU 222 398 Β1 az érett fehérje aktivitását lényegében nem befolyásoló modifikációkat tartalmaznak amelynek előállítása a következő lépésekből álló eljárással megy végbe:

aa) legalább egy baktérium transzfektálása egy alkalmas vektorral - amely vektor (i) egy, a rekombináns Asp-Pallidipint kódoló első DNS- vagy cDNS-molekulából, (ü) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilis (működőképes) kapcsolócsoportot tartalmaz - ezáltal a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje az expresszió és a periplazmába történő átvitel során úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett AspPallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz;

bb) a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje expressziója;

cc) az Asp-Pallidipin transzportálása a baktérium citoplazmájából a periplazmába, így az előfehéijét a transzport során legalább egy proteázzal hasítva megkapjuk az érett AspPallidipint;

dd) az Asp-Pallidipin izolálása a periplazma extrahálásával, és ee) Asp-Pallidipin tisztítása.

A találmány egy további előnyös megvalósításában az Asp-Pallidipint az alábbi lépésekben állítjuk elő:

- egy alkalmas vektorral transzfektált baktérium tenyésztése - amely vektor (i) egy, a rekombináns Asp-Pallidipint kódoló első DNS- vagy cDNS-molekulából, (ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilis kapcsolócsoportot tartalmaz -; ezáltal a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje az expresszió és a periplazmába történő átvitel során úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett Asp-Pallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz; és olyan körülmények között, amelyek hatására végbemegy

- a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje expressziója; és

- az Asp-Pallidipin transzportálása a baktérium citoplazmájából a periplazmába, így az előfehérjét a transzport során legalább egy proteázzal hasítva megkapjuk az érett Asp-Pallidipint; és

- a periplazmából kinyert Asp-Pallidipint tisztítjuk. Előnyös az olyan fehérje, amelynek szignálpeptidszekvenciája az alkalikus foszfatáz (APase), előnyösen az E. coli APase szignálszekvenciája.

A találmány szerinti fehérjék iparilag gyógyszerkészítményekben alkalmazhatók, amelyek a találmány szerinti fehérjét egy gyógyászatilag elfogadható hígítóvagy hordozóanyaggal együtt tartalmazzák.

A fent említett alléi változatok vagy módosulatok közé tartozik a nukleotidok vagy aminosavak sorrendjének változása, valamint a genotípus vagy fenotípus változása. Legalább egy nukleotid vagy aminosav lehet helyettesítve (szubsztitúció), kiiktatva (deléció) vagy inszertálva.

A deléciók, inszerciók és különösen a szubsztitúciók többsége feltehetően nem okoz radikális változásokat a találmány szerinti fehérje tulajdonságaiban. A találmány szerinti modifikált vagy mutált fehérjéket a szokásos módon lehet szkrinelni a szubsztitúció, deléció vagy inszerció pontos hatásának meghatározására oly módon, hogy a modifikált vagy mutált fehérjék funkcióit összehasonlítjuk a találmány szerinti - például az 1-3. szekvencia-azonosítószámú - fehérjék vagy a természetes Pallidipin jellemző funkcióival, és így megállapítjuk, hogy a megváltoztatott fehérjének van-e az eredetiekkel összemérhető hatása, például biológiai aktivitása.

A genetikai kód degeneratív; ez azt jelenti, hogy az aminosavak többségét egynél több - három nukleotidból álló - kodon kódolja. Ezért az alléi variációk vagy modifikációk vagy megváltoztatják az aminosavszekvenciát, vagy nem. Tehát az alléi variációk elsődlegesen a DNS-szinten vannak jelen, de felléphetnek az aminosavszekvencia szintjén is.

A találmány szerinti fehérjét kódoló DNS-szekvencia a szokásos módszerekkel módosítható, hogy a találmány szerinti fehérje végterméknek olyan változatait alakítsuk ki, amelyeknek aktivitása lényegében megegyezik a találmány szerinti, például az 1-3. szekvencia-azonosítószámú Asp-Pallidipin fehérjék vagy a természetes Pallidipin fehérje aktivitásával. Az aktivitást a példákban leírt módon mérjük. Tehát egy vagy több, például 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10... vagy akár 15 aminosavat lehet hozzáadni, helyettesíteni vagy eltávolítani anélkül, hogy a találmány szerinti fehérje aktivitása alapvetően megváltozna. A helyettesítéseket általában az alábbi 1. táblázat szerinti módon végezhetjük, ha a találmány szerinti fehérje aminosavszekvenciáját finoman kívánjuk módosítani.

A funkciók vagy az immunológiai azonosság lényeges változtatását az 1. táblázatban megadottaknál kevésbé konzervatív szubsztitúciókkal hajtjuk végre, vagyis olyan aminosavakat választunk, amelyek jelentősebben eltérnek (a) a polipeptid vázszerkezet struktúrájának például lemez vagy spirál alakzat - megtartásában a szubsztitúció helyén, (b) a molekula hidrofób jellegének vagy töltésének vagy (c) az oldalláncok terjedelmének megtartásában.

1. táblázat

Normál aminosavszubsztitúciók egy fehérjében

I Eredeti aminosav	Példák a szubsztitúcióra
Alá	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
\| Cys	Ser

HU 222 398 Bl

1. táblázat (folytatás)

\| Eredeti aminosav	Példák a szubsztitúcióra
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Tip	Tyr
Tyr	Trp, Phe
I Val	Ile, Leu

A muteineket két összehasonlított fehéqe homológiájával definiáljuk. A „homológia” az aminosavak közötti hasonlóságot és a két összehasonlított szekvencia közötti eltéréseket jelenti. Az aminosavak hasonlósága például az 1. táblázaton van megadva. A találmány szerinti mutánsok aminosavszekvenciája előnyösen legalább 60%-os, még előnyösebben legalább 90%-os, a legelőnyösebben legalább 95%-os homológiát mutat egy vagy több 1-3. azonosító számú fehéqe szekvenciájával.

A fent említett „poszttranszlációs változások”-on a transzláció során vagy utána végbemenő változásokat, például diszulfidhidak képződését és az aminosavak kémiai változásait értjük.

A fehéqék gyakran képeznek kovalens láncközi kötéseket. Ezek a diszulfidhidak a cisztein-SH aminosavak között képződnek a háromdimenziós térszerkezetű fehérjében vagy az olyan fehérjében, amelynek térszerkezete a transzláció során alakul ki. A kötések stabilizálják a fehérje háromdimenziós szerkezetét. Ilyen diszulfidkötések ritkán alakulnak ki az olyan fehéijemolekulában, amely még a citoszolban tartózkodik, mert a glutation-SS-(diszulfid-) redukálószer sejten belüli nagy koncentrációja a legtöbb ilyen hidat felbontja. Mikor a fehéqék már a citoplazmán kívül vannak, a sejttől elkülönülve vagy annak felületén, akkor sok esetben további kovalens láncközi kötéseket képeznek.

Továbbá az aminosavakat megváltoztathatjuk WO 91/10684 számon közzétett PCT nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon. Az aminosavak oldalláncain egyéb változtatások is végbevihetők.

A találmány szerinti fehéqe legalább 40%, előnyösen legalább 60%, még előnyösebben legalább 80%, a legelőnyösebben legalább 90% tisztaságú. A tisztaságot a találmány szerinti fehéqe mennyiségének a fehérje összes mennyiségéhez viszonyított arányaként definiáljuk. Ha a példákban leírt tisztítási módszereket alkalmazzuk, akkor a találmány szerintitől eltérő fehérjék nem mutathatók ki.

A találmány szerinti tisztított fehérje felhasználásával monoklonális antitesteket állíthatunk elő a jól ismert Koehler-Milstein-módszerrel, amely abból áll, hogy a tisztított fehérjével, mint immunogénnel hagyományos módon egereket vagy nyulakat immunizálunk, és ezután az egér vagy nyúl antitesttermelő sejtjei hibridómákat termelnek.

A találmány előnyös megvalósítása az E. coli E15 törzs által termelt 1. szekvencia-azonosítószámú fehéqe.

Az Asp-Pallidipin farmakológiai hatást mutat, ezért gyógyszerként használható lehet. Az Asp-Pallidipin gyógyszerkészítményben alkalmazható, amely az AspPallidipint egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyaggal együtt tartalmazza. A találmány további tárgya egy gyógyszerkészítmény, amely egy találmány szerinti, farmakológiailag hatásos Asp-Pallidipint és egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyagot tartalmaz.

Nevezetesen az Asp-Pallidipin gátolja a trombociták kollagén által indukált aggregációját, valamint azt, hogy a tumorsejtek, különösen az áttételes tumorsejtek a kollagénhez tapadjanak.

Tehát az Asp-Pallidipin gátolja a trombociták aggregációját. A vizsgálati eljárást a példákban írjuk le. Az Asp-Pallidipin a fehérje 0,5 és 50 pg közötti koncentrációjánál jelentős mértékben inhibiálja a trombocitaaggregációt. A legelőnyösebb Asp-Pallidipin, az 1. szekvencia-azonosítószámú fehérje IC₅₀-értéke 50 nmol/liter a példák szerinti, erősen tisztított fehérjéből. Az Asp-Pallidipin körülbelül 5 nmol/liter és körülbelül 1000 nmol/liter közötti koncentrációban gátolja a trombociták aggregációját.

Az in vitro vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti fehérje gyógyszerként vagy gyógyászati kezelésre használható. Az in vitro vizsgálati rendszer eredményei összefüggésbe hozhatók az in vivő rendszerével, mert ezen a területen ez egy jól megalapozott rendszer {Lásd: R. J. Shebusi és munkatársai [Thrombosis and Haemostasis, 64: 576-581 (1990)]}.

Az Asp-Pallidipin beadható intraperitoneális injekciók alakjában naponta egyszer vagy hetenként kétszerháromszor. Állatoknál csökken a trombocitaaggregáció, ha naponta annyi injekciót kapnak, amivel 100 nmol/liter vérszint érhető el. Ilyen körülmények között semmiféle komoly mellékhatás nem tapasztalható. Az Asp-Pallidipin egereknél olyan napi dózisoknál mutatja ezt a trombocitaaggregációt gátló hatást, amelyekkel körülbelül 10 nmol/liter és 1000 nmol/liter közötti vérszint érhető el.

Az Asp-Pallidipin ezért felhasználható atherosclerosisos vagy trombózisos sérülések kezelésére vagy a myocardialis infarktus kezelése után fellépő ismételt elzáródás megelőzésére. Az Asp-Pallidipin emlősökben - az embert is beleértve - felhasználható atherosclerosisvagy trombózisellenes szerként, például atherosclerotikus plakkok lehasadása vagy átfúvás vagy az endotheliumnak (belhám) vérmérgezés vagy transzplantáció esetén végzett eltávolítása következtében fellépő atherosclerosisos/trombózisos sérülések kezelésére vagy instabil angina kezelésére. Felhasználható továbbá az ismételt el5

HU 222 398 Bl záródás megelőzésére a myocardialis infarktusnak fibrinolízissel vagy érplasztikával (PTCA) végzett kezelése után. Ha a myocardialis infarktus kezelésre sztreptokinázzal, t-PA-val vagy más plazminogén aktivátorral végrehajtott fibrinolízist alkalmazunk, akkor az Asp-Pallidipin adalék anyagként használható az erek ismételt elzáródásának megelőzésére. A myocardialis infarktus ballonkatéterrel végzett kezelése ugyancsak megsérti az érfalat, és ez újabb vérrög képződéséhez vezethet. Ez megakadályozható oly módon, hogy a páciensnek az eljárás folyamán és után Asp-Pallidipint adunk be. Az Asp-Pallidipin a koronáriás és egyéb érplasztikai eljárásokban is alkalmazható.

A találmány oltalmi körébe tartozik:

a) egy találmány szerinti fehéije felhasználása egy, az atherosclerosis vagy trombózis kezelésére vagy a myocardialis infarktus kezelése után fellépő ismételt elzáródás megelőzésére (tehát ezek a fehérjék profilaktikusan hatásos gyógyszerként használhatók egy betegség vagy állapot kifejlődésének kockázatát viselő betegeknél);

b) az atherosclerosis vagy trombózis kezelésére vagy a myocardialis infarktus kezelése után fellépő ismételt elzáródás megelőzésére szolgáló eljárás, amely abból áll, hogy az arra rászoruló páciensnek a betegség megszüntetése szempontjából hatásos mennyiséget adunk be a találmány szerinti fehérjéből;

c) az atherosclerosis vagy trombózis kezelésére vagy a myocardialis infarktus kezelése után fellépő ismételt elzáródás megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amely egy találmány szerinti fehérjét és egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyagot tartalmaz.

Ezen javallatokhoz a megfelelő adagolás természetesen változik például az alkalmazott találmány szerinti vegyülettől, a pácienstől, a beadás módjától, valamint a kezelendő állapot természetétől és súlyosságától függően. Általában azonban kielégítő eredményeket érünk el állatoknál olyan napi dózisok alkalmazásával, amelyekkel körülbelül 10 és 1000 nmol/liter közötti, előnyösen 30 és 300 nmol/liter közötti vérszint érhető el.

A találmány szerinti fehérjék beadhatók bármilyen hagyományos módon, nevezetesen ebterálisan vagy parenterálisan, például injektálható oldatok vagy szuszpenziók alakjában. Előnyösen alkalmazható az intraperitoneális injekció.

Előnyös az 1. szekvencia-azonosítószámú fehérje.

A találmány további tárgyát képezik olyan gyógyszerkészítmények, amelyek a találmány szerinti vegyületeket tartalmazzák legalább egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyaggal együtt. Ezek a készítmények a szokásos - például az alábbi szakirodalmi helyen: [Remington’s Pharmaceutical Science, 15^,h ed. Max Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980)] leírt - módon állíthatók elő.

A találmány szerinti fehérjék gátolják továbbá a metasztázisos (áttételes) tumorsejteknek a kollagénhez való tapadását. A vizsgálatot a példákban írjuk le. A találmány szerinti fehérjék 1 és 100 pg közötti koncentrációban jelentős mértékben gátolják az áttételes tumorsejtek és a kollagén közötti tapadást.

A legelőnyösebb, vagyis az 1. szekvencia-azonosítószámú fehérje a 2. és a 15. példa szerinti, erősen tisztított állapotában 100 nmol/liter IC₅₀-értéket mutat. Az áttételes tumorsejtek és a kollagén közötti tapadást gátló hatást a találmány szerinti fehérjék 10 és 2000 nmol/liter közötti koncentrációban fejtik ki.

Az in vitro vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti fehérjék felhasználhatók gyógyszerként vagy gyógyászati kezelésre. Az in vitro vizsgálatok eredményei transzformálhatok in vivő eredményekké, mert ez a megoldás ezen a téren megalapozott, amint azt Chan és munkatársai [Science, 2: 1600-1602 (1990)] leírják.

A találmány szerinti fehérjék beadhatók elsődleges tumorok sebészeti műtétjei közben vagy után, annak megakadályozására, hogy az elkülönített tumorsejtek amelyek az operáció során a véráramba kerülhetnek áttételeket hozzanak létre. Ezek az antimetasztatikus hatások kimutathatók a Chan és munkatársai [Science, 2: 1600-1602 (1990)] által leírt „kísérleti” és „spontán” állatmodelleken.

A találmány szerinti fehérjék beadhatók intraperitoneális injekciók alakjában naponta egyszer vagy hetenként kétszer-háromszor. Ha az állatok naponta kapnak 200 nmol/liter vérszint eléréséhez elegendő injekciót, akkor csökken az áttételes tumorsejtek tapadása, ami a megtelepedett metasztázisos sejtközpontok számlálásával mérhető. Ilyen körülmények között semmiféle komoly mellékhatás nem tapasztalható.

A találmány szerinti fehérjék egerekben olyan napi dózisoknál mutatják ezt, az áttételes tumorsejteknek a kollagénhez való tapadását gátló hatást, amelyekkel körülbelül 20 és 2000 nmol/liter közötti, előnyösen 60 és 600 nmol/liter közötti vérszint érhető el.

A találmány szerinti fehérjék ezért felhasználhatók a rák, különösen az áttételes tumorsejtekkel járó, a legelőnyösebben az erősen áttételes tumorsejtekkel járó rák kezelésére.

A találmány oltalmi körébe tartozik:

a) egy találmány szerinti fehérje felhasználása az áttételes tumorsejtekkel járó rák kezelésére (ezek a fehérjék például tumorok sebészeti eltávolítása előtt beadva profilaktikusan hatásos gyógyszerként használhatók);

b) az áttételes tumorsejtekkel járó rák kezelésére szolgáló eljárás, amely abból áll, hogy az arra rászoruló páciensnek a betegség megszüntetése szempontjából hatásos mennyiséget adunk be a találmány szerinti fehérjéből;

c) az áttételes tumorsejtekkel járó rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amely egy találmány szerinti fehérjét és egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyagot tartalmaz.

Természetesen az ezen javallatokhoz a megfelelő adagolás például az alkalmazott találmány szerinti vegyülettől, a pácienstől, a beadás módjától, valamint a kezelendő állapot természetétől és súlyosságától függően változó. Általában azonban kielégítő eredményeket érünk el állatoknál olyan napi dózisok alkalmazásá6

HU 222 398 Bl val, amelyekkel körülbelül 20 és 2000 nmol/liter közötti, előnyösen 60 és 600 nmol/liter közötti vérszint érhető el.

A találmány szerinti fehétjék beadhatók bármilyen hagyományos módon, nevezetesen ebterálisan vagy parenterálisan, például injektálható oldatok vagy szuszpenziók alakjában.

Előnyös az 1. szekvencia-azonosítószámú fehérje.

A találmány további tárgyát képezik olyan gyógyszerkészítmények, amelyek a találmány szerinti vegyületeket tartalmazzák legalább egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyaggal együtt. Ezek a készítmények a szokásos - például az alábbi szakirodalmi helyen: [Remington’s Pharmaceutical Science. 15^th ed. Max Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980)] leírt - módon állíthatók elő.

A találmány további tárgyát képezik DNS-szekvenciák, az ilyen szekvenciákat tartalmazó vektorok, az ilyen vektorokat tartalmazó sejtek, valamint eljárások a találmány szerinti fehérjék és a velük szembeni antitestek rekombinációs előállítására. Ugyancsak a találmány tárgyát képezik olyan izolált és/vagy rekombináns (például genom vagy cDNS) DNS-szekvenciák, amelyek egy, az emberi trombociták kollagén által indukált aggregációját gátló fehérjét kódolnak. A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti, rekombinációs úton előállított fehérjék, például a leírásban megadott szekvenciák.

Az „izolált” kifejezés azt jelenti, hogy a találmány szerinti inhibitor vagy más önálló egység a rekombinációs vagy szintetikus úton vele együtt előállított komponensektől elválasztott (megtisztított) alakban van jelen. Az elválasztásnak vagy tisztításnak minden fokozata beletartozik a találmány oltalmi körébe. Előnyösek az elválasztásnak, illetve tisztításnak olyan fokozatai, amelyek révén az inhibitor gyógyászati célokra felhasználhatóvá válik. Az elválasztásnak ezek a fokozatai (például az aktivitással vagy tisztasággal megadva) rutinszerűen elérhetők például olyan kromatográfiás eljárásokkal, amilyenek a példákban is szerepelnek. További, például a homogenitásig végzett tisztítás rutinszerűen megoldható hagyományos - például az alábbi szakirodalmi helyeken:

[Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed. Murray P. Deutscher. Academic Press (1990)];

[Protein Purification Applications - A Practical Approach, ed. E. L. V. Harris and S. Angel, IRLPress (1990)];

[Protein Purification, Principles and Practice, Róbert Scopes, Springer-Verlag (1982)]; és [Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J-C. Janson and L. Ryden, VCH publishers (1989)] leírt módszerekkel.

A tisztaság a sokféle szokásos módszer bármelyikével - például SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel vagy analitikai HPLC-vel - meghatározható. A tisztított inhibitor a szakmában jártasak számára jól ismert, teljesen rutinszerű módszerekkel, például a Hewick és munkatársai [J. Bioi. Chem. 256, 7990-7997 (1981)] által leírt eljárással felhasználható a fehérje aminosavszekvenciájának meghatározására.

A találmány szerinti inhibitor aminosavszekvenciája felhasználható olyan DNS-próbák szekvenciájának meghatározására, amelyek alkalmasak új inhibitoroknak például más fajokban végzett keresésére. Ezek a próbák rutinszerűen, például automatikus DNS-szintetizáló berendezésekkel szintetizálhatok, és a genomvagy cDNS-könyvtárak szkrínelése - aminek leírása megtalálható például a WO 90/07861 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben - szintén jól ismert eljárás a szakmában jártasak számára.

Tehát a találmány további tárgyát képezi az olyan DNS-szekvencia, amely természetes környezetétől például oldással vagy egy vektoron elválasztva megfelel mind az Asp-Pallidipinhez szükséges DNS- (gén-)szekvenciának (illetve kódolja azt), mind pedig ezen szekvencia muteinjeinek. A mutánsok előállításának módszereit, valamint az ilyen új fehérjék hatásosságának vizsgálatára szolgáló, például a leírásban szereplő szkrínelési módszereket a szakmában jártasak szintén rutinszerűen és hagyományosan alkalmazzák.

Alkalmasak azok a mutánsok, amelyek a fentiekben leírt inhibitor biológiai aktivitásának - például a trombociták kollagén által indukált aggregációját gátló hatásának - legalább egy töredékét, például legalább 5%-át, előnyösen legalább 50%-át, a legelőnyösebben legalább 90%-át mutatják.

A találmány további tárgya egy tisztítási eljárás, amely az alábbi, egymást követő lépésekből áll :

(i) tisztítás kationcserés kromatográfiával;

(ii) tisztítás anioncserével és (iii) tisztítás méretkizárással.

Úgy véljük, hogy a szakmában jártasak a fenti leírás alkalmazásával további részletezés nélkül is teljes mértékben használni tudják a találmányt. Ezért az alábbi példák csak a találmány illusztrálására szolgálnak, annak oltalmi körét nem befolyásolják.

1. példa

Az expressziós vektor felépítése

Az Asp-Pallidipint kódoló találmány szerinti vektor felépítéséhez a következő szensz és antiszensz printereket (indító RNS) alkalmazzuk:

p3:

5’-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3’(WruI) (szekvencia-azonosítószám: 4); és p4:

5’-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTAT-3’/BamHI) (szekvencia-azonosítószám: 5).

A PCR-t (polimeráz láncreakció) nyolc 2 perces ciklusban 94 °C-on, 1 perc 30 másodpercen át 42 °C-on, és 2 perc 30 másodpercen át 72 °C-on végezzük primerpárként p3 és p4, valamint 1 pg minta-DNS (sablon) alkalmazásával. Géltisztítás és /VrwI-gyel és fiazwHI-gyel végzett emésztés után a fragmentumot pSB/pho-ba klónozzuk. Ezután a plazmid előállítására Xmal-gyel emészt7

HU 222 398 Β1 jük, majd az 5’ kinyúló véget mungobabos kezeléssel leetetjük, azután BamHI-gyel emésztjük.

A szerkezetet az inszertált fragmentumoknak az F. Sanger és munkatársai [Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 74 : 5463 -5467 (1977)] által leírt teljes DNSszekvenálásával és egy [³⁵S]dATP-t alkalmazó szekvenálókészlettel ellenőrizzük. A kompetens E. coli Élőnek Pallidipin expressziós szerkezettel vagy üres plazmiddal végzett transzformálását (az utóbbi az úgynevezett mock /hamis/ transzformáció) a J. Sambrock és munkatársai [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY (1989)] által leírt szokásos módszerekkel hajtjuk végre.

2. példa

Az Asp-Pallidipin expressziója és extrahálása

A pSB94-ből származó pSB94/pho plazmid előállításához {lásd: J. Daum és munkatársai [Eur. J. Biochem. 185: 347-354 (1989)]} az S. J. Hayashi és munkatársai [J. Bioi. Chem. 239: 3091-3106 (1964)] szerinti módon készített egyéjszakás E15 tenyészeteket az A. Becker és munkatársai [Protein Expression and Purification 5: 50-56 (1994)] által leírt módon 8 térfogat%-os, alacsony foszfáttartalmú közegben 6 órán át 37 °C-on szaporítjuk. A baktériumokat centrifugálással indukáljuk, majd begyűjtjük, és 1/10 térfogatnyi, 50 mmol/liter Tris-sósavat és 100 mmol/liter nátriumkloridot tartalmazó pH=8-as oldatban szuszpendáljuk. Ezt a készítményt fagyasztjuk, majd felengedjük, és centrifugáljuk, így kapunk egy első felülúszó-frakciót (FF1). A baktériumüledéket szuszpendáljuk, és centrifúgálás előtt szobahőmérsékleten 0,5 mmol/liter szacharózoldatban 10 percig kiegyenlítjük. A centrifugálással kapott felülúszót (FF2) elemzésre félretesszük, az üledéket 1 mmol/liter PMSF-et (fenil-metil-szulfonil-fluorid) tartalmazó jéghideg vízben szuszpendáljuk, és 10 percig jégen inkubáljuk. Ezen ozmózissokk után a sejteket lecentrifugáljuk, így megkapjuk az FF3 felülúszót. A citoplazmás frakciót (CF) tartalmazó üledéket 50 mmol/liter Tris-sósavat és 100 mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó pH=8-as oldatban szuszpendáljuk.

3. példa

A rekombináns Asp-Pallidipin tisztítása

Az Asp-Pallidipin főtömegét tartalmazó felülúszófrakció pH-ját ecetsavval 4,0-re állítjuk, majd a frakciót felvisszük egy FPLC rendszerű (Mono S. Pharmacia) kationcserélő oszlopra. Az oszlopot pH=4,0-es nátrium-acetátban 0—>500 mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó gradienssel mossuk, majd az Asp-Pallidipint 20 mmol/liter nátriumion-koncentrációjú, pH=7,0-es oldattal eluáljuk. Az SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) és az immunoblotting eredményei szerint Asp-Pallidipint tartalmazó eluált frakciókat összegyűjtjük, a pH-t 8,0-ra állítjuk, és az oldatot felvisszük egy Fractogel-EMD-TMAE 650 Merck anioncserélő oszlopra. Az Asp-Pallidipint pH=8,4-es 20 mmol/liter nátriumion-acetátban 0->l mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó gradienssel eluáljuk. A végső tisztításhoz az Asp-Pallidipint tartalmazó eluált frakciókat összegyűjtjük, Seed-Vac (Bachofer) készülékben bepároljuk, majd Superose 12-vel (Pharmacia) méretkizárásos kromatográfíát hajtjuk végre.

4. példa

A trombocitaaggregáció vizsgálata

A vizsgálatot lényegében a C. Noeske-Jungblut közleményében [J. Bioi. Chem. 269: 5050-5053 (1994)] leírt módon végezzük. Ez röviden abból áll, hogy emberi vért gyűjtünk 1/6 térfogatnyi, 71 mmol/liter citromsavat, 85 mmol/liter trinátrium-citrátot és 111 mmol/liter glükózt tartalmazó oldatba. 135 g-vel 20 percig végzett centrifugálással trombocitában gazdag plazmát kapunk. Asp-Pallidipint 500 μΐ trombocitában gazdag plazmával 1 percig 37 °C-on inkubálunk, majd 2 pg/ml kollagént adunk hozzá. Az aggregációt Micron aggretométerrel vizsgáljuk, és meghatározzuk a maximális értéket. Az IC₅₀-érték körülbelül 50 nM. Nem észlelhető jelentős eltérés a vegyületek között attól függően, hogy az Asp jelen van-e az első pozícióban.

Meghatározzuk az E. coli periplazmikus teréből kinyert tisztított Asp-Pallidipin kihozatalát. Trombocitában gazdag plazmát Asp-Pallidipinnel és kontrolianyagokkal inkubálunk. Az aggregációt kollagén hozzáadásával idézzük elő. Pozitív kontrollként nyálból tisztítással kinyert vad típusú Pallidipint használunk. Néhány más szerkezetet is használunk kontrollként a találmány szerinti Asp-Pallidipin előnyeinek bemutatására. A találmány szerinti fehérje és az összehasonlító anyagok kihozatala eltérő (lásd a 2. táblázatot).

2. táblázat

Fajta	Kihozatal
\| Rekombináns Pallidipin	461 pg
Rekombináns arginil-Pallidipin	298 pg
Rekombináns aszpartil-Pallidipin	864 pg

5. példa

A találmány szerinti fehérje jelenlétében csökken a tumorsejtek kollagénhez való tapadása A találmány szerinti fehérje gátolja a tumorsejtek tapadását egy kollagén mátrixhoz. Ezért a vándorló tumorsejtek részben vagy egészben meggátolhatok abban, hogy a szerveken vagy véredényekben megtapadjanak, ha a páciens vérében vagy plazmájában jelen van a találmány szerinti fehéije.

MTLn3 patkányemlő-tumorsejteket ⁵¹Cr-mal jelölünk. Egy lyukakkal ellátott lemezt III típusú egy éjszakán át 4 °C-on kollagénnel borítunk. 2 x1ο⁴ jelzett sejtet 500 μΐ DMEM F12 közegben, 20 mmol/liter Hepes, 1 mmol/liter nátrium-hidrogén-karbonát és 1% BSA jelenlétében 0, 2, 5, illetve 10 μΐ találmány szerinti fehérjével („Superose Pool”, 0,5 mg fehéije/ml) 10 percen át 37 °C-on inkubálunk. Ezután a szuszpenziót áthelyezzük egy kollagénnel bevont lyukba, és 2 órán át 37 °C8

HU 222 398 Β1 on inkubáljuk. Végül a lukakat kimossuk, a megtapadt sejteket 1 mól/liter nátrium-hidroxid-oldattal eltávolítjuk, és méijük a megtapadt sejtek radioaktivitását.

3. táblázat

A hozzáadott inhibitor mennyisége, μΐ	A sejtek megtapadása (db/1 000 000)
0	2215
2	2071
5	1608
1 ¹⁰	1081

6. példa

Antitesttermelés

0,5 ml komplett Freund’-féle adjuvánshoz körülbelül 100 pg-ot adunk a példák szerinti módon tisztított inhibitorból, és az emulziót szubkután injekció alakjában beadjuk egy nyúlnak. Körülbelül 2 hét múlva beadunk 20 egy második injekciót, amely 80 pg inhibitort és 0,5 ml inkomplett Freund’-féle adjuvánst tartalmaz. Az injektálás után néhány szérummintát veszünk a specifikus antitestek termelésének ellenőrzésére. A mintákat Westem-blot-módszerrel vizsgáljuk.

12,5%-os SDS-poliakrilamid-gélen 20 ng inhibitort alkalmazunk, és az elektroforézist, a blottolást (leitatás) 5 és kimutatást az E. Harlowe és D. Lane [Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory (1988)] által leírt módon végezzük (a vizsgált szérum hígítása 1:5000; nyúlban készített ellenanyaggal szemben kecskében készített peroxidáz IgG konjugátum, 10 mint második antitest; kimutatás: az Amersham Internationaltől /Amersham, UK/ beszerzett ECL-kittel). A biot azt mutatja, hogy az antiszérum specifikusan reagál a tisztított inhibitorral.

A fenti példák hasonló sikerrel megismételhetők oly 15 módon, hogy a találmány szerinti, általánosan vagy specifikusan leírt reagenseket és/vagy reakciókörülményeket a példákban használtakkal helyettesítjük.

A fenti leírásból az átlagosan művelt szakember megismerheti a találmány alapvető jellemzőit, és különböző változtatások végrehajtásával különböző területeken, változó körülmények között történő felhasználáshoz adaptálhatja anélkül, hogy a találmány szellemét vagy oltalmi körét megsértené.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő:

(A) Név: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT (B) Utca: Müllerstrasse 172-178.

(C) Város: BERLIN (E) Ország: NSZK (F) Irányítószám: (ZIP): 13353 (G) Telefon: (030)-468-2085 (H) Telefax: (030)-468-2058 (ii) A bejelentés címe: Eljárás Pallidipin, egy módosított, kollagénindukált vérlemezke-aggregációt gátló vegyület előállítására (iii) A szekvenciák száma: 5 (iv) Computerrel olvasható forma:

(A) Médium típusa: Floppy disk (B) Computer: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentin Release #1,0 m-version #1.30 (EPO) (v) A bejelentés jelenlegi adatai:

Bejelentési szám: EP 94250224.6 (2) Információ az 1. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 172 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (iii) Elméleti: nincs (v) Fragmentum típusa: N-terminális (xi) Szekvencialeírás: 1. azonosító számú szekvencia:

Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu 15 10 15

Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly 20 25 30

HU 222 398 BI

Pro

Ly s

Glu

Gin

Va 1

Cys

Arg

G1 u

Tyr

Lys

Thr

Lys

As n

Ser

Asp

35

40

45

G1 y

Thr

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr

Ly s

Thr

Gly

50

55

60

Lys

Pro

Tyr

Hi s

Ser

Glu

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

65

70

75

80

Gly

Lys

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Cys

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

85

90

95

Gly

Ly s

Lys

Ile

Hi s

Va 1

Glu

Thr

Ser

Val

Ile

Al a

Thr

Asp

Tyr

100

105

110

Lys

Asn

Tyr

Al a

Leu

Gin

Se r

Cys

Thr

Ly s

Thr

Glu

Ser

Gly

Ile

115

120

125

Alá

Asp

Val

Leu

Gin

Thr

Lys

Ly s

Glu

G1 y

Val

Asp

Pro

130

135

140

Gly

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Lys

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Leu

As p

Asp

Trp

145

150

155

160

Phe

Ser

Arg

Ser

Ly s

Val

Asn

Cy s

Asp

Asn

Me t

Lys

165 170 (2) Információ a 2. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 171 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (ii) Elméleti: nincs

(xi) Szekvencialeírás: 2. azonosító számú szekvencia
Asp Glu Glu 1	Cys Glu Leu Me t 5	Pro	Pro Gly 10	Asp Asn	Phe	Asp	Leu 15	Glu
Lys Tyr Phe	Ser Ile Pro His 20	Val	Tyr Val 25	Thr His	Ser	Arg 30	Asn	Gly
Pro Lys Glu 35	Gin Val Cys Arg	Glu 40	Tyr Lys	Thr Thr	Lys 45	As n	Ser	Asp
Gly Thr Thr 50	Thr Thr Leu Val 55	Thr	Ser Asp	Tyr Lys 60	Thr	Gly	Gly	Lys
Pro Tyr His 65	Ser Glu Leu Lys 70	Cy s	Thr Asn	Thr Pro 75	Lys	Ser	Gly	Val 80
Lys Gly Gin	Phe Ser Val Glu 85	Cy s	Glu Val 90	Pro Asn	Gly	Asn	Gly 95	Gly
Lys Lys Lys	Ile His Va1 Glu 100	Thr	Ser Val 105	Ile Alá	Thr	As p 110	Tyr	Ly s
Asn Tyr Alá 115	Leu Leu Gin Ser	Cy s 120	Thr Lys	Thr Glu	Ser 125	Gly	Ile	Al a

HU 222 398 Bl

Asp Asp 130

Val Thr 145

Ser Arg

Val Leu

Ser Val

Ser Lys

Leu

Leu Gin 135

Lys Ser 150

Asn Cys

Thr Lys

Val Asn

Asp Asn

Val 165 (2) Információ a 3. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzók:

(A) Hosszúság: 172 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (ii) Elméleti: nincs (xi) Szekvencialeírás: 3. azonosító számú szekvencia Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro 1 5

Ile

Lys Glu

Trp Ser 155

Me t Lys 170

Gly Val 140

Leu Asp

As p

Asp

Pro Gly

Trp Phe 160

Lys	Tyr
Pro	Lys
Gly	Thr 50
Lys 65	Pro
Gly	Lys
Gly	Ly s
Lys	Asn
Alá	Asp 130
Gly 145	Val
Phe	Ser

Phe Ser 20

Glu Gin 35

Thr Thr

Tyr His

Gly Gin

Lys Lys 100

Tyr Alá 115

Asp Val

Thr Ser

Arg Ser

Val

Thr

Ser

Phe

Ile

Leu

Va 1

Lys

165

Pro His

Cys Arg

Thr Leu 55

Glu Leu 70

Ser Val

His Val

Leu Gin

Leu Leu 135

Leu Lys 150

Val Asn

Val Tyr 25

Glu Tyr 40

Val Thr

Ly s	Cy s
Glu	Cy s
Glu	Thr 105
Ser 120	Cys
Gin	Thr
Ser	Val
Cy s	As p

Gly Asp 10

Val Thr

Lys Thr

Ser Asp

Thr Asn 75

Glu Val 90

Ser Val

Thr Lys

Lys Lys

Asn Trp 155

Asn Me t 170

Asn Phe

His Ser

Thr Lys 45

Tyr Lys 60

Thr Gin

Pro Asn

Ile Alá

Thr Glu 125

Glu Gly 140

Ser Leu

Lys

Asp

Arg

Asn

Thr

Ly s

Gly

Thr

110

Ser

Val

As p

Leu Glu 15

Asn Gly

Ser Asp

Gly Gly

Ser Gly 80

Asn Gly 95

Asp Tyr

Gly Ile

Asp Pro

Asp Trp 160 (2) Információ a 4. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 31 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás: desc=„szenszprimer” (ii) Elméleti: nincs

HU 222 398 Β1 (iv) Antiszensz: nincs (xi) Szekvencialeírás: 4. azonosító számú szekvencia GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G (2) Információ az 5. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 34bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: egyfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás: desc=„antiszenszprimer” (iii) Elméleti: nincs (iv) Antiszensz: van (xi) Szekvencialeírás: 5. azonosító számú szekvencia GCGATAGGAT CCAAGCTTAT TACTTCATGT TATC

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 20

1. Eljárás olyan rekombináns Pallidipin fehérje (Asp-Pallidipin) előállítására, amely emlősök trombocitáinak kollagén által indukált aggregációját gátolja, és 25 (i) egy, a Pallidipin fehéqék közül választott fehérjét (Pallidipin), és (ii) aszparaginsavat tartalmaz, amely aszparaginsav peptidkötéssel kapcsolódik a Pallidipin N-terminális végéhez 30

- így az Asp-Pallidipin aminosavszekvenciája

a) aa) az 1. szekvencia-azonosítószámon, bb) a 2. szekvencia-azonosítószámon vagy cc) a 3. szekvencia-azonosítószámon megadott;

vagy

b) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyikének egy alléi változata vagy muteinje, amely változatok vagy muteinek aktivitása a természetes fehéije aktivitásával megegyezik; vagy

c) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyike szerinti olyan fehéqe vagy annak egy olyan, a b) pont szerinti változata vagy muteinje, amely transzláció utáni módosítást tartalmaz, és aktivitása a természetes fehéqe aktivitásától eltérő -, azzal jellemezve, hogy aa) legalább egy baktériumot egy alkalmas vektorral transzfektálunk, amely vektor (i) egy, a rekombináns Asp-Pallidipint kódoló első DNS- vagy cDNS-molekulából, (ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilisan kapcsolódó csoportot tartalmaz

- ezáltal a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehéije az expresszió és a periplazmába történő átvitel során úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett Asp-Pallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz -; ezt követi bb) a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehéije expressziója; majd cc) az Asp-Pallidipint a baktérium citoplazmájából a periplazmába transzportáljuk, így az előfehérjét a transzport során legalább egy proteázzal hasítva megkapjuk az érett Asp-Pallidipint;

dd) az Asp-Pallidipint a periplazma extrahálásával izoláljuk; és ee) az Asp-Pallidipint tisztítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő vektorral - amely (i) egy, a rekombináns Asp-Pallidipint kódoló első DNS- vagy cDNS-molekulából, (ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilis kapcsolócsoportot tartalmaz, és ezáltal a

35 szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje az expresszió és a periplazmába történő átvitel során úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett Asp-Pallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz - transzfektált baktériumot olyan körülmények között

40 tenyésztjük, amelyek révén (A) végbemegy az Asp-Pallidipint és a szignálpeptidet tartalmazó előfehéqe expressziója, és (B) az Asp-Pallidipin transzportja a baktérium citoplazmájából a periplazmába, így az elófehéijét a

45 transzport során legalább egy proteázzal hasítva érett Asp-Pallidipint kapunk, és az így kapott Asp-Pallidipint a periplazma tisztításával kinyerjük.
3. Egy 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzaljel50 lemezve, hogy a szignálszekvenciát kódoló DNS kódolja az alkalikus foszfatáz (APase) szignálszekvenciáját.
4. Egy, az 1-3. igénypontok valamelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként E. colit alkalmazunk.

55
5. Asp-Pallidipin rekombináns fehéqe, amely emlősök trombocitáinak kollagén által indukált aggregációját gátolja, és (i) egy, a Pallidipin fehérjék közül választott fehérjét (Pallidipin), és 60 (ii) aszparaginsavat

HU 222 398 Bl tartalmaz, amely aszparaginsav peptidkötéssel kapcsolódik a Pallidipin N-terminális végéhez, így az Asp-Pallidipin aminosavszekvenciája

a) aa) az 1. szekvencia-azonosítószámon, bb) a 2. szekvencia-azonosítószámon vagy cc) a 3. szekvencia-azonosítószámon megadott; vagy

b) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyikének egy alléi változata vagy muteinje, amely változatok vagy muteinek aktivitása a természetes fehéije aktivitásával megegyezik; vagy

c) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyike szerinti olyan fehérje vagy annak egy, a b) pont szerinti olyan változata vagy muteinje, amely transzláció utáni, a természetes fehéije aktivitását lényegében nem befolyásoló módosítást tartalmaz.
6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns fehéije, azzal jellemezve, hogy az Asp-Pallidipin előállítása a következő lépésekből álló eljárással megy végbe:

aa) legalább egy baktérium transzfektálása egy alkalmas vektorral amely vektor (i) egy, rekombináns Asp-Pallidipint kódoló első DNS- vagy cDNS-molekulából, (ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából, és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilisan kapcsolódó csoportot tartalmaz - ezáltal a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje az expresszió és a periplazmába történő átvitel során úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett Asp-Pallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz;

bb) a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehéije expressziója;

cc) az Asp-Pallidipin transzponálása a baktérium citoplazmájából a periplazmába, így az előfehérjét a transzport során legalább egy proteázzal hasítva Asp-Pallidipint kapunk;

dd) az Asp-Pallidipin izolálása a periplazma extrahálásával, és ee) az Asp-Pallidipin tisztítása.
7. Az 5. igénypont szerinti rekombináns fehéije, azzal jellemezve, hogy az Asp-Pallidipin előállítása a következő eljárással megy végbe:

egy megfelelő vektorral - amely (i) egy, a rekombináns Asp-Pallidipint kódoló első DNS- vagy cDNS-molekulából, (ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilisan kapcsolódó csoportot tartalmaz, és ezáltal a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehérje az expresszió és a periplazmába történő átvitel során úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett Asp-Pallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz transzfektált baktériumot tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek révén (A) végbemegy az Asp-Pallidipint és a szignálpeptidet tartalmazó előfehérje expressziója, és (B) az Asp-Pallidipint a baktérium citoplazmájából a periplazmába transzportáljuk. így az előfehérjét a transzport során legalább egy proteázzal hasítva érett Asp-Pallidipin képződik, és az így kapott Asp-Pallidipint a periplazma tisztításával kinyeqük.
8. Egy 6. vagy 7. igénypont szerinti fehéije, azzal jellemezve, hogy a szignálszekvenciát kódoló DNS egy alkalikus foszfatáz (APase) szignálszekvenciát kódol.
9. Gyógyszerkészítmény, amely az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti Asp-Pallidipint és egy gyógyászatilag elfogadható hígító- vagy hordozóanyagot tartalmaz.
10. Az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti AspPallidipin felhasználása egy, az atherosclerosis vagy trombózis kezelésére vagy a myocardialis infarktus kezelése után fellépő ismételt elzáródás megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
11. Az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti AspPallidipin felhasználása a rák vagy áttételes ráksejtek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
12. Eljárás Asp-Pallidipin tisztítására, amely az alábbi, egymást követő lépésekből áll:

(i) tisztítás kationcserés kromatográfiával;

(ii) tisztítás anioncserével és (iii) tisztítás méretkizárással.
13. Egy rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy (i) egy első DNS- vagy cDNS-molekulából - amely egy olyan rekombináns Asp-Pallidipint kódol, amelynek aminosavszekvenciája

a) aa) az 1. szekvencia-azonosítószámon, bb) a 2. szekvencia-azonosítószámon vagy cc) a 3. szekvencia-azonosítószámon megadott; vagy

b) az 1-3. azonosító számú szekvenciák bármelyikének egy alléi változata vagy muteinje, amely változatok vagy muteinek aktivitása a természetes fehéije aktivitásával megegyezik;

(ii) egy alkalmas szignálpeptid-szekvenciát kódoló második DNS-molekulából és (iii) egy alkalmas promoterből álló operábilisan kapcsolódó csoportot tartalmaz, és ezáltal egy alkalmas bakteriális gazdaszervezetben lejátszódó expresszió után a szignálpeptidet és az Asp-Pallidipint tartalmazó előfehéije úgy hasad, hogy az aszparaginsav az érett Asp-Pallidipin aminosavszekvenciájának +1 helyén lesz.
14. Egy 13. igénypont szerinti vektorral transzformáit bakteriális gazdaszervezet.
15. Egy 14. igénypont szerinti bakteriális gazdaszervezet, amely E. coli baktérium.