HU227996B1 - A von Willebrand faktort (vWF) hasító proteáz polipeptid, a polipeptidet kódoló nukleinsav, és a polipeptid használata - Google Patents

Description

A jelen találmány tárgyát a von Willebrand faktort hasító pr.oteáz (vWF-cp), v^y annak részleges szekvenciája, a vWF-cp polipeptid. aminosav szekvenciáját kódoló nukleinsav molekula, valamint a poüpeptidet tartalmazó készítmény képezi. A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a vWF-cp polipeptid alkalmazása anti-vWF-cp polipeptid ellenanyagok, valamint a trombózis vagy tromboembóliás betegség profilaxisában és terápiájában használható készítmény előállítására.

A von Willehrand faktor egy glikoprotein, ami a plazmában kering több multimer formájában, amiknek a mérete körülbelül 500-20000 kDa. A von Willehrand faktor mnltímer formái 250 polipeptid alegységből állnak, amiket diszulfíd-híd kapcsol össze. A von Willebrand faktor hajtja végre a vérlemezke kiindulási tapadását a szuhendotéliumhoz, vagy egy károsodott érfalhoz, bár úgy tűnik, hogy csak a legnagyobb multimerek mutatnak hemosztatikus aktivitást. Az Ilyen, nagv molekulatömegét von

Willehrand faktor multímerek az endoteliális sejtek Weibel Pala.de tesíjeíben tárolódnak, és az a vélemény alakult ki, hogy az endoteliális sejtek szekretálják a von Willehrand faktor polimer formáit. A von Willebrand faktornak azoknak: a formáiról, ί

.. 2 · amiknek alacsony a molekulasúlyuk (alacsony ruolekula.sűlyú, vagy LMW vWPj, azt gondolják, hogy a nagyobb multimerek proteolltikus hasításából származnak.

A normális plazmában jelenlevő von Willebrand faktor egy kis része 139, 176 és 140 kDa méretű fragmensek formájában kering, amik a von Willebrand faktor in vivő proteolltikus eoomlásából származnak, a 140 kDa méretű fragmens az N-terminális· régióból származik, és a 176 kDa méretű fragmens az alegység C~terminális régiójából származik. Ha a von Willebrand faktor alacsony molekulasúlya (LMW) formáit izoláljuk a normál humán plazmából, és SDS-PAGE-nak (poliakrilamid gélelektroforézísj vetjük alá a. diszulfid hidak redukciója után, a. von Willebrand faktor fragmensek szokatlanul nagy mennyiségét találhatjuk. Ez a megfigyelés összhangban van azzal a véleménnyel, hogy a von Willebrand faktor LMW formái részben vagy' ;g a nagy szar , proteo]

A von Willebrand faktor proteolitikus lebomlása egy fiziológiás folyamat az egészséges emberekben, a 2A típusú von Willebrand betegségben (vWD| szenvedő betegekben felgyorsulhat, és ennek következtében ezekből a betegekből hiányoznak azok a vWF multimerek, amiknek legnagyobb a molekulatömegük. A nagy' von Willebrand faktor multímerek hiánya, és a proteolitikus fragmensek megnőtt szintje is megfigyelhető a szerzett von Willebrand betegségben (vWDj, ami a mieloproliferizácíős szindrómához kapcsolódik, ami megnőtt in vivő profeolízíst is mutat ebben az állapotban.

A trombotikus trombocítopénia purpureában (ΤΓΡ) szenvedő betegekben viszont szokatlanul nagy méretű von Willebrand * * ♦ faktor multímereket. lehet kimutatok és ezekben a betegekben a von Willebrand faktornak a vérlemezkékhez való fokozott kötődését demonstrálták [Moake és mtsai: The New England Journal of Medicine 307, 1432-1435 (1982)] . A családi TTP a von Willebrand faktor proteáz .súlyos kongenitális defioienciához kapcsolódik., míg a von Willebrand faktort hasító proteázokat gátló auto-eUenanyagok jelenléte figyelhető m.eg nem-családi TTP-ben szenvec

A von Willebrand faktor TTP-hez kapcsolódó nagy multimerje! normális körülmények kősóit eltűnnek, miután a beteget transzfundáltuk normális, frissen fagyasztott plazmával. Jelenleg a plazmacsere a legfontosabb kezelése a. TTP-nek, bár ennél a terápiánál szignifikáns mellékhatásokat írtak le. A vWF proteáz súlyos kongenitális deficienciájának létét olyan betegekben mutatták ki, akik családi TTP-ben szenvednek, és a von Willebrand faktort hasító proteázt gátló auto-ellenanyagokat megfigyelték nem-családi TTP-ben szenvedő betegeknél.

Számos proteázröl mutatták ki, hogy képesek elhasítani a von Willebrand faktort, ezzel akadályozva, a vérlemezkékhez való affinitását. Azonban a von Willebrand faktor m vitro hasítása ezekkel a proteázokkal mindegyik esetben olyan hasítási termékeket eredményez, amik eltérnek az ίη vivő hasításból származó π

Tehát például, miközben a plazmin képes számos pepfidkötest elhasítaní a von Willebrand faktorban, a plazminnal kezelt von Willebrand faktor megtart egy nagy molekulasúlyú mag régiót, ami megtartja a vérlemezke agglutinációs aktivitásának körülbelül '70 %-át (amit a rístocetín koíaktorként határozunk meg). Egy 34 kDa-os peptid hasad le az egyes von Willebrand faktor

- 4 · *» alegységek N-terminálisáról a plazmin kezelés korai időszakában, és az öyan plazminnal indukált fragmensek epitop térképezése azt mutatja, hogy ezek a fragmensek a von WiUebrand faktor olyan régióiból származnak, amik eltérnek a keringő plazmában levő von WiUebrand faktor fragmensektől.

A sertés pankreatikus elasztázról és a humán leukocitákból felszabaduló szerín proteázokról is kimutatták, hogy a von WiUebrand faktort proteolítikusan bontják, aminek, eredménye a nagy multimerek elvesztése. A bomlási termékek epitop térképezése ismét azt mutatja, hogy ezek a fragmensek eltérnek azoktól is, amik a. normál plazmában vannak jelen, valamint a 2A típusú von WiUebrand faktorban. Emellett, egy calpain-szerű fehérjéről, ami a humán vérlemezkékhöl szabadul fel, kimutatták,, hogy elbontja a nagy von WiUebrand faktor multimereket, és olyan von WiUebrand faktor fragmenseket generál, amik hasonlítanak az in vzvo megfigyeltekhez.

A jelen találmány tárgya egy von WiUebrand faktort hasító proteáz (vW'F-ep) polipeptid, vagy annak részleges szekvenciája.

A jelen találmány tárgya továbbá egy vWF-cp polipeptidet tartalmazó készítmény .

A jelen találmány tárgya továbbá egy olyan nukleinsav molekula, ami egy vWF~cp polipeptid amínosav szekvenciáját kódolja.

A jelen találmány tárgya továbbá egy rekombináns vWF-cp polipeptid,

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns vWFcp polipeptid előállítására.

i

A. jelen találmány tárgya továbbá eljárás vWF tisztítására, egy vWF-cp polipeptid,. vagy annak részleges szekvenciájának használatával, továbbá az anti-vWF-cp

A jelen találmány tárgyát Aid ligandumok.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a mellékelt ábrákat. Az 1. ábrán látható a vWF-cp sematikus tisztítási sémája plazmából.

A 2. ábrán látható a tisztított. vWF-ορ SDS~PAGE~ja, nemredukáló (A) és redukáló körülmények között, DTT jelenlétében

A 3. ábrán a vWF-cp polipeptid részleges nukleotid- és aminosav szekvenciája látható.

A 4. ábrán a vWF-et hasító proteáz gén genomiálís lokalizációjának sematikus ábrázolása látható.

Az 5. ábrán a vWf-et hasító proteáz teljes aminosav·· és nukleotid szekvenciája látható. A szígnálpeptíd kezdete és vége, metalloproteázok, a eiszteinben gazdag régió jACR), a thrombospondin l~es típusú motívum. (TSP 1), és a disintegrinszerú motívum (RGD) doméneket nyilak jelzik. A furin hasítási helyet, a katalitikus helyet és a Met-burkot aláhúztuk. A feltételezett N-giikozhezésí helyeket csillagokkal jelezzük.

A 6. ábrán mutatjuk be a von Willebfand faktort hasító proteáz, valamint az ADAM-TS család humán tagjai domén-szervezodésének sematikus ábrázolását. A von Wíllebrand faktort hasító proteáz (ADAMTS 13j, és az összes ismert humán ADAMTS fehérje domén-struktúráját bemutatjuk. Az ADAMTS 10 nem található meg az adatbázisokban, és az ADAMS 11 azonos az ADAMTS 5-tel.

,U

A 7. ábrán azoknak a sejteknek a Western biot elemzése látható, amik egy vWF-ep pohpeptídeí kódoló szekvenciát tartalmazó vektorral, vannak transzíektálva, az ábrán az 1, sávban a standard molekulasúly markor látható, a 2. sávban a kontroll vektor cDNS3.l(+j, és a 3. sávban a pCMV-vWFep vektor látható. A specifikus vWF-cp polipeptld csíkot nyíl mutatja.

A 8. ábrán a. vWF-ep aktivitás von Willebrand faktorra gyakorolt hatását mutatjuk he SDS-FAGE-val. az ábrán az 1. sávban a tisztított plazmatíkus von Willebrand faktor látható, kontrollként, a 2. .sávban a humán plazmával inkubált normál von Willebrand faktor látható, a 3. sávban a pufferrel, mint kontrollal inkubált von Willebrand faktor látható, a 4. sávban a kontroll c.DNA3.1(+) vektorral transzfektáit SK~Hep sejtek sejtlizátumával inkubált von Willebrand faktor látható, és az 5. sávban a vWF-cp-t expresszálö pCMV-vWFcp vektorral transzfektáit SKHep sejtek sejtlizátumával inkubált von Willebrand faktor látható.

A jelen találmány egyik tárgya egy vWF-cp polipeptld, ami tartalmaz a) egy aminosav szekvenciát, amit a következő csoportból választunk ki: 1. számú szekvencia, 2. számú szekvencia,

3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú szekvencia, vagy bj egy olyan aminosav szekvenciát, .ami legalább 80%-os azonosságot mutat az a) aminosav szekvenciával. A polipeptld molekulák mutathatnak legalább 90%-os, vagy legalább 95%-os azonosságot az aj aminosav szekvenciával· A polipeptidnek előnyösen az 5·. ábrán bemutatott aminosav szekvenciája van, vagy annak egy része, ami legalább 12, előnyösen legalább 15 amínosavböl ált A vWF-cp polípeptíd előnyösen von Willebrand faktort hasító aktivitással rendelkeznek. A. jelen találmány szerinti vWF'Ύ cp poupepna előnyösen megtartja a von Wiiieorand íaktor proteáz aktivitását szerin proteáz inhibitor és calpaín proteáz inhibitor jelenlétében. A szerin proteáz inhibitor lehet diizopropilfluorfoszfát, vagy annak bármilyen analógia, ami szerin proteáz inhibitor .aktivitással rendelkezik, A calpaín inhibitor lehet T-LeuLeu~Tyr-CHN2, vagy annak bármilyen analógja, ami calpaín inhibitor aktivitással rendelkezik,

A „polipeptid szakkifejezés jelentése amínosav csoportok lánca, amiket peptidkötések kapcsolnak össze, az egyik amínosav csoport α-karboxi szénatomja és a kővetkező amínosav csoport «-.nitrogénje között, és 10 vagy több, egymáshoz kapcsolt amínosav csoportot tartalmaz, A polipeptid tartalmazhat több mint 20, genetikailag kódolt aminosavat, A „polipeptid” szakkifejezés vonatkozik rövid láncokra, azaz például peptidekre,. oligopeptidekre vagy oligomerekre, és vonatkozik hosszabb láncokra.

itese olyan, ammosav -szekvenciák, amiket vagy természetes folyamatok, azaz például poszt-transzlációs módosítások, vagy a szakterületen ismert kémiai módosítások módosítottak, A módosítások, a polípeptidben bárhol előfordulhatnak. A módosítás eredményezhet egy polipeptid variánst, aminek amínosav szekvenciája egy vagy több helyettesítéssel, addíciővai, delécióval, fúzióval vagy ezek bármilyen kombinációjával eltérhet az. eredeti polípeptídétöl, vagy lehet természetes variáns, azaz például egy allélvariáns, vagy egy nem-természetes variáns,, amit mutagenezíssel vagy génsebészeti módszerekkel lehet előállítani. A polipeptid lehet processzálatlan, vagy részben processzált, prekurzor formában, „érett fehérje formájában, vagy lehet egy olyan fragraens, aminek az amínosav szekvenciája, teljesen azonos a t* ** hosszabb polipeptíd lánc egy részének (nem teljes egészének) aminosav szekvenciájával. A fragmens lehet egy hosszabb lánc rövidebb, egyetlen egybefüggő régiója, vagy lehet egy nagyobb polipeptidben, aminek egy részét képezi. A polipeptíd fragmens tartalmazhat például egy csonkított poiipeptidet, ami a vWF-cp részleges aminosav szekvenciájával rendelkezik, A „fragmens” lehet egy biológiailag aktív fragmens, ami befolyásolja a von Willebrand faktor proteáz aktivitását, beleértve azokat is, amik hasonló, vagy' jobb aktivitással, vagy’ éppen kisebb aktivitással rendelkeznek.

Az „azonosság” szakkifejezés jelentése az, hogy egy polipeptíd aminosav szekvenciája azonos egy olyan polipeptíd aminosav szekvenciájával, ami az 1. számú szekvencia, 2« számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia vagy 5. számú szekvencia aminosav szekvenciáját tartalmazza. A „legalább 80%es azonosság” szakkifejezés azt jelenti, hogy az aminosav szekvencia azonos, azzal a kivétellel, hogy a polipeptid-szekveneia 100 aminosavanként kevesebb mint 20 aminosavban eltér. A „legalább 90% azonosság’, vagy „legalább 95% azonosság’ 10-nél kevesebb, vagy 5-né.l kevesebb különbséget jelent. 10Ö amínoA „von Willebrand faktort hasító proteáz” (vWF~cp) szakkifejezés jelentése egy olyan fehérje vagy polipeptíd, ami von Willebrand faktort hasító aktivitással rendelkezik, és a nagy moleknlasúlyű von Willebrand faktor multimereket alacsonyabb molekula sú lyú molekulákká hasítja, amik még rendelkeznek a von Willebrand faktor aktivitásával és tulajdonságaival

A „von Willebrand faktort hasító proteáz polipeptíd” szakkifejezés jelentése olyan polipeptíd, ami legalább 10 aminosav cső¢, X fc * *

_ς «·»· portot tartalmaz. A processzálatlan polipeptid teljes aminosav szekvenciája 1427 aminosavat tartalmaz. Az „érett* polipeptid, amí egy nagyobb processzálatlan polipeptid része, normális esetben a 75-ös aminosavhoz közel kezdődik, AAGGlLH-val, és folytatódik a Ctermínálisíg. Az érett von Willebrand faktort hasító proteáz számított molekulasúlya körülbelül 45 kDa. Tartalmazhat további aminosavakat is, amik lehetnek szekréciós, vagy vezérszekvenciák, pro-szekvenciák, olyan szekvenciák, amik segítik a tisztítást vagy azonosítást, ilyenek például a többszörös His csoportok, a FLAG jelölés vagy olyan szekvencia, ami a rekombináns módszerrel történő előállítás során a stabilitáshoz a⁴A „von faktort hasító aktivitás* szakkifejezés jelentése fiziológiás von Willebrand faktort hasító aktivitás, amit a. következők definiálnak; 1) a von Willebrand faktor hasítása, a. 843Iyr~843M.et kötésnél, 2) közvetlen proteolitikus aktivitása van, ami a szingulett struktúrájú von Willebrand faktort szatellita struktúrájúvá alakítja át, és 3) megtartja az aktivitását szerin proteáz inhibitor, azaz például diizopropíl fluorofoszfát (D-FPj jelenlétében, valamint calpaín proteáz inhibitor, azaz például ka.rbobenzfio.xi (Z) peptidíl díazometílketon inhibitor (Z-LeuLeu-Tyr-CHNx) jelenlétében. A jelen találmány szerinti proteolitikus egységek hatásukat kifejthetik közvetve is, más effeklor fehérjén, azaz például egy proteázon keresztül. Ez a polipeptid kialakíthat egy aktív von Willebrand faktort hasító komplexet, egy fémionnal, amit a. következők közül választhatunk ki: üa~h Sr²*, Mg²⁺ és Bá²u Az előnyben részesített fémion a. Ca²*. Ez az ipes fiziológiásán elhasítani a von Willebrand aktív komplex kt faktort,, az előzőkben ismertetett módon. A jelen találmány sze- ΙΟ *** *

wso rínti polipeptid von Willebrand faktort hasító aktivitása bármelyik, a szakirodalomban, ismertetett meghatározható, azaz például Furlan és munkatársai módszerével [Furlan és mtsai: Blood Egy másik változat szerint

87, 4223-4234 (1996); WO 00/ egy kollagén-kötési esszé, azaz például az EP 0 816 852 szabadalmi leírásban ismertetett esszé ís használható teszt-rendA jelen találmány egyik tárgya egy izolált polipeptid, ami olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, ami legalább 8ö%-os azonosságot mutat a kővetkezők közöl választható aminosav szekvenciákkal: 1. számú szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú szekvencia. A jelen találmány ezen tárgyának egyik megvalósítási módja szerint az izolált polipeptid olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, amit a következők közül választhatunk ki: 1. szám ü szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú szekvencia.

Az „izolált* szakkifejezés azt. jelenti, hogy a. természetes állapotához képest meg van változtatva, és/vagy az eredeti környezetéből el van távoliévá.

A jelen találmány tárgya továbbá egy lényegében tiszta vWF~ep polipeptid, ami a következőket tartalmazza: a) aminosav szekvencia, amit a következők közül választhatunk ki: L számú szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú szekvencia, vagy b) aminosav szekvencia, ami legalább 80%-os azonosságot mutat az a) pontban említett aminosav szekvenciákkal.

A „lényegében tiszta'' szakkifejezés olyan tisztaságot jelent, hogy a vWF-cp aktivitással rendelkező polipeptid láncok az ossz- π

Λ fehérjéhez viszonyítva körülbelül 50% fölötti mennyiségben, inkább 80% fölötti mennyiségben, de az a legelőnyösebb, ha körülbelül 90% mennyiségben vannak jelen, a plazmában levő von Willebrand faktor proteáz aktivitáshoz viszonyítva. A tisztaságot ügy határozzuk meg, mint a nátrium-dodedl-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissei meghatározott (ezüsttel festett vagy Coomassie-val festett), és Western blottal meghatározott tisztaságot, es a von Willebrand faktor proteáz fehérjének az össz-fehérje mennyiségéhez viszonyított arányát, és az említett tisztaság előnyösen nagyobb mint körülbelül 98%. Ha a tisztított vWF-cp polipeptidet plazmából tisztítjuk, akkor a készítmény a kiindulási enzimaktivitásnak legalább 0,001-1%-át, előnyösen a plazma-fehérje kiindulási mennyiségének 0,002%-át és legalább 1%-át, előnyösen a kiindulási, enzimaktivitásnak legalább 2,3% át tartalmazza, ami részlegesen inaktiváíodhat a tisztítási eljárás során. Egy, a jelen találmány szerinti vWF-cp polipeptidet tartalmazó készítmény lényegében mentes a von Willebrand faktortól vagy a von Willebrand faktor fragmensektöl, azaz von Willebrand faktor tartalma 5% alatt, előnyösen a kimutatási határ alatt van, a von Willebrand faktor kimutatására használt esszével, azaz- például az EP 0 816 852 számú szabadalmi leírásban ismertetett kollagén esszével.

A lényegében tiszta vW'P-cp polipeptid látszólagos molekulasúlya körülbelül 170 kDa, 160 kDa, vagy 120 kDa, redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE elemzéssel.

A lényegében tiszta vWF-ep polipeptid látszólagos molekulasúlya körülbelül 150 kDa, 140 kDa, 130 kDa vagy 110 kDa nemredukálő· körülmények között végzett SDS-PAGE· elemzéssel.

Az SDS-PAGE-í redukáló körülmények között, vagy nemredukáló körülmények között hajtjuk, végre. A szakterületen jól ismert, hogy az SDS-PAGE-val meghatározott molekulasúlyok látszólagos molekulasúlyokat eredményeznek, amik eltérhetnek a natív, nem-denaturált fehérje molekulasúlyától.

A nem-denaturált anyag tömegspektroszkópiával való elemzése nagy molekulasúlyok széles csúcsait mutatja. Ez a megfigyelés összhangban van a megjelenéssel a gélszürésí kísérletekben., ami azt sugallja, hogy az ebben a készítményben levő fehérjék fiziológiás körülmények között hajlamosak a polimerizáciöra (a c kistér in tulajdonsága).

A jelen találmány szerinti polipeptid bármilyen, vWF-cp polipeptidet tartalmazó forrásból izolálható.

A „forrás” szakkifejezés jelentése humán plazma, a jelen felűlúszöja, a jelen találmány szerinti polípeptidet expresszáiö transzgenikns állatok teje vagy más testfolyadéka.

A vWF-cp polipeptid tisztítását kromatográfiás lépések kombinációjával hajthatjuk végre, beleértve az immunaffinításkromatográfiát, a gélszűrést és a ioncserélő kromatográfiát. Például az első lépés lehet ímmunaffiniíás-kromaíográfia, a második lépés lehet gélszűrés, ámít egy vagy több további imniunaífinításkromatográfiai lépés követ. A további tisztítást: végrehajthatjuk ioncserélő-kromatográfiával, előnyösen aníoneserélö kromatográfiával, és legalább egy affinitáskromatográfiával. A további tisztítási lépéseket végrehajthatjuk ioncseréíö-kroinatográfia, gélszűrés és további aífinitáskromatográfiaí lépések használatával,

A jelen találmány tárgya továbbá készítmény, ami olyan vWF-cp polípeptidet tartalmaz, aminek összetétele a következő:

* * aj az 1. számú szekvencia, 2. szánni szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú szekvencia közül választható aminosav szekvencia, vagy b) olyan aminosav szekvencia, ami legalább 80%-os .azonosságot mutat az a) aminosav szekvenciával.

A jelen találmány szerinti, a polipeptídet tartalmazó készítmény tartalmazhat még egy kétértékű iont is, ami lehet. Ca²⁺, 3r²% Ba²* vagy Mg²⁴ ion.

A. jelen találmány tárgya továbbá egy vWF-cp aktivitással rendelkező izolált vWF-cp poiipeptíd, von Willebrand faktor és a kővetkező csoportból választott fémionok; Ca²*, Sr²⁺, Ba²* vagy Mg²*komplexe. A készítmény a kétértékű fémionokat 1-10 ion per vWF proteáz aktivitással rendelkező poiipeptíd molekula tisztított formában tartalmazhatja.

A készítmény tartalmazhat clusterint, vagy annak clusterin aktivitással rendelkező analógját vagy származékát. A fehérje aktivitásával kapcsolatban a clusterin „származék” vagy „analóg” szakkifejezés olyan polipeptidre vonatkozik, ami ugyanazokat a jellemzőket mutatja, mint a természetes clusterin fehérje.

A clusterin egy heterodimer glikoprotein, ami két elférő alegységből áll, amiknek molekulatömege körülbelül 80 kDa [Rosenberg és mtsai: Int. J. Bíochem. Bell Bioi, 27, 633-645 (1995); Tschopp és mtsai: Clin. Exp. Immunot 97(Suppl.2)₅ 111.4 (1994)]. Ezt nagyon sok különböző szövet termeli, és a legtöbb biológiai folyadékban megtalálható. A szakirodalomban korábban ismertetett fiziológiás funkciók közé tartozik a komplement szabályozás, a lipid transzport, a sperma-érés, az apoptozis iniciálása, az endokrin szekréció, a membrán-protekció és a sejtek kői· 14 · csönhatásának elősegítése. Ögy találták, hogy a jelen találmány szerinti vWF-cp szokatlanul nagy stabilitása -a keringő plazmában a clusterin jelenlétéhez kapcsolódik, és a von 'WiUebrand faktort hasító proteáz aktivitás ín vioo felezési ideje 1 és 4 nap között van, mig a többi proteáz felezési ideje a plazmában másodpercek és órák között van. A elusterinnek a von WiUebrand faktor proteáz poiípeptidhez viszonyított aránya egy jelen találmány szerinti készítményben előnyösen és IMrlOM között van, előnyösebben a clusterin és a von WiUebrand faktor ekvimoláris arányban van jelen. A humán plazmában a von WiUebrand faktort hasító enzim koncentrációja 2-10 mg/liter, míg a clusteriné 50-400 mg/liter plazma (a von WiUebrand faktort hasító proteáznak a clusterinhez viszonyított mőlaránya a humán plazmában körülbelül 1:20 és 1:100 között változik).

A jelen találmány egyik tárgya szerint a jelen találmány tárgya nukleinsav molekula, ami egy olyan vWF-cp polipeptidet kódoló nukleínsavat tartalmaz, amely polipeptid aj olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, ami a kővetkező csoportból választható: 1. számú szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5, számú szekvencia közöl választható amínosav szekvencia, vagy b) olyan amínosav szekvencia, ami legalább 80%-os azonosságot mutat az aj amínosav szekvenciával.

A „nukleinsav molekula” szakkifejezés jelentése polínukleotid, és általában DNS-re vagy RNS-re vonatkozik, de ide tartoznak a DNS vagy az RNS variánsai is, a DNS vagy RNS, ami vagy módosítva van, vagy nincs módosítva, egyszálü vagy kétszálú, vagy ezek keveréke, vagy egy- rövid polínukleotíd, amit általában oligonnkleotídnak neveznek. Egy polínukleotíd tipikus van• 15 ánsa a nukleotid szekven olajában tér el az eredeti polinukieotid szekvenciától, és vagy megváltoztatja a referencia polinukieotid által kódolt polipeptid aminosav szekvenciáját, vagy nem. A nukleotid helyettesítések eredményezhetnek aminosav helyettesítéseket, addíciókat, delécíókat, fúziókat vagy csonkuiásokat a polipeptid aminosav szekvenciájában,. A polinukieotid szekvencia .módosítható, a rekombínáns expresszió javítására, Az ilyen módosítások közé tartozik az erősen transzlálödó kodonok használata. Azok a nukleinsav szekvenciák, .amik hibrídizálódnak az

5. ábrán, bemutatott DNS szekvenciával, vagy a részleges szekvencia, ami egy legalább 12 aminosavből állő szegmens! kódol, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartozik, A szakterületen jártas szakember számára a hibridizációs technikák jói ismertek.

A jelen, találmány egy másik tárgya, szerint a jelen találmány tárgya egy expressziős vektor, ami olyan nukleinsav molekulát tartalmaz, ami egy olyan vWF-cp polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaz, amely polipeptid a) olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, ami a következő csoportból választható: 1. számú szekvencia, 2, számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú szekvencia közül választható aminosav szekvencia, vagy b) olyan aminosav szekvenciával, ami legalább 80%-os azonosságot mutat az a) aminosav szekvenciával.

A jelen találmány szerinti nukleinsav molekula használható olyan expressziós rendszerek készítésére, amik megfelelő elemeket biztosítanak a vektornak egy gazdasejtben való replikácíőj'ához, és a DNS· expresszíőjához, amit azután egy, a jelen találmány szerinti von Wíllebrand faktort hasító proteáz aktivitással' rendelkező polipeptid expresszálására lehet használni. A nuklein' 16 sav szekvencia módosítható, hogy javítsuk az expressziót, például egy Kozák szekvencia hozzáadásával.

Az expressziós vektor tartalmazhat például szekvenciát a transzkripció vezérlésére, egy transzkripciós szabályozó régiót és egy, a gazdasejtben működőképes· transzlációs iniciációs régiót, egy DNS szekvenciát, ami egy, a jelen találmány szerinti vWF-cp polipeptídet expresszál, és az említett gazdasejtben működőképes transzlációs és transzkripciós· termínáciős régiókat, míg a nukleinsav szekvencia, expresszióját az iniciációs és termínáciős régiók szabályozzák. Az expressziós vektor tartalmazhat elemeket a nukleotid replikáciőjához. A DNS expressziós vektor példái, a kővetkezők lehetnek: pPBV, pSVL, pRc/CMV, pRc/RSV, miogén vektorrendszerek, pe.DNA3 alapú vektorok (Invítrogen);, vagy a vitális rendszerekből, azaz például a vakcínia vírusokból, az adenovírusokből, az adeno-asszociált vírusokból, a herpészvírusokből, a retrovírusökból vagy bakulovírusokbőí származó· vektorok. .Az alkalmas emlős expressziós vektorok általában tartalmaznak egy vagy több eukaríóta transzkripciós egységet, amik képesek emlős sejtekben expresszálódni. A transzkripciós egység tartalmaz legalább egy promoter elemet, amivel befolyásolni lehet az használható promoterek ismertek a szakterületen, és ide tartoznak a virális promoterek, azaz például az SV40, a citomegalovírusok (CMV), a Rous szarkóma vírus (RSV), az adenovírus (ADV), a szarvasmarha pspillómavírus promoterei, vagy más promoter, ami lehet például a metallotionein promoter és a ,β-aktin promoter. A szakterületen ismert más promoterek is alkalmazhatók az expresszi-óra.

A jelen találmány szerinti vWF-cp polipeptidet kódoló nukleínsav szekvenciát tartalmazó expressziős vektor használható gazdasejtek transzformálására, amik azután megtermelik a polipeptidet. A transzformált gazdasejtek azután egy sejttenyésztési rendszerben szaporíthatok, azzal a céllal, hogy a polipeptidet in vitro előállítsuk. A gazdasejtek, képesek a von Willebrand faktor nyésztő közegbe, amiből kinyerhető, vagy a polipeptid a sejtlizátűmből nyerhető ki.

Az expressziós vektor, ami olyan nukleinsav molekulát tartalmaz, ami egy polipeptidet kódol, amely polipeptid a) olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, ami a kővetkező csoportból választható: 1. számú szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia, 4. számú szekvencia és 5. számú, szekvencia közűi választható aminosav szekvencia, vagy b) olyan aminosav szekvenciával, ami legalább 80%-os azonosságot mutat az a) aminosav szekvenciával, transzformálható vagy transzfektálhatö egy gazdasejtbe, a rekombináns polipeptid expresszálása céljából. A megfelelő gazdasejtek közé tartozik bármilyen sejt, ami képes megtermelni a vWF-cp polipeptidet, transzformációja vagy transzlekciója után. Az előnyben részesített sejtek közé 'tartoznak a bakteriális sejtek, az élesztő, a. rovarsejtek vagy az állatsejtek. A gazdasejt lehet olyan sejt, ami egy emlős testéből származik, azaz lehet például fibroblaszt, keratinodra, hematopoietikus sejt, hepatocita vagy mioblaszt, amiket azután in váró transzformálunk egy expressziős rendszerrel, ami egy, a jelen találmány szerinti, nukleinsavat hordoz, majd visszaültetjük az emlősbe. A találmány szerinti, az említett nukleinsav által kódolt poli-18 :id ezekben a sejtekben in vivő színtetizálódík, és a kívánt biológiai aktivitást mutatja az emlősben.

Az expresszióhoz gazdasejtként hozzáférhető emlős sejtvonalak jól ismertek a szakterületen, ide tartozik számos immortalizált sejtvonal, amiket az American Type Culture Colleetion-től (ATCC) szerezhetünk be. Az emlős gazdasejtek közé tartoznak például a főemlős sejtvonaiak és a rágcsáló sejtvonalak, beleértve a transzformált sejtvonalakat. A vektor DNS stabil integrálásához, majd az integrált vektor DNS ezt követő amplifikálásához, mindegyikhez hagyományos módszereket használva, aranyhörcsőg petefészek (CHO) sejteket használunk kiválasztott emlős gazdasejtként. Más alkalmas sejtvonal lehet például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a HeLa sejt, a bébihörcsög vesesejt (BHK), a majom vesesejt (COS-1.}, a humán hepatocelluláris karcínóma sejtek (.azaz például Hep G2), a humán adenovírussal transzformált. 293 sejt, a HEK 293 sejt, az SKHep sejt, az egér L-929 sejt, a HaK hörcsög sejtvonal, a rágcsáló 3T3 sejtek, amik Swíss, Balb-c vagy N1H egerekből származnak, valamint egy sor más sejtvonah Más alkalmas emlős sejtvonal a CV-1 sejtvonal. A normális diploid sejtek, sejttőrzsek, amik primer szövet in vitro tenyészetéből származnak, valamint a primer explantumok szintén használhatók. A jelölt sejtek lehetnek genotipusosan deficiensek a szelekciós génben, vagy tartalmazhatnak egy dominánsan ható szelekciós gént.

A gazdasejtek lehetnek transzformált sejtek, vagy neratranszformáit sejtek. A gazdasejtek előnyösen azok, amik forint expresszálnak, vagy természetesen, vagy azután, hogy génsebészeti ütőn lettek úgy megváltoztatva, hogy expresszálják a rekombináns lurínt.

A megfelelő emlős gazdasejtek, és a transzformáció, teis, szűrővizsgálat valamint a termék előállítása és tisztítása megválasztása a szakterületen ismert.

A vWF-cp polípeptidet kódoló nnkleinsavat hordozó vektorral transzformált gazdasejt -azután megfelelő, körülmények között tenyészthető, ha szükséges, a bejuttatott gének amplifikálásával. A hatékony körülmények közé tartoznak anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a megfelelő táptalaj, a bioreaktor, a hőmérséklet, a pH és az oxigén megválasztása, amik lehetővé teszik a fehérje előállítását. Tehát a jelen találmány szerinti nyésztünk, amit egy olyan nukieinsav szekvenciával transzformáltunk, ami a vWF-cp· polípeptíd aminosav szekvenciáját kódolja, és a kódoló szekvencia egy transzkripciós szabályozószekvencia vezérlése alatt áll Az expresszáit polípeptidet. azután kinyerjük, izoláljuk és tisztítjuk a tenyésztő közegből, ha a polipepiid szekretálődik a sejtekből, vagy ha intracellulárísan expresszálődik, akkor a sejtekből, a szakterületen jártas szakember számára ismert megfelelő módszerekkel.

A jelen találmány szerinti nukieinsav molekula, vagy annak fragmense expresszáltathatő egy eukariöta vagy prokariőt.a mikroorganizmus rendszerben, azaz például gombákban, beleértve az élesztőket vagy baktériumokban. A fragmensek lehetnek a von Willebrand faktort hasitő proteáz csonkított formái. A csonkolás példái lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az N-termínális vagy C-termínális delécíők.

A jelen találmány szerinti nukieinsav molekula arra is használható, hogy transzgenikus állatokat állítsunk elő, amik az említett polipepüdef. in vivő expresszálják. Ennek a specifikus al-20 kalmazásnak egyik megvalósítási módja szerint a transzgenikus állatok a vWF-cp poiipeptidet .az endogén mirigyekben expresszáltathatják, például az emlómirigyfoen, amikből az említett fehérjék szekretálódnak, Az emlőmirigyek esetében, az említett, von Wiílebrand faktor proteáz. polipeptid az állatok tejébe szekretálódik, amikből az említett fehérjék előállíthatok. Az állatok lehetnek egerek, szarvasmarhák, sertések, kecskék, birkák, nyíllak, vagy más haszonállatok,

A jelen találmány szerinti vWF-cp polipeptid használható a. von Wiílebrand faktor tisztítási eljárásában, ahoíís a jelen találmány szerinti vWFcp polipeptid a von Wiílebrand faktor ligándumaként szolgál, a von Wiílebrand faktort tartalmazó oldatot érintkezésbe hozva a vWF-cp lígandummal, olyan körülmények között, melyek között a von Wiílebrand faktor kötődik a Ugandámhoz, majd az említett ligandumhöl kinyerjük a tisztított von Wiílebrand faktort. A vWF-cp polipeptid ligandum kötődhet egy szilárd hordozóhoz.

Emellett a jelen találmány szerinti vWF-cp polipeptid használható a vWF-cp polipeptidbez kötődő molekulák kifejlesztésére, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával. A kötő molekulák lehetnek anti-vWF-cp polipeptid ellenanyagok, amiket előállíthatunk egy állatnak egy jelen találmány szerinti polipeptiddel való immunizálásával., és az anti-vWF-cp polipeptid ellenanyagoknak az állatból való izolálásával.

Az „ellenanyagok” szakkifejezés jelentése a. továbbiakban políklonálís és monoklonálís ellenanyagok, kiméra ellenanyagok, egyláncű és humanizált ellenanyagok, valamint Fab fragmensek, beleértve egy Fab vagy más immunglobulin expressziós könyvtár termékeit, peptidek vagy pepridomimetikumok. A monoklonálís βψ ellenanyagok előállíthatok a szakterületen jól ismert módszerekkel. Más kötő molekula lehet például egy ellenanyag származéka, azaz például egy egyláncú ellenanyag, egy Fab-, vagy Fab*2-fragmens, egy kiméra ellenanyag, vagy egy peptid vagy egy peptid omimetikum, amit a szakterületen jól ismert módszerekkel lehet előállítani, azaz például a fág display módszerrel.

A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint egy vWF-ep poiipeptidet kötő molekulát, amit a kővetkező csoportból választhatunk ki: egyláncú ellenanyagok, Fab- vagy Fab'2-fragmensek vagy von Willebrand faktor proteáz kötőhellyel rendelkező polipeptidek, elóáltiíhaUmk egy módszerrel, ami szerint egy fág display könyvtárat átvizsgálunk, tartalmaznak-e anti-vWF-cp poiipeptidet kötő molekulát, a pozitív klónak nukleinsav szekvenciáját meghatározzuk, és a szekvenciát tartalmazó nukleinsav molekulát egy expressziós vektorba klónozzuk,

Áz ellenanyagok, ellenanyag származékok, peptidomímetiven más, a vW'F-cp poiipeptidet kötő molekulák kifejlesztését a szakterületen jól ismert módszerrel végezhetjük el (Greer és mtsai: d. Medicina! Chem, 37, 1035-1054 (1994); Kernp; Trends Bioteehnok 8, 249-255(1990)).

A jelen találmány szerinti vWF-cp poiipeptidet .kötő molekula ligandumként használható a vWF-ορ tisztításához. Egy ilyen tisztítást ügy hajthatunk végre, hogy a vWF-cp poiipeptidet tartalmazó- oldatot érintkezésbe hozunk a vWF-cp poiipeptidet kötő molekulával, olyan körülmények között, amely körülmények között a vWF-cp polipeptíd kötődik a kötő molekulához, majd kinyerjük a vWF-cp poiipeptidet, oly módon, hogy szelektíve eluáljuk a vWF-cp poiipeptidet a vWF-cp-t kötő molekuláról. A vWF-ep-t kötő molekula kötődhet egy -szilárd hordozóhoz.

*φ

A vWF-cp-t kötő molekula olyan módszerben is használható, amit a vWF-cp polipeptídnek egy mintában való kimutatására használunk. Ebben a módszerben az oldatot, amiről feltételezzük, hogy vWF-cp polipeptidet tartalmaz, érintkezésbe hozzuk egy vWF-cp polipeptidet kötő molekulával, az előzőkben ismertetett módon, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik a vWF-cp polipeptid/vWF-cp polipeptidet kötő molekula közötti komplex kialakulását, majd kimutatjuk a komplexet.

A jelen találmány szerinti vWF-cp polipeptid használható például plazmatíkus vagy rekombináns módszerrel előállított von Wiilebrand faktor processzálására. A rekombináns von Willebrand faktor (r~vWF) előállítható CHO sejtekben, például Fischer és munkatársai módszerével [Fischer és mtsai: FEBS Letters 375, .259-262 (1995)], Az ílymódon kinyert. r-vWF érett vWF-ként hozzáférhető, és szingulett struktúrájú, azaz eltér a plazma-eredetű von Willebrand faktortól, aminek mindig jellegzetes szatellita struktúrája van, ha 2%-os SDS agarőz gélen vizsgáljuk. Az 5,854,403 számú Amerikai. Egyesült. Államok-beli szabadalmi leírásban leírják., hogy az r-vWF mulíimerekből áll, nagy strukturális integritással, ami még a tisztítás és a vírusok inaktiválására végzett kezelés után is megmarad. Az r-vWF intakt struktúráját elektroforetikus elemzés eredményeképpen úgy lehet definiálni, mint ami több csíkból áll, szatellita csíkok: nélkül Ahhoz, hogy olyan r-vWF készítményt állítsunk elő, aminek a struktúrája inkább megfelel a plazma-eredetű von Wiilebrand faktor struktúrájának, mint a szingulett struktúrájú r-vWF-nek, az r-vWF-et von Willebrand faktor proteáz polipeptiddel kezeljük, -vagy egy olyan készítménnyel, ami tartalmazza a jelen találmány szerinti vWF-proteáz polipeptidet, valamint adott esetben tartalmaz fémionokat és/vagy clnsterint.

A jelen találmány egyik aspektusa szerint a vWF-cp polipeptid használható olyan készítmény előállítására, amit azután olyan betegségek profilaxisában, és terápiájában lehet használni, amiket sznpranormális vWF tartalom, vagy a von Willebrand faktor molekulasúlyának megemelkedése jellemez betegekben, azaz például tromboembóliás betegségekben. Ez eredményezhet trombózist és tromboembóliás betegségeket. Például a trombotikus trombocitás purpura (TTP), a Henoch-Schönlein purpura, a. preeelampsia, az újszülött trombocitopénia vagy a hemolitikus-urémiás szindróma. Ha a jelen találmány szerinti, vWF proteáz aktivitással rendelkező polípeptidból hatékony dózist adunk, be, akkor ez gyakran a nagy molekulasúlyú von Willebrand faktor multimerek mennyiségének csökkenését okozza a betegekben, ami ezeknek a betegségeknek, a hatékony terápiáját eredményezi. A betegség lehet tromboembóliás betegség, azaz trombotikus trombocitás purpura (TTP), a HenochSchönlein purpura, a preeelampsia, az újszülött trombocitopénia vagy a hemolitikus-urémiás szindróma.

A jelen találmányt az alábbi példákkal részletesen ismertetjük, anélkül hogy a jelen találmányt ezekre a példákra korláL Példa

A vWF-cp polipeptidek izolálása

Ll. Egy IgG-eTTP-kapcsolt affinitásgél készítése. Az IgG-eTTP-t 20 ml protein Α-Sepharose oszloppal (átmérője 1.6 cm) izoláljuk.

24X *

TBS-ben (pH~7,4). A szerzett TTP-ben szenvedő beteg ferézis plazmáját (,,erworhen.es TTP; eTTP), aminek előzőleg megvizsgáltuk az inhibitor-tartalmát, a von Wiileferand faktort hasító proteázhoz viszonyítva, egy 50 ml-es oszlopra visszük. TBS-szel .(pH-7,4) öblítjük, majd a megkötött IgG-ket lépésekben eluáljuk 0,1 M. (pH^:::4,0) citráttal és 0,1 M (pH~2,7) glicinnek A frakciókban azonnal beállítjuk a fiziológiás pH-t 1,5 mol/1, pH-8,8 TR1SZ hozzáadásával, majd TBS (pH™7,4) ellen dializáJjuk. Az Affi-Gel Hz-t a gyártó utasításai szerint kapcsoljuk az IgG-e'TTP-hez, amit a protein A-Sepharose-ból mosunk ki pH-4,G~n. Az ilymódon előállított oszlop-anyagot először az előzőkben ismertetett módon mossuk, majd ezután háromszor alternálva mossuk 50 ml B pufferrel és 200 ml A púderrel (1.7 fejezet). A felhasználás előtt minden esetben öblítjük. A pufíerreb

1.2. Első lépés

Kiindulási anyagként 100 ml egyesített CPD plazmát, ami legalább három különböző donorból származik, és -20 °C-on volt tárolva, 5 percig 2500 per pere fordulatszámmal (1 l ÖÖgj centrifugálunk, majd felhasználjuk. Viszonylag alacsony áramlási sebesség (FR: 30 m.l/óra) mellett a plazmát egy 200 ml-es IgG-eTTP Aífi-Gel Hz (hidrazíd) kromatográfiás oszlopra visszük, (átmérője

2,6 cm), amit előzőleg az A púderrel hoztunk egyensúlyba. Éjszakán át legalább 400 ml A pufferrel mossuk, azonos áramlási sebességgel, majd egy 200 ml-es sómentesítő gélszűrő oszlopot (Bio-Gel P--6DG, átmérője 2,6 cm), és egy 10 ml-es protein G-Sepharose (átmérője 1,6 cm) oszlopot, amit előzőleg szintén átőblitünk A pufferrel, kapcsolunk hozzá. Miután az áramlási sebességet 100 ml/órára növeltük, az Affi-Gel Hz-hez kötött fehér·· 25 -

*« < ♦ JÍ φ»* φ

jéket közvetlenül eluáljuk 50 ml B pufíerrel a Bio-Gel P~6DG~re, hogy eltávolítsák a fehérjéből az NaSCN-t. ami a B púderben van. A. sömentesítő oszlopról az NaSCN előtt eluált fehérjéket a protein G Sepharose-on vezetjük át, megszakítás nélkül, ahol megszabadulnak az IgG-.ktől Ekkor az áramlási sebességet 50 ml/őrára csökkentjük, hogy megnöveljük a fehérjék tartózkodási idejét, a 10 ml-es oszlopban. A regeneráláshoz a protein G-Sepharose-t röviden mossuk C pufíerrel, majd az eluált IgG frakciót

Az első lépést nyolcszor hajtjuk végre, mielőtt -20 °C-ra hűtött frakciókat egyesítjük és tovább feldolgozzuk.

1.3 Második lépés

Az első lépésben végrehajtott nyolc kromatográfiábó} származó egyesített frakciókat 1:1. arányban vízzel hígítjuk, hogy olyan ionerősséget kapjunk, aminél a kívánt fehérjék kötődnek az anioncserélő oszlophoz (High Q Support). A mintának, aminek térfogata a töltéstől függően 1500-1800 ml, vizsgáljuk a pH~ját és ionerősségét, majd éjszakán át 90 ml/óra áramlási, sebességgel egy 50 ml térfogatú, Therasorb (1,6 cm átmérőiül oszlopon bocsátjuk át, rá egy 5 ml-es High Q Support-ra (átmérő: 1,6 cm). Mind a Therasorb, mind a High Q Support oszlopot előzőleg a D pufíerrel hozzuk egyensúlyba. Miután körülbelül 150 ml D pufféiról mostuk, a Therasorb oszlopot lekapcsoljuk, majd a 25 mles lencse Lectin Sepharose (átmérő 1,6 cm) oszlopot, amit előzőleg az E pufíerrel hoztunk -egyensúlyba, kapcsoljuk a rend szerre a High Q Support után. 60 ml/óra áramlási sebességnél a High Q Support-hoz kötött fehérjék azonnal eluáíodnak az E pufferrel, közvetlenül a lencse Lectin Seph árosé oszlopra. A lencse fe* s * fe *

Lectin 'Sepharose oszlopra kötött fehérjéket két lépésben lehet eluálrti, a G és a H pufferrei, és össze lehet gyűjteni, A Therasorh és High Q Support oszlopokhoz kötve maradt fehérjéket a C vagy F pufferrei mossuk le, majd elemzés után döntjük.

A regeneráláshoz, felhasználás előtt, a Lencse Lectin Sepharose oszlopot minden esetben a gyártó utasításai szerint háromszor alternálva öblítjük, 20-20 ml I és J púderrel, a Hígh Q Support-ot egymás után öblítjük 10-10 ml 1 mol/l nátrium-hidroxiddal és 1 mol/l nátrium-kloríddal.

..4 Harmadik lépés

A Lencse Lectin Sepharose oszlopról a. H pufferrei leoldott, egyesített frakciókat háromszor díalízáljuk, összesen 4 óra hosszat, mindegyik alkalommal 1 liter D pufferrei szemben, majd ismét a Hígh Q Support oszlopra visszük, 60 ml/óra áramlási sebességgel, Eléje kapcsolva egy 5 ml-es heparín-Sepharose oszlopot használunk (átmérő 1,4 cm), amit hasonló módon egyensúlyba hoztunk D puffeirel. A minta felvitele után körülbelül 50 ml D pufferrei öblítjük, a heparín-Sepharose oszlopot lekapcsoljuk, majd egy SÖÖ ml-es Sephacryl S-3Ö0 H.R oszlopot (átmérő

2,6 cm) kapcsolunk utána, amit L pufferrei hoztunk egyensúlyba. A High Q Support oszlophoz kötődő fehérjéket kőzve tienni eluáljuk a gélszürö oszlopra, 10 ml K pufferrei. A kizárásos kromatográfiai 42 ml/óra áramlási sebességgel hajtjuk végre, majd 7 ml-es frakciókat szedünk. A High Q Support-hoz legerősebben kötődő fehérjéket ismét F pufferrei oldjuk le, azokat viszont, amik a heparin-Sepharose-hoz maradnak hozzákötve, K pufferrei oldjuk le.

* λ*

4-.

A harmadik lépésből származó, egyesített aktív frakciókat kezelés nélkül, 10 ml/'óra áramlási sebességgel felvisszük egy 1 ml-es antí-as-makroglobulín oszlopra (áramlási sebesség 0,7 cm), amit L pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az antí-aa-makroglobulin oszlopot úgy állítjuk elő, hogy a nyúl-anti-as-makroglobulin ellenanyagokat az utasítások szerint immobilizáljuk, 4,9 mg/ml koncentráeióban, BrCH -nal aktivált .arose-boz,. Az ehhez kötődő fehérjéket 3 mol/1 NaSCN-nel eluáljuk L pufferben, és C pufferrel, majd az elemzéshez tároljuk.

A pufferek listája

A puffer	TRÍSZ NaCl Nas-eitrát Na sav	10 mmol/1 0,15 mol/1 1 mrnol/l 0,02%	pH-7,4
B puffer	NaSCN A pufferben	3,0 mol/1	pH-7,4
C puffer	Glicm Na sav	0,1 mol/1 0,02%	pH.-2,7
D puffer	TRÍSZ NaCl	10 mmol/1 75 mmol/1	pH-7,4
E puffer	'ÍRISZ NaCl MnCb	20 mmol/1 0,5 mrnol/l : 1 mmoí/i	pH-7,4
F pnffer	TRÍSZ NaCl	10 mmol/1 1,0 mmol/1	pH::::7,4

281. Táblázat folytatása A pufferek listája

G puffer	TRISZ NaCl Mefil-a-B- mannopiranozid í	20 mmol/1 0,5 mol/l 30 mmol/1	pH 7,4
H puffer	TRISZ NaCl Metíl-a-D- mannopíranozid	20 mmol/I 0,5 mol/l 0,3 mol/l	pH ”7,4
I puffer	TRISZ NaCl	20 mmol/1 0,5 mmol/1	pH-8,5
J puffer	nátrium-acélát NaCi	20 mmol/1 0,5. mol/l	pH-5,5
K puffer	TRISZ NaCl	1.0 mmol/1 0,5 mmol/1	pH=7,4
L puffer (IBS)	TRISZ NaCl	10 mmol/1 0,15 mol/l	pH~7,4

2.. Táblázat

A kromatográfiás anyagok listája

Anyag	Gyártó/cég
affi-gél hidrazid gél: specifikus IgG-k ímmobilizálására	Bío-Rad, Hercules, CA USA

·· 29

2. Táblázat folytatása A. kromatográfiás anyagok listája

antí-as-makroglobulin oszlop: az «2-makroglobulm izolálása	a benyújtó saját terméke {lásd 1.5): nyűi-anti-oo-humán- mak- roglobulin ellenanyag BrCN-nal aktíváit Sepharose 4B~n; 4,9 mg/ml
Βίο-Gel P6-BG, közeg: gélszűrés, > 6 k.Da kizárási, korláttal	Bio-Bad
bróniclánnal aktivált Sepharose 4B; fehérjék immobilizálására	Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország
heparín Sepharose, HJTrap 5 ml: affínitáskrornatográfía: különböző fehérjéket köt meg	Am ersham Pharm acia.
High Q Snpport, Maero-Prép: erős anioncserélő	Bío-Rád
IgG eTTP Affi-gel Hz: von WiUebrand faktor proteáz megkötésére	a benyújtó saját terméke {lásd; 1.1): IgG eTTP Affi-gel Hz hidrazídon
Lencse Lectin-Sepharose 48: affinításkromatográfia: a fehér- jék cukmrcsoportjaihoz kötődik	Amersam Pharmacia
protein A Sepharose CL-4B. Az 1-es, 2-es és 4-es típusú IgG-t köti meg	Amersam Pharmacia.
protein G Sepharose 4PF; az Összes típusú IgG izolálása.	Amersam Pharmacia

• 30

2. Táblázat folytatása A kromatográfiás anyagok listája

Sephacryl S-3OÖ HR: gélszürés, | Amersam Pharmacia ·· 1,500.000 molekulasúlv között lg-ellenanyagok munglobulínok

-anti-humán- j Serag-Wi.essn.ei ím- Németország

Naíla, ι

Dgy másik változat szerint, vagy a 4. lépés mellett, egy anticlusterin kromatográha használható, további lépésként. A mintákat az anti-as-makroglobulin oszloppal megegyező módon kcX/.H ί K r*í AH í-S . us5r*t 55 ST ? > Γ** í f z-í £ l V/«i S-í· t ϊ K z-í í í ? >%Z.Í s ví J V .·-<

1.7 SDA- PAG E redukált/nem -redukált

A harmadik izolálás! lépésből származó végső készítményt egy 1,5 mm vastag SDS-poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk, Laemmli szerint [Laemmli: Natúré 227, 580-685 (1970)]. 4-12%~ os gradienst használunk a fehérjék frakeionálására. A nemredukáló vagy redukáló körülmények között, végzett elektroforézis után (végkoncentráció 65 mmol/1 ditiotreitol DTT) a fehérjéket ezüstfestéssel vagy Coomassie blue festékkel tesszük láthatóvá (2. ábra). Nem-redukálő körülmények között körülbelül 150 kDa, 146 kDa, 130 kDa és 110 kDa molekulasűíyú csíkok mutathatók ki, redukáló körülmények között körülbelül 180 kDa, 170 kDa, >a. és 120 kDa molekulasűlvú csíkok mutathatók ki.

1.8 A von Wíllebrand faktor proteáz aktivitás meghatározása.

Az előzőkben ismertetett tisztítási eljárással izolált különböző frakcióknak meghatározzuk a von Wíllebrand faktort hasító aktivitását, ehhez Furlan és munkatársai módszerét alkalmazva (Furlan és mtsai: Blood 87, 4223-4234 (1996)}.

2. Példa

A vWF-cp ponpeptiu aminosav a és ammosav-eiemzése

Az izolálás harmadik lépéséből származó végső fehérje készítményt elektroíoredzáljuk egy 1,5 mm vastag SDS-poliakrilamid gélen, Laemmlí módszerével jUemmlk Natúré 227,. 68ö~ 685 (1970)}. A nagy molekulasúlya fehérjék frakeionálásához 412%-os poliakrílamíd gradienst használunk, az alacsony molekulasúlyú fehérjék frakeionálásához 8-12% poliakrílamíd gradienst használunk. A nem-redukáló, vagy redukáló körülmények között végzett elektroforézis után. (végkoncentráció 65 mmol/1 ditíotreitol) a fehérjéket PVDF-memhránokra blöfföljük, majd 2 percig festjük 0,25¾ Coomassie Blue-val (45^:% metanol, 9% ecetsav és 46% víz összetételű oldatban). Miután egy 5'ö% metanol, 10% ecetsav és 40% víz összetételű oldattal leöblítettük, a látható fehérjecsíkokat kivágjuk, és egy Proeíse-cLC Sequencer-rel (Foster City, CA) elemezteünk, a berni egy etem Chemical Instítute-iában.

ííxíx meghatározása

A tisztított von Wíllebrand faktort hasító proteáz SDSPAGE-val elválasztott polipepüd csíkjainak aminosav szekvenciája N~termináíis aminosav szekvenciáját a 3, táblázatban mutatjuk be.

» *» *

3. Táblázat

A vWF-cp N-terminális aminosav szekvenciájának meghatározása.

Molekulasúly	Aminosav szekvencia
350 kDa redukálatlan	Ser- Val- Ser-Gly-Ly s · Pro- Gln-Tyr-Met- VaP
150 kDa redukálatlan	Ala-AIa-Gly-Gly He
140 kDa redukálatlan	Ala-Ala-Gly-Gly-lle
130 kDa redukálatlan	Ala-Ala-Gly-Gly-Ue
110 kDa redukálatlan	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-beu-Glu
70 kDa redukálatlan	Asp/Ser- Gin/Leu-Thr/met-Val/Pro- Ser/Phe**
180 kDa redukált	Ala-Ala-Gly-Gly-lle-.Leu~.Hís-Leu-Glu
170 kDa redukált	Ála-Ala-Gly-Gly-Iíe
160 kDa. redukált	AIa~Ala-GIy~Gly~Ile~Leu~His-Leu~Glu- Leu-Leu- Val-AJ a- Val-Gly
120 kDa redukált	AJa~AIa~Gly~Giy~Ile-IeU“His~Leu-G]u- Leu-Leu-Val-Ala-Val-Gly
40 kDa redukált	Asp- Gin -Thr-V al-Ser**

as-makroglobtdinként azonosítva cin ste rínk én 1 azono sít va

Az aminosav-ősszetétel elemzését ugyanabból a mintából végezzük ek mini amit az aminosav szekvenálásboz használunk. A fehérjecsíkokat gázfázisban 6 mol/l sósav fölött hidrolizál·· tatjuk, 22 óra hosszat, 110 C-οπ, majd az aminosavakat nagynyomású folyadékkromatográfiával határozzuk meg. A tisztított vWF-cp SDS-PAGE-jával kapott négy redukálatlan polipeptidet elemezzük, molekulasúlyuk 1.5Ü, 14Ö, 130 és 110 kDa. Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be.

-33 4. Táblázat

Az izolált vWF- cp polipeptid aminosav-'összetétele

J Aminosav	A csoportok	száma/100 csoport
	150 kf	>a 140 kDa	13 0 kDa	110 kDa |
| Asx	6,7	7,0	7,4	8,3 1
Glx	12,2	12,0	12,3	11,8
1 Ser	8,4	8,9	8,8	9 2 5
| Gly	11,8	12,1	1.2,1	12,9
1 His	2,5	o a Á* · v. J	o xi,’ y'M	2,4 1
1 Arg	8,3	7.6	8,1	7 9 1
I Thr	5,6	5,5	5,6	5,7 ;
Alá.	10,1	9,5	9,6	8,2 |
| Pro	8,9	8,5	8,3	8,1 |
1 Tvr }	2,1	2, 7	2,3	2,4 |
1 Val	7,0	6,9	6,7	6,5 i
i He	2,7	2,9	2,6	3,0 |
1 Leu	10,0	9,9	9,1	9,7 |
i Phe	2,6	2,8	2,6	3,2 |
Lys	1,0	1,3	T o	1,4 5 J

3 . Példa
A vWF-cp i	zén azonosítása

A tisztított humán plazmatifcus vWF-cp 15 N-terminális csoportjának AAGGILHLELLVAVG peptidje (2. számú szekvencia) aminosav szekvenciáját kódoló nukleotid szekvenciáját meghatároztuk, ez a következő: GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (9. számú, szekvencia). Az NCBi GenBank-ban (http:/ Zwww.ncbl.nim.nih.gov) végzett adatbázis keresés megmutatta a megfelelő GCT GCA GGC GGC ATC

CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (9. számú szekvencia! nukieinsav szekvencia helvét az RF11--244N20 klón (ALI58826, Gli 1544459) 9-es kromoszómáján. így alSÖOOI185911 számú bázisok közötti nukleotid szekvenciákat viz-sgáliuk át, potenciális exonokat keresve. Az egymást követő, átlapoló, különböző hosszúságú (150Ö-5ÖÖ0 bázis méretül genom-sxegmenseket elemezzük, kereső gépeket használva, amik a szűrést az intemet-exploreren keresztül végzik. A genomiális szekvencia szegmenseket, ezek transzlációját és a keresés eredményét a 'Vectors NTI Suitel v,5.2' számítógép programmal flnformax Inc. USA) menedzseljük. Az RP11-244N2Ö' szekvencia mérete körülbelül 185 izis, és az azonosított nukieinsav szekvencia a

156.653 pozícióban kezdődik. Egy exon-kereső program. (Grail, http://eompbÍo.omLgov/Grali-1.3) lehetővé tette körülbelül 30 feltételezett exon azonosítását, a 156.653 pozíció- előtt és után. A keresésben kapott első négy exont a megfelelő aminosav szekvenciára fordítjuk le, és ezeket a szekvenciákat vizsgáljuk át, homológiákat keresve. Ebből a keresésből kiderült, hogy mindegyik szekvencia nagy homolőgiát mutat a humán disíntegrín és metálloproteinázok családja aminosav szekvenciájával, thrombospondin motívumokkal (ADAM-TS).

Ahhoz, hogy a feltételezett exonokat kapcsoljuk, a májból származó polí-A-RNS-t reverz transzkripcióba visszük, majd a eDNS~t polimeráz láncreakcióval, amplínkáljuk, a feltételezett exon.ok közül néhányra specifikus primereket használva (5. táblázat). A 6142 (16, számú szekvencia) - 6277 (17. számú szekvencia), 6142 (16. számú szekvencia) — 6546 (18. számú szekvencia), 6351 (19. számú szekvencia) - 6546 (18. számú szekvencia). 6278 (21. számú szekvencia) - 6407 (20. számú szekvencia),

- 35 6346 (23. számú szekvencia) - 6395 (24. számú szekvencia), és a 6406 (25. számú szekvencia) -- 6506 (26. számú szekvencia) pri merekkel (amik a feltételezett 1-6, 3-11, 6-11, 10 -14. 13-16, 1423 exonokbő! származnak) kapott polimeráz láncreakció termékek a várt méretű csíkokat adták. A szekvenálás után egy nyitott leolvasási keretet lokalizáltunk az 1. és a 23. exon között, az

RP1.1-244N2Ö klón 3' végének közelében. A cDNS szekvencia 3' végét a cDNS polimeráz láncreakciős amplifikálásával vizsgáljuk, a 22-es exon 6548-as előrevivő printerjét (27. számú szekvencia) és az spdT reverz transzkriptáz primer specifikus MCI8 szekvenciáját. használva. A kapott körülbelül .1,8 kiloházis méretű fragmenst szekvenáljuk, majd az· adatbázisban való keresés után az új cDNS szekvencia 3'részét a 9-es kromoszóma q34~es (ÁCÖ02325) régiójában lehet, megtalálni.

A gén 5'végén levő ismeretlen szekvenciát. 5'-RÁCÉ-val azonosítjuk, és a kapott polimeráz láncreakció termék szekvenáíásávai két további exont kapunk. Az 1-2 exonok után (upstream) levő, következő őt exon közöl egyik sem. kapcsolható polimeráz láncreakcióval, a már ismert cDNS szekvenciához. Összesen 29 exont. találtunk, egy 4,6 kiloházis méretű cDNS-en. A von Wíllebrand faktort hasító proteáz génje körülbelül 37 kilobázison terül el, az exonok lokalizációjának sematikus ábrázolása a 4. ábrán látható. A teljes cDNS szekvenciát az 5. ábrán mutatjuk be..

9£

6506	5'-CAOGGCfCCÁGÖCTG	CAGG«>á®aetaffl!	í 23. exon révén í
! 6548	.................................................................
6725		rt/trtíWArt A ί^ΛΛΛ^Λ A WA ΑΦ ά Z\ A Λ v v Wv i V Wt V U vM w VA i vV1Λ v AVv
j	(28. számú szekvencia))
1 6276	S'-GGCCCTCGAGCGGnt	ÉrCCTOCTTCCÁGÖ-3'	29,exonrgveK-M ,
	f2S.sz«km)		i ) j

♦ ♦ ϊ,:

X<* » * ♦4 ♦ » X *

Ο ♦ « ♦

Φ * »»♦ ί ♦ » »

X ♦ #4X8»

-38A más fehérjékkel való hasonlóságok meghatározása

A SMART programmal (http://smart.eml-hexdelberg.de) végzünk keresést a proteáz dómén árchitektúrájára, és fehérje modulokat azonosítunk, beleértve egy szignalpeptidet, a transzmembrán régiójával, egy furin hasítási hellyel egy metalloproteáz doménnei, azaz például egy Zn-proteáz katalitikus hely konszenzus szekvenciát (HEXXHj, egy Met hurkot, egy dísintegnn domént, egy risztemben gazdag régiét és egy 1-es típusú thrombospondin (TSP-1) motívumot (ö. ábra). Ezek a motívumok megtalálhatók az új ADAMTS (dismtegrinre és 1-es típusú motívummal rendelkező metalloproleázra) metaüoproteináz család tagjaiban (Tang: FEBS Letters 445, 223-225 (1999); Tang: Int. J. Blochem. Cell Biok 33, 33-44. (2001)1. A von Willebrand faktort hasító proíeáz aminosav szekvenciáját illesztjük az összes humán ADAMTS fehétjeszokvenriához, amiket a humán genom szervezet (HUGÓ) nomenklatúra bizottsága (http: / / www.gene.uckac.uk/nomenclature/ genefamilyZadamts.html) sorol fel egy listában. A doméoeket sematikusan a 6. ábrán mutatjuk be, Az ADAMTS fehérjékkel ellentétben ezen család általunk feltételezett új tagjának nincsen prodoménje, Azonban, ha tanulmányozzuk az 1-2 exonok után álló (upstream) öt feltételezett exont, akkor ez nem mutat szefcvencia-homolőgiát az ADAMTS fehérjékkel, Emellett nem találhatók, szignálpeptid szekvenciák ezeken az exonokom Ezért a von Willebrand faktort hasitő proteázt ADAMTS 13-nak neveztük ek A kikövetkeztetett aminosav szekvenciát is összehasonlítjuk az EMBL fehérje adatbázissal (http: / /ww2.ebi.ac.uk). A 9-16-os exonok részben megfelelnek egy már benyújtott hipotetikus 39,9 kDa méretű fehérjének, ami a 9. kromoszómán található, és elnevezése 8-as nyi- 39 tott leolvasási keret (C9ORP8, XM 005647, Gl 12735207). Emellett a 26-29-es exon megfelel a DKPZp434ü2322 (NMÖ32252; Gl 14149974) hipotetikus fehérjének (Wiemann és mtsai: Genome Rés. 11, 422-435 (2001)].

4. Példa

A von Willebrand faktor fv'WF) affinitás-tisztítása

Az AAGGILHLELLV (Ϊ. számú szekvencia) szekvencíájú pepiidet szilárd fázisú hordozón szintetizáljuk meg, Bárány és munkatársai módszerét alkalmazva (Bárány és mtsai; Solid Phase Peptide Synthesís, ár. The Peptides, 2, szerk.: Gross, E. és Meienhofer, Academic Press, New York, SEJTEN (1980)]. A peptid hasítása és védocsoport-mentesítése után a pepiidet ioncserélőkromatográíiával tisztítjuk. A pepiidet fordított fázisú HPLC-vel jellemezzük egy CS szilikagél oszlopon, triíluoreeetsav-aeetonitr.il gradiens elúeiót alkalmazva. A peptid nem mutat nagyobb mennyiségú melléke.erm éket.

A pepiidet 5 mg/ml koncentrációban szolubilizáljuk 0,1 mólos foszfát pufferben (pH-7,5), majd egy előre aktivált géllel aktiváljuk az afiimtáskromatográfiához (Áctígel, ALD-Superflöw, Sterogene). Mielőtt a pepiidet a gélhez kapcsoljuk, az előre aktivált mátrixot nagy fölösleget alkalmazva mossuk ugyanazzal a foszfát pufferrei. Az előre mosott gélből egy térfogatnyit azután összekeverünk egy térfogat immohilizálandó peptid-oldattal, majd ezt kővetően 0,1 térfogatnyi oldattal mossuk, aminek összetétele; 0,1 mól cianobőrhidrid (NaCNBHs) 0,1 mól foszfát pufferben (pH =--7,5). A gélt szuszpendáljnk ebben az oldatban, majd 15 óra hosszat szobahőmérsékleten rázatjuk. Ezt követően a gélt zsugorított üvegszűrön mossuk 10 térfogatnyi foszfát pufferrei,

.. 40 ami 150 m.mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz, majd 5 térfogatnyi foszfát pufferrel, ami 2 niol/1 nátrium-kloridot tartalmaz. A gélt ezután fölöslegben levő 0,1 mólos foszfát pufferrel (ptí~7,Ö) hozzuk egyensúlyba.

A gélt ezután egy kromatográfiás oszlopba töltjük, aminek az arányai (átmérő a gél-ágy magasságához viszonyítva 1:4). A pepiidnek az inkubációs felülúsző oldatban való koncentrációját a géltől és a mosó-oldattól való elválasztás után meghatározva, az affinitás-mátrixhoz kapcsolódó peptid mennyiségét ki lehet számítani. A kapcsolási arány 85%.

Ezt kővetően a gélt a von Willebrand faktornak egy VlII-as faktor (FVÍIlJ/von Willebrand faktor komplexből való tisztítására használjuk. E Vlli-as faktor/von Willebrand faktor komplexet a 4,814,435 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás alapján állítjuk elő, ami a von Willebrand faktort 260 E vWF;Ag/ml koncentrációban tartalmazza, specifikus aktivitása 13,5 E vWF:A.g/mg fehérje. A koncentrátumot 20 mmol/i foszfát pufferrel (pH-7,0) 6 E vWF:Ag/ml von Willebrand íaktor végkon·· centrácíőra hígítjuk. Ebből az oldatból 20 ml~t az affinitás-oszlopra viszünk, ami az előzőkben ismertetett immobílizált pepiidet tartalmazza. Az oszlopot 10 ml foszfát, pufferrel mossuk, majd a peptid lígandnmhoz specifikusan kötődő von Willebrand faktort 0-2 mol/l nátrium-klorid foszfát pufferben készített lineáris gradiensével eluáljuk, 1 ml/perc áramlási sebességgel. 1 ml-es frakciókat szedünk, majd ezek optikai sűrűségét 280 nm-en meghatározzuk. Mindegyik frakciónak megmérjük a von Willebrand faktor antigén tartalmát, amihez specifikus ELISA módszert használunk (Asserachrom. vWF, Boehrínger Mannheim), A mérés egy specifikus von Willebrand faktor csúcsot mutat, ami

-41 * * Φ *t··

100 rom.0.1/1 nátríum-klorid koncentrációnál eluálőtiik a pepiidről, mig ÜV-elnyeléssel mérve a legtöbb fehérje a von Willebrand faktor frakció· előtt eluálódík, a mosőpufferrel. A von Willebrand faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük, és mérjük a von Willebrand faktor aktivitásukat. Ebben a pociban a von Willebrand faktor specifikus aktivitása. 95 E vWF/mg fehérje, és lényegében mentes minden más fehérjétől.

o. Példa

Anti-vWF-cp polipeptíd ellenanyagok

Az AAGGiLllLELLV (1. számú szekvencia) szekvenciájú pepiidet a. 4. példában ismertetett, módon szintetizáljuk meg és tisztítjuk. A pepiiddel azután háromhönapos BALB/c egereket immunizálunk az alábbi protokoll szerint: 100 ,ug peptid, 100 μ'ί Freund féle komplett adjuvánshan, ezzel primer szubkután injek-

CIÓ, foszfáttal puíterelt soolüatban, navonta egyszer.

Az anti-peptid litert rutin ELISA módszerrel teszteljük, vizsgáló antigénként tisztított pepiidet használva. A. végső erősítés után a lépeket kivesszük az egerekből a sejifúziös művelethez. A sejtfúziót az eredetileg Köhler és munkatársai által ismertetett standard protokollal hajtjuk végre (Köhler és mtsai: Natúré 256, 495-497 (1975)(. Az anti-peptid ellenanyagokat termelő hibridóma sejtvonalakat standard technikákkal vizsgáljuk át, a tisztított pepiidet használva vizsgáló antigénként, lényegében a hagyományos ELISA módszer alkalmazásával. Klónozás után egy sejtvonal izolálható, ami magas szinten expresszálja az ÁÁ.GG1LHLELLV szekvenciájú vizsgáló pepiidre specifikus ellenanyagot. Ezt. a sejtvonalat szérummentes tenyésztő közegben tenyésztjük, majd

tftf ** * κ » » tf X.’ _Α tf * ♦ 2» «*»« nagy sűrűségig szaporítjuk. A sejttenyészet felülú szóját centrifugálással nyerjük ki, hogy eltávolítsuk a sejteket, és a monoklonális ellenanyagot tartalmazó felülúszót ultra-diaszűréssel tö~ ményítjük,. majd a további felhasználáshoz kondicionáljuk.

A kapott monoklonális ellenanyagnak nagy a szelektivitása a von Willebrand faktort hasító proteázra, Furlan és munkatársai leírása szerint (Furlan és mtsai: Blood .87, 4223-4234 (1996)]. Ezt a monoklonális ellenanyagot immohilízáljuk egy polisztirol ELISA lemezre, karbonát/bikarbonát pufíerben (Ö.OS mol/l, pH~9,6), 5 pg immunglobulin/ml koncentrációban, éjszakán át (16 óra),. 4 °C on, tukán ként 100 μΐ bevonó oldatot használva. A bevonó oldatot eltávolítjuk a Inkákból, majd 2 órára Inkánként 100 μΐ, 100 pg/ml szarvasmarha. szérum-albumin (BSA) oldattal helyettesítjük. Á szarvasmarha szérum-albumin oldatot eltávolítjuk, majd a lukakat foszfáttal pufferelt sóoldattal mossuk. Az előre bevont lemezeket azután vagy olyan plazma mintákkal inkubáljuk, amik vérlemezkében szegény, egészséges humán plazmadonortól származnak, vagy olyanokkal, amik nem tisztán diagnosztizálható trombotikus trombocítopénia purpureábarx (TFP) vagy hemolitíkus urémíás szindrómában (HÚS) szenvedő, vérlemezkében szegény plazmák. A plazma-mintáknak az ellenanyaggal borított ELISA lemezekkel való ínkubálása esetében, mint például egy rutin szendvics ELISA rendszerben, 3 óra elteltével a. plazmát, eltávolítjuk a Inkákból. A lukakat foszfáttá.] pufferelt sőoidattal mossuk, majd az AAGGILHLELLV szekvenciájú pepiid elleni monoklonális ellenanyaggal ínkubáljuk, amit Wilson és munkatársai módszerével tormaperoxídázhoz konjugáltattunk (Wilson és mtsai: Immunfluorescence and Related St.aini.ng Techniques: szerk.: Knapp, W, Holubar, K. és Wiek, G.;

.-43 «φ *

* **

EIsevíer/Horih Holland. Amsterdam, 215 (1978)], majd Cathy és munkatársai leírása szerint OPT reagenssel mutatjuk ki (Cathy és mtsai; „RLISA and related enzyme immunassays”, In; Antibodies 11 a practieal approaeh; szerkz Cathy D., 1RL Press Eynsham Oxford Anglia, 97 (1989)).

Az egészséges humán plazma donorokból származó minták szintje alapján megállapítunk egy normális tartományt. A HÚS·· bán szenvedő betegekből származó plazmák proteáz aktivitása ekvivalens az egészséges emberekével, mig a TTP-ben szenvedő betegekben csökkent a proteáz aktivitás, amit egy másik, a WO 00/50904 számú szabadalmi leírásban ismertetett vizsgálat alapján kidolgozott esszével lehet igazolni.

A von Willebrand faktort hasító gén klónozása

A humán nyálmirigy poli A+ RNS-t a Clontech vásároljuk. Az első cDRS láncot Gxpand reverz transzkríptázzal (Hohmann La Roche} és oligo d(T) primőrrel kapjuk meg, a gyártó utasításai szerint. A polimeráz láncreakciót as 5' CGGCCGGATCCTACACCTGG 3' (10. számú szekvencia) és az 5 AATGTGACTCCAGGTCG A 3' (11. számú szekvencia) primerekkel hajtjnk végre, 10 ng nyálmirigy cDNS-sel mint templáttal és 10 E Hot Star Taq polimerázzal (Quiagen), A höciklus paraméterei a következők: kezdő ínkubálás 94 °C~on 15 percig, majd 45 ciklusban 94 *>C (50 másodpercig), 50 °C (50 másodpercig), 72 °C (2 percig). A polimeráz .láncreakció term ékei t közvetlenül szökvén áljuk mindkét irányban, a BÍgDye Terminator Cycle Sequeneing Ready Reaction Rít használatával (Perkin Elmer Life Science).

»U~ ·« szekvenciát arra használjuk, hogy átvizsgáljuk vele a génomiáhs. adatbázist, a BLAST (basíc loeal alígnment search tool) programok használatával, és az RP11224N2Ö klón 9-es kromoszómájához illesszük, A 9q34 kromoszóma 4 feltételezett exonjának megfelelő DNS és lefordított aminosav szekvenciát az 5, ábrán mutatjuk be.

A von Willebrand faktort hasitó proteáz prepro-szekvencíájának vagy érett doménjeínek megfelelő E’T-PCR fragmenseket a pDríve (Quíagen) vektorba klónozzuk, polimeráz láncreakciós klónozással, Az érett vWF-cp amplííikálásához a #6601 prímért (5' AGCGGTCTCTATGGCTGCAGGCGGCATCCTACACC-3') (30. számú szekvencia), és a #6617 primőrt (5' AGCCTCGAGCTGGCCAGACACGGAACAAAT-3') (31. számú szekvencia) használjuk. A kapott DNS fragmenst a pDríve vektor T--átfedéseihez Egáljuk, a vWF-ep-t tartalmazó konstrukció jelzése pFP H251/8. A vWF-cp prepro-szekvenciájának ampiíOkálásához a #66128 prímért (5*GGCGAATTCATGCACCAGCGTCACCCCCG-3'Ι (32. számú szekvencia) és a #6787 prímért (5'-ACAGCATTAAACTAAGGCGCC-3'} (33. számú szekvencia) használjuk. A kapott DNS fragmenst a pDríve vektorba építjük be. A kapott konstrukció

H262-35/14.

7. Példa

A von Willebrand faktort hasító proteáz expresszíóia.

Az eukarióta peDNA3.!(-*j (Invitrogen) expressziós vektort használjuk a teljes hosszúságú von Willebrand faktort hasító proteáz (vWF-cp) expresszájtatására., a humán CMV promoter vezérlésé vet

-4:

Egy 4,12 kilobázis méretű EcoRI/Xhol fragmenst vágunk ki a pFP H251/8 plazmidból, amely fragmens tartalmazza a cDNS szekvenciát, ami az érett vWF-ep-t kódolja, a 223-as nukleotidtöl a 4284-es nukleotidíg (az 1-22-es nukleotidok közötti preproszekveneía nélkül), majd a pcDNA3.!(ri EeoRi/XhoI hasítási helyére építjük be. A cDNS 5'-végének kialakításához, azaz a vezérszekveneía és a propeptíd szekvencia hozzáadásához polimeráz láncreakciót hajtunk végre, templátként a pFP H262-35/14 piazmidot használva, ami a vWP-cp cDNS szekvenciáját tartalmazza a -10-es nukleotidtöl (azaz az ATG startkodon előtt 10 nukleotiddal) a +824-es xiukleotídíg a pDríve vektorban (Quiagen), és a 6839 dírekt primerrel (S'-GATCGAATTCGCCGGCCACCATGCACAGCGTCACCC CCG-3j (34. számú szekvencia), ami tartalmazza a Kozák konszenzus szekvenciát (aláhúzva)., azért, hogy a startkodon felismeréséhez optimális környezetet, biztosítsunk, és a 3113 reverz primerrel (5'-CGGATÁACAATTTC~ ACACAGG-3 j (15. számú szekvencia), ami a pDrive vektor lacZ régiójához kötődik. A polimeráz láncreakciót standard reakciókörülmények között hajtjuk végre, HotStar DNS polimeráz (Quiagen) és Q -oldat (Quiagen) használatával. A -10-es nukleotidtól a r824~es nukleotidíg terjedő aroplífikált fragmenst EcoRI és Ascí restrikciós enzimekkel emésztjük', majd ezt arra hasz náljuk, hogy a nem teljes klón EcoRl/AscJ íragmensét helyettesítsük vele, ami csak az érett vWF-cp szekvenciát tartalmazza. Az utóbbi konstrukciót, ami a vWF-cp teljes szekvenciáját tartalmazza, p€MY--vWFcp-n.ek nevezzük, és a továbbiakban ezt használjuk az emlős sejtekben végzett, transzíekeiős és expressziós vizsgálatokhoz.

· 46 > * *

A vW'F-cp expressziőjához -SICHep sejteket (ATCC) tranziensen transzfektálunk a pCMV-vWFcp plazmiddal, és ezzel párhuzamosan, kontrollként, a kiindulási cDNA3.1(+) vektorral, Lipofectamíne 2ö90~et (Life Technologies, Inc.) használva. A transzfektált sejteket standard körülmények között tenyésztjük DMEM/HAM F12 (1:1) táptalajban (Gibco), 10% boíjúmagzat szérummal, 37 °C~on, 5% COs-t tartalmazó atmoszférában..

A vWF-ep expressziót Western blottal elemezzük, aminek során a kondicionált táptalajból és a begyújtott sejtekből vett mintát SDS-PAGE elemzésnek vetjük alá 4%-os felvivő/6%-os elválasztó gélen, majd a Western biot elemzést anti-vWF-cp TTP betegből származó plazmával, hajtjuk végre, ami políklonális antivWF-cp ellenanyagokat és kecske-anti-hu-IgG-t (Fab-specifíkus ellenanyag, SÍGMA) tartalmaz. A vWF-cp specifikus csíkokat BCIP/NBT kimutatással tesszük láthatóvá.

A vWF-cp a sejtlizátum mintájában mutatható ki, és úgy tűnik, hogy leginkább sejthez kötődik. A Western biot elemzés eredményeit a 7. ábrán mutatjuk be, amin a vWF-cp specifikus fehérjecsíkja látható, körülbelül 170 kDa molekulasúlynak' megfelelően, ami reagál a beteg szérumával.

A vWF-cp~t expresszáió sejtek sejtlizátumát tovább vizsgáljuk, Furlan és munkatársai módszerével mérjük a vWF-ορ aktivitásukat [Furlan és mtsai: Blood 87, 4223-4234 (1996)(, majd Rnggeri és munkatársai módszerével von Willebrand faktor multimer elemzést is végzünk 1%-os SDS-agaróz gélen (Rnggeri és mtsai: Blood 57, 1140-1143 (1981)( (8. ábra). Az emlős sejtekben expresszált vWF-cp biológiai, aktivitása világosan kimutatható, ahogy a nagy molekulasülyú vWF alacsonyabb molekulasúlyéi von Willebrand faktor molekulákká bomlik (8. ábra, 5. sáv).

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, valamint ezeket számítógéppel olvasható formában is mellékeljük.

SZEKVENCIÁLIST/ <1 Iö> Baxter ÁG <120> A von Wíllebrand faktort (vWF) hasító proteáz polipeptid, a polipeptídet kódoló nukiéinsav, és a polipeptid használata.

<130> FA247 < 140>

<I41>

<I51> 2000·· 11-22 <150> 09/833,328 <151> 2001-04-12 <I60> 35 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 12 <212> Fehérje <213> Homo sapiens <210>2 <211> 15 <212> Fehérje <213> Homo sapiens <400> 2

Aia Ma Gly Gly He Leu Kis Leu Glu Leu Leu Vei Aia Vei Gly I 5 10 25 <210> 3 <211> 148 <212> Fehérje <213> Homo sapiens <400> 3

Alá 1

Al a

Gly Gly

Ho 5

Le a

His

Le-ü

Glu

Leu 10

Lee

Val

Aha

Val

Giy 15

Pro

Asp

Vei

Phe

Gin

Alá

His

Gin

b.i u

Asp·

Thr

Glu

Arg

Tyr

val.

Lee

The

20

25

30

Asn

Leu

Asn

Π-8

Giy

Alá

Glu

Leu

Leu

Arg

Asp-

Pro

Ser

Leu

Giy

Aha

35

40

4 5

Gin

Phe

Arg

Val

Kis

Leu

Va 1

Lys

Kiírt

Val

He

Leu

Thr

Glu

Pro

Gin

50

55

60

Giy

AH

Pro

Asn

Tle

Thr

Al a

Asn

len

Thr

Sfer

Ser

Leu

Leu

Ser

Val

65

70

75

S0

Cys

GI y

Trp

Sor

Gin

Thr

Lle

Asn

Pre

Glu

As ρ

Asp

Thr

Asp

Pro

Giy

5 Ο-

50

95

Ki s

A.Le

Asp

Leu

νο. 1

Len

Tyr

lle

Thr

Arg

Phe

Asp

Leu

Glu

Le u

Pro

IÖÖ

2.05

110

Asp

Gly

Asn

Arg

G.i:o

Vei

Ar g

Giy

Val

Thr

Sin

Leu

Gly

Giy

Alá

Cys

115

120

125

Ser

Pro

Thr

Trp

Ser

Cys

Lsu

1 le

Thr

GI n

Asp

Thr

G.ly

Phe

Asp

Len

130

OS

Ή

Gly Vei The iie 14 5

-50- „ .. ,:

***’. <* · / ;

<210>4 <211> 1353 <212> Fehérje <213> Homo sapiens

<400> 4

Alá 1

W.

Giy

Gly

He 5

Les

K1 s

Len

GIo

Tara lö:

Leó

Ve 1

lila

Val

Giy 15

Pro

Asp

Val·

Phe

Gin 20

Als

Pro

Gla

G1 o

Asp 25:

Tar

Gin

.Arg

Tyr

Val. 30

Le o

Thr

Asn

L\::\j

As a 35

He

Gly

Al s

Gin

Lee 4 0

Le o

Arg

Asp

P.r o

Ser 4 5

Le o

Giy

Alá

Gla

Phe so

Arg

Val

H.ls

Len

Val 55

Lys

Pfet

Val

U.e

Lee 50

Thr

Gin

Pro

Gin.

Gly 65

Alá

Pro

As i>

He

Thr 70

Alá

Asn

Len

Thr-

Ser 75

Ser

Len

Lee

Ser

Val 80

Cys

GJ y

Tro

Ser

Gin 55

Thr

He

Asa

?;: o

Gla 00

Asρ

Asp

Thr

Asp

Pro 35

Gly

His

Ala

Asp

Isa ISO

Val

Len

Tyr

lis

Tar 105

Arg

Phe

Ásta

Leó

Gla: 115

Len

Pro

Asp

Gly

Asa 115

Arg

Π

Val

Arg

Giy 120

Val.

Thr

Gla

Leó

G.i.y 125

Gi y

Alá

cys

Ser

Pro 130

Thr

Trp

Sor

Gys

Len 135

Ho

Th.r

Gin

Asp

Thr 110

Gly

Phe

Asp

Len

Giy HS

Val

Thr

Ils

Ars

His 150

Gla

1 le

Gly

His

Ser 155

Phe

Gly

Leu

Gla;

His ISO

Asp

Gly

AH

Pro

Gly I 65

Ser

G1 y

Gys

Giy

Pro 170

Ser

Gly

His

Vai

Gél. 175

Alá

Ser

Asp

G1 y

Alá 150

Alá

Pro

Arg

Alá

Giy 185

Lee

Alá

T.rp

Se:c-

Pro 130

Cys

S or-

Arg

Arg

Gin 135

Les

Les

Ser

Les

Lee 200

Ser

Alá

Gly

Arg

AIs. 205

Arg

Gys

vai

Trp

Asp 210

Pro

Pro

Arg

Pro

Gin 215

Pro

Gly

Ser

Al a

Giy 220

His

Pro

Pro

Asp

Als 22 5

Gin

Pro

Gly

Les

Tyr 230

Tyr-

Ser

Als

Asa

Gin 2 H

Gla

G ys

A:rg

Val.

Aia 24 0

Phe

Gly

Pro

Lys

Alá H

Val

Alá

Cys.

Thr

Phe: 250

Alá

Arg

Gin

!-hi s

Le o 255

Asp

Heh

Gys

Gin

Ara 2 00

Lee

Se r

Cys

Η1 s

Thr 265

Asp

Pro

Len

Asp

G i O: 27 0

Se r

Ser’

*

Cys

Ser

Arg

Lse

Lee

Vai

Pre

Leu

Lse

Asp Giy

Thr Gin

cys

Giy

Vai

275

280

235

Glu

Lya

Trp

Gye

Ser

Lys

Giy

Arg

C ys

Arg Ser

Lea Vai

Gin

Leu

Thr

2 35

2 55

300

Pro

iie

isi a

Aia

Val

Kis

Giy

Arg

Trp

Ser Ser

Trp Giy

Pro

Arg

Ser

305

310

3:.5

320

Pro

Cys

Ser

Ar'g

Ser'

Cys

Giy

Giy

G1 y

Val var.

Thr Arg

Arg

Arg

Gin

325

330

335

Cys

Asn

Asn

Pro

Arg

Pro

Aia

Phe

Giy

Gl,y Arg

Aia Cys

Va 1.

Giy

Aia'

34 0

345

350

Asp

Len

G in

Aia

Gi a

Mer

Cys

Asn

Th r

Gin Aia

Cys Giu

Lys

Thr

Gin

355

360

365

Len

Giu

Phe

Mer

Ser

Gin

Gin

Cys

Aia

Arg Thr

Asp Giy

Gin

P r o

Leu

330

37 5

380

Arg

Ser

Ser

Pre

Giy

Giy

Aia

Ser

Phe

Tyr His

Trp Oly

Aia

Aia

Val.

385

390

395

400

Pro

His

Sor

G i. n

G1 y

Asp

Aia

Lea

Cys

Arg, Kis

Met: Cys

Arg

Aia

iie

405

4.10

415

Giy

Giu

Ser

Phe

iie

Mer.

Lys

Arg

Gr. y

.Asp Ser

Phe Leu

Asp

Giy

Thr

420

4 25

430

Arg

Cys

Mer

Pre

Ser

G.i y

Pro

Arg

Gin

Asp Giy

Thr Leu

Ser

Leu

Gys

4 35

44 0

4 45

Vai

Ser

Giy

Ser

Cys

Arg

Thr

Phe

GI y

Cy s .Asp

Giy Arg

Met.

Asp

Ser

450

4 55

4 60

Gin

Gin

Vai

Trp

Aap

.Ara

Cys

Glu;

Vai

Cys Giy

Giy Asp

As n

Ser

Thr

4 65

470

475

480

Cys

Se r:

Pre

Arg

Lys

Giy

Ser

Phe

Thr

Aia Giy

Arg Aia

Arg

Glu

Tyr

4 8 5

4 90

405

Val

Thr

Phe

Len

Thr

Val

Thr

Pre

Asn

Seu Th:c

Ser Vai

Tyr

iie

Al a

505

505

510

Asn

His

Arg

Pre

Lee

Phe

Tar

Kis

Lee

Alá Vai

Arg iie

οι y

Giy

Arg

515

520

525

Tyr

Vai

Vai

Aia

Giy

Lys

Mát

Ser

1 le

Ser Pro

Asn Thr

Thr

Tyr

Pre

530

535

54 0

Ser

5,0)1

Leu

Glu

Asp

Giy

Arg

vai

Glu

Tyr Arg

Val Aia

Len

Thr

Giu

54 5

550

555

560

Asp

Arg

Leis

Pre

Arg

Lee.

Glu

Gin

1 i e

Arg iie

Trp Giy

Pro

Lea

Gin

5 ö 5

57 0·

575

Glu

Asp

Al a

Asp

ile

Gin

Va.1.

Tyr

Arg

Arg Tyr

Giy Giu

G1 o

Tyr

Giy

580

56 5

590

Asn

Leu

Thr

Ara

Pre

Asp

iie

Thr

Phe

Thr Tyr

Phe Gin

Pro

Lys

Pro

535

600

005

Arg Gin 615

Alá

Trp

Val

Trp

Alá Alá Val Arg 615

Gly

Pro 625

cys

Ser

Val

Se r

Cys:

Gly

Alá

Gly

Leu

Arg

Trp

Val

Asn

Tyr

Ser

cys

Leu

Asp

Gin

Alá

625

650

635

640

Arg

Lys

G1 u

Lee

Ver

Glu

Thr

Val

om

Cys:

Gin

c i y

Ser

Cl e

hí j..Tí

Pro

69 5

SSL

5·

Pro

Alá

Trp

Pro

Gin

Ar a

Cys

Val

Len

Gin

Pro

Cys

Pro

Pro

Tyr

Trp

660

665

6 70

.6.13

Val

G r y

Asp

Phe

Gly

Pro

cvs

Ser

Ara

Ser

Cys

Gly

Gly

Gly

Len

67 6

680

685

Arg

Glu

Arg

Pro

Val

Arg

L.ys

Va 1

Glu

Alá

Gin

Gly

Ser

Len

Leu

L ys

690

650

750

Thr

Len

Pro

Pro

Alá

Arg

Cys

Arg

Alá

Gly

Alá

Gin

Gin

Pro

Alá

Val

?05

715

715

720

Aha

Leu

Glu

Thr

Cys

Asrt

Pro

Gin

Pro

cya

Pro

Alá

Arc·

Trp

G10

Vei

725

7 39

735

Ser

Gin

Pro

Ser'

Ser

Cys

Thr

Ser'

illa

Gly

G1 y

rt :. a

Gly

Leu

Ale

Len

740

7 4 5

759

G1 o

Asn

Glu

Thr

Gys

Val.

Pro

G.l y

Alá

Asp

Gly

Len

Glu

Alá

Pro

Vei

7 55

760

7 65

Thr

Glu

Gly

Pro

Gly

Ser

Va 1

As p

Glu

Lys

Len

Pro

Alá

Pro

Glu

Pro

770

77 5

780

Cys

Vei

Gly

Me r

Ser

Cys

Pro

Pro

Gly

Trp

Gly

31. s

Leó

Asp

Alá

Thr

7 85

7 80

7 95

800

Ser

Alá

Gly

Glu

Lys

Alá

Pro

Ser

Pro

Trp

Gly

Ser

He

Arg

Thr

Gly

80:5

810

815

Alá

Gin

Ara

Alá

His

Val

Trp

Thr

Pro

Alá

Alá

Gly

Ser

Gys

Ser

Val

830

625

8 30

Ssr

c y s

Gly

Arg

G1 y

Len

Me 5

Glu

Le tr

Arg

Phe

Len

Cys

Mer

Asp

Ser

835

849

845

Al a

Leu

Arg

Ve 1

Pro

Val

Gin

Gin

Gin

Len

Cys

Gly

Len

Alá

Ser

Lys

850

6 55

8 60

?::·:·

Gly

Ser

Arg

Arg

G1 ti

Var

Cys

Gin

Alá

Val

Pro

cys

Pro

Alá

Arg

8 6íi

8'75

875

880:

Trp

Gin

Tyr

Lys

Leu

Alá

Alá

Cys

Ser

Val

Ser

Cys

Gly

Áru

Gly

Val.

8 85

390

895

Val

Arg

Arg

Tle

Len

Tyr

Cys

Arg

Alá

31 s

Gr y

Glu

Asp

Asp

Gly

650

905

91.0

Gin

Glu

1 le

Leu

Leu

Asp

Thr

Gin

cys

Gin

...-ί y

lan;

Pro

Arg

Pro

Glu

315

330

925

Pro

Gin

Glu

Ale

Cys

Ser

Len

Glu

Pro

Cys

Pro

Pro Arg

Trp

Lys

Val

930

535

34 0

♦ *

Mer

Ser

Le u

Gy

Pro

Cys;

Sesr

Aia

Se r

Cys Gly La;.; Gly

Thr

ALa

Arg

945

950

955

960

A.rg

Ser

Val

Alá

Cys

Val

GX n

.Les

Asp

Glu

Gly

Gin

Asp

VLX.

G1 a

'Val

565

970

975

.Asp

Glu

AX.a

A la

Cys;

Aia

Alá

Leu

Val

Arg

Pro

G Le

Alá

Ser

Vai

Pro

980

985

999

Cys

Leu

Xle

Alá

Asp

Cys

Thr

Tyr

Arg

Trp

Kis

Val

Gly

Thr

Trp

Met

995

1000

1005

Glu

Cys

Ser

Va:

Se r

Cys;

GXy

Asp

Gly

lle

Gin

Arc;

Arg

Árut

.Asp

Thr

10 X0

70X5

102:0

Cys

Leu

Gly

Pro

Gin

A1 a

Gin

Aia

Pro

Vei

Pro

A·..;

Asp

Phe

Cys;

Gin

5025

103 9

1035

104 0

Ki s

leu

Pro

Lys

Pro

Va:

Thr

Val.

Arg

Giy

Cys

Tro

Al a

CX y

Pro

Cys

X05

5

1050

1055

Val

Cl y

Gin

Gly

Tar

Pro

Sar

Leu

Va;

Pro

Kis

Glu

CX a

AX.a

Aia

Aia

X. 060

1065

107 0

Pro

Gly

Arg

Tar

TX;r

AX.a

Thr

Pro

Aia

Giy

Aia

Ser

Leu

Glu

Trp

Ser

1075

I080

1085

Gin

Alá

Ara

Gly

Len

X,eu

Phe

Ser

Pro

Alá

Pro

Glu

Pro

Arg

Ara

Leu

1090'

10 95

XI00

Leu

Pro

Gly

Pro

Glu

CX u

Asn

Ser

Va X

G.l n

Se r

Sár

Aia

Cys

Gly

Arg

5105

1 X 10

1115

XX 20

Gin

Kis;

Lau

Glu

Pro

Thr

Giy

Thr

XX a

Asp

Hat:

Arg

GX.y

Pro

Giy

GX.r;

;12

5

X X 30

1135

Cl a

Asp

Cy s

AX.a

Val

AX.a

IX a

Giy

Arg

Pro

Lee

Gly

GX u

Var

Val

Thr

1140

1145

1150

Leu

Arg

Val

Leu

GX.u

S íír-

Se r

Lau

Aon.

Cys

Ser

Aia

Giy

Asp

Mer

Leu

1X55

1160

X X65

Lan

Les.;

Trp

oly

Arg

Le u

Thr

Trp

Arg

Lys

hat.

Cys

Arg

Lys

Leu

Leu

1170

117 5

XX 80

Asp

>P·

Thr

Phe

Se; r

Ser

Lys

Thr

Asn

Thr

Lee

Vei

Va 1

Arg

CX n

Arg

1135

1190

1195

X20C

Cys

Gly

Arg

Pro

Gly

Giy

Gly

Val

Le a

X>ea

Ara

Tyr

Giy

Ser

Gin

Lau

12 05

1210

1215

Aia

Pro

Glu

Thr

Phe

Tyr

Arg

Glu

Cys

Asp

Mer

Gin

X>ee

Phe

Gly

Pro

1220

1225

1230

Trp

G i y

G1 e.

1X a

Val

Ser

Pro

Ser

Le a

S e r

Pro

Ara

Thr

Ser

Aun

AX.a

1235

124 0:

129 5

Gly

Glv

Cys

Arg

Lau

Pl:e

Xle

Asn

V a X.

Aia

Pro

Kis;

A La

Ara

X X e

A1 a

1250

12 5 5

12 63

Lle

His

Aia

Les

Aia

Thr

Asn

hat:

Gr y

Aia

Gly

Thr

GX.u

G1 y

AX. s

Asn

1265

127 0

1275

2.2 PC

'**·**

Ala

Ser

Tyr

Ile

Len

Ile

Arg

Asp

Thr

His

Se r

Lee

Arg

Thr

Thr

Ala

Ú2S

3

12 90

1293

Phe

His

Giv

Gin

Gin

Val

Lee

Tyr

Trp

Gm

Ser

Gin

Ser

Ser

Gin

Ala

133;

5

1305:

1310

Glu

Me 1

Gin

Phe

Se r

Gin

Gly

Phe

Len

Ilye

Ala

Gin

Ala

Se r

Len

Ara

13 IS

1320

1325

Gly

Gin

Tyr

Trp

Thr

Len

Gin

Ser

Trp

Va 1

Pro

Gin

Mer

Cm

Asp

Pro

1330

13 SS

134 0

Gin

Ser

Tr'p

Lys

Gl y

L y s

Glu

Gly

Thr

134;

L350

<210> <211> <212>

<5 1427 Fehérje Homo sapiens

<21

,3>

<4ÖO> 5

bfet

Has

Gin

Arg

His

Pro

Arg

Ala

Arg

Cys

Pro

Pro

Lee

Cys

Val

A.l a

I

5

1C5

15

Gly

Ile

leu

Ala

Cys

G.i.v

Pite

Len

Leu

Gly

Cys

Trp

Gly

Pr o

Ser

His

215

25:

30

Phe

Gin

Gin

Ser

C y,s

Len

Gin

Air·

Lan

Gin

Pro

C5i rs

.Ala

Val

Ser

Ser

35

43

45

Tyr

Leu

Ser

Pro

Gly

Ais

Pro

le.;

Lys

Gly

Arg

Pro

Pro

Ser

Pro

Gly

53

SS

60

Phe

G1 n

Arg

G In

Arg

G1 n

Arg;

Gír

Arg

Arg;

Ais

Ala

Gly

Gly

1.1%

Len

65

70

75

30

H .1 s

Leu

Glu

Lee

Lee

Val

.Ala

Va 1

Gly

Pro

As p

Vsi

Pite

G i.n

Ala

His

3 5

90

95

Gin

Gin

Asp

Thr

Glu

Arg

Tyr

Va,].

Lan

Thr

Ara;

Leu

Asn

Ile

oly

Al a

100

1055

110

Gin

Len

Len

Arg

Asp

Pro

Ser

Len

Gly

Ai.a

Gin

Phe

Arg

Val.

Illa

Lee

1.15

123

125

Vei

Lys

Aet

Val

11a

Len

Thl'

Gl n

Pro

Gin

Gly

Am

Pro

Am

Ile

Thr

133

135

143

Al a

Asn

Len

Thr

Ser

Ser

Len

Lee

Ser

Vali

Cys

Gly

Trp

Ser

Gin

Thr

145

153

135

ISO

I le

.Asn

Pro

Gin

Asp

Asp

7o

Asp

Pro

.i.y

His

A.l a

Asp

Len

Val

Len

1 63

17 0

175

Tyr

TJo

Thr

Arg 130

Fiié

Asp

Leu

Glu

Leu 185

Pro

Asp

Gly

Asn Arg J.90

Gin

Ve i

Arg

c.i. y

Val

Til ί-

Gin

Leu

Gr y

Gly

Alá

Cys

S e χ-

Lm

Thr Trp

Ser

Cys

185

203

235

leu

I Lo

Thr

ο i il

Asp

Thr

o r y

Phe

Asp

Leu

ΟΙ y

Vei

Thr- l.i.e

AJ. a

8 i s

210

2 5.5

220

Gm

lie

Gly

Óis

Ser

Phe

g 2 y

Leu

Ga n

Hús

Asp

Giy

Ale Pro

Giy

Ser

225

230

235

2 45

GJ.y

Cys

Giy

Pro

Ser

Giy

his

Vei

Met

Alii

Ser

Asp

Giy Al.a

Aia

Pro

24 5

2 50

2 55

Arg

Alá

Cl y

Les

Aia

Trp

Ser

Pro

Cys

Ser

Arg

Arg

Gin i.OU

Leu

Ser

2 00

285

27 0

Leu

Leu

Ser

Aia

Gi y

Arg

Aia

Arg

Cys

Val

Trp

Aso

Pro Pro

Arg

Pro

37 5

280

285

Gin

Pro

ciy

Ser

Ale

GJ.y

í-i i.s

Pro

Pro

Asp

Alá

Gin

Pro GJ.y

leu

Tor-

280

2 95

330

Tyr

Ser

Al.a

Asn

Gi n

G i ti

Cys

Arg

Val

Ara

Phe

Giy

Pro Lys

Alá

vaj.

305

510·

315

320

Alá

Cys

Thr

Phe

Air

Arg

Gin

his

Leu

Asp

Mer

Cys

Gin Ale

len

Se ?:

32 5

330

335

Cys

His

Thr

Asp

Pro

Len

Asp

Gir

Ser

Ser

Cys

Ser

Arg Len

Leu

Vai

340

34 5

350

Pro

Le ti

Les

Asp

Gly

Thr

Gin

C y s·

G1 y

Vei

Gin

Lys

Trp Cys

sí ν: X

lys

355

360

365

Giy

Arg

G ys

Arg

Ser

Le u

Vei

Gin

Len

Thr

Pro

Ϊ ie

Ale Aia

Vai

His

37 0

375

380

Gly

Arg

Trp

5 er

Ser

Trp

Gly

Pro

.Arg

Ser

Pro

Cys

Ser Arg

Ser

Cys

385

390

335

400

Gly

oly

Gly

Val

Val

Thr

Arg

Arg

Arg

Gin

Cys

Asn

Asn Pro

Arg

Pro

COS

420

415

Alá

Phe

Gi y

Giy

Arg

Alá

Gye

Val

Gly

Aia

Asp

Leu

Gin Aia

G in

Met

420

4 25

433

Cys

Asn

Thr

Cin

Aia

Cys

Gin

Lys

Thr

Gin

Leu

Glu

Phe Met

Se r

Gi h

4 35

440·

445

Gin

Cys

AJ a

Írre

Thr

Asp

Giy

Gin

Pro·

Lee

Arg

Ser

Sex- Pro

GJ.y

Gly

450

4 55

4 60

Als

Ser

Fiié

Tyr

Sis

Trp

Gly

Ali:

A51 a

Val

Pro

Kis

Sér Gi n

Giy

Asp

4 65

4 70

4 35

483

A i n

Len

Cys

Arg

Fis

Met

Cys

Arg

AJ. a

IJ.e

Giy

Gin

Sex- Phe·

1 ie

Met

455

4 90

4 95

Lys

Arg

h:·.;. V

Asp

Ser

Phe

Lee

Asp

Giy

Tire

Arg

Cys

Met Pro

Ser

G.ry

SCO

SOS

515

· 56

Pro:

Arg

Gia 515

Asp

Gly

Thr

Mén

S er 528

tea

Cys

Val.

Ser !

Giy 525

Ser

Cys

Arg

Thr

Phe 530

Gly

Cys

Asp

elv

Arg 535

Met

Áss

Ser

Gin

Gin 54 0

Var

ΪΕΌ

Asp

Arg

Cys; 5 4 5

Gin

Val

Cys

Giy

Gly 558

Asp

Asn

Ser

Thr

cys 555

Ser

Pro

Arg

Ij y s Ci· Ι y 3 60

Ser

Phe

Thr

Ara

Gly 56:5

Arg

Aia

Arg

Glu

Tyr 576

Va 1

Thr

Phe

Leüt i

w 5 75

Val:

The-

Pro

A,S [3.

Leu 588

Thr

Ser

Vei

Tyr

Ile 585

Alá

Asn

Mis

Arg

Pro 5 80

Le a

Phe

Thr

Mis

Lee 5 SS

Alá

Vei

Arg

He

Gly 680

Gly

Arg

Tyr

Val

Vei 605

Alá

Gly

Lys:

Mer

Se r 61 0

Xle

Ser

'Pro

Asn

Thr 615

Thr

Tyr

Pro

Ser

Leu 620:

Lan

Glu

Asp

oly

Arg 62 5

Val

Gl a

Tyr

Arg

Val 630

Alá

Len

Thr

Glu

Asp 6 3 5

Arg

Len.

Pro

Arg !

Lsa 546

Glu

Glu

I le

Arg

He 645

Trp

Gly

Pro

Len

Gin 656

Gin

Asp

Aia

Asp

Ile 655

Gin

Val

Tyr

Arg

Ang- íS S0

Tyr

Giy

Gr a

Gin

Tyr 665

Gly

Asn

len

Thr

Arg 676

Pro

Asp

Xle

Thr

Phe 675

Thr

Tyr

Phe

Glu

Pro 688

lys

Pro

Arg

Gin

Ara 665

Trp

Va I

Trp

Alá

Alá 690·

Val

Arg

Gly

Pro

C-v s 665

Ser

Val

Se ι-

Cys

G1 y 700

Alt 3:

Gr y

Leu

Arg

Trp 7 85

Val

Asn

Tyr

Se r

Cys 710

Len

Asp

Cin

ΑΙ a

Arg 72.5

Lys

Glu

tea

Val

Cin. 720

Thr

Val

Gin

Cys

Gin 725

Gly

Ser

Gin

Gin:

Pro 736

Pro

Ara

Trp

Pro

Glu 7 35

Als

Cys;

Va.!.

T.-eu

Glu 7 4 h

Pro

Cys

Pro

Pro

Tyr 72 5

Trp

Aia

Vei

Gly

Asp 7 50

Phe

Giy

P r o

Cys

Ser 755

Aia

Se r

Cys

Giy

C1 y 7:60

Giy

leu

.Arg

Glu

Arg 7 65

Pro

Val

Arg

Cvs

Va.i. 770

Glu

A r a

Gi a

Gly

Se r 775

Leu

Lee

lys

Thr

Leu 73 Θ

Pro

Pro

Aia:

Arg

Cys 781

Arg

Alá

Giy

Alá

Gin 728

Gi n

Pro

Al .e

Val

Aia 765

Leu

G r a

Thr

Cys

Asn 808

Pro

Gin

Pro

Cys

Pro 865

Aia

Arg

Trp

Gin

Val 316

Se r

G1 a

Pro

Ser

Ser 315

Cys

Thr

Ser

Alá

Giy 820

Gly

Aia

el y

Len

AT a 825

te a

Gin

Asn

Gia

Thr 838

Cys

Var

Pro

C1 y

A.1 a 83:5

Asp

Gly

Leu

Glu·

Aia 820

Pro

Val

Thr

Glu:

Gly 32:5

Pro

Gly

Ser

Vei

Asp 8 59

Gla

Lys

Lee

Pro

Alá 855

Pro

Glu

Pro

Cys

Val 3 69

Gly

Met

Ser

Cys

Prö 865

Pre

öl y

Trp

Gly

His 879

Lee

Asp

Alá

Thr

Ser 875

Aia

o r y

Gie

Lys >

a 1 a. 389

Pro

Ser

P.ro

Trp

'·. :f ,1. y 885

Ger-

lle

Arg

Tilt

Gly 8 90:

Alá

Gin

Alá

AJ.e

His 895

Val

Trp

Thr

Pro

Alá 999

Alá

ely

Ser

Cys

Ser 905

Ve 1

Ser

Cys

Gly

Arg 310

G1 y

Lee

Met

Sir

Len 915

Arg

PL e

Lee

Gys

Bet 920

Asp

Ser

Alá

Leu

.Arg 925

Val

Pro

Vei

1::.ΐ, Γ;

G1 u 939

Glu

Lee

Cys

Gly

Lee 935

Alá

Ser

Cys

P.ro

Gly 340

Ser

Arg

Arg

Glu

Val 945

Cys

Gin

Alá

Val

Pro 950

Cys

Pro

Alá

Arg

Trp 955

Gin

Tyr

Lys

Len

Aia 360

Aia

Cys

Ser

Val

Ser 905

Cys

Gly

Arg

Gly

Val. 970

Vei

Ar-g

Arg

lle

Lee 37 5

Tyr

Cys

Alá

Arg

ni S: 989

Hl s

GI y

Glu

Asp

Asp 985

Gly

•Sírt

Glu

lle

Len 390

Leu

Asp

The

Gin

Cys 995

Gin

G1 y

Lee

Pro

Arg 1008

Pro

Glu

Pro

Gin

Glu 1005

Al a

Cys

S e r:

Leu

Giu 19 IC

Pro

Cys

Pro

Pro

Ar g- 1015

Trp

Lys

Vei

Met

Ser 1020

Lee

Gly

Pro

Cys

Ser 1025

Aia i

Ser

Cys

Gly

Len 1036

Gly

Thr

ara

Ar-g

.Arg 1035

Ser

Vei

Al. a

Cys

Val 1040

Glu

Lee

Asp

Cin

Gly 104?

Gin re J

.Asp

Val

Giu

Vei 10 SC-

Asp

Gin

Alá

Aia

C ys 1055

Aia

Ara

Lee

Val

Arg 106Ϊ

Pro ϊ

Glu

Alá

Se r

Val. 1085

Pro

Cys

Lee

lle

Ar. a 107 0

.Asp

Cys

Thr

Tyr

.Arg 1075

Trp

His

Val

Gly

Thr 1080

Trp

Bei:

Sle

C ys

Sort: 1085

Val

S e r:

Gys

Gly

Asp 1059

Gly !

lle

GI a

Arg

Arg 1095

Arg

Asp

Thr

Cys

Lau 1100

ciy

Pro

Gin

Alá

Gin 1105

Alá ί

Pro

Val

Pre

Aia 1118

Asp

Phe

Cys

Gin

His 1115

Len

Pro

c y v

Pro

Vei 1120

Thr

Vei

Arg

Gly

Cys ill;

Trp h

Alá

Gr y

Pro

Cys 1130

Vei

G.L y

Gin

Gly

Thr 1135

Pro

Ser

Len

Vei.

Pro His 1140

Gin.

Glo

Al a

Alá 1195

Alá

Pro

Gly

Arg

Thr 1150

Thr

Alii:

Thr

Pre

Ala Gly 115 5

Alá

Ser

Leu

Giu 1169

Trp

Ser

Gin

Aia

Arg 1185

er y

Lee

Lee

Phe

Se r 1170

Pro !

A la

Pro

Gin

Pro 117 5

Arg

Arg

Leu

Les

Pro 1180

G1 y

Pro

Gin

Glu

Aso

Ser

Vei

Gin

Ser

Ser

Aia

Cys

Gly

Arg

Gin

His

Leu

Glu

Pro

Thr:

1185

1130

1 195:

1

200

Giy

Tar

lie

Asp

Mer

Arg

Gly

Pro

Gly

Gin

Alá

Asp

Cys

Aia

Val

Aia

1225

1210

i 215

1 le

Gl y

Arg

Pro

leu

Gly

Glu

Val

Vei

Thr

Leu

Arg

Val

Leu

Glu

Ser

121!

1

1225

1230:

Ser

Leu

Asn

Cys

S e r

Alá

Giy

Asp

Met:

leu

leu

Leu

Trp

G1 y

Arg

leu

1235

1240

124 5

Thr

Trp

Arg

lys

Met

Cys

Arg

lys

Leu

Leu

Asp

Met

Thr

Phe

Ser

Ser

1251

1235

1260

Lys

Thr

Asn

Thr

len

Vei

vei

Arg.

Gin

Arg

Cys

Giy

.Arg

Pro

Gly

Gly

‘265

1230

1275

1

2 0 0

Gly

Val

Len

Leu

Ara

Tyr

Gly'

Ser

Glu

Leu

Aia

Pro

Glu

Thr

Phe

Tyr

120'

j

120®:

1205

Arg

Glu

Cys

Asp

Mer

Gin

Leu

Phe

Gl y

Pro

Trp

Gly

Glu

He

Val

Ser

1301

3

1303

1310

Pro

.Ser

Len

Ser

Pro

.Ai·:!

Thr:

Ser

Asn

AIs

Giy

Giy

Cys

A.rg

Phe

1315

1320

1325

11«

As n

Va 1

-AÍU

Pro

H is

Alá

Arg

lie

A is

ile

His

Aia

Lee

Aia

Thr

133:

}

1335

1340

Asn

Met:

Giy

Aha

Giy

Thr

Glu

Gr y

Ai S:

Asn

Aia

Ser

Tyr

He

Leu

lie

1343

1330

1355

j

.360

Arg

Asp

Thr

Ars

Se r

Leu

Arg

Thr

Thr·

Ars.

Phe

His

g i y

Gin

G1 n

Val

isi:

1370

1375

Leu

Tyr

T rp

Glu

Sor

i U

Se:r

Ser

Gin

AI.E;

Glu

Met

Glu

Phe

Ser

Glu

1381

3

1365

1300

Gly

Phe

Leu

lys

Aia

Gin

Is i a

Ser:

leu

Arg

Gl y

Cin

Tyr

Trp

Thr

leu

•355

I400:

14.05

Gin

Ser

Trp

Var

Pro

i U

Met.

Gin

Asp

Pro

Gin

S e r'

Trp

Lys

e .1 y

Lys

1410

131.5

1420:

Glu Giy Tbt 1425 <210>6 <211> 4585 <212> DNS <213> Homo sapiens <900>6 » «

cccat t ecst	a-ctgaccaga	ttcooag0.es	CG.aö:'5'9'C'o<x	etetesetéé	get ocsctcc	SO
t egggctggc	tcí.cc tgagg	atgcaccagc	gtc-Hccccccí	gecsagatgc	octeocctct	12D
cítcjtggccgg	ag i. í.c.'í. t góc	tgfcggettíse	teesessete	ctggggeeoc	teocatttec	18o
agcagagttg	tetteagget	ttggagccsc	aggcegtgtc	ttettacttg	agccctggtg	240
ctccettsaa	aggccgccct	ecet c ccctg	gettccagsg	gcagaggcag	agges gagg c	800
gggctgcagg	cggcatccta	csect.gqagc	tgetggtggc	cgtgggcccc	gatgtottcc	360
aggétcacca	gg.sggacsca	gagegetatg	tgctoaccaa	ceteascatc	ggqqcsqaac	420
tgcttcggga	cecgtccctg	ggggctcsgt	t tcgggt.gcs	cctggfcgaag	atsgtcattc	48 0
tgacagagco	tg.agggt.gct	ccaaatatca	cagccsacct	eacctogtec	ctgctgagcg	54 0
tctgtgggtg	gagccagacc	ateaaocctg	aggacgacac	sgatcctggo	es t get gat:c	00 c
·: ggtectcta	tatcactágg	tttgacetgg	agttgectqa	tggtsaccgg	caggtgcggg	6 6 0
qcg t oa cc ca	gctgggcggt	gcctgotccc	η Cs'GeiC·	ofcgcctoatt	socgsggsea	720
ctggcttcga	cetgggagte	sooattgocc	stgagsttgg	goacagcfctc	ggccfcggase	780
acgacggcgc	gcccggcage	ggctgeggee	c cagcg g a c a	cgtgatgget	teggaeggeg	040
eogcgccecg	cgccggcctc	•te Ct0 .·: ·- CCC	cccgcagoog	ccggcagctg	etgagcotgc	900
tcagcgcagg	segggegege	tgcgtgtgcg	acccgeegcg	gcctesaccc	egetecsete	960
gg c a e. e cg c c	ggatgcgcag	cetggeot.ct	sotaesgege	caacgageag	tgccgcctgg	j.020
ccttcggccc	csaggctgtc	gcefcgcacct	tcqcceggga	goacctggat	stgt;gc>::agg	:;080
ecetctcctg	ccacacagac	ccgetggsoe	a a S: g cíi g e. t g	eagecgceto	etegtteste	1140
ecet ggs : gg	gaesqaatgt	ggcgtggaga	agtggtgcte	caagggtcgo	tgocgetocc	•200
tggtggagoc	gaccc ccat a	gcagcsgtgc	atgggccctg	gt ctagetgg	g g t occcgaa	260
gtccttgcrc	cegetcetgc	ggaggaggte	tggtcaecag	gaggcggcag	üjC·:: <3. ·’O C	1320
ccagacctge	ettfcgggggg	egtgcatgtg	ttggtgctga	cetccaggec	gagatgtcca	1380
acactcaggc	etqcgagsag	.acccagctgg	sgt tcatgte	<jC33CS.^t CjC	qccaggaccg	1940
scggccagce	get geget-cc	tcccotggcg	gcgoctcett	c í:a ecset gc	ggtgctgctq	1500
tsecacscag	cca.agggg.at	gctet.gtgea	g se a.ea tg; t g:	cegggccs t t	ggogsgagct	1560
tcatcatga-a	gegtggagsc	agcttectcg	atgggacceg	gtgtstgcca	sgt ggcccec	•620
gggaggaegg	gscectgagc	cfcgtgtgtgt	cgggeagetg	oaggaeattt	ggetgtgstg	isw
gtaggatggs	ctcccag-cag	gtat gggaoa	sgtgceaget	gtgtsstggg	gaeaacagca	17 40
cqt gca g ccc	acgqaaggqc	tctttoacag	ctqgcsgagc	gagagaatat	g t c;a cet ttc	1 SCO
t.qscagttac	ccccaacetg	accagtgtct	acattgccaa	cos oaggco t	1, u 11 o 0 S e	1060
aett-ggegg t.	gagg ategg a	gggcgctatg	tcstggctgg	gaasatgsge	at; ex cccc t a	1920
aeaccsccta	cccctccctc	ctggaqgatg	gtcgtgtcga	gtacagagtg	gccetcscog	1900
a-ggaeeggöt	gcccogcc ·: g	gaggagatce	gestetgggg	aceectccag	gaaga t get: g	20 4 0
ács t cos ggt.	ttacaggcgg	tatggogagg	astatggcaa	ectcscecgc	ccagscatca	2100
ccttcaccta	ct tccsgcct	aagccaogge	aggcetgggt	gtgggccgct	gtgcgtgggc	21 60
ectgcteggt	gagetgtggg	goagggctgc	getqqgtsss	ctácsgetgo	etggaecsgg	2220
ccaggasgga	gttggtggag	aetgtccsgt	gceaagg g cig	oeagcsgccs	ecsgegtgge	2280
cagsggcetg	cgtgctegaa	ecctgceetc	cctsctgggc	ggtggga.gac	t ocgqcocát	2340
gcagegcctc.	ctgtgggggt	ggcctsegge	ageggecsgt:	gegetgcgtg	gsggcccagg	2400
gcagcctcet	gaa ga ca t tg	cccccagcec	ggt ecsetet	aggggcocag	oag ocagetg	24 60
tggcgctggs	sacetgosec	eeccagccct	gcectgeoag	gtgggaggtg	t cagagceoa	2020

gctcafc gcac	at estje fc.qgt	ggageaggoe.	t.ggeet t qgs	•gaaegagacc	tgtqtgecag	25-80
g-ggcagafcgg	cctgeaggct.	ccagtgactg	aygqqectgg	ctccgtsgat	gagaagetge	2640
etgeecctga	geectgtgte	qgg sfc gt cafc	qtccfcecagy	etggggeeat	etggatgeea	2700
cctctgcagg	ggsgsaggct	ccctecccst	qggqcsgcat	cággacgggg	getcaagetg	27 fc 0
cacacgtgfcg	gacccctgc-g	gcagggtcgt	gctecgtctc	ctgegggega	ggtctgatgg	2828
agetgcgttt	eetqtgeatg	gactctgccc	t.csgggtgcc	fcgtccaggaa	gagctgtgfcg	2880
gcetggcaag	caagcct ggg	agc.cggc.ggg	aggtctgccs	ggcfcgtcccg	tgeeefcgete	294 0
ggtggcagta	•c.sagctggcg	gecfcgcagcg	tgagefcgtgg	cagaggggtc	gtgeggagga	3000
tcctgtattg	fcgeecgggee	catggggsqg	acgatggfcgs	ggagateetg	ttggacaccc	3060
agfcgccaggg	gcfcgectcgc	00- Ο Ci ct Ο· C Ό O	aggaggeet-g	csgcetggsg	ccctgcccac	3120
ctaggfc.-gga a	agtcatgtcc	ettggcecat	gttcgqccaq	ctgtggcctt	ggcaetgeta	3180
gacgcteggt	ggccfcgtgtg	j. e. t. .ί q a e c	aaggccagga	cgfc.ggaqqt g	gscgaggegg	32 4 0
ccfc gtgcggc	gcfc.gyfcgegc	c c.c g s g ge c a	gfcigtccccfc.g	tcfccattgcc	g a cfc gca cet	3300
accgctggca	tgfc fc. gg c -scc	tggatggagt	getetgttte	etgtggggat	ggea t ce age.	3360
gccggcgtga	cacctgcctc	gg accvvagg	cceaggegcc	tgtgccagct	gafcttefcgee	3420
aqoacttgcc	eaagcoggfcy	a-ct. gtgcgtg·	gct/gcfcgggc	tgggccctgfc	gt.ggg&cagc	34 80
gt.acgc.ccag	eΌ gg <- g ec. e	qa c ga a gaa g	cégetgetce	aggaeggace	aeagecaccc	3540
ctgetggtgc	cfcecc-: qexq	tggtcceagg	cccggggcct	getet fcct.ee	cc gg c fc e ec c	3600
-agcctcggcg	gctccfcgccc	g-ggcccca-gg	a&aaetcagt	geagtccagt	geetetggea	3660:
ggcagcacc-t	fc gagccaaea	ggaacaattg-	acat qegagg	eccagggeaq	gcagactgfcg	3720
cagtggccat	tgggcggccc	cteggggagg	tggtgaccet	cegegtcett	gsgagttete	3780
fc caací: ígc-atj	fc.qcqgqeqsc	atqfc t.gctgc	ttfcggggcog	gctcacctgg	a-ggaagatgt	3840
gcaggaa-gct	gttggacatg	aettteaget	ecaagaccaa	cacgctggtg	gtgaggcage	3900
gct-gcgggcg	q eea gga ggfc:	ggggtgcfcgc	fcgcgqfcatgg	gageeagcfcfc	gctcctgaaa	3960
ccttctacag	agaatgtgac	afcgeagetct	ttgggeectg	gggfc-gsaate	gtgageccct	4020
cg-etgagtcc.	acüeacccqt	asfcgcagggg	gcfcgccgget	etteattaat	gtggcfcccge	4080
acgcscggat	fcgccafcccat	gccetggcca	ccaacatggg	cgctgggacc	qagggagccs	4140
atgccagcta	eat.ct cgafc.c	eggyacaccc	aeagcfc.-fc.gag	yaccacagcg	ttccatggge	4 200
agcaggtgcfc	ctaetgqgay	tcagagagca	’í c c gge fc-·'--; c.	gatggagt tc	agcgagggcfc	42 60
t cctgaaggc.	c e -:j q ge c -ag c	e fcq e qqeq c.c	agtactggae	cetceaatcs	tcggfcaccgg	4320
agafcgcagga	eecfccagtec	tggaagggaa	aggaaggaac	ctgagggtca	fc t gaaeattt	4 3 Sí)
gttccgtgt ·::	fcggccag ccc	fcggsgggttg	aececfcggto	fcaaqtgcfc .tt	ccaattegaa	4440
cfcttttccaa	tct.fcsgqtat	etaetttags	gtetteteca	atgtccaaaa	ggctaggggg	4500
ttggaggfcgg	ggaetetyga	a aa geagccc	ccatttccte	ggg t accaat	aaataaaaea	4 560
fc gca gg ca a a	3 ötrí d <:5 <3 el :li i:í	aaaaa			4585

<210> 7 <211> 4284 <212> DNS <2Ι3> Homo sapiens » «

<220>

<221> CDS <222> (1 )..(4284) <400>7

a tej

cae

eag

egt

cae

CCC

egg

g ca:

aga

tge

cet

coe

et c

tgt

gtg

O ÍJ

4 8

Met ί

H 1 8

Gin

Arg

His S

Pro

Arg

Aia

.Arg

Cys 10

Pro

Pro

Len

Cys

Val 15

Aia

aga

ate

ett

gec

tgt

ggc

tfct

ctc

ct g

gge

tge

tgg

gga

eee

t c e

cat

96

Gly

5 le

Le a

Aia 20

Gys

Gly

Phe

Leu

Len 25

Gly

Cys

Trp

Gly

Pro 30

Ser

lila

tt c

caq

eag

agt

tgt

::1.1:

eag

get

1tg

g a e

cca

eag

gce

gtg

tét

tet

144

Pne

Gin

Glu 35

Se r

Cys

leu

Gin

Alá 50:

Len

Glu

Pro

Gin

Alá 45

val.

Ser

Ser

tac

ttg

age

cet.

ggt

get:

eee

tta

aaa

ggc

ege

c t

cet

t ca

e c t

gg-

192

Tyr

Lee 50

Ser

Pro

Gly

Alá

Pro 55

leu

Lys

Gly

Arg

Pro 60

Pro

Ser

Pro

Gly

eag

agg

eag

agg

eag

agg

eag

®gg

egg

get

cca

ggc

ggc

ate

cta

24 0

Phe 65

Gin

Arg

•Gin

Ar g

Gin. 70

Arg

Gin

Arg

.Arg

Aia 7 5

Alá

Giy

Giy

lle

Leu. 80

esc

et g

«ag

ctg

ctg

gtg

gce

gtg

ggc

c cc

gat

gtc

ttc

eag

get

cac

288

His

Leu

Glu

Len

leu 85

Val

Alá

Tel

Gly

Pro 90:

Asp

Val

Phe

Gin

Aia 95

His

eag

ga g

gac

<5. Col

g®o

ege

tat:

gtg

ctc

acc

<3 ·Π O

c te

a a c

ate

ggg

goa

336

Gin

Gin

Asp

Thr 100

Glu

Arg

Tyr

Val

Le a 105

Thr

Asn

Leu

Asn

1 le no

Gly

A.l a

ga a

ctg

•cfct

CqCÍ

03 c

ccc

tec

ctg

ggg

get

eag

ttt

egg

gtg

i';:l O

ctg

38 5

Gin

Leu

leu 115

Arg

Asp

Pro

Ser

leu 120

s.Í.y

Alui

Gin

Phe

Arg 125

Val

His

Len

gtg

aag

atg

gt c

att

c :

a ca

gag

cet

gag

ggt

get:

cca

aat

ate

aca

4 32

Val

lys ISO

Két

Val

Lle

Len

Thr 135

Glu

Pro

Gin

Gl y

Aia liö

Pro

Asn

ile

Tru:

gce

aac:

ctc

ace

teg

tce

ctg

e 1 g

ag c

gtc

tgt

ggg

tgg

age

e.ag

ciCC

4 80

Alá 14 5

Asn.

Leu

Thr

Ser

Ser 150

Leu

Leu

Ser

Val

Cys 155

G ly

Trp

Se r

Gin

Thr: 1 e.o

a. te

a ac

cet

gag

gac

gac

a cg

gat

cet

gg c

cat

get

g a e:

ctg

gtc

ct

528

ele

Asn

Pro

G1 u

Asp 16.5

Asp

Thr

Asp

Pro

Gly 170

8 is

A. la

Asp

Len

Val 175

Leu

tat

a te

get

agg

itt

gac

ctg

g*g

ttc

cet

gat

ggt.

a a c

ogg eag

gtg

576

Tyr

ele

Thr

Arg 180:

Phe:

Asp

Leu

Giu

Leu 185

Pro

Asp

Gly

Asn Arg Gin 130

Val

cgg

gg-

gte

acc

oag

ctg

ggc

ggi

gcc

tge

tcc

CCct

acc

tgg agc

tge

624

A.rg

Gly

val 195

Thr

Glu

Leu

Giy

Gi y 200

Alá

Lys

Ser

Pro

Thr ?05

Trp Ser

Cys

ctc

att

acc

gag

gac

C Ct

ggG

ttc

gac

ctg

gga

yfcc

acc

att. geo

cárt:

67 2

Leu

Tio 210

Thr

Glu

Asp

Thr

Giy 235

Phe

Asp

Leu

Gly

Val 220

Thi-

Hs Aia

hús

gag

att

ggg

cac

agc

ttc

ggc

ctg

gag

cac

gac

ggc

gcg

ccc gcc

dCC

720

Gin 225

lie

Gly

Hl s

Ser

Phe: 235

Giy

Len

Glu

Bis

Asp 235

Gly

Aia

Pro Giy Ser 240

u

tge

99«

CCC

agc

gga

ece

gtg

a tg

get

reg

gac

gg-

gcc gcg

tcc

768

Gly

Gye

Giy

Pro

Ser 245

Gly

Mis

Sál

Mefc

Aia 259

Ser

Asp

Gly

Aia: Aia 255

Pro·

cg·::·

gcc

TGG

c t c

gcc

r gg

tcc.

CCC

fcgc

i:i Q O

CC c

ege

cag

ctg ctg

.agc

616:

Arg

Aia

Giy

len 2 60

Ara

Trp

Ser

Pro

Cys 2 65

Ser

Arg

Arg

Gin

Leu Leu 27 0

Ser

ctg

ctc

agc

gca

gga

egg

gcg

ege

tge

gtg

tgg

gac

ccg

ccg egg

c c t

8 64

Leu

Le a

Ser 2 75

Aia

G1 y

Arg

Aia

Arg 23 0

Cys

Vali.

Trp

&sp

Pro 285

Pro Arg

Thr o

C:i«

CCC

agg

t. k-. L..

g cg

ggg

cee

ccg

ccg

gat:

gcg

cag

cet.

ggc ctc

tac

912

Gin

Pro 2 30

Gly

S e r

Aia

Gly

Bis 235

Pro

Pro-

Asp

Aia

Gin 309

Pro

Giy Leu

Tyr

tac

agc

gcc

aac

gag

cag

tge

ege

gtg

g cc

ttc

ggc

ccc

aag get

gte

960

Tyr 395

Ser

Aia

Asn

Gin

Gin 310

Cys

Arg:

Val

z-sle

Phe 315

Giy

Pro

Lys A.la Val 320

gcc

t g c

acc

fete

gcc

agg

gag

Ct 0

ctg

gat

a i: g

tge

cag

gcc ct-c

tcc

1008

Al 3

Cys

Thr

Phe

Aia 32:5

Arg

G1 u

Bis

Leu

Asp 330

Hét

Cys

Gin

Aia Leu 335

Ser

tge

cac

aca

gac

ccg

ctg

g.&e

C33

agc

agc

t gc

agc

ege

ere ctc

gt fc

1056

Cyc

.9 i 3

The-

Asp 34 9

Pro

Lou

Asp·

Gin

Ser 3 IS.

Ser

C ys

Se r

A.rg

Leu Leu 350:

Val

cet

c t c

ctg

gat

ggg

aca

gaa

t gt

ggc

gtg

gag

cac

tgg

fc gc tcc

;aaq

1104

Pro

Len

Leu 355

Asp

Giy

Thr

Giu

C ys 369

Gly

Val

Gin

Lys

Trp 365

Cys Ser

Lys

GC

ege

r ;.:

ege

fc ec

ctg

gtg

CCC

ctg

c cc

CGO

ata

gca

goa gog

ca't

1152

Giy

Arg 32 0

Cys

Arg

Ser

Leu

Val 375

Glu

Lee

Tar

Pro

He 385

Aia

Alá Vei

ill 3

ggg

ege

tgg

te::

agc

tgg

ggt

cec

cga

agt

cet

tgc

tcc

ege

tcc

tgc

1200

Gl y

Arg

Trp

Ser

Ser

Trp

Gly

Pro

Arg

Ser

Pro

Gye

Ser

Arg

Ser

Cys

385

590

395

403

gga

gga

ggt

gtg

g t: c

acc

-53 G

agg

egg

cag

tgc

aac

a a c

CC c

a ga

cet

124 8

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Thr

Arg

Arg

Arg

Gin

Cys

Asn

Asn

Pro

Arg

Pro

405

410

415

gcc

te t

ggg

GGG

cg t

gca

t g

gtt

ggt

get

ctc

ca g

gcc

gag

atg

1293

A1.S

Pho

Gly

Gly

Arg

Al a

Cys

Val

Gly

Alá

Asp

-Li e n

Gin

Alá

Glu

Got

425

425

430

tgc

aac

act

cag

g c c

tgc

g a g

Q

arc

cag

ctg

gag

t c

atg

t cg

caa

13 4 4

Cys

Asn

Thr

Gin

Ara

Cys

Gre

Lys

Thr

Gin

Lee

Gin

Phe

Get

Ser

Gin

•4 35

4 45

4 45

cag

tgc

gee

agg

acc

gac

ggc

cag

ecg

ctg

ege

t ee

r ee

cet

GGC

ggc

1392

Gin

Cys

A ·:;

Arg

Thr

Asp

Gly

Gin

Pro

Les

Arg

Ser

Se r

Pro

Gly

Gly

4 55

4 55

4 00

gcc

tcc

ttc

t. a c

cae

tgg

ggt

goi:

get

gta

CCö

cac

.&<<<:

ca a

GGG

gat:

44 5

Ma

Se i'

Phe

Tyr

illa

Trp

Gly

Alá

Alá

var

Pro

His

Sor

Gin

Gly

Asp

415

4 70

4 75

450

get

ctg

tgc

aga

CSC

atg

tgc

egg

gee

att

ggc

gag

age

ttc

ato

atg

435

A 1,3

Lee

Gye

Arg

His

Get

Cys

Arg

Alá

II a

Gly

Gin

Ser

Phe

ile

Get

4 55

4 95

495

tag

cg t

ggs

gac

a g ·::

1t‘ 0

C-t.C

gat

GGG

acc

egg

tgt

atg

cca

agt

ggc

153 6

Lys

Arg

Gr y

Asp

Ser

Phe

Lee

Asp

G1 y

Thr

Arg

Cys

Get

Pro

Sex:

Gly

5 GO

505

510'

ccc

egg

gag

gac

GGG

a e c

ctg

agc

ctg

tgt

gtg

teg

ggc

agc

tgc

agg

1584

Pro

Arg

G1 ti

Asp

Gly

Thr

Lee

Ser

Lee

Cys

Vei

Sár

Gly

Ser

Cys

Arg

515

520

525

CCS

ttt

ggc

tgt

gat

GG'5

agg

atg

gac

tcc

cag

cag

gta

tgg

gac

^GG

1332

Tót

Phe

Gly

C ys

Asp

Gly

Arg

G-?:t

Asp

Se r

Gin

Gin

Vall

Trp

Asp

.Arg

530

535

540

t gc

cag

gtg

tgt

GG Ι-

GGG

gac

oi >:S <?-

agc

acg

tgc

agc

cca

<:GG

aag

ggc

1685

Cys

Gin.

Va 1

Gye

ΟΙ y

Gly

Asp

Asn

Ser

Thr

Cys

Ser

Pro

Arg

Lys

G i. y

54 5

550

535

5 60

tel.

1;: ·:::

,3 ca

gc

ggc

a g a

ecg

aga

gaa

tat

gtc

acg

1tt

ctg

aca

gtt

17 25

Se r

Aho

Thr

Alá

G1. y

Arg

Alá

Arg

Gin

Tyr

Val

Thr

Phe

Lsn

Thr

Val

515

57 0

575

acc

CCC

aac

ctg

acc

agc

gtc

tac

ai: t

gee

aac

CSC

agg

cet

et e

ttc

17 7 6

Thr

P.r c

Asn

Lee

Thr

.Ser

Val

Tyr

He

Alá

Asn

His

Arg

Pre

L οι-

Phe.

530

5 SS

595

:i. v ói

cac

ttg

geg

15G

agg

S! C

gga

ggg

ege

tat

gt c.

gtg

get

ΤΟν

aag

1524

Thr

Kis

Lse

A.La

Val

A a ej

Ile

Gly

Gly

Arg

Tyr

Val

Val

Alá

Gly

:, ys

595

600

005

.. 64-

♦ »*K « * fe * ♦ fe

» fe # fe ♦ (tíx* *

< fe * * » fe * * ** „ . *· * Cv* **

arg

agc

a te

t ·.'·:?

cet;

aae

acc

acc tac

ccc

tcc

ct c

ctg

gag gat

ggt

1879

Me t

Ser

lle

Sár

Pro

Arra

Thr

Thr Tyr

Pro

Se χ·

Len

Len

Glu Asp

Gly

610

615

82 8

cg í:

gte

trK?

aga

gtg

geo

ctc acc

gag

gac

egg

ctg

ccc ege

ctg

1926

Arg

Val

GTn

Tyr

Arg

Val

Alá

Len Tar

Gin

Asp

Arg

Len

Pro Arg

Lati

625

630

635

610

gag

gag

ato

ege

3 tC

tgg

gga

ccc ctc

cég

gaa

gat

get

c o e sí i. e

cag

1968

Gáti

Glu

1 Le

Arg

1 ia

Trp

Gly

Pro Len

Gl n

Gl o

Asp

Alá

Asp lis

Gla

64 5

656

655

gtt

tac

agg

ccc

tat

gge

gag

gag t at

ccc

aac

ct c

acc

ege cca.

-gac

2016

Vai

Tyr

Arg

Arg

Tyr

Giy

Gin

Glu Tyr

c< 1 v

Asn

Leu

Thr

Arg Pro

Asp

660

665

67 0

atc

acc

ttc

acc

tac

ttc

cag

cet aag

CCC

egg

cag

geo

tgg gtg

tgg

2064

lle

Thr

Pha

Thr

Tyr

Phe

Sin

Pro Lys

Pro

Arg

Gin

Alá

Trp Val

Trp

675

680

625

gcc

get

gtg

cgt

ggg

c c. c

tge

teg gtg

sgc

rgt.

ggg

gca

ggg ctg

ege

2112

Als

Alá

Val

Arg

Gly

Pro

Cys

Ser Val

Ser

Cys

Gly

Alá

Gly Len

Arg'

690

695

700

tgg

gfca

C3C

tac

agc

tge

ct g

gac cag

góc

agg

aag

gag

ttg gtg

gag

21 60

Trp

Val

Asn

Tyr

Ser

Cys

Len

Asp Gin

Ara

Arg

Lys

Glu

Leu Val

Gin

705

7 18

715

12Q

aot

gtc

cag

t ge

caa

ggg

agc

cag cag

ccc

•cca

gcg

tgg

cca gag

gcc

2208

Thr

Val

Gin

Cys

Gin

Gly

Ser

Gin Sl.n

Pro

Pro

Alá

Trp

Pro Glu

A; a

7 c· f<

7 30

7 35

tgo

gtg

Ct c

ga 3

cet

tge:

cet

ccc tac

tgg

gcg

gtg

ggc

gac t.to

ggc

2256

Cys

Val

hsa

Gin

Pro

Cys

Pro

Pro Tyr

Trp

Alá

Val

Gly

Asp Phe

Gly

748

7 45

75Q:

cca

tge

agc

gcc

t cc

t g t

ggg

ggt ggc

ctg

<116

gag

ogg

CC<Í: O: <- Cj

ege

2 384

Pro

Cys

Ser

Alá

Ser

Cys

Gly

Gly Gly

Leu

Arg

Glu

Arg

Pro Val

Arg

7 55

7 66

7 65

tge

g t g

gag

gcc

cag

ggc

agc

ctc ctg

aag

aca

11 g

CCC

cea gcc

cg g

2 352

Cys

Val

Gin

Alá

Gin

Gly

Sor

Leu Leu

Lys

Thr

Len

Pro

Pro Ara

Arg

770

1ΊΑ

78 ö

tgo

aga

gca

ggg

gcc

cag

cag

??? get

Ctg

Gcg

c tg

C.33

acc tge

aac

2406

Cys

Arg

Aj. a

Gly

A la

Gin

Gl n

Pro Alá

Va.i

Alá

Leu

Glu

Thr cys

A.s n

785

790

795

800

ccc

cag

CCC

tg o

cet:

cce

agg

tgg gag

gtg

tea

gag

ccc

agc tea

ccc

2448

Pro

Gin

Pro-

C ys

Pro

Als

Arg

T rp Gl ü

Val

Ser

Glu

Pro

Ser Ser

Cys

SOS

810

615

aca

tea

get

ggt

gga

gca

ggc

ctg geo

tt g

gag

<3. C

gag

acc tgt

gtg

2496

Thr

Ser

Al a

C:> j. y

Gly

Alá

Gly

Leu Ais

Len

Glu

Asn

Gin

Thr Gyr;

Val.

62 0

825

636

COS

egg

get

gat

\f-gc

ctg

gag

get

cca

gtg

aot

gag

999

cet

ege

tce

2544

Pro

Giy

Aéa ö 35

Asp

GoL y

Len

Glu

.61 a 640

Pro

Vai

Thr

Glu

Giy 045

Pro

n.-éy

Ser-

C t3

gat

gag

aag

óig

cet

íjü.c

cet

eag:

cce

tgt

gte

999

atg

t ea

ig;:

2592

Vai

Aa p 850

Glu

Lys

Le. a

Pro

Als. 0 55

Pre

Glu

Pre

Cys

Vai Ötéi

G.ly

Mel

Sor-

Gye

cet

C-G&

ggc

tg«

gg o

est

ci g

get

gcc

acc

te·.

gea

«99

9««

ság

get

2640

Pre 8 65

Pro

G r y

Trp

Giy

his 670

Leu

Asp

Aéa

Thr

Ser 675

Aia

Gly

G2.U

Lys Alá 860

CCC

t:

cca

m«

g g «

ago

at o

agg

aeg

990

get

caa

g c t

gea

oac

gtg

2688

Pro

Ser

Pro

Trp

Gly 66 5

Ser

lle

Arg

Thr

Gly 890:

Al. a

Gin

Ara

Alá

His 995;

Vai

teg

acc

cet

gcq

goa

ggg

t cg

tgo

tcc

C<i c

t c c

ige

«99

ega

ggt

ctg

2736

Trp

Thr

.Pro

Aéa 060

Alá

Gly

Ser

Cys

Se r 905

Vai

Ser

Cys

Gly

Arg 91.0

Gly

Lee

atg

gae

ctg

ogt

fc te

ctg

tgc

atg

gac

tét

geo

ete

agg

gtg

cet:

g t c

2764

Mát:

GI a

Inra 915

Arg

Phs

Les.

Cys

Met 920

Asp

Ser

A is

Leu

Arg 925

Val

Pre

Vsi

es g

gaa

gag

o t g

tgt

ggc

ctg

goa

aag

oot

«gg

«99

egg

gag

2832

Gin

Géu 930

Glu

Leu

Cys

Gly

Lee 935

Aia

Ser

Lys

Pro

Gly 940

Ser

Arg

Arg

c é u

g t c

tgc

oag

g ot

gte

ocg

ige

oot

got

«97

tgg

cag

tac

aag

ctg

geg

2880

Vei

Gye

Gén

Aia

Val

Pre 650

Cys

Pro

Aia

Arg

Trp 955

Gih

Tyr

Lys

Leu

Alá 900

.get:

tgc

gi«

sgc

tgt

««o

::l Cj 3.

99«

gte

g t y

egg

«99

ate

otg

t s t

2928

Ara

Cys

Per

Val

Ser 06 5

Cys

Gly

.Arg

G é y

Val 970

Vai

Arg

Arg

léi:

Leu 97 5

Tyr

tgt:

<3 CG

«gg

geo

oat

ggg

gag

geo

gat

gg fc

gag

gag

ate

ctg

11 g

gae

2976

Cys

Al a.

Arg

Aéa 060

Hl s

Gly

61.u

A.sp

Asp 905

Giy

Glu

Gin

1 le

Len 990

1:-:: U

Asp

acc

G::i <i

gc

os g

gg«

otg

cet

CiíC

ccg

ess

c co

cső

gag

geo

tgo

3024

Thr

Gin

Cys 905

Gin

Gly

Lee

Pro

Arg LOGO

Pro

Glu

Pr o

Gin

Glu 1005

Aia

Cys

Ser

ctg

gag

co: c

t go

öcs

oct

agg

agy

ssa

et 0

atg

toc

ctt.

ggc

CO3.

tgt

3072

Leu.

Gin Pro 1010

Cys

Pre

Pro

Arg 1015

Trp

Lys

Vai

Met

Ser 1020

Leu

Gly

Pre

Cys

teg

geo

agc

kgí

ege

ott

ggc

act

got

aga

ege

teg

gtg

geo

tgt

gtg

3120

Ser 1025

Aéa j

Sár-

Cys

Gé y

Leu 1030

Giy

Thr

Ara

Arg

Arg 1035

Ser

Vai

A la

Cya

Va 1 10 4ö

eag

ete

gáé

c.a a

ggc

oag

gac

gi g

gag

eta

gae

gae

geg

gcc

tgt

geg

31.66

erén

Len

Asp

Gin

Gl y G:l:h 1045

Asp

val

Glu

Vai 10 50

Asp

G1 a

ALs

Aia

Cys 1055

Aia

- 66 Φ X »

geg

ctg

gtg

egg

ccc

gag

gcc

agt gtc

ζ! C C

tgt

ct c

att

gcc

gac

tgc

3216

A. la

Lee

Val

Arg

Pro

G lu

Ale

Ser Vei

Pro

Cys

Leu

Ile

Ale

Asp

cys

1900

1065

10755

<:CC

tac

C. '.Z? G

t gg

ca t

gt t

ggc

art: tgg

a. tg

gag

tgc

rét

gtt

tcc

tgt

3264

Thr

Tyr

Arg

Trp

His

Val

Sly

Thr Trp

Met

Glu

Cys

Se r

Val.

Ser

Cys

1075

1ÖSO:

1085

999

gat

góc

a te

eag

ege

cgc;

cgt geo

acc

tgc

ctc

gga

ccc

cag

gcc

3312

Gly

Asp

Gly

Ile

Gin

Arc

Arg

Arg Asp

Thr

Cys

Lsa

Gly

Pro

Gin.

Alá

1G9-0

1-005

1100^

tag

gcg

cet

9Á9

CCS

get

Sőt

tfcc tgc

cag

cac

ttg

esc

aag

ecg

gt g

3360

Gin

Alá

Pro

Val

Pro

Ale

Asp

Phe Cys

Gla

His

Les

Pro

sys:

Pro

Val

l· 10 5

1110

1115

112 0

ser

3 tg

eot

ggc

tgc

tgg

get

ggg ccc

t.gt

919

gga

cag

ggt

acg

ccc

3408

Thr

Val

Arg

Gly

Cys

Trp

Alá

Gly Pro

Cys

Val

Gly

Gin

Gr y

Thr

Pro

1125

1130

1135

sge

ctg

gtg

ccc

cac

gaa

gaa

gcc get

gc t

cca

gga

egg

•acc

aca

gcc

3456

Ser

Leu

Var

P re

His

Glu

Glu

Alá Alá

Alá

Pro

Gly

Arg

Thr

Thr

Ara

1140

1145

1150

sec

cet

got

ggt

gcc

tcc

ctg

gag tgg

cég

gcc

egg

ggc

e t g

et e

3504

TOr-

Pro

Alá

Gly

Alá

Ser

Leu

Glu Trp:

Se r

Gin

Alá

Arg

Gly

Leu

Leu

1135

1160:

1165

tte

ÍCC

cég

get

ccc

cag

cet

egg

ctc

et g

ccc

999

coc

cag

gaa

3552

Phe

Ser

Pro

Alá

Pro

Gin

Pro

Arg Arg

Leu

Leu

Pro

Gly

Pro

Sin

Gla

ll?0

1175

1180

clciC

tea

gtg

eag

tcc

agt

gcc

tgt ggc

agg

cag

CSC

ott

9--=9

cca

aca

3 60 0

A.sn

Ser

val

Gla

Ser

Ser

Ale

Cys Gly

Arg

Oil.a

Mis

Leu

Glu.

Pro

Thr

nos

1130

1195

L 200

gga

ace

att

gac

a tg

c.ga

99 --·

cca ggg

ca g

gea

gac

tgt

gca

gtg

ú; (?· í J

364 8

Gly

Thr

Ile

Asp-

M=e t

Arg

Gly

Pro Gly

Gla

Ale

Asp

Gy s

Al a

Val

Alá

1205

1210

12IS

Sít

999

<-99

ccc

ctc

999

gag

gtg gtg

acc

ere

ege

gtc

ett

9=--9

agt:

30 9 6

I le

Gly

Arg

Pro

Leu

Gly

Gl n

Vei Val

Th r

Lee

Arg

Val

Leu

G r u

Ser

χ a. χ· C

i

1225

1230

tet

ct o

aac

tgc

agt

gcg

999

gac atg

ttg

ctg

ett

tgg

ggc

egg:

ctc

37 4 4

Ser

Leu

A.sn

Cys

Ser

Ale

Gly

Asp Met

Lea

Leu

Lsu

Trp

Gly

Arg

Leu

12 35

124 0

1245

ace

tgc

agg

G.ag

atg

tgc

agg

aag ctg:

ttg

gac

atg

act

t te

agc

tcc

37 92

Ter-

Trp

Arg

Lys

Met

Cys

Arg

Lys Lőj

Leu

Asp

Met

Thr

Phe

5 e r

Ser

1255

I

12 55

1260

esig

<! CC

aac

acg

ctg

gtg

gtg

agg eag

cgc

tgc

ggg

egg

cca

gga

ggt

334 9

Lys

Thr

Asu

Thr

Lee

Val.

Val.

Arg Gin

Arg

Cys

Gly

Arg

Pro

Oly

Gly

· 67

tf *+♦ * tf tf * » ♦

♦ * tf * * tf *.x*« *

99 ·* c>~·

ggg

gtg

ctg

ctg

egg

tat

ggg

agc

cag

ct t

get

cet

gaa

acc

11: e

tea

333 8

Gly

Val

Lau

Leu

Arc

Tyr

G1 y

Se r

Gin

Leu

íL a:

Pro

Gin

The

Pite

Tyr

1285

1230

12 95

aga

gaa

tgt

gac

atg

ca g

ctc

: tt

g«o

ccc

tgg

ggt

gaa

atc

gtg

agc

2038

Arg

Glu

Cys

Asp

M-efc

Gin

Leu

Phe

Gly

Pro

Trp

Gly

Gin

lle

val

Ser

1300·

1305

1310

CCC

heg

ctg

agt

CCS;

gcc

acg

agt

aat

222

ggt

tgc

tgg

ctc

ttc

3034

Ser

Leu

Ser

Pro

Ara

Thr

Ser

Aon

Alá

Gly

Gly

Cys

Arg

Leu

Phe

1315

1320

1325

t:

aat

gt g

gel

ccq

cac

gca

ege

at: t

gce

atc

cat

geo

ctg

gcc

acc

4032

3 3. C'

Asn

Val

Alá

Pro

His

Ara

.Arc

lle

Alá

He

His

Ara

Len

A la

Thr

1330

1335

1310

6 C. C

atg

ggc

get

ggg

acc

gag

gga

gcc

aat

gcc

agc

t a c

atc

ttg

a t

4080

Asn

Met

Gly

A1 a

Gly

Thr

G1 u

Gly

AT a

Aar

A La

Ser

Tyr

1 le

Len

lle

1345

1350

1355

1300

tgg

gac

a c c

cac

agc

ttg

agg

sec

aca

qcg

tt c

cat

022

ca g

cag

gtg

4128

Arg

Asp

Thr

His

Ser

Leu

Arc

Thr

Thr

Alá

Phe

Sic

t::.:.y

Gin

Gin

Val

1365

1370

1375

ctc

tac

tgg

gag

tea

gag

agc

agc

cag

get

gag

atg

gtg

ttc

a gc

2 ·3 g

4176

Len

Tyr

Trp

Glu

Ssr

Glu

Ser

Ser

Gin

Ara

Glu

Met

Glu

Phe

Ser

G.lu

1 300

1385

1390

ggc

ttc

ctg

aac

get

cag

gcc

.agc

ctg

egg

ggc

cag

tac

tgg

acc

ctc

4224

Gly

Phe

Leu

Lys

A.i.a

Gin

Alá

Ser

Len

Arg

Gl y

Grn

Tyr

Trp

Thr

Leu

1395

14 00

14 85

CSí&

tea

tgg

gta

ccg

gag

a tg

tag

gac

cet

cag

A. C C

tgc

aag

gga

a a g

4 2 72

Gin

Trp

Val.

Pro

G1 n

Met

Gin

Asp

Pro

Glu

Ser

Ttc

Lys

Gly

Lys

1410

lile

1420

gaa

gga

3íX

tqa

4 2:34

Gin Gly Thr 1425 <2Γ0> 8 <211> 1427 <212> Fehérje <213> Homo sapiens „í <400>8

Met 1

His

Gin

Arg

His 3

Pro

Arg

Ara

Arg

Cys 10:

Pro

Pro

Len

cys

Val 15

Alá

Gly

Hs

Len

XI a ί ι-,

Cys

Gly

Phe

Leu

toi '*> ÍC

Gly

Cys

Trp

Gly

Pro '<··;

Ser

Hl s

Phe

Gin

Gin 35

b Ser

Cys

Len

Gin

Alá 4:0

íL J Len

Glu

Pro

G.ln

Alá 45

Gál

Ser

Ser

Tyr

Les 50

Ser

Pro

Gly

Alá

Pro 55

Len

Lys

ei y

.Arg

Pro 6Q:

Pro

Ser

Pro

Gly

Phe 65

G a. n

Arg

Gin

Arg

Gin 7 0

Arg

Gin

Arg

Arg

AI a 2 5

Alá

Gl y

Gly

He

Len 8 0

6 is

Lee

Gin

Len

Leu 85

Val

XI a

Val

Gly

Pro 90

Asp

Va ·

Phe

Gin

A La 95

H; s

Sin

Gin

.Asp

Thr 106

Gin

Arg

Tyr

Val

Len 105

Thr

Asn

Lei.i

Asn

lle no

Gly

Alá

Gl u

Len

Len H5

Ar g

Asp

Pro

Ser'

Len 120

Gly

Alá

Gin

Phe

Arg 125

Val

His

Len

Val

Ly® 130

Met

Val

He

Len

Thr 135

Gl u

Pro

Gin

Gly

Alá 140

Pro

Asn

He

Thr

Alá 1-3 5

Asn

Len

Thr

Ser

Ser 150·

Len

neu

Ser

Val

Cys 155

Gly

Trp

Se r

Gin

Thr ISO

1le

Asn

Pro

51: n

Asp 165

Asp

Thr

Asp

P;: o

G.1 y 170:

His

Alá

Asp

Len

Val 17 5

Len

Tyr

I le

Thr

Arg 18 0

Phe

Asp

Len

Glu

Len 185

Pro

Asp

Gr y

Aen

Arg 190

Gin

Val

Arg

Gly

Vei 195

Thr

Gin

Len

Gly

Gly 200·

Ar u

cys

Ser

Pro

Thr 205

Trp

Ser

Cys

Lee

He 210:

Thr

Gin

Asp

Thr

Gly 215

Phe

Asp

Len

Gly

Val 226

Thr

He

Al a

Hl s

Glu 225

lle

Gly

His

Ser

Píré 2 311

Gly

Len

Gr a

His

Asp 235

Gly

.Alá

Pro

G .3. y

Ser 240

Sty

Cys;

Oly

Pro

Se r 245

Gly

L'ia

Val

Mei:

Alá 250

Ser

Asp

Gly

Alá

Alá 2 5 5

P ro

Arg

Ál 3

Gly

Len 260

Alá

Lep

Ser

Pro:

Cy:; 205

Ser

Arg

Arg

Gin

Len 276

Len

Ser

Len

Len

Ser 27 5

A. la

Gly

Arg

Alá

Arg 280

Cys;

Val

Trp

Asp

Pro 285

Pro

Arg

Pro

sin

Pro 2 90

Gly

Se r

Ai 3

Gly

ILLs 295

Pro

Pro

Asp

Alá

Gin 300

Pro

Gly

Lee

Tyr

Tyr 305

Ser

Alá

asn

Gl'j

Cin 310

Cys

Arg

Val

Ara

Phe 315

Gly

Pro

Lys

A la

Va 1 32Θ

Al a

Gys

Thr

Phe

.1. i:i

.Arg

GI a

His

Leu

Asp

Met

cys

Gin

Aia

Leu

Ser

325

330

335

Cys

His

Thr

Asp

Pro

1,GU

Aup

Glu

Sitt

Ser

Cys

Ser

Arg

Leu

LSU

Vei

34 0

345

350

Pro

Leu

Leu

Asp

Gly

Tar

Gin

Cys

Gly

Vai

Glu

Lys

Trp

G y s

Ser

Lys:

355

3 60

365

Giy

.Arg

Cys

Arg

Ser

Lsu

Vei

Glu

Lett

Thr

Pro

He

Aia

Alá

Vai

His

376

37 5

330

Gly

Arg

Trp

Ser

Ser

Tép

Giy

Pro

Arg

Ser

Pro

cys

Ser

Arg;

Ser

Cys

385

390

395

J05

Giy

Gly

Gly

Vei

Va 1

Thr

Arg

A. tg

Arg

Gin

Cys

Asn

Asn

Pro

Arg

Pro

455

410

415

Aia

Phe

G.i.y

Gr y

Ars;

A1 a

Cys

Val

Gly

A. La.

Asp

Le a

Gin

Alá

Glu

Mer.

420

425

430

Gy s

Asn

Tar

Gla

Aia

Cys

G1 tt

Lys

Thr

Gin

Leu

Glu

Pne

Met

Ser

G-1 n

4 35

4 1 6

445

GI n

Cys

Aia

Arg

Thr

Asp

Gly

Gm

Pro

Leu

Arg

Ser

Ser

Pro

G.l y

Ή y

455

4 55

4 60

AJ. a

Ser

Phe

Tyr

His

Trp

Gly

Alá

Aia

Vai

Pro

His

Ser

Gin

t:t L y

Aap

4 65

4 75

47 5

480

Alá

Leu

Cys

Arg

His

Met

cys

Arg

Alá

He

Giy

Glu

Ser

Phe

He

Met

435

4 30

495

Lys

Arg

Giy

Asp

Ser

Phe

Lett

Asp

Giy

Thr

Arg

Cys

Met-

Pro

Ser

Gi y

55 5

505

515

P re

Arg

Gru

Asn

Giy

Thr

Leu

Ser

Lett

Cyí>

Vai

Ser

Gly

Ser

G ys

Arg

515

:H5

525

Thr

Phe

Gly

Cys

Asp

Giy

Arg

Met

Asp

$·;:·!?

Gin

Gin

VaJ.

Ttp

Asp

Arg

530

535

54 0

Cya

Gin

Val

Cys

Giy

Giy

Asp

Asn

Ser

Thr:

Cys

Ser

Pro

Art!

Lys

Gly

515

550

55 5

5 60

Ser

Phe

Tar

Alá

Giy

Arg

Al a

Arg

Glu

Tyr

Val

Thr

Phe

Leu

H:;t

VaJ.

565

575

575

Thr

Pro

.Asn

'Lee

Thr

Ser

Vai

Tyr

He

Aia

Asn

His

A. tg

Pro

Len

Phe

530

585

590

T fe r

His

Larí

Alá

Val

Arg

He

Giy

Giy

Arc

Tyr

Vai

vai

Alá

C.iy

Lys

535

605

655

Met

S e r

ile

Se r

Pro

Asn

Thr

Thr

Tyr

Pro

Ser

Lett

Leu.

G Le

Asr

e i y

615

61 5

620

Arg

Vai

G r u

Tyr

Arg

Val

Alit

Leu

Thr

Glu

Asp

Arg

Le u

Pro

Arg

Leit

62 5

635

6 3 5

640

G τ u

GI u

He

Arg

He

Trp

Giy

Pro

Leu.

Gin

G1 tt

.Asp

Aia

At$p

He

Gl.n

645

650

655

Va L

Tyr

Arg

Arc; 660

Tyr

Giy

Guu

Glu

Tyr 665

Giy

Asn

Leu

Thr

Arg ‘67 0

Pro

Asp

I 1 a

Thr

Phe 67 5

Thr

Tyr

Phe

Gin

Pro 580

Lys

Pro

Arg

Gin

Aia 685

Trp

Vai

Trp

Alá

Alá 690

Vei

Arg

el y

Pro

Cys 695

Sár

Vai

Ser

Cys

G i y 7 00

Ai.a

Giy

I.:eu

Arg

Trp 7 65

Val

Asn

Tyr

Ser

Cys 710

Len

Asp

Glu

As a

Arg 715

Lys

Glu

Leu

Val

Glu 7 20

Thr

Val

Gin

Cys

G i n 725

Giy

Sere

Gi n

G i n

Pro 7 30

P r o

Aia

Trp

Pro

G1 a 785

Alá

Cys

Vai

Leu

Giu 740

Pro

C y s

Pro

Pro

Tyr 74 5

Trp

Aia

Vai

Giy

Asp '750

Phe

Giy

Pro

Cys

Ser 7 55

Aia

Ser

Cys

Giy

Giy 760

oly

Leu

Arg

Glu

Arg 7 65

Pro

Vai

Arg

Cys

Val 77 0

Glu

Aia

Cin

Giy

Ser 775

Len

Leu

Lys

Thr

Lep 780

Pro

Pro

Aia

Arg

Cys '7 85

Arg

Alá

Giy

Ai.a

Gin 790

Gi n

Pro

Ai.a

Vai

Ai.a 7 95

Len

Giu

Thr

Cys

Asn 800

Pro

0 i n

Pro

C ys

Pro 805

Ai.a

Arg

Trp

Gi u

Vai 810

Ser

Glu

Pro

Ser

Se r 815

Cys

Thr

Ser

Alá

Giy 820:

Giy

Aia

Giy

Leu

Ai.a 825

Len

Giu

Asn

Giu

Thr 830

Cys

Val.

Pro

Giy

Aia 635

Asp

Giy

Leu

Gi u

Aia 840

Pro

Vai.

Thr

Glu

ciy 845

Pro

ciy

Se r

Val

Asp 850

Glu

Lys

Leu

Pro

Aia 855

Pro

Giu

Pr; o

Cys

Vai 665

Giy

Keh

Ser

Cys

Pro 8 65

Pro

Giy

Trp

or y

Kis 870

Leu

As ρ

Aia

Thr

Ser 873

Aia

ciy

Giu·

Lys

Aia 860

Pro

Ser

Pro

Trp

Ge y 885

Ser

lie

Áru

Thr

Ge y 890

Aia

Gi n

Ai.a

Ai a

His 6 95

Vai

Trp

Th r

Pro

Aia 90 0

Aia

Giy

Ser

G ys

Se r 965

Val

Ser

Cys

ciy

Áru 916

Ciy

Leu

Met

Glu

Leu Sió

Arg

Phe

Len

Cys

Met: 920

Asp

Ser

Aia

Leu

Arg 925

Vai

Pro

Vai

Gin

Gin 930

GI u

Les

Gys

Giy

Len 935

A1 a

Ser

ny s

Pro

Giy 940

Ser

Áru

Arg

Giu

Val 34 5

Cys

Gin

Aia

Vai

Pro. 950

Cys

Pro

Aia

Arg

Trp 955

Giu

Tyr

Lys

Len

Ai.a 9 6 0

A is

Cys

Ser

Vai

Ser 963

Cys

Giy

Arg

Giy

Vai 970

Vai

Arg

Arg

li.e

Leu 97 5

Tyr

Cys

Alá

Arg

Ai.a 980

Pia

Giy

C in

Asp

Asp 96 5

Giy

Gin

GLu

I Le

Leu 990

Leu

Asp

« «κ ♦ *

Thr

Gin

Cyi> 995

Gin

Gly

Leu

Pro

Arg 1000

Pro

Glu

Pro

Gin

Gih 10:05

Ale

Cys

Ser

Leu

Glu

Pr o

Gys

Pro

Pro

A rg

Trp

Lys

Var

Met

Ser

Leu

G1 y

Pro

Gys

1010

1015

1028

Sex-

Alá

Se r

Gys

Gly

Lee

Gly

The?

Ara.

Ars

Arg

Ser

Val

A1 a

Cvs

Val

1025

1030

1035

1040

Gin

Leu

Asp

Gin

Gly

Gin

Asn

Val

Glu

Vei

Asp

Glu

Alá

Alá

Cys

A1 a

104

ÍG k.‘

10 5 ö

1055

Als

Leu

Val

Arg

Pro

Glu

Alá

Sex'

v a 1

Pr·:..

Cys

Len

He

Alá

Asp

Cys

1060

1065

1070

Tor

Tyr

Arg

Trp

his

Val

e r y

Thr

Trp

Mer

Glu

Cys

Ser

Val

Ser

Cys

1 07 5

1080

1085

Gly

Asp

He

Gin

Arg

Arg

Arg

Asp

Thr

Cys

Leu

Gly

Pro

Gin

.Al a

1030

1035

1100

Gin

Ara

Pro

Val

Pro

Aha

Asp

Phe

Gys

G.rn

8i s

Leu

Pro

Lys

Pro

Val

ii ere

HÍG

1115

112:0

Thr

Val

Ar g

Gly

Cys

Trp

Al a

Gly

Pro

Gys

Var

Gi y

Gin

Gi y

Thr

Pro

112

5

1130

1135

Ser

Len

Val

Pxr?

Hxs

Glu

Gin

Alá

Ale

Ara

Pro

Gly

Arg

Thr

Thx?

Alá

1140:

1145

115 0

Thr

Pr o

Al a.

Gly

Ale

Sex'

Leu

Gin

Trp

Ser

Gin

Alá

Arg

oly

Leu

Leu

HS5

HOG

1165

Phe

Sex?

Pro

Alá

P r o

Gin

Pro

Arg

Arg

Leu

Len

Pro

G1 y

Pro

Gin

Gin

1170

1175

1180

Asn

Ser

Vei

Gin

Ser

Ser

Alá

Gys

Gi y

Arg

Gin

'His

Leu

Glu

Pro

Thr

1185

1190

1135

1200

Gly

Thr

He

Asp

Met

Arg

Gly

Pro

Gly

Gin

Alá

Asp

C y s

Alá

Val

Alá

1205

1218:

1215

He

Gly

Arg

Pro

Len

Gly

Glu

Vei

val

Thr

Len

Arg

Vei

Leu

Glu

Ser

12 2 G

•

122 5

1230

Ser

Le»

Asn

Cys

Ser

Alá

Gly

Asp

Me t

Len

Len

Leó

Txgo

Gr y

Arg

Leu

1255

12411

12 4 5

Thr

Trp

Arg

Lys

Met

Cys

Arg

Lys

hsa

Leu

Asp

Met

Thr

Phe

Ser

Ser

1250

1255

12 60

Lys.

Thx-

Asn

Thx·

Leu

Vei

Val

Arg

Gin

Arg

C ys

Gly

A:rg

Pr o

Gly

Gly

Π 65

1270

127 5

1280

Gly

Val

Leu

Leu

Arg

Tyx-

Gly

Ser

Gin

Leu

Als

Pro

G1 u

Thx?

Phe·

Tyr

125 5

12 00

12 95

Arg

Glu

Gys

Asp

Met

Gin

•..erű

Phe

Gly

Pro

Trp

Gly

Gin

He

Va 1

5··'::Γ

1550

1305

1310

Pro

5 er

Tea

Ser-

Pro

Ale

Thr

Ser

Áru;

A la

Gly

Gly

Cys

Arg

Len

Phe

Dl 5

1 320'

1325

«<**

».ί-

ülő Asn. Val 1310

Ala

Pro

His;

A1 a 1335

Arg

I le

Ala

He

has 1340

Al a

Len

A13

Thr

Asn Mer Gly

Ala

G1 y

Thr

Glu

Gly

A.r a

Asn

Ala

Ser

Tyr

He

Len

Ile

1345

1353

1355

1350

Arg Asp Thr

His

Sor

Ina;

Arg

Thr

Thr

Al s

Phe

His

Guy

Gin

Glu;

Va 1

1365

1330

137 5

Len Tyr Trp

Glu

Ser

Glu

Ser

Ser

Gin

Ala

Glu

he;:

Gin

P.ne

Ser

Glu

138G

1385

13 90

Gly Phe Len

Lys

Ala

Glo

Ala

Sár

Leu

Arg

Gly

Gin

Tyr

Trp

Thr

Len

1395

14 öö

1405

Gin Ser Trp

Va 1

Pro

Gin

Hét:

Gin

Asp

Pro

Gin

Ser

Trp

Lys

Gly

Lys;

1410 1415 1520

Glu Gly Thr 1425 <210>9 <211> 45 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221> primer kötés <222> (1),.(45} <400>9 cfctgcagg-cg yueruutacu cctggagctg oLggtgynng tggyc <211> 20 <2!2> DNS <213> Mesterséges szekvencia.

<220>

<221> primer kötés * « <222> (1) .. (20) <400> 10 <210> 11 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <<Η a&tggtgact ecc^ggtcaö <210> 12 <211> 20 <212:

<220>

<2 21 >

(1) . - (20)

400> 12

SS Ct <210> 13 <21.1> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221 > primer kötés <222> (1) . . (20) <400> 13 gagcaa.attc ctgtactcac <210> 14 <211> 22 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia.

<22 i> primer kötés <400> 14

Cc^CCSCQ'CC-t. S l CO'SCQf CC: SC <21ö> 15 <211>21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia.

<220>

<221> primer kötés « * * *

<210> 16 <211 > 30 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221> primer kötés <222> (Iri . (30) <400 16 cgggctgcag gcgugatcet acacutggag <210> 17 <211> 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <221> primer kötés <222> (1) .. (21) <400> 17 »* 9

-76 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221> primer kötés <222> 0)..(20) <400> 18 tggaggtcag caccaacaca <210> 19 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <221> primer kötés <222:

<400> 19 q ag tqt g a ·: q g í. a a a ·'. g <210> 20 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221 > primer kötés *««« <4v gége <210 21 <211> 21 <212> DNS <220>

<221 > primer kötés <222> (1) . . (21) cgctcectgg tgsagctgac e <210 22 <212:

,3>

iges S2 <220>

<221> primer kot <222> Π.Ι. . se.

2C

» « * * • *

Λ Λ «* <21!>21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221> primer kötés

l.cid: gduige gtggsgae <2K)> 24 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <221 > primer kötés <222> (1) .. (20) <400> 24 cct g q a ggg g t qcccag a tg <210> 25 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <221 > primer kötés <222> (1 )..(20) <400> 25 tg-cagcccac ggaagggctc ·210> 26 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221> primer kötés <222> (1)..(20) <400> 26 caggget c ca ggetgeaggc <210> 27 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia.

<220>

<221 > primer kötés <222> (1) .. (20) : 10>

* i,

-Sö<21!> 39 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22ö>

<221 > primer kötés <222> (1).439) <400> 28

g.acgcggccc agccggccgc tgcaggcggc <210> 29 <211> 34 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia.

<220>

<221> primer kötés <222 > (11..(34) <400> 29

D Q il :1 CCli'k C <210> 30 <21 !> 35 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22Ö>

<221 > primer kötés ·' Λ.ί *

ϊ.

<222> {I)..(35) <400> 30 a ycyg ί: etet atggctgoag goggc a t: ecr. acacc <210> 31 <2I1> 30 <2'12>DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<22 !> primer kötés <222> (1) .. (30) <400>31 agccKegsge tggcea^aca cggaacaaat <21ö> 32 <21 !> 29 <212>DNS <213> Mesterséges szekvencia

82<211>21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <221> primer kötés <222> {1)..(21) <400> 33 « caq c ?i 11 & &

aaqocqe <21ö> 34 <211> 40 <212>DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<221> primer kötés <222> (1)..(40) <40G> 34 yaregasttc -gccg<

t. q ca <210> 35 <211>21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia

Claims (20)

1. Poiipeptid, amely vWF-cp aktivitással rendelkezik, és amely tartalmazza az AAGGILHLELLV amínosav-szekvenciát, amely vWF-cp aktivitást a kővetkezők definiálnak 1) a vWF hasítása a 843Tyr--843Met peptidkötésnéL 2) közvetlen proteolitikus aktivitása van, ami a szingulett struktúrájú von Willebrand faktort szatellité struktúrájúvá alakítja át, és 3} megtartja az aktivitását szerin proteáz inhibitor, azaz például diizopropii fíuorofoszfát (DFP) jelenlétében, valamint ealpain proteáz inhibitor, azaz például karbobenziloxi (Zj peptidil diazometilketon inhibitor -(Z-Leu-Leu-Tyr-CHNa) jelenlétében.

2. Az 1. igénypont szerinti poiipeptid, amely |nek .molekulatömege SDS PAGE módszerrel redukáló- körülmények között meghatározva kb. 180kD, kb. 170 kD, kb. .160 kD vagy kb. 120 kD.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti poiipeptid, amely tartalmazza a 2. vagy 3, sz. szekvenciát..

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti poiipeptid, amely említett poiipeptid megtartja a von Willebrand faktort hasító proteáz aktivitását szerin proteáz Inhibitor és egy ealpain proteáz inhibitor jelenlétében is.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti poiipeptid, ahol a polipeptidet egy olyan gazdasejt expres szálja, amelyet egy vWF-cp polipeptidet kódoló nukleinsavat hordozó vektorral transzformáltunk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti poiipeptid, amely lényegében tiszta.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti poiipeptid, amely izolált.

8. Az 1-7, igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmazó készítmény.

♦ *

9.

fokú fémion

A 8, igénypont szerinti készítmény, ami tartalmaz még egy kétért, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: Ca²⁺, Sr²*·, Mg²* és

10, A 8. vagy 9. igénypont szerinti készítmény, ami clusterint tartalmaz, vagy annak clusterín aktivitással rendelkező analógját vagy származékát.

11. Nukleinsav molekula, amí az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vWF-cp polipeptidet kódoló- nukleinsav szekvenciát tartalmaz..

12. Expressziős vektor, ami a 11. igénypont szerinti nukleinsav molekulát tartalmaz.

13. Gazdasejt, ami a 12. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmaz.

14. Eljárás egy vWF-cp proteáz polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az alá bbi lépéseket alkalmazzuk:

- a 13, igénypont szerinti gazdasejtet táptalajban szaporítunk, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik az említett, polipeptid expresszióját

- az említett, expresszált polipeptidet begyújtjuk és

- az említett polipeptidet izoláljuk.

15. Eljárás anti-vWF~cp polipeptid ellenanyagok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy állatot egy, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vWF-cp pollpeptiddel immunizálunk, és egy aníí-vWP-cp polipeptid ellenanyagot izolálunk az említett állatból.

16, péseket t

Eljárás vWF-cp polipeptid tisztítására, amely eljárás az alábbi létalmazza: a vWF-cp polipeptidet tartalmazó oldatot érintkezésbe * Λ* χ 9 t, * « « X X * hozzuk egy az ellenanyagok, egyláncú ellenanyagok vagy a Fab- vagy Fab'2fragmensek csoportjába tartozó vWF proteáz polipeptid kötő .molekulával, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a vWF-cp polipeptid kötődjön az említett vWF-cp polipeptid kötő molekulához, majd szelektive eluáljuk a vWF-cp polipeptidet az említett kötő molekuláról, és kinyerjük a tisztított vWF-cp polípeptidet.

17. Eljárás vWF-cp polipeptid kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy egy oldatot, amiről feltételezzük, hogy vWF-ep-1 tartalmaz, érintkezésbe hozzuk egy, az ellenanyagok, egyláncú ellenanyagok vagy a Fab- vagy Fab’2-fragmensek csoportjába tartozóÁ'WF-^roteáe'-pokpeprid-kötö molekulával^ vWF-cp polipeptid kötő molekulával, ezzel lehetővé téve egy vWF-ορ polipepüd/kötő molekula komplex kialakulását, majd kimutatjuk-az említett komplexet.

18. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vWF~cp polipeptid használata trombózis és tromboembőlíás betegségek profilaxisában és kezelésében használható készítmény előállításában.

.

19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, amiben a tromhoemhóliás betegség trombotikus trombocitá-s purpura (TTP), Henoch-Schönlein purpura, preéclampsia, újszülött trombocitopéma vagy hemolitikus-urémiás szindróma.

20. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a vWF proteáz polipeptid kötő molekula egy monoklonálís ellenanyag.