CN102661932B

CN102661932B - 一种基于表面等离子共振技术的种质资源中特定dna序列鉴定方法

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Publication number: CN102661932B
Application number: CN201210110730.8A
Authority: CN
Inventors: 王利兵; 于艳军; 苏荣欣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2032-04-17
Also published as: CN102661932A

Abstract

一种基于表面等离子共振的种质资源中特定DNA序列资源的鉴定方法，属于种质资源鉴定技术领域。本发明包括传感表面适配体固定、样品标记、样品鉴定、传感元件再生四个步骤，利用同一传感芯片对不同DNA序列进行鉴定；其特征在于以免疫球蛋白E作为标记分子探针，将传感芯片表面连接免疫球蛋白E适配体；对食品样品进行一系列预处理，加入单链DNA的免疫球蛋白E标记物，混合后竞争结合金属纳米粒子修饰的单链DNA相应的适配体；利用表面等离子体共振检测仪检测免疫球蛋白E的含量，间接鉴定特定单链DNA序列；并对传感芯片进行再生，用于检测其它特定DNA序列。本发明提供了一种种质资源中特定DNA序列的有效鉴定方法，实现了同一表面等离子体共振传感芯片对不同DNA序列的鉴定，具有极高的通用性。

Description

一种基于表面等离子共振技术的种质资源中特定DNA序列鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种种质资源中特定DNA序列鉴定技术，特别是基于表面等离子共振技术，核酸适配体与未标记和标记的样品特异性竞争识别，采用免疫球蛋白E修饰的传感元件间接鉴定种质资源中特定DNA序列的方法。

背景技术

种质资源是国民经济可持续发展的基础性战略资源。然而，近年来，我国种质资源流失严重，一方面我国拥有的人类遗传资源、重要经济作物资源、药用资源、工业微生物资源等通过非正当途径大量流失到国外；另一方面一些发达国家在我国建立植物提取物粗加工基地，掠夺性地从我国引进优等药材和资源性提取物。此外，长期以来，我国种质资源鉴定通常是根据形态标记来进行的，如株高、穗长、粒色等。此种形态标记简单直观，但存在数少、多态性差、易受环境条件影响等缺点。因此，导致我国种质资源保护工作面临着巨大的挑战，严重缺乏能满足巨大数量和多种类型物种资源检测鉴定的分析技术。

近10年来，在人类基因组研究计划的推动下，结合现代检测鉴定技术，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。荧光定量PCR技术可以通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，但该技术目前并不能准确地鉴定种质资源；而建立在PCR基础上直接测序的方法，成本昂贵，无法实现快速高通量检测鉴定。可以说，在物种遗传标记等真实性检测鉴定技术方面我国基本处于空白状态。以表面等离子体共振谱仪为技术平台，可以为种质资源中特定DNA序列的快速鉴定提供一种简便可靠的方法，大大缩短了检测鉴定时间，有望发展成为种质资源鉴定的标准化检测平台。但其存在传感芯片检测专一性和成本高问题。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片SA芯片成本为3000多元人民币。因此，如何实现同一传感芯片检测不同特定DNA序列已成为表面等离子体共振检测领域热点研究问题。

发明内容

为了解决现有特定DNA序列分析技术存在的耗材量大、造价昂贵等问题，同时满足对种质资源中各种DNA序列的鉴定要求，本发明提供了一种种质资源中特定DNA的表面等离子体共振鉴定方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点，满足对种质资源中特定DNA序列的鉴定要求。

本发明的技术方案为：一种应用表面等离子共振仪的种质资源中特定DNA序列鉴定方法，利用同一传感芯片对不同种质资源中特定DNA序列进行鉴定；其特征在于包括以下步骤：

（一）传感芯片表面适配体固定：选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50μL浓度为1-50μg/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体；

（二）对特定单链DNA进行免疫球蛋白E标记，标记方法根据待测物基团不同；所述标记方法包括DNA的对苯二异硫氰酸酯修饰和与免疫球蛋白E的氨基偶联。如将水稻一段SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后，再与免疫球蛋白E的氨基偶联，形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-SSR序列偶联物，待用；

（三）标准溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液，浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合，获得特定单链DNA标准溶液，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量；

（四）建立对照曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100μL特定单链DNA标准溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图，获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A；

（五）检测鉴定：提取种质资源总DNA，进行不对称PCR扩增反应，获得单链DNA；对于待测单链DNA样品进行一系列预处理，取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后，竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量；采用表面等离子体共振检测仪记录待测单链DNA的光谱图；通过检测免疫球蛋白E，间接鉴定特定DNA是否存在；对比待测单链DNA样品的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A，当B小于A时，说明种质资源中含有特定DNA序列，当B等于A时，说明不含有特定DNA序列；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH为2-3）的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。

可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。

所述步骤（一）传感器表面适配体固定，包括如下步骤：

（1）将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰；

（2）通入0.02mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液；

（3）通入5-50μL浓度为1-50μg/L生物素修饰的免疫球蛋白E适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定；

（4）重复步骤（2）至（3），获得免疫球蛋白E适配体修饰的传感芯片。

可以采用免疫球蛋白E标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。

所述步骤（三）中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。

所述步骤（四）和（五）中通过检测免疫球蛋白E的含量，间接鉴定特定DNA是否存在，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种种质资源中特定DNA序列的检测。

本发明的有益效果：

（1）本发明解决种质资源中特定DNA序列鉴定芯片的专一性差问题，引入免疫球蛋白E作为标记分子，采用生物素标记的适配体对表面等离子体共振传感芯片进行修饰，将种质资源中特定DNA序列的鉴定转换为对免疫球蛋白E的测量，实现传感芯片的通用性，使用同一传感芯片对种质资源中不同特定DNA序列进行鉴定。具体检测原理见附图1；

（2）本发明解决芯片稳定性差问题，采用适配体作为芯片表面通用配体，再生容易。可重复使用性强，极大地延长了芯片的使用寿命，降低检测成本；

（3）本发明解决试剂消耗量大问题，采用待测样品中DNA序列和免疫球蛋白E标记的特定DNA序列竞争识别特定DNA的适配体时，相对于以往的竞争抑制结合思想，无须加入过量的适配体，既实现了响应信号放大，也节省了试剂消耗；

（4）本发明提高了检测灵敏度，操作中可选用纳米粒子修饰的特定DNA适配体，基于表面等离子体共振检测时，信号显著增加。

附图说明

图1是本发明所述的种质资源中特定DNA序列鉴定原理图；其中为特定DNA序列，为样品中待鉴定DNA序列，为免疫球蛋白E标记的特定DNA序列，为特定DNA的适配体，为免疫球蛋白E的适配体，为纳米粒子。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。

实施例：选择水稻显性早熟基因Ehd的一段SSR序列为鉴定对象，具体操作步骤如下：

（1）传感器表面适配体固定：选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入20μL浓度为30μg/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体；

（2）水稻显性早熟基因Ehd特定SSR序列和免疫球蛋白E偶联：将特定SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后，再与免疫球蛋白E的氨基偶联，形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-特定SSR序列偶联物，待用；

（3）标准溶液配制：用0.02mol/L（pH＝7.4）的HEPBS缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液，浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合，获得特定单链DNA标准溶液，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量；

（4）建立对照曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的HEPBS缓冲液为测量基准，通过微泵通入30μL特定单链DNA标准溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图，获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A；

（5）特定SSR单链鉴定方法

将处理后的样品通过（1）修饰好的传感芯片表面进行鉴定，具体步骤为：

1）对待测单链DNA样品进行一系列预处理，取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后，竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量；

2）将处理后的待测溶液流过传感芯片表面10min，记录下工作通道和参比通道的表面等离子体共振仪光谱图稳定值B；

3）对比待测单链DNA的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A；当B值小于A值时，种质资源中存在特定DNA序列，否则反之；

4）对传感芯片进行再生，通入20mmol/L甘氨酸/盐酸缓冲溶液10min，用以破坏免疫球蛋白E与芯片上适配体的结合，并通入缓冲液冲洗。

本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中以水稻显性早熟基因Ehd的一段SSR序列进行详细描述，但本发明同样适用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。传感器表面再生所用溶液选择0.02mol/L（pH＝2.4）甘氨酸-盐酸溶液，但还可以选择盐溶液或弱酸弱碱溶液或高离子强度电解质溶液，如0.5mol/L氢氧化钠溶液或10 mmol/L甘氨酸/盐酸缓冲溶液，破坏凝血酶与适配体的结合，因此上述内容均在本发明保护范围之内。此外，根据实施例1的方法进行检测样品，与现有表面等离子体检测技术相比，准确度提高2~10倍，探头寿命延长10倍以上，现有表面等离子体检测技术不能准确检测的短链特定DNA序列等（小分子量<1000 Da），可以采用本发明的方法获得准确的检测结果。

Claims

1.一种应用表面等离子体共振仪的种质资源中特定DNA序列鉴定方法，利用同一传感芯片对不同种质资源中特定的DNA序列进行鉴定；其特征在于包括以下步骤：

（二）对特定单链DNA进行免疫球蛋白E标记；

（三）标准溶液配制：用0.01-0.1mol/L的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液，浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合，获得特定单链DNA标准溶液，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量大于加入的适配体量；

（四）建立对照曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100μL特定单链DNA标准溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图，获得特定单链DNA溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A；

（五）检测鉴定：提取种质资源总DNA，进行不对称PCR扩增反应，获得单链DNA；对于待测单链DNA样品进行预处理，取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后，竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量；采用表面等离子体共振检测仪记录待测单链DNA的光谱图；通过检测免疫球蛋白E，间接鉴定特定DNA是否存在；对比待测单链DNA样品的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A，当B小于A时，说明种质资源中含有特定DNA序列，当B等于A时，说明不含有特定DNA序列；

（六）通入0.01-0.05mol/L的pH为2-3的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（二）的标记方法包括DNA的对苯二异硫氰酸酯修饰和与免疫球蛋白E的氨基偶联。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：当种质资源为水稻，标记方法为将水稻一段SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后，再与免疫球蛋白E的氨基偶联，形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-SSR序列偶联物，待用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（一）传感芯片表面适配体固定，包括如下步骤：

（2）通入0.02mol/L的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用免疫球蛋白E标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（三）中纳米粒子是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（四）和（五）中通过检测免疫球蛋白E的含量，间接鉴定特定DNA是否存在，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性。