CN102115497A - 具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子及其制备方法和应用。本发明还公开了该人IgA结合分子的编码基因、基于噬菌体分子进化的人IgA结合分子的制备方法及其应用。本发明公开的人IgA结合分子，尤其是人IgA亲和体的重复体分子，具有与人IgA结合的分子内亲合力效应，显示出很高的与人IgA结合的活性，可用于高效特异性IgA纯化和检测试剂的研发，以用于酶联免疫吸附法、免疫层析法和免疫组化等免疫方法对人IgA抗体进行检测。

Description

具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具有涉及具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子及其制备方法和应用。

背景技术

IgA是人体粘膜表面和分泌液中的主要免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，它不仅在机体的免疫防御中起重要作用，而且与许多疾病的诊断和预后密切相关，因此研究开发高效特异性人IgA(hIgA)纯化和检测试剂具有重要的应用价值。金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)是具有Ig结合活性的细菌表面蛋白之一。据文献报道，利用蛋白A的5个Ig结合单结构域各位置中出现频率最高的氨基酸，合成新的含58个氨基酸的蛋白A单结构域(命名为Z结构域)[Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，et al.(1997)Nat Biotechnol 15：772-777.]，其空间构型更为稳定，呈三股反向α螺旋结构，其中参与IgG Fc段恒定区结合的2个α螺旋表面具有13个溶剂可及残基(solvent accessible residues)。国外学者选择Z结构域作为类似抗体的支架，将这13个表面残基模拟抗体结合位点进行随机突变，建立噬菌体展示突变文库，并以不同的靶蛋白(如重组人VIII因子、呼吸道合胞病毒A亚类的G蛋白、人表皮生长因子受体胞外区和人CD28分子等)对该文库进行亲和筛选，分别获得与这些靶蛋白特异性结合的分子，并将这些类似抗体的结合分子命名为亲和体(affibody)。人IgA(hIgA)亲和体是以IgA单克隆抗体为诱饵，经噬菌体展示Z结构域突变文库进化筛选获得的失去对人IgG、IgD、IgE、IgM的结合能力，而对hIgA具有很高的结合活性的结合分子。

hIgA亲和体只存在一个hIgA结合位点，而细菌天然的Ig结合蛋白是由多个高度同源的Ig结合单结构域串联而成，如蛋白A和大芬戈尔德菌(原名大消化链球菌)蛋白L的抗体结合区分别由5个序列高度同源的单结构域组成。本实验室曾以蛋白A、链球菌蛋白G及大芬戈尔德菌蛋白L的单结构域为基本单位，构建了由4个Ig结合单结构域随机组合而成的噬菌体展示文库，并以不同的Ig分子为配基进行亲和筛选，结果表明Ig结合单结构域有机串联，可产生明显高于单一单结构域的结合活性；并且各单结构域的组合方式和结构域之间不同的随机连接肽序列，对于其Ig结合功能均具有重要影响。国外学者用基因工程方法将两个hIgA亲和体头尾相连，形成人工二聚体，可从正常人血浆中回收纯化hIgA蛋白，同时也有少量IgG和IgM吸附回收，指出可能是污染所致，未给予合理解释[Ronnmark J， Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA.(2002)Eur J Biochem 269(11)：2647-2655.]。基于此，进一步获得高亲合力的新的hIgA亲和体组合分子以实质性提高与hIgA的结合活性是值得深入研究的问题，目前国内外尚未见报道。

发明内容

本发明通过将具有较高hIgA结合活性的hIgA亲和体SEG1(其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示)和SEG2(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)序列作为基本结构单元，分别在其3′端引入3个氨基酸大小的随机连接肽序列，构建噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库，然后以hIgA分子为筛选配基，通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的生物淘洗方法，对噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库进行多轮定向进化筛选，并结合PCR方法检测每轮筛选后各代噬菌体文库插入片段的分布情况，根据每次筛选结果来判断占主导优势的噬菌体中含有的hIgA亲和体重复体片段的数量；然后测定筛选出的含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的阳性单克隆噬菌体的DNA序列，推导所含外源氨基酸序列；最后通过ELISA检测、Western blot试验、表面等离子共振检测以及竞争ELISA检测等检测方法，筛选出与hIgA具有最高结合能力的hIgA亲和体重复体。通过本发明的筛选方法，获得了含1个hIgA亲和体的序列为SEQ1- _RAI (氨基酸序列如SEQ NO ID：3中所示)或SEQ2- _RFY (氨基酸序列如SEQ NO ID：4中所示)；含2个hIgA亲和体的序列为SEQ2- _NPS -SEQ2- _TCQ (氨基酸序列如SEQ NO ID：5中所示)或SEQ1- _QIT -SEQ2- _ICM (氨基酸序列如SEQ NO ID：6中所示)；含3个hIgA亲和体的序列为SEQ1- _RSH -SEQ1- _AGR -SEQ1- _TGH (氨基酸序列如SEQ NO ID：7中所示)或SEQ1- _VKD -SEQ1- _MKT -SEQ1- _ADA (氨基酸序列如SEQ NO ID：8中所示)；含4个hIgA亲和体的序列为SEQ2- _RHG -SEQ1- _NLN -SEQ2- _TKD -SEQ1- _SRH (氨基酸序列如SEQ NO ID：9中所示)；其中，含3个hIgA亲和体重复体和含4个hIgA亲和体重复体与hIgA有明显结合优势，具有分子内结合的亲合力效应，显示出很高的与人IgA结合的活性，可用于高效特异性IgA纯化和检测试剂的研发，以用于酶联免疫吸附法、免疫层析法和免疫组化等免疫方法对人IgA抗体进行检测等领域。

上述hIgA亲和体中使用的氨基酸单字母缩写所代表的氨基酸名称为：A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，颉氨酸；Y，酪氨酸。

本发明的第一个目的，是克服现有技术的缺陷，提供一种具有分子内亲合力效应的人 IgA免疫球蛋白结合分子，及其制备方法。

本发明的第二个目的，是提供编码上述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的多核苷酸。

本发明的第三个目的，是提供一种具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的定向进化筛选方法。

本发明的第一方面，公开了一种具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子，它是SEQ ID NO：5～9中任一所示的氨基酸序列的蛋白，或其保守性变异蛋白。

较佳的，它是SEQ ID NO：7～9中任一所示的氨基酸序列的蛋白。

本发明第二方面，公开了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码前述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子。

较佳的，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO：10～14中任一所示的核苷酸序列。

编码所述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备，包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；也可以先合成具有SEQ ID NO：10～14所示的核苷酸序列，然后通过定点突变、定向诱变或以其它本领域熟知的技术来插入、替换、剔除序列以获得所需的核苷酸序列。

编码所述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。

编码人IgA免疫球蛋白结合分子的核苷酸序列和编码载体蛋白的核苷酸序列之间的融合技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。

本发明的第三个方面，公开了一种表达载体，该表达载体表达上述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子，且该表达载体含有上述多核苷酸以及与该多核苷酸操作性相连的表达调控序列。

较佳的，所述表达载体为原核表达载体，优选为pET32a(+)原核表达载体。

本发明的第四方面，公开了一种宿主细胞，所述宿主细胞被上述表达载体所转化。

较佳的，所述宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21。

本发明的第五方面，公开了上述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的筛选制备方法，包括如下步骤：合成编码上述人IgA免疫球蛋白结合分子的多核苷酸，将此多核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有编码上述人IgA免疫球蛋白结合分子的多核苷酸的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，通过亲和层析制备所述具有分子内亲合 力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子。

优选的，所述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的筛选制备方法的步骤为：将hIgA亲和体序列克隆至pET32a(+)原核表达载体，转化BL21(DE3)受体菌，经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后，用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达蛋白。

本发明的第六方面，公开了一种具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的定向进化筛选方法，包括如下步骤：

1)以具有较高hIgA结合活性的hIgA亲和体SEG1和SEG2序列(其中，所述SEG1的序列为SEQ ID NO：1所示，所述SEG2的序列为SEQ ID NO：2所示)作为基本结构单元，分别在其3′端引入长度为3个氨基酸的随机连接肽序列，构建噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库；

2)以hIgA分子为筛选配基，通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的生物淘洗方法，对步骤1)中得到的噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库进行3～5轮筛选；

3)用PCR方法检测每轮筛选后各代噬菌体文库插入片段的分布情况，用PCR方法检测每轮筛选后各代噬菌体文库插入片段的分布情况，分析每轮筛选后噬菌体中含有的hIgA亲和体重复片段的数量以及含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的噬菌体克隆的百分比；

4)随机挑取含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的噬菌体克隆进行鉴定，经酶联免疫吸附检测上述噬菌体克隆与hIgA的结合能力；

5)测定含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的阳性单克隆噬菌体的DNA序列，推导所含外源氨基酸序列；

6)筛选获得的hIgA亲和体序列克隆至表达载体，转化受体菌，经诱导表达并纯化表达蛋白；

7)经ELISA检测、Western blot试验以及表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)检测，筛选出与hIgA具有最高结合能力的hIgA亲和体重复体；

8)分别以含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的亲和体重复体作为竞争抑制剂，进一步通过竞争ELASA试验证实含3或4个hIgA亲和体重复体的蛋白与hIgA有明显结合优势；

9)将hIgA和hIgG分别用二巯基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)处理，使抗体解离为单链，检测其与不同IgA亲和体重复分子的结合反应，通过ELISA试验和Dot blot检测表明：3-4个亲和体重复分子与hIgA的结合方式是分子内结合，产生分子内亲合力效应，而1-2个亲和体与hIgA结合方式则是分子间结合；同时，2-4个亲和体重复分子与hIgG的 结合方式既存在分子内也存在分子间的结合作用，提示1个以上hIgA亲和体重复分子保留了与hIgG结合的残留活性；

10)将4个IgA亲和体重复分子吸附偶联于Sepharose(琼脂糖凝胶)，观察其从正常人血清中回收hIgA抗体作用，并用Western blot检测抗hIgA、抗hIgG和抗hIgM分别与亲和层析洗脱液的反应性，结果显示4个hIgA亲和体重复体分子可回收正常人血清中IgA，也可回收到少量IgG和IgM。

优选的，所述步骤2)中的生物淘洗方法的具体步骤为：将hIgA抗体以每孔200ng于37℃包被ELISA板条3h，加磷酸盐缓冲液(PBS)配制的封闭液(含10％脱脂奶粉、0.1％Tween-20，0.2％柳硫汞)室温封闭1h，用PBS洗涤3次后，加入噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库(1×10¹²TU)，37℃放置2h，用PBST(含0.25％Tris，0.05％Tween-20)洗涤40次。每孔加入100μl对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1h，收集菌液，取10μl测定滴度，其余菌液接种至50ml 2×YT培养基(含Amp 100μg/ml)，于37℃振荡培养1h后加入辅助噬菌体M13KO7(1×10¹⁰TU)，继续培养1h后加入Kana至15μg/ml，37℃振荡培养过夜。

优选的，所述步骤6)中的表达载体为pET32a(+)原核表达载体，所述受体菌为BL21(DE3)，所述诱导表达为经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，所述纯化为用Ni-NTA亲和层析柱纯化。

本发明中，所述ELISA检测、Western blot试验、表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR)检测以及竞争ELASA试验均为本领域公知技术，本领域技术人员可以参考现有技术进行确认。

本发明的第七方面，公开了上述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的应用，较佳的，所述应用为用于高效特异性IgA的纯化和检测，或者用于酶联免疫吸附法、免疫层析法和免疫组化等免疫方法对人IgA抗体进行检测。

本发明采用噬菌体随机组合文库进行分子定向进化筛选，筛选出具有较高hIgA结合活性的新型蛋白结合分子。本发明中公开了几种人IgA免疫球蛋白结合分子，还公开了该人IgA结合分子的编码基因、基于噬菌体分子进化的人IgA结合分子的制备方法及其应用。本发明公开的人IgA结合分子，尤其是人IgA亲和体的重复体分子，具有与人IgA结合的分子内亲合力效应，显示出很高的与人IgA结合的活性，可用于高效特异性IgA纯化和检测试剂的研发，以用于酶联免疫吸附法、免疫层析法和免疫组化等免疫方法对人IgA抗体进行检测和诊断。

本发明公开的基于噬菌体的分子定向进化筛选获得hIgA蛋白结合分子的制备方法，使得低成本、快速简便筛选免疫球蛋白结合分子成为可能。另一方面，本发明公开的上述hIgA蛋白结合分子中，含2个以上hIgA亲和体重复体与hIgA有明显结合优势，具有分子内结合的亲合力效应，提示人工结合蛋白的筛选和研究在亲合力层次上进行设计、构建和评价具有重要意义。

附图说明

图1：重组pMD-18T克隆载体的构建流程图。

图2：噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库的构建流程图。

图3：PCR法检测hIgA筛选噬菌体文库后每轮单克隆噬菌体插入片段的大小

1-24：随机挑取的单克隆噬菌体；M：DL2000Marker；C：阴性对照(pCANTAB5S质粒)；I、II、III、IV：分别为1-4轮筛选的不同轮次。

图4：经hIgA筛选后各代噬菌体文库中的20个单克隆噬菌体插入片段的组成比例变化

横坐标：原始噬菌体文库0以及经hIgA 1-4轮筛选后子代文库

纵坐标：含不同插入片段的噬菌体克隆的百分比例

代表不含和含1个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例； 

代表含2个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例； 

代表含3个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例； 代表含4个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例。

图5：ELISA方法检测含1-4个hIgA亲和体的噬菌体分别与hIgA和hIgG的结合活性

横坐标：筛选的噬菌体克隆与hIgA 

hIgG 

和hIgM(□)的结合反应

纵坐标：A490，即波长490nm的光吸收值

Ori-PL：原始噬菌体展示文库。

图6： hIgA亲和体代表序列的原核表达、纯化及功能鉴定流程图。

图7： hIgA亲和体表达序列的酶切回收片段的琼脂糖电泳图

M：DL2000Marker；1-4：分别代表1-4个hIgA亲和体DNA序列。

图8： hIgA亲和体重组表达质粒的酶切鉴定电泳图

1：SEG1/pET32a(+)质粒；

2：SEG1/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；

3：SEG1-SEG2/pET32a(+)质粒；

4：SEG1-SEG2/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；

5：SEG1-SEG1-SEG1/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；

6：SEG1-SEG1-SEG1/pET32a(+)质粒；

7：SEG2-SEG1-SEG2-SEG1/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；

8：SEG2-SEG1-SEG2-SEG1/pET32a(+)质粒；

9：pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；

M：DL2000 Marker。

图9：hIgA亲和体融合蛋白小量表达的SDS-PAGE结果

C：空菌对照；

M：蛋白Marker，97400、66200、43000、31000、20100、14400分别表示14400-97400Daltons Marker电泳显色条带对应的分子量

1：代表含1个hIgA亲和体的融合蛋白；

2，3：均代表含2个hIgA亲和体的融合蛋白；

4，5：均代表含3个hIgA亲和体的融合蛋白；

6，7：均代表含4个hIgA亲和体的融合蛋白。

图10：纯化的4种hIgA亲和体融合蛋白的SDS-PAGE结果

M：蛋白Marker，97400、66200、43000、31000、20100、14400分别表示14400-97400Daltons Marker电泳显色条带对应的分子量

1-4：分别代表含1-4个hIgA亲和体的融合蛋白。

图11：ELISA检测4种人IgA亲和体融合蛋白分别与hIgA(A)、hIgG(B)、hIgG1-Fc(C)和hIgM(D)的结合活性

横坐标：生物素标记的hIgA稀释度(1)、生物素标记的hIgG稀释度(2)、生物素标记的hIgG1-Fc稀释度(3)、生物素标记的hIgM稀释度(4)

纵坐标：A490，即波长490nm的光吸收值

带“—■—”线条：对应4个hIgA亲和体融合蛋白

带“—▲—”线条：对应3个hIgA亲和体融合蛋白

带“—○—”线条：对应2个hIgA亲和体融合蛋白

带“—  —”线条：对应1个hIgA亲和体融合蛋白

带“—●—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白。

图12 ：Western blot法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与4种Ig分子的结合反应

A：hIgA亲和体融合蛋白与hIgA的结合反应

B：hIgA亲和体融合蛋白与hIgG的结合反应

C：hIgA亲和体融合蛋白与hIgG1-Fc的结合反应

D：hIgA亲和体融合蛋白与hIgM的结合反应

1：pET-32a(+)融合蛋白

2：1个hIgA亲和体融合蛋白

3：2个hIgA亲和体融合蛋白

4：3个hIgA亲和体融合蛋白

5：4个hIgA亲和体融合蛋白

6：金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。

图13：表面等离子共振(SPR)法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与3种Ig分子的结合反应

横坐标：作用时间(秒)

纵坐标：共振单位(RU)

A：4种hIgA亲和体融合蛋白与hIgA的结合反应

B：4种hIgA亲和体融合蛋白与hIgG的结合反应

C：4种hIgA亲和体融合蛋白与hIgM的结合反应

SEG1，SEG2：为2种hIgA亲和体

每张图中6条曲线代表6个稀释度，由上至下按1∶2倍比稀释。

图14 ：1-4个hIgA亲和体融合蛋白(A，B，C，D)结合生物素标记的hIgA(b-hIgA)的竞争抑制以及2-4个hIgA亲和体融合蛋白(E，F，G)结合生物素标记的hIgG(b-hIgG)的竞争抑制

横坐标：log(inhibitor)(nM)，即抑制因子浓度对数值

纵坐标：Percent ofinhibition，即抑制百分数

带“—■—”线条：对应4个hIgA亲和体融合蛋白

带“—▽—”线条：对应3个hIgA亲和体融合蛋白

带“—▼—”线条：对应2个hIgA亲和体融合蛋白

带“—○—”线条：对应1个hIgA亲和体融合蛋白

带“—●—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白。

图15 ：hIgA和hIgG经二巯基乙醇(BME)处理前后的SDS-PAGE结果

M：蛋白Marker，97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3分别表示14300-97200Daltons Marker电泳显色条带对应的分子量

9A(1)：变性条件下hIgA和hIgG经BME处理前后的SDS-PAGE结果

9A(2)：非变性条件下hIgA和hIgG经BME处理前后的SDS-PAGE结果

1：hIgA；2：经BME处理后hIgA；3：hIgG；4：经BME处理后hIgG。

图16 ：ELISA检测hIgA和hIgG经二巯基乙醇(BME)处理前后分别与2个和4个hIgA亲和体融合蛋白的结合反应

横坐标：生物素标记的4个hIgA亲和体融合蛋白稀释度[9B(1)]、生物素标记的2个hIgA亲和体融合蛋白稀释度[9B(2)]、生物素标记的hIgA稀释度[9B(3)]、生物素标记的hIgG稀释度[9B(4)]、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hIgA稀释度[9B(5)]、HRP标记的抗hIgG稀释度[9B(6)]

纵坐标：A450，即波长450nm的光吸收值

图16(A)

带“—■—”线条：对应生物素标记的4个hIgA亲和体融合蛋白与包板的hIgA的反应

带“—□—”线条：对应生物素标记的4个hIgA亲和体融合蛋白与包板的BME处理的hIgA反应

带“—●—”线条：对应生物素标记的4个hIgA亲和体融合蛋白与包板的hIgG的反应

带“—○—”线条：对应生物素标记的4个hIgA亲和体融合蛋白与包板的BME处理的hIgG反应

带“—▲—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白

图16(B)

带“—■—”线条：对应生物素标记的2个hIgA亲和体融合蛋白与包板的hIgA的反应

带“—□—”线条：对应生物素标记的2个hIgA亲和体融合蛋白与包板的BME处理的hIgA反应

带“—●—”线条：对应生物素标记的2个hIgA亲和体融合蛋白与包板的hIgG的反应

带“—○—”线条：对应生物素标记的2个hIgA亲和体融合蛋白与包板的BME处理的hIgG反应

带“—▲—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白

图16(C)

带“—■—”线条：对应生物素标记的hIgA与包板的4个hIgA亲和体融合蛋白的反应

带“—□—”线条：对应生物素标记的BME处理的hIgA与包板的4个hIgA亲和体融合蛋白反应

带“—●—”线条：对应生物素标记的hIgA与包板的2个hIgA亲和体融合蛋白的反应

带“—○—”线条：对应生物素标记的BME处理的hIgA与包板的2个hIgA亲和体融合蛋白反应

带“—▲—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白

图16(D)

带“—■—”线条：对应生物素标记的hIgG与包板的4个hIgA亲和体融合蛋白的反应

带“—□—”线条：对应生物素标记的BME处理的hIgG与包板的4个hIgA亲和体融合蛋白反应

带“—●—”线条：对应生物素标记的hIgG与包板的2个hIgA亲和体融合蛋白的反应

带“—○—”线条：对应生物素标记的BME处理的hIgG与包板的2个hIgA亲和体融

合蛋白反应

带“—▲—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白

图16(E)

带“—■—”线条：对应辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hIgA与包板的hIgA反应

带“—□—”线条：对应辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hIgA与包板的BME处理的hIgA反应

带“—▲—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白

图16(F)

带“—●—”线条：对应辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hIgG与包板的hIgG反应

带“—○—”线条：对应辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hIgG与包板的BME处理的hIgG反应

带“—▲—”线条：对应pET-32a(+)融合蛋白。

图17 ：Dot blot法检测hIgA和hIgG经二巯基乙醇(BME)处理前后分别与2个和4个hIgA亲和体融合蛋白的结合反应

BME(-)：hIgA和hIgG未经BME处理

BME(+)：hIgA和hIgG经BME处理

1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128：分别表示hIgA和hIgG的稀释度。

图18：用4个IgA亲和体重复分子从正常人血清中回收hIgA亲和层析洗脱液的SDS-PAGE和Western blot结果

A：亲和层析洗脱液的SDS-PAGE结果

B：正常人血清的SDS-PAGE结果

C：与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hIgA单克隆抗体反应的Western blot结果

D：与HRP标记的抗hIgG单克隆抗体反应的Western blot结果

E：与HRP标记的抗hIgM单克隆抗体反应的Western blot结果

M：蛋白Marker，97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3分别表示14300-97200DaltonsMarker电泳显色条带对应的分子量

1：hIgA；2：hIgG；3：hIgM；E：亲和层析洗脱液；N：正常人血清。

具体实施方式

在本发明中，术语“其保守性变异蛋白”是指具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子(其氨基酸序列如SEQ ID NO：或SEQ ID NO：所示)的蛋白的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-30个，较佳的1-10个，更佳的1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸，例如，在本领域中，用性能相近或相似地氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质地功能，如可以用Val或Leu或Ile取代Ala等，又比如，在C末端和/或N末端添加一个和数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。此外，这些变异形式还包括成熟蛋白与另一个化合物融合所形成的蛋白，附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，比如GST)。此外，变异形式还包括(但不限于)进化免疫球蛋白结合分子及上述蛋白经过修饰后的形式：化学衍生形式如乙酰化或羧基化；糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白，这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟悉技术人员公知的范围。

本发明中，术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适 当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

用重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法或热击法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明所述适合表达具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的条件与表达所用的宿主细胞有关，重组载体转化的宿主细胞获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。上述方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1

应用噬菌体分子进化获得具有分子内亲合力效应的人IgA亲和体重复分子

1、hIgA亲和体SEG1、SEG2片段的基因合成  根据文献[Ronnmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA.(2002)Eur J Biochem 269(11)：2647-2655.]提供的hIgA亲和体的氨基酸序列设计大肠杆菌偏爱密码子序列的hIgA亲和体SEG1和SEG2基因(均含174个核苷酸)，委托上海英骏生物技术有限公司合成。

2、重组pMD-18T克隆载体的构建  将合成的SEG1基因和SEG2基因序列分别克隆于 pMD-18T载体，命名为pMD-18T/SEG1和pMD-18T/SEG2。重组pMD-18T克隆载体的构建流程见图1。挑取pMD-18T/SEG1和pMD-18T/SEG2重组质粒各3个，委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，测序结果用DNASTAR软件分析，结果表明合成的序列与文献[Ronnmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA.(2002)Eur J Biochem 269(11)：2647-2655.]提供的氨基酸序列完全一致(见表1)。

表1  hIgA亲和体SEG1和SEG2的核苷酸(NT)和氨基酸(AA)序列

3、引物合成  设计4条引物用于构建hIgA亲和体随机组合文库，上游引物UB-1K和下游引物DB-1K均引入用于克隆重组的Kpn I酶切位点(GGTACC)。下游引物DB-1K中引入3个氨基酸大小的随机连接肽编码序列(NNS NNS NNS，N＝A/T/C/G，S＝G/C)，另外设计两条引物UB-2和DB-2为保护碱基序列，保护上下游的酶切位点；同时合成用于噬菌粒载体pCANTAB5S中克隆片段的PCR扩增及测序引物pCANTAB5S-1和pCANTAB5S-6。以上引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列见表2。

表2  展示hIgA亲和体随机组合文库的建库和测序引物

注：下划线部分为Kpn I酶切位点；斜体部分为随机连接肽编码序列(N＝A/T/C/G，S＝G/C)

4、噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库的构建

分别以pMD-18T/SEG1和pMD-18T/SEG2为模板，以UB1-K、DB1-K为引物，PCR扩增含Kpn I酶切位点和3个氨基酸随机连接肽编码序列的hIgA亲和体SEG1和SEG2片段。PCR反应体积50μl，其中含质粒模板1μl，上下游引物各0.5μl，dNTP 100μmol/L，Mg²⁺3mmol/L，Taq酶1U；扩增条件为94℃，40s；60℃，40s；72℃，40s；30个循环，72℃延伸5min结束反应。取PCR反应产物1μl为模板，再以上下游保护引物UB-2和DB-2进行第二轮PCR，条件同上，经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。用胶回收试剂盒3S DNAGel Purification Kit 3.1分别回收hIgA亲和体SEG1与SEG2的PCR产物后，用5U Kpn I酶切回收产物(反应体积80μl)，37℃酶切过夜，用3S DNA Ge1Purification Kit回收纯化酶切片段。SEG1和SEG2 DNA片段用T4连接酶于16℃连接2h后，再与Kpn I酶切的pCANTAB5S噬菌粒载体连接后转化大肠杆菌Top10F′用于提取重组噬菌粒。之后该重组噬菌粒转化大肠杆菌TG1并铺LB平板[含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml]。转化菌落接种至10ml 2×YT培养基[含Amp 100μg/ml]于37℃振荡培养至A₆₀₀约0.5时，加入1×10¹⁰TU(Transformation unit)的辅助噬菌体M13KO7，37℃培养1h后于1000g离心10min，沉淀重悬于50ml 2×YT培养基[含Amp 100μg/ml和卡那霉素(Kana)15μg/ml)于37℃振荡培养过夜。扩增的噬菌体颗粒用PEG 8000/NaCl沉淀纯化后，重悬于10ml 2×YT中，经0.22μm无菌滤膜过滤，即获得展示hIgA亲和体随机组合文库的重组噬菌体。噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库的构建流程见图2。

5、噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库的亲和筛选

将hIgA抗体以每孔200ng于37℃包被ELISA板条3h，加磷酸盐缓冲液(PBS)配制的封闭液(含10％脱脂奶粉、0.1％Tween-20，0.2％柳硫汞)室温封闭1h，用PBS洗涤3次后，加入噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库(1×10¹²TU)，37℃放置2h，用PBST(含0.25％Tris，0.05％Tween-20)洗涤40次。每孔加入100μl对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1h，收集菌液，取10μl测定滴度，其余菌液接种至50ml 2×YT培养基(含Amp 100μg/ml)，于37℃振荡培养1h后加入辅助噬菌体M13KO7(1×10¹⁰TU)，继续培养1h后加入Kana至15μg/ml，37℃振荡培养过夜。次日噬菌体沉淀和收集的方法同上，共进行4轮重复筛选。

6、PCR检测筛选后各代噬菌体文库插入片段的分布情况

随机挑取每轮筛选后噬菌体文库感染TG1宿主菌生成的单克隆菌落24个，分别接种至0.5ml 2×YT培养基(含Amp 100μg/ml)，于37℃、250rpm培养5h，以2μl培养菌液为模板，以噬菌粒载体pCANTAB5S克隆位点上下游的两段序列pCANTAB5S-1和pCANTAB5S-6为上、下游引物，进行PCR扩增。PCR反应体积50μl，其中含上下游引物各0.5μl，dNTP 100μmol/L，Mg⁺⁺3mmol/L，Taq酶1U；扩增条件为94℃，40s；60℃，40s；72℃，40s；30个循环，72℃延伸5min结束反应。以pCANTAB5S质粒作为阴性对照。经1.2％琼脂糖凝胶电泳判断PCR产物，分析比较各轮筛选文库中插入片段的分布情况。结果可见噬菌体文库展示插入片段的大小随着筛选轮次的增加发生明显的变化(见图3)。图3中显示的是PCR法检测hIgA筛选噬菌体文库后每轮单克隆噬菌体插入片段的大小，其中I、II、III、IV分别代表1-4轮筛选的不同轮次；第1-24为筛选的每一轮次中随机挑取的单克隆噬菌体；M表示DL2000Marker；C表示阴性对照(pCANTAB5S质粒)。

在第1轮和2轮筛选文库中，展示1-2个结构域的单克隆比例＞80％，而经第3轮和第4轮筛选后，文库中展示1-2个结构域的单克隆比例逐渐减少并消失，而展示3-4个结构域的单克隆分子占优势，其中展示4个结构域的克隆显著增加，至第4轮筛选后，其比例接近90％(见图4)，显示筛选过程的有效性。图4为经hIgA筛选后各代噬菌体文库中的20个单克隆噬菌体插入片段的组成比例变化，其中，横坐标表示原始噬菌体文库0以及经hIgA1-4轮筛选后子代文库；纵坐标表示含不同插入片段的噬菌体克隆的百分比例。

图4中， 表示不含和含1个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例； 

代表含2个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例； 

代表含3个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例； 

代表含4个hIgA亲和体的噬菌体克隆比例。

7、ELISA检测筛选后噬菌体克隆与hIgA、hIgG及hIgM的结合反应

分别取经PCR检测后含1-4个hIgA亲和体的噬菌体克隆各20个，分别用TBS缓冲液(含50m mol/L Tris-HCl，pH 7.5，150m mol/LNaCl)稀释至10¹²TU/ml后，各取100μl分别加至hIgA抗体(200ng/孔)包被的ELISA板条中，37℃反应2h，加封闭液(含10％脱脂奶粉)室温封闭1h，PBST洗涤3次，加入HRP标记的鼠抗噬菌体抗体(1∶5000)，经邻苯二胺(OPD)显色后用酶标仪(Bio Rad)读取A₄₉₀值。同法平行检测该噬菌体克隆与hIgG、hIgM结合活性。以未经筛选的原始噬菌体文库(Ori-PL)作为阴性对照。结果如图5所示，图5为ELISA方法检测含1-4个hIgA亲和体的噬菌体分别与hIgA和hIgG的结合活性图，其中，横坐标：筛选的噬菌体克隆与hIgA 

hIgG 

和hIgM(□)的结合反应；纵坐标表示A490，即波长490nm的光吸收值，ori-PL表示原始噬菌体展示文库。

由图5中展示的结果可见：含1-4个hIgA亲和体的噬菌体克隆均可与hIgA结合，且含3个和4个hIgA亲和体重复体的噬菌体克隆与hIgA有着非常明显的结合优势；含1个hIgA亲和体的噬菌体克隆与hIgG没有明显结合作用，而展示2-4个hIgA亲和体重复体的噬菌体克隆与hIgG抗体有弱结合反应；含1-4个hIgA亲和体的噬菌体克隆均未检测出与hIgM结合(结果未显示)。

8、测序分析每轮亲和筛选后噬菌体克隆插入片段的序列组成

分别随机挑取含1-4个hIgA亲和体的阳性单克隆噬菌体各20个，委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，测序引物为pCANTAB5S-1和pCANTAB5S-6(见表2)，测序结果用DNASTAR软件分析。结果可见，含1个hIgA亲和体SEG1或SEG2噬菌体克隆中，展示SEG1的噬菌体克隆占明显优势；含2个hIgA亲和体重复体有2种构成形式：SEG2-SEG2和SEG1-SEG2，且这2种构成形式的随机连接肽序列不同，其中展示SEG1-SEG2的噬菌体克隆占明显优势；含3个hIgA亲和体重复体为SEG1-SEG1-SEG1形式，其随机连接肽序列有两种不同形式，其中展示SEG1-_VKD-SEG1-_MKT-SEG1-_ADA的组合分子呈筛选优势；含4个hIgA亲和体重复体的克隆只展示一种组合分子形式，即SEG2-SEG1-SEG2-SEG1，其随机连接肽序列完全一致(表3)，说明对该噬菌体组合文库的筛选，SEG1、SEG2亲和体的组成形式和随机连接肽序列都受到了严格的筛选。

表3.筛选后阳性噬菌体展示hIgA亲和体SEG1和SEG2分子组成形式

hIgA亲和体  重复体数量

阳性噬菌体展示  插入片段的组成形式

展示不同片段的  噬菌体克隆数

每轮筛选后展示不同片段的  噬菌体克隆发布情况

下划线及斜体部分表示随机连接肽序列。SEG1和SEG2表示hIgA亲和体。*：1-4轮筛选轮数。氨基酸单字母缩写：A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，颉氨酸；Y，酪氨酸。

9、原核表达载体pET32a(+)-SEG1/2的构建流程见图6

9.1引物合  成用于PCR扩增筛选获得的1-4个hIgA亲和体分子的cDNA序列的引物为：

上游引物5SNco-u：5′-TATCCATGGCTGCGGCCCAGCCGGCCTCT-3’，下游引物

5S-6：5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’。上游引物中引入了Nco I酶切位点(下划线部分)，引物DNA序列由上海生工生物技术服务有限公司合成。

9.2 hIgA亲和体表达序列的PCR扩增  以含阳性噬菌粒的菌株为模板，用合成的上、下游引物进行扩增，PCR反应体积为50μl，其中含上下游引物各0.5μl，dNTP 100μmol/L，Mg⁺⁺3mmol/L，Taq酶1U。反应条件：94℃30s；60℃30s；72℃45s；35个循环，72℃延伸5min结束反应。PCR扩增的hIgA亲和体cDNA片段在Kpn I位点后有(G4S)3接头(为pCANTAB5S载体上固有的)。胶回收纯化后用用Nco I和BamH I双酶切去(G₄S)₃接头，1.2％琼脂糖电泳检测，得到1-4个hIgA亲和体表达序列分别约183bp、366bp、549bp、732bp(见图7)。图7为hIgA亲和体表达序列的酶切回收片段的琼脂糖电泳图，其中M为DL2000Marker，1-4分别代表1-4个hIgA亲和体DNA序列。

9.3 hIgA亲和体重组表达质粒的构建和鉴定  原核表达载体pET32a(+)购自Novagen公司，pET-32a(+)用Nco I和BamH I双酶切，试剂盒回收酶切产物。上述PCR纯化产物用Nco I和BamH I双酶切，试剂盒回收后取400ng与400ng PET-32a(+)载体Nco I和BamH I酶切产物连接。转化后挑选重组子用Nco I和BamH I酶切鉴定，1％琼脂糖电泳检测显示符合理论预期(见图8)。图8中，hIgA亲和体重组表达质粒的酶切鉴定电 泳图，1为SEG1/pET32a(+)质粒；2为SEG1/pET32a(+)质粒/Nco I+BamH I；3为SEG1-SEG2/pET32a(+)质粒；4为SEG1-SEG2/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；5为SEG1-SEG1-SEG1/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；6为SEG1-SEG1-SEG1/pET32a(+)质粒；7为SEG2-SEG1-SEG2-SEG1/pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；8为SEG2-SEG1-SEG2-SEG1/pET32a(+)质粒；9为pET32a(+)质粒/Nco I+BamHI；M为M：DL2000 Marker。

9.4 hIgA亲和体重组表达质粒的序列分析  提取4种hIgA亲和体重组表达质粒，委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，上游测序引物B-S-U：5′-GGATCCGAGCTCAGGCCTGTCGACGGTACCGTT-3’；下游测序引物S-H-D：5′-GAGCTCAAGCTTACCAGATCCACCACCGCCGGTACC-3’。序列分析结果证实pET-32a(+)在Nco I和BamH I克隆位点间的插入序列与4种hIgA亲和体代表分子的序列完全相符，读框完全正确，起始子和终止子已加上，插入片段的上下游序列与pET32a(+)载体序列完全一致。

9.5 hIgA亲和体融合蛋白的表达

9.5.1重组表达载体pET-32a(+)-SEG1/2的转化  氯化钙法制备大肠杆菌BL21感受态细胞(E.coli BL21-TRXB(DE3)购自Novagen公司)，取pET-32a(+)-SEG1/2200ng加入感受态BL21-TRXB 100μl，冰水浴30min，42℃90s，冰水浴1-2min后加900μl的SOC培养基37℃150rpm培养1h后涂LB平板(含Amp 100ng/ml和Kana 35ng/ml)，37℃培养过夜。

9.5.2 hIgA亲和体的诱导表达和SDS-PAGE样品的制备  从pET-32a(+)-SEG1/2/BL21转化平板上挑取4个单克隆菌落接种至0.5mlLB(含Amp100ng/ml)中摇床培养3.5h后，取出100μl接至700μl LB(Amp)离心管中培养4h后加200μl甘油制备甘油菌种；余菌液加IPTG至终浓度1mM诱导培养3.5h后取300μl菌液10000rpm离心1分钟，弃上清，加2×SDS点样液25μl及0.01PBS25μl，混匀，制成SDS样品。收集空菌BL21培养液同样比例制成SDS样品。

9.5.3 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达  制备12％SDS聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品及低分子量标准蛋白沸水浴5分钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝进入分离胶后提高至12V/cm，直至溴酚蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脱色3-4小时。结果见图9，图9为hIgA亲和体融合蛋白小量表达的SDS-PAGE结果，其中，1代表1：代表含1个hIgA亲和体 的融合蛋白，2和3均代表含2个hIgA亲和体的融合蛋白，4和5均代表含3个hIgA亲和体的融合蛋白，6和7均代表含4个hIgA亲和体的融合蛋白。由图9中可以看出含1-4个hIgA亲和体的克隆分别在25KD、31KD、38KD和44.5KD左右均有目的蛋白条带，空BL21均未见该条带。

9.6 hIgA亲和体融合蛋白的大量表达及纯化

9.6.1表达  将pET-32a(+)-SEG1/2/BL21甘油菌种500μl接至50ml LB(含Amp)培养过夜，再转至500ml LB中3.5h 37℃摇床培养3.5h后加1mol/l的IPTG 500μl诱导培养3.5h，取出分装250ml离心管中6000rpm 4℃离心10分钟，去上清，加入20ml的0.1mol/l的PBS重悬于50ml离心管中，11000rpm 4℃离心20分钟，去上清，沉淀加入20ml的8mol/l的尿素重悬，4℃过夜。

9.6.2纯化  过夜尿素裂解液11000rpm 4℃离心20分钟，取上清过Ni-NTA柱(金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)购自德国QIAGEN公司)，Ni-NTA柱以8M尿素(pH8.0)平衡，尿素裂解液上清上柱，8M尿素(pH7.0)洗柱，以8M尿素(pH4.5)洗脱，收集洗脱峰，0.1M Tris中和，以PBS透析，SDS-PAGE分析纯化效果，可见在25KD、31KD、38KD和44.5KD左右均有清晰的目的蛋白条带(见图10)。图10为纯化的4种hIgA亲和体融合蛋白的SDS-PAGE结果，其中1-4分别代表含1-4个hIgA亲和体的融合蛋白。

10、ELISA法检测hIgA亲和体融合蛋白与各类抗体及抗体片断的结合活性

10.1与人多克隆IgA的结合：

10.1.1人多克隆IgA购自Sigma公司。

10.1.2 1mg/ml人多克隆IgA以PBS(pH7.2)透析。取50μl 3mg/ml长臂活化生物素(购自PIERCE公司)加入1ml hIgA(1mg/ml)，在室温中轻微振荡4h后加入透析袋在PBS中4℃透析过夜，透析完后加等量甘油于-20℃中保存。

10.1.3将10μg纯化的4种hIgA亲和体融合蛋白分别以碳酸盐缓冲液(pH9.6)1∶200稀释包被96孔板，每种蛋白均包被3排复孔，4℃24h后PBST洗4-5次，封闭液(2％BSA0.05％TWEEN-20)封闭37℃1h后洗板，加入1∶2倍比稀释的生物素标记的hIgA抗体(初始浓度为2μg/ml)，最后一孔不加，37℃45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物(购自PIERCE公司)，37℃15min，37℃孵育15min，PBST洗涤4次，经OPD显色，2M硫酸终止，酶标仪(Bio Rad)读取A490值；计算均值，Excel绘制结合曲线。结果可见所有4种hIgA亲和体融合蛋白均与hIgA结合，其中3个和4 个IgA亲和体重复分子与hIgA的结合有更为显著的结合优势(见图11(1))。图11(A)为ELISA检测4种人IgA亲和体融合蛋白分别与hIgA(A)、hIgG(B)、hIgG1-Fc(C)和hIgM(D)的结合活性，图11(A)的横坐标为生物素标记的hIgA稀释度(1)、生物素标记的hIgG稀释度(2)、生物素标记的hIgG1-Fc稀释度(3)、生物素标记的hIgM稀释度(4)，纵坐标为A490，即波长490nm的光吸收值；带“—■—”线条对应4个hIgA亲和体融合蛋白；带“—▲—”线条对应3个hIgA亲和体融合蛋白；带“—○—”线条对应2个hIgA亲和体融合蛋白；带“—×—”线条对应1个hIgA亲和体融合蛋白；带“—◆—”线条对应pET-32a(+)融合蛋白。

10.2与人多克隆IgG的结合：

10.2.1人多克隆IgG购自Sigma公司，生物素标记同10.1.2。

10.2.2ELISA方法同10.1.3。结果可见2-4个hIgA亲和体重复分子与hIgG有弱结合反应(见图11(2))。

10.3与人多克隆IgG1-Fc的结合：以生物素标记的IgG1-Fc进行与4种hIgA亲和体融合蛋白的结合，方法同10.1.3。结果可见2-4个hIgA亲和体重复分子与IgG1-Fc有弱结合反应(见图11(3))。

10.4与人多克隆IgM的结合：

10.4.1人多克隆IgM购自Sigma公司，生物素标记同10.1.2。

10.4.2ELISA方法同10.1.3。结果可见4种hIgA亲和体融合蛋白均不与hIgM结合(见图11(4))。

11、Western blot检测hIgA亲和体融合蛋白与各类抗体及抗体片断的结合活性

11.1与hIgA的结合活性

11.1.1将4种hIgA亲和体融合蛋白(各5μg)经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，分别以pET-32a(+)表达蛋白和SPA作为阴性对照和阳性对照。

11.1.2电泳结束，取出一块置于考马斯亮蓝染液中染色，另一块适当修剪，浸泡于转移缓冲液中准备转膜。

11.1.3剪12张与凝胶大小一致的滤纸与一张硝酸纤维素膜，带手套操作，将滤纸与硝酸纤维素膜用转膜缓冲液浸泡15分钟。

11.1.4将6张滤纸整齐叠放，凝胶置于其上(靠近负极)，将硝酸纤维素膜(靠近正极)置于凝胶上，再叠放6张滤纸。

11.1.5蛋白转移：300mA稳流转膜50min。

11.1.6转膜结束后加适量封闭液(含0.01mol/L PBS、10％脱脂奶粉、0.1％Tween-20、0.2％柳硫汞)于4℃封闭过夜。

11.1.7用PBS洗液漂洗去除封闭液，加入生物素标记hIgA抗体(封闭液1∶3000稀释)37℃孵育2h。

11.1.8用PBS洗液漂洗硝酸纤维素膜6遍，加入辣根过氧化酶标记的链亲和素(ABC稀释液1∶500稀释)，37℃孵育30min，用PBS洗液漂洗硝酸纤维素膜6次，加入底物DAB显色5-10分钟，出现棕色条带后立即用蒸馏水冲洗，终止显色反应。结果可见所有4种hIgA亲和体融合蛋白均与hIgA结合，其中3个和4个IgA亲和体重复分子与hIgA的结合有更为显著的结合优势；阴性对照未见反应条带(见图12(A))。图12(A)为Western blot法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgA的结合反应的结果图，且其中1表示pET-32a(+)融合蛋白，2表示1个hIgA亲和体融合蛋白，3表示2个hIgA亲和体融合蛋白，4表示3个hIgA亲和体融合蛋白，5表示4个hIgA亲和体融合蛋白，6表示金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。

11.2与hIgG的结合活性

检测方法同11.1。结果可见2-4个hIgA亲和体重复分子与hIgG有弱结合反应(见图12(B))。图12(B)为Western blot法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgG的结合反应的结果图，且其中1表示pET-32a(+)融合蛋白，2表示1个hIgA亲和体融合蛋白，3表示2个hIgA亲和体融合蛋白，4表示3个hIgA亲和体融合蛋白，5表示4个hIgA亲和体融合蛋白，6表示金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。

11.3与hIgG1-Fc的结合活性

检测方法同11.1。结果可见2-4个hIgA亲和体重复分子与hIgG1-Fc有弱结合反应，其中2个hIgA亲和体重复分子与hIgG1-Fc的结合反应略强于与hIgG的结合(图12(C))。图12(C)为Western blot法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgG1-Fc的结合反应的结果图，且其中1表示pET-32a(+)融合蛋白，2表示1个hIgA亲和体融合蛋白，3表示2个hIgA亲和体融合蛋白，4表示3个hIgA亲和体融合蛋白，5表示4个hIgA亲和体融合蛋白，6表示金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。

11.4与hIgM的结合活性

检测方法同11.1。结果可见4种hIgA亲和体融合蛋白不与hIgM结合(见图12(D))。图12(D)为Western blot法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgM的结合反应的结果图，且其中1表示pET-32a(+)融合蛋白，2表示1个hIgA亲和体融合蛋 白，3表示2个hIgA亲和体融合蛋白，4表示3个hIgA亲和体融合蛋白，5表示4个hIgA亲和体融合蛋白，6表示金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。

12、SPR法检测hIgA亲和体融合蛋白与各类抗体的结合活性

12.1与hIgA的结合活性

12.1.1人多克隆hIgA(浓度为1mg/ml)，用10mM的醋酸钠(pH值分别为5.0、4.5、5.0)以1∶5稀释，以氨基共价耦连固相化到CM-5传感芯片。

12.1.21-4个hIgA亲和体分别以初始浓度0.023mg/ml、0.02lmg/ml、0.025mg/ml、0.024mg/ml开始，用HEPES缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％surfactant P20)作为稀释液，以1∶2倍比稀释。以40μl/min的流速对各个稀释度样品分别进行检测。芯片用100mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.5)进行再生。数据以BiacoreT100评价软件进行分析。结果可见所有4种hIgA亲和体融合蛋白均与hIgA结合，其中3个和4个IgA亲和体重复分子与hIgA的结合有更为显著的结合优势(见图13(A))。图13(A)为表面等离子共振(SPR)法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgA分子的结合反应结果图，其中，横坐标为作用时间(秒)，纵坐标为共振单位(RU)，且SEG1，SEG2分别代表2种hIgA亲和体，图中6条曲线代表6个稀释度，由上至下按1∶2倍比依次稀释。

12.2与hIgG的结合活性

检测方法同12.1；1-4个hIgA亲和体分别以初始浓度0.231mg/ml、0.212mg/ml、0.251mg/ml、0.243mg/ml开始，用HEPES缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％surfactant P20)作为稀释液，以1∶2倍比稀释。结果可见2-4个hIgA亲和体重复分子与hIgG有弱结合反应，未检测出1个hIgA亲和体与hIgG的结合作用(见图13(B))。图13(B)为表面等离子共振(SPR)法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgG分子的结合反应结果图，其中，横坐标为作用时间(秒)，纵坐标为共振单位(RU)，且SEG1，SEG2分别代表2种hIgA亲和体，图中6条曲线代表6个稀释度，由上至下按1∶2倍比依次稀释。

12.3与hIgM的结合活性

检测方法同12.1；1-4个hIgA亲和体分别以初始浓度0.231mg/ml、0.212mg/ml、0.251mg/ml、0.243mg/ml开始，用HEPES缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％surfactant P20)作为稀释液，以1∶2倍比稀释。结果可见4种hIgA亲和体融合蛋白不与hIgM结合(见图13(C))。图13(C)为表面等离子共振(SPR) 法检测4种hIgA亲和体融合蛋白分别与hIgM分子的结合反应结果图，其中，横坐标为作用时间(秒)，纵坐标为共振单位(RU)，且SEG1，SEG2分别代表2种hIgA亲和体，图中6条曲线代表6个稀释度，由上至下按1∶2倍比依次稀释。

13、竞争ELISA检测hIgA亲和体融合蛋白与不同抗体的结合活性

13.1 hIgA亲和体结合hIgA的竞争抑制ELISA试验

13.1.1人多克隆IgA购自Sigma公司，生物素标记同10.1.2。

13.1.2将10μg纯化的4种hIgA亲和体融合蛋白分别以碳酸盐缓冲液(pH9.6)1∶200稀释包被96孔板，每种蛋白均包被3排复孔，另包一排用于不加竞争蛋白组，4℃24h后PBST洗4-5次，封闭液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封闭37℃Ih后洗板，同时加入0.1μM生物素标记的hIgA(b-hIgA)和倍比稀释的4种竞争蛋白(SEG1、SEG1-SEG2、SEG1-SEG1-SEG1、SEG2-SEG1-SEG2-SEG1)(初始浓度均为1μM)，以同时加入b-hIgA和pET-32a(+)表达蛋白作为阴性对照，37℃45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物，37℃15min，洗板后TMB显色，2M硫酸终止，酶标仪读取A450值。计算各复孔的A450均值，Excel绘制竞争抑制曲线，抑制百分数＝(A-Ax)100/A(单位％，A代表不加抑制蛋白组的吸光度均值，Ax表示在各种抑制浓度下的三个复孔的A450均值)。图14为1-4个hIgA亲和体融合蛋白(A，B，C，D)结合生物素标记的hIgA(b-hIgA)的竞争抑制以及2-4个hIgA亲和体融合蛋白(E，F，G)结合生物素标记的hIgG(b-hIgG)的竞争抑制，其中，横坐标为log(inhibitor)(nM)，即抑制因子浓度对数值；纵坐标为Percent of inhibition，即抑制百分数。结果可见1-2个hIgA亲和体抑制hIgA与3-4个hIgA亲和体重复体结合的作用很低，远低于3-4个hIgA亲和体重复体对此的抑制作用(见图14(A-B))，而4种hIgA亲和体融合蛋白均能有效抑制hIgA和1-2个hIgA亲和体的结合(见图14(C-D))，说明3-4个hIgA亲和体重复体与hIgA有明显的结合优势。

13.2 hIgA亲和体结合hIgG的竞争抑制ELISA试验

13.2.1人多克隆IgG购自Sigma公司，生物素标记同10.1.2。

13.2.2试验方法同13.1.2，同时加入生物素标记的hIgG和倍比稀释的4种竞争蛋白或pET-32a(+)表达蛋白进行检测。结果可见除1个hIgA亲和体外，2-4个hIgA亲和体重复体均能分别有效抑制其自身与hIgG的结合(见图14(E-G))。

14、新型hIgA亲和体重复体的分子内结合模式的证实

14.1 ELISA检测hIgA和hIgG经二巯基乙醇(BME)处理前后与hIgA亲和体重复体的结 合反应

14.1.1 ELISA检测hIgA经BME处理前后与hIgA亲和体重复体的结合反应

14.1.1.1多克隆hIgA购自Sigma公司。

14.1.1.2分别取10μg多克隆hIgA加50mM二巯基乙醇(BME)，于室温反应2h后，分别经变性的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和非变性的SDS-PAGE电泳，以不加BME处理的hIgA作为对照。电泳结束，凝胶置于考马斯亮蓝染液中染色。如图15(A)的变性条件下hIgA和hIgG经BME处理前后的SDS-PAGE结果示意图中所示，经变性的SDS-PAGE电泳，hIgA加或不加BME处理均解离为轻链和重链2个片段(其余条带为多聚体或非特异性条带)。如图15(B)的非变性条件下hIgA和hIgG经BME处理前后的SDS-PAGE结果示意图中所示，经非变性的SDS-PAGE电泳时，只有加BME处理的hIgA解离为轻链和重链2个片段(其余条带为多聚体或非特异性条带)，未加BME处理的hIgA因分子量过大未游离出加样孔，故未显示出电泳条带，说明hIgA经BME处理后可完全解离为单链。

14.1.1.3将BME(50mM)处理前后的hIgA各10μg分别以碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被96孔板，每种抗体包被3排复孔，另包一排pET-32a(+)表达蛋白作为阴性对照，4℃24h后PBST洗4-5次，封闭液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封闭37℃1h后洗板，分别加入1∶2倍比稀释的生物素标记的2个或4个hIgA亲和体重复体(初始1∶200稀释)(生物素标记方法同10.1.2)，37℃45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物(购自PIERCE公司)；阳性对照孔加1∶2倍比稀释的HRP标记的抗hIgA(初始1∶200稀释)，37℃孵育15min，PBST洗涤4次，经TMB显色，2M硫酸终止，酶标仪(Bio Rad)读取A450值；计算均值，Excel绘制结合曲线。结果可见，hIgA经BME还原处理前后，4个hIgA亲和体重复体与其结合作用显著下降(见图16(A))，而2个hIgA亲和体重复体与其的结合并无明显变化(见图16(B))，抗hIgA与还原前后的hIgA的结合作用也无明显变化(见图16(E))，提示4个hIgA亲和体重复体与hIgA的结合存在分子内的亲合力效应。

14.1.1.4将2个和4个hIgA亲和体重复体各5μg分别以碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被96孔板，每种抗体包被3排复孔，另包一排pET-32a(+)表达蛋白作为阴性对照，4℃24h后PBST洗4-5次，封闭液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封闭37℃1h后洗板，分别加入BME(50mM)处理前后的生物素标记的hIgA(1∶2倍比稀释，初始1∶200 稀释)(生物素标记方法同10.1.2)，37℃45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物(购自PIERCE公司)，37℃孵育15min，PBST洗涤4次，经TMB显色，2M硫酸终止，酶标仪(Bio Rad)读取A450值；计算均值，Excel绘制结合曲线。结果可见，4个hIgA亲和体重复体与还原后hIgA的结合作用显著下降，而2个hIgA亲和体重复体与还原前后hIgA的结合作用并无明显变化(见图16(C))，提示4个hIgA亲和体重复体与hIgA的结合存在分子内的亲合力效应。

14.1.2 ELISA检测hIgG经BME处理前后与hIgA亲和体重复体的结合反应

14.1.2.1多克隆hIgG购自Sigma公司。

14.1.2.2多克隆hIgG经BME处理方法及经SDS-PAGE电泳同14.1.1.2。结果可见经变性的SDS-PAGE电泳，hIgG加或不加BME处理均解离为轻链和重链2个片段(见图15(A))；而经非变性的SDS-PAGE电泳时，只有加BME处理的hIgG解离为轻链和重链2个片段，未加BME处理的hIgG因分子量过大未游离出加样孔，故未显示出电泳条带(见图15(B))，说明hIgG经BME处理后可完全解离为单链。

14.1.2.3ELISA检测hIgG经BME处理前后与2个和4个hIgA亲和体重复体的结合反应方法同14.1.1.3和14.1.1.4。结果可见，当抗体包被时，hIgG经BME还原处理后，2个和4个hIgA亲和体重复体与hIgA的结合作用均显著下降(见图16(A和B))；而当hIgA亲和体重复体包被时，经BME处理前后的hIgG与2个或4个hIgA亲和体重复体的结合作用并无明显变化(见图16(D))；抗hIgG与还原前后的hIgG的结合作用也无明显变化(见图16(F))，提示2个和4个hIgA亲和体重复体与hIgG的结合既存在分子间的亲和力，也存在分子内的亲合力效应。

14.2 Dot blot检测hIgA和hIgG经二巯基乙醇(BME)处理前后与hIgA亲和体重复体的结合反应

14.2.1 D ot blot检测hIgA经BME处理前后与hIgA亲和体重复体的结合反应

14.2.1.1多克隆hIgA购自Sigma公司。

14.2.1.2多克隆h IgA经BME处理方法同14.1.1.2。hIgA亲和体重复体的生物素标记同10.1.2。

14.2.1.3将BME(50mM)处理前后的hIgA各3μg分别用PBS以1∶2倍比稀释(初始1∶4稀释)依次点样于硝酸纤维素膜(Millipore公司产品)上，共点样3张膜，晾干后加适量封闭液(含0.01mol/L PBS、10％脱脂奶粉、0.1％Tween-20、0.2％柳硫汞)室 温封闭2h，用PBS洗液漂洗去除封闭液，其中2张膜分别加入1∶50生物素标记的2个或4个hIgA亲和体重复体2ml，另1张膜加入辣根过氧化酶(HRP)标记的抗hIgA作为阳性对照，37℃反应2h，用PBS洗液漂洗硝酸纤维素膜6遍，前2张膜加入HRP标记的链亲和素(ABC稀释液1∶500稀释)，37℃孵育30min，随后3张膜均用PBS洗液漂洗硝酸纤维素膜6次，加入底物DAB显色5-10分钟，出现棕色斑点后立即用蒸馏水冲洗，终止显色反应。结果可见，hIgA经BME还原处理前后，2个hIgA亲和体重复体与其的结合并无明显变化(见图17(1))，而4个hIgA亲和体重复体与其结合作用显著下降(见图17(2))，抗hIgA与还原前后的hIgA的结合作用也无明显变化(见图17(5))，提示4个hIgA亲和体重复体可同时与hIgA的两条链结合而产生分子内的亲合力效应。

14.2.2D ot blot检测hIgG经BME处理前后与hIgA亲和体重复体的结合反应

14.2.2.1多克隆hIgG购自Sigma公司。

14.2.2.2多克隆h IgG经BME处理方法同14.1.1.2。hIgA亲和体重复体的生物素标记同10.1.2。

14.2.2.3Dot blot检测hIgG经BME处理前后与2个和4个hIgA亲和体重复体结合反应方法同14.2.1.3。结果可见，hIgG经BME处理后，2个或4个hIgA亲和体重复体与其结合作用下降，但下降作用并不十分显著(见图17(3)，(4))；抗hIgG与还原前后的hIgG的结合作用无明显变化(见图17(6))，提示2个和4个hIgA亲和体重复体与hIgG的结合既存在分子间的亲和力，也存在分子内的亲合力效应。

15、从正常人血清中回收hIgA及其鉴定

15.1亲和层析法从正常人血清中回收hIgA

15.1.1 Sepharose-4B层析柱购自Amersham Pharmacia Biotech公司。

15.1.2将5mg 4个hIgA亲和体重复体融合蛋白偶联吸附于层析柱，具体步骤按试剂手册操作进行。

15.1.3将5ml正常人血清于室温过4个hIgA亲和体重复体融合蛋白偶联的Sepharose-4B层析柱，依次用10ml 0.01M磷酸盐溶液(pH 7.5)和2ml 5mM醋酸氨溶液(pH5.5)液涤弃除非结合蛋白。

15.1.4换用50mM醋酸(pH 3.0)洗脱，收集洗脱液。

15.2 SDS-PAGE电泳检测亲和层析洗脱液目的片段  制备12％SDS聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品及低分子量标准蛋白沸水浴5分钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝进入 分离胶后提高至12V/cm，直至溴酚蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脱色3-4小时。结果可见洗脱液(E)中回收到预期的hIgA，同时也回收到少量hIgG和hIgM，提示4个hIgA亲和体重复体融合蛋白具有与hIgG和hIgM结合的残存活性(见图18-A)。

15.3 Western blot检测亲和层析洗脱液与各类抗Ig的结合活性

15.3.1与抗hIgA的结合活性

15.3.1.1将正常人血清和上述亲和层析洗脱液各10μl经SDS-PAGE电泳，电泳结束，取出凝胶适当修剪，浸泡于转移缓冲液中准备转膜。

15.3.1.2剪12张与凝胶大小一致的滤纸与一张硝酸纤维素膜，带手套操作，将滤纸与硝酸纤维素膜用转膜缓冲液浸泡15分钟。

15.3.1.3将6张滤纸整齐叠放，凝胶置于其上(靠近负极)，将硝酸纤维素膜(靠近正极)置于凝胶上，再叠放6张滤纸。

15.3.1.4蛋白转移：300mA稳流转膜50min。

15.3.1.5转膜结束后加适量封闭液(含0.01mol/L PBS、10％脱脂奶粉、0.1％Tween-20、0.2％柳硫汞)于4℃封闭过夜。

15.3.1.6用PBS洗液漂洗去除封闭液，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的抗hIgA单克隆抗体(封闭液1∶3000稀释)，37℃孵育2h。

15.3.1.7用PBS洗液漂洗硝酸纤维素膜6次，加入底物DAB显色5-10分钟，出现棕色条带后立即用蒸馏水冲洗，终止显色反应。结果可见洗脱液中含有与抗hIgA单克隆抗体特异结合的hIgA分子(见图18-C)。

15.3.2与抗hIgG的结合活性

检测方法同15.3.1。结果可见洗脱液中含有与抗hIgG单克隆抗体特异结合的hIgG分子，可能是由于4个hIgA亲和体重复体融合蛋白可通过其分子内亲合力效应保留了与hIgG结合的残留活性(见图18-D)。

15.3.3与抗hIgM的结合活性

检测方法同15.3.1。结果可见洗脱液中含有与抗hIgM单克隆抗体特异结合的hIgM分子，可能是由于偶联在亲和层析柱上的4个hIgA亲和体重复分子通过与血清中hIgM五聚体的VH3结合而将少量hIgM吸附回收(见图18-E)。

                           序列表 

<110>中国人民解放军第二军医大学 

<120>具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子 

<130>091834 

<160>14 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>58 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>1 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 

    50                  55 

<210>2 

<211>58 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>2 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ala Ser Arg Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Glu Leu Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                 25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 

    50                  55 

<210>3 

<211>61 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>3 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Arg Ala Ile 

    50                  55                  60 

<210>4 

<211>61 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>4 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ala Se rArg Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Glu Leu Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                 45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Arg Phe Tyr 

    50                  55                 60 

<210>5 

<211>122 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>5 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ala Ser Arg Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Glu Leu Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Asn Pro Ser Val Asp Asn 

    50                  55                  60 

Lys Phe Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ala Ser Arg Glu Ile Arg Glu Leu 

65                  70                  75                  80 

Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu 

                85                  90                  95 

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 

            100                 105                 110 

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Thr Cys Gln 

        115                 120 

<210>6 

<211>122 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>6 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gln Ile Thr Val Asp Asn 

    50                  55                  60 

Lys Phe Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ala Ser Arg Glu Ile Arg Glu Leu 

65                  70                  75                  80 

Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu 

                85                  90                  95 

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 

            100                 105                 110 

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ile Cys Met 

        115                 120 

<210>7 

<211>183 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>7 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Arg Ser His Val Asp Asn 

    50                  55                  60 

Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Leu Leu 

65                  70                  75                  80 

Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu 

                85                  90                  95 

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 

            100                 105                 110 

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Gly Arg Val Asp Asn Lys Phe Asn 

        115                 120                 125 

Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Leu Leu Pro Asn Leu 

    130                 135                 140 

Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu Asp Asp Pro 

145                 150                 155                 160 

Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 

               165                 170                 175 

Gln Ala Pro Lys Thr Gly His 

            180 

<210>8 

<211>183 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>8 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Lys Asp Val Asp Asn 

    50                  55                  60 

Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Leu Leu 

65                  70                  75                  80 

Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu 

                85                  90                  95 

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 

            100                 105                 110 

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Met Lys Thr Val Asp Asn Lys Phe Asn 

        115                 120                 125 

Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Leu Leu Pro Asn Leu 

    130                 135                 140 

Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu Asp Asp Pro 

145                 150                 155                 160 

Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 

                165                 170                 175 

Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala 

            180 

<210>9 

<211>256 

<212>PRT 

<213>Homo sapiens 

<400>9 

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ala Ser Arg Glu Ile 

1               5                   10                  15 

Arg Glu Leu Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 

            20                  25                  30 

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 

        35                  40                  45 

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Arg His Gly Val Asp Asn 

    50                  55                  60 

Lys Phe Asn Lys Glu Thr Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Leu Leu 

65                  70                  75                  80 

Pro Asn Leu Asn Gly Arg Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu 

                85                  90                  95 

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 

            100                 105                 110 

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Asn Leu Asn Val Asp Asn Lys Phe Asn 

        115                 120                 125 

Lys Glu Lys Ile Ile Ala Ser Arg Glu Ile Arg Glu Leu Pro Asn Leu 

    130                 135                 140 

Asn His Gln Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu Asp Asp Pro 

145                 150                 155                 160 

Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 

                165                 170                 175 

Gln Ala Pro Lys Thr Lys Asp Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr 

            180                 185                 190 

Ile Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gly Arg 

        195                 200                 205 

Gln Lys Leu Ala Phe Ile His Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser 

    210                 215                 220 

Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro 

225                 230                 235                 240 

Lys Ser Arg His Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly His Ile Ser 

                245                 250                 255 

<210>10 

<211>366 

<212>DNA 

<213>Homo sapiens 

<400>10 

gttgacaaca aattcaacaa agaaaaaatc atcgcttctc gtgaaatccg tgaactgccg     60 

aacctgaacc accagcagaa actggctttc atccactctc tgctggacga cccgtctcag    120 

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaaaacccg    180 

tctgttgaca acaaattcaa caaagaaaaa atcatcgctt ctcgtgaaat ccgtgaactg    240 

ccgaacctga accaccagca gaaactggct ttcatccact ctctgctgga cgacccgtct    300 

cagtctgcta acctgctggc tgaagctaaa aaactgaacg acgctcaggc tccgaaaacc    360 

tgtcaa                                                               366 

<210>11 

<211>366 

<212>DNA 

<213>Homo sapiens 

<400>11 

gttgacaaca aattcaacaa agaaaccatc caggcttctc aggaaatccg tctgctgccg     60 

aacctgaacg gtcgtcagaa actggctttc atccactctc tgctggacga cccgtctcag    120 

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaacagatt    180 

accgttgaca acaaattcaa caaagaaaaa atcatcgctt ctcgtgaaat ccgtgaactg    240 

ccgaacctga accaccagca gaaactggct ttcatccact ctctgctgga cgacccgtct    300 

cagtctgcta acctgctggc tgaagctaaa aaactgaacg acgctcaggc tccgaaaata    360 

tgcatg                                                               366 

<210>12 

<211>549 

<212>DNA 

<213>Homo sapiens 

<400>12 

gttgacaaca aattcaacaa agaaaccatc caggcttctc aggaaatccg tctgctgccg     60 

aacctgaacg gtcgtcagaa actggctttc atccactctc tgctggacga cccgtctcag    120 

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaacggagt    180 

catgttgaca acaaattcaa caaagaaacc atccaggctt ctcaggaaat ccgtctgctg    240 

ccgaacctga acggtcgtca gaaactggct ttcatccact ctctgctgga cgacccgtct    300 

cagtctgcta acctgctggc tgaagctaaa aaactgaacg acgctcaggc tccgaaagcg    360 

ggacgagttg acaacaaatt caacaaagaa accatccagg cttctcagga aatccgtctg    420 

ctgccgaacc tgaacggtcg tcagaaactg gctttcatcc actctctgct ggacgacccg    480 

tctcagtctg ctaacctgct ggctgaagct aaaaaactga acgacgctca ggctccgaaa    540 

acaggccac                                                            549 

<210>13 

<211>549 

<212>DNA 

<213>Homo sapiens 

<400>13 

gttgacaaca aattcaacaa agaaaccatc caggcttctc aggaaatccg tctgctgccg     60 

aacctgaacg gtcgtcagaa actggctttc atccactctc tgctggacga cccgtctcag    120 

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaagttaaa    180 

gatgttgaca acaaattcaa caaagaaacc atccaggctt ctcaggaaat ccgtctgctg    240 

ccgaacctga acggtcgtca gaaactggct ttcatccact ctctgctgga cgacccgtct    300 

cagtctgcta acctgctggc tgaagctaaa aaactgaacg acgctcaggc tccgaaaatg    360 

aagacggttg acaacaaatt caacaaagaa accatccagg cttctcagga aatccgtctg    420 

ctgccgaacc tgaacggtcg tcagaaactg gctttcatcc actctctgct ggacgacccg    480 

tctcagtctg ctaacctgct ggctgaagct aaaaaactga acgacgctca ggctccgaaa    540 

gccgacgct                                                            549 

<210>14 

<211>732 

<212>DNA 

<213>Homo sapiens 

<400>14 

gttgacaaca aattcaacaa agaaaaaatc atcgcttctc gtgaaatccg tgaactgccg     60 

aacctgaacc accagcagaa actggctttc atccactctc tgctggacga cccgtctcag    120 

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaacgtcac    180 

ggggttgaca acaaattcaa caaagaaacc atccaggctt ctcaggaaat ccgtctgctg    240 

ccgaacctga acggtcgtca gaaactggct ttcatccact ctctgctgga cgacccgtct    300 

cagtctgcta acctgctggc tgaagctaaa aaactgaacg acgctcaggc tccgaaaaat    360 

ctgaacgttg acaacaaatt caacaaagaa aaaatcatcg cttctcgtga aatccgtgaa    420 

ctgccgaacc tgaaccacca gcagaaactg gctttcatcc actctctgct ggacgacccg    480 

tctcagtctg ctaacctgct ggctgaagct aaaaaactga acgacgctca ggctccgaaa    540 

actaaagatg ttgacaacaa attcaacaaa gaaaccatcc aggcttctca ggaaatccgt    600 

ctgctgccga acctgaacgg tcgtcagaaa ctggctttca tccactctct gctggacgac    660 

ccgtctcagt ctgctaacct gctggctgaa gctaaaaaac tgaacgacgc tcaggctccg    720 

aaaagccgcc at                                                        732 

Claims (10)

1.一种具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子，它是SEQ ID NO：5～9中任一所示的氨基酸序列的蛋白，或其保守性变异蛋白。

2.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1中所述的具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子。

3.如权利要求2中所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO：10～14中任一所示的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1中所述的具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子，且所述表达载体含有如权利要求2或3中任一所述的多核苷酸以及与该多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。

5.如权利要求4中所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞被权利要求4-5中任一权利要求所述的表达载体所转化。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

8.权利要求1中所述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的制备方法，包括如下步骤：合成编码权利要求1中所述的人IgA免疫球蛋白结合分子的多核苷酸，将此多核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有编码权利要求1中所述的人IgA免疫球蛋白结合分子的多核苷酸的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，通过亲和层析制备所述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子。

9.一种具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子的定向进化筛选方法，包括如下步骤：

1)以hIgA亲和体SEG1和SEG2序列作为基本结构单元，分别在其3′端引入长度为3个氨基酸的随机连接肽序列，构建噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库；

2)以hIgA分子为筛选配基，通过生物淘洗方法，对步骤1)中得到的噬菌体展示hIgA亲和体随机组合文库进行多轮筛选；

3)用PCR方法检测每轮筛选后各代噬菌体文库插入片段的分布情况，用PCR方法检测每轮筛选后各代噬菌体文库插入片段的分布情况，分析每轮筛选后噬菌体中含有的hIgA亲和体重复片段的数量以及含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的噬菌体克隆的百分比；

4)随机挑取含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的噬菌体克隆进行鉴定，经酶联免疫吸附检测上述噬菌体克隆与hIgA的结合能力；

5)测定含有不同数量hIgA亲和体重复体片段的阳性单克隆噬菌体的DNA序列，推导所含外源氨基酸序列；

6)筛选获得的hIgA亲和体序列克隆至表达载体，转化受体菌，经诱导表达并纯化表达蛋白；

7)经ELISA检测、Westernblot试验以及表面等离子共振检测，筛选出与hIgA具有最高结合能力的hIgA亲和体重复体。

10.权利要求1中所述具有分子内亲合力效应的人IgA免疫球蛋白结合分子在高效特异性IgA的纯化和检测中的应用。

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