JP2007512002A - ビタミンkエポキシドリサイクリングポリペプチドvkorc1、クマリンおよびその誘導体の治療標的 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クマリンおよびその誘導体の標的となる、新規ポリペプチド、ビタミンKエポキシドリサイクリングポリペプチド(VKORC1)に関する。本発明はさらに、クマリン誘導体を同定する方法を提供し、VKORC1関連欠乏症、例えば、ワルファリン耐性と関連する配列異常を含むVKORC1ポリペプチドおよびVKORC1核酸であって、これらの欠乏症の診断に用いることが可能なVKORC1ポリペプチドおよびVKORC1核酸の特許も主張する。さらに、本発明は、げっ歯類の駆除に使用が可能なクマリン誘導体を同定する方法に関する。
血栓発生に対し緊急な処置および、長期的な防止をするためには、血液凝固の抑制が治療選択肢となる。いくつかの抗凝固剤のある中で、クマリンは、例えば、術後で動けない患者、慢性心不全患者、アテローム性血管病を抱える患者、悪性腫瘍患者、および妊娠患者における血栓症の予防に広く使用されている。さらに、クマリンは、血栓症の治療および予防においてもっとも広く使用される経口性抗凝固剤である[非特許文献1]。クマリンは、典型的には、6−ヒドロキシクマリンの誘導体、例えば、3−(アセトニルベンジル)−4−ヒドロキシクマリン(COUMADIN(登録商標))である。
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前述の目的を解決する試みにおいて、下記の群から選択されるポリペプチド配列を含む、または該配列から成るビタミンKエポキシドリサイクリングポリペプチド(VKORC1)が提供される。
(a)配列番号1、12、17、21、25、および27による配列からなる群から選択されるポリペプチド配列;
(b)(a)に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列;
(c)(a)または(b)に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも80%の相同性を有し、VKORC1活性を有するポリペプチド配列;
(d)(a)、(b)、または(c)に定義され、VKORC1活性を有するポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列。
(I)VKORC1核酸、または、VKORC1核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程;
(II)該宿主細胞においてVKORC1ポリペプチドを発現する工程;
(III)候補のクマリン誘導体を投与する工程;
(IV)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(候補活性値);
(V)候補活性値をコントロール活性値と比較する工程;および、
(VI)候補活性値がコントロール活性値と有意に異なる場合、その候補クマリン誘導体を、VKORC1ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程。
(I)少なくとも一つの配列異常を有する、本発明によるVKORC1ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程;
(II)クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程;
(III)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(配列異常活性値);および、
(IV)配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
コントロール配列活性値に対する、配列異常活性値の有意な偏差は、そのVKORC1ポリペプチドの配列異常は、VKORC1ポリペプチドに対して発揮されるクマリン作用を伝えるものであることを示すものとする方法が提供される。
(I)患者から得られたDNAサンプルを増幅する工程、または、患者から得られたRNAサンプルを逆転写してDNAとし、そのDNAを増幅する工程;
(II)工程(I)の増幅DNAを分析し、請求項1のVKORC1ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、VKORC1ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも一つの配列異常を決定する工程、
を含み、求められた配列異常は、患者が、VKORC1関連欠乏症に罹患すること、好ましくは該配列異常は、VKORC1ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすことを示すものとする方法が提供される。
(I)ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程;
(II)該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程;
(III)げっ歯動物に対する候補クマリン誘導体の毒性を定量する工程(候補クマリン誘導体毒性値);
(IV)候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程;
(V)候補クマリン誘導体毒性値が、コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、その候補クマリン誘導体を、げっ歯類殺作用において効果的なクマリン誘導体であると同定する工程、
を含む方法が提供される。
新規クマリン誘導体の開発の必要性、クマリンおよびその誘導体の標的の特定の必要性に応えるために、ビタミンKエポキシドリサイクリングポリペプチド(VKORC1)をクローンした。この遺伝子は、今まで知られていない5126bpのゲノム領域に及び、163個のアミノ酸から成るタンパクをコードする3個のエキソンを含んでいた。トポロジー分析から、少なくとも2個の膜貫通ドメインを有する、疎水性の高いタンパクであることが示唆された。これは、VKORC1複合体の活性がER膜に局在するという既知の事実、および、VKORC1構築物によってトランスフェクトされたCOS−7細胞の免疫蛍光染色データ(図5)とも一致する。
(i)R98W突然変異は、VKCFD2を有する、互いに無関係の二つ家族において病気と共に分離する;
(ii)98位置におけるこのアルギニンは、それぞれ、ヒト遺伝子、およびマウスとラットの相同遺伝子において保存されている;
(iii)三人のワルファリン耐性の兄弟が、R58G置換を共通に持っている;
(iv)このアミノ酸、および、さらに二人の、互いに無関係なWR患者(V29LおよびL128R)において突然変異を示すことが判明した他のアミノ酸残基が、3種の細菌遺伝子を除き、分析した全ての動物種において保存されている(図3参照);および、
(v)5種の予想突然変異のどれも、192個のコントロールDNAサンプルの中に見られなかった。
(a)配列番号1、12、17、21、25、および27による配列からなる群から選択されるポリペプチド配列;
(b)(a)に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列;
(c)(a)または(b)に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも80%の相同性を有し、VKORC1活性を有するポリペプチド配列;
(d)(a)、(b)、または(c)に定義され、VKORC1活性を有するポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列。
(a)本発明によるVKORC1ポリペプチドをコードする核酸配列;
(b)配列番号2、13、18、22、26、および28による配列からなる群から選択される核酸配列;
(c)(a)または(b)に規定される核酸配列に対して厳密条件の下にハイブリダイズし、かつ、VKORC1活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(d)(a)、(b)または(c)に規定される核酸配列に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、好ましくは厳密条件下にハイブリダイズし、かつ、VKORC1活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;および、
(e)(a)、(b)、(c)、または(d)に規定される核酸配列のフラグメントであって、VKORC1活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント。
(I)VKORC1核酸、好ましくは配列番号2、13、18、22、26、および28による核酸、または、VKORC1核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程;
(II)該宿主細胞においてVKORC1ポリペプチドを発現する工程;
(III)宿主細胞からVKORC1ポリペプチドを単離する工程、
を含む方法を提供する。
(a)上に規定されるVKORC1ポリペプチド、好ましくは配列番号1、12、17、21、25、27によるポリペプチド、または、VKORC1核酸によって、好ましくは、配列番号2、13、18、22、26、28による核酸によってコードされるポリペプチド、および、
(b)異種部分、である。
(I)VKORC1核酸、または、VKORC1核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程;
(II)該宿主細胞においてVKORC1ポリペプチドを発現する工程;
(III)候補のクマリン誘導体を投与する工程;
(IV)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(候補活性値);
(V)候補活性値をコントロール活性値と比較する工程;および、
(VI)候補活性値がコントロール活性値と有意に異なる場合、その候補クマリン誘導体を、VKORC1ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程。
(A)工程(I)に従って宿主細胞を提供する工程;
(B)宿主細胞においてVKORC1ポリペプチドを発現する工程;および、
(C)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(コントロール活性値)。
(I)本発明によるVKORC1ポリペプチド、好ましくは、配列番号1、12、17、21、25、および27によるポリペプチドであって、少なくとも一つの配列異常、好ましくは、V29L、V45A、R58G、R98W、L128R,およびY139Cからなる群から選択される配列異常を有するVKORC1ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程;
(II)クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程;
(III)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(配列異常活性値);および、
(IV)配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
コントロール配列活性値に対する、配列異常活性値の有意な偏差は、そのVKORC1ポリペプチドの配列異常は、VKORC1ポリペプチドに対して発揮されるクマリン作用を伝えるものであることを示すものとする方法を提供する。VKORC1ポリペプチドの活性は上に詳述したやり方で定量してもよい。
(I)VKORC1ポリペプチド、好ましくは、配列番号1、12、17、21、25、および27によるポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する工程;
(II)クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程;および、
(III)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(コントロール配列活性値)。
(a)VKORC1ポリペプチドの活性に作用を及ぼす、少なくとも1個の配列異常を含むVKORC1ポリペプチドをコードする核酸であって、VKORC1ポリペプチドは、好ましくは、配列番号1によるポリペプチドであり、配列異常は、V29L、V45A、R58G、R98W、L128R、およびY139Cからなる群から選択されることを特徴とする核酸;
(b)配列番号3、4、5、6および7、14、および94による配列からなる群から選択される核酸配列;および、
(c)(a)または(b)に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズする核酸配列であって、上に定義した少なくとも1個の配列異常を含むポリペプチドをコードする核酸配列
からなる群から選択されるVKORC1核酸を提供する。
(I)患者から得られたDNAサンプルを増幅する工程、または、患者から得られたRNAサンプルを逆転写してDNAとし、そのDNAを増幅する工程;および、
(II)工程(I)の増幅DNAを分析し、VKORC1ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、VKORC1ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも一つの配列異常を決定する工程、
を含み、求められた配列異常は、患者が、VKORC1関連欠乏症に罹患すること、好ましくはワルファリン耐性に罹患することを示し、好ましくはその配列異常は、V29L、V45A、R58G、R98W、L128R、およびY139Cからなる群から選択されることを特徴とする方法を提供する。
(I)患者からのサンプルを提供する工程;および、
(II)上に定義した配列異常を有するVKORC1ポリペプチドに向けた抗体を用いて、該サンプルにおいて配列異常を有するVKORC1ポリペプチドを検出する工程、
を含み、求められた配列異常は、患者が、VKORC1関連欠乏症に罹患することを示すものとする方法を提供する。好ましくはその配列異常は、V29L、V45A、R58G、R98W、L128R、およびY139Cからなる群から選択される。
(I)VKORC1ポリペプチド、好ましくは、3、4、5、6、7、14、および94からなる群から選択される配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程;
(II)候補クマリン誘導体を該細胞に投与する工程;
(III)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(配列異常活性値);および、
(IV)配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
(V)候補クマリン誘導体の投与が、コントロール配列活性値よりも有意に低い配列異常活性値をもたらす場合、その候補クマリン誘導体を、VKORC1ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体と同定する工程、
を含む方法を提供する。
(I)請求項1のVKORC1ポリペプチド、好ましくは、配列番号1または12によるVKORC1ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程;
(II)クマリンを該細胞に投与する工程;および、
(III)VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(コントロール活性値)。
(I)ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程;
(II)該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程;
(III)げっ歯動物に対する候補クマリン誘導体の毒性を定量する工程(候補クマリン誘導体毒性値);
(IV)候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程;
(V)候補クマリン誘導体毒性値が、コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、その候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を含む方法を提供する。
ビタミンK依存性凝固因子2型(VKCFD2)の複合欠損症の座位は、染色体16のセントロメア周辺領域のマーカーD16S3131とD16S419の間にマップされた[Fregin et al.,2002]。この領域は約20Mbを含む。ラット(Rw)およびマウス(War)におけるワルファリン耐性に関与する遺伝子は、ミオシンのL鎖2遺伝子(Myl2)と近接して染色体1[Kohn et al.,1999]および染色体7[Wallace,1976][Geaveses & Ayres,1967]にマップされた。Myl2のヒトのオーソログ、HUMMLC2Bは、VKCFD2候補領域内の、染色体16p11に位置し、保存連鎖の遺伝子群の一部となる。このシンテニーおよび生化学的考察に基づくと、VKCFD2とワルファリン耐性は、同じ遺伝子における対立遺伝子突然変異によるものと仮定される。もしそうなら、これによって、ヒトにおける最重要間隔が、染色体16の短腕における、インターロイキン4受容体遺伝子(IL4R)とインテグリンアルファM鎖遺伝子(ITGAM)との間の約4.5Mbの領域に狭められる(図1)。
2人のVKCFD2および3人のWR被験者からのゲノムDNAを用いて、残余の候補遺伝子の比較配列決定による系統的な突然変異スクリーニングを行った。このVKCFD2家系の臨床データは以前に記述されている[Oldenburg et al.,2000]。ワルファリン耐性患者は、血栓症治療または予防の際のワルファリン経口投与に対するその異常な反応に基づいて確認された。患者CとEは散発的な症例である。患者Dは、ワルファリン耐性を病む二人の兄弟を持っている。患者CおよびDは、経口的に抗凝固作用の治療範囲を実現するのに週当たり約150−250mgのワルファリンを必要とし、一方、患者Eは全く反応を示さなかった。患者は全て参加する前にインフォームドコンセントを提出した。
VKORC1遺伝子のオーソログは、マウスに存在しており(NM_178600)、ラットおよびFugu rubripesにおけるオーソログは、相同性探索とRT−PCRによって確かめられた(図3)。対応するタンパクは、ヒトのタンパクと79%から84%の同一性を共有している。データベース探索では、既知の遺伝子に対しても、特性が明らかにされたタンパクドメインに対しても相同性は認められなかった。トポロジー予想プログラムでは、3個の膜貫通ドメイン(TM)が予想された。試験した全てのプログラムにおいて、第1TMは10から29残基の間に配置された。予想は、第2および第3TMに関しては一致しなかった。これらは、アミノ酸100と150の間に配置された。PSORTIIサーバーは、67%の確率で、ヒトVKORC1の159−163位置にER膜保持シグナル(KKXXまたはKXKXX)を予想した[Jackson et al.,1990]。他のVKORC1タンパクには共通配列も存在した。これは、VKORC1複合体は恐らくER膜システムの中に配されるものとする予想と一致する[Cain et al.,1997]。
VKORC1は広く発現されるように見える。対応するUnigen記入は、様々な組織において100を超えるESTを含む。ヒトの胎児および成人組織におけるVKORC1の発現をノーザンブロット分析によって調べた。このために、ヒトの複数組織のノーザンブロット(胎児ブロット1、Stratagene;ヒト12−レーン、BD Clontech)は、2μgのポリ(A)+−RNAを含んでいた。ヒトのVKORC1cDNA全長を、ランダムプライマーDNA標識システム(Invitrogen life technologies)を用いて放射能標識し、miracleHyb高性能ハイブリダイゼーション液(Stratagene)を用いてハイブリダイズした。複数組織のノーザンブロットを備えるβアクチンプローブを、コントロールハイブリダイゼーションとして用いた。
VKORC1の完全コード配列の増幅を、ヒトの肝臓および腎臓cDNA(Marathon−Ready cDNA、BD Biosciences Clontech)において、HindIIIおよびEcoRIに対する切断部位を含む下記のプライマーを用いて実行した。すなわち、
VKORC1−HindIII−F: ATTAAGCTTCACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT(配列番号53)
VKORC1−EcoRI−R: ATTGAATTCCGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG(配列番号54)
この産物を、pBluescript IIベクター(Stratagene)に挿入クローンし、対応する制限酵素で切断し、直接配列決定で確認した。免疫細胞組織化学的実験のために、挿入体を再度哺乳類発現ベクターpEGFP−N1(BD Biosciences Clontech)、およびpcDNA3.1/myc−His(Invitrogen)に挿入再クローンした。
生化学的分画実験から、VKORC1活性は、ミクロソーム膜と共に精製されることが分かっている[Cain et al.,1997]。さらに、免疫細胞化学によってγ−グルタミル−カルボキシラーゼは、小胞体の膜に局在することが示されている[Presnell,2002#31]。ヒトのVKORC1の細胞内局在を調べるために、GFP−およびmyc−エピトープ標識VKORC1融合タンパク構築物を、COS−7細胞の一過性トランスフェクション実験のために作製した。エピトープタグに対する一次抗体、および、フルオロクローム標識二次抗体を用いて融合タンパクを可視化した。ER−特異的タンパクカルネキシンに対する抗体をコントロールとして用いた。このために、COS−7細胞(DSMZ、Braunschweig)を、10%ウシ胎児血清を添加した、ダルベッコの改定イーグル培養液にて維持した。細胞を、6ウェルプレートのガラスカバースリップに静置し、18−24時間培養後、Effectene(QIAGEN)をメーカーの指示に従って用いて発現ベクター構築物によってトランスフェクトした。さらに48−60時間培養した後、細胞をPBSで洗浄し、70%アセトン/30%メタノールにて−20℃で15分固定した。固定後、細胞をPBS、0.1%Nonidet P−40(SIGMA N−6507)において透過させ、次に、37℃で、PBS、2%BSA、および0.1%NP−40でブロックした。Living Colors A.v.(JI−8)(BD Biosciences Clontech)、抗myc抗体(Invitrogen)、および抗カルネキシン(SIGMA)を、ブロッキング液にて希釈し(1:100)、37℃で45分インキュベートした。カバースリップを、PBS、0.1%NP−40にて30分洗浄した。二次抗体、すなわち、抗マウスIgG−FITC(SIGMA)および抗ウサギIgGF(ab′)2フラグメント−Cys(SIGMA)にも同じインキュベーションおよび洗浄工程を用いた。カバースリップを、DAPI(1:500)にて1分間カウンターステインし、脱イオン水にて洗浄し、Vectashield(Vector)を用いてスライドにマウントし、Leicaの蛍光顕微鏡にて視像化した。
HEK293−EBNA細胞(Invitrogen)を、10FCS添加MEMにて育成した。各実験のために、6x105個の細胞を、94mmペトリ皿に静置した。37℃、5%CO2に30時間暴露後、リン酸カルシウム法によりトランスフェクション(1個の皿当たり20μgのDNA)を行った。35℃、3%CO2に40時間暴露後、トランスフェクト細胞(ほぼ集密に近く増殖)をPBSにて洗浄し、収穫し、450μlの0.25mMイミダゾール(pH=7.6)、0.5%CHPSにて細胞溶解した。トランスフェクション効率は、細胞分液のRT−PCR産物の配列決定によってチェックした。
(実施例8:VKORC1配列異常を診断する方法)
標本(ヒト患者または哺乳動物)のゲノムDNAを、熟練研究者には一般的に既知の標準法に従って単離された。VKORC1の所望のエキソン(1−3)のゲノムDNAを、これも熟練した専門家によって設計が可能な特異的プライマーを用いてPCRによって増幅した。次に、このPCR産物を、例えば、SAP/Exo(小エビ・アルカリフォスファターゼおよびエキソヌクレアーゼ)を用いて標準条件下に精製する。
*2μlの100mM EDTA、2μlの5M NaOAc(pH4.8)、1μlのグリコーゲンを加えて、渦流攪拌、
*60μlの95%エタノールを加えて、渦流攪拌、
*13000gにて遠心(10分)、
*上清を除去、
*ペレットを180μlの70%エタノールで洗浄、
*ペレットを乾燥、
*ペレットを、35μlのサンプル負荷液(SLS)に溶解。
あるラット(Rattus norvegicus)がワルファリン耐性を有するかどうか、すなわち、配列番号13によるVKORC1コード配列がY139C(416A>G)突然変異を有するかどうかを決めるために、ARMS−PCRに基づく下記のアッセイを、ラットゲノムDNAの供給源としてラット糞を用いて行った。
−rVKORC1−外部F: ATCCTGAGTTCCCTGGTGTCTGTCGCTG(配列番号88)
−rVKORC1−外部R: TCAGGGCTTTTTGACCTTGTGTTGTGGC(配列番号89)
−416G−突然変異対立遺伝子特異的PCRプライマー「rVKORC1−内部F」: TGATTTCTGCATTGTTTGCATCACCACATG(配列番号90)
−416A−野生型対立遺伝子特異的PCRプライマー「rVKORC1−内部R」: CAACATCAGGCCCGCATTGATGGAAT(配列特定番号91)
ラット(Rattus norvegicus)において、ワルファリン耐性を有するもの、および持たないものをアッセイに用いた。PCRの結果を図13に示す。野生型ラットは、123bpにバンドを示し、突然変異に対してホモのラットは、101bpにバンドを示し、最後に、ヘテロの変異を有するラットは、2本のバンド、1本は101bp、もう1本は123bpを示した。
Claims (44)
- 哺乳動物における、クマリンおよびその誘導体の標的としれのビタミンKエポキシドリサイクリングポリペプチド(VKORC1)であって、
(a)配列番号1、12および17に記載の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列;
(b)(a)に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列;
(c)(a)または(b)に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも80%の相同性を有し、ここで、該ポリペプチド配列がVKORC1活性を有する、ポリペプチド配列;
(d)VKORC1活性を有し、(a)、(b)または(c)に規定されるポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列、
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、ビタミンKエポキシドリサイクリングポリペプチド(VKORC1)。 - VKORC1核酸であって、
(a)請求項1のVKORC1ポリペプチドをコードする核酸配列;
(b)配列番号2、13および18に記載の配列からなる群から選択される核酸配列;
(c)(a)または(b)に規定される核酸配列に対してストリンジェントな条件の下にハイブリダイズする核酸であって、ここで、VKORC1活性を有するポリペプチドをコードする。核酸配列;
(d)(a)、(b)または(c)に規定される核酸配列に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列がVKORC1活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列;および、
(e)(a)、(b)、(c)または(d)に規定される核酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントがVKORC1活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、
からなる群から選択される核酸配列を含む、VKORC1核酸。 - 融合タンパクであって、
(a)請求項1のVKORC1ポリペプチド、または、請求項2のVKORC1核酸によってコードされるポリペプチド、および
(b)異種部分
を含む、融合タンパク。 - 請求項2のVKORC1核酸を含むベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項4のベクター。
- 前記ベクターがノックアウト遺伝子構築物である、請求項4または5のベクター。
- 請求項2のVKORC1核酸、または請求項4〜6のいずれか1項のベクターを含む、宿主細胞。
- 非ヒト胚性幹細胞である、請求項7の宿主細胞。
- トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、請求項8の宿主細胞を含む、トランスジェニック哺乳動物。
- 請求項2のVKORC1核酸に対する、DNAプローブまたはRNAプローブ。
- 請求項2のVKORC1核酸に対するPCRプライマーであって、好ましくは、配列番号53〜69および70に記載のPCRプライマーからなる群から選択される、PCRプライマー。
- 請求項2のVKORC1核酸に対する低分子干渉性RNA分子(siRNA)または短鎖ヘアピンRNA(shRNA)であって、好ましくは、配列番号29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49および50からなる群から選択される、siRNA。
- 請求項2のVKORC1核酸に対する、アンチセンスRNAまたはアンチセンスDNA。
- 請求項1のVKORC1ポリペプチドに対するRNAアプタマーであって、該VKORC1ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、RNAアプタマー。
- 請求項1のVKORC1ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
- VKORC1ポリペプチドを生産する方法であって、
(I)請求項2のVKORC1核酸、または、請求項4〜6のいずれか1項のVKORC1核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程;
(II)該宿主細胞において該VKORC1ポリペプチドを発現する工程;
(III)該宿主細胞から該VKORC1ポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1のVKORC1ポリペプチドの活性に作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
(I)前記VKORC1核酸、または、該VKORC1核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程;
(II)該宿主細胞において該VKORC1ポリペプチドを発現する工程;
(III)候補のクマリン誘導体を投与する工程;
(IV)該VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(候補活性値);
(V)該候補活性値をコントロール活性値と比較する工程;および、
(VI)提供される該候補活性値が該コントロール活性値と有意に異なる場合、該候補クマリン誘導体を、該VKORC1ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項17の方法であって、前記コントロール活性値は、
(A)工程(I)に従って宿主細胞を提供する工程;
(B)該宿主細胞において前記VKORC1ポリペプチドを発現する工程;および、
(C)該VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(コントロール活性値)
を包含する方法によって決定される、方法。 - 請求項17の方法であって、前記定量されたVKORC1ポリペプチドの活性は、ビタミンK2,3−エポキシドのビタミンKキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる活性値は、前記コントロール活性値よりも有意に高い候補活性値である、方法。
- 請求項17の方法であって、少なくとも1つのさらなる化合物が前記宿主細胞に導入され、該化合物は、ビタミンK、シトクロームB5、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
- VKORC1活性に対して発揮されるクマリン作用を伝えるVKORC1ポリペプチド配列を決定する方法であって、
(I)少なくとも1つの配列異常を有する、請求項1のVKORC1ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程;
(II)クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程;
(III)該VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(配列異常活性値);および、
(IV)該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程を包含し、
ここで、該コントロール配列活性値に対する、該配列異常活性値の有意な偏差は、該VKORC1ポリペプチドの配列異常が、VKORC1ポリペプチドに対して発揮される該クマリン作用を伝えることの指標である、方法。 - 請求項21の方法であって、前記コントロール配列活性値は、
(I)請求項1のVKORC1ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する工程;
(II)クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程;および、
(III)該VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(コントロール配列活性値)
を包含する方法によって決定される、方法。 - 請求項21の決定方法であって、前記定量された活性は、ビタミンK2,3−エポキシドのビタミンKキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる値とは、前記コントロール配列活性値よりも有意に高い配列異常活性値である、方法。
- 請求項21の方法であって、少なくとも1つのさらなる化合物が前記細胞に導入され、該化合物は、ビタミンK、シトクロームB5、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
- 請求項1のVKORC1ポリペプチドであって、該VKORC1ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、少なくとも1つの配列異常を含む、VKORC1ポリペプチド。
- 請求項25のVKORC1ポリペプチドであって、該VKORC1ポリペプチドは、配列番号1または12に記載のポリペプチドであり、かつ、前記配列異常は、V29L、V45A、R58G、R98W、L128R,およびY139Cからなる群から選択される、ポリペプチド。
- VKORC1核酸であって、
(a)請求項25または26のVKORC1ポリペプチドをコードする核酸;
(b)配列番号3、4、5、6、7、14および94に記載の配列からなる群から選択される核酸配列;および、
(c)(a)または(b)に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列が、請求項25または26のポリペプチドをコードする、核酸配列、
からなる群から選択される、核酸。 - 請求項27のVKORC1核酸を含むベクター。
- 請求項27のVKORC1核酸に対するDNAプローブまたはRNAプローブ。
- 請求項27のVKORC1核酸に対するPCRプライマー。
- 請求項25または26のVKORC1ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
- トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、請求項27のVKORC1核酸、または請求項28に記載のベクターを含む幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項27のVKORC1核酸、請求項29のDNAプローブまたはRNAプローブ、請求項30のPCRプライマー、および請求項31の抗体からなる群から選択される化合物を含む、診断薬。
- 患者においてVKORC1関連欠乏症を診断する方法であって、
(I)該患者から得られたDNAサンプルを増幅するか、または該患者から得られたRNAサンプルを逆転写してDNAとし、該DNAを増幅する工程;および、
(II)工程(I)の増幅されたDNAを分析し、請求項1のVKORC1ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、該VKORC1ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも1つの配列異常を決定する工程を包含し、
ここで、該決定される配列異常は、該患者が、VKORC1関連欠乏症に罹患すること、好ましくはワルファリン耐性を患っていることの指標である、方法。 - 請求項34の方法であって、前記増幅されたDNAは、配列番号1に記載のVKORC1ポリペプチドの少なくとも部分配列をコードし、ここで、前記配列異常は、V29L、V45A、R58G、R98W、L128RおよびY139Cからなる群から選択される、方法。
- 請求項34の方法であって、前記増幅されたDNAは、PCRベースの分析、制限消化分析、およびDNA配列決定分析からなる群から選択される技術によって分析される、方法。
- 患者においてVKORC1関連欠乏症を診断する方法であって、
(I)該患者からのサンプルを提供する工程;および、
(II)請求項31の抗体を用いて、該サンプルにおいて配列異常を有するVKORC1ポリペプチドを検出する工程を包含し、
ここで、決定される配列異常は、該患者が、VKORC1関連欠乏症に罹患することの指標である、方法。 - 請求項37の方法であって、前記サンプルは、免疫組織化学的検出、イムノブロッティング、好ましくはウェスタンブロッティング、およびELISAからなる群から選択される技術によって分析される、方法。
- 少なくとも1つの配列異常を有するVKORC1ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
(I)請求項25または26に記載のVKORC1ポリペプチド、好ましくは、配列番号3、4、5、6、7、14および94からなる群から選択される配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程;
(II)候補クマリン誘導体を該細胞に投与する工程;
(III)該VKORC1ポリペプチドの活性を定量する工程(配列異常活性値);および、
(IV)該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
(V)該候補クマリン誘導体の投与が、該コントロール配列活性値よりも有意に低い配列異常活性値をもたらす場合、該候補クマリン誘導体を、VKORC1ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体として同定する工程、
を包含する、方法。 - ワルファリン耐性げっ歯動物において毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
(I)ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程;
(II)該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程;
(III)該げっ歯動物に対する該候補クマリン誘導体の毒性を定量する工程(候補クマリン誘導体毒性値);
(IV)該候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程;
(V)該候補クマリン誘導体毒性値が、該コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、該候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項40の方法であって、ワルファリン耐性げっ歯動物は、請求項1のVKORC1ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物であり、該VKORC1ポリペプチドは、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも1つの配列異常、好ましくは、配列番号14に記載の配列によってコードされるポリペプチドを含む、方法。
- 請求項40の方法であって、VKORC1ポリペプチドは、配列番号12に記載のポリペプチドであり、かつ、該配列異常は、V29L(85G>T)、V45A(134T>C)、R58G(172A>G)、R98W(292C>T)、およびL128R(383T>G)、およびY139C(416A>G)からなる群から選択される、方法。
- げっ歯類を殺す組成物であって、請求項39〜41のいずれか1項に記載の方法によって同定されたクマリン誘導体の毒物学的に有効な量を含む、組成物。
- 配列番号88〜91に記載のPCRプライマーの使用であって、ラットから得たサンプルにおいて、該ラットがワルファリン耐性遺伝子型を有するか否かを決定するための、使用。
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