WO2021200744A1 - 増殖細胞の生産方法、細胞生産物の生産方法、間葉系幹細胞集団およびその生産方法、幹細胞の培養上清およびその生産方法、並びに治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
更に、本発明は、上述の細胞培養技術に基づいて、新規特徴を有する間葉系幹細胞集団を提供すること、および、上述の細胞培養技術に基づいて、多量のサイトカインなどの細胞生産物を含む、幹細胞の培養上清を提供することを目的とする。また、本発明は、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤を提供することを目的とする。
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
更に別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
更に別の側面によれば、HLA-ABC陽性の間葉系幹細胞の比率が70%以下である間葉系幹細胞集団が提供される。
更に別の側面によれば、
幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法が提供される。
更に別の側面によれば、5000pg/mL以上のHGFを含有する、幹細胞の培養上清が提供される。
更に別の側面によれば、50pg/mL以上のCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清が提供される。
更に別の側面によれば、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤が提供される。
本発明によれば、上述の細胞培養技術に基づいて、新規特徴を有する間葉系幹細胞集団を提供すること、および、多量のサイトカインなどの細胞生産物を含む、幹細胞の培養上清を提供することができる。また、本発明によれば、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤を提供することができる。
1つの側面によれば、0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法が提供される。
ラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液を予め調製し、細胞を、0.002~2000細胞/cm2の播種密度になるように、予め調製された増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
細胞を、0.002~2000細胞/cm2の播種密度になるように増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液にラミニンフラグメントまたはその改変体を添加し、これを培養容器に播種することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
細胞を、0.002~2000細胞/cm2の播種密度になるように増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種し、播種された細胞懸濁液にラミニンフラグメントまたはその改変体を添加することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
細胞としては、任意の細胞、例えば幹細胞を使用することができる。細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、または胚性幹細胞(ES細胞)であり、より好ましくは間葉系幹細胞である。細胞は、より好ましくは、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞であり、更に好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である。
この方法では、細胞を0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で増殖培養液に播種する。
0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の存在下で、接着培養により培養する。
従来、細胞を低い細胞密度で播種すると、細胞の増殖が停止し、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができなかったのに対し、上述の方法によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができる。これにより、培養容器1枚の細胞から、次の代で培養される培養容器の枚数を増やすことができ、増殖細胞や細胞由来成分を効率良く生産することができる。
<2-1.第1実施形態(1回の生産培養工程を行う実施形態)>
別の側面によれば、上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む。
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
増殖培養までの工程は、<1.増殖細胞の生産方法>の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、増殖細胞を接着状態で得ることができる。増殖培養を、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行えば、増殖細胞をコンフルエントの状態で得ることができる。
増殖培養後、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養する。「増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養する」とは、増殖培養後、培養容器底面に接着している細胞を、培養容器底面から剥がさないで接着状態を維持したまま生産培養を行うことを意味する。
従来、増殖培養の途中で細胞の増殖が停止したり、生産培養の途中で細胞が培養容器から剥離して、細胞の接着状態を維持することができなかったりしたのに対し、上述の方法によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させ、その後、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま生産培養を行うことができる。これにより、簡便な手法で多量の細胞生産物を生産することができる。
別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される。
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
増殖培養までの工程は、<1.増殖細胞の生産方法>の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、増殖細胞を接着状態で得ることができる。増殖培養を、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行えば、増殖細胞をコンフルエントの状態で得ることができる。
生産培養の工程は、<2-1.第1実施形態(1回の生産培養工程を行う実施形態)>の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、細胞に細胞生産物を生産させることができる。
生産培養後、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養する。「増殖細胞を、接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養する」とは、生産培養後、培養容器底面に接着している細胞を、培養容器底面から剥がさないで接着状態を維持したまま回復培養を行うことを意味する。
第2実施形態に係る方法は、第1実施形態に係る方法と同様、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させ、その後、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま生産培養を行うことができる。加えて、第2実施形態に係る方法は、生産培養を終えた細胞の接着状態を維持したまま回復培養を行い、細胞が細胞生産物を生産する能力を回復させることができる。これにより、細胞の接着状態を維持したまま複数回の生産培養工程を繰り返し行うことができ、その結果、簡便な手法で多量の細胞生産物を長期にわたって生産することができる。
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
[A1] 0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
[A2] 0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質を含有する増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
[A3] 増殖培養液と、0.002~2000細胞/cm2の播種密度を達成する量の細胞と、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質とを含む細胞懸濁液を培養容器に播種することと、その後、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含む、増殖細胞の生産方法。
[A4] 増殖培養液と、0.002~2000細胞/cm2の播種密度を達成する量の細胞とを含む細胞懸濁液を培養容器に播種することと、
播種された前記細胞懸濁液に、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質を添加することと、その後、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含む、増殖細胞の生産方法。
[A5] 前記細胞が幹細胞である[A1]~[A4]の何れか1に記載の方法。
[A7] 前記細胞が間葉系幹細胞である[A1]~[A6]の何れか1に記載の方法。
[A8] 前記細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である[A1]~[A7]の何れか1に記載の方法。
[A9] 前記細胞が臍帯由来間葉系幹細胞である[A1]~[A8]の何れか1に記載の方法。
[A10] 前記細胞がヒト幹細胞である[A1]~[A5]の何れか1に記載の方法。
[A12] 前記細胞がヒト間葉系幹細胞である[A1]~[A7]、[A10]および[A11]の何れか1に記載の方法。
[A13] 前記細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である[A1]~[A8]および[A10]~[A12]の何れか1に記載の方法。
[A14] 前記細胞がヒト臍帯由来間葉系幹細胞である[A1]~[A13]の何れか1に記載の方法。
[A15] 前記細胞が凍結細胞である[A1]~[A14]の何れか1に記載の方法。
[A17] 前記細胞が、0.002~1900細胞/cm2、好ましくは0.002~1800細胞/cm2、より好ましくは0.002~1700細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1600細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1500細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1400細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1300細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1200細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1100細胞/cm2、更に好ましくは0.002~1000細胞/cm2、更に好ましくは0.002~900細胞/cm2、更に好ましくは0.002~800細胞/cm2、更に好ましくは0.002~700細胞/cm2、更に好ましくは0.002~600細胞/cm2、更に好ましくは0.002~500細胞/cm2、更に好ましくは0.002~400細胞/cm2、更に好ましくは0.002~300細胞/cm2、更に好ましくは0.002~200細胞/cm2、更に好ましくは0.002~100細胞/cm2の細胞密度で播種される[A1]~[A16]の何れか1に記載の方法。
[A18] 前記細胞が、1~2000細胞/cm2、好ましくは1~1900細胞/cm2、より好ましくは1~1800細胞/cm2、更に好ましくは1~1700細胞/cm2、更に好ましくは1~1600細胞/cm2、更に好ましくは1~1500細胞/cm2、更に好ましくは1~1400細胞/cm2、更に好ましくは1~1300細胞/cm2、更に好ましくは1~1200細胞/cm2、更に好ましくは1~1100細胞/cm2、更に好ましくは1~1000細胞/cm2、更に好ましくは1~900細胞/cm2、更に好ましくは1~800細胞/cm2、更に好ましくは1~700細胞/cm2、更に好ましくは1~600細胞/cm2、更に好ましくは1~500細胞/cm2、更に好ましくは1~400細胞/cm2、更に好ましくは1~300細胞/cm2、更に好ましくは1~200細胞/cm2、更に好ましくは1~100細胞/cm2の細胞密度で播種される[A1]~[A16]の何れか1に記載の方法。
[A19] 前記増殖培養液が、前記細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である[A1]~[A18]の何れか1に記載の方法。
[A20] 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である[A1]~[A19]の何れか1に記載の方法。
[A22] 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる[A1]~[A21]の何れか1に記載の方法。
[A23] 前記培養が、500cm2以上の底面積を有する培養容器で行われる[A1]~[A22]の何れか1に記載の方法。
[A24] 前記培養が、500~10000cm2の底面積を有する培養容器で行われる[A1]~[A23]の何れか1に記載の方法。
[A25] 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである[A1]~[A24]の何れか1に記載の方法。
[A27] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである[A25]または[A26]に記載の方法。
[A28] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン511 E8フラグメント、ラミニン521 E8フラグメント、ラミニン411 E8フラグメント、ラミニン421 E8フラグメント、ラミニン332 E8フラグメント、ラミニン311 E8フラグメント、ラミニン321 E8フラグメント、ラミニン211 E8フラグメント、ラミニン221 E8フラグメント、ラミニン213 E8フラグメント、ラミニン111 E8フラグメント、またはラミニン121 E8フラグメントである[A25]~[A27]の何れか1に記載の方法。
[A29] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン511 E8フラグメントである[A25]~[A28]の何れか1に記載の方法。
[A30] 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である[A1]~[A24]の何れか1に記載の方法。
[A32] 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である[A30]または[A31]に記載の方法。
[A33] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである[A31]または[A32]に記載の方法。
[A34] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン511 E8フラグメント、ラミニン521 E8フラグメント、ラミニン411 E8フラグメント、ラミニン421 E8フラグメント、ラミニン332 E8フラグメント、ラミニン311 E8フラグメント、ラミニン321 E8フラグメント、ラミニン211 E8フラグメント、ラミニン221 E8フラグメント、ラミニン213 E8フラグメント、ラミニン111 E8フラグメント、またはラミニン121 E8フラグメントである[A33]に記載の方法。
[A35] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン511 E8フラグメントである[A33]または[A34]に記載の方法。
[A36] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン421 E8フラグメントである[A33]または[A34]に記載の方法。
[A38] 前記改変体が、ラミニン511 E8フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である[A30]~[A37]の何れか1に記載の方法。
[A39] 前記改変体が、ラミニン421 E8フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である[A30]~[A37]の何れか1に記載の方法。
[A40] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.005μg~2μgである[A1]~[A39]の何れか1に記載の方法。
[A41] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.01μg~0.5μgである[A1]~[A40]の何れか1に記載の方法。
[A42] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.05μg~0.25μgである[A1]~[A41]の何れか1に記載の方法。
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法。
[B2] [A1]~[A42]の何れか1に記載の方法に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法。
[B3] 前記細胞生産物が、アミノ酸、脂質、糖などの細胞代謝物;ホルモン;ペプチド;サイトカイン、細胞外マトリックスなどの分泌タンパク質;またはエクソソームである[B1]または[B2]に記載の方法。
[B4] 前記細胞生産物がサイトカインである[B1]~[B3]の何れか1に記載の方法。
[B5] 前記細胞生産物がエクソソームである[B1]~[B3]の何れか1に記載の方法。
[B7] 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である[B1]~[B6]の何れか1に記載の方法。
[B8] 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である[B1]~[B7]の何れか1に記載の方法。
[B9] 前記生産培養液が、血清を含まない培養液である[B1]~[B8]の何れか1に記載の方法。
[B10] 前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む[B1]~[B9]の何れか1に記載の方法。
[B12] 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地である[B1]~[B11]の何れか1に記載の方法。
[B13] 前記生産培養液が、細胞の栄養成分、好ましくはアミノ酸を追加した細胞培養用基本培地である[B1]~[B12]の何れか1に記載の方法。
[B14] 前記生産培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない[B1]~[B13]の何れか1に記載の方法。
[B15] 前記生産培養液中での前記培養が、0.5~10日間、好ましくは2~5日間にわたって行われる[B1]~[B14]の何れか1に記載の方法。
[B17] 前記回復培養液が、前記細胞の増殖を促進するタンパク質を含む培養液である[B2]~[B16]の何れか1に記載の方法。
[B18] 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である[B2]~[B17]の何れか1に記載の方法。
[B19] 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である[B2]~[B18]の何れか1に記載の方法。
[B20] 前記回復培養液が、前記増殖培養液と同じ組成を有する[B2]~[B19]の何れか1に記載の方法。
[B22] 前記回復培養液中での前記培養が、0.5~10日間、好ましくは2~5日間にわたって行われる[B2]~[B21]の何れか1に記載の方法。
[B23] 前記生産培養液中での前記培養と前記回復培養液中での前記培養とのサイクルが、2~10回繰り返される[B2]~[B22]の何れか1に記載の方法。
本発明者らは、<1.増殖細胞の生産方法>の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養すると、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーであるHLA-ABCおよびCD105の発現が低下することを新たに見出した(後述の実施例4を参照)。
CD105の陽性率が低い細胞は、TGFb1の発現量が高く、T細胞増殖を抑制するため、炎症疾患への治療効果が期待されている報告がある。
本発明者らは、<2.細胞生産物の生産方法>の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養し、その後、生産培養液中での培養と回復培養液中での培養とを交互に繰り返し、生産培養液の上清を回収すると、生産培養の回数を重ねるにつれて、培養上清中のサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームの量が増加することを新たに見出した(後述の実施例5を参照)。
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法が提供される。この方法において、幹細胞は、例えば間葉系幹細胞である。
本発明者らは、<1.増殖細胞の生産方法>の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養すると、得られた間葉系幹細胞は、下肢虚血モデルのラットの虚血下肢の血流を有意に増加させることができることを新たに見出した(後述の実施例6を参照)。
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
<7-1.間葉系幹細胞集団およびその生産方法>
[C1] 間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したHLA-ABC陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法。
[C2] 前記間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である[C1]に記載の方法。
[C3] 前記間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である[C1]または[C2]に記載の方法。
[C4] 前記間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である[C1]に記載の方法。
[C5] 前記間葉系幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である[C1]または[C2]に記載の方法。
[C7] 前記増殖培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である[C1]~[C6]の何れか1に記載の方法。
[C8] 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である[C1]~[C7]の何れか1に記載の方法。
[C9] 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である[C1]~[C8]の何れか1に記載の方法。
[C10] 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる[C1]~[C9]の何れか1に記載の方法。
[C12] 前記培養が、500~10000cm2の底面積を有する培養容器で行われる[C1]~[C11]の何れか1に記載の方法。
[C13] 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである[C1]~[C12]の何れか1に記載の方法。
[C14] 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである[C13]に記載の方法。
[C15] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである[C13]または[C14]に記載の方法。
[C17] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン511 E8フラグメントである[C13]~[C16]の何れか1に記載の方法。
[C18] 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である[C1]~[C12]の何れか1に記載の方法。
[C19] 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である[C18]に記載の方法。
[C20] 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である[C18]または[C19]に記載の方法。
[C22] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン511 E8フラグメント、ラミニン521 E8フラグメント、ラミニン411 E8フラグメント、ラミニン421 E8フラグメント、ラミニン332 E8フラグメント、ラミニン311 E8フラグメント、ラミニン321 E8フラグメント、ラミニン211 E8フラグメント、ラミニン221 E8フラグメント、ラミニン213 E8フラグメント、ラミニン111 E8フラグメント、またはラミニン121 E8フラグメントである[C21]に記載の方法。
[C23] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン511 E8フラグメントである[C21]または[C22]に記載の方法。
[C24] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン421 E8フラグメントである[C21]または[C22]に記載の方法。
[C25] 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である[C20]~[C24]の何れか1に記載の方法。
[C27] 前記改変体が、ラミニン421 E8フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である[C18]~[C25]の何れか1に記載の方法。
[C28] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.005μg~2μgである[C1]~[C27]の何れか1に記載の方法。
[C29] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.01μg~0.5μgである[C1]~[C28]の何れか1に記載の方法。
[C30] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.05μg~0.25μgである[C1]~[C29]の何れか1に記載の方法。
[C31] 前記低下したHLA-ABC陽性率が、70%以下、好ましくは60%以下、より好ましくは50%以下、更に好ましくは40%以下、更に好ましくは30%以下、更に好ましくは20%以下、更に好ましくは10%以下である[C1]~[C30]の何れか1に記載の方法。
[D2] HLA-ABC陽性の間葉系幹細胞の前記比率が、60%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは40%以下、更に好ましくは30%以下、更に好ましくは20%以下、更に好ましくは10%以下である[D1]に記載の間葉系幹細胞集団。
[D3] 前記間葉系幹細胞集団は、CD105陽性の間葉系幹細胞の比率が50%以下である[D1]または[D2]に記載の間葉系幹細胞集団。
[D4] CD105陽性の間葉系幹細胞の前記比率が、40%以下、好ましくは30%以下、より好ましくは20%以下、更に好ましくは10%以下である[D3]に記載の間葉系幹細胞集団。
[D5] [C1]~[C31]の何れか1に記載の方法によって得られる間葉系幹細胞集団。
[D6] 前記間葉系幹細胞集団が、[C1]~[C31]の何れか1に記載の方法によって得られる[D1]~[D4]の何れか1に記載の間葉系幹細胞集団。
[E1] 幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法。
[E2] 前記生産培養液の上清の回収が、前記生産培養液中での2回目以降の前記培養の後、好ましくは、前記生産培養液中での3回目以降の前記培養の後、に行われる[E1]に記載の方法。
[E3] 前記幹細胞が、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞などの体性幹細胞;または人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)などの多能性幹細胞である[E1]または[E2]に記載の方法。
[E4] 前記幹細胞が間葉系幹細胞である[E1]~[E3]の何れか1に記載の方法。
[E5] 前記幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である[E1]~[E4]の何れか1に記載の方法。
[E7] 前記幹細胞がヒト幹細胞である[E1]または[E2]に記載の方法。
[E8] 前記幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト皮膚幹細胞、ヒト肝幹細胞、ヒト筋幹細胞、ヒト脂肪幹細胞などのヒト体性幹細胞;またはヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞)、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)などのヒト多能性幹細胞である[E1]~[E3]の何れか1に記載の方法。
[E9] 前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞である[E1]~[E4]の何れか1に記載の方法。
[E10] 前記幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である[E1]~[E5]の何れか1に記載の方法。
[E12] 前記増殖培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である[E1]~[E11]の何れか1に記載の方法。
[E13] 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である[E1]~[E12]の何れか1に記載の方法。
[E14] 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である[E1]~[E13]の何れか1に記載の方法。
[E15] 前記増殖培養液中での前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる[E1]~[E14]の何れか1に記載の方法。
[E17] 前記増殖培養液中での前記培養が、500~10000cm2の底面積を有する培養容器で行われる[E1]~[E16]の何れか1に記載の方法。
[E18] 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである[E1]~[E17]の何れか1に記載の方法。
[E19] 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである[E18]に記載の方法。
[E20] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである[E18]または[E19]に記載の方法。
[E22] 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン511 E8フラグメントである[E18]~[E21]の何れか1に記載の方法。
[E23] 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である[E1]~[E17]の何れか1に記載の方法。
[E24] 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である[E23]に記載の方法。
[E25] 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である[E23]または[E24]に記載の方法。
[E27] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン511 E8フラグメント、ラミニン521 E8フラグメント、ラミニン411 E8フラグメント、ラミニン421 E8フラグメント、ラミニン332 E8フラグメント、ラミニン311 E8フラグメント、ラミニン321 E8フラグメント、ラミニン211 E8フラグメント、ラミニン221 E8フラグメント、ラミニン213 E8フラグメント、ラミニン111 E8フラグメント、またはラミニン121 E8フラグメントである[E26]に記載の方法。
[E28] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン511 E8フラグメントである[E26]または[E27]に記載の方法。
[E29] 前記ラミニンE8フラグメントが、ラミニン421 E8フラグメントである[E26]または[E27]に記載の方法。
[E30] 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である[E25]~[E29]の何れか1に記載の方法。
[E32] 前記改変体が、ラミニン421 E8フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である[E23]~[E30]の何れか1に記載の方法。
[E33] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.005μg~2μgである[E1]~[E32]の何れか1に記載の方法。
[E34] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.01μg~0.5μgである[E1]~[E33]の何れか1に記載の方法。
[E35] 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積1cm2あたり0.05μg~0.25μgである[E1]~[E34]の何れか1に記載の方法。
[E37] 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である[E1]~[E36]の何れか1に記載の方法。
[E38] 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である[E1]~[E37]の何れか1に記載の方法。
[E39] 前記生産培養液が、血清を含まない培養液である[E1]~[E38]の何れか1に記載の方法。
[E40] 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地を含む培養液であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である[E1]~[E39]の何れか1に記載の方法。
[E42] 前記生産培養液が、細胞の栄養成分、好ましくはアミノ酸を追加した細胞培養用基本培地である[E1]~[E41]の何れか1に記載の方法。
[E43] 前記生産培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない[E1]~[E42]の何れか1に記載の方法。
[E44] 前記生産培養液中での前記培養が、0.5~10日間、好ましくは2~5日間にわたって行われる[E1]~[E43]の何れか1に記載の方法。
[E45] 前記回復培養液が、前記幹細胞の増殖培養液である[E1]~[E44]の何れか1に記載の方法。
[E47] 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である[E1]~[E46]の何れか1に記載の方法。
[E48] 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である[E1]~[E47]の何れか1に記載の方法。
[E49] 前記回復培養液が、前記増殖培養液と同じ組成を有する[E1]~[E48]の何れか1に記載の方法。
[E50] 前記回復培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない[E1]~[E49]の何れか1に記載の方法。
[E51] 前記回復培養液中での前記培養が、0.5~10日間、好ましくは2~5日間にわたって行われる[E1]~[E50]の何れか1に記載の方法。
[E52] 前記生産培養液中での前記培養と前記回復培養液中での前記培養とのサイクルが、2~10回繰り返される[E1]~[E51]の何れか1に記載の方法。
[F2] 前記培養上清が、10000pg/mL以上、好ましくは15000pg/mL以上のHGFを含有する[F1]に記載の培養上清。
[F3] 前記培養上清が、5000~1000000pg/mL、好ましくは10000~1000000pg/mL、より好ましくは15000~1000000pg/mLのHGFを含有する[F1]または[F2]に記載の培養上清。
[F4] 50pg/mL以上のCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清。
[F5] 前記培養上清が、100pg/mL以上、好ましくは200pg/mL以上のCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を含有する[F4]に記載の培養上清。
[F7] 前記培養上清が、50pg/mL以上のCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を更に含有する[F1]~[F3]の何れか1に記載の培養上清。
[F8] 前記培養上清が、100pg/mL以上、好ましくは200pg/mL以上のCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を更に含有する[F1]~[F3]の何れか1に記載の培養上清。
[F9] 前記培養上清が、50~100000pg/mL、好ましくは100~100000pg/mL、より好ましくは200~100000pg/mLのCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を更に含有する[F1]~[F3]の何れか1に記載の培養上清。
[F10] 前記培養上清が、3000pg/mL以上のMCP-1、1000pg/mL以上のGRO、および5μg/mL以上のフィブロネクチンを更に含有する[F1]~[F9]の何れか1に記載の培養上清。
[F12] 前記培養上清が、3000~1000000pg/mL、好ましくは4000~1000000pg/mL、より好ましくは6000~1000000pg/mLのMCP-1;1000~1000000pg/mL、好ましくは2000~1000000pg/mL、より好ましくは4000~1000000pg/mLのGRO;および、5~1000μg/mL、好ましくは6~1000μg/mL、より好ましくは8~1000μg/mLのフィブロネクチンを更に含有する[F1]~[F9]の何れか1に記載の培養上清。
[F13] 前記培養上清が、200pg/mL以上のTGF-1b、5pg/mL以上のIL-4、および8pg/mL以上のIL-10を更に含有する[F1]~[F12]の何れか1に記載の培養上清。
[F14] 前記培養上清が、300pg/mL以上、好ましくは500pg/mL以上のTGF-1b;10pg/mL以上、好ましくは20pg/mL以上のIL-4;および、10pg/mL以上、好ましくは12pg/mL以上のIL-10を更に含有する[F1]~[F12]の何れか1に記載の培養上清。
[F15] 前記培養上清が、200~100000pg/mL、好ましくは300~100000pg/mL、より好ましくは500~100000pg/mLのTGF-1b;5~100000pg/mL、好ましくは10~100000pg/mL、より好ましくは20~100000pg/mLのIL-4;および、8~100000pg/mL、好ましくは10~100000pg/mL、より好ましくは12~100000pg/mLのIL-10を更に含有する[F1]~[F12]の何れか1に記載の培養上清。
[F17] 前記培養上清が、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンのいずれも含まない[F1]~[F16]の何れか1に記載の培養上清。
[F18] 前記培養上清が、組換えタンパク質を含まない[F1]~[F17]の何れか1に記載の培養上清。
[F19] 前記培養上清が、IL-1α、IL-1βおよびTNF-αの少なくとも1つを0~15pg/mLの量で含む[F1]~[F18]の何れか1に記載の培養上清。
[F20] 前記培養上清が、IL-1α、IL-1βおよびTNF-αの各々を0~15pg/mLの量で含む[F1]~[F19]の何れか1に記載の培養上清。
[F22] 前記培養上清が、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞などの体性幹細胞の培養上清;または人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)などの多能性幹細胞の培養上清である[F1]~[F21]の何れか1に記載の培養上清。
[F23] 前記培養上清が、間葉系幹細胞の培養上清である[F1]~[F22]の何れか1に記載の培養上清。
[F24] 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清、脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、胎盤由来間葉系幹細胞の培養上清、または臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清である[F1]~[F23]の何れか1に記載の培養上清。
[F25] 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清または脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である[F1]~[F24]の何れか1に記載の培養上清。
[F27] 前記培養上清が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞の培養上清、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清である[F1]~[F24]の何れか1に記載の培養上清。
[F28] 前記培養上清が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清またはヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、好ましくはヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である[F1]~[F25]の何れか1に記載の培養上清。
[F29] [E1]~[E52]の何れか1に記載の方法によって得られる培養上清。
[F30] 前記培養上清が、[E1]~[E52]の何れか1に記載の方法によって得られる[F1]~[F28]の何れか1に記載の培養上清。
[G1] [D1]~[D6]の何れか1に記載の間葉系幹細胞集団または[F1]~[F30]の何れか1に記載の培養上清を含む治療剤。
[G2] [D1]~[D6]の何れか1に記載の間葉系幹細胞集団を含む治療剤。
[G3] [F1]~[F30]の何れか1に記載の培養上清を含む治療剤。
[G4] 前記治療剤が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患;上皮創傷、熱傷などの傷;老化に伴うサルコペニア;リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎;腎炎、角膜炎、サイトカインストームなどの炎症性疾患;神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患;GVHD(移植片対宿主病)、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患;またはがん疾患を治療するためのものである[G1]~[G3]の何れか1に記載の治療剤。
[G5] 前記治療剤が、虚血性疾患;好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症;より好ましくは下肢虚血を治療するためのものである[G1]~[G4]の何れか1に記載の治療剤。
[G7] [D1]~[D6]の何れか1に記載の間葉系幹細胞集団を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
[G8] [F1]~[F30]の何れか1に記載の培養上清を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
[G9] 前記傷病が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患;上皮創傷、熱傷などの傷;老化に伴うサルコペニア;リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎;サイトカインストーム、腎炎、角膜炎などの炎症性疾患;神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患;GVHD(移植片対宿主病)、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患;またはがん疾患である[G6]~[G8]の何れか1に記載の方法。
[G10] 前記傷病が、虚血性疾患;好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症;より好ましくは下肢虚血である[G6]~[G9]の何れか1に記載の治療剤。
[G11] 前記被検体が、哺乳類、好ましくはヒトである[G6]~[G10]の何れか1に記載の方法。
[G13] 治療剤の製造のための[D1]~[D6]の何れか1に記載の間葉系幹細胞集団の使用。
[G14] 治療剤の製造のための[F1]~[F30]の何れか1に記載の培養上清の使用。
[G15] 前記治療剤が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患;上皮創傷、熱傷などの傷;老化に伴うサルコペニア;リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎;サイトカインストーム、腎炎、角膜炎などの炎症性疾患;神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患;GVHD(移植片対宿主病)、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患;またはがん疾患を治療するためのものである[G12]~[G14]の何れか1に記載の使用。
[G16] 前記治療剤が、虚血性疾患;好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症;より好ましくは下肢虚血を治療するためのものである[G12]~[G15]の何れか1に記載の治療剤。
(1)方法
実施例1では、幹細胞の増殖培養を行った。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker(ゼノアック)で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を使用した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e3の細胞数(播種密度10cells/cm2)、5x10e4の細胞数(播種密度100cells/cm2)、5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)、および5x10e6の細胞数(播種密度10000cells/cm2)で、MSC Expansion XSFM B 培地(富士フイルム和光純薬株式会社)100mlに懸濁し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。それぞれの条件ごとに、4枚のフラスコに播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e3の細胞数(播種密度10cells/cm2)、5x10e4の細胞数(播種密度100cells/cm2)、5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)、および5x10e6の細胞数(播種密度10000cells/cm2)で、MSC Expansion XSFM B 培地(富士フイルム和光純薬株式会社)100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント(株式会社ニッピ)を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。それぞれの条件ごとに、4枚のフラスコに播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e3の細胞数(播種密度10cells/cm2)、5x10e4の細胞数(播種密度100cells/cm2)、5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)、および5x10e6の細胞数(播種密度10000cells/cm2)で、MSC Expansion XSFM B 培地(富士フイルム和光純薬株式会社)100mlに懸濁し、予めゼラチンコーティングしたピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。ゼラチンコーティングは、ゼラチン溶液(StemSure 0.1w/v% Gelatin Solution、富士フイルム和光純薬株式会社)で2時間処理することより行った。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)が増殖してT512フラスコでコンフルエントの状態に達すると、約3×10e7個の細胞(すなわち、約60000cells/cm2)が回収できた。したがって、図1、3および5において、約60000cells/cm2がコンフルエントの状態を表す。
(1)方法
実施例2では、幹細胞の増殖培養を行った後、生産培養を行った。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker(ゼノアック)で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を使用した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e5(播種密度1000cells/cm2)の細胞数で、MSC Expansion XSFM B(富士フイルム和光純薬株式会社)(以下、MSC培地Bともいう)100mlに懸濁し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e5(播種密度1000cells/cm2)の細胞数で、MSC Expansion XSFM B(富士フイルム和光純薬株式会社)(以下、MSC培地Bともいう)100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント(株式会社ニッピ)を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。
図7Aでは、一部の細胞が剥がれて細胞塊になっていた。図7Aにおいて細胞塊が存在する箇所を矢印で示した。図7Bでは、大部分の細胞が剥がれて残っていなかった。一方、図8Aおよび図8Bのどちらの画像においても、細胞は剥がれておらず接着状態を保っていた。
(1)方法
実施例3では、幹細胞の増殖培養を行った後、長期の生産培養を行った。実施例3で行った培養工程を模式的に図9に示す。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker(ゼノアック)で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を使用した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)で、MSC Expansion XSFM B(富士フイルム和光純薬株式会社)(以下、MSC培地Bともいう)100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント(株式会社ニッピ)を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、1.5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)でMSC Expansion XSFM B(富士フイルム和光純薬株式会社)(MSC培地B)20mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメントを添加しないでT150フラスコ(コーニング)に播種した。ラミニンフラグメントを添加しなかったこと以外は実験3-1と同様の手順で増殖培養を行った。
サイトカインの定量結果を図10~12に示す。図10~12のそれぞれのグラフは、左から順に、
本発明の例で1回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、
本発明の例で2回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、
本発明の例で3回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、および
比較例で回収された培養上清中のサイトカインの量
を示す。
実施例4では、間葉系幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養し、得られた間葉系幹細胞集団の細胞表面マーカー陽性率を解析した。また、間葉系幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養し、得られた間葉系幹細胞集団の細胞表面マーカーの発現を免疫染色画像により確認した。
実験4-1(本発明の例)
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)または脂肪由来間葉系幹細胞(ADMSC)を、5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)で、MSC Expansion XSFM B 培地(富士フイルム和光純薬株式会社)100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント(株式会社ニッピ)を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。臍帯由来間葉系幹細胞は、1週間、2週間、3週間の期間にわたって培養し、脂肪由来間葉系幹細胞は、1週間、2週間の期間にわたって培養した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、5x10e5の細胞数(播種密度1000cells/cm2)で、MSC Expansion XSFM B 培地(富士フイルム和光純薬株式会社)100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメントを添加しないでピールオフT512フラスコ(住友ベークライト株式会社)に播種した。ラミニンフラグメントを添加しなかったこと以外は実験4-1と同様の手順で培養を行った。
ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図13に示し、ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の脂肪由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図14に示し、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図15に示す。
実施例5では、実施例3に記載の方法に従って、間葉系幹細胞の増殖培養を行った後に複数回の生産培養を行い、各々の生産培養の後に培養上清を回収した。得られた間葉系幹細胞の培養上清に含まれるサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームマーカーの量を解析した。
培養上清に含まれるサイトカインおよび細胞外マトリックスの量を、ELISA解析キット(R&D Systems社)を用いて解析した。サイトカインとして、HGF(肝細胞増殖因子)、MCP-1、GRO/CXCL1、PDGF-AA、VEGF(血管内皮増殖因子)、TGF-1b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-7、IL-15、IL-9、IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-8、EOTAXIN、IL-6、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、IL-12P40、IP-10、MIP-1αの24種類を解析し、細胞外マトリックスとしてFibronectinを解析した。また、培養上清に含まれるエクソソームの量を、CD9/CD63 ELISAキット(コスモバイオ)を用いて、エクソソームマーカータンパク質(CD9/CD63融合タンパク質)を指標として解析した。本明細書において、サイトカインの量、細胞外マトリックスの量、エクソソームマーカータンパク質の量は、特異的な抗体を用いてELISA法により測定される値を指す。
この実施例においても、実施例3と同様、本発明の例では、ラミニンフラグメントの存在下で増殖培養を行ったのに対し、比較例では、ラミニンフラグメントの非存在下で増殖培養を行った。このため、本発明の例では、複数回の生産培養を繰り返し行うことができたが、比較例では、1回目の生産培養の間に細胞が培養容器から剥がれ始めたため、1回目の生産培養しか行うことができなかった。
実施例6では、本発明の方法に従って得られた間葉系幹細胞を下肢虚血モデルのラットに投与し、治療効果を確認した。
<下肢虚血モデルのラットの準備>
12週齢のSprague Dawley(SD)雄ラット(CLEA Japan(大阪、日本)から購入)を使用した。SDラットを5ml/kgの用量でコンビネーション麻酔薬(M/M/B:0.3/4/5)を腹腔内投与して麻酔した。下肢虚血は、外腸骨動脈と内腸骨静脈、足首直下レベルの伏在動脈と静脈、および全枝を露出させて結紮し、結紮した血管のうち全血管を切除することにより誘導した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UCMSC)を、実施例4と同様の方法で、ラミニンフラグメントの存在下および非存在下のそれぞれで培養した。また、脂肪由来間葉系幹細胞(ADMSC)を、実施例4と同様の方法で、ラミニンフラグメントの存在下および非存在下のそれぞれで培養した。得られた間葉系幹細胞(すなわち、ラミニンフラグメントの存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞、ラミニンフラグメントの存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞、およびラミニンフラグメントの非存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞)を、1mlのDMEM/F12培地(Sigma)に1.25x10e6の細胞数で懸濁した。
下肢の血流量をMoor LDI 2.0システム(Moor instruments, Devon, UK)を用いて評価した。血流量は、下肢虚血の誘導から14日後に測定した。血流量の測定時には、ラットにイソフルラン吸入麻酔を行った。血流量比(%)は、下記式により相対値で算出した。
血流量比(%)=(左虚血下肢の血流量/右非虚血下肢の血流量)×100
下肢血流量比の結果を図43に示す。図43において、「Control」は、DMEM/F12培地を投与した群、「UCMSC laminin-」は、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞を投与した群、「UCMSC laminin+」は、ラミニンフラグメントの存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞を投与した群、「ADMSC laminin-」は、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞を投与した群、「ADMSC laminin+」は、ラミニンフラグメントの存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞を投与した群を表す。図43において、エラーバーは標準誤差を表す。
Claims (33)
- 0.002~2000細胞/cm2の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
- 前記培養が、前記培養基質を含有する増殖培養液中で行われる請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞が間葉系幹細胞である請求項1~3の何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞が臍帯由来間葉系幹細胞である請求項1~4の何れか1項に記載の方法。
- 前記細胞が凍結細胞である請求項1~5の何れか1項に記載の方法。
- 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる請求項1~6の何れか1項に記載の方法。
- 前記培養が、500cm2以上の底面積を有する培養容器で行われる請求項1~7の何れか1項に記載の方法。
- 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである請求項1~8の何れか1項に記載の方法。
- 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である請求項1~8の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1~10の何れか1項に記載の方法に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法。 - 請求項1~10の何れか1項に記載の方法に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法。 - 前記生産培養液が、異種由来成分を含まない培養液である請求項11または12に記載の方法。
- 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である請求項11~13の何れか1項に記載の方法。
- 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である請求項11~14の何れか1項に記載の方法。
- 前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む請求項11~15の何れか1項に記載の方法。
- 幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法。 - 前記生産培養液の上清の回収が、前記生産培養液中での2回目以降の前記培養の後に行われる請求項17に記載の方法。
- 前記幹細胞が間葉系幹細胞である請求項17または18に記載の方法。
- 間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したHLA-ABC陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法。
- HLA-ABC陽性の間葉系幹細胞の比率が70%以下である間葉系幹細胞集団。
- CD105陽性の間葉系幹細胞の比率が50%以下である請求項21に記載の間葉系幹細胞集団。
- 5000pg/mL以上のHGFを含有する、幹細胞の培養上清。
- 50pg/mL以上のCD9/CD63 ECドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清。
- 3000pg/mL以上のMCP-1、1000pg/mL以上のGRO、および5μg/mL以上のフィブロネクチンを更に含有する請求項23または24に記載の培養上清。
- 200pg/mL以上のTGF-1b、5pg/mL以上のIL-4、および8pg/mL以上のIL-10を更に含有する請求項23~25の何れか1項に記載の培養上清。
- インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンの少なくとも1つを含まない請求項23~26の何れか1項に記載の培養上清。
- 組換えタンパク質を含まない請求項23~27の何れか1項に記載の培養上清。
- IL-1α、IL-1βおよびTNF-αの少なくとも1つが0~15pg/mLの量で含まれる、請求項23~28の何れか1項に記載の培養上清。
- 20種類以上のサイトカインを含み、各サイトカインが10pg/mL以上の濃度を有する請求項23~29の何れか1項に記載の培養上清。
- 前記培養上清が、間葉系幹細胞の培養上清である請求項23~30の何れか1項に記載の培養上清。
- 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である請求項23~31の何れか1項に記載の培養上清。
- 請求項21または22に記載の間葉系幹細胞集団または請求項23~32の何れか1項に記載の培養上清を含む治療剤。
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See also references of EP4130240A4 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2024019080A1 (ja) * | 2022-07-19 | 2024-01-25 | 国立大学法人 長崎大学 | 血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法、および肺疾患治療用医薬組成物 |
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