CN100486993C - 一种进化免疫球蛋白结合分子、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型进化免疫球蛋白结合分子、其制备方法及其应用。本发明公开了一种分离的进化免疫球蛋白结合分子，它是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白、或其具有免疫球蛋白结合活性的保守性变异蛋白。本发明还公开了该免疫球蛋白结合分子的编码基因、基因工程制备方法及其应用。本发明公开的免疫球蛋白结合分子广谱结合各种免疫球蛋白，显示出很高的免疫球蛋白全分子结合活性，可用于基因工程抗体的大规模纯化，天然抗体、单克隆抗体的纯化，酶联免疫吸附法、免疫层析法和免疫组化等免疫方法对抗体进行检测和诊断。

Description

一种进化免疫球蛋白结合分子、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及重组的免疫球蛋白结合分子，尤其涉及将金黄色葡萄球菌蛋白和大消化链球菌表面蛋白的Ig结合结构域重排获得的免疫球蛋白结合分子，其制备方法及应用。

背景技术

免疫球蛋白结合分子(Ig binding proteins，IBP)是一类表达于细菌表面的能与宿主Ig特定部位结合的蛋白，调节宿主对细菌的免疫反应，是细菌重要致病因子之一。研究最多的IBP主要有三种：金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)、人链球菌(C和G群)蛋白G(SpG)和部分大消化链球菌表面的蛋白L(PpL)。

SpA分子量约57KDa，由524个左右氨基酸构成，其胞外部分含有5个长58—61个氨基酸残基且序列高度同源的Ig结合结构域(分别命名为E、D、A、B和C)，单个Ig结合结构域由三股返折的α螺旋组成，每个单结构域具有独立的Ig结合活性。SpG分子中包含两至三个序列高度同源的Ig结合结构域(C1、C2、C3)，其单结构域由两对反向平行的β片层和中间的一个α螺旋组成。PpL分子中包含由4—5个(依不同菌株而异)由72-76个氨基酸残基组成序列高度同源的Ig结合结构域(B1-B5)，虽然氨基酸序列与SpG相差甚远，但其单结构域构象却相似。晶体结构分析含PpL的B1—B4四个Ig结合结构域的肽链具有同时结合同一Ig分子的两条kappa轻链的特性。SpA和SpG主要与IgG的Fc段具有较强的亲和力，同时SpA还能结合属于VH3基因家族的VH区(与抗原决定簇不重合，不影响与抗原的结合)，因此，它除了具有与IgG(IgG3除外)较强的亲和力外，还能结合其它类的Ig。SpG还可以结合IgG的CHI区(CHI γ)，它仅结合IgG，并具有更高的亲和力。而PpL通过与Ig的轻链，主要是κ轻链的1、3、4亚型相互作用而结合免疫球蛋白，结合位点位于抗原决定簇以外的轻链可变区，其结合能力与重链亚类无关SpA和SpG与IgG—Fc段的强亲和力的特性使其广泛应用于检测和纯化IgG。此外，SpA还被用作某些自身免疫性疾病的辅助治疗，其机制是清除循环免疫复合物和免疫调节。这三种主要的天然Ig结合分子各自在Ig结合谱上都是有限的。SpA不结合人IgG3，由于VH3基因家族在不同类Ig的分布不同，SpA只结合约15％、13％和40％的人IgGFab、IgA和IgM。另外，在不同种系的哺乳动物之间的结合特性差别也很大：对大鼠的Ig结合弱，对小鼠的IgG在不同亚类间差别很大，而对兔的Ig结合性强。与SpA相似，由于PpL只结合κ轻链的1、3、4亚型，因此只结合60％的人Ig，对来源于兔、牛的Ig结合很弱，而对鼠的Ig具有较强结合性。

SpA、SpG和PpL已被广泛用于免疫化学反应的定量和定性分析。当偶连到一个放射性的、酶性质的或荧光标签时，SpA是一个很好的、检测和定量与该蛋白质高亲和力结合的抗体的试剂，酶标SpA已广泛地应用到ELISA法的抗体检测中，尤其是许多传染病的特异抗体检测中。SpA与金颗粒的微粒结合可用于免疫电镜中IgG的定位，使许多特殊结构及病原体的电镜检测成为可能，此外SpA胶体金颗粒也已广泛应用于免疫层析法进行免疫学的抗体检测。固定在固相介质上的SpA可用于多种动物天然抗体和小鼠单克隆抗体的大规模纯化，此外，固相化的SpA还广泛用于收集免疫复合物、抗原或完整的细胞。尽管已经发展了许多用于纯化IgG分子的技术，但优选的方法还是用SpA包裹的球珠来吸附和洗脱。利用纯化的SpA和包含SpA的IgG结合结构域的工程融合蛋白采用类ELISA三明治技术，可以纯化和检测DNA片段。与SpA一样，SPG在抗体的纯化，免疫测定及一些治疗中都有广泛的用途。但其在收集免疫复合物和纯化IgG试剂中有一个潜在的劣势是它能强烈地结合牛血清白蛋白。然而，SPG的IgG结合位点和牛血清白蛋白结合位点在结构上是截然不同的。而且工程版的、缺少了牛血清白蛋白结合位点的SPG通过商业途径也可以得到。另外，SPG的血清白蛋白结构域一直用作融合蛋白质中的纯化标签。PpL是一个很有用的工具，与SpA和SpG相比，其在从添加胎盘牛血清或牛血清白蛋白的介质中纯化单克隆抗体和从转基因动物中纯化人源化抗体等方面更具优势。

由于三种Ig结合分子的抗体结合位点不同，protein A和protein G主要与IgG的Fc段恒定区结合而protein L与Ig的κ轻链可变区结合，因此能否集合并优化两种蛋白的Ig结合功能，构建出新型Ig结合分子用于Ig检测，提高免疫诊断的敏感性和特异性，是国外学者关注的焦点。1992年，瑞典学者构建出protein L和protein G的融合蛋白Protein LG(以下简称pLG)，发现Protein LG有广泛的抗体结合活性能结合大多数Ig的Fc、Fab段和Ig轻链。与单一的protein L或G相比，其抗体结合特性更完全，除人类Ig外，还可用于鼠源性抗体的检测。1998年，瑞典学者将protein L的四个结合Ig κ轻链的结构域与protein A四个结合IgG的结构域融合，构建出一种新型杂合蛋白Protein LA(以下简称pLA)，结合谱广，不仅能结合人及一些哺乳动物的不同类型Ig和IgG所有亚类，还能结合基因工程单链抗体Fv(ScFv)片段而不影响抗体的抗原结合能力，且与抗体的亲和力得以提高，除用于免疫检测外，通过亲和色谱法还可纯化各类Ig及Fv(ScFv)片段，证明Protein LA是一种多功能的抗体结合分子。1999年，protein A抗体结合区和protein L(1-3)抗体结合区的融合蛋白ProteinLA被CLONTECH公司开发为检测和纯化抗体的商品化试剂，兼有protcin A和protein L的双重功能，Protein LA可结合各种类型的抗体，解决了传统方法IgM检测困难的弊端。ProteinLA有可溶的、HRP-酶标，或结合琼脂糖形式的制剂，不仅能提高免疫检测的敏感性，还能一步法进行抗体纯化，简便易行。国内尚未有类似产品出现。

pLA和pLG简单拼接虽然保留了来源分子各自的功能，但这种结构可能没有达到同时发挥双位点结合的精确构象要求。我们选择IBP分子发挥作用的基本单位即Ig结合单结构域作为研究的基本对象，对单结构域DNA随机的重组拼接，并用以噬菌体展示为主的分子进化手段筛选，以期得到具有新的结合功能的重组分子。具体为；克隆SpA和PpL的单个Ig结合结构域，将单结构域DNA片段在体外随机拼接，再应用噬菌体展示技术将这些重组分子表达于噬菌体表面，构建了SpA和PpL的单结构域随机组合噬菌体展示文库，以人Ig为诱饵对文库进行亲和筛选，结果得到了一种由PpL的B3结构域与SpA的D、A、B、C(主要为D)结构域间隔排列组成的新型Ig结合分子形式(MDPL-MDPA)n(MDPL，mono-domain of proteinL；MDPA，mono-domain of protein A)，该分子形式在天然IBP中不存在，在重组的IBP分子中也未见报道，因此是一种新的IBP分子结构形式，由于是通过分子进化手段获得，我们把这类分子统称为进化免疫球蛋白结合分子(evolved Ig-binding molecules)，进化免疫球蛋白结合分子LD5(L-D-L-D-L；L为PpL的B3结构域，D为SpA的D结构域)是其中最具代表性的优势克隆，该内容在《噬菌体展示SpA及PpL Ig结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中具有详细描述，但该篇文章对LD5各种功能特性没有进一步的阐述。

本发明从多种(MDPL-MDPA)n序列中选取代表序列LD5克隆入原核表达载体pET32a(+)构建原核表达系统，生产和纯化新型进化免疫球蛋白结合分子LD5，对该蛋白与各免疫球蛋白的结合特性进行了详细的测定，建立了应用该分子制备的亲和层析柱进行基因工程抗体的大规模纯化、天然抗体及单克隆抗体的纯化的方法，建立了应用该分子标记酶进行酶联免疫吸附试验等免疫学方法检测抗体的诊断方法，建立了应用该分子制备胶体金标记酶进行免疫层析法检测抗体的诊断方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新型进化免疫球蛋白结合分子及其编码基因。

本发明的另一个目的是提供上述进化免疫球蛋白结合分子的载体、转化体及其基因工程制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述进化免疫球蛋白结合分子的应用。

本发明的第一方面，公开了一种重组的进化免疫球蛋白结合分子，它是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白。较佳的，它具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

上述分子是发明人构建了一个噬菌体展示SpA及PpL Ig结合单结构域随机组合文库后，通过亲和筛选发现的，具体的过程在《噬菌体展示SpA及PpL Ig结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中有详细描述。经过发明人的一系列试验，发现该分子具有突出的免疫球蛋白结合特性：不仅能结合IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc，还能结合scFv。此外，实施例也证实了它与人免疫球蛋白IgG全分子有很高的结合活性；与人免疫球蛋白IgG Fab片断比SpA和PpL有增强的结合活性；与人免疫球蛋白IgM比SpA和PpL有增强的结合活性；与人免疫球蛋白IgA比SpA和PpL有增强的结合活性。并且，它与各免疫球蛋白是以Ig κ轻链和VH3重链的双位点结合模式结合的。

本发明的第二方面，公开了一种分离的多核苷酸，它编码上述进化免疫球蛋白结合分子。较佳的，它具有SEQ ID：NO 2所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面，公开了一种表达载体，它含有上述多核苷酸以及与该多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。较佳的，上述载体为原核载体，其中优选PET-32a(+)。

本发明的第四方面，公开了一种宿主细胞，它被上述表达载体所转化。较佳的，上述宿主细胞为原核细胞，其中优选大肠杆菌，更佳的，为大肠杆菌BL21-TRXB。

本发明的第五方面，公开了上述进化免疫球蛋白结合分子的制备方法，该方法包含：(1)在适合表达进化免疫球蛋白结合分子的条件下，培养上述宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有免疫球蛋白结合活性的多肽。实施例中，发明人将新型进化免疫球蛋白结合分子克隆入原核表达载体pET32a(+)中，构建其大肠杆菌表达菌种，对该菌种进行大规模培养，诱导生产进化免疫球蛋白结合分子，用Ni亲和层析柱进行纯化，制备出纯化的新型进化免疫球蛋白结合分子LD5。

本发明的第六方面，公开了将上述的进化免疫球蛋白结合分子用于体外结合免疫球蛋白，进化免疫球蛋白结合分子与体外结合免疫球蛋白结合的方式为双位点结合模式，即与免疫球蛋白κ轻链和VH3重链这两个位点的结合模式。较佳的，上述免疫球蛋白选自IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc中的一种或几种，更佳的，上述IgG、IgM、IgA、IgGFab或IgGFc来源于人。同样较佳的，上述免疫球蛋白为scFv。

优选的，上述应用为将进化免疫球蛋白结合分子用于抗体的体外免疫学检测，其中免疫学检测优选酶联免疫吸附或免疫层析或免疫组化。

同样优选的，上述应用为将进化免疫球蛋白结合分子用于纯化抗体，其中抗体优选基因工程抗体或天然抗体或单克隆抗体。

本发明的优点在于：

本发明公开的进化免疫球蛋白结合分子，可以广谱结合各种免疫球蛋白，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结合更广谱，不仅可以结合IgG、IgM、IgA、IgGFab或IgGFc，还能结合scFv，此外，与免疫球蛋白的结合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。另一方面，本发明公开了上述进化免疫球蛋白结合分子的基因工程制备方法，使得低成本、大规模生产成为可能。再一方面，本发明公开了将上述进化免疫球蛋白结合分子用于抗体的体外免疫学检测及抗体的纯化，与现有技术相比，使用了本发明的进化免疫球蛋白结合分子可以提高检测的灵敏度及准确性，纯化的效果也更好。

附图说明

图1 重组表达质粒pET32a(+)-LD5的构建流程图

图2 LD5 cDNA序列的扩增

    m：DL2000 Marker

    1-8：pCANTAB5S-LD5 PCR扩增产物

图3 LD5表达序列的PCR产物回收

    m：DL2000 Marker

    1-4：pCANTAB5S-LD5 PCR回收产物

图4 pET32a(+)—LD5的NcoI+Sal I双酶切鉴定

    M：DL15000Marker

    1：LD5/PET32(a)质粒/Nco I+Sal I

    2：LD5/PET32(a)质粒

图5 融合蛋白LD5的表达

    M：14400—97400 Daltons Marker

    1-4：LD5/PET32(a)/BL21-TRXB  单克隆1-4#

    IPTG诱导表达

    5：空菌BL21-TRXB对照

    97400、66200、43000、31000、20100、14400：分别表示14400—97400 Daltons Marker

    电泳显色条带对应的分子量

图6 融合蛋白LD5的纯化

    M：14400—97400 Daltons Marker

    7：LD5

    1—6：其他IBP分子

图7 LD5与PpL和SPA对生物素标记人多克隆IgG结合比较

    横坐标：log(IgG-biotin)(nm)，即IgG-biotin浓度对数值

    纵坐标：OD450nm，即波长450nm的OD值

    带“—◆—”线条：对应PpL

    带“—△—”线条：对应LD5

    带“—×—”线条：对应SPA

图8 LD5与PpL和SPA对生物素标记人多克隆IgM结合比较

    横坐标：log(IgM-biotin)(nm)，即IgM-biotin浓度对数值

    纵坐标：OD450nm，即波长450nm的0D值

    带“—◆—”线条：对应PpL

    带“—△—”线条：对应LD5

    带“—×—”线条：对应SPA

图9 LD5与PpL和SPA对生物素标记人多克隆IgA结合比较

    横坐标：log(IgA-biotin)(nm)，即IgA-biotin浓度对数值

    纵坐标：OD450nm，即波长450nm的OD值

    带“—◆—”线条：对应PpL

    带“—△—”线条：对应LD5

    带“—×—”线条：对应SPA

图10 LD5与PpL和SPA对生物素标记人多克隆IgG Fab结合比较

     横坐标：log(IgFab-biotin)(nm)，即IgFab-biotin浓度对数值

     纵坐标：OD450nm，即波长450nm的OD值

     带“—◆—”线条：对应PpL

     带“—△—”线条：对应LD5

     带“—×—”线条：对应SPA

图11 LD5与PpL和SPA对生物素标记人多克隆IgG Fc结合比较

     横坐标：log(IgG Fc-biotin)(nm)，即IgG Fc-biotin浓度对数值

     纵坐标：OD450nm，即波长450nm的OD值

     带“—◆—”线条：对应PpL

     带“—△—”线条：对应LD5

     带“—×—”线条：对应SPA

图12：生物素标记LD5与scFv KM36、KM38、KM41的结合

   横坐标：log(LD5-biotin)(nm)，即IgLD5-biotin浓度对数值

   纵坐标：OD450nm，即波长450nm的OD值

   带“—◆—”线条：对应含KM36的TG1菌裂解液上清

   带“—□—”线条：对应含KM38的TG1菌裂解液上清

   带“—△—”线条：对应含KM41的TG1菌裂解液上清

   带“—×—”线条：对应空TG1菌裂解液上清

图13 LD5结合人多克隆IgGFab的竞争抑制

   横坐标：concentration of inhibitor(nm)，即抑制因子浓度(nm)

   纵坐标：percent of inhibitin，即抑制百分数

   带“—□—”线条：对应PpL

   带“—△—”线条：对应LD5

   带“—×—”线条：对应SpA

   带“—○—”线条：对应PpL+SpA

图14 LD5结合人多克隆IgM的竞争抑制

   横坐标：concentration of inhibitor(nm)，即抑制因子浓度(nm)

   纵坐标：percent of inhibitin，即抑制百分数

   带“—□—”线条：对应PpL

   带“—△—”线条：对应LD5

   带“—×—”线条：对应SpA

   带“—○—”线条：对应PpL+SpA

图15 LD5结合人多克隆IgA的竞争抑制

   横坐标：concentration of inhibitor(nm)，即抑制因子浓度(nm)

   纵坐标：percent of inhibitin，即抑制百分数

  带“—□—”线条：对应PpL

  带“—△—”线条：对应LD5

  带“—×—”线条：对应SpA

  带“—○—”线条：对应PpL+SpA

图16 纯化基因工程抗体电泳图

图17 纯化天然抗体电泳图

图18 纯化单克隆抗体电泳图

图19 抗—HCV免疫层析测试条

    A：HCV Ab阴性血样检测结果

    B：空白

    C、D：HCV Ab阳性血样检测结果

    1：chicken anti-Protein A

    2：Core Ag+NS4 Ag

    3：NS5Ag，NS即丙肝病毒的非结构蛋白(non structure protein)

    4：NS4 Ag

    5：NS3 Ag

    6：Core Ag

具体实施方式

在本发明中，术语“其保守性变异蛋白”是指具有免疫球蛋白高亲和活性的进化免疫球蛋白结合分子的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1—30个，较佳的1—10个，更佳的1—5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸，例如，在本领域中，用性能相近或相似地氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质地功能，如可以用Val或Leu或Ile取代Ala等，又比如，在C末端和/或N末端添加一个和数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。此外，这些变异形式还包括成熟蛋白与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，比如GST)。此外，变异形式还包括(但不限于)进化免疫球蛋白结合分子及上述蛋白经过修饰后的形式：化学衍生形式如乙酰化或羧基化；糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白，这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成：具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟悉技术人员公知的范围。

本发明所述的编码进化免疫球蛋白结合分子的多核苷酸的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用已公开的质粒作为模板，扩增而得有关序列。应用PCR法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的多核苷酸片段。

本发明中，编码进化免疫球蛋白结合分子的多核苷酸序列可插入到各种载体中，所述载体包括各种表达载体，包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，优选原核载体，比如pKK223-3、pBR322、pGEX载体等等，在本发明中适用的载体优选PET-32a(+)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

本发明中，术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

本发明中转化重组载体的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属:鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞:果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO，COs.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。本发明优选原核细胞中的大肠杆菌BL21-TRXB。

用重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法或热击法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明所述适合表达进化免疫球蛋白结合分子的条件与表达所用的宿主细胞有关，重组载体转化的宿主细胞获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的进化免疫球蛋白结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法〔如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。上述方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理〔盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC〕和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

一、一种新型进化免疫球蛋白结合分子原核制备

本发明所述的一种新型进化免疫球蛋白结合分子LD5是应用分子进化方法从噬菌体展示细菌SpA A、B、C、D单结构域和PpL的B3结构域随机重组的分子组合文库中筛选获得的新的免疫球蛋白结合分子形式，详细情况在《噬菌体展示SpA及PpL.lg结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中具有详细描述。本发明以含有编码进化免疫球蛋白结合分子LD5(L-D-L-D-L；L为PpL的B3结构域，D为SpA的D结构域)cDNA序列克隆pCANTAB5S—LD5为模板，PCR扩增LD5的DNA片断，并通过引物合成方法在扩增片断上游引入NcoI和SalI内切酶识别位点。扩增片断用PCR产物回收试剂盒回收后NcoI和SalI内切酶酶切，酶切片断行琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，克隆到原核表达载体PET-32a(+)的NcoI和SalI位点中，构建成功原核表达载体PET32a(+)—LD5，用PET32a(+)载体的下游引物T7ter测定克隆片段LD5的DNA序列，序列分析结果证实PET-32a(+)在NcoI和SalI位点间的插入序列与PALn随机分子库噬菌体筛选的阳性克隆LD5序列完全相符，读框完全正确，起始子和终止子已加上，插入上下游序列与PET32a(+)载体序列完全一致。取重组质粒PET32a(+)—LD5200ng转化大肠杆菌BL21-TRXB，获得LD5的原核表达菌种。将该菌中培养后IPTG诱导表达，设空菌作阴性对照，SDS电泳显示在分子量约59000 Daltons处出现对照菌没有的一条蛋白带，符合LD5的分子量。将菌种活化后大量培养，TPTG诱导表达，Ni-NTA柱纯化获得纯化LD5融合蛋白，SDS电泳显示纯化后仅出现一条蛋白带，符合其相应分子量。

二、新型进化免疫球蛋白结合分子与各类抗体及抗体片断的结合

本发明所述的一种新型进化免疫球蛋白结合分子LD5是细菌PpL的B3结构域与SpA D单结构域的间隔重复序列(L-D-L-D-L；L为PpL的B3结构域，D为SpA的D结构域)，其中的PpL B3结构域具有与免疫球蛋白κ轻链的结合功能，SpA D结构域具有与免疫球蛋白VH3重链的结合功能和与免疫球蛋白IgG Fc段结合的功能。因此，理论上LD5能结合各类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)Fab和免疫球蛋白IgG Fc。本发明应用上述所表达纯化的LD5融合蛋白进行包被，分别对免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA进行生物素标记，用ELISA方法分别检测LD5与免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA的结合情况，并与PpL和SpA与上述免疫球蛋白分子的结合进行比较。结果证实LD5与免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA的结合比PpL和SpA有所增强，与免疫球蛋白IgG和免疫球蛋白IgG Fc的结合与SpA相当。

三、新型进化免疫球蛋白结合分子κ轻链和VH3重链的双位点结合模式的证实

本发明所述的一种新型进化免疫球蛋白结合分子LD5是应用分子进化方法从噬菌体展示细菌SpA A、B、C、D单结构域和PpL的B3结构域随机重组的分子组合文库中筛选获得的新的免疫球蛋白结合分子形式，详细情况在《噬菌体展示SpA及PpL lg结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中具有详细描述。该类免疫球蛋白结合分子形式是文库筛选所获得的优势克隆，所测定的36个克隆中有33个含有该类结构，由于应用人免疫球蛋白结合分子(包含IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类型)作为诱饵对组合文库进行分子进化筛选，因此，可以推定该结构与免疫球蛋白Fab有着比PpLB3与免疫球蛋白κ轻链和SpA与免疫球蛋白VH3重链的单独结合功能更强的结合活性，上述的结合试验结果也证明的这一点。能具备这种增强结合活性的最可能的结合形式即是与免疫球蛋白结合分子κ轻链和VH3重链的双位点结合模式。要证实上述与免疫球蛋白结合分子κ轻链和VH3重链的双位点结合的试验为结合竞争试验。

本发明中我们应用了竞争抑制ELISA实验来证实LD5与免疫球蛋白结合分子κ轻链和VH3重链的双位点的结合。具体对LD5标记生物素，分别应用免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA包被酶标板，同时加入固定浓度的生物素标记的LD5和倍比稀释的各种竞争蛋白(LD5、PpL、SpA和PpL+SpA)，37℃　45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物，37℃　15min，洗板后TMB显色5-10min，2M硫酸终止，酶标仪读取OD450nm。计算各复孔的0D均值，Excel绘制竞争抑制曲线。如果是双位点结合的协同效应，则联合用PpL和SpA对LD5与IgG Fah、IgM、IgA(IgG　Fab缺乏Fc段，IgM和IgA的Fc段不能与SpA和LD5结合，这样排除了Fc段对竞争抑制试验的干扰作用)与结合的抑制作用要明显小于LD5本身的抑制作用：如果不是双位点结合的协同效应，而是分别对可变区VH3重链和κ轻链的单独结合，则联合用PpL和SpA对LD5与IgGFab、IgM、IgA结合的抑制作用应与LD5本身的抑制作用相当。结果可见联合用PpL和SpA对LD5与IgG Fab、IgM、IgA与结合的抑制作用要明显小于LD5本身的抑制作用，说明LD5与免疫球蛋白结合是与κ轻链和VH3重链的双位点的结合。

四、应用新型进化免疫球蛋白结合分子大规模纯化基因工程抗体、天然抗体和单克隆抗体

本发明所述的一种新型进化免疫球蛋白结合分子LD5是应用分子进化方法从噬菌体展示细菌SpA A、B、C、D单结构域和PpL的B3结构域随机重组的分了组合文库中筛选获得的新的免疫球蛋白结合分子形式，结合实验证明了该分了不仅具有SpA和PpL这两种蛋白的结合特性，而且产生了其他细菌免疫球蛋白结合分子(包括SpA和PpL)所小具有的κ轻链和VH3重链的双位点结合特性。在实际应用中SpA、SpG等一些细菌免疫球蛋白结合分子已被广泛应用于天然抗体、单克隆抗体和基因工程抗体的纯化，在发明中新型进化免疫球蛋白结合分子LD5也被证明能应用于天然抗体、单克隆抗体和基因工程抗体的纯化。

本发明中我们将LD5分子共价偶联于CNBr-Sepharose 4R颗粒上制备成亲和纯化柱，利用该亲和纯化柱对来自血液、小鼠腹水及基因工程抗体的CHO-KL工程细胞株培养液中的各种类型的抗体进行纯化。具体是将包含各种抗体的血清稀释后过LD5亲和层析柱使抗体结合在柱子上，再用酸将柱子上的抗体洗脱下来即获得纯化的抗体：将能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株培养后注射小鼠腹腔，制备腹水，是将包含单克隆抗体的腹水稀释后过LD5亲和层析柱使抗体结合在柱子上，再用酸将柱子上的抗体洗脱下来即获得纯化的抗体:将基因工程抗体的CHO-K1工程细胞株体外大规模发酵培养，制备培养液，是将包含单克隆抗体的细胞培养液直接过LD5亲和层析柱使抗体结合在柱子上，再用酸将柱子上的抗体洗脱下来即获得纯化的抗体。

五、应用新型进化免疫球蛋白结合分子ELISA法检测特异抗体

本发明所述的一种新型进化免疫球蛋白结合分子LD5能与多种人免疫球蛋白分子结合其中包括免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM、免疫球蛋白IgA等抗体，因此，将该分子标记上辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶分子，可以用作酶复合物(酶标二抗)进行ELISA法检测特异抗体。

本发明中我们将LD5分子标记辣根过氧化物酶(HRP)，替代商品化的抗—HCV抗体ELISA检测试剂盒中的酶复合酶(HRP标记的动物抗人免疫球蛋白)进行抗—HCV抗体检测，并与商品化的抗—HCV抗体ELISA检测试剂盒进行平行对照检测，评价LD5分子标记辣根过氧化物酶作为酶复合物的检测效果。

六、应用新型进化免疫球蛋白结合分子免疫层析法检测特异抗体

本发明所述的一种新型进化免疫球蛋白结合分子LD5能与多种人免疫球蛋白分子结合，其中包括免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM、免疫球蛋白IgA等抗体，因此，将该分子与胶体金颗粒充分吸附制备LD5胶体金，可以吸附被检测标本中的抗体分子用于免疫层析法检测特异抗体。

本发明中我们将LD5胶体金分子充分吸附制备LD5胶体金，在硝酸纤维素膜上用HCV抗原(1.5mg/L)及人IgG(1mg/L)划线(1mm宽)，分别作为检测线和对照线。检测样品(血清)中的抗体首先与LD5胶体金上的LD5分子结合，并被固定在胶体金颗粒上，该颗粒运动至硝酸纤维素膜上用HCV抗原划线处，如检测样品中含有抗—HCV抗体，则吸附抗体的胶体金颗粒就与HCV抗原结合被固定在划线处，形成一紫红色的胶体金线条，检测为阳性，如检测样品中不含有抗—HCV抗体，则胶体金颗粒就不能被HCV抗原结合被固定在划线处，不能形成一紫红色的胶体金线条，检测为阴性。应用免疫层析法检测抗—HCV抗体特异抗体，并与商品化的抗—HCV抗体ELISA检测试剂盒进行平行对照检测，评价LD5分子胶体金检测效果。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1一种新型进化免疫球蛋白结合分子原核制备的方法

1.新型进化免疫球蛋白结合分子cDNA序列及克隆

含有编码进化免疫球蛋白结合分子LD5(L-D-L-D-L；L为PpL的B3结构域，D为SpA的D结构域)cDNA序列克隆的重组噬菌粒载体pCANTAB5S—LD5，是通过分子进化方法筛选获得，制备pCANTAB5S—LD5的具体步骤在《噬菌体展示SpA及PpL lg结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中已完全公开，即文献中表4中第3轮筛选的27#/44#和第4轮筛选的4#/33#克隆载体，其cDNA序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进化免疫球蛋白结合分子LD5 cDNA序列(SEQ ID NO：2)：

AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACA

AACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAA

ATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCICGCTGATGCG

CAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCA

ACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAA

ACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAAC

TTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAG

ATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTA

AATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTG

AACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAA

CGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAA

AAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTT

GAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGC

AGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA

进化免疫球蛋白结合分子LD5氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

KEKTPEEPKEEVTIKANLYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADA

QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKAN

LIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEIL

NMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTF

EEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAG

2.原核表达载体pET32a(+)—LD5的构建流程见图1

2.1 引物合成用于PCR扩增进化免疫球蛋白结合分子LD5的cDNA序列的引物为：上游5SNco-u：5’-TATCCATGGCTGCGGCCCAGCCGGCCTCT-3’，下游5SNoG-d：5’-CCTGCGGCCGCAACTGCCGCCGCC3’。上游引物中引入了NcoI酶切位点(下划线部分)，引物DNA序列由上海博亚生物技术公司(现为英骏生物技术公司)合成。

2.2 LD5表达序列的PCR扩增以pCANTAB5S-LD5为模板，用合成的上、下游引物进行扩增，PCR的反应体积为50μl，加质粒模板5ng，上、下游引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg3mmol，Taq酶1U，加ddH₂O至50μl。反应条件：94℃ 30s-60℃ 30s-72℃ 45s；35个循环，反应结束前72℃延伸5min，产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收试剂盒回收纯化。PCR扩增的LD5 cDNA片段在SalI位点后有(G4S)3接头(为pCANTAB5S载体上固有的)。由图2可见，PCT产物大小符合1156bp左右。胶回收纯化后用NcoI和SalI双酶切切去(G4S)3接头，得到LD5表达序列1103bp，结果分别见图3。

2.3 重组表达质粒的构建及DNA序列测定原核表达载体pET32a(+)购自Novagon公司，pET-32a(+)用NcoI和Sall双酶切，试剂盒回收酶切产物。上述PCR纯化产物用NcolI和SalI双酶切，试剂盒回收后取400ng与400ng PET-32a(+)载体NcoI和SalI酶切产物连接。转化后挑选重组子酶切鉴定，获重组质粒pET-32a(+)—LD5。提取pET32a(+)—LD5质粒，用NcoI和SalI双酶切(见图4)，符合理论预期并用其下游引物测定插入片段的DNA序列。

2.4 LD5融合蛋白的表达

2.4.1 重组表达载体pET-32a(+)—LD5的转化氯化钙法制备大肠杆菌BL21感受态细胞(E.coli BL21trxB(DE3)购自Novagen公司)，取pET-32a(+)—LD5 200ng加入感受态BL21-TRXB100μl，冰水浴30min，42℃90s，冰水浴1-2min后加900μl的SOC培养基37℃150rpm培养1h后涂LB平板(含Amp100ng/ml和Kana35 ng/ml)37℃培养过夜。

2.4.2 LD5的诱导表达和SDS-PAGE样品的制备从pET-32a(+)—LD5/BL21转化平板上挑取4个单克隆菌落接种至0.5mlLB(含Amp100ng/ml)中摇床培养3.5h后，取出100μl接至700μl LB(Amp)离心管中培养4h后加200μl甘油制备甘油菌种；余菌液加IPTG至终浓度1mM诱导培养3.5h后取300μl菌液10000rpm离心1分钟，弃上清，加2×SDS点样液25μl及0.01PBS25μl，混匀，制成SDS样品。收集空菌BL21培养液同样比例制成SDS样品。

2.4.3 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达制备12％SDS聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品及低分子量标准蛋白沸水浴5分钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝进入分离胶后提高至12V/cm，直至溴酚蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脱色3-4小时。结果见图5，可见所挑取的四个克隆在59kd左右均有目的蛋白带，空BL21均未见该条带。

2.5 融合蛋白LD5的大量表达及纯化

2.5.1 表达将pET-32a(+)—LD5/BL21甘油菌种500μl接至50mlLB(含Amp)培养过夜，再转至500mlLB中3.5h37℃摇床培养3.5h后加1mol/l的IPTG500μl诱导培养3.5h，取出分装250ml离心管中6000rpm4℃离心10分钟，去上清，加入20ml的0.1mol/l的PBS重悬于50ml离心管中，11000rpm4℃离心20分钟，去上清，沉淀加入20ml的8mol/l的尿素重悬，4℃过夜。

2.5.2 纯化  过夜尿素裂解液11000rpm4℃离心20分钟，取上清过Ni—NTA柱(金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)购自德国QIAGEN公司)，Ni-NTA柱以8M尿素(pH8.0)平衡，尿素裂解液上清上柱，8M尿素(pH7.0)洗柱，以8M尿素(pH4.5)洗脱，收集洗脱峰，0.1M Tris中和，以PBS透析，SDS-PAGE分析纯化效果(见图6)，可见在59kd有LD5的条带，无明显杂蛋白带。蛋白测序结果也显示含有SEQ ID NO：1的序列。

实施例2 新型进化免疫球蛋白结合分子与各类抗体及抗体片断的结合

1.与人多克隆IgG的结合：

1.1 人多克隆IgG购自Sigma公司，PpL和SpA购自Sigma公司。

1.2 1mg/ml人多克隆IgG以PBS(pH7.2)透析。取50μL3mg/ml长臂活化生物素(购自PIERCE公司)加入1mL IgG(1mg/mL)，在室温中轻微振荡4h后加入透析袋在PBS中4℃透析过夜，透析完后加等量甘油于-20℃中保存。

1.3 LD5、PpL和SpA均调整浓度至1mg/ml后以碳酸盐缓冲液(pH9.6)1：200稀释包被96孔板，每种蛋白均包被3排复孔，4℃ 24h后PBST洗4-5次，封闭液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封闭37℃ 1h后洗板，生物素标记的IgG以一定浓度开始倍比稀释，最后一孔不加，37℃45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物(购自PIERCE公司)，37℃ 15min，洗板后TMB显色5-10min，2M硫酸终止，酶标仪读取OD450nm；计算均值和标准差，Excel绘制结合曲线。结果可见LD5与人多克隆IgG的结合与SpA相当，明显高于PpL与人多克隆IgG的结合(见图7)。

2.与人多克隆IgM的结合；

2.1 人多克隆IgM购自Sigma公司，生物素标记同1.2。

2.2 以LD5 PpL SpA分别包板，与生物素标记的IgM结合，方法同1.3。结果可见LD5与人多克隆IgM的结合明显高于SpA和PpL(见图8)。

3.与人多克隆IgA的结合：

3.1 人多克隆IgA购自Sigma公司，生物素标记同1.2。

3.2 ELISA方法同1.3。结果可见LD5与人多克隆IgA的结合明显高于SpA和PpL(见图9)。

4.与人多克隆IgG Fab的结合：

4.1 对IgG进行木瓜蛋白酶切获得Fab和Fc：

4.1.1 半胱氨酸活化木瓜蛋白酶：多克隆人IgG IgM IgA均购自Sigma公司。木瓜蛋白酶(华美生物技术有限公司)用PBS溶解成浓度1mg/ml，加EDTA和L-半胱氨酸均至终浓度0.01M，37℃ 30min后以0.1M醋酸钠透析除去半胱氨酸和EDTA。

4.1.2 人多克隆IgG与活化的木瓜蛋白酶按30：1的质量比进行酶切，37℃ 5h后加入碘代乙酰胺至0.03M终止反应。

4.1.3 产物过SpA柱分离Fab和Fc：以20mM磷酸钠缓冲液洗柱，酶反应液上柱，收集含Fab的流穿峰，后以0.1M pH3.0的醋酸钠洗脱结合的Fc。

4.2 IgGFab IgGFc的生物素标记同1.2

4.3 以生物素标记的IgGFab进行与包被的LD5、SpA和PpL结合，方法同1.3，结果可见LD5与人多克隆Ig Fab的结合明显高于SpA和PpL(见图10)。

5.与人多克隆IgG Fc的结合：以生物素标记的IgG Fc进行与各种IBP分子的结合，方法同1.3。结果可见LD5与人多克隆IgG Fc的结合与SpA相当，PpL与人多克隆IgG Fc不结合(见图11)。

6.与基因工程scFv的结合：

6.1 scFv在大肠杆菌中的表达和纯化

6.1.1 scFv的诱导表达

三种scFv的表达载体，KM36(VH3-Vλ)KM38(VH3-Vκ)KM41(VH1-Vκ)为荷兰Sanquil实验室Dr Jan Voorberg提供，其详细制备方法由文献Edward N.van den Brink，EllenA.M.Turenhout，Niels Bovenschen，Bram G.A.D.H.Heijnen，Koen Mertens，MarjoleinPeters，and Jan Voorberg.Multiple VH genes are used to assemble human antibodiesdirected toward the A3-C1 domains of factor VIII.BLOOD，2001；97(4)：966—972完全公开。scFv其N端带有6个组氨酸标签。转化E Coli TG1，挑取单克隆转接于20ml 2×YTG(Amp100mg/ml)，37℃ 250rpm过夜后扩增至500ml 2×YT(Amp100mg/ml 0.1％Glu)，37℃ 250rpm至OD600＝0.5时加入IPTG至0.1mM，30℃ 220rpm 3h后离心取沉淀菌。

6.1.2 诱导菌的裂解和scFv的纯化

沉淀菌加入冰预冷的50mMTris-HCl(20％蔗糖1mMEDTA 1mMPMSF)悬浮，20min后，12000rpm离心10min取上清，沉淀再以冰预冷的5mM MgS04(1mMPMSF)20min后离心12000rpm 10min取上清。对获得的菌体裂解上清以20mM咪唑(500mMNaCl 50mM磷酸钠pH7.5)，4℃透析过夜；Ni-NTA柱以透析液平衡，样品上柱，以20mM咪唑洗柱后以100mM咪唑洗脱，收集洗脱液即为纯化的scFv。

6.2 三种scFv与生物素标记LD5结合的ELISA

将三种纯化的单克隆scFv KM36、KM38和KM41包板，同时用不含scFv表达载体的TG1菌裂解上清包板。用生物素标记的LD5对固相化Ig行结合实验。KM36 KM38 KM41的TG1和空TG1菌裂解上清以碳酸盐缓冲液1：200稀释包被96孔板，每种scFv均包被3排复孔，4℃ 24h后PBST洗3-4次，封闭液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封闭37℃ 1h后洗板，2mg/ml的生物素标记LD5以1：200开始倍比稀释，最后一孔不加，余步骤同1.3。结果可见LD5与KM38(VH3-Vκ)的结合远大于与KM41(VH1-Vκ)和KM36(VH3-Vλ)的结合(图12)。

实施例3 新型进化免疫球蛋白结合分子κ轻链和VH3重链的双位点结合模式的证实

SpA与IgG的Fc段具有较强的亲和力，同时SpA还能结合属于VH3基因家族的VH区(SassoEH，Silvcrman GJ，Mannik M.Human 1gA and IgG F(ab’)2 that bind to staphylococcalSpA belong to the VHIII subgroup.J Immunol.1991:147：1877-1883)。PpL通过与Ig的轻链，主要是κ轻链的1、3、4亚型相互作用而结合免疫球蛋白(NilSon BH，Solomon A，BjorckL，et al.PpL from peptostreptococcus magnus binds to the kappa light chain variabledomain；J Biol Chem.1992；267(4)：2234-9)。从LD5与各类Ig分子的结合实验看，LD5具有对IgGFab IgM IgA较SpA和PpL更高的亲和力，推测LD5具有对VH3重链和κ轻链可变区的双位点结合特性。竞争抑制试验能验证是否LD5具有对VH3重链和κ轻链可变区的双位点结合特性，如果是双位点结合的协同效应，则联合用PpL和SpA对LD5与IgG Fab、IgM、IgA(IgG Fab缺乏Fc段，IgM和IgA的Fc段不能与SpA和LD5结合，这样排除了Fc段对竞争抑制试验的干扰作用)结合的抑制作用要明显小于LD5本身的抑制作用；如果不是双位点结合的协同效应，而是分别对可变区VH3重链和κ轻链的单独结合，则联合用PpL和SpA对LD5与IgGFab、IgM、IgA结合的抑制作用应与LD5本身的抑制作用相当。

1.LD5结合IgG Fab的竞争抑制ELISA实验

2mg/ml IgG Fab以碳酸盐缓冲液(pH9.6)1：200稀释包被96孔板，用于四类竞争蛋白(LD5自身、PpL+SpA、PpL、SpA)的复孔各包被三排，另包一排用于不加竞争蛋白组，4℃ 24h后PBST洗2—3次，封闭(2％BSA0.05％TWEEN-20)37℃ 1h后洗板，同时加入固定浓度的生物素标记的LD5和倍比稀释的各种竞争蛋白(初始浓度为生物素标记LD5的10倍)，另一排只加入相同固定浓度的生物素标LD5，37℃ 45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物，37℃ 15min，洗板后TMB显色5-10min，2M硫酸终止，酶标仪读取OD450nm。计算各复孔的OD均值，Excel绘制竞争抑制曲线，抑制百分数＝(OD-ODx)100/OD(单位％，OD代表不加抑制蛋白组的吸光度均值，ODx表示在各种抑制浓度下的三个复孔的OD均值)。结果可见PpL+SpA、PpL、SpA对生物素标记的LD5 IgG Fab结合的抑制作用远小于LD5本身(图13)，说明LD5与IgG Fab中的κ轻链和VH3重链的结合是同时双位点结合，而不是分别与各个位点单独结合。

2.LD5结合IgM的竞争抑制ELISA实验

以IgM包板，方法同1。结果可见PpL+SpA、PpL、SpA对生物素标记的LD5 IgG Fab结合的抑制作用远小于LD5本身(图14)，说明LD5与IgM中的κ轻链和VH3重链的结合是同时双位点结合，而不是分别与各个位点单独结合。

3.LD6结合IgA的竞争抑制ELISA实验

以IgA包板，方法同1。结果可见PpL+SpA、PpL、SpA对生物素标记的LD5 IgG Fab结合的抑制作用远小于LD5本身(图15)，说明LD5与IgA中的κ轻链和VH3重链的结合是同时双位点结合，而不是分别与各个位点单独结合。

实施例4  应用新型进化免疫球蛋白结合分子

大规模纯化基因工程抗体、天然抗体和单克隆抗体

1.琼脂糖活化

(1)称4g CNBr-Sepharose 4B(购自Pharmacia公司)，用4mM HCl，pH2.5溶液浸泡15min，再用该溶液反复洗涤5次。

(2)将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/LpH 9.0 NaHCO3抽洗。

2.偶联蛋白

(1)事先将LD5蛋白120mg置于0.1Mol/LpH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。

(2)将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min内，从抽洗到偶联)，4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。

3.装柱

将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3(含0.1Mol/L NaCl)洗涤至洗出液的OD280<0.02为止。用0.01Mol/LpH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，加入0.02％Na N3于4℃保存备用

4.大规模纯化基因工程抗体

(1)使用复旦张江生物医药有限公司重组的表达抗Her2的基因工程抗体的CHO-K1工程细胞株生产基因工程抗体。在工程细胞株的构建中，将目的基因和谷氨酰胺合成酶基因(GS)基因共转染空宿主细胞，利用GS基因扩增系统，使用(硫氨甲硫氨酸(MSX))作为筛选药物筛选高表达细胞株。最后进行高表达细胞株的单克隆化、适应无血清悬浮培养，扩增、建库和用于GMP生产。生物反应器采用New Brunswick Scientific Co.，CELLTGEN PLUS型。工作体积为1.4L；发酵温度为37℃；搅拌转速为150rpm；通过添加CO2和8％NaHCO₃控制pH在7.20；通过环形供气装置(ring sparger)进行气体供应，控制通气流量在0.1-0.2vvm；通过空气、氧气、氮气控制溶氧在50％空气饱和度。工程细胞株经悬浮扩增培养后接种至2.2L生物反应器，经连续灌注培养25天，收获培养上清进行纯化和评价。

(2)基因工程抗体细胞培养液按100倍床体积直接缓慢加入纯化柱，用0.01Mol/LpH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280<0.02为止。

(3)加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸—HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。

(4)以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/LpH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02％Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。纯化的蛋白对PBS透析，—40℃保存。纯化蛋白行SDS PAGE凝胶电泳分析，可见纯度达90％以上(图16)。

5.大规模纯化天然抗体

(1)人血清按床体积1/10加样，血清用PBS稀释至浓度为20％，缓慢加入纯化柱，用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280<0.02为止。

(2)加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸—HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。

(3)以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02％Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。纯化的蛋白对PBS透析，—40℃保存。纯化蛋白行SDS PAGE凝胶电泳分析，可见纯度达90％以上(图17)。

6.大规模纯化单克隆抗体

(1)将抗重组人干扰素—γ单克隆抗体杂交瘤细胞株复苏，该细胞株来源的详细资料见《重组人γ干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞建株研究》，上海免疫学杂志，1986年第6卷第6期第35～43，RPMI—1640培养液(购自GIBCO公司)培养。于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷(购自SIAMA公司)，注射后第3周内接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml(含1.0×10⁷个细胞/ml)，种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次，所取腹水—40℃保存备用。

(2)单克隆抗体腹水按床体积1/10加样，小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×10⁵转离心30min，去沉淀，将上清缓慢加入纯化柱，用0.01Mol/LpH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280<0.02为止。加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸—HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。

(3)以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02％Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。纯化的蛋白对PBS透析，—40℃保存。纯化蛋白行SDS PAGE凝胶电泳分析，可见纯度达90％以上(图18)。

实施例5  应用新型进化免疫球蛋白结合分子ELISA法检测特异抗体

1、LD5分子标记辣根过氧化物酶(HRP)

取10mg HRP(购自SIAMA公司)加1ml 0.1mol/L醋酸钠或水溶解，充分混匀，约5分钟后加0.08mol/LNaIO₄，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内20分钟，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21％NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇(AR)沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇(尽量去除乙醇)，沉淀用PH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml LD5(内含蛋白量20mg左右)，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mg NaBH₄混匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理盐水透析除盐(需换液5次)，如有沉淀藉离心除去，上清呈淡棕色即为酶结合物。加60％甘油PBS，分装保存备用。

2、用HRP标记的LD5分子ELISA检测抗—HCV抗体

购买商用抗—HCV ELISA抗体检测试剂盒(上海科华生物技术有限公司)，按照试剂盒的说明书对383份血液透析患者的血清进行抗—HCV抗体的ELISA检测，所不同的是将试剂盒中的酶标稀释液重新配置，将原来的酶复合物改换成HRP标记的LD5分子。具体为；加100μL稀释液于包被抗原的检测板孔内，再加10μL的检测血清，盖好板盖，置37℃水浴中，保温45min。甩掉板孔内的血清，用洗液洗五次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。将HRP标记的LD5分子(1mg/ml)按1:500加入酶标记抗体稀释液(0.02mol/L pH7.2PBS-0.05％吐温-20-0.1％白明胶-10％健康牛血清)中，混匀后，每空加入100μL，置37℃水浴中，保温45min。甩掉板孔内的酶复合物液，用洗液洗五次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。用100μL微量吸液器，每孔加新配制的TMB A液和B液各100μL，在室温下避光反应大约5～10min，用2mol/L硫酸终止反应。用酶标测试仪，在波长450nm下，测定各孔OD值。所有标本用抗—HCV ELISA抗体检测试剂盒(上海科华生物技术有限公司)按照试剂盒的说明书进行测定，与酶复合物改换成HRP标记的LD5分子的测定结果进行比较。结果见表1，经计算，应用HRP标记的LD5分子ELISA检测抗—HCV抗体的检测结果与商用试剂盒的检测结果相比敏感度达到99.3％，特异性达100％，总符合率达到99.7％，说明HRP标记的LD5分子完全达到了商用化的检测要求。

表1 HRP标记的LD5分子ELISA检测抗—HCV抗体与商用试剂盒检测结果的比较

 

	阳性(科华)	阴性(科华)
				阳性(LD5)	145	0	145
阴性(LD5)	1	237	238
					146	237	383

实施例6 应用新型进化免疫球蛋白结合分子免疫层析法检测特异抗体

1、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶

取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积。

2、LD5标记胶体金

①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH6.0。

②于100ml金溶胶中加入2～3ml LD5蛋白(10mg/ml)，搅拌2～3分钟。

③加入5ml 1％ PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件)，小心吸去上清液(切忌倾倒)。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A1cm/540nm＝1.5左右为宜，以0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。

3、免疫层析测试条的制备

测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成.吸水纤维部分附着有胶体金免疫复合物；在硝酸纤维素膜上用HCV抗原(1.5mg/L)及人1gG(1mg/L)划线(1mm宽)，分别作为检测线和对照线，晾干，用50g/LBSA封闭2h，以0.01mol/L PBS洗涤3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5cm×10cm的试条，加干燥剂密封保存。制备的抗—HCV免疫层析测试条见图19。

4、抗HCV检测

将0.1～0.2mL血清点加在测试条含有金标记物的一端的电样孔即可。结果判定：以测试条硝酸纤维素膜上出现两条红色条带为抗Hp-CagA IgG阳性；仅出现一条红色条带(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性.如果无红色条带出现则视为试剂失效。结果确定时间：强阳性标本在5min内即可在检测线处见到红色胶体金颗粒聚集；弱阳性标本约需要10min确定。用该抗—HCV免疫层析测试条对383份血液透析患者的血清进行抗—HCV抗体检测，并用商用抗—HCV ELISA抗体检测试剂(上海科华生物技术有限公司)作对照，结果见表2，经计算，免疫层析测试条检测抗—HCV抗体的检测结果与商用试剂盒的检测结果相比，敏感度达到94.5％，特异性达99.2％，总符合率达到97.4％，说明LD5制备的抗—HCV免疫层析测试条完全达到了实用化的检测要求。

表2 LD5制备的抗—HCV免疫层析测试条与商用试剂盒检测结果的比较

 

	阳性(科华)	阴性(科华)
				阳性(LD5层析条)	138	2	140
阴性(LD5层析条)	8	235	243
					146	237	383

序列表

<110>上海润龙生物科技有限公司

<120>一种进化免疫球蛋白结合分子、其制备方法及应用

<130>PCNRL060599

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>346

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>misc_feature

<400>1

<210>2

<211>1038

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>misc_feature

<400>2

Claims (5)

1.一种进化免疫球蛋白结合分子在体外结合免疫球蛋白中的应用，其特征在于，所述进化免疫球蛋白结合分子其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，进化免疫球蛋白结合分子体外结合免疫球蛋白的方式为双位点结合模式，即与免疫球蛋白κ轻链和VH3重链这两个位点的结合模式，所述的免疫球蛋白选自IgM、IgA或IgG Fab中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述的IgM、IgA或IgG Fab来源于人。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将进化免疫球蛋白结合分子用于制备HCV检测试剂条。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于将进化免疫球蛋白结合分子用于纯化抗体。

5.如权利要求4所述的应用，其中所述的抗体为基因工程抗体或天然抗体或单克隆抗体。

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