PT2189523E - Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados - Google Patents

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Tim-Matthias Strom
Simone Rost
Andreas Fregin
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Description

1
DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDO DE RECICLAGEM DE EPÓXIDO DE VITAMINA K, VKORC1, UM ALVO TERAPÊUTICO DE CUMARINA E SEUS DERIVADOS"
Campo da Invenção A invenção refere-se a métodos para carboxilar em gama um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira compreendendo introduzir um ácido nucleico que codifica o VK0RC1 na referida célula hospedeira de um modo que o ácido nucleico que codifica o VK0RC1 seja expressado de modo recombinante na referida célula. Além disso, a presente invenção refere-se a utilizações de um ácido nucleico de VK0RC1 recombinante para carboxilar em gama um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira.
Antecedentes da invenção A repressão da coagulação sanguínea inoportuna é a opção terapêutica de eleição para o tratamento agudo e para a prevenção prolongada de eventos trombóticos. Entre os anticoagulantes, as cumarinas são muito utilizadas para a prevenção de trombose tal como em doentes imobilizados após cirurgia, doentes possuindo uma insuficiência cardíaca crónica, doentes possuindo doença vascular aterosclerótica, doentes possuindo uma malignidade e doentes que estão grávidas. Além disso, as cumarinas são os anticoagulantes orais mais utilizados para o tratamento e profilaxia de trombose [Suttie, 1987]. As cumarinas são tipicamente derivados de 6-hidroxicumarina, como a 3-(acetonilbenzil)-4-hidroxicumarina (COUMADIN®) .
As cumarinas visam indiretamente a cascata de coagulação sanguínea através da inibição do ciclo de vitamina K. 2 A vitamina K é um cofator essencial para a ativação pós-tradução por carboxilação gama de um grupo de proteínas reguladoras, as proteínas Gla. Em várias vias metabólicas, algumas proteínas chave requerem carboxilação para funcionamento adequado. A cascata de coagulação sanguínea é o exemplo mais bem estudado. Aqui, os fatores pró-coagulantes II, VII, IX e X, e os fatores anticoagulantes proteína C, proteína S, proteína Z são dependentes de carboxilação gama. Esta modificação pós-tradução permite a ligação das proteínas modificadas - na presença de cálcio -a membranas bicamada de fosfolípido, a qual é um passo essencial na ativação de coagulação sanguínea [Sperling et al., 1978] [Esmon et al., 1975]. Outras proteínas que requerem carboxilação gama são as proteínas gla da matriz e a osteocalcina, ambas reguladoras do metabolismo ósseo [Price, 1988] e o "gene específico de paragem do crescimento", uma proteína de transdução de sinal do ciclo celular [Manfioletti et al., 1993] [Stitt et al., 1995].
Durante a carboxilação gama é introduzido um grupo carboxilo em resíduos glutamato das proteínas alvo pela enzima gama-glutamil-carboxilase (GGCX) em microssomas de fígado [Furie & Furie, 1988] [Suttie, 1987]. A reação requer como um cofator, quantidades estequiométricas de vitamina Kl reduzida hidroquinona (vitamina K1H2) a qual é oxidada a epóxido de vitamina K-2.3 [Cain et al., 1997]. A regeneração do cofator ativo é mediada por um complexo multi-proteico designado epóxido de vitamina K-2.3-redutase (VKOR) [Wallin & Martin, 1985]. 0 mesmo complexo é visado pelos venenos tipo cumarina utilizados no controlo de pragas de roedores. Este "ciclo de vitamina K" foi caracterizado bioquimicamente em grande pormenor mas as componentes moleculares ainda não foram purificadas até à 3 homogeneidade [Guenthner et al., 19981]. Além disso, a natureza molecular da atividade da cumarina e as moléculas que interagem com as cumarinas continuam ininteligíveis. É geralmente reconhecido na técnica que, apesar de serem muito eficazes, existe um número de restrições à utilização de cumarinas. Antes de mais nada; existem humanos que são não reativos ao tratamento com cumarina. 0 termo resistência à varfarina (WR) é utilizado para indivíduos que mantêm atividades normais do fator de coagulação apesar da anticoagulação oral com cumarinas (N° Acesso OMIM 1227 00) . Foi observada transmissão autossómica dominante em várias linhagens [0'Reilly et al., 1964] [0'Reilly, 1970]. A deficiência combinada de todos os fatores de coagulação dependentes de vitamina K (VKCFD) é um distúrbio hemorrágico muito raro em humanos de hereditariedade autossómica recessiva com 14 casos descritos até à data [McMillan & Roberts, 1966] [Fischer, 1966] [Johnson et al., 1980] [Goldsmith et al., 1982] [Vicente et al., 1984] [Ekelund et al., 1986] [Pauli et al., 1987] [Leonard, 1988] [Pechlaner et al., 1992] [Boneh & Bar-Ziv, 1996] [Brenner et al., 1998] [Spronk et al., 2000] [Oldenburg et al., 2000]. Os sintomas clínicos da doença incluem episódios de hemorragia intracerebral perinatal por vezes com resultado fatal. A tendência para sangramento é em geral totalmente revertida por administração oral de vitamina K. Outros sintomas em recém-nascidos podem assemelhar-se a embriopatia varfarínica com hipoplasia nasal e falângica distai e calcificação prematura de epífises [Pauli et al., 1987]. A doença pode resultar de uma reabsorção/transporte insuficiente de vitamina K para o fígado [Prentice, 1985] ou de mutações em um dos genes envolvidos na carboxilação gama. No subtipo 1 (VKCFD1, OMIM # 277450), mutações no 4 gene GGCX no cromossoma 2pl2 resultam em carboxilação insuficiente de fatores de coagulação [Brenner et al., 1998] [Spronk et al., 2000]. Foi descrita uma ligação de dois parentes com deficiência familiar múltipla de fatores de coagulação (FMFD, agora designada: VKCFD2, OMIM # 607473) num intervalo de 20 Mb da região pericêntrica do cromossoma 16pl2-q21 [Fregin et al., 2002]. Doentes com VKCFD2 exibiram níveis de epóxido de vitamina K no soro significativamente aumentados, sugerindo assim um defeito em uma das subunidades do complexo de VKOR. No seu conjunto, é evidenciado que existem doentes que exibem resistência à varfarina. Consequentemente, existe uma necessidade de identificar novos derivados de cumarina que sejam anticoagulantes eficazes para tratar estes doentes e métodos para identificar estes derivados de cumarina. A utilização de cumarinas está associada a um risco de sangramentos espontâneos, com uma taxa de mortalidade significativa. Além disso é difícil determinar a dose exata de cumarina de manutenção. Na ausência da molécula alvo sobre a qual a cumarina exerce um efeito, o regime de tratamento tem de ser determinado doente a doente. Durante o período de tempo em que ainda não foi estabelecido o regime ótimo, o doente sofre de um maior risco de trombogénese ou de um maior risco de sangramento. Portanto, existe a necessidade de um método para determinar o regime de tratamento ótimo que seja mais rápido e mais seguro. Além do mais, a determinação de um regime de tratamento ótimo é complicada pelo facto de existir um atraso considerável entre a administração de cumarinas e o aparecimento da sua atividade anticoagulante. Dado a ação retardada da cumarina e dado o facto de a cumarina tender a acumular-se ao longo do tempo existe uma necessidade para 5 derivados de cumarina que afetem a coagulação sanguínea de modo mais rápido que as cumarinas conhecidas na técnica. Pela mesma razão, existe também a necessidade de cumarinas que sejam metabolizadas mais rapidamente para que a acumulação de cumarina seja evitada ou melhorada e, consequentemente, seja reduzido ou anulado o perigo de sobredosagem.
Está bem estabelecido que se o tratamento com cumarina é iniciado durante um estado trombótico, os níveis de proteína C e S diminuem, criando assim temporariamente um potencial trombogénico o qual é geralmente compensado pela administração sobreposta de heparina e cumarina durante um certo número de dias. Mais uma vez, existe uma necessidade de identificar o alvo molecular de ação da cumarina para se conseguir selecionar novos derivados de cumarina que não possuam estas limitações ou que as possuam pelo menos num grau menor. A terapia de cumarina induz, por vezes, necrose cutânea nos doentes e se aplicada durante a gravidez pode provocar embriopatia criando uma necessidade de novos derivados de cumarina que não originem estes efeitos.
Existe um número de interações entre fármacos e cumarinas. Alguns destes fármacos, como o Fenobarbital, induzem menores níveis de cumarinas no plasma devido a uma maior metabolização de cumarina que se julga que seja provocada pelas oxidases de função mista como as oxidases de função mista do citocromo P450. Uma tal interação é de relevância clínica se tiver sido determinado o regime apropriado de, por exemplo, Fenobarbital e cumarina e mais tarde for descontinuada apenas a administração de Fenobarbital 6 levando a um aumento do nível de cumarina no plasma, o qual provocaria uma anticoagulação excessiva. Outros fármacos como a Amiodarona provocam uma metabolização retardada de cumarina levando mais uma vez a anticoagulação excessiva se coadministrada com cumarinas. Uma vez que as moléculas afetadas pelas cumarinas não são conhecidas na técnica, existe uma necessidade para desenvolver novas cumarinas e ferramentas para identificar as últimas para resolver estes problemas.
Finalmente, as cumarinas, especialmente a varfarina, não são apenas usadas em humanos mas desde os anos 50, as cumarinas têm sido utilizadas como um ingrediente ativo em composições rodenticidas. A base para a eficácia da varfarina como um rodenticida assenta no facto de ser um anticoagulante eficaz em doses múltiplas, pequenas. Uma ou duas doses do composto são raramente fatais se tomadas à concentração recomendada; assim é muito reduzido o perigo de toxicidade aguda no homem, animais domésticos e vida selvagem. Geralmente, os roedores começam a morrer após quatro ou cinco doses diárias dos materiais, e a população é muito reduzida ou erradicada em aproximadamente três semanas. A morte é provocada por hemorragias, originadas pela ação da varfarina na redução do poder de coagulação do sangue. Estas hemorragias podem ser externas ou internas e podem ser iniciadas por lesões muito ligeiras ou degradação capilar. Uma das outras vantagens das cumarinas é que, devido ao facto de serem necessárias ingestões múltiplas para matar os roedores, eles não desenvolvem receio ao isco. Nos inícios de 1969, os roedores - em particular ratazanas e, em menor grau, os ratos - começaram a mostrar resistência aos iscos de varfarina. A suposição geral era que uma tal resistência tinha uma base genética. No que se 7 refere ao mecanismo, é o complexo VK0RC1 mencionado acima que é visado pelos derivados de varfarina em utilização no controlo de pragas de roedores. [Jackson et al., 1988]. A resistência aos derivados de cumarina surgiu espontaneamente em várias populações de roedores selvagens tornando a utilização destas drogas localmente ineficazes no controlo de pragas. Foram mapeados sítios autossómicos dominantes de resistência à varfarina no rato (War) no cromossona 7 [Wallace et al., 1976] e na ratazana (Rw) no braço comprido do cromossoma 1 [Greavses & Ayres, 1967] [Kohn & Pelz, 1999] . Uma vez que o complexo de VKOR é o alvo da resistência aos fármacos de cumarina, julga-se que seja mediada por alterações numa das suas componentes proteicas [Jackson, 1988] . 0 desenvolvimento de resistência em roedores criou uma necessidade para identificar o alvo da ação de cumarinas o que poderia facilitar o desenvolvimento de novos derivados de cumarina para utilização no controlo de pragas.
Num contexto relacionado, a WO 00/03015 A2 descreve homólogos da proteína de transporte humana (HTPH), polinucleótidos que identificam e codificam a HTPH, os respetivos vetores de expressão, células hospedeiras, anticorpos, aqonistas e antagonistas, bem como métodos para diagnosticar, tratar ou prevenir distúrbios associados à expressão de HTPH. Além disso, Fregin, A. et ai. (Fregin, A. et ai., Homocygosity mapping of a second gene locus for hereditary combined deficiency of vitamin K-dependent clotting factors to the centromeric region of chromosome 16, Blood 100(9), Novembro 2002) descreve a ligação da deficiência familar de múltiplos fatores de coagulação (FMFD) com a região centromérica do braço curto do cromossoma 16.
Além disso é um objeto da presente invenção proporcionar métodos para carboxilar em gama um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira e utilizações de um ácido nucleico de VK0RC1 recombinante para carboxilar em gama um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira. À reivindicação 1 foi adicionada uma rejeição não divulgada (", e em que o referido método não é um método de tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia") para rejeitar matéria objeto não patenteável. Analogamente, à reivindicação 6 foi adicionada uma rejeição não divulgada (", e em que a referida utilização não é uma utilização para o tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia") para rejeitar matéria objeto não patenteável.
Sumário da Invenção
Na resolução dos objetos acima as formas de realização como caracterizadas nas reivindicações são métodos para carboxilar em gama um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira e utilizações de um ácido nucleico de VK0RC1 recombinante para carboxilar em gama um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira.
Breve descrição dos desenhos
Fig. 1 representa uma comparação do intervalo candidato de 3cM no mapa genético contendo o locus do gene de VK0RC1 em humanos, ratazanas e ratos. É mostrado o ideograma do cromossoma 16 humano, a área de homozigosidade nas famílias 9 1 e 2 prolonga-se desde 16pll.2 até 16ql3 correspondendo a aproximadamente 25 Mb. Na parte direita da figura existem partes homólogas de cromossomas de rato e ratazana. São representados os genes sintéticos de 16pll.2 e 16ql2.1 com os correspondentes homólogos em Mus musculus (MMU) e Rattus norvegicus (RNO). Os sítios do fenótipo de resistência à varfarina no rato (War) e ratazana (Rw) estão mapeados em regiões homólogas a 16pll.2. MMU: Mus musculus; RNO: Rattus norvegicus; PRKCB1; Prkcb; IL4R: recetor de interleucina 4 á (humano); II4ra: recetor de interleucina 4 á (murídeo); II4r: recetor de interleucina 4 á (ratazana); SPS2: Selenofosfato-sintetase (humana); Sps2: Selenofosfato-sintetase (murídea/ratazana); HUMMLC2B: Cadeia leve 2 da miosina (humana); Milpf: Cadeia leve 2 da miosina (murídea) ; MÍ12: Cadeia leve 2 da miosina (ratazana); SPN: Sialoforina (humana); Spn: Sialoforina (muridea/ratazana).
Fig. 2 apresenta mutações VK0RC1 no fator de coagulação 2 dependente de vitamina K humano (VKCFD2) e doentes com resistência à varfarina (WR) . A parte superior da figura mostra a segregação da mutação R98W em duas famílias VKCFD2 e os eletroferogramas de um mutante homozigótico (esquerda) em comparação com um controlo (direita). A parte inferior da figura mostra as mutações heterozigóticas de quatro doentes WR. (85G>T, 134T>C, 172A>G, 383T>G) e uma ratazana Rw (416A>G).
Fig. 3 mostra um alinhamento de sequência de polipéptidos VK0RC1 e proteína 1 tipo VK0RC1 (VK0RC1L1) . 0 alinhamento foi gerado com CLUSTALW e PRETTYBOX. Os polipéptidos VK0RC1 de humano (hVKORCl), rato (mVKORCl) e ratazana (rVKORCl) e os polipéptidos VK0RC1L1, isto é VK0RC1L1 de humano (hVKORCILl), rato (mVKORCILl) e Fugu rubripes (fVKORCILl), 10 partilham aproximadamente 84% de identidade de sequência em ambos os grupos e aproximadamente 50% de identidade entre ambos os grupos de proteínas. xVKORCl representa a sequência do polipéptido VKORC1 de Xenopus laevis, fVKORCl a sequência do polipéptido VKORC1 de Fugu rubripes e aVKORCl a sequência do polipéptido VKORC1 de Anopheles gambiae. A análise de árvore permite o agrupamento das proteínas de Fugu rubripes, Xenopus laevis e Anopheles gambiae no grupo apropriado. Estão sublinhadas as localizações dos domínios transmembranares previstos. Os resíduos 29, 45, 58 e 128 mutados em doentes WR são conservados em todas as espécies. A arginina na posição 98 mutada nos doentes com VKCFD2 é conservada em humanos, ratazanas e ratos (sinal mais).
Fig. 4 apresenta uma análise de transferência de Northern de VK0RC1 em tecidos fetal e adulto humano. O diagrama superior representa uma transferência de Northern de tecido adulto, enquanto o diagrama inferior representa uma transferência de Northern de tecido fetal. Para mais detalhes ver Exemplo 4. As linhas com fragmentos de tamanhos 2,4, 4,4, 7,5 e 9,5 KB indicam marcadores de massa molecular e permitem estimar o tamanho de todas as bandas visíveis)
Fig. 5 mostra a localização subcelular de VKORC1. Para mais pormenores ver exemplo 6. Para este fim, células COS-7 transfetadas transitoriamente com construções VK0RC1 foram reveladas com anti-calnexina (vermelho; coluna da esquerda) e anti-GFP ou anti-myc, respetivamente (verde; coluna do meio) . Na coluna da direita são mostradas figuras fundidas das células com revelação dupla. Ambas as construções VK0RC1 (marcadas com GFP ou myc) são co-localizadas com a 11 revelação de calnexina especifica para ER. A construção de controlo (pEGFP-Nl) mostra um padrão de revelação difuso ao longo do citoplasma.
Fig. 6 apresenta uma lista de sequências de ARNsi para VK0RC1 de homo sapiens e iniciadores que codificam estes ARNsis os quais podem ser utilizados para os expressar utilizando, por exemplo, o Sistema de Interferência de ARN da Cassete siLentGene™ U6.
Fig. 7 apresenta localizações de alvos de ARNsi na sequência de codificação da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs__VKORCl) , as quais são mostradas a cinzento claro; as regiões que fazem parte de dois alvos possíveis de ARNsi são mostradas a cinzento mais escuro; e as regiões com duas ou mais sequências de ARNsi possíveis são mostradas a cinzento ainda mais escuro.
Fig. 8 fornece uma lista de sequências iniciadoras de PCR e condições de PCR para amplificação de VK0RC1 de Homo sapiens e VK0RC1L1 de Homo sapiens.
Fig. 9 fornece uma listagem das sequências e seus respetivos SEQ ID NOs.
Fig. 10 mostra atividades VKOR de células HEK293 transfetadas com ADNc de VKORC1. Os valores são dados como percentagem de epóxido de vitamina K convertida em vitamina K quinona (produto/substrato residual+produto). A atividade VKORC1 selvagem também é definida como sendo sensível à varfarina (4,3% de atividade residual a 80μΜ de varfarina em comparação com a não inibida). As mutações Y139C e V29L 12 que conduzem a resistência à varfarina exibem 69 e 11 % de atividade residual a 80 μΜ de varfarina, respetivamente). Todos os ensaios foram realizados em duplicado. Não transfetadas e transfetadas de modo simulado apresentaram atividades de 1,49 e 0,96%, e foram inibidas em >90% por 10 μΜ de varfarina. Para mais detalhes ver Exemplo 7.
Fiq. 11 mostra a sequência de aminoácidos do polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K de Homo sapiens (HS_VK0RC1; SEQ ID NO: 1)
Fig. 12 mostra a sequência de codificação de ácido nucleico do polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K de Homo sapiens (HS_VK0RC1; SEQ ID NO: 2).
Fig. 13 mostra o resultado de uma experiência de ARMS-PCR para determinar se uma ratazana testada é resistente varfarina. A ratazanas de tipo selvagem exibiram uma banda a 123 pb (sonda# 3351, 3133, 3137, 3142, 4724, 4684, 3138, 3162), as ratazanas homozigóticas à mutação (sonda# 4701) exibiram uma banda a 101 pb e, finalmente, ratazanas com a mutação heterozigótica (sonda# 3066, 3350, 3352, 3354, 3139, 3140, 4754, 3146, 3148, 3149 ) mostraram duas bandas, uma banda a 101 e outra a 123 pb. Para mais pormenores ver Exemplo 9.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se às utilizações de um polipéptido VKORC1 ou um ácido nucleico de VKORC1 para carboxilar em gama polipéptidos dependentes de vitamina K, bem como aos respetivos métodos. Preferencialmente, o polipéptido dependente de vitamina K carboxilado em gama é um polipéptido selecionado do grupo consistindo de fator de 13 coagulação sanguíneo II, VII, IX e X, proteína C, proteína S, proteína Z proteína gla da matriz e osteocalcina. Numa forma de realização preferida, o VK0RC1 é utilizado em associação com pelo menos um composto adicional preferencialmente numa montagem celular, composto adicional esse que é selecionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5 e um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epoxidesidroxilase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase. A fim de satisfazer as necessidades de desenvolver novos derivados de cumarina e para identificar o alvo de cumarina e seus derivados, clonou-se o polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K (VK0RC1). Era anteriormente desconhecido que este gene atravessava uma região genómica de 5126 pb e que compreendia três exões que codificavam uma proteína de 163 aminoácidos. A análise de topologia sugere uma proteína extremamente hidrófoba com pelo menos dois domínios transmembranares. Isto é compatível com a localização conhecida da atividade do complexo VK0RC1 em membranas ER e com os dados de imunofluorescência em células COS-7 transfetadas com construções de VK0RC1 (Fig. 5) . 0 gene de VK0RC1 foi surpreendentemente identificado num rastreio de mutantes de doentes resistentes à varfarina (para pormenores cf. exemplos 1 e 2) . Foi surpreendentemente identificado um gene, VK0RC1, o qual está mutado em doentes com uma deficiência combinada de todos os fatores de coagulação dependentes de vitamina K (VKCFD2) e com resistência à varfarina (WR) , respetivamente, mostrando que o polipéptido VK0RC1 contém um sítio de ligação para a varfarina e é um alvo de 14 cumarina e seus derivados. A evidência que as mutações são originadoras dos dois fenótipos é como se segue: (i) uma mutação R98W surge com a doença em duas famílias sem parentesco com VKCFD2; (ii) esta arginina na posição 98 é conservada nos genes humano e nos homólogos de rato e ratazana, respetivamente, (iii) três irmãos resistentes à varfarina partilham uma substituição R58G; (iv) este aminoácido e os outros resíduos encontrados mutados em mais dois doentes WR sem parentesco (V29L e L128R) são conservados em todas as espécies analisadas exceto em três genes bacterianos (ver Fig. 3); e (v) nenhuma das 5 mutações presumíveis foram encontradas em 192 amostras de ADN de controlo.
Além do mais, pesquisas de homologia em bases de dados de genoma e proteínas não revelaram quaisquer semelhanças de VK0RC1 com qualquer domínio de proteína ou péptido da função anotada. No entanto, estão presentes genes homólogos em vertebrados (ratazana, rato, Xenopus, Fugu), insetos (Anopheles) e bactérias (Fig. 3). Surpreendentemente, os três mamíferos e o Fugu têm cada um deles um segundo gene tipo VKORCl de semelhança moderada com o gene cognato. Um certo número de posições de aminoácido dentro destes genes foi conservado ao longo da evolução. Isto está de acordo com o facto bem estabelecido de que a carboxilação gama - e assim a utilização de vitamina K como um cofator deste processo - é uma modificação evolucionária antiga pós-tradução da proteína [Bandyopadhyay et al., 2002]. 15
Uma substituição de valina 29, arginina 58 leucina 128 -embora dispersada sobre todo o polipéptido VK0RC1 - torna, obviamente, a inibição de atividade VK0RC1 pela varfarina ineficaz. Pode especular-se que estes aminoácidos cooperam funcionalmente na estrutura terciária da proteína 1 de VK0RC1. No seu conjunto, os dados de mutação em doentes com dois fenótipos diferentes indicam o VK0RC1 como a proteína alvo, para a ligação tanto da vitamina K como da varfarina. 0 polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K (VK0RC1) utilizado com respeito à presente invenção compreende, consiste preferencialmente de, uma sequência polipeptídica selecionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptídica selecionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com SEQ ID No. 1, 12,17, 21, 25 e 27; (b) uma sequência polipeptídica de um alelo da sequência polipeptídica definida em (a); (c) uma sequência polipeptídica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptídica definida em (a) ou (b) , sequência polipeptídica essa que tem atividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptídica de um fragmento da sequência polipeptídica definida em (a), (b) ou (c) possuindo atividade VK0RC1.
Preferencialmente, o polipéptido VKORC1 é um alvo para a cumarina e seus derivados em mamíferos.
Dentro do significado da invenção, o termo "polipéptido VKORC1" refere-se à sequência completa do polipéptido VK0RC1 como definido no parágrafo anterior. 0 termo "polipéptido VKORC1" também abrange polipéptidos VK0RC1 16 isolados e polipéptidos VK0RC1 que são preparados por métodos recombinantes, por exemplo por isolamento e purificação a partir de uma amostra, de uma célula hospedeira que expressa o polipéptido VK0RC1, por triagem de uma biblioteca e por síntese de proteínas, sendo todos este métodos geralmente conhecidos do especialista na técnica. Preferencialmente, pode sintetizar-se todo o polipéptido VK0RC1 ou partes deste, por exemplo, com a ajuda de síntese convencional como a técnica Merrifield. Mais preferencialmente, o termo "polipéptido VK0RC1" também abrange polipéptidos que têm uma homologia de sequência de cerca de 80%, preferencialmente cerca de 90%, em particular, cerca de 95%, especialmente cerca de 98% com o polipéptido VK0RC1 de acordo com uma de SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, desde que tal polipéptido VK0RC1 possua atividade VKORCl. Além disso, é preferido que o termo "polipéptido VKORCl" também abranja polipéptidos homólogos que tenham origem em organismos que não o humano, preferencialmente de mamíferos não humanos como roedores, por exemplo rato, ratazanas, ou macacos e porcos e outros vertebrados e invertebrados, como as sequências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID, Nos. 12, 17, 21, 25, 27, desde que esse polipéptido VKORCl possua atividade VKORCl. É ainda mais preferido que o termo "polipéptido VKORCl" também inclua polipéptidos VKORCl, os quais são codificados por alelos diferentes do gene, em indivíduos diferentes, em órgãos diferentes de um organismo ou em fases diferentes do desenvolvimento, desde que esse polipéptido VKORCl possua atividade VKORCl. Pretende-se ainda que o termo "polipéptido VKORCl" também abranja preferencialmente mutações naturais ou sintéticas que não exerçam nenhum efeito ou que exerçam apenas efeitos insignificantes na atividade do polipéptido VKORCl. Outros 17 polipéptidos preferencialmente abrangidos pelo termo "polipéptido VK0RC1" incluem polipéptidos VK0RC1 que possam resultar de excisão-união diferencial do transcrito de VK0RC1, desde que esse polipéptido VK0RC1 possua atividade VK0RC1. 0 termo "fragmento da sequência polipeptídica" pretende abranger sequências parciais de polipéptidos VK0RC1, fragmentos esses que compreendem, preferencialmente consistem de pelo menos cerca de 60%, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% da sequência completa do polipéptido VKORC1. Em particular, prefere-se que o fragmento consista de uma única sequência contígua do polipéptido VKORC1 mas também pode conter pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos cerca de cinco porções de sequência diferentes de um polipéptido VKORC1 as quais podem, ou não, estar intercaladas por uma sequência heteróloga ou não conter de todo qualquer sequência polipeptídica extra. 0 termo "homologia de sequência" é entendido como o grau de identidade (% de identidade) de duas sequências que, no caso de polipéptidos, pode ser determinada por meio de, por exemplo, BlastP 2.0.1 e no caso de ácidos nucleicos por meio de, por exemplo BLASTN 2.014, em que o Filtro está fixado e o BLOSUM é 62 (Altschul et al., 1997). "Atividade VKORC1" como aqui utilizada pretende significar a atividade biológica do polipéptido VKORC1 de SEQ ID No.1. Mais preferencialmente, "atividade VK0RC1" é definida como a atividade do polipéptido VKORC1 para converter 18 enzimaticamente (ou suportar a conversão enzimática) de 2,3-epóxido de vitamina K em vitamina K-quinona e/ou a conversão de vitamina K quinona em vitamina K hidroquinona. A atividade VK0RC1 pode ser determinada utilizando um ensaio com base nas experiências descritas em pormenor no exemplo 7 e figura 10. Utilizando o ensaio, uma percentagem medida de epóxido de vitamina K convertida em vitamina K quinona (produto/substrato+produto) em células que expressam um dado polipéptido VK0RC1, ou uma molécula de ácido nucleico que codifica esse polipéptido VK0RC1, a qual aumenta a atividade VKOR basal de células HEK293 de cerca de 1% (1,49 e 0,96% para células HEK293 não transfetadas e transfetadas de modo simulado, respetivamente) para cerca de 15% ou mais, preferencialmente para cerca de 18% ou mais, preferencialmente para cerca de 20% ou mais, muito preferencialmente para cerca de 25% ou mais é considerada uma atividade VK0RC1 dentro da aceção da invenção.
Os polipéptidos VKORCl como definidos acima podem ser produzidos por um método descrito em mais pormenor abaixo. Entre outras coisas, os polipéptidos VKORCl são úteis para identificar derivados de cumarina que evitem os problemas descritos acima. Em particular, eles são úteis para identificar derivados de cumarina, que inibem eficazmente a atividade VKORCl e que são testados em ensaios independentes quanto à (1) sua semivida metabólica para identificar derivados de cumarina que são metabolizados mais depressa que as cumarinas conhecidas na técnica, (2) sua capacidade para provocar necrose cutânea para identificar derivados de cumarina que não provoquem necrose cutânea ou que provoquem em menor grau do que as cumarinas conhecidas na técnica, (3) interações derivado de cumarina-fármaco para identificar derivados de cumarina com menos 19 efeitos secundários do que as cumarinas conhecidas na técnica. Além disso, os polipéptidos VK0RC1 como definidos acima são úteis para identificar uma sequência VK0RC1 que interaja com a cumarina e seus derivados, e para tratar doentes possuindo uma atividade VK0RC1 menor ou maior em relação aos níveis de controlo. Ácido nucleico de VK0RC1 compreende, consiste preferencialmente de um modo essencial de, uma sequência de ácido nucleico selecionada do qrupo consistindo de: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido VK0RC1 de acordo com a invenção: (b) uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28/ (c) uma sequência de ácido nucleico < que hibridiza em condições rigorosas na sequência de ácido nucleico definida em (a) ou (b), sequência de ácido nucleico essa que codifica um polipéptido possuindo atividade VK0RC1; (d) uma sequência de ácido nucleico a qual, exceto no caso de degeneração do código genético, hibridizaria, preferencialmente em condições rigorosas, no ácido nucleico definido em (a) , (b) ou (c) e sequência de ácido nucleico essa que codifica um polipéptido possuindo atividade VK0RC1; e (e) um fragmento da sequência de ácido nucleico definida em (a) , (b) , (c) ou (d) , fragmento esse que codifica um polipéptido possuindo atividade VK0RC1. 20
Preferencialmente, o ácido nucleico de VKORCl codifica um alvo para a cumarina e seus derivados em mamíferos. O termo "ácido nucleico de VKORCl" refere-se a ARN ou ADN, o qual pode ser uma molécula de cadeia simples ou preferencialmente de cadeia dupla. A sequência do ácido nucleico de VKORCl pode ainda compreender pelo menos um intrão e/ou uma sequência poliA. O termo "ácido nucleico de VKORCl" também pode abranger uma sua fase precursora, por exemplo um pró-polipéptido ou pré-pró-polipéptido. Entender-se-á ainda que podem estar presentes sequências não traduzidas na extremidade 5' e/ou extremidade 3' do ácido nucleico, sem que se altere significativamente a atividade dos polipéptidos codificados. No entanto, é particularmente preferida a região de ADN que codifica o polipéptido VKORCl. Nos eucariotas, esta região começa com o primeiro códão de início (ATG) o qual está localizado numa sequência Kozak (Kozak, 1987) e prolonga-se até ao próximo códão de paragem (TAG, TGA ou TAA) o qual está localizado na mesma grelha de leitura que a ATG. No caso de procariotas, esta região começa com a primeira AUG (ou GUG) após uma sequência Shine-Dalgamo e termina com o próximo códão de paragem (TAG, TGA ou TAA) o qual está localizado na mesma grelha de leitura que a ATG. Além do mais, o termo "ácido nucleico de VKORCl" também pode abranger sequências que exibem pelo menos cerca de 70%, em particular pelo menos cerca de 80%, especialmente pelo menos cerca de 90%, de homologia de sequência com a sequência de acordo com as SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28, preferencialmente com a sequência de acordo com a SEQ ID No. 2, desde que o polipéptido VKORCl codificado por esse ácido nucleico possua atividade VKORCl. Preferencialmente, o ácido 21 nucleico compreende um ácido nucleico possuindo uma sequência complementar e/ou antimensageira a um ácido nucleico de VK0RC1 como definido no parágrafo anterior. 0 ácido nucleico de VK0RC1 também pode compreender uma variante mutante não funcional do ácido nucleico de VK0RC1 como definido acima, contendo essa variante um único polimorfismo de nucleótido (SNP) como as sequências de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID No. 8 e 9, desde que o polipéptido VK0RC1 codificado por esse ácido nucleico possua atividade VK0RC1. 0 termo "condições de hibridização rigorosas" é para ser entendido, em particular, como significando aquelas condições às quais ocorre uma hibridização, por exemplo, a 60°C em tampão SSC 2,5x seguida de vários passos de lavagem a 37 °C numa concentração menor de tampão e permanece estável. 0 termo "fragmento da sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido possuindo atividade VK0RC1" é compreendido como abrangendo fragmentos de sequência de ácido nucleico compreendendo, consistindo preferencialmente de, pelo menos cerca de 60%, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% da sequência completa que codifica o polipéptido VKORC1 como definido acima, preferencialmente que codifica o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1, desde que o polipéptido codificado por esse fragmento possua atividade VKORC1. Em particular, prefere-se que o fragmento consista de uma única sequência contígua que codifique o polipéptido VKORC1 mas também pode conter pelo menos duas, pelo menos três ou 22 pelo menos cerca de cinco porções de sequência diferentes, as quais podem, ou não, estar intercaladas por uma sequência heteróloga ou não conter de todo qualquer sequência de ácido nucleico extra, desde que todas as porções de sequência estejam arranjadas na mesma grelha de leitura. É essencial para a definição destes fragmentos que eles apresentem atividade VK0RC1.
Os ácidos nucleicos de VK0RC1 podem ser produzidos por métodos geralmente conhecidos do especialista. Os ácidos nucleicos podem ser preparados sinteticamente. Assim, os ácidos nucleicos de VK0RC1 podem ser, por exemplo, quimicamente sintetizados, por exemplo de acordo com o método de fosfotriéster, com a ajuda as sequências de ADN como definidas acima e/ou com a ajuda das sequências polipeptidicas que são também definidas acima tal como a SEQ ID No. 1 e por referência ao código genético (ver, por exemplo, Uhlmann & Peyman, 1990) . Preferencialmente, os ácidos nucleicos de VKORC1 são produzidos por métodos de tecnologia recombinante de genes geralmente conhecidos do especialista na técnica.
Entre outras coisas, os ácidos nucleicos de VKORC1 são úteis (1) para identificar derivados de cumarina que evitam os problemas descritos acima, (2) para produzir iniciadores de PCR, sondas de ADN e ARN, ARNsi ou ARNsh, e para o polipéptido VKORC1, (3) para tratar doentes que têm uma atividade VKORC1 menor ou maior do que os valores de controlo, e (4) para identificar derivados de cumarina que podem ser utilizados para controlar pragas de roedores, as quais são todas descritas em mais pormenor abaixo. 23 Método de produção de um polipéptido VK0RC1, preferencialmente um polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, compreende os passos de: (I) proporcionar uma célula hospedeira onde foi introduzido um ácido nucleico de VK0RC1, preferencialmente um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28, ou um vetor contendo o ácido nucleico de VK0RC1; (II) expressar o polipéptido VK0RC1 na célula hospedeira; e (III) isolar o polipéptido VK0RC1 a partir da célula hospedeira. A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira como definida abaixo. Os métodos para selecionar e cultivar as células hospedeiras e para fazer com que as células hospedeiras expressem um polipéptido são geralmente conhecidos do especialista na técnica. 0 mesmo é verdade para métodos de isolamento do polipéptido expressado da célula hospedeira; para este fim pode utilizar-se um anticorpo para precipitação por imunoafinidade. Como uma alternativa, o vetor pode conter uma etiqueta (poli)peptídica que permite a precipitação por imunoafinidade por anticorpos específicos contra a etiqueta de acordo com protocolos correntes conhecidos do especialista (ver também abaixo). A proteína de fusão compreende, consiste preferencialmente de um modo essencial de, (a) o polipéptido VK0RC1 como definido acima, preferencialmente de acordo com a SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25, 27, ou um polipéptido codificado pelo ácido nucleico de VK0RC1, preferencialmente um ácido 24 nucleico de acordo com a SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 2 6, 28 e; (b) uma parte heteróloga.
Isto envolve proteínas de fusão que contêm o polipéptido VK0RC1 descrito acima, sendo as próprias proteínas de fusão já ativas ou tornando-se apenas ativas depois de ter sido eliminada a parte heteróloga. Para esta finalidade, a parte heteróloga pode compreender ainda um péptido dissociável por uma protéase. A parte heteróloga pode ser um composto proteico, um péptido ou um composto diferente. Estas proteínas de fusão incluem, em particular, proteínas de fusão possuindo um teor de cerca de 1-300, preferencialmente de cerca de 1-200, de um modo particularmente preferido de cerca de 1-150, em particular de cerca de 1-100, especialmente de cerca de 1-50 aminoácidos estranhos que constituem a parte heteróloga. A parte heteróloga pode estar localizada na extremidade N-terminal, C-terminal e/ou internamente em relação ao polipéptido VK0RC1. Exemplos dessas sequências peptídicas são sequências peptídicas procariotas que podem ser provenientes, por exemplo, da galactosidase de E. coli.
Outros exemplos preferidos de sequências peptídicas para proteínas de fusão são péptidos que facilitam a deteção da proteína de fusão; exemplos destes são a proteína fluorescente verde ou seus derivados funcionais. Também se pode adicionar pelo menos mais uma "etiqueta polipeptídica," por exemplo, para o propósito de purificar os polipéptidos VKORC1 anteriormente descritos. Por exemplo, as etiquetas proteicas adequadas permitem que as proteínas de fusão que vão ser purificadas sejam absorvidas com afinidade alta para uma matriz. Isto é depois seguido, 25 por exemplo, de lavagem rigorosa com tampões adequados sem eluir as proteínas de fusão em qualquer extensão significativa e, subsequentemente, eluição específica das proteínas de fusão. Exemplos de etiquetas proteicas que são conhecidas do especialista são uma etiqueta (His)6, uma etiqueta Myc, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de hemaglutinina, uma etiqueta de glutationa-transferase (GST), inteína possuindo uma etiqueta de ligação de quitina por afinidade e uma etiqueta proteica de ligação de maltose (MBP) . Estas etiquetas proteicas podem ser localizadas em posição N-terminal, C-terminal e/ou internamente em relação ao polipéptido VK0RC1. As proteínas de fusão são, por exemplo, úteis para a produção de VK0RC1 e isolamento subsequente. Além disso, as proteínas de fusão podem ser utilizadas para detetar a localização do produto de expressão na célula ou no organismo. É divulgado o vetor compreendendo um ácido nucleico de VK0RC1 como definido acima, preferencialmente o ácido nucleico de VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 2. Preferencialmente, o vetor é um vetor de expressão. A fim de permitir que os ácidos nucleicos de VK0RC1 sejam utilizados de acordo com a presente invenção, eles podem ser introduzidos numa célula eucariota ou procariota por meio de transfeção, transformação ou infeção, e desse modo permitir que o polipéptido seja expressado. 0 ácido nucleico de VK0RC1 pode estar presente como um plasmídeo, ou como uma parte de um vetor virai ou não virai. Os vetores virais particularmente adequados a este respeito são: baculovírus, vírus de vaccinia, adenovírus, vírus adeno-associados e vírus herpes. Os vetores não virais particularmente adequados são por exemplo: virossomas, lipossomas, lípidos catiónicos e ADN conjugado com 26 polilisina. Os vetores podem ser vetores de expressão procariotas ou eucariotas. Exemplos de vetores de expressão procariotas são os vetores pGEM ou derivados de pUC, os quais são utilizados para expressão em E. coli, e exemplos de vetores de expressão eucariotas são os vetores p426Met25 ou p426GALl (Mumberg et al., 1994) os quais são utilizados para expressão em Saccharamyces cerevisiae, os vetores de Baculovírus, como divulgados em EP BI 0 127 839 ou EP BI 0 549 721, os quais são utilizados para expressão em células de inseto, e os vetores Rc/CMV e Rc/RSV, ou vetores de SV40, os quais são utilizados para expressão em células de mamíferos, encontrando-se todos estes vetores geralmente disponíveis. Em geral, os vetores de expressão também contêm promotores os quais são adequados para a respetiva célula, como o promotor trp promotor para expressão em E. coli (ver, por exemplo, EP-B1-0 154 133) , o promotor Met 25, GAL 1 ou ADH2 para expressão em leveduras (Russel et al, 1983; Mumberg, ver acima), e o promotor poliedrina de baculovírus para expressão em células de inseto (ver, por exemplo, EP BI 0127 839) .
Os promotores que permitem a expressão constitutiva, regulável, específica em relação ao tecido, específica em relação ao tipo de célula, específica em relação ao ciclo celular ou específica em relação ao metabolismo em células eucariotas são adequados, por exemplo, para expressão em células de mamíferos. Os elementos reguláveis de acordo com a presente invenção são promotores, sequências ativadoras, intensificadoras, silenciadoras e/ou repressoras. Exemplos de elementos reguláveis preferidos que permitem a expressão constitutiva em eucariotas são promotores que são reconhecidos pela ARN-polimerase III ou promotores virais, intensificador de CMV, promotor de CMV, promotor de SV40 ou 27 promotores de LTR, por exemplo derivados de MMTV (virus do tumor mamário de rato; Lee et ai., 1981) e outras sequências promotoras e ativadoras virais que são derivadas, por exemplo, de HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV ou HIV. Exemplos de elementos reguláveis que permitem a expressão indutivel em eucariotas são o operador de tetraciclinas em associação com um repressor apropriado (Gossen et ai., 1994) . A expressão de ácidos nucleicos de VK0RC1 ocorre preferencialmente sob o controlo de promotores específicos em relação ao tecido. Os vetores de expressão podem ser utilizados para preparar polipéptidos VK0RC1, sondas de ADN ou ARN, ou ARNsi ou ARNsh.
Noutro aspeto do presente pedido, o vetor é uma construção de gene anulado. A construção de tais construções e os métodos de construção de animais de gene anulado são conhecidos do especialista na técnica, por exemplo, a partir das patentes US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 e US 5,750,825. Tais vetores são, por exemplo, úteis para gerar células e animais de gene anulado, os quais podem por sua vez ser utilizados para identificar distúrbios e doenças associadas com atividade VKORC1 insuficiente. "Atividade VKORC1 insuficiente" como aqui utilizada refere-se a um nível de atividade e/ou expressão da proteína VKORC1 que é inferior ao nível de atividade do controlo (como definida acima) e/ou à expressão determinada num indivíduo saudável; os respetivos níveis de atividade também podem ser determinados com base no ensaio como descrito no Exemplo 7. 28 A célula hospedeira, preferencialmente uma célula pluripotente embrionária não humana, contém um dos vetores supramencionados, preferencialmente um vetor de expressão ou uma construção de gene anulado. A célula hospedeira pode ser qualquer célula adequada para expressão de polipéptidos VK0RC1 e/ou ácidos nucleicos de VK0RC1, preferencialmente uma célula HEK293-EBNA. As células podem ser células procariotas ou eucariotas, células heterólogas ou autólogas. Exemplos de células procariotas são E. coli e exemplos de células eucariotas incluem células de hepatócitos primários, células de levedura, por exemplo Saccharomyces cerevisiae ou células de inseto. Mais preferencialmente, a célula hospedeira é uma linhagem de células, por exemplo uma célula COS como células COS-7 ou linhagens de células de hepatócitos como células HepG2. Além disso, a célula hospedeira é preferencialmente uma célula pluripotente embrionária não humana. Os métodos para selecionar e cultivar células hospedeiras e para fazer com que as células hospedeiras expressem um polipéptido são geralmente conhecidos do especialista na técnica. Os processos para a transformação de células e/ou células pluripotentes são também bem conhecidos de um especialista na técnica e incluem, por exemplo, electroporação ou microinjeção. As células hospedeiras podem ser, por exemplo utilizadas em métodos de identificação de derivados de cumarina, na produção de polipéptidos VK0RC1 e ácidos nucleicos de VK0RC1, ARNsis e ARNshs, e para pré-selecionar novos fármacos tais como derivados de cumarina que afetem a atividade e/ou expressão de VK0RC1.
Noutro aspeto, o presente pedido refere-se à disponibilização de um mamífero não humano transgénico contendo uma célula hospedeira como definida acima. Os 29 animais transgénicos, em geral, exibem uma expressão aumentada especifica em relação ao tecido dos polipéptidos VK0RC1 e/ou ácidos nucleicos de VK0RC1 e podem ser utilizados para a análise de distúrbios de coagulação e resistência à varfarina e para o desenvolvimento e avaliação de estratégias terapêuticas de tais distúrbios. Os animais transgénicos podem ser ainda utilizados na produção do polipéptido VK0RC1. 0 polipéptido produzido pelo animal pode estar, por exemplo, enriquecido num fluido corporal do animal.
Além disso, um mamífero não humano transgénico que é transgénico para um polipéptido VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VK0RC1 como definida em pormenor abaixo. Preferencialmente, o animal é transgénico para o polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, e preferencialmente a anormalidade de sequência é selecionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C. Estes animais transgénicos são, por exemplo, úteis (1) para testar derivados de cumarina em relação à resistência à varfarina; (2) para identificar novos derivados de cumarina que são anticoagulantes eficazes em organismos que são resistentes ou menos suscetíveis a tratamento anticoagulante com as cumarinas conhecidas na técnica, como os doentes resistentes à varfarina; e (3) como uma fonte de células que expressam o polipéptido VK0RC1 e/ou ácidos nucleicos de VK0RC1. Além disso, estes animais podem ser utilizados para identificar novos derivados de cumarina.
Os métodos para a preparação de animais transgénicos, em particular de ratos transgénicos, são também conhecidos do 30 especialista na técnica a partir de DE 196 25 049 e US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 e US 5,750,825 e incluem animais transgénicos que podem ser produzidos, por exemplo, por meio de injeção direta de vetores de expressão de acordo com o presente pedido em embriões ou espermatócitos ou por injeção dos vetores de expressão no pronúcleo do óvulo fertilizado ou por meio de transfeção de vetores de expressão em células pluripotentes embrionárias ou por transferência nuclear em células recetoras apropriadas (Polites & Pinkert, 1994; Doetschman, em Pinkert, 1994, supra; Wood em Pinkert, 1994, supra; Monastersky em Pinkert, 1994, supra).
Dentro do significado do termo "deficiência associada a VKORC1" pretende-se incluir um distúrbio ou doença que está associado a resistência à varfarina, isto é o doente apresenta uma suscetibilidade reduzida ou nula ao tratamento com cumarina ou seus derivados, preferencialmente a resistência à varfarina resulta de uma anormalidade de sequência do polipéptido VKORC1. Além do mais, o termo também abrange preferencialmente distúrbios ou doenças associadas a um nivel de atividade e/ou expressão de VKORC1 que difere significativamente da condição em doentes saudáveis, preferencialmente a expressão do polipéptido VK0RC1 e/ou a sua atividade está significativamente reduzida ou anulada, o que pode ser determinado, por exemplo, medindo o tempo de protrombina, por exemplo pelo protocolo do índice internacional normalizado (INR). Esta deficiência associada a VKORC1 pode ser provocada por uma anormalidade de sequência no polipéptido VKORC1 ou ácido nucleico de VKORC1 como descrito em pormenor. Além disso, quando o nível de expressão e/ou atividade do polipéptido VKORC1 ou ácido 31 nucleico de VKORC1 é reduzido ou até completamente anulado, também pode ser insuficiente a carboxilação gama de proteínas dependentes de vitamina K. Assim, neste contexto o termo "deficiência associada a VK0RC1" também abrange doenças e/ou distúrbios selecionados de deficiência de fatores múltiplos familiar, um distúrbio ou doença associada a coagulação sanguínea diminuída, como hemofilia e um distúrbio associado a calcificação vascular diminuída, doenças e/ou distúrbios associadas a carboxilação gama insuficiente de proteínas dependentes de vitamina K.
Também é concebível que o nível de expressão e/ou atividade do polipéptido VK0RC1 esteja aumentada em relação à condição em doentes saudáveis. Tais deficiências, as quais também estão abrangidas pelo termo "deficiência associada a VK0RC1" podem ser provocadas por uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 e/ou no gene correspondente. Além do mais, quando o nível de expressão e/ou atividade do polipéptido VK0RC1 ou ácido nucleico de VK0RC1 está aumentado, a carboxilação gama de proteínas dependentes de vitamina K também pode estar facilitada. Assim, neste contexto o termo "deficiência associada a VK0RC1" pode ainda compreender deficiências selecionadas de doenças ou distúrbios associados a coagulação sanguínea aumentada incluindo doentes que sofrem de um trombo e/ou doentes possuindo um maior risco de desenvolver um trombo, preferencialmente devido a uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 ou no seu gene, doenças e/ou distúrbios associados a carboxilação gama aumentada de proteínas dependentes de vitamina K.
Também é possível que uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 e/ou no gene correspondente possa 32 aumentar a suscetibilidade ao tratamento com cumarina e seus derivados num doente possuindo tal anormalidade de sequência. Como consequência os doentes submetidos a tratamento com cumarina podem exibir valores de coagulação sanguínea muito baixos. Tais distúrbios associados a uma maior suscetibilidade ao tratamento com cumarina também estão abrangidos pelo termo "deficiência associada a VK0RC1". Os doentes portadores de um gene de VK0RC1 possuindo uma mutação de paragem sofrem de uma tal deficiência associada a uma maior sensibilidade à cumarina. A sonda de ADN ou ARN é dirigida contra o ácido nucleico de VK0RC1 como definido acima, preferencialmente contra o ácido nucleico de VK0RC1 selecionado de acordo com a SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28. A sonda é uma molécula de ácido nucleico que permite a deteção de um ácido nucleico de VK0RC1 que é dirigido contra a mesma. A sonda tem uma sequência que hibridiza com a sequência alvo, isto é o ácido nucleico de VK0RC1. Preferencialmente, a sonda permite a deteção específica do ácido nucleico de VK0RC1, isto é pelo menos em condições em rigorosas ela não se liga a outras moléculas que não o ácido nucleico de VK0RC1 específico. Por exemplo, as sondas adequadas são fragmentos de ADN ou ARN possuindo um comprimento de cerca de 10 até cerca de 492 nucleótidos, preferencialmente possuindo um comprimento de cerca de 10 até cerca de 400 nucleótidos, preferencialmente de cerca de 10 até cerca de 250 nucleótidos, em particular possuindo um comprimento de cerca de 10 até cerca de 150 nucleótidos, em particular possuindo o comprimento total da sequência de codificação, sequência essa que pode ser derivada dos polipéptidos VKORC1, preferencialmente selecionado do polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27 ou tomado 33 diretamente do ácido nucleico de VK0RC1, preferencialmente selecionado de SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28. As sondas podem conter adicionalmente uma etiqueta adequada para deteção direta ou indireta como a biotina, uma etiqueta fluorescente como a fluoresceina ou uma etiqueta radioativa como [H]3 ou outras etiquetas conhecidas do especialista. A deteção pode ser realizada por métodos geralmente conhecidos do especialista, incluindo transferência de Northern e técnicas de transferência de bibliotecas de ADNc. A construção das sondas de acordo com a presente invenção também é conhecida do especialista (cf. construção de ácido nucleicos descrita acima). Tais sondas podem ser utilizadas, por exemplo, para efeitos de diagnóstico e podem compreender ou consistir preferencialmente das sondas adequadas para a deteção de uma anormalidade de sequência, tais como as selecionadas das sequências de acordo com a SEQ ID No. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14 e 94. 0 iniciador de PCR, preferencialmente um conjunto de pelo menos dois iniciadores de PCR, é dirigido contra o ácido nucleico de VK0RC1, preferencialmente o ácido nucleico de VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28. Os iniciadores adequados são, por exemplo, os fragmentos de ADN possuindo um comprimento de cerca de 10 até cerca de 100 nucleótidos, preferencialmente possuindo um comprimento de cerca de 15 até cerca de 50 nucleótidos, em particular possuindo um comprimento de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, preferencialmente cerca de 30 nucleótidos. A conceção e síntese de tais iniciadores é geralmente conhecida do especialista na técnica. Os iniciadores podem conter adicionalmente sítios de restrição, por exemplo adequados para integração da sequência amplificada em vetores, ou outros adaptadores ou 34 sequências suspensas, por exemplo, possuindo uma etiqueta como descrita na secção precedente. Por exemplo, pode-se preparar um diagnóstico com base na reação em cadeia da polimérase (PCR), adequado para deteção de anormalidades da sequência de VK0RC1, preferencialmente com base no ensaio descrito no Exemplo 9 (ARMS PCR).
Se a quantidade de VK0RC1 expressada for para ser determinada, serão utilizados iniciadores de PCR específicos para o ácido nucleico de VK0RC1 para fins de diagnóstico ou terapêutico. Para este fim pode ser efetuada a técnica de RT-PCR, preferencialmente RT-PCR quantitativa, em que após isolamento do ARN total ou ARNm da amostra, o ARN é transcrito de modo inverso em ADNc e subsequentemente submetido a uma reação de PCR utilizando os iniciadores específicos como definidos acima. Esta técnica é bem conhecida do especialista. Isto abre uma nova possibilidade para obter os ácidos nucleicos de VK0RC1 descritos, por exemplo, por isolamento de um gene ou biblioteca de ADNc adequado, por exemplo, a partir de um banco de genes específico para o fígado ou distúrbios hepáticos, com a ajuda de um iniciador adequado. Um conjunto preferido de iniciadores de PCR e as condições para isolar um ácido nucleico de VK0RC1 são proporcionados no Exemplo 5. Exemplos de iniciadores de PCR preferidos contra a SEQ ID No. 2, são os iniciadores de acordo com a SEQ ID No. 53-70 e as condições preferidas para utilizar estes iniciadores de PCR são proporcionadas na Figura 8. O termo "amostra" pretende referir um biomaterial compreendendo tecido ou células fetais ou adultas, preferencialmente tecido ou células, preferencialmente isolados ou provenientes de coração, rim e pulmão, 35 pâncreas, cérebro, placenta e músculo-esquelético e sangue, preferencialmente de fígado. A amostra pode ser isolada de um doente ou de outro indivíduo por meio de métodos incluindo métodos invasivos e não invasivos. Os métodos invasivos são geralmente conhecidos do especialista e compreendem, por exemplo, isolamento da amostra por meio de punção, remoção cirúrgica da amostra do corpo aberto ou por meio de instrumentos endoscópicos. Os métodos minimamente invasivos e não invasivos também são conhecidos do especialista na técnica e incluem, por exemplo, colheita de fluidos corporais como sangue, preferencialmente por venopunctura, ou urina ou fezes. 0 termo "amostra" também pode abranger uma biblioteca genómica ou uma biblioteca de expressão, preferencialmente construída com base numa amostra isolada de um doente, em cujo caso podem ser utilizadas técnicas de isolamento de ADNc que são geralmente conhecidas do especialista. A molécula de ARN interferente pequena (ARNsi) e/ou o ARN de gancho curto (ARNsh) é dirigido contra o ácido nucleico de VK0RC1, preferencialmente contra uma sequência derivada da SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27 ou um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28, o que permite diminuir a estabilidade do ácido nucleico de VK0RC1 e/ou inibir a tradução do ácido nucleico de VK0RC1 numa cultura de células ou in vivo. Os ARNsi de cadeia dupla medeia o silenciamento pós-tradução, específico em relação à sequência da expressão de um gene pelo ARN de cadeia dupla. Os ARNsi têm uma estrutura muito específica: ARNs de cadeia dupla com 17 a 25, preferencialmente 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleótidos com extremidades 3' de 2 nucleótidos suspensas. Os ARNsi são geralmente derivados de moléculas mais compridas de ARN de cadeia dupla por 36 dissociação enzimática, mas os ARNsi também podem ser química ou enzimaticamente sintetizados fora das células e em seguida fornecidos às células (por exemplo, por transfeção). Assim, utilizando ARNsi ou ARNsh, a expressão dos correspondentes genes nas células pode ser diminuída ou até mesmo silenciada tanto in vitro como in vivo (McManus et al. 2002). Os ARNsh consistem de uma primeira porção de eixo compreendendo (I) uma sequência de pelo menos 18, preferencialmente pelo menos 19, mas preferencialmente pelo menos 20 nucleótidos, que é complementar à sequência de ARNm de um ácido nucleico de VKORC1, preferencialmente uma sequência complementar à SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28/ e (II) uma segunda porção de eixo compreendendo uma sequência de pelo menos 18, preferencialmente pelo menos 19, mais preferencialmente pelo menos 20 nucleótidos que é suficientemente complementar à primeira porção de eixo para hibridizar com a primeira porção de eixo para formar um eixo de cadeia dupla; e (III) uma porção em ansa que liga as duas porções de eixo. A porção de ansa pode compreender pelo menos 4, preferencialmente pelo menos 7, mais preferencialmente pelo menos 11 nucleótidos. Os ARNsi ou ARNsh também podem ser incluídos num vetor permitindo a expressão constitutiva do ARNsi ou ARNsh na célula hospedeira após transformação da célula hospedeira (cf. WO 03/006477). As estratégias para a conceção de sequências de ARNsi ou ARNsh e os métodos de construção e produção destas moléculas são geralmente conhecidos do especialista na técnica (cf. McManus e tal., supra). As moléculas de ARNsi e ARNsh como definidas acima são úteis, por exemplo, para regulação terapêutica da expressão do gene de VKORC1 e para inclusão em métodos para identificar derivados de cumarina, por exemplo como um controlo positivo da ação da cumarina. Os exemplos preferidos de sequências de ARNsi são listados 37 na Figura 6 e 7 e são selecionados das SEQ ID No. 29, 20, 33, 34, 37, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 50. A Figura 6 também proporciona os respetivos iniciadores a jusante destas moléculas de ARNsi, os quais podem ser utilizados para integrar em vetores para que o ARNsi possa ser expressado numa célula visada para expressão de ARNsi.
Como uma abordagem alternativa para silenciar a atividade e/ou expressão de VKORC1, o presente pedido proporciona oligonucleótidos antimensageiros dirigidos contra o ácido nucleico de VKORCl como definido acima, preferencialmente de acordo com a SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28, preferencialmente contra uma sequência derivada da SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27 (Zheng & Kemeny, 1995; Nellen & Lichtenstein, 1993).
Noutro aspeto, um aptâmero de ARN é dirigido contra um polipéptido VKORCl, preferencialmente contra uma sequência de acordo com a SEQ ID No. 1, aptâmero de ARN esse que exerce um efeito na atividade do polipéptido VKORCl. Os aptâmeros de ARN são agonistas ou antagonistas eficazes de proteínas que são visadas pelos aptâmeros, como foi demonstrado para o fator de coagulação IXa (Rusconi et al. 2002) . Um aptâmero como definido acima pode ser utilizado como um anticoagulante através da redução da atividade de VKORCl de uma maneira mais fina do que as cumarinas. Para testar os aptâmeros, estes podem ser adicionados a uma reação de VKORCl e analisados por HPLC como descrito no Exemplo 7.
Noutro aspeto, um anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um polipéptido de VKORCl como definido acima, preferencialmente um polipéptido de VKORCl de acordo 38 com a SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, ou um fragmento do anticorpo. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal ou policlonal especifico para os polipéptidos de VK0RC1. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo é produzido de acordo com métodos geralmente conhecidos do especialista na técnica imunizando um mamífero, por exemplo um coelho, com um ácido nucleico de VK0RC1 ou com um polipéptido de VK0RC1 como definido acima, ou partes destes possuindo pelo menos 6 aminoácidos de comprimento, preferencialmente possuindo pelo menos 8 aminoácidos de comprimento, em particular possuindo pelo menos 12 aminoácidos de comprimento, se apropriado na presença de, por exemplo, adjuvante de Freund e/ou geles de hidróxido de alumínio (ver, por exemplo, Harlow & Lane, 1998) . Os anticorpos policlonais formados no animal em consequência da reação imunológica podem ser depois facilmente isolados do sangue de acordo com métodos geralmente conhecidos e purificados, por exemplo, por meio de cromatografia em coluna. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos, por exemplo, de acordo com o método conhecido de Winter & Milstein (1991). Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para o diagnóstico de deficiências associadas a VK0RC1. Além disso, os anticorpos podem ser úteis para elucidar interações cumarina-VKORCl. Finalmente, os anticorpos podem ser utilizados para isolar e/ou purificar um polipétido VK0RC1 a partir de uma amostra de tecido ou células isolada de um doente.
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" ou "fragmento de anticorpo" é entendido como significando também anticorpos ou partes destes de ligação ao antigénio preparados por manipulação genética e opcionalmente modificados, tal como, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, 39 anticorpos multifuncionais, anticorpos bi- ou
oligoespecificos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos F(ab) ou F(ab)2 (ver, por exemplo, EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).
Noutro aspeto, o presente pedido proporciona um método de identificação de um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VKORC1 como definido acima, preferencialmente o polipéptido VK0RC1 possuindo a sequência selecionada de SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, compreende os passos de: (I) proporcionar uma célula hospedeira onde foi introduzido um ácido nucleico de VKORC1 ou um vetor contendo o ácido nucleico de VKORC1; (II) expressar o polipéptido VKORC1 na célula hospedeira; (III) administrar um derivado de cumarina candidato; (IV) determinar a atividade de polipéptido VKORC1 (valor de atividade do candidato); (V) comparar o valor de atividade do candidato com um valor de atividade de controlo; e (VI) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VKORC1, desde que o valor de atividade do candidato seja significativamente diferente do valor de atividade do controlo. A atividade determinada do polipéptido VKORC1 é a conversão dependente de ditiotreitol de 2,3-epóxido de vitamina K em vitamina K quinona e em que o valor de atividade significativamente diferente é um valor de atividade do 40 candidato que é significativamente maior do que o valor de atividade do controlo, como descrito em mais pormenor acima e no Exemplo 7 e Figura 10. Se essencialmente a mesma concentração de derivado de cumarina candidato produz uma menor percentagem de conversão de epóxido de vitamina K em vitamina K quinona (produto/substrato+produto) que a varfarina a essa concentração, isto é indiciador de o derivado de cumarina candidato possuindo um efeito inibidor mais forte do que a varfarina, e vice-versa.
Preferencialmente no método de identificação de um derivado de cumarina como definido acima, o valor da atividade de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (A) proporcionar uma célula hospedeira de acordo com o passo (I); (B) expressar o polipéptido VKORC1 na célula hospedeira; e (C) determinar a atividade do polipéptido VKORC1 (valor de atividade de controlo).
Ainda mais preferencialmente no método de identificação de um derivado de cumarina como definido acima é introduzido pelo menos um composto adicional na célula hospedeira, composto esse que é selecionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5, um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epóxido-hidrolase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase. Os métodos para introduzir ácidos nucleicos em células hospedeiras foram descritos em pormenor acima. Preferencialmente, os ácidos nucleicos são expressados sob o controlo de um promotor constitutivamente ativo ou um promotor que pode ser especificamente ativado na célula hospedeira escolhida. 41
Os métodos de identificação de um derivado de cumarina são úteis para desenvolver novos derivados de cumarina que evitem pelo menos uma das limitações da cumarina e dos seus derivados, conhecidas na técnica. Se a análise da cinética de coagulação sanguínea estiver incluída como um ensaio separado na determinação da atividade do polipéptido VK0RC1, o método como definido acima pode ser útil na identificação de derivados de cumarina que medeiam a coagulação sanguínea de modo mais rápido do que a cumarina e seus derivados conhecidos na técnica e/ou que são metabolizados mais rapidamente pelo que pode ser evitada ou melhorada a acumulação de cumarina e seus derivados e, consequentemente, é substancialmente diminuído ou até mesmo eliminado o perigo de sobredosagem. Além do mais, esse método de identificação pode ser combinado com outros ensaios para que possam ser identificados derivados de cumarina que têm um efeito mais forte (fraco) na atividade VK0RC1 e assim, por sua vez, na coagulação sanguínea e derivados de cumarina esses que demonstrem em ensaios independentes que (1) são metabolizados mais rapidamente pelo que pode ser evitada ou melhorada a acumulação de cumarina e, consequentemente, é substancialmente reduzido ou mesmo eliminado o perigo de sobredosagem, (2) não provocam ou provocam em menor grau necrose cutânea em doentes ou embriopatia se aplicados durante a gravidez e/ou (3) são metabolizados mais rapidamente ou são menos estáveis e/ou são menos afetados por outros fármacos como Fenobarbital ou amiodarona. Os ensaios que são adequados para examinar tais propriedades dos derivados de cumarina e os quais são combinados numa triagem com o método de identificação de um derivado de cumarina como definido acima são geralmente conhecidos do especialista na técnica. 42 0 termo "cumarina" é entendido como significando 3-(acetonilbenzil)-4-hidroxicumarina, isto é COUMADIN® ou varfarina sódica. 0 termo "derivado de cumarina" é entendido como abrangendo compostos orgânicos ou inorgânicos, péptidos, polipéptidos ou complexos destes, desde que eles exerçam um efeito na atividade e/ou expressão do polipéptido VK0RC1, preferencialmente um efeito que inibe a atividade do polipéptido VK0RC1, ainda mais preferencialmente um efeito especifico para o polipéptido VK0RC1, isto é o derivado de cumarina não interage diretamente com outras moléculas envolvidas na via de coagulação. Exemplos de tais compostos são moléculas orgânicas que são provenientes de bibliotecas de compostos, preferencialmente aquelas que foram analisadas quanto à sua atividade farmacológica. Por causa da sua interação, os derivados de cumarina podem influenciar a atividade do polipéptido VK0RC1 in vivo e/ou in vitro e entrar em interações de maneira covalente ou não covalente com o mesmo. Se o derivado de cumarina é um composto quiral entender-se-á que o "derivado de cumarina" também abrange as respetivas formas enantioméricas R e L do composto como aquelas divulgadas em WO 00/43003. Em particular, o termo "derivado de cumarina" refere-se a compostos derivados de 4-hidroxicumarina, especialmente compostos derivados de COUMADIN. Mais preferencialmente, "derivado de cumarina" também inclui quaisquer coagulantes que inibam a regeneração de vitamina K ativa. O termo "derivado de cumarina candidato" é entendido como abrangendo compostos orgânicos ou inorgânicos, péptidos, polipéptidos ou complexos. Exemplos de tais compostos são 43 moléculas orgânicas que são derivadas de bibliotecas de compostos, preferencialmente aquelas que foram analisadas quanto à sua atividade farmacológica. Preferencialmente, o termo refere-se a compostos que são estruturalmente relacionados ou derivados de 4-hidroxicumarina, especialmente compostos relacionados ou derivados de COUMADIN. Se o derivado de cumarina candidato é um composto quiral entender-se-á que as respetivas formas enantioméricas R e L do composto, como aquelas divulgadas em WO 00/43003, também estão abrangidas pelo termo "derivado de cumarina candidato". O método de determinação de uma sequência de um polipéptido VKORC1 que confere um efeito de cumarina exercido sobre a atividade VKORC1, compreende os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa o polipéptido VKORC1 como definido acima, preferencialmente um polipéptido de acordo com as SEQ ID NO. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, polipéptido VKORCl esse que tem pelo menos uma anormalidade de sequência, preferencialmente uma anormalidade de sequência selecionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C; (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a atividade do polipéptido VKORCl (valor de atividade da anormalidade de sequência); e (FV) comparar o valor de atividade da anormalidade de sequência com o valor de atividade da sequência de controlo, em que um desvio significativo do valor de atividade da anormalidade de sequência do valor de atividade da sequência de controlo é revelador que a anormalidade de 44 sequência do polipéptido VK0RC1 confere o efeito de cumarina exercido sobre o polipéptido VK0RC1. A atividade do polipéptido VK0RC1 pode ser determinada como descrito em pormenor acima.
Mais preferencialmente, no método de determinação de uma sequência de um polipéptido VK0RC1, o valor de atividade da sequência de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa um polipéptido VK0RC1, preferencialmente um polipéptido de acordo com as SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27; (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a atividade do polipéptido VK0RC1 (valor de atividade da sequência de controlo). A atividade VK0RC1 determinada é a conversão dependente de ditiotreitol de 2,3-epóxido de vitamina K em vitamina K quinona e o valor significativamente diferente é um valor de atividade de anormalidade da sequência que é significativamente maior do que valor de atividade da sequência de controlo. Mais pormenores são proporcionados acima e no Exemplo 7 e Figura 10. O método pode ser útil na identificação de polipéptidos VK0RC1 que são menos sensíveis às cumarinas. Ao introduzir polipéptidos VKORC1 com anormalidades de sequência diferentes este método permite a identificação de sítios do polipéptido que são críticos para a interação de uma cumarina e VKORCl testados. Esse conhecimento será, por exemplo, útil para conceber novas cumarinas. 45 É particularmente preferido que no método de determinação de uma sequência de um polipéptido VK0RC1 seja introduzido pelo menos um composto adicional na célula, composto esse que é selecionado do qrupo consistindo de vitamina K, citocromo B5, e um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epóxido-hidrolase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase. 0 polipéptido VK0RC1 como definido acima, preferencialmente o polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1, contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VK0RC1. Mais preferencialmente, o polipéptido VK0RC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 e a anormalidade de sequência é selecionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C. Noutro aspeto, o pedido refere-se ao polipéptido VK0RC1 de Rattus norvegicus de acordo com a SEQ ID No. 12 que tem uma anormalidade de sequência, preferencialmente a anormalidade de sequência Y139C (416A>G). Outro aspeto do pedido refere-se a um ácido nucleico de Rattus norvegicus que codifica o polipéptido VK0RC1 de Rattus norvegicus de acordo com a SEQ ID No. 12 que tem uma anormalidade de sequência, preferencialmente o ácido nucleico de VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 12 que tem uma anormalidade de sequência, preferencialmente a anormalidade de sequência 416A>G. A sequência de ácido nucleico de VK0RC1 contendo a anormalidade 416A>G é a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID No. 14.
Um tal polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência pode ser gerado por métodos geralmente conhecidos do especialista, incluindo técnicas recombinantes e, por exemplo, mutagénese especifica de um 46 locus, ou por isolamento do polipéptido VK0RC1 possuindo a pelo menos uma anormalidade de sequência a partir de uma amostra obtida de um doente, preferencialmente de um doente que sofre de deficiências associadas a VK0RC1. Os métodos para isolar proteínas de uma amostra foram descritos em pormenor acima. 0 polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VK0RC1 pode ser, por exemplo, utilizado para gerar anticorpos que se ligam especificamente a estes polipéptidos VK0RC1. Por sua vez, estes anticorpos podem ser utilizados para diagnosticar deficiências associadas a VK0RC1. 0 termo "anormalidade de sequência" pretende abranger adições, inserções, supressões, substituições de pelo menos um aminoácido que resultem numa alteração da sequência do polipéptido VK0RC1, preferencialmente da sequência do polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1. Também são abrangidas adições, inserções, supressões, substituições de pelo menos um nucleótido que conduzam a uma sequência de aminoácidos alterada codificada pela sequência de ácido nucleico de VK0RC1. Também são abrangidas alterações da sequência do ácido nucleico de VK0RC1 que conduzam a uma alteração na grelha de leitura da sequência de ácido nucleico.
As anormalidades de sequência são indicadas pelo código de uma letra de aminoácidos em que o aminoácido original está colocado à esquerda do número que indica o número do aminoácido na sequência polipeptidica de acordo com a SEQ ID No. 1. 0 número à direita do número do aminoácido indica 47 o aminoácido que substitui o aminoácido original. Por exemplo, a anormalidade de sequência V29L indica que na posição 29 do polipéptido VK0RC1 de SEQ ID No. 1, o aminoácido valina (V) foi substituído por leucina (L) . No caso da anormalidade de sequência ocorrer num polipéptido VK0RC1 que não o polipéptido VK0RC1 de SEQ ID No. 1, o número no código refere-se à posição na sequência de acordo com a numeração dos aminoácidos nesse outro polipéptido particular.
Noutro aspeto, o presente pedido proporciona um ácido nucleico de VK0RC1 selecionado do grupo consistindo de: (a) um ácido nucleico que codifica um polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, o qual exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VK0RC1, em que o polipéptido VK0RC1 é preferencialmente o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 e a anormalidade de sequência é selecionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C; (b) uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com a SEQ ID No. 3, 4, 5, 6 e 7, 14 e 94; e (c) uma sequência de ácido nucleico a qual, exceto para a degeneração do código genético, hibridaria com o ácido nucleico definido em (a) ou (b) e sequência de ácido nucleico essa que codifica o polipéptido contendo pelo menos uma anormalidade de sequência como definida acima.
Estes ácidos nucleicos são, por exemplo, úteis para isolar polipéptidos VK0RC1 e ácidos nucleicos possuindo essa 48 anormalidade de sequência, para produzir sondas de ADN e/ou ARN, para produzir anticorpos, para a construção de animais transgénicos e animais de gene anulado, e para inclusão em rastreios de identificação de derivados de cumarina. 0 vetor contém o ácido nucleico de VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência como definida acima. Tais vetores podem ser selecionados a partir dos vetores descritos em pormenor acima. Os métodos de construção desses vetores também são descritos em pormenor acima. Por exemplo, tais vetores são úteis para preparar as sondas descritas no parágrafo seguinte, especialmente no contexto diagnóstico. A sonda de ADN ou ARN dirigida contra o ácido nucleico de VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência como definida acima, preferencialmente uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID No. 3, 4, 5, e 7, 14 e 94. Os métodos de conceção e produção de tais sondas de ADN e ARN foram descritos em mais detalhe acima. Por exemplo, tais sondas são úteis para detetar anormalidades de sequência no gene de VK0RC1 numa biblioteca de genes, numa biblioteca de expressão ou numa amostra isolada de um doente, por exemplo no contexto de diagnóstico de deficiências associadas a VK0RC1 e para a mutagénese especifica de um locus para produzir ácidos nucleicos de VK0RC1 contendo uma anormalidade de sequência. As técnicas para rastrear bibliotecas são geralmente conhecidas do especialista. 0 iniciador de PCR dirigido contra o ácido nucleico de VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência como definida acima. Os iniciadores de PCR preferidos para 49 detetar a anormalidade de sequência Y139C (416A>G) são os iniciadores de acordo com as SEQ ID No. 88 a 91 (ver Exemplo 9) . É geralmente conhecido do especialista o modo de conceção dos iniciadores de PCR para que possam ser utilizados para detetar outras anormalidades de sequência tais como as mencionadas acima (V29L, V45A, R58G, R98W, L128R) para os efeitos da invenção. Os métodos de conceção e produção de tais iniciadores de PCR, as técnicas para realizar a amplificação por PCR foram descritas em mais pormenor acima, sendo a diferença principal que os iniciadores têm de ser concebidos de modo a que sejam especificamente amplificadas apenas as sequências que contêm a anormalidade de sequência, enquanto as sequências de ácidos nucleicos de VK0RC1 nativos e outros ácidos nucleicos de VK0RC1 que não contêm a anormalidade de sequência, tal como o ácido nucleico de VK0RC1 de SEQ ID No. 2, permanece por detetar. Tais iniciadores são úteis, por exemplo, para detetar anormalidades de sequência no gene de VKORC1 numa biblioteca de genes, numa biblioteca de expressão ou numa amostra isolada de um doente, por exemplo, no contexto do diagnóstico de deficiências associadas a VK0RC1. As técnicas para rastrear bibliotecas são geralmente conhecidas do especialista.
Num outro aspeto, o presente pedido refere-se a um anticorpo que reconhece e liga especificamente o polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência como definida acima, sendo o polipéptido VK0RC1 preferencialmente o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 e sendo a anormalidade de sequência selecionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C, ou um fragmento do anticorpo. Os tipos de anticorpo abrangidos, os métodos de construção e produção de tais anticorpos e 50 seus fragmentos foram descritos em mais pormenor acima. Por exemplo, tais anticorpos são úteis para a deteção e isolamento de um polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência como definida acima, especialmente no contexto do diagnóstico de deficiências associadas a VKORC1 e para a deteção de resistência à varfarina em humanos e roedores tais como ratazanas.
Diagnóstico compreende um composto selecionado do grupo consistindo do ácido nucleico de VKORC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, preferencialmente pelo menos uma anormalidade de sequência selecionada de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C; a sonda de ADN ou ARN dirigida contra o ácido nucleico de VKORC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, o iniciador de PCR dirigido contra o ácido nucleico de VKORC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência e um anticorpo dirigido contra o polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência; os quais foram todos definidos acima. No caso da deficiência associada a VK0RC1 ser devida ou estar correlacionada com a anormalidade de sequência, é o principio do diagnóstico ser utilizado para a deteção dessa anormalidade de sequência numa sonda obtida de um doente. Os métodos adequados para utilizar o diagnóstico como definido acima são mencionados mais abaixo. Opcionalmente, o diagnóstico compreende ainda um aditivo e/ou auxiliar farmaceuticamente aceitável. Um tal diagnóstico é útil para diagnosticar deficiências associadas a VK0RC1 especialmente a resistência à varfarina.
Se, por outro lado, a deficiência associada a VK0RC1 for para ser diagnosticada com base na deteção do nivel de expressão do ARNm de VK0RC1, ADNc de VKORC1 ou polipéptido 51 VKORCl na amostra, tais níveis de expressão podem ser determinados por métodos geralmente conhecidos do especialista na técnica. Exemplos de tais métodos para detetar a presença de um ARNm de VKORCl incluem a análise por transferência (Northern) de ARN, proteção de nuclease, hibridização in situ, PCR de transcriptase inversa (RT-PCR; incluindo RT-PCR cinética quantitativa). Micromatrizes de ADNc e oligonucleótidos também são incluídas em tais métodos. Uma biblioteca de expressão derivada de um doente também pode ser rastreada para efeitos de diagnóstico utilizando técnicas geralmente conhecidas do especialista. A presença do polipéptido VKORCl também pode ser determinada por métodos geralmente conhecidos do especialista, alguns dos quais são descritos abaixo. Opcionalmente, o diagnóstico compreende ainda um aditivo e/ou auxiliar farmaceuticamente aceitável.
Como aqui utilizado, "aditivo" e "auxiliar" não estão particularmente restringidos e são geralmente conhecidos do especialista na técnica e compreendem, por exemplo, soro fisiológico, água desmineralizada, reagentes estabilizadores de proteínas à base de gelatina ou glicerol. Alternativamente, os ácidos nucleicos de VKORCl, sondas, iniciadores ou polipéptido de acordo com a presente invenção podem ser liofilizados para efeitos de estabilização. 0 método de diagnóstico de uma deficiência associada a VKORCl num doente compreende os passos de: (I) amplificar uma amostra de ADN obtida do doente ou transcrever inversamente uma amostra de ARN obtida do doente num ADN e amplificar o ADN; e 52 (II) analisar o ADN amplificado do passo (I) para determinar pelo menos uma anormalidade de sequência numa sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido VK0RC1 ou numa sequência de aminoácidos do polipéptido VK0RC1; em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora de que o doente sofre de uma deficiência associada a VK0RC1; preferencialmente resistência à Varfarina; preferencialmente a anormalidade de sequência exerce um efeito sobre a atividade do polipéptido VK0RC1, preferencialmente a anormalidade de sequência é selecionada de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.
Os métodos para obter amostras de um doente e para isolar o ARN total ou ARNm são geralmente conhecidos do especialista, alguns dos quais foram descritos acima. As técnicas para amplificação de ADN não estão particularmente restringidas e incluem técnicas de PCR, as quais também foram descritas acima. Do mesmo modo, as técnicas para transcrição inversa foram mencionadas acima e não estão particularmente restringidas e incluem transcrição inversa utilizando protocolos convencionais e estojos comercialmente disponíveis que geralmente utilizam transcriptase inversa e iniciadores oligo dT. A análise também se pode basear em ADN genómico isolado de uma amostra obtida de um doente.
Após amplificação, o ADN é submetido a análise para determinar pelo menos uma anormalidade de sequência numa sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido VK0RC1. Os métodos para analisar o ADN amplificado não estão particularmente restringidos. Preferencialmente, o ADN amplificado é analisado por uma técnica selecionada do 53 grupo consistindo de análise com base em PCR, utilizando preferencialmente iniciadores de PCR específicos para a anormalidade de sequência, análise por digestão de restrição e análise por sequenciação de ADN. Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico portador de uma anormalidade de sequência codifica uma sequência de VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência selecionada do grupo consistindo de V29L(85 G>T), V45A(134 T>C), R58G (172 A>G) , R98W (292 C>T), e L128R (383 T>G), Y139C (416 A>G) .
Numa forma de realização preferida do método de diagnóstico, o ADN amplificado codifica pelo menos uma sequência parcial do polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1. No exemplo 8 é proporcionada uma maneira de determinar uma anormalidade de sequência que está associada a uma deficiência associada a VK0RC1.
As sequências de VK0RC1 como definidas acima contendo as mutações 85 G>T, 134 T>C, 172 A>G, 292 C>T e 383 T>G são proporcionadas nas SEQ ID Nos. 3 até 7 e podem ser utilizadas como sondas para diagnosticar uma deficiência associada a VK0RC1 utilizando a análise de amostras de ácido nucleico de um doente com base na técnica de hibridização.
Como uma alternativa, a expressão de VK0RC1 pode ser detetada ao nível do polipéptido VK0RC1. Por conseguinte, um método de diagnóstico de uma deficiência associada a VK0RC1 num doente compreende os passos de: (I) proporcionar uma amostra obtida do doente; e (II) detetar um polipéptido VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência na amostra utilizando um anticorpo dirigido contra o polipéptido VK0RC1 54 possuindo uma anormalidade de sequência como definida acima em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora de que o doente sofre de uma deficiência associada a VK0RC1. Preferencialmente a anormalidade de sequência é selecionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.
Os métodos de obtenção de amostras já foram descritos em pormenor. Os métodos para deteção do polipéptido VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência não estão particularmente restringidos, desde que o método permita a deteção especifica da proteína portadora da(s) anormalidade (s) de sequência. Exemplos de tais métodos incluem preferencialmente deteção imuno-histoquímica, imunotransferência, preferencialmente transferência de Western e ELISA do polipéptido, de modo particularmente preferido com anticorpos específicos para o polipéptido VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência como definido acima. A análise de anormalidades de sequência ao nível da sequência de aminoácidos não está particularmente restringida e pode ser, por exemplo, realizada utilizando anticorpos contra VK0RC1 os quais reconhecem e ligam especificamente um polipéptido VK0RC1 possuindo uma ou mais anormalidades de sequência.
Preferencialmente, os métodos de diagnóstico são utilizados para diagnosticar doenças e/ou distúrbios selecionados de resistência à varfarina, deficiência de fatores múltiplos familiar, um distúrbio ou doença associada a coagulação sanguínea reduzida ou nula, como hemofilia e um distúrbio associado a uma calcificação vascular diminuída, doenças 55 e/ou distúrbios associados a carboxilação gama insuficiente de proteínas dependentes de vitamina K.
Além disso, os métodos de diagnóstico também podem ser utilizados para diagnosticar distúrbios e doenças associados a coagulação sanguínea aumentada incluindo doentes e/ou doentes possuindo um maior risco de desenvolver um trombo devido a uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 ou no seu gene, doenças e/ou distúrbios associados a uma maior carboxilação gama de proteínas dependentes de vitamina K.
Noutro aspeto, o presente pedido proporciona um método de identificação de um derivado de cumarina o qual exerce um efeito inibidor sobre a atividade de um polipéptido VK0RC1 possuindo pelo menos uma anormalidade de sequência, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa o polipéptido VK0RC1, preferencialmente um polipéptido codificado por uma sequência selecionada do grupo consistindo de 3, 4, 5, 6, 7, 14 e 94; (II) administrar um derivado de cumarina candidato à célula; (III) determinar a atividade do polipéptido VK0RC1 (valor de atividade da anormalidade de sequência); e (IV) comparar o valor de atividade da anormalidade de sequência com o valor de atividade da sequência de controlo, (V) identificar o derivado de cumarina candidato como o derivado de cumarina que exerce um efeito inibidor sobre a atividade de um polipéptido VK0RC1, se a administração do derivado de cumarina 56 candidato resultar num valor de atividade de anormalidade de sequência é significativamente menor do que valor de atividade da sequência de controlo.
Mais preferencialmente, o valor de atividade da sequência de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa o polipéptido VK0RC1 da reivindicação 1, preferencialmente um polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 ou 12; (II) administrar cumarina à célula; (III) determinar a atividade do polipéptido VK0RC1 (valor de atividade da sequência de controlo). A atividade do polipéptido VK0RC1 pode ser determinada como descrito em pormenor acima. E o método pode ser adaptado do método descrito no Exemplo 7. Um tal método de identificação de um derivado de cumarina é útil para identificar derivados de cumarina que podem ser utilizados como anticoagulantes em doentes com resistência à varfarina.
Noutro aspeto, o presente pedido proporciona um método de identificação de um derivado de cumarina que é toxicologicamente eficaz em roedores resistentes à varfarina compreendendo os passos de: (I) proporcionar um roedor resistente à varfarina; (II) administrar um derivado de cumarina candidato ao roedor; (III) determinar a toxicidade do derivado de cumarina candidato sobre o roedor (valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato); 57 (IV) comparar o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato com um valor de toxicidade de cumarina de controlo; e (V) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina toxicologicamente eficaz, desde que o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato seja significativamente maior do que o valor de toxicidade da cumarina de controlo.
Preferencialmente, o roedor resistente à varfarina é um roedor transgénico para um polipéptido VK0RC1 como definido acima, em que o polipétido VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência que origina resistência à varfarina, preferencialmente um polipéptido codificado pela sequência de acordo com a SEQ ID N°. 14 ou uma ratazana resistente a varfarina comercialmente disponível ou uma ratazana selvagem possuindo resistência à varfarina. Mais preferencialmente, o polipéptido VK0RC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 12 e a anormalidade de sequência é selecionada do grupo consistindo de V29L (85 G>T), V45A (134 T>C) , R58G (172 A>G) , R98W (292 OT) e L128R (383 T>G) e Y139C (416 A>G). A amostra pode ser qualquer órgão, tecido, fluido corporal ou sonda desde que possua ADN genómico ou ARNm da ratazana a ser testada. Preferencialmente, a amostra é sangue, tecido da cauda ou orelha, urina ou fezes. Outros pormenores do método são proporcionados no Exemplo 9.
Roedores resistentes à varfarina foram descritos (Kohn & Pelz, 1999) e podem ser obtidos de fornecedores comerciais (por exemplo Centro de Investigação Biológico Federal para 58 a Agricultura e Silvicultura, Instituto de Nematologia e Investigação de Vertebrados, Toppheideweg 88, 48161 Munster, Alemanha). Num aspeto preferido, o roedor resistente à varfarina é um roedor transgénico para o polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, anormalidade de sequência essa que provoca resistência à varfarina. De um modo mais preferido, o polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência é o polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID Nos. 3 até 7 e 15, e a anormalidade de sequência é selecionada do grupo consistindo de V29L (85 G>T) , V45A(134 T>C) , R58G (172 A>G) , R98W (292 C>T), e L128R (383 T>G), Y139C (416 A>G) . Os métodos para gerar roedores, em particular ratos transgénicos para os polipéptidos VK0RC1 especificados foram descritos acima. A utilização de iniciadores de PCR de acordo com as SEQ ID No. 88 até 91 pode determinar se uma ratazana tem um genótipo de resistência à varfarina numa amostra obtida de uma ratazana. A administração de cumarina e seus derivados não está particularmente restringida. Tipicamente, composições toxicologicamente eficazes contendo cumarina (varfarina) são formuladas com composições de isco granular contendo de cerca de 50-300 ppm, preferencialmente cerca de 250 ppm, de cumarina e seus derivados. 0 isco é tipicamente formulado com 0,5% até 2,5% de concentrado de varfarina num aglutinante adequado tal como óleo de milho. Se for utilizado óleo de milho como um aglutinante, ele pode estar presente numa quantidade de cerca de 0,5% até cerca de 2% da composição total. O aglutinante e a varfarina são então 59 misturados, por exemplo, com um produto à base de produtos cereais, farinha de milho, aveia enrolada, rações animais mistas e produtos semelhantes conhecidos na técnica. A administração, isto é a quantidade, formulação e frequência e duração de administração podem seguir protocolos correntes para avaliar a toxicidade varfarina em roedores, mais preferencialmente seguem protocolos correntes para avaliar o valor de dose letal 50 (LD50) para um dado veneno a ser testado, os quais são todos geralmente conhecidos do especialista e descritos no exemplo 9.
Para que o derivado de cumarina seja toxicologicamente eficaz é desejável que sejam necessárias ingestões múltiplas para matar o roedor para que eles não desenvolvam receio ao isco. Por conseguinte, prefere-se repetir a administração das composições do derivado de cumarina candidato várias vezes. Duma maneira geral, os roedores começam a morrer após quatro ou cinco doses diárias das composições. Além disso, pode preferir-se suprimir a dor nas ratazanas para melhorar o sofrimento durante as experiências através da administração de agentes supressores da dor geralmente conhecidos do especialista. A inclusão de supressores de dor na composição de cumarina e derivado de cumarina pode ser ainda vantajosa para suprimir ainda mais a possibilidade dos roedores desenvolverem receio ao isco.
Após administração determina-se a toxicidade do derivado de cumarina candidato no roedor, o que produz o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato. Os métodos para determinar a toxicidade dos derivados de cumarina candidatos são geralmente conhecidos do especialista e incluem a análise de LD50, análise da coagulação sanguínea 60 determinando o tempo de protrombina, por exemplo pelo protocolo do índice internacional normalizado (INR). O valor determinado para toxicidade do derivado de cumarina candidato é então comparado com um valor de toxicidade da cumarina de controlo apropriado determinado submetendo um espécimen diferente do roedor resistente à varfarina ao mesmo tratamento mas trocando a administração dos derivados de cumarina pela administração de composições correntes de cumarina para roedores às quais os roedores são resistentes, habitualmente utilizadas para o controlo de pragas. No controlo são utilizadas as mesmas condições experimentais que as descritas acima para a administração do derivado de cumarina candidato. Se o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato for igual ou, de um modo preferido, significativamente maior em termos estatísticos do que o valor de toxicidade da cumarina de controlo, o derivado de cumarina candidato representa um derivado de cumarina toxicologicamente eficaz. A composição para matar roedores compreende uma quantidade toxicologicamente eficaz dos derivados de cumarina identificados pelo método descrito acima. A formulação de composições de isco contendo cumarina e o seu derivado de cumarina foi descrita acima. Uma formulação típica tem os seguintes constituintes: ingrediente %: Veículo em grão 94%, Óleo de milho 1,0%, concentrado de cumarina ou derivado de cumarina (0,5%) 5,0/ total 100,0%.
Uma composição farmacêutica anticoagulante compreende um composto selecionado do grupo consistindo do polipétido VKORC1, do ácido nucleico de VKORC1, da proteína de fusão como definida acima, do vetor como definido acima, da 61 célula hospedeira como definida acima, opcionalmente combinado com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Um método de tratamento de um doente necessitado desse tratamento compreende o passo de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica anticoagulante ao doente. 0 método pode ser utilizado para tratar um doente que sofre de uma deficiência associada a VK0RC1.
Uma composição farmacêutica anticoagulante compreende um composto selecionado do grupo consistindo do ARNsi e/ou ARNsh como definido acima, do ARN ou ADN antimensageiro como definido acima, do aptâmero de ARN como definido acima, do anticorpo como definido acima, opcionalmente combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Um método de tratamento de um doente necessitado desse tratamento compreende o passo de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica anticoagulante ao doente. A presente invenção refere-se às utilizações de um polipéptido VK0RC1 ou um ácido nucleico de VK0RC1 para carboxilar em gama polipéptidos dependentes de vitamina K, bem como aos respetivos métodos. Preferencialmente, o polipéptido dependente de vitamina K carboxilado em gama é um polipéptido selecionado do grupo consistindo de fator de coagulação sanguíneo II, VII, IX e X, proteína C, proteína S, proteína Z proteína gla da matriz e osteocalcina. Numa forma de realização preferida, o VK0RC1 é utilizado em associação com pelo menos um composto adicional preferencialmente numa montagem celular, composto adicional 62 esse que é selecionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5 e um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epoxidesidroxilase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase. A invenção será agora adicionalmente ilustrada a seguir com o auxilio das figuras e exemplos, sem que a invenção se restrinja aos mesmos.
Exemplos
Exemplo 1: Caracterização da região genómica candidata 0 locus da deficiência combinada de fatores de coagulação dependentes de vitamina K de tipo 2 (VKCFD2) foi mapeado na região pericentromérica do cromossoma 16 entre os marcadores D16S3131 e D16S419 [Fregin et al., 2002] . Esta região compreende aproximadamente 20 Mb. Os genes responsáveis pela resistência à varfarina em ratazanas (Rw) e ratos (War) foram mapeados no cromossoma 1 [Kohn et al., 1999] e cromossoma 7 [Wallace, 1976] [Greavses & Ayres, 1967] em estreita ligação com o gene da cadeia leve 2 de miosina (Mil2). 0 ortólogo humano de Mil2, HUMMLC2B, está localizado no cromossoma 16pll na região candidata de VKCFD2 e faz parte de um grupo de ligação conservado de genes. Com base nesta sintonia e em considerações bioquímicas é admitida a hipótese de que a VKCFD2 e a resistência à varfarina possam ser devidas a mutações alélicas no mesmo gene. Se assim for, isto tornaria mais estreito o intervalo crítico nos humanos a uma região de aproximadamente 4,5 Mb entre o gene do recetor de interleucina 4 (IL4R) e o gene da cadeia alfa M de integrina (ITGAM) no braço curto do cromossoma 16 (Fig. 1). 63
De acordo com a montagem do genoma, esta região contém 141 genes Ensembl com aproximadamente 1000 exões. Destes genes, 117 foram assinalados como conhecidos. Muitos destes genes podiam ser excluídos de mais análise porque a sua função estava bem definida e, obviamente, não relacionada com os passos metabólicos do ciclo de vitamina K. Por outro lado, foram incluídos os genes a montante e a jusante desta região que foram vistos como candidatos funcionais no rastreio da mutação.
Exemplo 2: Rastreio de mutação
Utilizando ADN genómico de dois indivíduos VKCFD2 e três indivíduos WR, iniciou-se um rastreio sistemática de mutações por sequenciação comparativa dos genes candidatos remanescentes. Os dados clínicos das famílias VKCFD2 foram anteriormente descritos [Oldenburg et al., 2000]. Os doentes resistentes à varfarina foram comprovados devido à sua resposta anormal à administração oral de varfarina durante tratamento ou prevenção de trombose. Os doentes C e E são casos esporádicos. 0 doente D tem dois irmãos que também sofrem de resistência à varfarina. Os doentes C e D requerem aproximadamente 150 - 250 mg de varfarina por semana para se alcançar uma gama terapêutica de anticoagulação oral enquanto o doente E não mostrou qualquer resposta. Todos os doentes deram consentimento informado antes de participar.
Surpreendentemente, foram encontradas mutações antimensageiras num gene de função desconhecida em todos os indivíduos VKCFD2 e WR investigados (Fig. 2) . Este gene (IMAGE3455200) atravessa uma região genómica de 5126 pb e compreende três exões que codificam uma proteína de 163 aminoácidos. Foi chamada proteína 1 de reciclagem de 64 epóxido de vitamina K (VK0RC1). Constatou-se que ambos os doentes VKCFD2 sem parentesco e os seus irmãos afetados eram portadores do mesmo ponto de mutação homozigótico no terceiro exão (292C>T) ao mesmo tempo que se constatou que os pais eram heterozigóticos. A mutação é provocada pela substituição de arginina por triptofano no resíduo de aminoácido 98 (R98W) . As famílias são de origem Alemã e Libanesa. Os haplotipos na região de homozigosidade em torno do gene mutado foram diferentes em ambas as famílias indicando eventos de mutação independentes. Nos doentes WR foram observadas três mutações heterozigóticas diferentes que levaram a uma substituição de valina por leucina (doente C: V29L), uma substituição de arginina por glicina (doente D: R58G) e uma troca de leucina para arginina (doente E: L128R) . A mutação R58G é partilhada pelos dois irmãos afetados do doente de índice D. As mutações antimensageiras não estavam presentes em 384 cromossomas de controlo. A sequenciação dos cromossomas de controlo revelou dois polimorfismos de um único nucleótido não sinónimos (C43C; L120L).
As sequências e anotações do genoma foram obtidas de NCBI, UCSC e Ensembl. Os iniciadores para o rastreio de mutações foram concebidos utilizando o software Primer3 integrado num escrito, ExonPrimer, para permitir a conceção automática do iniciador. Para o rastreio de mutações, os exões com iniciadores intrónicos foram amplificados e os fragmentos amplificados foram analisados por sequenciação direta com o estojo de sequenciação BigDye Terminator Cycle (ABI)). As sequências iniciadoras estavam disponíveis a pedido. As previsões da topologia foram realizadas utilizando TMPRED e TMHM. 65
Exemplo 3: Homologia e estrutura da proteína
Estava presente um ortólogo do gene de VK0RC1 no rato (NM_178600) e os ortólogos na ratazana e no Fugu rubripes foram estabelecidos por pesquisa de homologia e RT-PCR (Fig. 3). As proteínas correspondentes partilham 79% a 84% de identidade com a proteína humana. As pesquisas de bases de dados não mostraram qualquer homologia com um gene conhecido nem com qualquer domínio de proteína caracterizado. Os programas de previsão de topologia anteciparam três domínios transmembranares (TM) . 0 primeiro TM é localizado entre os resíduos 10 até 29 por todos os programas testados. As previsões são discordantes quanto ao segundo e terceiro TM, os quais são localizados entre os aminoácidos 100 e 150. 0 servidor PSORT II previu um sinal de retenção de membrana ER (KKXX ou KXKXX) na posição 159-163 de VKORC1 em humanos com uma probabilidade de 67 % [Jackson et al., 1990]. A sequência consenso também estava presente nas outras proteínas VKORC1. Isto está em concordância com a localização provável do complexo VKORC1 no sistema membranar ER [Cain et al., 1997].
Pesquisas Tblastn com VKORC1 detetaram um homólogo humano (BC027734) e um gene de rato (AK009497) que apresentam 50% de identidade de proteína um com o outro. Ambos os ARNm foram erradamente previstos como codificando proteínas que não mostram qualquer homologia com VKORC1. A proteína humana prevista começa na terceira metionina. A sequência de ARNm de rato está incompleta com uma proteína prevista numa grelha de leitura diferente. O ADNc completo foi estabelecido no rato bem como em Fugu rubripes e parcialmente na ratazana. Estas proteínas foram designadas proteína 1 tipo VKORC1 (VK0RC1L1). As proteínas VKORC1L1 humana, de rato e ratazana partilham, aproximadamente 84% 66 de identidade umas com as outras e aproximadamente 50% de identidade com as proteínas VKORC1 correspondentes. Foi ainda detetada uma proteína homóloga em Xenopus laevis (AAH43742) e - com menor homologia (1 e-14) - em Anopheles gambiae (EAA06271). Três análises sugeriram que ambas as proteínas eram ortólogos do gene de VKORC1.
Exemplo 4: Análise da expressão O VKORC1 parece ser expressado de modo disseminado. A entrada Unigene correspondente contém mais do que 100 ESTs em vários tecidos. A expressão de VKORC1 em tecidos humanos de feto e adulto foi examinada por análise de transferência de Northern. Para este fim, as transferências de Northern de múltiplos tecidos humanos (Transferência Fetal 1, Stratagene; Pista 12 humana, BD Clontech) continham 2 pg de poli(A)+-RNA. O ADNc completo de VKORC1 foi marcado radioativamente utilizando o sistema de marcação de ADN de iniciadores aleatórios (Invitrogen life technologies) e hibridizado utilizando uma Solução de Hibridização de Alto Desempenho miracleHyb (Stratagene). Foi utilizada uma sonda de β-actina fornecida com a transferência de Northern de múltiplos tecidos para controlo da hibridização.
Os níveis de expressão mais elevados de VKORC1 podem ser observados no fígado fetal e adulto (Fig. 4). Também foram observados níveis de expressão altos no coração, rim e pulmão fetal, bem como no coração e pâncreas adulto. O cérebro fetal, placenta e músculo-esquelético adultos mostraram níveis de expressão intermédios. Foram detetados níveis de expressão menores no cérebro, pulmão e rim adulto. 67
Exemplo 5: Clonagem de VK0RC1 e construção de vetores de expressão A amplificação da sequência de codificação completa de VK0RC1 foi efetuada a partir de ADNc de fígado e rim humano (ADNc de Marathon-Ready, BD Biosciences Clontech) com os seguintes iniciadores incluindo sítios de clivagem para HindiII e EcoRI:
VKORC1-HindiII-F: ATTAAGCTTCACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT (SEQ ID No. 53) VKORCl-EcoRI-R: ATTGAATTCCGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG (SEQ ID No. 54) . 0 produto foi clonado no vetor pBluescript II (Stratagene) que foi clivado com as enzimas de restrição correspondentes e verificado por sequenciação direta. Para as experiências de imunocitoquímica, a inserção foi reclonada nos vetores de expressão de mamífero pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech) e pADNc3.1/myc-His (Invitrogen).
Para os estudos de expressão, o ADNc de VKORC1 foi clonado no vetor pADNc3 (Invitrogen) após amplificação com os iniciadores VK0RCl-pADNc3-F: GGGCGGAAGCTTGAGATAATGGGCA (SEQ ID No. 92) e VKORC l-pADNc3-R: GCTTGAATTCAGGGCTCAGTGC (SEQ ID No. 93). A mutagénese foi realizada utilizando o estojo de mutagénese QuikChange (Stratagene) . Os ADNc de tipo selvagem e mutados foram reclonados para expressão em pCEP4 (Invitrogen) utilizando os sítios HindiII e XhoI. Todas as construções foram verificadas por sequenciação.
Exemplo 6: Cultura de células, transfeção transitória e imunocitoquímica e localização subcelular A partir das experiências de fracionamento bioquímico, sabe-se que a atividade VK0RC1 purifica com a fração de membrana microssomal [Cain et al., 1997]. Além disso, a 68 gama-glutamil-carboxilase foi localizada na membrana do retículo endoplasmático por imunocitoquímica [Presnell, 2002 #31]. Para estudar a localização subcelular de VKORC1, foram geradas construções de proteína de fusão marcada com epítopo GFP e myc de VKORC1 humana para experiências de transfeção transitória de células COS-7. Foram utilizados anticorpos primários contra as etiquetas de epítopo e anticorpos secundários marcados com fluorocromos para visualizar as proteínas de fusão. Um anticorpo contra a proteína específica para ER, calnexina, serviu como um controlo. Para este fim células COS-7 (DSMZ, Braunschweig) foram mantidas em meio de Eagle modificado por in Dulbecco com 10% de soro fetal de vitelo. As células foram aplicadas em lamelas de vidro em placas de seis poços e após 18-24 h em cultura foram transfetadas com as construções do vetor de expressão utilizando Effectene (QIAGEN) de acordo com as especificações do fabricante. Após 48-60 h de cultura adicional, as células foram lavadas com PBS e fixadas em 70% de acetona / 30% de metanol a -20 °C durante 15 min. Após fixação, as células foram permeabilizadas em PBS, 0,1% de Nonidet P-40 (SIGMA N-6507) e em seguida bloqueadas com PBS, 2% de BSA e 0,1% de NP-40 a 37°C. Anticorpos primários, Living Colors A.v. (JI-8) (BD Biosciences Clontech), anticorpo anti-myc (Invitrogen) e anti-calnexina (SIGMA) foram diluídos (1:100) na solução de bloqueio e incubados durante 45 min a 37 °C. As lamelas foram lavadas em PBS, 0,1% de NP-40 durante 30 min. Foram utilizados os mesmos procedimentos de incubação e lavagem para os anticorpos secundários, isto é anti-IgG de rato-FITC (SIGMA) e fragmento-Cy3 de F(ab')2 de anti-IgG de coelho (SIGMA). As lamelas foram submetidas a revelação de contraste com DAPI (1:500) durante 1 min, lavadas com água desionizada, montadas em lâminas utilizando Vectashield 69 (Vector) e visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência Leica. A imunofluorescência verde das proteínas de fusão VK0RC1 decoraram as estruturas tipo malha de ER no citoplasma e co-localizaram-se perfeitamente com a etiqueta do marcador de ER calnexina (vermelho) (Fig. 5).
Exemplo 7: Um ensaio para determinar a atividade enzimática de VK0RC1 Células HEK293-EBNA (Invitrogen) foram multiplicadas em MEM com 10% de FCS. Em cada experiência foram aplicadas 6xl05 células em placas Petri de 94 mm. Após 30 h a 37°C e 5% de C02 foi efetuada a transfeção (20 pg de construção de ADN por placa) utilizando o método de fosfato cálcio. Após 40 h a 35 °C, as células transfetadas a 3% de C02 (multiplicadas quase até à confluência) foram lavadas em PBS, colhidas e submetidas a lise em 450 pL de imidazole 0,25 mM, (pH = 7,6), 0,5% de CHAPS. A eficiência de transfeção foi verificada por sequenciação dos produtos de RT-PCR de uma alíquota de células. A atividade enzimática de VKOR foi medida com 30 pL dos extratos de células completas as quais foram ressuspendidas em 500 pL de tampão A (imidazole 0,25 mM, (pH = 7,6), 0,5% de CHAPS) . Em seguida foram adicionados 20pL de DTT 125mM com um minuto de incubação. Em seguida foram adicionados 5pL de CaCl2 400 mM e Varfarina em 10 pL de DMSO (concentração final 0-80pM). A reação foi iniciada pela adição de 2 pL de 2,3-epóxido de vitamina K (concentração final 5pM) e incubada a 30°C durante uma hora. A reação foi parada pela extração do substrato (2,3-epóxido de vitamina K) e dos produtos da reação (Vitamina K-quinona e 70 hidroquinona) utilizando 1 mL de 2-Propanol/Hexano (3:2, v/v); o sobrenadante orgânico foi recolhido, seco e resolvido em 50 pL de metanol e analisado com um HPLC a 254 nm. A vitamina K quinona foi separada do epóxido por HPLC numa coluna C-18 de fase inversa. Durante o procedimento de extração a vitamina K hidroquinona foi quantitativamente oxidada à forma de quinona. O resultado do HPLC foi analisado automaticamente calculado a área sob a linha de extinção de cada pico. A percentagem de conversão do substrato foi estimada fixando a área do pico do substrato residual (epóxido) e do pico do produto (quinona) como 100 por cento. As medições foram efetuadas em duplicado e a atividade é dada como percentagem de substrato convertido em quinona. O 2,3-epóxido de vitamina K foi preparado por oxidação de vitamina K quinona (Sigma-Aldrich) com H2O2. A varfarina (Sigma-Aldrich) foi adicionada em DMSO (< 1% v/v) . A dose-resposta à inibição da varfarina foi medida a uma concentração final de 5 até 80 μΜ (Walin & Martin 1985). As células não transfetadas e transfetadas de modo simulado mostraram uma atividade basal baixa que era sensível à varfarina. A sobreexpressão de VKORC1 selvagem resultou numa estimulação impressionante da atividade VKOR. A produção de vitamina K quinona foi 14 a 21 vezes maior relativamente às células não tratadas e transfetadas de modo simulado. A atividade foi inibida pela varfarina de um modo dependente da dose (Figura 10).
As requerentes também determinaram a atividade VKOR após transfeção com construções de VKORC1 mutadas (Figura 10). A expressão recombinante da mutação R98W observada nas duas famílias VKCFD2 apenas aumentou ligeiramente a atividade 71 VKOR em células HEK293. Episódios de sangramento espontâneo e níveis elevados de epóxido de vitamina K no soro destes doentes sugerem que a eficiência de reciclagem de vitamina K também é drasticamente diminuída in vivo (Oldenburg et al. 2000) . As cinco mutações WR mostraram uma atividade VKOR reduzida que variava de 5% na variante L128R até 96% na mutação V29L. As mutações V45A, R58G e Y139C apresentaram cerca de 23%, 21 % e 48% de atividade, respetivamente (Quadro 1) . Foi observada uma menor atividade VKOR associada a uma maior necessidade de vitamina K e morte por sangramento espontâneo em ratazanas Rw heterozigóticas e homozigóticas (Martin et al. 1979, Thijssen & Pelz 2001, Fasco et al. 1983b). Analogamente, no nosso sistema de expressão que imita as condições homozigóticas de mutações WR conduziu a uma eficiência funcional mais baixa do complexo de VKOR. Enquanto ao nível fenotípico todas as variantes WR exibiram pelo menos resistência parcial para o efeito de anticoagulação da varfarina, ambas as proteínas selvagem e mutante foram sensíveis à varfarina in vitro. A concentrações superiores a 20 μΜ, as mutações V29L e Y139C mantiveram atividades VKOR maiores do que o tipo selvagem enquanto nas mutações V45A, R58G, L128R, a atividade VKOR caiu abaixo do limite de deteção (Figura 10) .
Exemplo 8: Um método de diagnóstico de uma anormalidade da sequência de VKORC1 (Exemplo de Referência) ADN genómico do espécimen (doente humano ou mamífero) é isolado de acordo com procedimentos correntes geralmente conhecidos do especialista. O ADN genómico do Exão (1-3) de VKORC1 desejado é amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos os quais também podem ser concebidos pelo especialista. O produto de PCR é então 72 purificado utilizando por exemplo SAP/Exo (fosfatase alcalina e exonuclease de camarão) sob condições correntes. 0 ADN purificado é então submetido a procedimentos de sequenciação correntes como: adição de 0,3 pL de iniciador o qual é 10 pmol/pL (iniciador direto ou inverso) a 1 pL do produto de PCR purificado; seguido da adição de 8 pL de DTCS-Mix (Beckman-Coulter) e 10,7 pL de água; seguido de sequenciação cíclica a
Primeiro atraso 96°C 60 s Desnaturação 95 °C 30 s Emparelhamento Específico para o iniciador (55-60°C) 30 s Alongamento 60 °C 4 min
Após a sequenciação cíclica seguiu-se a purificação por precipitação: • adicionar 2 pL de EDTA lOOmM, 2 pL de NaOAc 5M (pH 4,8), 1 pL de Glicogénio, vortex • adicionar 60 pL de etanol a 95 %, vortex • centrifugar a 13000 g (10 min) • remover o sobrenadante • lavar os sedimentos com 180 pL de Etanol a 70 % • secar os sedimentos • resolver os sedimentos em 35 pL de Solução de Carga de Amostra (SLS)
Em seguida as sondas são pipetadas numa placa microtítulo e cobertas com uma gota de óleo de parafina. Depois segue-se a separação no sequenciador a 4,2 V durante 60-120 min. Os dados em bruto são analisados e as sequências são alinhadas com as sequências de controlo utilizando o software CEQ 2000 XL (Versão 4.3.9, Beckman Coulter). As diferenças entre as sequências de controlo (preferencialmente a 73 sequência do ácido nucleico genómico de VK0RC1 ou a sua sequência de codificação de acordo com SEQ ID NO. 2) e o ADN sequenciado são reveladores da sequência das sondas para representar um ácido nucleico de VK0RC1 contendo uma anormalidade de sequência.
Exemplo 9: Ensaio à base de PCR para determinar resistência à varfarina em ratazanas (Exemplo de Referência)
Para determinar se uma ratazana (Rattus norvegicus) é resistente à varfarina, isto é se a sequência de codificação de VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 13 é portadora de uma mutação Y139C (416A>G) utilizou-se o seguinte ensaio com base em ARMS-PCR utilizando fezes de ratazana como uma fonte de ADN genómico de ratazana. É um principio do ensaio incluir na reação de PCR (1) um iniciador de PCR (rVKORCl-F interior) que hibridiza especificamente com a sequência de ADN que contém o alelo mutado resistente à varfarina 416G e (2) outro iniciador de PCR (rVKORCl-R interior) que hibridiza especificamente com a sequência de ADN de tipo selvagem que contém o alelo de tipo selvagem 416A. Além do mais, estes dois iniciadores estão orientados em direções opostas pelo que eles emparelham com um dos dois iniciadores de PCR adicionais incluídos na reação. Os últimos iniciadores estão localizados a distâncias diferentes e em direções opostas em relação ao sítio 416 e em consequência, dependendo de se o sítio 416 está mutado ou não, o iniciador rVKORCl-R interior ou o iniciador rVKORCl-F interior emparelhará e a reação de PCR resultará em ADN amplificado de um tamanho diferente o que é revelador do genótipo da ratazana cujo ADN foi analisado. Nas ratazanas de tipo selvagem, a reação de PCR resultará numa banda de 123 pb, enquanto em 74 ratazanas homozigóticas para a mutação 416G, a reação de PCR produzirá uma banda a 101 pb. Finalmente, em ratazanas com um genótipo heterozigótico, a reação de PCR dará origem a duas bandas, uma banda a 101 e outra a 123 pb. O ADN genómico foi isolado das fezes utilizando procedimentos correntes de isolamento de ADN geralmente conhecidos do especialista. As seguintes componentes foram combinadas numa reação de PCR: 1 pL de ADN (ratazana), 1 pL de Betaina 5M (Sigma), 2 pmol de Iniciador-F-exterior (1 pL de uma diluição a 1:50), 2 pmol de Iniciador-R-exterior (1 pL de uma diluição a 1:50), 10 pmol de Iniciador-F-interior (1 pL de uma diluição a 1:10), 10 pmol de Iniciador-R- interior (1 pL de uma diluição a 1:10), 0,25 pL de Taq/Pfu-Polimerase (1,25U de Taq (Invitrogen) e 0,25U de Pfu (Stratagene) ) , adicionar 25 pL de tampão de PCR- (1 mL de tampão de PCR contém: 100 pL de tampão de PCR lOx (Invitrogen), 160 pL de solução de nucleótidos (dNTPs 1,25 mM) , 30 pL de MgCl2, 610 pL de água destilada) . As
condições de PCR foram: 95°C durante 3 min, seguida de 32 ciclos de: 95°C durante 20 s, 62°C durante 20 s e 70°C durante 10 s. Finalmente, a reação é incubada a 70°C durante 3 min. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese de gel num Gel de 3,5 % de TAE-Agarose com brometo de etidio (10 pL de uma solução a 1% para cada 100 mL) . A eletroforese de gel foi deixada correr durante 30 min a 130 V.
Utilizou-se os seguintes iniciadores: - rVKORCl-F exterior: ATC CTG AGT TCC CTG GTG TCT GTC GCT G (SEQ ID No. 88) - rVKORCl-R exterior: TCA GGG CTT TTT GAC CTT GTG TTC TGG C (SEQ ID No. 89) 75 - iniciador de PCR especifico para o alelo mutante 416G "rVKORCl-F interior": TGA TTT CTG CAT TGT TTG CAT CAC CAC ATG (SEQ ID No. 90) - iniciador de PCR especifico para o alelo de tipo selvagem 416A "rVKORCl-R interior": CAA CAT CAG GCC CGC ATT GAT GGA AT (SEQ ID No. 91)
No ensaio foram utilizadas ratazanas (Rattus norvegicus) com e sem resistência à varfarina. Os resultados de PCR são mostrados na Figura 13. As ratazanas de tipo selvagem exibiram uma banda a 123 pb, as ratazanas homozigóticas para a mutação exibiram uma banda a 101 pb e finalmente, as ratazanas com a mutação heterozigótica mostraram duas bandas, uma banda a 101 e outra a 123 pb.
Consequentemente, estes dados demonstram, que este ensaio pode ser utilizado para determinar se uma dada ratazana é resistente à varfarina ou não. Tais ensaios são extremamente versáteis para controlar pragas numa dada região, uma vez que o conhecimento da frequência de ratazanas resistentes à varfarina é critica para decidir qual o pesticida que pode ser utilizado eficazmente. Se numa dada região existe uma prevalência elevada de ratazanas resistente à varfarina, a varfarina e seus análogos são um meio inadequado para matar as ratazanas. Se, contudo, a frequência determinada de ratazanas resistentes à varfarina é baixa, a varfarina pode ser eficazmente utilizada para combater os roedores. 76
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<210> 1 <211> 163 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1
Ser Pro Gly Trp Vai Arg Leu Ala Leu Cys 10 15 Ser Leu Tyr Ala Leu His Vai Lys Ala Ala 25 30 Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Vai Gly Thr Ala 40 45 Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 55 60 Gly Gin Asp Ser Ile Leu Asn Gin Ser Asn 75 80 Phe Tyr Thr Leu Gin Leu Leu Leu Gly Cys 90 95 Ser Vai Leu Met Leu Leu Ser Ser Leu Vai 105 110 Tyr Leu Ala Trp Ile Leu Phe Phe Vai Leu 120
Met Gly Ser Xhr Trp Gly 1 5
Leu Thr Gly Leu Vai Leu 20
Arg Ala Arg Asp Arg Asp 35
Ile Ser Cys Ser Arg Vai 50
Leu Vai Glu His Vai Leu 65 70
Ser Ile Phe Gly Cys Ile 85
Leu Arg Thr Arg Trp Ala 100
Ser Leu Ala Gly Ser Vai 115 125 85 85 Ile Thr Thr Tyr Ala Ile Asn Vai 140 Lys Vai Gin Glu Pro Gin Gly Lys 155
Tyx Asp Phe Cys Ile Vai Cys 130 135
Leu Met Trp Leu Ser Phe Arg 145 150
Lys Arg His
<210> 2 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg agcatattcg gttgcatctt ctacacacta tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc aagaggcact ga gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgo tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac cagctattgt taggttgcct gcggacacgc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct
Ser Ala 160 60 120 180 240 300 360 420 480 492
<210> 3 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 60 120 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 180 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 86 a9999tttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gtggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga__ _492
<210> 4 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacttgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 5 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 87 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgeggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgo tctacgcgct gcacgfcgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 3.20 gcgctctgog acgcgggcac cgccafccaac tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 280 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcetcaa tcaatcc&ac 240 agcat&ttcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt tagattgcct gcggacacgc 300 tgggcctefcg tcctgatgct gctgagcfccc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttettcgt gctctatgat ttctgcattg tttgt&tcae caccfcatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctoagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 452
<210> 6 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc cgggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492 <210> 7 88
<211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta SÕ gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcago tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gcgctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 8 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgtg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 a9999tttcg 99Ctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492 <210> 9 <211> 492 89
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 tgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctçgc fcctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gegcfcctgcg acgtgggcac cgccafccagc tgttcgcgcg tcttcfccctc caggtggggc xbq aggggtttcg ggctggtgga gcatgfcgcfcg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 ageafcatfccg gtfcgcatctt ctacaeacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 3oo tgggcctctg tcctgafcgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacttg 360 gcctggatcc fcgttctfccgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac caccfcatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagfctfcc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcaet ga 432
<210> 10 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Met Ala Ala Pro Val Leu Leu Arg Val Ser Val Pro Arg Trp Glu Arg 1 5 10 15 vai Ala Arg Tyr Ala Val Cys Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Tyr Hls Val 01« Arg Glu Lys Glu Arg Asp Pro Glu His Arg Ala 35 40 45 Leu Cys Asp Iiôu Gly Pro Trp Val Lys Cys Ser Ala Ala Leu Ala Ser 50 55 60 Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser ile Phe Gly Lys Asp 65 70 75 80 90
Gly Vai Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Ile 85 90 95 Leu Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Ala Ser Ala Vai Ala Ala Leu Ile 100 105 110 Leu Met Thr Ser Ser Ile Met Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Ala 115 120 125 Tyr Ile Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Glu Phe Cys Ile Ile Cys Ile Vai 130 135 140 Thr Tyr Vai Leu Asn Phe Leu Leu Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Arg Leu 145 150 155 160 Vai Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Arg Gin Leu Gin Pro Lys Gin Asp 165 170 175 <210> 11 <211> 531 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 11 atggcggctc ccgtcotgct aagagtgtcg gtgccgcggt gggagcgggt ggcccggtat 60 gcagtgtgcg ctgccggaat cctgctctcc atctacgcct accacgtgga gcgggagaag 120 gagcgggacc ccgagcaccg ggccctctgc gacctggggc cctgggtgaa gtgctccgcc 180 gcccttgcct ccagatgggg tcgaggattt ggtcttttgg gttccatttt tggaaaggat 240 ggtgtattaa accagccaaa cagtgtcttt ggacttatat tttatatact acagttatta 300 cttggcatga cagcaagcgc tgtggcggct ttgatcctça tgacgtcctc catcatgtcg 360 gtcgtggggt ccctgtacct ggcctacatt ctgtactttg tgctgaagga gttctgcatc 420 atctgcatcg tcacgtacgt gctgaacttc cttcttctca ttatcaacta caaacgacta 480 gtttacttga acgaggcctg gaagcggcag ctgcaaccca agcaggactg a 531
<210> 12 <211> 161 <212> PRT <213> Rattus norvegicus 91 <400> 12 mt Gly Thr Thr Trp Arg Ser Pro Gly Arg Leu Arg Leu Ala Leu Cys 15 10 15
Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Vai Lys Ala Ala 20 25 30
Arg Ala Arg Asn Glu Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Vai Gly Thr Ala 35 40 45
IIe Ser Cys Ser Arg Vai Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 50 S5 6Q
Leu Vai Glu His Vai Leu Gly Ala Asp Ser Xle Leu Asn Gin Ser Asn 65 70 75 80
Ser Xle Phe Gly Cys tíet Phe Tyr Thr Ile Gin Leu Leu Leu Gly Cys 85 90 95
Leu Arg Gly Arg Trp Ala Ser Xle Leu Leu Ile Leu Ser Ser Leu Vai 100 105 110
Ser Vai Ala Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Trp Ile Leu Phe Phe vai Leu 115 12G 125
Tyr Asp Phe Cys Ile Vai Cys Ile Thr Thr Tyr Ala Ile Asn Ala Gly 130 135 140
Leu Met Leu Leu Ser Phe Gin Lys Vai Pro Glu His Lys Vai Lys Lys 145 150 155 160
Pro <210> 13 <211> 486 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <400> 13 92 atgggcacca cctggaggag ccctggacgt ttgcggcttg cactatgcct cgctggccta 60 gccctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcaatga ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac ggccatcagc tgttcccgcg tcttctcctc tcggtggggc 180 cggggctttg ggctggtgga gcacgtgtta ggagctgaca gcatcctcaa ccaatccaac 240 agcatatttg gttgcatgtt ctacaccata cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300 tgggcctcta tcctactgat cctgagttcc ctggtgtctg tcgctggttc tctgtacctg 360 gcctggatcc tgttctttgt cctgtatgat ttctgcattg tttgcatcac cacctatgcc 420 atcaatgcgg gcctgatgtt gcttagcttc cagaaggtgc cagaacacaa ggtcaaaaag 480 ccctga 486
<210> 14 <211> 486 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <400> 14 atgggcacca cctggaggag ccctggacgt ttgcggcttg cactatgcct cgctggccta 60 gccctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcaatga ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac ggccatcagc tgttcccgcg tcttctcctc tcggtggggc 180 cggggctttg ggctggtgga gcacgtgtta ggagctgaca gcatcctcaa ccaatccaac 240 agcatatttg gttgcatgtt ctacaccata cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300 tgggcctcta tcctactgat cctgagttcc ctggtgtctg tcgctggttc tctgtacctg 360 gcctggatcc tgttctttgt cctgtatgat ttctgcattg tttgcatcac cacctgtgcc 420 atcaatgcgg gcetgatgtt gcttagcttc cagaaggtgc cagaacacaa ggtcaaaaag 480 ccctga 486 <210> 15 93
<211> 176 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 15
Met Ala Ala Pro Vai Leu Leu Arg vai Ser Vai pro Arg Trp Glu Arg 1 S XO 15
Vai Ala Arg Tyr Ala Vai Cys Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ser Ile Tyr 20 25 30
Ala Tyr His Vai Glu Arg Glu Lys Glu Arg Asp Pro Glu His Arg Ala 35 40 45
Leu Cys Asp Leu Gly Pro Trp Vai Lys Cys Ser Ala Ala Leu Ala Ser 50 55 60
Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser Xle Phe Gly Lys Asp 65 70 75 80
Gly Vai Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Xle 85 90 95
Leu Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Ala Ser Ala Vai Ala Ala Leu Vai 100 105 110
Leu Met Thr Ser Ser Ile Vai Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Ala 115 120 125
Tyr Ile Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Glu Phe cys Ile Ile Cys Vai Thr 130 135 140
Thr Tyr Vai Leu Asn Phe Leu Leu Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Arg Leu 145 150 155 160
Vai Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Arg Gin Leu Gin Pro Lys Glu Asp 165 170 175
<210> 16 <211> 531 <212> ADN <213> Rattus norvegicus 94 <400> 16 atggcggcgc ccgtcctgcfe gagagfcgfccg gfcgccgcggt gggaacaggC ggcccggtat 60 gcagtgtgcg cegcrcgggat cctgctctcc atctacgcct accacgtgga gcgggagaag 120 gagagggacc cggagcaccg ggccctctgc gacctggggc cctgggtgaa gtgceccgcc aso gccctggcct ccagatgggg tcgaggattt ggtottfctgg gttccatttt tggaaaagat 240 ggtgtáttaa accagctraaa cagtgtcttt ggacfct&tat tttatatact acagctatta 300 cttggeafcga cagccagcgc agttgcaget ctggtcctca tgaectcctc catcgtgtcc 360 Sfcggtggggt ctttgtacct ggcctacatt ctgtactttg tgctgaagga gttttgcatc 420 atcfcgcgfcca ccacatatgt gctgaacttc cttctcctca tcatcaacta caaacgactg 480 gtttacttga atgaggcctg gaagcgacaa ctgcagco.ta aSSaagactg a 532
<210> 17 <211> 161 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17
Met 1 Gly Thr Thr Trp 5 Arg Ser Pro Gly Leu 10 Vai Arg Leu Ala Leu 15 Cys Leu Ala Gly Leu 20 Ala Leu Ser Leu Tyr 25 Ala Leu His Vai Lys 30 Ala Ala Arg Ala Arg 35 Asp Glu Asn Tyr Arg 40 Ala Leu Cys Asp Vai 45 Gly Thr Ala Ile Ser 50 Cys Ser Arg Vai Phe 55 Ser Ser Arg Trp Gly Arg 60 Gly Phe Gly Leu 65 Vai Glu His Met Leu 70 Gly Ala Asp Ser Vai 75 Leu Asn Gin Ser Asn 80 Ser Ile Phe Gly Cys 85 Leu Phe Tyr Thr Leu 90 Gin Leu Leu Leu Gly Cys 95 Leu Arg Gly Arg 100 Trp Ala Ser Ile Leu 105 Leu Vai Leu Ser Ser 110 Leu Vai 95
Ser Val Aula 115 Gly Ser Val Tyr Leu 120 Ala Trp lie Leu Phe 125 Phe Val Leu Tyr Asp 130 Phe Cys lie Val Cys 135 Ile Thr Thr Tyr Ala 140 lia Asn Val Gly Leu M$t 145 Leu Leu Sêr Phe 150 Gltt. Lys Val Pro Glu 155 His Lys Thr Lys Lys iêô
HÍS
<210> 18 <211> 486 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 18 atgggcacca cctggaggag ccctggactc gtgcggcttg cactgtgcct cgctggctta 60 gccctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcgatga aaattaccgc 120 gcgctctgcg atgtgggcac ggccatcagc tgttcccgcg tcttctcctc tcggtggggc 180 cggggctttg ggctggtgga gcacatgcta ggagcggaca gcgtcctcaa ccaatccaac 240 agcatatttg gttgcctgtt ctacacctta cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300 tgggcctcta tcctactggt gctgagttcc ctggtgtccg tcgctggttc cgtgtacctg 360 gcctggatcc tgttctttgt gttatatgat ttctgcattg tgtgcattac cacctatgcc 420 atcaatgtgg gtctgatgtt gcttagcttc cagaaggtac cagaacacaa gaccaaaaag 480 cactga 486
<210> 19 <211> 176 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 96
Met Ala Ala Pro Vai Leu Leu Arg Vai Ser Vai Pro Arg Trp Glu Arg i 5 10 15
Val Ala Arg Tyr Ala Vai Cys Ala Ala Gly II© Leu Leu Ser Ile Tyr 20 25 30
Ala Tyr His val Glu Arg Glu Lys Glu Arg Asp Pro Glu His Arg Ala 35 40 45
Leu Cys Asp Leu Gly Pro Trp Val Lys Cys Ser Ala Ala Leu Ala Ser 50 55 60
Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser Ile Phe Gly Lys Asp 65 70 75 80
Gly Val Leu Asn Gin Pro Asn Ser Val Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Ile 85 90 95
Leu Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Ala Ser Ala Val Ala Ala Leu Val 100 105 HO
Leu Mefc Thr Ser Ser Ile Val Ser Val Val Gly Ser Leu Tyr Leu Ala 115 120 125
Glu Phe Cys Ile Ile Cys Val Thr 140
Tyr Ile Leu Tyr 130
Phe Val Leu Lys 135
Thr Tyr Val Leu Asn Phe Leu Leu Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Arg Leu 145 150 155 160 val Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys 165
Arg Gin Leu Gin Pro Lys Glu Asp 170 175
<210> 20 <211> 531 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 97 atggcggcgc ccgtcctgct gagagtgtcg gtgccgcgtt gggaacgggt ggcccggtat 60 gcagtgtgcg ccgccgggat cctgctctcc atctacgcct accacgtgga gcgggagaag 120 gagagggacc cggagcaccg ggccctctgc gacctggggc cctgggtgaa gtgctccgcc 180 gccctggcct ccagatgggg tcgaggattt ggtcttttgg gttccatttt tggaaaagat 240 ggtgtattaa accagccaaa cagtgtcttt ggacttatat tttatatact acagttatta 300 cttggcatga cagccagcgc agttgcagct ctggtcctca tgacctcctc cattgtgtct 360 gtggtgggct ctttgtacct ggcctacatt ctgtactttg tgctgaaaga gttttgcatc 420 atctgcgtca ccacatatgt gctgaacttc ctcctcctca tcatcaatta caaacgacta 480 gtttatttga atgaggcctg gaagcgacag ctgcagccta aggaagactg a 531
<210> 21 <211> 163 <212> PRT <213> Fugu rubripes <400> 21
Met Ala Ile Pro Thr Trp Glu Arg Lys Vai Arg Ile Phe Leu Cys Vai 15 10 15
Phe Gly Leu Leu Leu Ser Vai Tyr Ala Leu His Vai Glu Leu Ser Arg 20 25 30
Glu Arg Asn Pro Asp Tyr Arg Ala Met Cys Asp Leu Gly Glu Ser Vai 35 40 45
Ser Cys Ser Lys Vai Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu 50 55 60
Vai Gin Tyr Phe Vai Asp Lys Asp Ser Pro Leu Asn Gin Pro Asn Ser 65 70 75 80 98
Vai Leu Gly Ile Ile Phe Tyr Thr Leu Gin Met Cys Leu Gly Leu Ser 85 90 95
Leu Ser Arg Lys Ala Ala Leu Phe Leu Vai Phe Ser Ser Trp Vai Ser 100 105 110
Vai Ala Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Ala Phe Vai Leu Gly 115 120 125
Asp Phe Cys Met Vai Cys Vai Ser Thr Tyr Leu Vai Asn Phe Vai Leu 130 135 140
Leu Phe Thr Asn Leu Lys Arg Arg Arg Ala Ile Glu Gly Leu Lys Glu 145 150 155 160
Lys Ser Gly
<210> 22 <211> 492 <212> ADN <213> Fugu rubripes <400> 22 atggcgatcc ccacatggga gagaaaagtg cgcatatttc tctgtgtttt tggattactt 60 ttgtctgttt aegcgctcca cgtcgagcta tcccgagaga gaaacccgga ttacagggcg 120 atgtgcgacc tgggggagtc tgtgagctgc tctaaggttt tcagctccag atggggacgg 180 ggttttggcc tagtccagta ctttgttgac aaagatagcc ctctgaacca gcccaacagt 240 gtgcttggca tcatttfctta cactctgcag atgtgtcttg gactgtctct gtccagaaaa 300 gctgcgctgt ttttagtctt ctcctcctgg gtgtctgtgg ccggctccct ctatctggca 360 tcgattctag cgtttgttct gggagacttc tgtatggtct gtgtgtcaac atatcttgtt 420 aacttcgtac tgctcttcac taacctgaaa cgacggagag caattgaagg actgaaggag 480 aagtctggat ag 492 <210> 23 <211> 175
<212> PRT 99 <213> Fugu rubripes <400> 23
Met Ala Ala Pro Vai Leu Arg Vai Ser Thr Pro Arg Trp Glu Arg Ile 15 10 is
Ala Arg Vai Leu vai Cys Leu Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Tyr Ala 20 25 30
Phe His Vai Glu Arg Glu His Ala Arg Asp Pro Ser Tyr Lys Ala Leu 35 40 45
Cys Asp Vai Ser Ser Ser ile Ser Cys Ser Lys Vai Phe Gly Ser Arg 50 55 60
Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser ile Phe Gly Asn Asp Ser 65 70 75 80
Ala Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Tyr Gly Xle Vai Phe Tyr Ala Phe 85 50 95
Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Vai Ser Ala Met Ala Ala Leu Xle Leu 100 105 110
Met Thr Thr Ser ile Met Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Gly Tyr 115 120 125
Xle Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Asp Leu Cys Vai Ile Cys Vai Thr Thr 130 135 140
Tyr Ala Leu Asn Phe Xle Leu Phe Vai Leu Asn Tyr Lys Arg Leu Vai 145 150 155 160
Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Gin Lys Leu Gin Ala Lys Gin Asp 165 170 175 100
<210> 24 <211> 528 <212> ADN <213> Fugu rubripes <400> 24 atggcggcgc ccgtcctgag agtatccacc ccteggfcggg aaagaatagc ccgggtectc 60 gfcgtgcctcc tgggcatact gctgtcfcetg tacgoottcc acgfcggagag ggaacatgcfc 120 cgggatceea gttataaggc tttgtgcgac gtcagtagct ccatcagctg ttctaaagtg 180 ttcggctcca ggtggggccg aggatttgga ctcttgggct ccafcttttgg gaatgacagc 240 geaefcgaacc aaccc&acag egtcfcacggg atcgtctttt acgccttcca gcttttacta 300 ggaafcgacgg tcagtgcgat ggcggccctg atcctcatga ccacgtccat catgtcggtg 3S0 gcgggctcgc tctacctggg ctacatcctc tactttgtcc tcaaggaect gfcgcgtcatc 420 tgcgtcaoca cgtacgcgct gaaettcatc ctttttgtcc tcaactacaa gcgactggtt 480 tactcgaacg aggcctggaa gcagaagctc caggccaagc aggactaa 528
<210> 25 <211> 169 <212> PRT <213> Xenopus laveis <400> 25
Met Ser Vai Pro Gly Trp Glu Arg Pro Vai Arg Leu Leu Leu Cys Ser 1 S 10 15
Vai Gly Xle Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Pha Hls Vai Glu Thr Ser Arg 101
Glu Arg Asp Pro Asp Tyr Thr Ala Leu Cys Asp Ile Asn Pro Ser Ile 35 40 45 Ser Cys Ser Lys Vai Phe Thr Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu 50 55 60 Vai Glu Gin Phe Leu Gly Gin Gin Ser Leu Leu Asn Gin Pro Asn Ser 65 70 75 80 Vai Phe Gly Vai Leu Phe Tyr Gly Leu Gin Leu Leu Leu Gly Phe Ser 85 90 95 Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ser Thr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Met Ser 100 105 110 Ile Gly Gly Ser Met Tyr Leu Ala Tyr Ile Leu Val Tyr Val Leu Arg 115 120 125 Asp Phe Cys Vai Ile Cys Val Ser Thr Tyr Val Leu Asn Leu Leu Leu 130 135 14 0 Leu Leu Leu Asn Leu Lys Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ala Pro Pro Lys 145 150 155 160 Lys His Lys Asn Lys Arg Lys Lys Asn 165
<210> 26 <211> 510 <212> ADN <213> Xenopus laveis <400> 26 102 atgtctgtgc cgggctggga gaggccagtg aggctgttgc tgtgctctgt gggtattgcc 60 ctgtcactat atgccttcca tStagagacc tcccgggaaa gagaccccga ctataccgct 120 ctgtgtgaca tcaacccctc catcagctgc tccaaggtct tcacttccag atgggggcga 180 ggatttgggc tcgtggagca attcctgggg cagcagagtt tgctgaatca gcccaacagc 240 gtgtttggag tcctgttcta cggcctgcag ctcctgctgg gtttcagcgg atccctggct 300 gccgcctcca cgctactggg aacgtctctg atgtccatcg ggggctccat gtacttggcc 360 tatatcctgg tctatgtact gcgcgacttc tgcgttatct gcgtctccac ctacgtcctg 420 aacctcctcc tcctcctgct caacctcaag cgcctgtoct ccctccgagc gccccccaaa 480 aagcacaaga acaaacgcaa gaagaactaa 510
<210> 27 <211> 176 <212> PRT <213> Anopheles gambiae <400> 27
Met Ser Ile Leu Ala Gly Asn Cys Lys Cys Thr Tyr Thr Leu Ala Leu 1 5 10 15 Vai Gly Leu Ser Vai Cys Gly Phe Leu Leu Ser Leu Tyr Thr Ser Tyr 20 25 30 Vai Glu Leu Arg Ala Glu His Asp His Thr Tyr Gin Ala Met Cys Asp 35 40 45 Ile Ser Glu Arg Ile Ser Cys Thr Lys Vai Phe Thr Ser Arg Tyr Gly 50 55 60 103
Arg Gly Phe Qly He Vai Gly Pr© Leu Leu Gly Asp Asp Ser Leu Leu 65 70 75 80
Asií Vai Pro Asn Gly Pbe Tyr Gly He Phe Tyr Tyr Phe Leu Vai Ma 85 90 95
Gly Leu Ser Phe Ser Asn Asn Leu Ala Vai Ser Arg Leu Thr Ser Tyr 100 105 110
Leu Ile Leu Leu Ser Asn Gly Leu Ser Leu Tyr Leu Ala Tyr Leu Leu 115 120 125
Tyr Phe Vai Leu Gin Asp Mefc Cys Vai Vai Cys Vai Thr Thr Tyr Ala 130 135 140
Vai Asn Leu Vai Ser Leu He Leu Ala Leu Gin Lys Ile Gin Ala Leu 145 ISO 155 160
Ile Arg Glu Glu Gin Vai Met Arg Ma Leu Lys Vai Gly Lys Ma Lys 165 170 175
<210> 28 <211> 528 <212> ADN <213> Anopheles gambiae <400> 28 atgagcatcc tggcgggcaa ctgcaaafcgc aogtacacgc tcgcgctegt cggccfcgagc 60 gtgtgcggct ttctgetgte gcfcgtacacg toctacgtgg agetgcgggc egageacgac 120 cataccfcacc aggccatgtg cgacattago gagcgeafcea gctgcaaeaa agtgfcttacc 180 104 tccaggtacg ggcgtggttt tggcattgtc gggccgttgc tcggogacga ctcgctgctg 240 aacgtgccga acgggttcta cggcatcttc taefcacfctcc tagtggccgg cctcagcttc 300 agcaacaatc tggccgtctc gcggctgacc agctacctca fcactgctgtc caacgggctg 360 tcgctctacc tcgcctacct gctctacttc gtgctgcagg acatgtgcgt cgtgtgcgtc 420 accacgtacg cggtcaatct ggtcagcctg atacfcggcgc fcgcagaaaat tcaggctotg 490 atcegggagg agcaggfcaat gcgcgcgctc aaggfctggca aggeaaag 528
<210> 29 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 1 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 29 gguugcaucu ucuacacacu u 21
<210> 30 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 2 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 30 isuccaacgua gaagaugugti g 21 <210> 31 <211> 57 105
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador a jusante 1 para a sequência ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 31 caaaaacfcgt aaaaaggttg catcttcfcac ãcacggtgfcfc tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 32 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 2 para a sequência ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 32 caaaaactgt aaaaagtgtg tagaagatgc aaccggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 33 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 3 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 33 21 gucucucgcu gguueugucu u 106
<210> 34 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 4 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 34 uucagagage gaccaagaca g 21
<210> 35 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 3 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 35 caaaaactgt aaaaagtctc tcgctggttc tgtcggtgtt fccgtcctttc eacaaga 57
<210> 36 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador a jusante 4 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) 107 <400> 36 caaaaacfcgfc aaaaagacag aaccagcgag agacggtgtt tcgtcctttc cacaaga 5?
<210> 37 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 5 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 37 ggccuggauc cuguucuucu u 21
<210> 38 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 6 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 38 uuccggaccu aggacaagaa g 21
<210> 39 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 108 <223> Iniciador a jusante 5 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 39 caaaaactgt aaaaaggcct ggatcctgtt cttcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 40 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 6 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 40 caaaaactgt aaaaagaaga acaggatcca ggccggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 41 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 7 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 41 gauccuguuc uucgugcucu u 21 <210> 42 <211> 21
<212> ARN 109 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 8 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 42 uucuaggaca agaagcacga g 21
<210> 43 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 7 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 43 caaaaactgt aaaaagatcc tgttcttcgt gctcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 44 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 8 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 44 caaaaactgt aeaaagagca cgaagaacag gatcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 5? 110
<210> 45 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 9 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 45 gcauuguuug uaucaccacu u 21
<210> 46 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 10 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 46 uucguaacaa acauaguggu g 21
<210> 47 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador a jusante 9 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 47 111 caaaaactgt aaaaagcatt gtttgtatca ccacggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 48 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador a jusante 10 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 48 caaaaactgt aaaaagtggt gatacaaaca atgcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 49 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 11 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 49
geueaguuuc cggsaggucu u 2X
<210> 50 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 12 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) 112 <400> 50 imcgagucaa aggccuucca g 21
<210> 51 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 11 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 51 caaaaactgt aaaaagctca gtttccggaa ggtcggtgtfc tcgtcctttc cacaaga 57 <210> 52 <211> 57
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 12 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 52 caaaaactgt aaaaagacct tccggaaact gagcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 53 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial 113 <22 0> <223> Iniciador de PCR para amplificação da sequência de codificação completa da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (VKORCI-HindIII-F) <400> 53 atfcaagcfctc accatgggca gcacctgggg gagccct 37 <210> 54 <211> 31
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para amplificação da sequência de codificação completa da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (VKORCl-EcoRI-R) <400> 54 attgaattec gtgcctctta gccttgccct g 31
<210> 55 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs_VKORCl-Exl-F <400> 55 caafccgcega gtcagagg <210> 56 <211> 20
<212> ADN 18 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Exl-R <400> 56 taatcatctg gcatcctggc
<210> 57 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Ex2-F <4 0 0> 57 eaaggcactg ggttgaeag
<210> 58 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Ex2-R <400> 58 gagtggggct gagctgac <210> 59
<211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial 115 <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Ex3-F <4 0 0> 59 gacatcafcgg agtgtfccggg 20 <210> 60 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Ex3-R <400> 60 ettaggeaag gctcacatgc 20 <210> 61 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-ADNc-F <4 0 0> 61 ggeaegaggg ttttctcc 18
<210> 62 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-ADNc-R 116 <4Ο0> 62 ctcacatgcc aaagcaaag 19
<210> 63 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCl-ADNc-F <4 0 0> 63 ggcgggttct tccctctt 18
<210> 64 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCl-ADNc-R <400> 64 cafcgfcgcfcaa ggcaaagcaa 20 <210> 65 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn_VKORCl-ADNc-F-nes <400> 65 117 fctgtgtctejc gctgtactgt o 117 21 <210> 66 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para <4 0 0> 66 gtcagcctgg catgaggt <210> 67 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para <4 0 0> 67 Rn VKORC1-ADNc-R-nes Fr VKORCl-ADNc-F tettfctccat ttgattggtc et
IS 22 <210> 68 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR para
Fr VKORC1-ADNc-R <400> 68 21 tcagtttagt cgcacctcct g
118 <210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para <4 0 0> 69 gtggccatct gagcagaaac <210> 70 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para <4 0 0> 70 tgetggattfc cagtgggaac <210> 71 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCl-ADNc-F-nes Fr VKORC1-ADNc-R-nes Hs VKORCILl-ADNc-F 20 20 <400> 71 18 fcgggtcgggc cccgacgg <210> 72 <211> 22 119
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-R <400> 72 22 tttaaatcca tcggctaaaa ac
<210> 73 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-F-nes 15 <400> 73 ggcggetgag gtggag
<210> 74 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-R-nes <400> 74 agcaatggtt gctcacttta c
<210> 75 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial 21 120 <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr_VKORClLl-ADNC-F <400> 75 cgagctccct gcgtatgtat
<210> 76 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr_VKORClLl-ADNc-R <400> 76 25 gacgtfcgfctg tttgtttatt tgsttfc
<210> 77 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr_VKORClLl-ADNc-F-nes <400> 77 cgtatgfcatg egtgtctcca g
<210> 78 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 21 121 <223> Iniciador de PCR para Fr_VKORClLl-ADNc-Rnes <400> 78 fefefetsaccgc cgttctga 18 <210> 79 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Iniciador de PCR para Rn VKORC1L1- ADNc-: F <400> 79 ggcggcgfccfc gagtggag 18
<210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn_VKORClLl-ADNc-R <400> 80 acaggfcttaa afcccatcggc 20
<210> 81 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn_VKORClLl-ADNc-F-nes 122 <4Ο0> 81 etgagtggag gcggagg χ?
<210> 82 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCILl-ADNc-R-nes <4 0 0> 82 tttcatgttc atgatcacat tttg 24 <210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCILl-ADNc-R-short <400> 83 efcggçtgtca fcgeeaagfcaa 20 <210> 84 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Mm_VKORClLl-ADNc-F <400> 84 123 ggaagatggç ggcgcccg 123 1Θ
<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para <4 0 0> 85 tçtgctgtca açactgcacc <210> 86 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para <4 0 0> 86 ggtatgcagt gtgcgcc <210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Mm VKORCILl-ADNc-R 20
Mm VKORCILl-ADNc-F-nes
Mm VKORC1L1-ADNc-R-nes <400> 87 20 gcatttccca agatgttctg 124
<210> 88 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR F exterior de rVKORCl <4 0 0> co co atcctgagtt ccctggtgtc tgfccgctg 28
<210> 89 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR R exterior para rVKORCl <4 0 0> 89 tcagggcttt ttgaccfctgt gttctggç 28 <210> 90 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR F interior para rVKORCl-F <400> 90 tgatttctgc attgtttgca tcaccacatg 30 <210> 91 <211> 26 125
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR R interior para rVKORCl <400> 91 caacatcagg cccgcattga fcggaat
<210> 92 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR F de VKORCl-pADNc3 <400> 92 25 gggcggaagc tfcgagataafc gggca
<210> 93 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR R de VKORCl-pADNc3 <400> 93
gcttgaattc agggctcagt gc <210> 94 <211> 492 <212> ADN <213> Sequência artificial 22 126 <22 0>
<223> VK0RC1 de homo sapiens com mutação de resistência à varfarina de ratazana 416A>G <400> 94 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctcttfcgect gacgggctta 60 gtgctcfcegc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggafctaccgc 120 gcgctetgcg acgtgggcae cgccatcagc tgttcgcgcg tcttotcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctetg tccfcgatget gotgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctaccfcg 360 gcetggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttcfcgcattg tttgtatcac cacetgtgct 420 ateaacgfcga gcctgatgtg gctcagfcttc cggaaggtcc aagaaeccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 402
Lisboa, 13 de Janeiro de 2012

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para carboxilação gama de um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira compreendendo introduzir na referida célula hospedeira um ácido nucleico que codifica o VK0RC1 de um modo que o ácido nucleico que codifica o VK0RC1 seja expressado de modo recombinante na referida célula; em que o ácido nucleico que codifica o VK0RC1 codifica: (a) uma sequência polipeptidica selecionada do grupo consistindo de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem atividade VK0RC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo atividade VK0RC1, em que a expressão do referido VK0RC1 na referida célula hospedeira aumenta a atividade basal do VKORC1 da referida célula hospedeira e em que o referido método não é um método de tratamento de um corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia.
2. Método para carboxilação gama de um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira compreendendo introduzir na referida célula hospedeira um ácido nucleico que codifica o VKORC1 de um modo que o ácido nucleico que codifica o VKORC1 seja expressado de modo 2 recombinante na referida célula; em que o ácido nucleico que codifica o VK0RC1 codifica: (a) uma sequência polipeptidica selecionada do grupo consistindo de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem atividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo atividade VKORC1, em que a expressão do referido VKORC1 na referida célula hospedeira aumenta a atividade basal do VKORC1 da referida célula hospedeira e em que a referida célula é uma célula selecionada do grupo consistindo de células HEK293-EBNA, células de E. coli, hepatócitos primários, células de levedura, células de inseto, células COS, linhas de células de hepatócitos e células pluripotentes embrionárias não humanas.
3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que a referida proteína dependente de vitamina K é selecionada do grupo consistindo de fator de coagulação sanguínea II, VII, IX, X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína gla da matriz e osteocalcina.
4. Método da reivindicação 1 ou 2, em que o referido ácido nucleico que codifica o VKORC1 é expressado em associação com um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase. 3
5. Método da reivindicação 1 ou 2, em que as referidas células que expressam o referido VK0RC1 têm uma atividade basal de VK0RC1 aumentada que está aumentada em cerca de 15% ou mais em comparação com a atividade basal da referida célula na ausência da expressão recombinante do referido VK0RC1 na referida célula hospedeira.
6. Utilização de um ácido nucleico de VK0RC1 recombinante que codifica uma sequência polipeptidica selecionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica selecionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com a SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem atividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo atividade VKORC1, para carboxilação gama de um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira, em que a expressão do referido VKORC1 na referida célula hospedeira aumenta a atividade basal do VKORC1 e em que a referida utilização não é uma utilização para o tratamento de um corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia. 4
7. Utilização de um ácido nucleico de VK0RC1 recombinante que codifica uma sequência polipeptidica selecionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica selecionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com a SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem atividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo atividade VKORC1, para carboxilação gama de um polipéptido dependente de vitamina K numa célula hospedeira, em que a expressão do referido VKORC1 na referida célula hospedeira aumenta a atividade basal do VKORC1 e em que a referida célula é uma célula selecionada do grupo consistindo de células HEK293-EBNA, células de E. coli, hepatócitos primários, células de levedura, células de inseto, células COS, linhas de células de hepatócitos e células pluripotentes embrionárias não humanas.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o referido polipéptido dependente de vitamina K é selecionado do grupo consistindo de fator de coagulação sanguínea II, VII, IX, X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína gla da matriz e osteocalcina. 5
9. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o referido ácido nucleico de VK0RC1 é utilizado em associação com um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase.
10. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que as referidas células que expressam o referido VKORC1 têm uma atividade basal de VKORC1 aumentada que está aumentada em cerca de 15% ou mais em comparação com a atividade basal da referida célula na ausência da expressão recombinante do referido VKORC1 na referida célula hospedeira. Lisboa, 13 de Janeiro de 2012
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