JP7441169B2 - Ｍｕｃ１６を標的とするがんワクチンおよびその使用 - Google Patents

Ｍｕｃ１６を標的とするがんワクチンおよびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５９８，３１４号および２０１７年１２月１５日に出願された同第６２／５９９，５１３号に対する優先権およびその利益を主張し、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年１２月１２日に作成された該ＡＳＣＩＩのコピーは、１０４４０９＿０００４４６＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズは５４，０２７バイトである。
本発明は、ＭＵＣ１６抗原およびそれをコードする核酸分子に関する。本発明は、ＭＵＣ１６抗原および／または核酸分子を含むワクチンにも関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導し、ＭＵＣ１６発現がん性細胞を予防し、かつ／またはそれを有する対象を治療するためのワクチンの使用方法に関する。
がんは、米国において、および世界的に依然として主な死亡原因である。がんワクチン市場は急速に成長している。有効な腫瘍ワクチンは、腫瘍の成長を阻止するために有用であり得、かつ／または進行がんの患者の標準治療のより有効で毒性が低い代替品として有用であり得る。がんと関連する抗原、したがって抗腫瘍ワクチンの標的はＭＵＣ１６である。
ＭＵＣ１６は、高分子量糖タンパク質のムチンファミリーのメンバーである。ムチンは、呼吸器、消化管、および生殖器系の様々な臓器の管腔側を囲む特殊上皮細胞によって発現される。ＭＵＣ１６は、上皮の完全性の維持、ならびに上皮表面の潤滑および保護において直接的および間接的な役割を有する。
ＭＵＣ１６のタンデム反復ドメインは、反復ペプチドエピトープＣＡ１２５を含有し、これは、１）早期発見のためのスクリーニング、２）骨盤内腫瘤を呈する閉経前および閉経後の女性における良性と悪性疾患との区別、ならびに３）療法に対する応答の監視を含む、卵巣がんの診断および治療全体を通して生じる複数の臨床シナリオの代表的なバイオマーカーとなった。加えて、機能的研究は、ＭＵＣ１６が卵巣腫瘍の形質転換および転移に寄与することを示した。
卵巣がんの大多数におけるその高い発現と、また腫瘍発生の治療効果を高めるその想定される役割のため、ＭＵＣ１６は、魅力的ながん療法ワクチンの標的である。しかしながら、抗原設計は、その大きい大きさ、複雑なグリコシル化プロファイル、および健康な表皮組織における発現により影響される。
がんの治療および予防のためのワクチンが大きな関心のものである。腫瘍細胞抗原を標的とする既存のワクチンは、しばしば、インビボでの不十分な抗原発現によって制限される。したがって、ＭＵＣ１６を発現する腫瘍に適用可能な安全かつ有効なワクチンを開発し、それによりそのようながんを患っている対象に治療を提供し、その生存を促進するための必要性が当該技術分野において残存する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
（ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
（ａ）配列番号４をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
（ａ）配列番号３、（ｂ）配列番号３の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３に記載の核酸配列を含む。
（ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
（ａ）配列番号６をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号５の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号５と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％同一である断片、ならびに（ｄ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
（ａ）配列番号８をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に提供される。
（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号７の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号７と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号７に記載の核酸配列を含む。
本明細書に記載の核酸分子のうちの１つ以上が、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに組み込まれ得る。本明細書に記載の核酸分子のうちの１つ以上が、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。またさらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号４をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号３、（ｂ）配列番号３の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号６をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。またさらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号５の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号５と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％同一である断片、ならびに（ｄ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号８をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号７の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号７と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号７に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、調節要素に動作可能に連結される。いくつかの実施形態では、調節要素は、プロモーターおよび／またはポリ－アデニル化シグナルである。さらなる実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。またさらなる実施形態では、ポリ－アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である。
本明細書に記載される１つ以上の核酸分子を含む組成物も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。
（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。
（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０、（ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。
（ａ）配列番号６、（ｂ）配列番号６の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ならびに（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。
（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。
（ａ）配列番号８、（ｂ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原タンパク質がさらに提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。
抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１によってコードされる。
抗原が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号３によってコードされる。
抗原が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号５によってコードされる。
抗原が配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号７によってコードされる。
核酸分子を含むワクチンがさらに提供され、この核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む。核酸分子を含むワクチンが本明細書にさらに開示され、この核酸分子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原をコードする。
核酸分子を含むワクチンがさらに提供され、この核酸分子は、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む。核酸分子を含むワクチンが本明細書にさらに開示され、この核酸分子は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原をコードする。
核酸分子を含むワクチンがさらに提供され、この核酸分子は、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む。核酸分子を含むワクチンがさらに本明細書に開示され、この核酸分子は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原をコードする。
核酸分子を含むワクチンがさらに提供され、この核酸分子は、配列番号７に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む。核酸分子を含むワクチンが本明細書にさらに開示され、この核酸分子は、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１６抗原をコードする。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクターを含み得る。ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、またはＲＡＮＴＥＳである。
ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも本明細書に提供され、この抗原は配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１によってコードされる。
ペプチドを含むワクチンがさらに提供され、このペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも本明細書に提供され、この抗原は配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号３によってコードされる。
ペプチドを含むワクチンがさらに提供され、このペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも本明細書に提供され、この抗原は配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号５によってコードされる。
ペプチドを含むワクチンがさらに提供され、このペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンも本明細書に提供され、この抗原は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号７によってコードされる。
ペプチドを含むワクチンがさらに提供され、このペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
治療有効量の本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、ＭＵＣ１６発現がん性細胞を有する対象の治療方法がさらに提供される。いくつかの実施形態では、投与は電気穿孔ステップを含む。他の実施形態では、投与は、対象の１つ以上の部位で行われる。
対象へのＭＵＣ１６発現がん性細胞のワクチン接種方法も提供される。いくつかの実施形態では、投与は電気穿孔ステップを含む。他の実施形態では、投与は、対象の１つ以上の部位で行われる。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号４をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号６をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号８をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、がんの治療において薬剤として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、薬剤の調製に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製に使用するためのものである。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号３、（ｂ）配列番号３の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号５の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号５と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
薬剤として使用するための、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号７の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号７と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号７と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子も本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、がんの治療において薬剤として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、薬剤の調製に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製に使用するためのものである。
天然ヒトＭＵＣ１６構造を図示する。ＭＵＣ１６ワクチン構築物が標的とする領域を示す。 ヒト天然ＭＵＣ１６中央タンデム反復の系統発生分析を示す。 各ＭＵＣ１６反復マイクロコンセンサス（ＲＭＣ）が由来する個々の天然ＭＵＣ１６反復配列、および互いとのそれらの配列同一性パーセントを示す（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ６５１３３．２）。 ＭＵＣ１６カルボキシ末端ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。下線付きの領域（ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲ（配列番号９））は潜在的な切断部位であり、太字の下線付き領域は膜貫通ドメインであり、細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ）は二重下線で示される。膜貫通ドメインの上流の特定されていない配列は細胞外外部ドメインである。ボックスは潜在的なＳ／Ｔ／Ｙリン酸化部位を表す。Ｎ－およびＯ－グリコシル化部位は、それぞれ、ＸおよびＯで示される。 修飾されたコンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン（配列番号１１）ならびにヒト天然ＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン（配列番号１２）のアライメントを図示する。コンセンサスの変化は灰色で影が付けられている。 オフターゲットエピトープの可能性を低減するための、ＲＭＣ、天然反復、ならびに合成コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインを組み立てるための戦略を図示する。図６Ａは、中央タンデム反復およびカルボキシ末端ドメイン設計戦略を組み込むことにより、予備合成ＭＵＣ１６免疫原がどのように生成されたかを示す。しかしながら、ＲＭＣ４－Ｒ６１接合部（ＲＭＣ４の最後の１１個のアミノ酸および天然Ｒ６１の最初の１１個のアミノ酸）がすべての天然ＭＵＣ１６反復接合部（隣接する天然反復の最後の１１個のアミノ酸および初めの１１時のアミノ酸）にアライメントされたとき、最大配列同一性はわずか７６．２％であり、望ましくないエピトープが恐らくこの接合部に導入された可能性があることを示唆した。 オフターゲットエピトープの可能性を低減するための、ＲＭＣ、天然反復、ならびに合成コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインを組み立てるための戦略を図示する。図６Ｂは、ＲＭＣ４－Ｒ６１接合部を避けるための１つの戦略がＲＭＣ４とＲ６１との間に天然Ｒ５９を付加することであったことを示す。 プラスミドｐＧＸ１４３５、ｐＧＸ１４３６、ｐＧＸ１４３７、ｐＧＸ１４３８、およびｐＧＸ１４３９によってコードされた４つの合成コンセンサスＭＵＣ１６免疫原の略図である。 ヒト天然および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ中央タンデム反復ドメインの大きさ評価および比較モデル化を示す。図８Ａは、天然ＭＵＣ１６（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＬ６５１３３．２に基づく）および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣの略図である。 ヒト天然および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ中央タンデム反復ドメインの大きさ評価および比較モデル化を示す。図８Ｂは、天然ＭＵＣ１６（左）と合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ設計（右）との間の大きさの相違を図示するための比較モデル化を示す。 ヒト天然および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ中央タンデム反復ドメインの大きさ評価および比較モデル化を示す。図８Ｃは、ｃｐｋフォーマットで示される合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ反復領域の比較モデルである。反復マイクロコンセンサス配列ＲＭＣ１～ＲＭＣ４は薄灰色で示され、設計されたフーリン切断部位および天然反復配列Ｒ６１～Ｒ６３は暗灰色である。 修飾されたｐＶＡＸ１骨格（ｐＧＸ０００１）の図式表示である。 ｐＧＸ０００３骨格の図式表示である。 プラスミドｐＧＸ１４３５および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ＋Ｒ５９の図式表示である。 プラスミドｐＧＸ１４３６および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣの図式表示である。 プラスミドｐＧＸ１４３７および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣの図式表示である。 プラスミドｐＧＸ１４３８ならびに合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣおよび合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣの図式表示である。 プラスミドｐＧＸ１４３９および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣの図式表示である。 イムノブロッティングによる合成コンセンサスＭＵＣ１６構築物の発現を図示する。 本開示の実施形態において使用された合成コンセンサスＭＵＣ１６抗原タンパク質に対応するペプチドに含有されたペプチドプールの図式表示である。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３５（図１８Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図１８Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図１８Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からのＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ応答を図示する。ｐＧＸ１４３５により誘導された独特のＲ５９（ペプチドプール６）エピトープに対する検出可能な応答も示される（図１８Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３５（図１８Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図１８Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図１８Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からのＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ応答を図示する。ｐＧＸ１４３５により誘導された独特のＲ５９（ペプチドプール６）エピトープに対する検出可能な応答も示される（図１８Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３５（図１８Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図１８Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図１８Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からのＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ応答を図示する。ｐＧＸ１４３５により誘導された独特のＲ５９（ペプチドプール６）エピトープに対する検出可能な応答も示される（図１８Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３５（図１８Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図１８Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図１８Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からのＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ応答を図示する。ｐＧＸ１４３５により誘導された独特のＲ５９（ペプチドプール６）エピトープに対する検出可能な応答も示される（図１８Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３６（図１９Ａ）およびｐＧＸ１４３７（図１９Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からの結果を図示する。示される投与量のｐＧＸ１４３６およびｐＧＸ１４３７でのＥＬＩＳｐｏｔによる合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ応答ならびに完全長構築物に対する免疫応答の比較（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３６（図１９Ａ）およびｐＧＸ１４３７（図１９Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からの結果を図示する。示される投与量のｐＧＸ１４３６およびｐＧＸ１４３７でのＥＬＩＳｐｏｔによる合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ応答ならびに完全長構築物に対する免疫応答の比較（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３６（図１９Ａ）およびｐＧＸ１４３７（図１９Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からの結果を図示する。示される投与量のｐＧＸ１４３６およびｐＧＸ１４３７でのＥＬＩＳｐｏｔによる合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ応答ならびに完全長構築物に対する免疫応答の比較（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。 ３週間隔で３回、示される投与量の合成コンセンサスＭＵＣ１６（ｐＧＸ１４３６（図１９Ａ）およびｐＧＸ１４３７（図１９Ｃ）、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、ｎ＝８）で免疫化を行った雌のＣＢ６Ｆ１からの結果を図示する。示される投与量のｐＧＸ１４３６およびｐＧＸ１４３７でのＥＬＩＳｐｏｔによる合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ応答ならびに完全長構築物に対する免疫応答の比較（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。 本開示の実施形態において使用されたフローサイトメトリーゲーティング戦略を図示する。 合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物ｐＧＸ１４３５（図２１Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２１Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２１Ｃ）により誘導されたＣＤ４+Ｔ細胞の相対頻度を図示する。 合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物ｐＧＸ１４３５（図２１Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２１Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２１Ｃ）により誘導されたＣＤ４+Ｔ細胞の相対頻度を図示する。 合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物ｐＧＸ１４３５（図２１Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２１Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２１Ｃ）により誘導されたＣＤ４+Ｔ細胞の相対頻度を図示する。 ｐＧＸ１４３５（図２２Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２２Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２２Ｃ）により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞溶解能力およびサイトカインプロファイルを図示する。 ｐＧＸ１４３５（図２２Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２２Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２２Ｃ）により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞溶解能力およびサイトカインプロファイルを図示する。 ｐＧＸ１４３５（図２２Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２２Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２２Ｃ）により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞溶解能力およびサイトカインプロファイルを図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３５（図２３Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２３Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２３Ｃ）により誘導された細胞性免疫応答を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３５（図２３Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２３Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２３Ｃ）により誘導された細胞性免疫応答を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３５（図２３Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２３Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２３Ｃ）により誘導された細胞性免疫応答を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３５（図２４Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２４Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２４Ｃ）により誘導された細胞性免疫応答およびサイトカインプロファイルを図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３５（図２４Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２４Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２４Ｃ）により誘導された細胞性免疫応答およびサイトカインプロファイルを図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３５（図２４Ａ）、ｐＧＸ１４３８（図２４Ｂ）、およびｐＧＸ１４３９（図２４Ｃ）により誘導された細胞性免疫応答およびサイトカインプロファイルを図示する。 ＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３６により誘導された細胞性免疫応答（図２５Ａ）、ならびに部分長構築物ｐＧＸ１４３６の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２５Ｂ）を図示する。 ＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３６により誘導された細胞性免疫応答（図２５Ａ）、ならびに部分長構築物ｐＧＸ１４３６の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２５Ｂ）を図示する。 ＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３７により誘導された細胞性免疫応答（図２６Ａ）、ならびに部分長構築物ｐＧＸ１４３７の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２６Ｂ）を図示する。 ＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３７により誘導された細胞性免疫応答（図２６Ａ）、ならびに部分長構築物ｐＧＸ１４３７の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２６Ｂ）を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３６により誘導された細胞性免疫応答（図２７Ａ）、ならびに部分長構築物の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２７Ｂ）を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３６により誘導された細胞性免疫応答（図２７Ａ）、ならびに部分長構築物の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２７Ｂ）を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３７により誘導された細胞性免疫応答（図２８Ａ）、ならびに部分長構築物の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２８Ｂ）を図示する。 ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおけるｐＧＸ１４３７により誘導された細胞性免疫応答（図２８Ａ）、ならびに部分長構築物の細胞溶解性免疫応答および特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答のプロファイル（図２８Ｂ）を図示する。 ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおける完全長構築物に対するｐＧＸ１４３６（図２９Ａ）およびｐＧＸ１４３７（図２９Ｂ）により誘導された細胞性免疫応答の比較、ならびに特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを図示する。 ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおける完全長構築物に対するｐＧＸ１４３６（図２９Ａ）およびｐＧＸ１４３７（図２９Ｂ）により誘導された細胞性免疫応答の比較、ならびに特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを図示する。 本明細書で開示される完全長構築物のＩＦＮγ（図３０Ａ）、ＣＤ４+（図３０Ｂ）、およびＣＤ８+Ｔ（図３０Ｃ）細胞データの要約を提供する。 本明細書で開示される完全長構築物のＩＦＮγ（図３０Ａ）、ＣＤ４+（図３０Ｂ）、およびＣＤ８+Ｔ（図３０Ｃ）細胞データの要約を提供する。 本明細書で開示される完全長構築物のＩＦＮγ（図３０Ａ）、ＣＤ４+（図３０Ｂ）、およびＣＤ８+Ｔ（図３０Ｃ）細胞データの要約を提供する。
本発明は、ＭＵＣ１６抗原を含むワクチンに関する。ＭＵＣ１６は、多くの腫瘍において発現される。したがって、ワクチンは、ＭＵＣ１６を発現するがんまたは腫瘍のための治療を提供する。本発明のワクチンは、治療を必要とする対象のがんの特定の予防または治療のための特定のがん抗原の任意の組み合わせを提供することができる。
組換えがん抗原の核酸およびそのコードされたアミノ酸配列を設計するための１つの様式は、天然がん抗原の全体的なアミノ酸配列において特定のアミノ酸を変更する変異を導入することによるものである。変異の導入によってがん抗原はそれほど変更されないため、哺乳類対象、好ましくはヒトまたはイヌ対象にわたって広く適用することはできないが、得られるアミノ酸配列が寛容を破壊するか、または免疫応答を生成するために外来抗原とみなされるには十分にそれを変更する。別の様式は、その対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％および最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％および最大９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％および最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％および最大９８％の配列同一性を有するコンセンサス組換えがん抗原を創出することであり得る。場合によっては、組換えがん抗原は、その対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。天然がん抗原は、特定のがんまたはがん腫瘍と通常関連する抗原である。がん抗原によって、がん抗原のコンセンサス配列は、哺乳類種にわたって、もしくは種のサブタイプ内、またはウイルス株もしくは血清型にわたってもよい。いくつかのがん抗原は、野生型アミノ酸配列のがん抗原と大きく異ならない。いくつかのがん抗原は、種にわたって非常に異なるため、コンセンサス配列を生成することができない核酸／アミノ酸配列を有する。これらの場合では、その対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％および最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％および最大９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％および最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％および最大９８％の配列同一性を有する、寛容を破壊し、免疫応答を生成する組換えがん抗原が生成される。場合によっては、組換えがん抗原は、その対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。前述のアプローチは、最終組換えがん抗原が、上で考察された天然がん抗原のアミノ酸配列に対して類似性パーセントを有するように組み合わされ得る。
ムチン－１６（「ＭＵＣ１６」）抗原は、一部、異なる種または種内の異なるアイソフォームからのＭＵＣ１６の配列に由来するコンセンサスＭＵＣ１６抗原であり得、したがって、コンセンサスＭＵＣ１６抗原は非天然である。
ＭＵＣ１６抗原は、天然反復マイクロコンセンサス（ＲＭＣ）または反復（Ｒ）配列由来のＲＭＣまたは天然Ｒ配列の選択も含み得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のＲＭＣおよび／またはＲ配列がタンパク質分解切断部位により互いに連結されている核酸構築物が提供される。フーリンタンパク質分解切断部位は、構築物によって発現される融合タンパク質においてＲＭＣおよび／またはＲドメインを連結し得るタンパク質分解切断部位の例である。
ＭＵＣ１６抗原に対するさらなる修飾には、外部ドメインおよび膜貫通ドメインにおけるアスパラギン残基の変異、ならびにＭＵＣ１６抗原のＮ末端への上流コザックおよび／またはＩｇＥリーダー配列の付加が含まれ得る。
組換えＭＵＣ１６は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導し、それにより抗原を発現するがんまたは腫瘍に指向されるか、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発することができる。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された細胞性免疫応答には、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）の誘導または分泌が含まれ得る。他の実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を上方制御する因子、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ－１０およびＴＦＧ－βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生された可溶性因子、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ－１、ならびに免疫チェックポイント分子を低減または阻害することができる。
ワクチンは、ＰＤ－１およびＰＤＬ－１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わされて、細胞性および液性両方の免疫応答の刺激を増加させることができる。抗ＰＤ－１または抗ＰＤＬ－１抗体を使用することによって、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを阻止する。全般的に、免疫系によって認識されるがん抗原を設計することにより、腫瘍細胞による他の形態の免疫抑制を克服するのを助け、これらのワクチンは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞応答をさらに増加させるために、抑制または阻害療法（抗ＰＤ－１および抗－ＰＤＬ－１抗体療法など）と組み合わせて使用することができる。
定義
特に別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができる。本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、一例にすぎず、制限することを意図しない。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、制限することを意図しない。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、およびそれらの異形は、追加の作用または構造の可能性を除外しない変更可能移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないと明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。本開示は、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書の数値範囲の列挙に関して、列挙される範囲の最小値および最大値と同程度の精度を有する各介在値は明示的に企図される。例えば、６～９の範囲に関して、６および９に加えて７および８という数字が企図され、６．０～７．０の範囲に関して、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数字が明示的に企図される。
本明細書で使用される「アジュバント」は、本明細書に記載のＭＵＣ１６抗原および／または抗原をコードする核酸分子の免疫原性を増強するために、本明細書に記載のワクチンに添加される任意の分子を意味する。
本明細書で使用される「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの各クラスの抗体、またはその断片もしくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、ならびにそれらの誘導体を含む。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を呈する、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはその任意の混合物であり得る。
「ＭＵＣ１６抗原」は、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０；配列番号４のアミノ酸１９～６４２；配列番号６のアミノ酸１９～７１０；配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１；配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；本明細書に記載の長さのその断片、バリアント、すなわち、本明細書に記載される配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して同一性を有する配列を伴うタンパク質、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片；本明細書に記載の長さのその断片、バリアント、すなわち、本明細書に記載される配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して同一性を有する配列を伴うタンパク質、本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。抗原は、他のタンパク質からのものなどのシグナルペプチドを任意選択で含み得る。
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される対象または哺乳動物の細胞において発現を指向することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に動作可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸がヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得ることを意味する。
本明細書で使用される、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、異なる生物からの同じ遺伝子に対する複数の配列のアライメントの分析に基づいたポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。コンセンサス配列を含むタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンを使用して、抗原に対して広範な免疫を誘導することができる。
本明細書で使用される、「定電流」は、同じ組織に送達される電気パルスの持続期間にわたって、組織または該組織を定義する細胞が受信または経験する電流を記載する。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。本明細書に提供される電気穿孔装置はフィードバック要素を有する、好ましくは即時フィードバックを有するため、この電流は、電気パルスの寿命にわたって該組織において一定のアンペア数に保たれる。フィードバック要素は、パルスの持続期間全体を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置にその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ため、同じ組織内の電流が電気パルス全体を通して（数マイクロ秒ほど）およびパルス間で一定に保たれる。いくつかの実施形態では、フィードバック要素はコントローラを備える。
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、交換可能に使用されてもよく、電極間の組織の電流を測定し、一定のレベルに電流を維持するためにＥＰ装置によって送達されるエネルギー出力を適宜変更することを含む、提供される電気穿孔装置の能動応答を意味し得る。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気治療の開始前にユーザによって予め調整される。フィードバックは、中の電気回路が電極間の組織の電流を継続的に監視し、その監視される電流（または組織内の電流）を予め調整した電流と比較し、継続的にエネルギー出力調整を行って、監視される電流を予め調整したレベルに維持することができるため、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えばコントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、即時的であり得る。
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し、このパターンは、電気穿孔される組織の任意のエリアの電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、好ましくは排除する。
本明細書で交換可能に使用される「電気穿孔」、「電気透過処理」、または「電気運動増強」（「ＥＰ」）は、生体膜において微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の片側から反対側に通過することが可能になる。
核酸配列に関して本明細書で使用される「断片」は、本明細書に開示の抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部分を意味する。断片は、以下に記載のタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択される核酸分子断片であり得る。断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除く、本明細書に記載の核酸配列のうちの１つ以上の全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除く、以下に記載の核酸配列のうちの１つ以上の全長の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。
いくつかの実施形態では、断片は、任意の異種シグナルペプチドを除いて、本明細書に記載の核酸配列のうちの１つ以上と少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であり得る。いくつかの実施形態では、断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除いて、以下に記載の核酸配列のうちの１つ以上と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。
さらなる実施形態では、断片は、加えて任意選択で、同一性パーセントを計算するときに含まれない異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列も含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
いくつかの実施形態では、断片は、以下に記載の核酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも１７００ヌクレオチド以上、１７５０ヌクレオチド以上、１８００ヌクレオチド以上、１８５０ヌクレオチド以上、１９００ヌクレオチド以上、１９５０ヌクレオチド以上、２０００ヌクレオチド以上、２０５０ヌクレオチド以上、２１００ヌクレオチド以上、２１５０ヌクレオチド以上、２２００ヌクレオチド以上、２２５０ヌクレオチド以上、２３００ヌクレオチド以上、２３５０ヌクレオチド以上、２４００ヌクレオチド以上、２４５０ヌクレオチド以上、２５００ヌクレオチド以上、２５５０ヌクレオチド以上、２６００ヌクレオチド以上、２６５０ヌクレオチド以上、２７００ヌクレオチド以上、２７５０ヌクレオチド以上、２８００ヌクレオチド以上、２８５０ヌクレオチド以上、２９００ヌクレオチド以上、２９５０ヌクレオチド以上、３０００ヌクレオチド以上、３０５０ヌクレオチド以上、３１００ヌクレオチド以上、３１５０ヌクレオチド以上、３２００ヌクレオチド以上、３２５０ヌクレオチド以上、３３００ヌクレオチド以上、３３５０ヌクレオチド以上、３４００ヌクレオチド以上、３４５０ヌクレオチド以上、３５００ヌクレオチド以上、３５５０ヌクレオチド以上、３６００ヌクレオチド以上、３６５０ヌクレオチド以上、３７００ヌクレオチド以上、３７５０ヌクレオチド以上、３８００ヌクレオチド以上、３８５０ヌクレオチド以上、３９００ヌクレオチド以上、３９５０ヌクレオチド以上、４０００ヌクレオチド以上、４０５０ヌクレオチド以上、４１００ヌクレオチド以上、４１５０ヌクレオチド以上、４２００ヌクレオチド以上、４２５０ヌクレオチド以上、４３００ヌクレオチド以上、４３５０ヌクレオチド以上、４４００ヌクレオチド以上、４４５０ヌクレオチド以上、４５００を含み得る。
ポリペプチド配列に関して「断片」または「免疫原性断片」は、本明細書に開示の抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。断片は、本明細書に記載の様々なアミノ酸配列のうちの少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。コンセンサスタンパク質の断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除く、コンセンサスタンパク質の全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除く、以下に記載のアミノ配列のうちの１つ以上の長さの少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。
いくつかの実施形態では、断片は、任意の異種シグナルペプチドを除いて、本明細書に記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であり得る。いくつかの実施形態では、断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除いて以下に記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。
さらなる実施形態では、断片は、加えて任意選択で、同一性パーセントを計算するときに含まれない異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、コンセンサスタンパク質の断片は、本明細書に開示されるタンパク質配列の５５０個以上のアミノ酸、６００個以上のアミノ酸、６５０個以上のアミノ酸、７００個以上のアミノ酸、７５０個以上のアミノ酸、８００個以上のアミノ酸、８５０個以上のアミノ酸、９００個以上のアミノ酸、９５０個以上のアミノ酸、１０００個以上のアミノ酸、１０５０個以上のアミノ酸、１１００個以上のアミノ酸、１１５０個以上のアミノ酸、１２００個以上のアミノ酸、１２５０個以上のアミノ酸、１３００個以上のアミノ酸、１３５０を含み得る。
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される対象の細胞において発現を指向することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に動作可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用される、「発現可能な形態」という用語は、対象の細胞に存在するとき、コード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に動作可能に連結された必須調節要素を含有する遺伝子構築物を指す。
本明細書で使用される「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。完全な相補性配列が標的核酸へハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する部分的な相補性配列は、「実質的に相同」という機能的用語を使用して表される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される、「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される、「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸テンプレート配列にハイブリダイズすることができる（すなわち、その補体である）プローブを指す。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される、「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、２つの配列を最適にアライメントし、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、同一の残基が両配列で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算することができる。２つの配列が異なる長さのものであるか、またはアライメントにより１つ以上の付着端が生じ、特定の比較領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等とみなされ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータシーケンスアルゴリズムを使用することによって行うことができる。
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察する場合に使用され得、オームの法則に従う電流値に変換され、したがって予め調整された電流と比較することができる。
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系が活性化することを意味する。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答の形態、またはその両方であり得る。
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述も相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸は記述される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントが所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖両方の配列の部分を含有し得る。核酸がデオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る場合、核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得る。核酸は、化学合成法または組換え法により得ることができる。
本明細書で使用される「動作可能に連結される」は、遺伝子の発現が空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子において、そのプロモーターと、それが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野において既知であるように、この距離の変化は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、細胞における核酸の発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などの外部刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子成分の発現を調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター ＣＭＶ ＩＥプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、プロモーターはｈＣＭＶプロモーターである。
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端で連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指向する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からその分泌を容易することが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、しばしば成熟タンパク質と称される、タンパク質の残りの部分から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）で連結される。
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複雑な混合物などにおいて、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列の熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５～１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）であり得る（標的配列は過剰で存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０～８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１～１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブについては（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブについては（例えば、約５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の添加によっても達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは背景ハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は次を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳで洗浄。
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望む、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであり得る。
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的であることを意味する。
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止する、または完全に排除することにより疾患から動物を保護することを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現の前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の阻止は、疾患の臨床的出現後に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照核酸またはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において典型的にわずかな変化を伴うと認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、一部、アミノ酸の疎水性親水性指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似する疎水性親水性指数のアミノ酸が置換され、尚もタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ ｌｏｃａｌ ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）の計算が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似する親水性値を有するアミノ酸を置換することにより、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性親水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の特性により明らかにされるように、アミノ酸の相対類似性および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
バリアントは、完全な遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するか、それを含み得る。
ワクチン
本明細書に記載されるＭＵＣ１６抗原またはＭＵＣ１６抗原をコードする核酸分子を含むワクチンが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、本明細書に記載されるＭＵＣ１６抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４のアミノ酸１９～６４２をコードする核酸配列、配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号６のアミノ酸１９～７１０をコードする核酸配列、配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１をコードする核酸配列、配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、ならびに／または配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号８のアミノ酸１９～１３４１をコードする核酸配列、配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０、配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０を含む核酸分子の少なくとも９０％の全長を含む断片、配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６、配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６を含む核酸分子の少なくとも９０％の全長を含む断片、配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０、配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０を含む核酸分子の少なくとも９０％の全長を含む断片、配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３、配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３を含む核酸分子の少なくとも９０％の全長を含む断片、配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％同一である断片ならびに／または配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の少なくとも９０％の全長を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３、配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号４をコードする核酸配列、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号６をコードする核酸配列、配列番号６の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号８をコードする核酸配列、配列番号８の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１、配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号３、配列番号３の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号３と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号５、配列番号５の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号５と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号５と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号７、配列番号７の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号７と少なくとも９５％同一である断片、および／または配列番号７と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質、および／または配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号２、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号４のアミノ酸１９～６４２、配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質、および／または配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号４、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号６のアミノ酸１９～７１０、配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質、および／配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号６、配列番号６の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号６と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１、配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ならびに／または配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号８のアミノ酸１９～１３４１、配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および／配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはＭＵＣ１６抗原を含み、この抗原は、配列番号８、配列番号８の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
ワクチンは、対象において、抗原に対して免疫応答を生成することが可能であり得る。免疫応答は、治療的または予防的免疫応答であり得る。ワクチンを使用して、がん、例えば、ＭＵＣ１６を発現するがんまたは腫瘍を防ぐことができる。ワクチンは、ＭＵＣ１６を発現する腫瘍を予防および／または治療するために、それを必要とする対象において使用することができる。ワクチンは、ＭＵＣ１６に対しておよびＭＵＣ１６を発現する腫瘍に対して細胞性および／または抗体応答を誘導することができる。一実施形態では、ワクチンは、ＭＵＣ１６を発現する卵巣がん細胞、具体的にはＭＵＣ１６を発現する上皮卵巣がん細胞、より具体的にはＭＵＣ１６を発現する漿液性卵巣がん細胞を防ぐ、それを予防および／もしくは治療する、またはそれに対して細胞性および／もしくは抗体応答を誘導するために使用され得る。
本明細書に記載されるがんワクチンの開発には、免疫系によって認識されず、異常に発現される自己抗原であるがん抗原、例えばＭＵＣ１６を同定することを含む。同定されたがん抗原は、免疫系によって認識されるために、自己抗原から外来抗原に変更される。自己から外来抗原に組換えがん抗原の核酸およびアミノ酸配列を再設計することにより、免疫系による抗原の寛容が破壊される。寛容を破壊するために、以下に記載されるように、いくつかの再設計手段ががん抗原に適用され得る。
ワクチンの組換えがん抗原は、自己として認識されず、それにより寛容を破壊する。寛容の破壊は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導し、それにより抗原を発現するがんまたは腫瘍に指向されるか、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発することができる。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された細胞性免疫応答には、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）の誘導または分泌が含まれ得る。他の実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を上方制御する因子、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ－１０およびＴＦＧ－βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生された可溶性因子、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ－１、ならびに免疫チェックポイント分子を低減または阻害することができる。
ワクチンはＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号（参照により完全に本明細書に組み込まれる）に開示されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクターを含み得る。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬をさらに含み得る。
ワクチンは、がん抗原をコードするＲＮＡを含み得る。ＲＮＡワクチンは、細胞内に導入され得る。
ワクチンは、弱毒化生ワクチン、抗原を送達するための組換えベクターを使用するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチン、例えば、限定されないが、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号（各々参照により本明細書に組み込まれる）に記載のワクチンであり得る。
いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは分子アジュバントをさらに含み得、場合によっては、分子アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得、場合によっては、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、抗プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）を含むチェックポイント阻害剤である。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、１つ以上の抗原のコード配列を含む１つ以上の核酸分子上に含まれ得る。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、同じプラスミド上などの核酸ワクチンによってコードされ得るか、またはそれらは別個にプラスミドなどの別個の核酸分子上に含まれ得る。
本発明のワクチンは、ワクチン自体が病気もしくは死を引き起こさないように安全である、病気を防ぐ、中和抗体を誘導する、防御性Ｔ細胞受容体を誘導する、ならびに投与が容易であり、副作用が少なく、生物学的に安定であり、また用量あたりのコストが低いなど、有効なワクチンに求められる特徴を有し得る。ワクチンは、以下で考察されるがん抗原を含有することによりこれらの特徴のいくつかまたはすべてを達成することができる。
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に説明される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスによる提示、Ｔ細胞による提示、および／もしくは分化、Ｂ細胞による提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を阻止する任意の核酸またはタンパク質である。また以下により詳細に説明されるように、ワクチンは、ＰＤ－１およびＰＤＬ－１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わされて、細胞性および液性両方の免疫応答の刺激を増加させることができる。抗ＰＤ－１または抗ＰＤＬ－１抗体を使用することによって、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを阻止する。
抗原
上述のように、ワクチンは、抗原または抗原をコードする核酸分子を含み得る。抗原は、ＭＵＣ１６、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＭＵＣ１６は、高分子量糖タンパク質のムチンファミリーのメンバーである。ムチンは、呼吸器、消化管、および生殖器系の様々な臓器の管腔側を囲む特殊上皮細胞によって発現される。ムチンは、上皮の完全性の維持、ならびに上皮表面の潤滑および保護において直接的および間接的な役割を有する。
ＭＵＣ１６は、腫瘍またはがん形成と関連している。ＭＵＣ１６のタンデム反復ドメインは、反復ペプチドエピトープＣＡ１２５を含有し、これは、１）早期発見のためのスクリーニング、２）骨盤内腫瘤を呈する閉経前および閉経後の女性における良性と悪性疾患との区別、ならびに３）療法に対する応答の監視を含む、卵巣がんの診断および治療全体を通して生じる複数の臨床シナリオの代表的なバイオマーカーとなった。加えて、機能的研究は、ＭＵＣ１６が卵巣腫瘍の形質転換および転移に寄与することを示した。
したがって、ワクチンは、ＭＵＣ１６発現がんまたは腫瘍に罹患する対象を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんは卵巣がんである。ＭＵＣ１６抗原は、天然の「正常な」ＭＵＣ１６とは異なり、したがってＭＵＣ１６抗原発現腫瘍に対する療法または予防法を提供することができる。したがって、天然ＭＵＣ１６配列とは異なるＭＵＣ１６抗原配列およびそのようなＭＵＣ１６抗原配列をコードする核酸分子（すなわち、組換えもしくは変異されたＭＵＣ１６遺伝子または配列）が本明細書に提供される。
上述の異種配列を含む核酸分子が提供される。上述の異種配列からなる核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０を含む核酸分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の全長を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６を含む核酸分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の全長を含む断片、（ｃ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３、（ｂ）配列番号３の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０を含む核酸分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の全長を含む断片、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号５の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）ヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３、配列番号７、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３を含む核酸分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の全長を含む断片、（ｃ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、ならびに（ｄ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３を含む核酸分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９の全長を含む断片、（ｃ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号７の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号７に記載の核酸配列を含む。
ＭＵＣ１６抗原をコードする核酸配列が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ１９～１４９０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４のアミノ１９～６４２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号４をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６のアミノ１９～７１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号６をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号６の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号８の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が提供される。
上述の異種配列を含む単離された核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、および以下に記載される核酸分子の他の形態などのベクターに組み込まれ得る。
上述の異種アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述の異種アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上述の配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書に提供される。タンパク質およびポリペプチドは、ＭＵＣ１６抗原およびＭＵＣ１６免疫原と称され得る。ＭＵＣ１６抗原は、ＭＵＣ１６抗原を発現する腫瘍に対して免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０、（ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号６、（ｂ）配列番号６の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、ならびに（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８、（ｂ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。
一態様では、コンセンサス抗原が以下のうちの１つ以上を有することを含む、改善された転写および翻訳を提供することが望ましい：転写を増加させるための低ＧＣ含有量リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化、ならびに可能な限りシス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除。
ＭＵＣ１６抗原は、２つ以上の種に由来するコンセンサス抗原（または免疫原）配列であり得る。いくつかの実施形態では、コンセンサス抗原は、ＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含み得る。ＭＵＣ１６コンセンサス抗原は、外部ドメインおよび／または膜貫通ドメインに１つ以上の変異を含み得る。１つ以上の変異は、Ｎグリコシル化に関与するアミノ酸のうちの１つ以上の置換を含み得る。１つ以上の変異は、アスパラギンのアラニンへの置換を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、ＭＵＣ１６外部ドメインおよび／または膜貫通ドメインにおいて１、２、または３個のアミノ酸を置換することができる。
いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６抗原は、天然ＲＭＣ配列に由来する１つ以上の反復マイクロコンセンサス（ＲＭＣ）、例えば、ＲＭＣ１、ＲＭＣ２、ＲＭＣ３、および／またはＲＭＣ４の任意の組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６抗原は、１つ以上の天然反復（Ｒ）配列、例えば、Ｒ５９、Ｒ６１、Ｒ６２、および／またはＲ６３の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６抗原は、ＲＭＣ１、ＲＭＣ２、ＲＭＣ３、ＲＭＣ４、Ｒ６１、Ｒ６２、およびＲ６３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６抗原は、ＲＭＣ１、ＲＭＣ２、ＲＭＣ３、ＲＭＣ４、Ｒ５９、Ｒ６１、Ｒ６２、およびＲ６３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６抗原は、ＲＭＣ１、ＲＭＣ２、ＲＭＣ３、およびＲＭＣ４配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６抗原は、Ｒ６１、Ｒ６２、およびＲ６３配列を含む。
ＭＵＣ１６抗原は、発現を改善するための修飾を含み得る。修飾は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増加させるためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の追加、および／またはＭＵＣ１６抗原の免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の追加を含み得る。ＭＵＣ１６抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得る。
ＭＵＣ１６抗原は、エピトープを最適化するための修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような切断部位は、ＲＭＣ配列間、Ｒ配列間、またはＲＭＣもしくはＲ配列の接合部分に挿入され得る。切断部位はフーリン切断部位であり得る。ある特定の実施形態では、フーリン切断部位は、ＲＭＣ４とＲ６１との間に挿入され得る。
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたワクチン
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に説明される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスによる提示、Ｔ細胞による提示、および／もしくは分化、Ｂ細胞による提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を阻止する任意の核酸またはタンパク質である。
そのような阻害剤は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤に連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含み得る。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列であり得る。他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
ａ．免疫チェックポイント分子
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤に連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含み得る。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
（１）ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、それらの断片、それらのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現され、したがって、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ－１は、Ｔ細胞調節因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に調節し、それにより免疫応答を負に調節する。ＰＤ－１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に調節することができ、したがって、ＣＤ８媒介細胞傷害性を阻害し、腫瘍成長を増強する。
ＰＤ－１は、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドを有する。ＰＤ－Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ－ＣＳＦ治療に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、ならびにＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞上で上方制御される。ＰＤ－Ｌ１は、骨髄腫、マスト細胞腫、および黒色腫を含む多くの腫瘍細胞株によって発現される。
ｂ．抗免疫チェックポイント分子抗体
上述のように、免疫チェックポイント阻害剤は抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述の免疫チェックポイント分子）に結合するか、またはそれと反応し得る。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体とみなされ得る。抗体は、に含有される核酸配列によってコードされ得る。
抗体は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、ならびに／またはヒンジ領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖ポリペプチドのＮ末端から始まり、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含有し得る。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から始まり、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
抗体は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）への支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間的関係を画定する重鎖と軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットとの間にそれぞれ挿入される、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み得る。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から始まり、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含み得る。
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
加えて、タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片をもたらし、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は各々、無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むいくつかの断片（Ｆ（ａｂ’）２断片を含む）を提供することができる。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種からの抗体であり得る。
（１）ＰＤ－１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ－１抗体（本明細書において「ＰＤ－１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１抗体はニボルマブであり得る。抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍成長を減少させることができる。
（２） ＰＤ－Ｌ１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（本明細書において「ＰＤ－Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍成長を減少させることができる。
ベクター
ワクチンは、ＭＵＣ１６抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターが、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含有する核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであり得る。
１つ以上のベクターは、特異遺伝子を標的細胞に導入するために使用される、一般的にプラスミドである発現構築物であり得る。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として機能し、発現ベクターで運ばれる遺伝子の効率的な転写をもたらす調節配列を含有するように頻繁に操作される。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
ベクターは、強いプロモーター、強い終結コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との間の距離の調整、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（ポータブルな転写開始配列（ｐｏｒｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））の挿入などの発現シグナルを有し得る。
ベクターは、プロモーターおよびポリ－アデニル化シグナルから選択される調節要素に動作可能に連結される核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。いくつかの実施形態では、ポリ－アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である。
ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸であり得る。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指向することができる。ベクターは、終結シグナルに動作可能に連結され得る抗原コードヌクレオチド配列に動作可能に連結されるプロモーターを有し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列、ならびにベクターをクローニングおよびサブクローニングするための配列、ならびにその断片も含有し得る。関心のヌクレオチド配列を含むベクターはキメラであり得る、つまり、その構成成分のうちの少なくとも１つがその他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して異種である。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝されるときにのみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織もしくは臓器または発達段階に特異的であってもよい。
ベクターはプラスミドであり得る。プラスミドは、抗原をコードする核酸を細胞にトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は、培養され、抗原の発現が起こる条件下で維持される。
プラスミドは、抗原に対して免疫応答を誘発することができる合成のコンセンサス抗原、そのようなタンパク質の断片、そのようなタンパク質のバリアント、バリアントの断片、またはコンセンサスタンパク質および／もしくはコンセンサスタンパク質の断片および／もしくはコンセンサスタンパク質のバリアントおよび／もしくはバリアントコンセンサスタンパク質の断片の組み合わせで構成される融合タンパク質をコードするコード配列を含む上に開示される様々な抗原のうちの１つ以上をコードする核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＣＣＲ２０のみをコードするか、またはこれらのプラスミドの一部としてコード配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２８のコード配列をさらに含み得る。
プラスミドは、コード配列の上流であり得る開始コドン、およびコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終結コドンは、コード配列とインフレームであり得る。
プラスミドは、コード配列に動作可能に連結されるプロモーターも含み得る。コード配列に動作可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）などのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
プラスミドは、コード配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナル、またはウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）であり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は参照により完全に組み込まれる。
プラスミドは、プラスミドを染色体外で維持し、細胞においてプラスミドの複数コピーを産生するために、哺乳類の複製起点も含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐ Ｖ ＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であってもよく、これは、組込むことなく高コピーのエピソーム複製を産生し得るエプスタイン・バーウイルス複製起点および核内抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得る。プラスミドの骨格はｐＡ Ｖ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
プラスミドは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現によく適している可能性がある調節配列も含み得る。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
コード配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列も含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
プラスミドはｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐＧＸ００１（Ｉｎｏｖｉｏ）であってもよく、これはｐＶＡＸ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から修飾される。
ベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、細胞ゲノムに組み込むことにより標的細胞を形質転換するか、または染色体外で存在することができる（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
電気穿孔により対象に効率的に送達され、１つ以上の所望の抗原を発現することができる直鎖状核酸ワクチンまたは直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の直鎖状ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含有し得る。抗原の発現はプロモーターにより制御され得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
ＬＥＣは、局在化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
ＬＥＣはｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
ベクターはプロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離された核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、本明細書に記載の抗原配列を転写する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる転写に必要なシス作用性配列要素である。異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、ベクターがその天然環境において転写開始部位からであるため、ベクターの転写開始からほぼ同じ距離に位置し得る。しかしながら、この距離の変化は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
プロモーターは、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な抗原およびシグナルをコードする核酸配列に動作可能に連結され得る。
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞において発現に有効であると示される別のプロモーターであり得る。
ベクターは、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得てもよい。
ベクターの調製方法
本明細書で考察されるＭＵＣ１６抗原をコードする核酸分子を含むベクターの調製方法が本明細書に提供される。哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ベクターを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に播種するために使用することができる。
以下により詳細に説明される電気穿孔装置で使用するためのベクターは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００８年５月２３日に出願された米国公開第２００９／００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらも組み込む。上に参照される刊行物及び特許、米国公開第２００９／００４７１６号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
賦形剤およびワクチンの他の構成成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤はトランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などの界面活性剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ－Ｌ－グルタメートであり、ポリ－Ｌ－グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在し得る。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、リポソーム（ＤＮＡ－リポソーム混合物として、レシチンリポソームまたは当該技術分野において既知の他のリポソームを含む）（例えばＷ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤も含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、代替えのプラスミドにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α－インターフェロン（ＩＦＮ－α）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＰ－１～、ＩＬ－８、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、任意選択でＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチド、もしくはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を有するＩＬ－１５、およびそれらの機能断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、１つ以上のタンパク質および／またはＣＣＬ－２０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、もしくはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ－１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１１年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６９６００号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＩ０／０４８８２７号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節剤の例は米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ－７、ＩＬ－２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国第０２１，５７９号（参照により完全に組み込まれる）に説明される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
ワクチンは、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム～約２ミリグラムの量で抗原コードベクターを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるワクチンは、約５ナノグラム～約１０００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約１０ナノグラム～約８００マイクログラムの核酸を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約０．１～約５００マイクログラムの核酸を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約１～約３５０マイクログラムの核酸を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラム、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、約１ミリグラム～約２ミリグラム、約５ナノグラム～約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム～約８００マイクログラム、約０．１～約５００マイクログラム、約１～約３５０マイクログラム、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラムの抗原またはそのプラスミドを含有し得る。
ワクチンは、使用される投与モードにより製剤化され得る。注射可能なワクチン医薬組成物は、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｆｒｅｅ）であり得る。等張製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。ワクチンは、血管収縮剤（ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を含み得る。等張溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む安定剤は、製剤を長期間室温または周囲温度で安定させることができる。
ワクチンの医薬組成物
ワクチンは、医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物はワクチンを含み得る。医薬組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）～約１０ミリグラム（ｍｇ）の核酸分子のワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、約２５ｎｇ～約５ｍｇの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５０ｎｇ～約１ｍｇの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１～約５００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～約３５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５～約２５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０～約２００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１５～約１５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０～約１００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５～約７５マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３０～約５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３５～約４０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１００～約２００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０マイクログラム～約１００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０マイクログラム～約８０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５マイクログラム～約６０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３０ｎｇ～約５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３５ｎｇ～約４５マイクログラムの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約０．１～約５００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１～約３５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５～約２５０マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１００～約２００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含有する。
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇの核酸分子のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムの核酸分子のワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上の核酸分子のワクチンを含み得る。
他の実施形態では、医薬組成物は、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ（これらの値を含む）の核酸分子のワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム（これらの値を含む）の核酸分子のワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ（これらの値も含む）の核酸分子のワクチンを含み得る。
医薬組成物は、使用される投与モードにより製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含である。等張製剤を使用することが好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。
医薬組成物は、上に提供される薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、上に提供される機能分子、ビヒクル、アジュバント、担体、希釈剤、またはトランスフェクション促進剤を含み得る。
ワクチン接種方法
上述の医薬製剤を使用して、限定されないが、卵巣がんなどのＭＵＣ１６発現がんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象における、限定されないが、卵巣がんなどのＭＵＣ１６発現がんの治療および／または予防に上述の医薬製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の医薬製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の医薬製剤を使用する治療方法と集合的に称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、細胞において発現され、細胞の表面に送達されると、免疫系が認識して、細胞性、液性、または細胞性および液性応答を誘導する核酸分子としての本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で考察されるワクチンを対象に投与することにより、対象において、ＭＵＣ１６に対して免疫応答を誘導または誘発するために使用され得る。
ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節するために対象に投与され、それにより免疫応答を増強させることができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。哺乳動物にワクチンを投与し、それによりベクターを哺乳動物の細胞に導入すると、トランスフェクトされた細胞が本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上を発現および分泌する。これらの分泌されたタンパク質または合成抗原は、１つ以上のがん抗原に対して作られた抗体、および特異的に１つ以上のがん抗原に対するＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始する免疫系により異物として認識される。いくつかの例では、本明細書で考察されるワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅｄ）免疫系を有し、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を接種された場合、抗原刺激を受けた免疫系は、液性、細胞性、または細胞性および液性両方の免疫応答によるものかにかかわらず、本明細書に開示される後のがん抗原を迅速に除去することができる。
ワクチンの核酸分子の投与方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、その両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、および好ましくはヒト、ウシ、またはブタであり得る。ワクチンは同様に、免疫応答を誘発するために、非哺乳動物対象、例えば、ニワトリに投与され得る。
ワクチンの用量は、時間あたりの１キログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム～１０ｍｇの活性成分（成分／ｋｇ体重／時間）であり得、２０マイクログラム～１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
ワクチンにより免疫応答を生成する方法
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞が単離され得る。
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を生成する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、上述のＭＵＣ１６抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に対して対象に予防的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、ＭＵＣ１６を発現する卵巣がんまたは腫瘍に罹患している対象に治療的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。ワクチンの投与前に、本明細書に開示される１つ以上のＭＵＣ１６抗原を発現する卵巣がんまたは腫瘍の診断は、日常的に行うことができる。
ワクチンによりがんを治療する方法
ワクチンを使用して、哺乳動物において、限定されないが、卵巣がん、より具体的には上皮卵巣がん、最も具体的には漿液性卵巣がんなどのＭＵＣ１６発現がんに対して反応性であるかまたはそれに指向される、免疫応答を生成または誘発することができる。誘発された免疫応答は、卵巣がんまたは腫瘍成長を阻止することができる。
誘発された免疫応答は、卵巣がんに罹患する対象において、がん性または腫瘍細胞の転移を阻止し、かつ／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンを投与されたがんを有する哺乳動物または対象におけるがんまたは腫瘍を治療および／または予防する方法において使用され得る。
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、（１）単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）の産生を遮断する抗体を生成し、それにより骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を遅延し、腫瘍成長を抑制するＢ細胞応答による液性免疫、（２）腫瘍細胞を攻撃し、殺傷するＣＤ８+などの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増加、（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加、（４）ならびにＩＦＮ－γおよびＴＦＮ－αによる炎症応答の増加、または好ましくは前述のすべてを誘導することにより、腫瘍細胞のクリアランスを媒介するか、またはその成長を阻止することができる。ワクチンは、無腫瘍生存率（ｔｕｍｏｒ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％増加させることができる。ワクチンは、免疫化後、腫瘍量を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％低減することができる。ワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞により分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）の増加を阻止または遮断することができる。ワクチンは、腫瘍生存率を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％増加させることができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ワクチンを投与された対象において、様々な組織または系（例えば、脳または神経系など）に損傷を与えないか、またはその炎症を引き起こさない液性免疫応答および／または抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成することができる。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、がん性もしくは腫瘍細胞または組織を標的とする抗原特異的免疫応答を確立して、ワクチンを投与された対象において、損傷を与える、または病気もしくは死を引き起こすことなく、１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍を除去または排除するために、末梢に投与され得る（以下により詳細に説明される）。
ワクチンの投与により、対象における細胞性免疫応答を、約５０倍～約６０００倍、約５０倍～約５５００倍、約５０倍～約５０００倍、約５０倍～約４５００倍、約１００倍～約６０００倍、約１５０倍～約６０００倍、約２００倍～約６０００倍、約２５０倍～約６０００倍、または約３００倍～約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンの投与により、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、対象における細胞性免疫応答を、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
投与されたワクチンは、対象におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）レベルを、約５０倍～約６０００倍、約５０倍～約５５００倍、約５０倍～約５０００倍、約５０倍～約４５００倍、約１００倍～約６０００倍、約１５０倍～約６０００倍、約２００倍～約６０００倍、約２５０倍～約６０００倍、または約３００倍～約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、ワクチンを投与されない対象におけるＩＦＮ－γレベルと比較して、対象におけるＩＦＮ－γレベルを、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
ワクチンの用量は、時間あたりの１キログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム～１０ｍｇ（成分／ｋｇ体重／時間）の活性成分であり得、２０マイクログラム～１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
投与経路
ワクチンまたは医薬組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内 くも膜下腔内、および／もしくは関節内、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用において、本組成物は、通常の獣医学的実践に従い、好適に許容可能な製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎｓ）」、または電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、ナノ粒子促進トランスフェクション（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を伴うまたは伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、いくつかの周知の技術により哺乳動物に投与され、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアなどの組換えベクターを使用することができる。ワクチンの１つ以上のがん抗原がインビボ電気穿孔とともにＤＮＡ注射により投与され得る。
電気穿孔法
ワクチンまたは医薬組成物は、電気穿孔法により投与され得る。電気穿孔法によるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置を使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される予め調整された電流と同等の定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。電気穿孔構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、ステータス報告要素、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素のうちの１つ以上を含み、かつそれらを組み込むことができる。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
本発明のＤＮＡワクチンの投与を容易にし得る電気穿孔装置および電気穿孔方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの投与を容易にするために使用され得る他の電気穿孔装置および電気穿孔方法は、２００７年１０月１７日に出願された同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００６年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対して利益を主張する）に提供されるものを含み、これらのすべてはそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を説明している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。オペレーターは、支持構造に載置される複数の針電極を把持し、それらを身体もしくは植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次に、生体分子を、皮下針により選択された組織内に投与する。プログラム可能な定電流パルスコントローラを作動させ、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用された定電流電気パルスは、生体分子を、複数の電極間の細胞に導入するのを容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを効果的に容易にするために使用することができる電気穿孔装置を説明している。電気穿孔装置は、操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づいた一連の電極とパルスパラメータの入力との間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを作り出し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および着脱可能なガイドディスクも備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に説明される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器にも深く浸透させるのに適応し得る。電極アレイの構成により、注射針は標的臓器にも完全に挿入され、注射は電極によって予め描かれたエリアの標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に説明される電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図される、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるものの電気穿孔装置がある。さらに、様々な装置のいずれかを使用したＤＮＡの投与に関係する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法が注目された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書に企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。
ワクチンの調製方法
本明細書で考察されるＤＮＡプラスミドの調製方法が本明細書において提供される。哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＤＮＡプラスミドを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に播種するために使用することができる。
本発明の電気穿孔法装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、２００７年７月３日に発行された利用許諾特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらも組み込む。上記に参照される出願および特許、米国第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって図示される多くの態様を有する。
本発明は、以下の実施例においてさらに図示される。これらの実施形態は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に実例として示されることを理解するべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
実施例１：ＭＵＣ１６中央タンデム反復ドメイン設計戦略
天然ヒトＭＵＣ１６は、長さが２２，１５２個のアミノ酸の大きな強くグリコシル化された（ｈｅａｖｉｌｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）タンパク質である。これは、Ｎ末端ドメイン、中央タンデム反復ドメイン、およびカルボキシ末端ドメインの３つのドメインで構成されている。天然ヒトＭＵＣ１６のＮ末端ドメインは非常に大きく（１２，０６８個のアミノ酸）、反復配列を欠くため、中央タンデム反復およびカルボキシ末端ドメインのみが標的とされる（図１）。異なる設計戦略をタンデム反復およびカルボキシ末端ドメインに適用した。
天然ヒトＭＵＣ１６の中央タンデム反復ドメインは、長さが９，７９９個のアミノ酸であり、最後の反復が１２７個のみのアミノ酸であることを除き、各々１５６個のアミノ酸である一連の６３の相同反復である。その長さと、様々な種間での相同性の欠如により、s潜在的にヒト天然反復の大部分に対して交差反応性Ｔ細胞を誘発するために、反復マイクロコンセンサス（ＲＭＣ）配列は複数のヒト天然反復配列に由来した。簡潔に、低品質の天然ヒト反復配列を除いた後、残りの３４の天然ヒト反復配列を使用して、系統発生分析を行った（図２および図３）。結果は、これらの配列が互いに＞８０％の同一性を共有する４つの群の反復に分けることができたことを示した。以前のＴ細胞に基づくワクチン開発の経験に基づいて、このマイクロコンセンサスを生成するために使用された天然反復に対して交差反応性Ｔ細胞応答を誘発するために、各マイクロコンセンサス配列は互いに＞８０％の配列同一性を共有する配列に由来するべきである。結果として、４つのＲＭＣ配列を生成した。
これら４つの群のいずれにも分類されなかったそれらの反復の間で、他の３つの天然反復（Ｒ６１～６３）のみが４つすべての生成された反復マイクロコンセンサス（ＲＭＣ）配列と＜８０％の配列同一性を共有した（表１）。表１は、すべての分類されなかった天然ＭＵＣ１６の個々の反復配列（Ｒ１４、Ｒ１、Ｒ５５、Ｒ５６、Ｒ２１、Ｒ５８、Ｒ２２、Ｒ５９、Ｒ６０、Ｒ６１、Ｒ６３、およびＲ６２）のＲＭＣ１～４との配列同一性パーセントを示す。太字は、残りの分類されなかった天然反復配列がＲ６１、Ｒ６２、およびＲ６３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ６５１３３．２）を除いて、少なくとも１つのＲＭＣと≧８０％の同一性パーセントを共有することを示す。
Figure 0007441169000001
ワクチン誘導Ｔ細胞応答の幅を潜在的に増加させるために、これら３つの反復をＭＵＣ１６中央タンデム反復ドメイン設計に個々の要素として含めた。天然反復（Ｒ１、Ｒ１４、Ｒ５５、Ｒ５６、Ｒ２１、Ｒ５８、Ｒ２２、Ｒ５９、およびＲ６０）の残りは、少なくとも１つのＲＭＣと≧８０％の配列同一性を共有し、４つのＲＭＣ配列のうちの少なくとも１つによって網羅されるはずである。
要約すると、合成コンセンサス設計アプローチは、中央タンデム反復ドメインを標的とするために使用されなかった。代わりに、ヒト天然反復の大部分に対して交差反応性Ｔ細胞を潜在的に誘発するために、複数のヒト天然反復配列に由来する４つのＲＭＣ配列を生成した。各ＲＭＣは、互いに＞８０％の配列同一性を共有する反復配列に由来した。すべてが４つすべてのＲＭＣ配列と＜８０％の配列同一性を共有する、天然反復Ｒ６１、Ｒ６２、およびＲ６３も、ワクチン誘導Ｔ細胞応答の幅を潜在的に増加させるために、ＭＵＣ１６中央タンデム反復ドメイン設計に個々の要素として含められた。
実施例２：ＭＵＣ１６カルボキシ末端ドメイン設計戦略
天然ヒトＭＵＣ１６のカルボキシ末端ドメインは、長さが２８４個のアミノ酸であり、細胞外外部ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、膜貫通ドメイン、および短い細胞質側末端からなる。中央タンデム反復ドメインと違い、カルボキシ末端ドメインは多くの種の間で十分に保存されている。しかしながら、ＭＵＣ１６の細胞質側末端は、複数の潜在的なＳ／Ｔ／Ｙリン酸化部位を含有し、シグナル伝達経路（複数可）におけるＭＵＣ１６の改善を示唆する（図４）。図４において、ボックスは潜在的なＳ／Ｔ／Ｙリン酸化部位を表す。Ｎ－およびＯ－グリコシル化部位は、それぞれ、ＸおよびＯで示される。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｕｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｏｎｃｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２，３４８－３６６（２００１）。望ましくない下流シグナル伝達を引き起こすのを阻止するために、細胞質側末端（天然のカルボキシ末端ドメインのアミノ酸２５４～２８４）は、ＭＵＣ１６免疫原のいずれにも含まれない。
コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインの生成
細胞質側末端を欠くヒトコンセンサスＭＵＣ１６カルボキシ末端ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）からの２１のＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン配列を使用して構築された。これらの配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＡＡＬ６５１３３．２、ＸＰ＿００４０５９９９３．１、ＸＰ＿０１４１９７９５２．１、ＸＰ＿００３９１４８６９．１、ＸＰ＿００７９９３３３８．１、ＸＰ＿０１１７３９１０３．１、ＸＰ＿０１１９３２７５９．１、ＸＰ＿０１１８１０３５８．１、ＸＰ＿０１５２９６３１４．１、ＸＰ＿０１０３８７１６４．１、ＸＰ＿００８９８５４１７．１、ＸＰ＿０１０３４７９０４．１、ＸＰ＿０１２２９１２４１．１、ＸＰ＿０１１２８７７９９．１、ＸＰ＿００３３５４１３８．３、ＸＰ＿０１４４１０２７１．１、ＸＰ＿０１５０９６３７０．１、ＸＰ＿０１１３７３０９９．１、ＸＰ＿０１１２２６５９９．１、ＸＰ＿００８７０３７０４．１、およびＸＰ＿０１２４９６６７５．１である。
コンセンサス配列は、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して生成された。ＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムを使用してアライメントした。得られたＭＵＣ１６の外部ドメインおよび膜貫通ドメイン配列は、ヒト天然ＭＵＣ１６の外部ドメインおよび膜貫通ドメインと９６．０％～９６．４％の同一性を共有すると決定された。
ＭＵＣ１６の生物学的機能を無効化するためのカルボキシ末端ドメインへの変異導入の理論的根拠
コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインを生成した後、３つのアスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）への変異（Ｎ－＞Ａ）を導入して、得られたコンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインタンパク質の生物学的機能を無効化した。これら３つの変異は、ＭＵＣ１６のカルボキシ末端外部ドメインが、腫瘍発生、腫瘍浸潤、および転移の促進に関係していたため導入された。Ｒａｏ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０（２０１５）。Ｒａｏらは、Ｎグリコシル化を無効化するためにＭＵＣ１６の外部ドメインにこれら３つのＮ－＞Ａ変異を導入することにより、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化、ならびにトランスフェクトされた３Ｔ３線維芽細胞を移植された無胸腺ヌードマウスにおけるインビボ腫瘍成長が劇的に低減されたことを示した。合成コンセンサスＭＵＣ１６構築物に３つのＮ－＞Ａ変異を導入した後の生物学的機能の無効化は、インビトロまたはインビボで評価されなかった。
ＭＵＣ１６カルボキシ末端ドメイン設計の概要
コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインを生成し、３つの変異（Ｎ－＞Ａ）を導入して、Ｎグリコシル化を無効化した。（図５）。修飾されたコンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインは、ヒト天然ＭＵＣ１６の外部ドメインおよび膜貫通ドメインと９５．３％の同一性を共有する。表２は、生成されたＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインのヒト天然ＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメインとの配列相同性パーセントを示す。
Figure 0007441169000002
実施例３：オフターゲットエピトープを導入する可能性を低減するＲＭＣ、天然反復、ならびに合成コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン（ＣＴＤ）を組み立てるための戦略
ＭＵＣ１６設計に含まれる要素には、４つのＲＭＣ、３つの天然反復、ならびに合成コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン（ＣＴＤ）が含まれた。最初の設計戦略は、図６Ａ～６Ｂに示される要素を組み込むことにより、ＭＵＣ１６免疫原（予備合成ＭＵＣ１６免疫原）を生成することであった。しかしながら、この免疫原におけるＲＭＣ１－ＲＭＣ２、ＲＭＣ２－ＲＭＣ３、ＲＭＣ３－ＲＭＣ４、ＲＭＣ４－Ｒ６１、およびＲ６３合成コンセンサスＭＵＣ１６外部ドメインおよび膜貫通ドメイン接合部は天然ＭＵＣ１６配列では生じないため、これらの接合部が少なくとも１つの天然ＭＵＣ１６反復接合部と高い配列同一性を共有しない場合、無関係なオフターゲットエピトープが潜在的に導入され得る可能がある。合成免疫原接合部のＭＵＣ１６の天然反復接合部のすべてとの配列同一性を決定するために、すべての隣接する天然反復の最後の１１個のアミノ酸および最初の１１個のアミノ酸を、すべての隣接する合成免疫原接合部（ＲＭＣ１－ＲＭＣ２、ＲＭＣ２－ＲＭＣ３、ＲＭＣ３－ＲＭＣ４、ＲＭＣ４－Ｒ６１、およびＲ６３合成コンセンサスＣＴＤ）の最後の１１個のアミノ酸および最初の１１個のアミノ酸とアライメントさせた。分析結果は、ＲＭＣ４－Ｒ６１合成免疫接合部を除いて（すべての天然反復接合部と最大７６．２％の配列同一性を共有したのみであった）、すべての合成免疫原接合部が少なくとも１つの天然反復接合部と＞９５．２％の配列同一性を共有したことを示した（図６Ａ）。
オフターゲットエピトープがＲＭＣ４－Ｒ６１接合部配列に導入される可能性を低減するために、天然ＭＵＣ１６反復５９（Ｒ５９）を、ＲＭＣ４とＲ６１（合成コンセンサスＩＲＣ＋Ｒ５９免疫原）との間に挿入した（図６Ｂ）。配列分析は、ＲＭＣ４－Ｒ５９およびＲ５９－Ｒ６１接合部が、ＲＭＣ４－Ｒ６１接合部と比較して、天然反復接合部と高い同一性を共有した（それぞれ、８５．７％および９０．９％）ことを示した。さらに、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉ／）を使用したＭＨＣクラスＩエピトープ予測は、ＲＭＣ４－Ｒ５９およびＲ５９－Ｒ６１接合部におけるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ハロタイプの強い結合体を予測しなかった。
２つのプラスミド（一方はＲＭＣ１－ＲＭＣ４免疫原を発現し、もう一方はＲ６１、Ｒ６２、Ｒ６３、および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＣＴＤ免役原を発現する）を使用すること、予備合成免疫原のＲＭＣ４と天然Ｒ６１との間にフーリン切断部位を付加すること、ならびに一方がＲＭＣ１－ＲＭＣ４免疫原の発現を駆動するプロモーター（ｈＣＭＶ）、そしてもう一方がＲ６１、Ｒ６２、Ｒ６３、および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＣＴＤ免疫原の発現を駆動するプロモーター（ｓＣＭＶ）を有するデュアルプロモーター発現ベクターを使用することを含む、ＲＭＣ４－Ｒ６１接合部の導入を避けるためのさらなる戦略も利用された。結果として、５つの異なる合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＤＮＡプラスミドを表３に示すように生成した。合成コンセンサスＭＵＣ１６免疫原の略図を図７に示す。
Figure 0007441169000003
より高い発現レベルを有するように、上流コザックおよびＩｇＥリーダー配列を４つすべての合成コンセンサスＭＵＣ１６免疫原のＮ末端に付加した。Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４，８０９－８１６（２００１）。さらに、これらの免疫原をコードするＤＮＡ配列のコドン使用をヒト遺伝子のコドンバイアスに適合させた。Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１４９７－１５０３（１９９８）、Ｄｅｍｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，１０９９１－１１００１（２００１）。
加えて、ＲＮＡ最適化も行った：非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域ならびに内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位などのシス作用性配列モチーフは避けられた。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１，４８９２－４９０３（１９９７）、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４，１３４－１４６（２００３）。合成された合成コンセンサスＭＵＣ１６免疫原を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（ｐＧＸ１４３５－ｐＧＸ１４３８）のいずれか、またはＰｍｅＩおよびＸｈｏＩもしくはＳａｌＩおよびＭｌｕＩ（ｐＧＸ１４３９）のいずれかで消化し、Ｉｎｏｖｉｏの発現ベクターｐＧＸ０００１（ｐＧＸ１４３５－３８）またはＩｎｏｖｉｏのデュアルプロモーター発現ベクターｐＧＸ０００３（ｐＧＸ１４３９）のいずれかにクローニングした。すべての合成コンセンサスＭＵＣ１６プラスミドに関して、完全長配列決定を行い、その後分析し、２つの分析物が正しいことを確認した。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ配列に基づく合成コンセンサスＭＵＣ１６免疫原の中央タンデム反復領域の代表的な比較モデルを図８Ａ～８Ｃに示す。図８Ａは、天然ＭＵＣ１６（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＬ６５１３３．２に基づく）および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣの略図である。大きさにおける明確な違いが２つの分子間で存在し、天然配列は合成コンセンサスのバージョンに存在しない追加のドメインを含有する。天然ＭＵＣ１６および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣの両方は、一連のウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン（ＳＥＡ）様反復ならびに膜貫通ドメインを含有する。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣにおいて、反復配列は、中央タンデム反復設計戦略のセクションに記載のマイクロコンセンサス配列プロトコルに基づく。図８Ｂに示されるように、比較モデル化は、天然ＭＵＣ１６と合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ設計との間の大きさの違いを図示する。ＳＥＡ様反復モジュールは、天然ＭＵＣ１６および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣの両方についてモデル化された。天然配列の大きさにより、モデル化は、低解像度のみで行われ、相対的大きさの情報を伝えるために提供された。図８Ｃは、ｃｐｋ形式で示される合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ反復領域の比較モデルを示す。ＭＵＣ１６の大きなＮ末端領域ならびにＣ末端領域は、信頼できる親テンプレートを有する配列を含有せず、そのためそれらはモデル化することができなかった。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ＋Ｒ５９のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）は、それぞれ、表２１および表２２に表示される。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣのヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）は、それぞれ、表２３および表２４に表示される。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣのヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）は、それぞれ、表２５および表２６に表示される。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣのヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）は、それぞれ、表２７および表２８に表示される。配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８の要素の注釈、ならびに対応するアミノ酸位置は、表４に提供される。
Figure 0007441169000004
合成コンセンサスＭＵＣ１６免疫原と天然配列との間の違いを表５に要約する。中央タンデム反復ドメインの大きさは種間で異なり（ヒト：６３反復、アカゲザル：４反復；マウス：１５反復）、個々の反復の大きさは種間で大きく異なるため、完全長合成ＭＵＣ１６免疫原配列を種特異的天然配列と正確にアライメントすることは困難である。したがって、中央タンデム反復ドメインに関して、この領域が反復配列の最も保存された領域であるため、合成構築物のウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン（ＳＥＡ）ドメイン領域のみを、天然ヒト、マウス、およびアカゲザルＳＥＡドメイン配列と比較した。
Figure 0007441169000005
実施例４：プラスミド構築および構造
ｐＧＸ０００１
ベクター骨格ｐＧＸ０００１は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）の制御下の２９９８ｂｐの修飾されたｐＶＡＸ１発現ベクターである。元のｐＶＡＸ１は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。修飾された発現ベクターｐＶＡＸ１（ｐＧＸ０００１）のマップおよび説明は、それぞれ、図９および表６に示される。
Figure 0007441169000006
修飾をｐＶＡＸ１に導入して、ｐＧＸ０００１を創出した。これらの修飾を表７に列記し、プラスミド増幅ならびに抗原転写および翻訳に関する問題は検出されなかった。ｐＧＸ０００１の配列におけるさらなる変更は、骨格としてｐＧＸ０００１を使用するプラットホームでのプラスミド産生のいずれにおいても観察されなかった。塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流の骨格において、ＡＣＴからＣＴＧに変更された。
Figure 0007441169000007
ｐＧＸ０００３
ベクター骨格ｐＧＸ０００３は、２つのプロモーター：ＳＶ４０ポリＡシグナルを伴うｈＣＭＶプロモーターおよびｂＧＨポリＡシグナルを伴うｓＣＭＶプロモーターの制御下で挿入のための２つの複数のクローニング部位を有する４５９６塩基対の真核生物発現プラスミドである。この骨格は、ＫａｎＲおよびｐＵＣ ｏｒｉも含む。ｐＧＸ０００３のマップおよび説明は、それぞれ、図１０および表８に示される。
Figure 0007441169000008
ｐＧＸ１４３５
ｐＧＸ１４３５は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位において合成コンセンサスＭＵＣ１６（合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ＋Ｒ５９）ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製された。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。ｐＧＸ１４３５および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ＋Ｒ５９の略図は図１１に提示され、プラスミドおよび対応する塩基対の要素は、表９に提示される。
Figure 0007441169000009
ｐＧＸ１４３６
ｐＧＸ１４３６は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位において合成マイクロコンセンサスＭＵＣ１６（合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣ）ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製された。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。ｐＧＸ１４３６および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣの略図は図１２に提示され、プラスミドおよび対応する塩基対の要素は、表１０に提示される。
Figure 0007441169000010
ｐＧＸ１４３７
ｐＧＸ１４３７は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位において合成コンセンサスＭＵＣ１６（合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣ）ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製された。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。ｐＧＸ１４３７および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣの略図は図１３に提示され、プラスミドおよび対応する塩基対の要素は、表１１に提示される。
Figure 0007441169000011
ｐＧＸ１４３８
ｐＧＸ１４３８は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位において合成コンセンサスＭＵＣ１６（合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣ）ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製された。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。ｐＧＸ１４３８および合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＲＣの略図は図１４に提示され、プラスミドおよび対応する塩基対の要素は、表１２に提示される。
Figure 0007441169000012
ｐＧＸ１４３９
ｐＧＸ１４３９は、ＳａｌＩおよびＭｌｕＩ部位において合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣ ＤＮＡ配列を、そしてＰｍｅＩ およびＸｈｏＩ部位において合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣ ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００３にクローニングすることにより作製された。
ｐＧＸ１４３９は、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣ関連ｍＲＮＡ産生がヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、かつサルウイルス４０ポリ－アデニル化シグナル（ＳＶ４０ポリＡ）によって終結され、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣ関連ｍＲＮＡ産生がサルＣＭＶプロモーター（ｓＣＭＶプロモーター）によって駆動され、かつウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される、デュアルプロモーターＤＮＡプラスミドである。ｐＧＸ０００３骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。
ｐＧＸ１４３９ならびに合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＲＭＣおよび合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＮＲＣの略図は図１５に提示され、プラスミドおよび対応する塩基対の要素は、表１３に提示される。
Figure 0007441169000013
実施例５：インビトロ抗原発現
ｐＧＸ１４３５、ｐＧＸ１４３６、ｐＧＸ１４３７、ｐＧＸ１４３８、およびｐＧＸ１４３９による抗原タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングにより確認された。１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地中に維持されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３６）を、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ ８（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、ｐＧＸ１４３５、ｐＧＸ１４３６、ｐＧＸ１４３７、ｐＧＸ１４３８、ｐＧＸ１４３９、またはｐＧＸ０００１（６μｇ／１０ｃｍ2皿）でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞を溶解し、細胞溶解物を収集した。総タンパク質濃度を決定するためのＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）後、１５μｇの細胞溶解物を、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で電気穿孔し、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、クローンＥＰＳＩＳＲ２３－９６、ａｂ１６８３６０）を使用して検出を行い、次いでＥＣＬウエスタンブロット分析システム（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃ｓｃ－２００４）で可視化した。ローディング対照として、抗β－アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローン、Ｃ４）を使用して、アクチン発現についてブロットを再検出した。
合成コンセンサスＭＵＣ１６（約１６２．５ｋＤ）の予想された分子量のタンパク質バンドならびに領域１（約６８．２ｋＤａ）および領域２（約７７．２ｋＤａ）のタンパク質バンドが検出された（図１６）。ｐＧＸ０００１レーンにおいて、タンパク質バンドは検出されず、タンパク質バンドが合成コンセンサスＭｕｃ１６に特異的であったことを示した。類似する強度の抗β－アクチンバンドが検出され、等量のタンパク質が各レーンにローディングされたことを示す。ｐＧＸ１４３５およびｐＧＸ１４３８は、そのそれぞれの抗原タンパク質を発現することが分かり、ｐＧＸ１４３６、ｐＧＸ１４３７、およびｐＧＸ１４３９がそれらのそれぞれの抗原タンパク質領域を発現することが分かった。
実施例６：合成コンセンサスメソテリンワクチン構築物の免疫原性
動物および免疫化
雌の８週齢のＣＢ６Ｆ１マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。すべての動物を、ＢＴＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の温度制御された光サイクル施設に収容した。動物のケアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐｒｏｐｏｓａｌ（ＡＣＵＰ）（ＢＴＳ ＡＣＵＰ ＃１５－０９１）のガイドラインに従って行われた。表１４に詳述されるように、マウスを１６の群に分けた。
Figure 0007441169000014
ＳＯＰ Ｒ２０－００３１４７ ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３Ｐ Ｍｏｕｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔに従い、免疫化群のマウスに、示される用量のｐＧＸ０００１またはｐＧＸ１４３５、ｐＧＸ１４３６、ｐＧＸ１４３７、ｐＧＸ１４３８、ｐＧＸ１４３９をワクチン接種した。簡潔に、示される用量が筋肉内注射により３０μＬの注射量で前脛骨筋に送達されるように、プラスミドを減菌注射用水（ＶｅｔＯｎｅ）用に製剤化した。各筋肉内注射の直後に、３Ｐアレイを備えるＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用する電気穿孔（ＥＰ）が続いた。装置は、５２ｍｓパルス幅の２つの０．１Ａｍｐパルスを１秒遅れの間隔で送達するように構成された。マウスおよび群の数が多いため、各群のマウスの半分は３週間隔で３回の免疫化を受けた。最後の免疫化の１週間後にこれらのマウスを屠殺し、細胞免疫の読み取りのために脾臓を採取した。各群のマウスのもう半分が３週間隔で３回の免疫化を受けた。最後の免疫化の１週間後にマウスを屠殺し、細胞免疫の読み取りのために脾臓を採取した。他の組織は収集されなかった。
脾臓リンパ球の単離
脾細胞を無菌で単離し、５ｍＬのＲ１０培地（１０％のウシ胎仔血清および１％の抗生物質－抗真菌薬で補充されたＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０）に入れた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ機器（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して脾臓を機械的に破砕することにより脾細胞を単離し、４０－μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して、得られた産物を濾過した。得られた産物を遠心分離し、ＲＢＣの溶解のためにペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で５分間処理した。次いで、脾細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、その後Ｒ１０培地に再懸濁し、さらなる分析のために直ちに使用した。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ
ＭａｂＴｅｃｈ（ＭａｂＴｅｃｈ、＃３３２１－４ＡＰＷ－１０）からのキットを使用してマウス ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行い、抗原特異的細胞応答を評価した。抗マウスＩＦＮγ抗体（ｍＡｂ ＡＮ１８）で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳ中で洗浄し、Ｒ１０培地で室温で２時間遮断し、その後２×１０５細胞／ウェルの投入細胞数で（３つ組で）蒔いた。ペプチドのセットを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、それぞれ、各構築物の全合成コンセンサスＭＵＣ１６タンパク質配列を表す、１１個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含有する。ペプチドのこれらのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、約２μｇ／ｍｌのペプチドの濃度で６つのペプチドプールにプールした。ペプチドプールは、図１７に提供される略図に示される合成コンセンサスＭＵＣ１６抗原タンパク質に対応するペプチドを含有した。５μｇ／ｍｌのコンカバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベータ中で、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、ビオチン化抗マウスＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ、ｍＡｂ Ｒ４－６Ａ２）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＬＰ抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。キット製造業者の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を使用してスポット検出を完了した。プレート上のスポットは、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して計数した。スポット形成単位（Ｓｐｏｔ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ）（ＳＦＵ）の平均数は、データ表示のために１×１０６脾細胞に調整された。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによる抗原特異的応答は、培地のみの対照のＳＦＵよりも大きい１×１０6脾細胞あたりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数として報告される。
合成コンセンサスＭＵＣ１６構築物の免疫原性を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ およびフローサイトメトリー（ｎ＝８／群）により、３つの投与量（１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇ）で評価した。マウスを、陰性対照として空のプラスミド骨格（ｐＧＸ０００１）で免疫化した（ｎ＝４／群）。合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物（ｐＧＸ１４３５、ｐＧＸ１４３８、およびｐＧＸ１４３９）でのワクチン接種は、陰性対照ワクチン接種されたマウスと比較して、非常に頑強な細胞免疫応答を誘導した。
ＥＬＩＳｐｏｔにより決定される、ｐＧＸ１４３５により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６に対するＩＦＮγ産生の規模は用量依存的であった（図１８Ａ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３５ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、１５６４±６６１、３８５８±２７６７、および５４０７±１９５９であった。ｐＧＸ１４３５により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３５の１０μｇ（ｐ＝０．００２）、３０μｇ（ｐ＝０．０２８）、および５０μｇ（ｐ＝０．００１）の用量で、ナイーブよりも有意に大きかった。ｐＧＸ１４３５により誘導された独特のＲ５９（ペプチドプール６）エピトープに対する検出可能な応答も図１８Ｄに示される。
ＥＬＩＳｐｏｔにより決定される、ｐＧＸ１４３８構築物により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ産生の規模は用量依存的ではなく、より低い用量はより頑強な応答を示す（図１８Ｂ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３８ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、５６２８±３１４４、７６６８±３３７１、および６００５±３４７２であった。ｐＧＸ１４３８により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３５の１０μｇ（ｐ＝０．００８）、３０μｇ（ｐ＝０．００２）、および５０μｇ（ｐ＝０．００９）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。
ＥＬＩＳｐｏｔにより決定される、ｐＧＸ１４３９構築物により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ産生の規模も用量依存的ではなく、より低い用量はより頑強な応答を示す（図１８Ｃ）。具体的には、ｐＧＸ１４３９合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、３１８０±１３７７、６１３８±２６９６、および４８６２±２０６９であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３９ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３５の１０μｇ（ｐ＝０．００２）、３０μｇ（ｐ＝０．００２）、および５０μｇ（ｐ＝０．００２）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。
完全長構築物のＩＦＮγ応答を表１５に要約する。
Figure 0007441169000015
合成コンセンサスＭＵＣ１６部分長構築物（ｐＧＸ１４３６およびｐＧＸ１４３７）でのワクチン接種も、陰性対照ワクチン接種されたマウスと比較して、非常に頑強な細胞免疫応答を誘導した。
ＥＬＩＳｐｏｔにより決定される、ｐＧＸ１４３６構築物により誘導された領域１に対する合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ産生の規模は用量依存的であった（図１９Ａ）。具体的には、ｐＧＸ１４３６により誘導された合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、３６０９±１３７７、４７１１±２３６５、および５５６５±３４９６であった。ｐＧＸ１４３６により誘発された合成コンセンサスＭＵＣ１６ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３６の１０μｇ（ｐ＝０．００１）、３０μｇ（ｐ＝０．００４）、および５０μｇ（ｐ＝０．０１４）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。すべてのＭＵＣ１６構築物により誘導された領域１に対するＩＦＮγ応答を比較した場合、ｐＧＸ１４３５誘導応答はｐＧＸ１４３８よりも有意に低い（図１９Ｂ）。
ＥＬＩＳｐｏｔにより決定される、ｐＧＸ１４３７構築物により誘導された領域２に対する合成コンセンサスＭＵＣ１６特異的ＩＦＮγ産生の規模も用量依存的であった（図１９Ｃ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、８３５±４２８、１８９３±１２９１、および２３９９±１２４５であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３７の１０μｇ（ｐ＝０．００５）、３０μｇ（ｐ＝０．０２２）、および５０μｇ（ｐ＝０．００５）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。ｐＧＸ１４３８での領域２に対するＩＦＮγ産生がより頑強である傾向があった（図１９Ｄ）。
部分長構築物のＩＦＮγ応答を表１６に要約する。
Figure 0007441169000016
フローサイトメトリー
合成コンセンサスＭＵＣ１６により誘導された細胞性免疫応答は、フローサイトメトリーによりさらに特徴付けされた。ワクチン接種されたおよびナイーブマウスからの２ｘ１０6脾細胞を、単離後に、ブレフェルディンＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で６時間、合成コンセンサスＭＵＣ１６ペプチドで直ちに刺激した。ペプチドでの刺激後、脾細胞を沈降させ、２０μＬ／ウェルのマウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液に再懸濁した。ＰＢＳ中１：４０の初期希釈でＦｃ Ｂｌｏｃｋを使用し、４℃で５分間インキュベートした。
インキュベーション後、残りの細胞外抗体（ＰＢＳ中）を３０μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞外株の添加により、１：１００の最終希釈でのＦｃ Ｂｌｏｃｋおよびそれらの適切な作業希釈での細胞外抗体からなる、各ウェルの最終容積は５０μＬである。次いで、細胞を、生存率染色（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）（Ｖｉｖｉｄ，Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）および以下の細胞外抗体：ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＲＭ４－５）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン６３－６，７）で染色した。その後、細胞内サイトカインを以下の抗体：ＢＶ６０５抗マウスＩＦＮγ、ＡＰＣ－Ｒ７００抗マウスＩＬ－２、およびＰＥ抗マウスＴＮＦ－α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を固定し、４℃で２０分間透過処理した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５４７１４）。細胞内染色を、その後、以下の抗体：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５－２Ｃ１１）、ＢＶ６０５抗マウスＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＸＭＧ１．２）、ＡＰＣ－Ｒ７００抗マウスＩＬ－２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＪＥｓ６－５Ｈ４）、およびＰＥ抗マウスＴＮＦ－α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＭＰ６－ＸＴ２２）で完了した。
１０色ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＩＣＳデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を完了した。フローサイトメトリーゲーティング戦略を図２０に示す。フローサイトメトリーにより抗原特異的と呼ばれる細胞に関して、報告されたパラメータの頻度は、培地のみの対照の頻度を超えなければならない。抗原特異的ＣＤ１０７ａを産生すると同定される細胞に関して、細胞は、ブーリアンゲーティングにより同定される、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－２および／またはＴＮＦαの抗原特異的産生にも陽性であると同定されなければならない。
合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物は、ＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおいて強い応答を誘発し、ｐＧＸ１４３８が最も頑強であった（図２１Ａ～２１Ｃ）。合成コンセンサスＭＵＣ１６は、ｐＧＸ１４３５、ｐＧＸ１４３８、およびｐＧＸ１４３９の１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇ用量レベル群において、ナイーブ（０．２９％±０．２３％）よりも有意により頑強な抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答頻度を誘発した（図２１Ａ～２１Ｃ）。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３５構築物特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の規模は、用量依存的であった（図２１Ａ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３５ ＣＤ４+Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、１．３４％±０．４５％、２．２７％±１．３８％、および３．１２％±１．４５％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３５ ＣＤ４+Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３５の１０μｇ（ｐ＜０．００１）、３０μｇ（ｐ＝０．０２０）、および５０μｇ（ｐ＝０．００４）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３５特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+、またはＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-産生ＣＤ４+Ｔ細胞からなった。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３８構築物特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の規模も、用量依存的であった（図２１Ｂ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３８ ＣＤ４+Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、３．１２％±１．１９％、３．７３％±１．４８％、および４．０６％±１．８７％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３８ ＣＤ４+Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３８の１０μｇ（ｐ＝０．００１）、３０μｇ（ｐ＝０．００１）、および５０μｇ（ｐ＝０．００３）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３８特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ＋ＩＬ－２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ－２－ＴＮＦα＋、またはＩＦＮγ+ＩＬ-２－ＴＮＦα-産生ＣＤ４+Ｔ細胞からなった。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３９構築物特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の規模は、用量依存的であった（図２１Ｃ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３９ ＣＤ４+Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、１．９９％±０．９９％、２．７１％±０．５１％、および３．２５％±１．２９％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３９ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３９の１０μｇ（ｐ＝０．００７）、３０μｇ（ｐ＜０．００１）、および５０μｇ（ｐ＝０．００１）の投与量で、ナイーブよりも有意に大きかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３９特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ＋ＩＬ－２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ－２－ＴＮＦα＋、またはＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-産生ＣＤ４＋Ｔ細胞からなった。抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表１７にさらに詳述される。
合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物のすべての投与量が、ナイーブ（０．０８％±０．０４％）よりも大きいＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度を誘導したが、すべての用量でのｐＧＸ１４３８構築物のみが 有意により頑強であった。
具体的には、ｐＧＸ１４３５抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．０１１）、３０μｇ（ｐ＝０．２９７）、および５０μｇ（ｐ＝０．００８）の投与量群において、それぞれ、０．２７％±０．１４％、０．３２％±０．３７％、および０．６４％±０．３４％であった（図２１Ａ）。ｐＧＸ１４３５特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２２Ａ）。
ｐＧＸ１４３８抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．００４）、３０μｇ（ｐ＝０．０２９）、および５０μｇ（ｐ＝０．００４）の投与量群において、それぞれ、０．４０％±０．１８％、０．５４％±０．３６％、および０．５３％±０．２５％であった（図２１Ｂ）。ｐＧＸ１４３８特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２２Ｂ）。
ｐＧＸ１４３９抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．０６９）、３０μｇ（ｐ＝０．００８）、および５０μｇ（ｐ＝０．００６）の投与量群において、それぞれ、０．２６％±０．１８％、０．３６％±０．１８％、および０．５０％±０．２５％であった（図２２Ｃ）。ｐＧＸ１４３９特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２２Ｃ）。細胞溶解能力を有する抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表１７にさらに詳述される。
Figure 0007441169000017
合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物により誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての構築物の全投与量群において対照（０．１３％±０．１５％）より増加した（図２３Ａ～２３Ｃ）。具体的には、ｐＧＸ１４３５の１０μｇ（０．６５％±０．２８％、ｐ＝０．００７）、３０μｇ（０．８２％±０．４６％、ｐ＝０．０２２）、および５０μｇ（１．６０±１．０８％、ｐ＝０．０３４）で免疫化された群における抗原特異的ＣＤ８+Ｔ応答の頻度は、ナイーブと比較して有意により頑強であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３５特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答は用量依存的であり、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+産生ＣＤ８+Ｔ細胞からなった（図２３Ａ）。
ｐＧＸ１４３８の１０μｇ（１．３０％±０．７９％、ｐ＝０．０２４）、３０μｇ（１．３３％±０．８７％、ｐ＝０．０３４）、および５０μｇ（１．３６％±０．７１％、ｐ＝０．０１０）で免疫化された群における抗原特異的ＣＤ８+Ｔ応答の頻度も、ナイーブと比較して有意により頑強であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３８特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答は用量依存的ではなく、用量間でほとんど差がなく、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+産生ＣＤ８+Ｔ細胞からなった（図２３Ｂ）。
ｐＧＸ１４３９の１０μｇ（１．３６％±０．６２％、ｐ＝０．００４）、３０μｇ（２．０７％±１．７７％、ｐ＝０．０８９）、および５０μｇ（１．１９％±０．６９％、ｐ＝０．０２０）で免疫化された群における抗原特異的ＣＤ８+Ｔ応答の頻度は、ナイーブと比較してより頑強であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３９特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答は用量依存的ではなく、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+産生ＣＤ８+Ｔ細胞からなった（図２３Ｃ）。抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、表１８にさらに詳述される。
抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞のパターンと類似して、合成コンセンサスＭＵＣ１６完全長構築物は、ナイーブ（０．０５％±０．０４％）と比較して、すべての群の間でＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度において有意な変化を誘導したが、３０μｇの投与量でのｐＧＸ１４３９は例外であった（図２４Ａ～２４Ｃ）。具体的には、抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、ｐＧＸ１４３５の１０μｇ（ｐ＝０．００５）、３０μｇ（ｐ＝０．０１３）、および５０μｇ（ｐ＝０．０４３）の投与量群において、それぞれ、０．４７±０．２３％、０．５９±０．３４％、および１．１９±０．９０％であった（図２４Ａ）。ｐＧＸ１４３５特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、大部分はＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２３Ａ）。
抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、ｐＧＸ１４３８の１０μｇ（ｐ＝０．０１６）、３０μｇ（ｐ＝０．０３９）、および５０μｇ（ｐ＝０．０１６）の投与量群において、それぞれ、０．８０％±０．４８％、１．０５％±０．７７％、および１．０５％±０．６５％であった（図２３Ｂ）。ｐＧＸ１４３８特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、大部分は、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２４Ｂ）。
抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、ｐＧＸ１４３９の１０μｇ（ｐ＝０．０１８）、３０μｇ（ｐ＝０．０９４）、および５０μｇ（ｐ＝０．０３８）の投与量群において、それぞれ、１．０４％±０．６５％、１．６８％±１．５４％、および０．９３％±０．６８％であった（図２３Ｃ）。ｐＧＸ１４３９特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、大部分はＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２４Ｃ）。細胞溶解能力を有する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、表１８にさらに詳述される。
Figure 0007441169000018
合成コンセンサスＭＵＣ１６部分長構築物は、ＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおいて強い応答を誘発した（図２５Ａ～２５Ｂおよび図２６Ａ～２６Ｂ）。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６構築物特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の規模は、用量依存的ではなかった（図２５Ａ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６ ＣＤ４+Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、１．７４％±０．７９％、２．１８％±１．１５％、および１．３２％±１．７４％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６ ＣＤ４+Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３６の１０μｇ（ｐ＝０．００３）および３０μｇ（ｐ＝０．００７）の投与量で、ナイーブ（０．１７％±０．１０％）よりも有意に大きかったが、５０μｇ（ｐ＝０．３５９）の投与量ではそうではなかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+、またはＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-産生ＣＤ４+Ｔ細胞からなった。ｐＧＸ１４３６抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．０２０）、３０μｇ（ｐ＝０．０８０）、および５０μｇ（ｐ＝０．３６９）の投与量群において、それぞれ、０．４５％±０．２８％、０．３１％±０．２６％、および０．２３％±０．３０％であった（図２５Ｂ）。ｐＧＸ１４３６特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２５Ｂ）。細胞溶解能力を有する抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表１９にさらに詳述される。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７構築物特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の規模は、用量依存的であった（図２６Ａ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、０．５６％±０．３８％、１．１４％±０．３６％、および１．８７％±１．０５％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３７の３０μｇ（ｐ＜０．００１）および５０μｇ（ｐ＝０．０１１）で、ナイーブ（０．２１％±０．１４％）よりも有意に大きかったが、１０μｇ（ｐ＝０．０６３）の投与量ではそうではなかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+、またはＩＦＮγ-ＩＬ－２-ＴＮＦα+産生ＣＤ４+Ｔ細胞からなった。ｐＧＸ１４３７抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．３３５）、３０μｇ（ｐ＜０．００１）、および５０μｇ（ｐ＝０．０１６）の投与量群において、それぞれ、０．０９％±０．０９％、０．２１％±０．０５％、および０．３６％±０．２１％であった（図２６Ｂ）。ｐＧＸ１４３７特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２６Ｂ）。細胞溶解能力を有する抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表１９にさらに詳述される。
Figure 0007441169000019
合成コンセンサスＭＵＣ１６部分長構築物は、ＣＤ８+Ｔ細胞コンパートメントにおいて頑強な応答を誘発した（図２７Ａ～２７Ｂ及び図２８Ａ～２８Ｂ）。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６構築物特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の規模は、用量依存的ではなかった（図２７Ａ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６ ＣＤ８+Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、１．７６％±０．７３％、２．１７％±０．８１％、および１．９２％±２．１３％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６ ＣＤ８+Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３６の１０μｇ（ｐ＝０．００２）および３０μｇ（ｐ＝０．００１）で、ナイーブ（０．０６％±０．０８％）よりも有意に大きかったが、５０μｇ（ｐ＝０．１９２）の投与量ではそうではなかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-またはＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞からなった。ｐＧＸ１４３６抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+ Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．００１）、３０μｇ（ｐ＝０．００１）、および５０μｇ（ｐ＝０．１９３）の投与量群において、それぞれ、１．５５％±０．６４％、１．８６％±０．７３％、および１．７２％±１．９５％であった（図２６Ｂ）。ｐＧＸ１４３６特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２７Ｂ）。全体的に、ｐＧＸ１４３５により誘導された領域１に対するＣＤ８+ Ｔ細胞応答は、ｐＧＸ１４３６よりも有意に低かった（図２９Ａ）。細胞溶解能力を有する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、表２０にさらに詳述される。
合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７構築物特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の規模は、用量依存的であった（図２８Ａ）。具体的には、合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７ ＣＤ８+Ｔ細胞は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量において、それぞれ、０．２６％±０．１４％、０．７７％±０．４７％、および０．８９％±０．３７％であった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７ ＣＤ８+Ｔ細胞は、ｐＧＸ１４３７の３０μｇ（ｐ＝０．０２５）および５０μｇ（ｐ＝０．００１）で、ナイーブ（０．０７％±０．０７％）よりも有意に大きかったが、１０μｇ（ｐ＝０．０６９）の投与量ではそうではなかった。合成コンセンサスＭＵＣ１６ ｐＧＸ１４３７特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+またはＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-産生ＣＤ８+ Ｔ細胞からなった。ｐＧＸ１４３７抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．０２２）、３０μｇ（ｐ＝０．０３０）、および５０μｇ（ｐ＝０．００２）の投与量群において、それぞれ、０．１６％±０．１０％、０．５８％±０．４０％、および０．８９％±０．３７％であった（図２８Ｂ）。ｐＧＸ１４３７特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+細胞で構成された（図２８Ｂ）。全体的に、ｐＧＸ１４３５およびｐＧＸ１４３８により誘導された領域２に対するＣＤ８+Ｔ細胞応答は、ｐＧＸ１４３７よりも有意に低かった（図２９Ｂ）。細胞溶解能力を有する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、表２０にさらに詳述される。
Figure 0007441169000020
統計分析
ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２（ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して統計分析を完了した。多重比較を調整するためにＴｕｋｅｙの事後Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＤ）とともにＡＮＯＶＡを使用して、群間の分析を行った。等分散性は多重比較の前にＦ統計を使用して確認された。すべての統計分析に関して、０．０５０のｐ値が有意であるとみなされた。
結論
全体的に、完全長ＭＵＣ１６構築物ｐＧＸ１４３８（フーリン切断）およびｐＧＸ１４３９（デュアルプロモーター）は、ｐＧＸ１４３５（融合）と比較して、より頑強な免疫応答を誘導した（図３０Ａ～Ｃ）。ｐＧＸ１４３５と比較して、ｐＧＸ１４３８は、１０μｇおよび３０μｇの投与量で、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより有意により頑強な応答を誘導した。また、ＣＤ４+ Ｔ細胞コンパートメントにおいて、ｐＧＸ１４３８は、１０μｇの投与量でのｐＧＸ１４３５と比較して、有意により頑強な応答を誘発した。３つの完全長ＭＵＣ１６構築物により誘導された応答の規模において、有意な差は他になかったが、ｐＧＸ１４３８およびｐＧＸ１４３９により誘導されたＣＤ８+ Ｔ細胞応答がより頑強である傾向があった。
さらに、ｐＧＸ１４３８およびｐＧＸ１４３９は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより決定されるように、およびＣＤ４+Ｔ細胞コンパートメントにおいて、ｐＧＸ１４３６に等しい領域１に対する応答を誘導し、ｐＧＸ１４３７に等しい領域２に対する応答を誘導した。ｐＧＸ１４３９のみがＣＤ８+ Ｔ細胞コンパートメントにおいてｐＧＸ１４３７に等しい応答を誘導した。
前述の詳細な説明および付随する実施例は一例にすぎず、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されないことが理解される。
本開示の実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含む、本開示の実施形態に対するそのような変更および修正は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。
Figure 0007441169000021
Figure 0007441169000022
Figure 0007441169000023
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Figure 0007441169000025
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Figure 0007441169000029
Figure 0007441169000030

Claims (72)

  1. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  2. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０、および
    （ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～４４７０と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  3. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号２をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号２と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  4. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号１、および
    （ｂ）配列番号１と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  5. 配列番号１に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  6. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  7. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６、および
    （ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～１９２６と少なくとも９８％同一である断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  8. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号４をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  9. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号３、および
    （ｂ）配列番号３と少なくとも９８％同一である断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  10. 配列番号３に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  11. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  12. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０、および
    （ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５～２１３０と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  13. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号６をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号６と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  14. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号５、および
    （ｂ）配列番号５と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  15. 配列番号５に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  16. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  17. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３、および
    （ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～１９２６および１９４８～４０２３と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  18. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  19. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３、および
    （ｂ）配列番号７のヌクレオチド５５～４０２３と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  20. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号８をコードする核酸配列、および
    （ｂ）配列番号８と少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸配列であって、前記タンパク質が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、核酸配列
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  21. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子であって、
    （ａ）配列番号７、および
    （ｂ）配列番号７と少なくとも９８％同一である断片であって、前記断片が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンをコードする断片
    からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  22. 配列番号７に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  24. 請求項６～１０のいずれか一項に記載の核酸分子および請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  25. 前記核酸分子が、プロモーターおよびポリ－アデニル化シグナルから選択される調節要素に動作可能に連結される、請求項２３または２４に記載のベクター。
  26. 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である、請求項２５に記載のベクター。
  27. 前記ポリ－アデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である、請求項２５に記載のベクター。
  28. 前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のベクター。
  29. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸分子を含む、組成物。
  30. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 請求項２３～２８のいずれか一項に記載の１つ以上のベクターを含む、組成物。
  32. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０、および
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～１４９０と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンを含むアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  34. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号２、および
    （ｂ）配列番号２と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンを含むアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  35. 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  36. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２、および
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸１９～６４２と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  37. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号４、および
    （ｂ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  38. 配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  39. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０、および
    （ｂ）配列番号６のアミノ酸１９～７１０と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンを含む、アミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  40. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号６、および
    （ｂ）配列番号６と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンを含む、アミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  41. 配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  42. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１、および
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～６４２および６５０～１３４１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、アミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  43. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１、および
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸１９～１３４１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、アミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  44. ＭＵＣ１６抗原タンパク質であって、
    （ａ）配列番号８、および
    （ｂ）配列番号８と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、アミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  45. 配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  46. 抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  47. 前記抗原が、配列番号１によってコードされる、請求項４６に記載のワクチン。
  48. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含み、前記核酸配列が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンをコードする、ワクチン。
  49. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、前記タンパク質が、配列番号２に対して、アミノ酸位置１４０８にアラニン、アミノ酸位置１４３１にアラニン、およびアミノ酸位置１４３７にアラニンを含む、ワクチン。
  50. 抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  51. 前記抗原が、配列番号３によってコードされる、請求項５０に記載のワクチン。
  52. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含む、ワクチン。
  53. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、ワクチン。
  54. 抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  55. 前記抗原が、配列番号５によってコードされる、請求項５４に記載のワクチン。
  56. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含み、前記核酸配列が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンをコードする、ワクチン。
  57. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、前記アミノ酸配列が、配列番号６に対して、アミノ酸位置６２８にアラニン、アミノ酸位置６５１にアラニン、およびアミノ酸位置６５７にアラニンを含む、ワクチン。
  58. 抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  59. 前記抗原が、配列番号７によってコードされる、請求項５８に記載のワクチン。
  60. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号７に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含み、前記核酸配列が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンをコードする、ワクチン。
  61. ＭＵＣ１６抗原タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、前記タンパク質が、配列番号８に対して、アミノ酸位置１２５９にアラニン、アミノ酸位置１２８２にアラニン、およびアミノ酸位置１２８８にアラニンを含む、ワクチン。
  62. 前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項４８～４９、５２～５３、５６～５７、または６０～６１に記載のワクチン。
  63. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項４８～４９、５２～５３、５６～５７、または６０～６１に記載のワクチン。
  64. アジュバントをさらに含む、請求項４８～４９、５２～５３、５６～５７、または６０～６１に記載のワクチン。
  65. 前記アジュバントが、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項６４に記載のワクチン。
  66. ＭＵＣ１６発現がんの治療における使用のための、請求項４６～４７、５０～５１、５４～５５、または５８～５９のいずれか一項に記載のワクチン。
  67. ＭＵＣ１６発現がんの治療における使用のための、請求項４８～４９、５２～５３、５６～５７、または６０～６５のいずれか一項に記載のワクチン。
  68. ＭＵＣ１６発現がんに対するワクチン接種における使用のための、請求項４６～６５のいずれか一項に記載のワクチン。
  69. 薬剤として使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  70. がんの治療において薬剤として使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  71. 薬剤の調製において使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  72. がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
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