CN104292333A - 小鼠抗人prrt2单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。PRRT2是新发现的基因，该基因突变可导致发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmalkinesigenicdyskinesia,PKD)。本发明提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQIDNO3-SEQIDNO8中的任意一条所示。本发明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，为进一步研究PRRT2在PKD发病中的作用提供了工具，具有重要应用前景。本发明还涉及上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法和应用。

Description

小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及PRRT2抗体的制备和应用。具体的说，本发明提供了一种小鼠抗人PRRT2蛋白的单克隆抗体、及其制备方法和应用。 

背景技术

发作性运动诱发性运动障碍是（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD） 是一种反复发作、运动诱发、持续时间短暂的运动障碍，呈常染色体显性遗传，表现为舞蹈症、手足徐动、投掷症、肌张力障碍等不自主运动。2011年，本申请的发明人在国际上首次发现PRRT2是家族性PKD的致病基因。 

人PRRT2位于16p11.2，有4个外显子，编码含340个氨基酸的富含脯氨酸跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2, PRRT2)。PRRT2蛋白属于CD225家族，其靠近C端有2个跨膜结构域。 

目前，几种商品化的PRRT2抗体均为多克隆抗体，特异性差，应用Western blot和免疫荧光的方法，该抗体检测结果显示明显的非特异性，从而对人PRRT2表达谱研究和功能研究受到限制。因此，制备特异性较好的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，并应用于表达谱分析及在PKD发病中的作用具有实际作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好的抗PRRT2蛋白的单克隆抗体。 

本发明的另一个目的是提供上述抗PRRT2蛋白的单克隆抗体的制备方法。 

本发明从PRRT2蛋白序列中设计串联的多肽抗原表位，进行抗原合成，进而制备筛选出PRRT2单克隆抗体，并进行应用。 

本发明抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合。选择长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽作为抗原表位。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不同肽片段之间插入一个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。通过全基因组化学合成的方法合成抗原表位对应的目的cDNA序列，重组到表达载体，诱导表达免疫原，纯化后多点免疫小鼠。经过了3年多时间、数以千次的试验，最终得到本发明的抗体。 

  

本发明提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条所示。较好的，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 6 或者 SEQ ID NO 7所示。

本发明提供了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，其制备方法是从PRRT2蛋白序列中选择数个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；任选组合佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。 

在本发明的一个优选例中，对所获得的抗人PRRT2单克隆抗体进行了保藏。相关产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，是分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株9293-1hz-3P2，保藏号为CGMCC No.7810。CGMCC即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年7月9日。 

本发明的抗人PRRT2单克隆抗体，能够特异性识别PRRT2蛋白。 

本发明还提供了上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤： 

（1）   从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干条；

（2）   合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；

（3）   佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。

其中所述选择数个肽片段作为抗原表位，通常选2-10个，本发明选择6个 肽片段。 

其中，所述的肽片段是长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区并且位于无序区域的肽。 

在本发明的一个实施例中，所述的串联多肽免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。 

所述肽片段可以采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序获得，然后通过实验检测验证。 

所述接头最好具有弱免疫原性。例如，在本发明的优选例中，采用的是GGGGS。制备单抗串联多肽原是5个GGGGS将选择6个抗原表位肽片段串联在一起的肽段。 

抗原表位cDNA可以通过本领域常规基因工程技术手段获得，或者采用全基因组化学合成的方法获得。 

串联多肽原的表达是通过将串联多肽原的cDNA重组到PET32a表达质粒，转化Rosetta感受态细胞，诱导表达获得。 

本发明的方法中，免疫过程中所使用的佐剂选自：弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。 

其中，所述多位点免疫在选自以下位点的、至少2个位点进行：颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。 

其中，所述细胞融合是将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（例如，SP2/0）进行融合。 

其中所述筛选是对融合的杂交瘤细胞进行筛选。杂交瘤的筛选是通过有限稀释法亚克隆和ELISA检测。所述抗体通过Western blot 和细胞免疫荧光进行特异性验证。 

在本发明的一个优选例中，所产生的单克隆抗体所对应的抗原表位是：PSSQLAGPGV。 

本发明的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体的提取方法具体如下： 

1. 人PRRT2免疫抗原设计

人PRRT2蛋白全长氨基酸序列为：（SEQ ID NO 1）

1   maassseise  mkgveespkv  pgegpghsea  etgppqvlag  vpdqpeapqp  gpnttaapvd 

61  sgpkaglape  ttetpagase  taqatdlsls  pggeskancs  pedpcqetvs  kpevskeata 

121 dqgsrlesaa  ppepapepap  qpdprpdsqp  tpkpalqpel  ptqedptpei  lsesvgekqe 

181 ngavvplqag  dgeegpapep  hsppskkspp  angapprvlq  qlveedrmrr  ahsghpgspr 

241 gslsrhpssq  lagpgvegge  gtqkprdyii  lailscfcpm  wpvnivafay  avmsrnslqq 

301 gdvdgaqrlg  rvakllsiva  lvggvliiia  scvinlgvyk

采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计软件从目标蛋白PRRT2的aa序列中挑选6条长度为10aa的肽段（见表1），肽段与肽段之间用GGGGS肽段连接。

最终确定PRRT2蛋白串联多肽序列为：PPQVLAGVPD-GGGGS-PKPALQ PELP-GGGGS-QETVSKPEVS-GGGGS-PSSQLAGPGV-EGPAPEPHSP-GGGGS- VPDQPEAPQP（SEQ ID NO 2）。 

表 1 免疫原串联多肽选择 

氨基酸序列	长度/aa	起始位点	终止位点	序列标号
					PPQVLAGVPD	10	34	43	（SEQ ID NO 3）
PKPALQPELP	10	152	161	（SEQ ID NO 4）
					QETVSKPEVS	10	106	115	（SEQ ID NO 5）
PSSQLAGPGV	10	247	256	（SEQ ID NO 6）
					EGPAPEPHSP	10	194	203	（SEQ ID NO 7）
VPDQPEAPQP	10	41	50	（SEQ ID NO 8）

将设计好的序列用DNA Works软件进行密码子优化，生成核苷酸序列，如下（SEQ ID NO 9）：CCUCCCCAAGUUCUUGCCGGUGUUCCGGAUCGGTGGTGGAGGTTCT   CAAAACCUGCACUGCAAGAAUUACCCGGGGGAGGCGGCAGCCAAGAGACUGUCAGCAAGCCAGAGGUGUCAGGTGGGGGTGGAAGCCCCUCUUCCCAGCUAGCCGGACCUGGGGUAGGCGGTGGCGGCTCGGAAGGUCCGGCCCCGGAGCCACACUCACCGGGTGGGGGTGGAAGCGUACCAGACCAACCAGAGGCCCCGCAACCU

由赛百盛（中国上海）公司采用全基因组化学合成的方法合成上述抗原DNA序列。

2. 抗原表达与纯化 

全基因合成的抗原序列利用BamHI/EcoRI酶切后，再与BamHI/EcoRI酶切并回收好的PET32a载体通过T4 连接酶在室温进行2h连接。连接产物与CaCl2法制备的Rosetta感受态细胞(Novagen, Merck, Germany)在冰上(4℃)孵育0.5h，再于42 ℃热激活90s，热激后的菌液补加500ul无抗性LB液体培养基后在37 ℃摇床上250rpm慢摇45min，最后涂板于含相应抗生素的LB平板上。在37℃培养箱将细菌平板培养过夜(16h)。

次日，挑转化菌落于自身诱导系统培养基中，37℃， 250rpm表达过夜。次日将菌液离心（6000g，5min），上清弃去，沉淀用裂解液（50mM Tris、500mM NaCl、4M urea、1mM PMSF，pH7.4）重悬并于室温裂解过夜。 

预先用25ml（5倍柱体积）裂解液平衡Ni²⁺–NTA柱，静置待用。细胞裂解液离心（15,000g, 10min）后将上清上柱，室温孵育1h。孵育后，待裂解液从柱上自然流净，用30ml洗涤液（4M urea，50mM Tris，500mM NaCl，30mM imidazole，pH 7.4）洗涤，最后用5ml洗脱液（4M urea，50mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH 7.4）洗脱收集蛋白。洗脱的蛋白透析到缓冲液(pH5.8的磷酸盐缓冲液)中，中途换液2次，共透析24小时。共得到1.2mg透析后蛋白，浓度为0.3mg/ml，纯度>95%。 

3. 动物免疫 

将成功获得的抗原与不同佐剂混合后皮下多点注射免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。第8天、第14天分别加强免疫一次，第14天小鼠眼眶取血，ELISA方法检测血清滴度，小鼠血清效价均大于1：32000。

4. 细胞融合和筛选 

第15天将免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。

具体方法如下：将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此为单克隆。即我们通常认为的建株成功的杂交瘤细胞株。将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2x10⁶ /管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。 

表位筛选结果见表2。 

表2 表位筛选结果

表位	表位序列	细胞株数	Elisa Titer*
				1	PPQVLAGVPD	0	—
2	PKPALQPELP	0	—
				3	QETVSKPEVS	0	—
4	PSSQLAGPGV	4	128K
				5	EGPAPEPHSP	4	128K
6	VPDQPEAPQP	0	—

Elisa Titer：将抗体进行一定的梯度稀释，大于NC（NC：免疫抗原包板，检测抗体为牛奶+细胞培养基）两倍且大于0.25的OD450值对应的稀释度值即为该抗体的效价。

5. 腹水制备、抗体纯化 

细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。采用Western blot和免疫荧光进行特异性验证，最终针对抗原表位PSSQLAGPGV制备的杂交瘤细胞株分泌的腹水经检测具有较好的特异性和敏感性；采用Protein G柱纯化腹水，得到纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80℃。

6. 小鼠抗人PRRT2单克隆抗体的应用 

(1). 免疫印记：用构建的pCMV-Myc-PRRT2表达质粒转染SH-SY5Y细胞，将收集的细胞裂解液按20μg上样电泳，转膜，5%脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60min，同样的方法电泳、转膜3次，然后将封闭的电转膜分别孵育

Myc标签抗体(1:5000)，市售的兔抗人PRRT2多克隆抗体(1:1000)和本发明小鼠抗人PRRT2单克隆抗体（1:1000），室温摇育2小时，或4℃摇育过夜， 1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG做为二抗，1：5000稀释，室温摇育60分钟， 1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，ECL显色，曝光仪曝光成像。结果显示，本发明的PRRT2检测结果同Myc标签抗体检测结果一致，在空转的细胞中未检测到条带，在转染野生型的PRRT2-Myc过表达质粒的细胞中检测到单一条带，表明本发明抗体特异性好。两种抗体检测结果均在约70KD处出现特异条带，而根据PRRT2的氨基酸序列预测PRRT2-Myc融合蛋白分子量约35KD，提示PRRT2-Myc融合蛋白可能被某种大分子物质修饰。而应用市售的兔抗人多克隆抗体空转细胞核转染野生型PRRT2的细胞均显示多条非特异性条带，进一步表明本发明抗体的优势。

(2). 细胞免疫荧光染色：将转染的pCMV-Myc-PRRT2的SH-SY5Y细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4%多聚甲醛固定细胞，10%山羊血清室温封闭细胞60min；分别用Myc标签抗体(1:500)、市售的兔抗人多克隆抗体(1:200)和本发明的小鼠抗人PRRT2抗体(1:200)稀释，室温反应2小时，1×PBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1：1000-1：2000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1×PBS摇洗3次，每次5-10分钟；封片镜下观察。 

结果显示，本发明的小鼠抗人PRRT2抗体同Myc标签抗体检测一致，在在空转的细胞中均未检测到表达，而在转染Myc-PRRT2质粒的SH-SY5Y细胞中两种抗体检测结果均表明PRRT2-Myc融合蛋白表达在细胞膜上，也表明本发明抗体具有较好的特异性。而市售的兔抗人多克隆抗体检测结果显示在空转和转染野生型PRRT2的细胞的胞浆和胞膜中均有表达，与PRRT2固定表达在细胞膜上矛盾，表明该抗体具有明显分特异性。这也进一步表明本发明抗体的优势。 

本发明公开了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。PRRT2是新发现的基因，该基因突变可导致发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD)。目前国内外尚无特异性较好的人来源的PRRT2抗体。本发明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，为进一步明确PRRT2在人不同组织中的表达分布提供了基础，并有助于研究PRRT2在PKD发病中的作用，具有重要应用前景。 

本发明的有益效果是： 

由于本发明设计并制备了小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，具有高度特异性，解决了目前商品化的PRRT2多克隆抗体的非特异性问题，有助于PRRT2蛋白的功能研究及其在PKD发病过程中的具体作用。

附图说明

图1. 蛋白表位指标分析图。 这张图综合显示了目标蛋白中各区域的表位指标以及被选中的表位。X轴是目标蛋白中各10 肽的起始位置。Y轴是表位指标得分。 得分越高，该10肽成为成功表位的可能性越高。曲线是每个10 肽的得分曲线， 在曲线上标记的短波浪线表示被选中的10 肽片段。X轴上短柱表示目标蛋白中亲水性的分布。跨膜区在X轴下方用粗横线标识。 

图2. 本发明抗体用于免疫印迹的结果照片。A. Myc标签抗体检测结果；B.市售的兔抗人PRRT2多克隆抗体检测结果；C. 本发明的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体检测结果。 M, 蛋白Marker；1，空转染的细胞裂解液作为对照；2，转染pCMV- Myc-PRRT2的野生型表达质粒的细胞裂解液。 

图3. 本发明抗体用于细胞免疫组化的结果照片。用pCMV-Myc-PRRT2转染SH-SY5Y细胞，分别用Myc标签抗体(A)、市售兔抗人PRRT2多克隆抗体(B)和本发明的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体(C)进行免疫荧光检测。1，空转染的SH-SY5Y细胞；2，转染pCMV-Myc-PRRT2的SH-SY5Y细胞；DAPI, 标记细胞核， Merge，融合图像。 

具体实施方式

实施例1：人PRRT2免疫抗原串联多肽的设计方法 

本发明抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合。选择了6条长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽作为抗原表位（附图1）。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不同肽片段之间插入一个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。最终确定PRRT2蛋白串联多肽序列为：PPQVLAGVPD-GGGGS-PKPALQPELP-GGGGS-QETVSKPE VS-GGG GS-PSSQLAGPGV-EGPAPEPHSP-GGGGS- VPDQPEAPQP。

将设计好的序列用DNA Works软件进行密码子优化，生成核苷酸序列，如下：CCUCCCCAAGUUCUUGCCGGUGUUCCGGAUCGGTGGTGGAGGTTCT   CAAAACCUGCACUGCAAGAAUUACCCGGGGGAGGCGGCAGCCAAGAGACUGUCAGCAAGCCAGAGGUGUCAGGTGGGGGTGGAAGCCCCUCUUCCCAGCUAGCCGGACCUGGGGUAGGCGGTGGCGGCTCGGAAGGUCCGGCCCCGGAGCCACACUCACCGGGTGGGGGTGGAAGCGUACCAGACCAACCAGAGGCCCCGCAACCU 

上述抗原DNA序列由赛百盛（中国上海）公司采用全基因组化学合成的方法合成。

实施例2： 抗原表达与纯化 

全基因合成的抗原序列利用BamHI/EcoRI酶切后，再与BamHI/EcoRI酶切并回收好的PET32a载体通过T4 连接酶在室温进行2h连接。连接产物与CaCl2法制备的Rosetta感受态细胞(Novagen, Merck, Germany)在冰上(4℃)孵育0.5h，再于42 ℃热激活90s，热激后的菌液补加500ul无抗性LB液体培养基后在37 ℃摇床上250rpm慢摇45min，最后涂板于含相应抗生素的LB平板上。在37℃培养箱将细菌平板培养过夜(16h)。

次日，挑转化菌落于自身诱导系统培养基中，37℃， 250rpm表达过夜。次日将菌液离心（6000g，5min），上清弃去，沉淀用裂解液（50mM Tris、500mM NaCl、4M urea、1mM PMSF，pH7.4）重悬并于室温裂解过夜。 

预先用25ml（5倍柱体积）裂解液平衡Ni2+–NTA柱，静置待用。细胞裂解液离心（15,000g, 10min）后将上清上柱，室温孵育1h。孵育后，待裂解液从柱上自然流净，用30ml洗涤液（4M urea，50mM Tris，500mM NaCl，30mM imidazole，pH 7.4）洗涤，最后用5ml洗脱液（4M urea，50mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH 7.4）洗脱收集蛋白。洗脱的蛋白透析到缓冲液(pH5.8的磷酸盐缓冲液)中，中途换液2次，共透析24小时。共得到1.2mg透析后蛋白，浓度为0.3mg/ml，纯度>95%。 

实施例3： 单克隆抗体制备 

A、动物免疫

寡聚核苷酸佐剂：50ul 铝佐剂（Thermo Fisher，USA）+1μg DNA佐剂，序列为tccatgacgttcctgacgtT，小写的碱基为需要硫代修饰的位点，委托赛百盛（中国上海）公司合成。

免疫方法：3只Balb/c小鼠，8-10周龄，体重18-20g。 20μg抗原与氟氏完全佐剂（Sigma）乳化完全，免疫位点为后足掌、尾根以及前肢腋下以及腹股沟，每点50μL左右。20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫小鼠后腿肌肉，每点50-100μL。 

第8天取10μg抗原与氟氏完全佐剂（Sigma）乳化完全，免疫小鼠前肢腋下以及腹股沟，每点50-100μL。20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂混合，免疫小鼠尾根以及后腿肌肉，每点50-100μL。 

第12天，10μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫小鼠后腿肌肉。 

第14天小鼠眼眶取血，ELISA方法检测血清滴度，小鼠血清效价均大于1：32000 

B、 细胞融合和筛选

第15天将免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。具体方法如下：将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此为单克隆。亦即通常认为的建株成功的杂交瘤细胞株。将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2x10⁶ /管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。

C、腹水制备、抗体纯化 

细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。采用Western blot和免疫荧光进行特异性验证，最终针对抗原表位PSSQLAGPGV制备的杂交瘤细胞株分泌的腹水经检测具有较好的特异性和敏感性；采用Protein G柱纯化腹水，得到纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80℃。

已经对产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞进行保藏。系分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株 9293-1hz-3P2，保藏号为CGMCC No.7810。CGMCC即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 

实施例4：小鼠抗人PRRT2单克隆抗体的应用 

(1). 免疫印记：用构建的pCMV-Myc-PRRT2表达质粒分别转染293T细胞和SH-SY5Y细胞，将收集的细胞裂解液按20μg上样电泳，转膜，5%脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60min；小鼠抗人PRRT2单克隆抗体做为一抗，1:1000稀释，应用Myc标签抗体作为对照(1:5000)，室温摇育2小时，或4℃摇育过夜， 1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG做为二抗，1：5000稀释，室温摇育60分钟， 1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，ECL显色，曝光仪曝光成像（图2）。

(2). 细胞免疫荧光染色：将转染的pCMV-Myc-PRRT2的SH-SY5Y细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4%多聚甲醛固定细胞，10%山羊血清室温封闭细胞60min；小鼠抗人PRRT2抗体1：200稀释，室温反应2小时，1×PBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1：1000-1：2000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS摇洗3次，每次5-10分钟；封片镜下观察（图3）。 

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  复旦大学附属华山医院

 

 

<120>  小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备和应用

 

 

<130>  20130701

 

 

<160>  9    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  340

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  1

 

Met Ala Ala Ser Ser Ser Glu Ile Ser Glu Met Lys Gly Val Glu Glu

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Pro Lys Val Pro Gly Glu Gly Pro Gly His Ser Glu Ala Glu Thr

            20                  25                  30         

 

 

Gly Pro Pro Gln Val Leu Ala Gly Val Pro Asp Gln Pro Glu Ala Pro

        35                  40                  45             

 

 

Gln Pro Gly Pro Asn Thr Thr Ala Ala Pro Val Asp Ser Gly Pro Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Glu Thr Pro Ala Gly Ala Ser Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Thr Ala Gln Ala Thr Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Glu Ser Lys

                85                  90                  95     

 

 

Ala Asn Cys Ser Pro Glu Asp Pro Cys Gln Glu Thr Val Ser Lys Pro

            100                 105                 110        

 

 

Glu Val Ser Lys Glu Ala Thr Ala Asp Gln Gly Ser Arg Leu Glu Ser

        115                 120                 125            

 

 

Ala Ala Pro Pro Glu Pro Ala Pro Glu Pro Ala Pro Gln Pro Asp Pro

    130                 135                 140                

 

 

Arg Pro Asp Ser Gln Pro Thr Pro Lys Pro Ala Leu Gln Pro Glu Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Pro Thr Gln Glu Asp Pro Thr Pro Glu Ile Leu Ser Glu Ser Val Gly

                165                 170                 175    

 

 

Glu Lys Gln Glu Asn Gly Ala Val Val Pro Leu Gln Ala Gly Asp Gly

            180                 185                 190        

 

 

Glu Glu Gly Pro Ala Pro Glu Pro His Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

        195                 200                 205            

 

 

Pro Pro Ala Asn Gly Ala Pro Pro Arg Val Leu Gln Gln Leu Val Glu

    210                 215                 220                

 

 

Glu Asp Arg Met Arg Arg Ala His Ser Gly His Pro Gly Ser Pro Arg

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Ser Leu Ser Arg His Pro Ser Ser Gln Leu Ala Gly Pro Gly Val

                245                 250                 255     

 

 

Glu Gly Gly Glu Gly Thr Gln Lys Pro Arg Asp Tyr Ile Ile Leu Ala

            260                 265                 270        

 

 

Ile Leu Ser Cys Phe Cys Pro Met Trp Pro Val Asn Ile Val Ala Phe

        275                 280                 285             

 

 

Ala Tyr Ala Val Met Ser Arg Asn Ser Leu Gln Gln Gly Asp Val Asp

    290                 295                 300                

 

 

Gly Ala Gln Arg Leu Gly Arg Val Ala Lys Leu Leu Ser Ile Val Ala

305                 310                 315                 320

 

 

Leu Val Gly Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ser Cys Val Ile Asn Leu

                325                 330                 335    

 

 

Gly Val Tyr Lys

            340

 

 

<210>  2

<211>  80

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  2

 

Pro Pro Gln Val Leu Ala Gly Val Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Pro Ala Leu Gln Pro Glu Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Glu

            20                  25                  30         

 

 

Thr Val Ser Lys Pro Glu Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Ser

        35                  40                  45             

 

 

Gln Leu Ala Gly Pro Gly Val Glu Gly Pro Ala Pro Glu Pro His Ser

    50                  55                  60                  

 

 

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Asp Gln Pro Glu Ala Pro Gln Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

<210>  3

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  3

 

Pro Pro Gln Val Leu Ala Gly Val Pro Asp

1               5                   10 

 

 

<210>  4

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  4

 

Pro Lys Pro Ala Leu Gln Pro Glu Leu Pro

1               5                   10 

 

 

<210>  5

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  5

 

Gln Glu Thr Val Ser Lys Pro Glu Val Ser

1               5                   10 

 

 

<210>  6

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  6

 

Pro Ser Ser Gln Leu Ala Gly Pro Gly Val

1               5                   10 

 

 

<210>  7

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  7

 

Glu Gly Pro Ala Pro Glu Pro His Ser Pro

1               5                   10 

 

 

<210>  8

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

 

<400>  8

 

Val Pro Asp Gln Pro Glu Ala Pro Gln Pro

1               5                   10 

 

 

<210>  9

<211>  252

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<400>  9

ccuccccaag uucuugccgg uguuccggau cggtggtgga ggttctcaaa accugcacug     60

 

caagaauuac ccgggggagg cggcagccaa gagacuguca gcaagccaga ggugucaggt    120

 

gggggtggaa gccccucuuc ccagcuagcc ggaccugggg uaggcggtgg cggctcggaa    180

 

gguccggccc cggagccaca cucaccgggt gggggtggaa gcguaccaga ccaaccagag    240

 

gccccgcaac cu                                                        252

 

 

Claims (13)

1.一种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人PRRT2单克隆抗体对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条所示。

2.如权利要求1所述的抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 6 或者 SEQ ID NO 7所示。

3.一种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，它由保藏号为CGMCC No.7810的杂交瘤细胞产生。

4.一种产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株 9293-1hz-3P2，保藏号为CGMCC No.7810。

5.权利要求1所述的抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干条；

合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；

佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的肽片段是长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区并且位于无序区域的肽。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的接头具有弱免疫原性。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的串联多肽免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所使用的佐剂选自：弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多位点免疫在以下位点中至少2个位点进行：颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。

11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的筛选包括利用有限稀释法亚克隆和ELISA检测。

12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的筛选包括通过Western blot 和细胞免疫荧光进行特异性验证所得抗体。

13.权利要求1-3中任意一种抗人PRRT2单克隆抗体的应用，其特征在于，所述的抗人PRRT2单克隆抗体能够特异性识别PRRT2蛋白。