KR20230007550A - 인자 xa 해독제용 동결건조된 제형 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 인자 Xa (fXa) 해독제의 동결건조된 제형의 제조 용액 및 방법에 관한 것이다. 동결건조에 적합한 수성 제형은 fXa 해독제, 가용화제, 안정제, 및 결정성 성분을 포함하고, 상기 제형은 동결건조 동안 붕괴하지 않는다.
Description
관련 특허 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 하기 하에서 35 U.S.C. § 119(e) 하의 출원일을 우선권으로 주장한다; U.S. 가출원 62/039809 (2014년 8월 20일 출원) (그 전체가 모든 목적으로 본원에서 참고로 편입되어 있음)
항응고제는 응혈을 형성하는 경향이 있는 환자, 예컨대, 예를 들어, 부동성의 기간에 국한된 또는 의료 수술을 경험한, 응고 장애를 갖는 환자에서 원하지 않는 혈전증의 치료 또는 예방에서의 시장에서 필요성을 제공한다. 항응고제 요법의 주요 제한 중 하나는, 그러나, 치료와 관련된 출혈 위험, 및 과투약의 경우 또는 긴급 수술 과정이 요구되면 항응고제 활성을 빠르게 가역하는 능력에 관한 제한이다. 따라서, 모든 형태의 항응고제 요법에 대해 특이적 및 유효한 해독제는 매우 요망된다.
주사로 생물학적 활성 단백질의 전달은 일반적으로 경구 전달이 실제적이지 않은 경우 또는 즉각적인 치료적 활성이 요구된 경우 선택의 전달 경로이다. 그러나, 생물학적, 화학적, 및 물리적 배리어 예컨대 좋지 못한 장기간 보관, 오스몰농도, 용해도, 및 안정성은 문제있는 포유동물에 주사로 생물학적 활성 제제를 전달한다. 동결건조는 장기간 보관 사안을 해결할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 동결건조체의 동결건조, 예컨대 좋지 못한 용해도 및 안정성으로 또한 발생하는 문제가 있다. 따라서, 안정성 및 가용성인, 항응고제에 대한 해독제의 개선된 주사가능 제제에 대한 필요성이 존재한다. 개시내용은 이들 및 다른 필요성을 충족시킨다.
본원에서 언급된 임의의 및 모든 공보, 특허, 특허 출원은 이로써 그 전체가 참고로 편입된다.
요약
본 개시내용은, "r-해독제"로 칭해진, 인자 Xa (fXa) 단백질의 유도체를 위한 동결건조된 제형을 제공한다. 야생형 fXa 단백질과 비교하여, r-해독제는 Gla 도메인 및 활성 부위에 대한 변형을 갖고, fXa 저해제에 결합하는 fXa의 능력을 보유하지만 프로트롬빈분해효소 복합체에 조립하지 않는다. r-해독제는 2-사슬 폴리펩타이드이다 (참고 표 3에서 서열식별번호. 3, 하기를 포함한다: 경쇄 (서열식별번호. 4) 및 중쇄 (서열식별번호. 5) (경쇄의 시스테인 98 (Cys98)과 중쇄의 시스테인 108 (Cys108) 사이에서 연결됨).
또한 야생형 fXa처럼, r-해독제는 특정 아미노산 잔기, 예를 들면, 하기에서 당화를 초래한 번역후 변형을 경험한다: 경쇄 Ser56, Ser72, Ser76 및 중쇄의 Thr82 및 Thr249, 그리고 변형된 잔기, 경쇄의 Asp29에서 (3R)-3-하이드록시Asp. 추가로, 인터-사슬 디설파이드 결합에 더하여, 경쇄의 시스테인 16 및 27, 21 및 36, 38 및 47, 55 및 66, 62 및 75, 및 77 및 90, 및 중쇄의 시스테인 7 및 12, 27 및 43, 156 및 170, 및 181 및 209 사이에서 형성된 인트라-사슬 디설파이드 결합이 있다.
r-해독제의 2-사슬 구조 및 다양한 번역후 변형이 주어지면, 안정성 및 가용성 용액에 허용가능한 오스몰농도를 제공하는 안정성 동결건조된 제형의 개발이 위대한 도전을 나타내는 것이 본원에서 보여진다. 예상외로, 그러나, 본 발명자들은 단백질 용해도, 안정성, 케이크 구조 및 오스몰농도를 조화시키는 용액을 달성할 수 있었다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 수성 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 제형은 하기를 포함하고: 10 mM 내지 55 mM 아르기닌 또는 8 mM 내지 35 mM 시트레이트, 1% 내지 3% 수크로오스 (w/v), 2% 내지 8% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기 사이, 및 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기의 디설파이드 결합을 포함한 적어도 5 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드, 상기 제형은 7.5 내지 8의 pH를 갖는다.
일부 측면에서, 제형은 40 mM 내지 50 mM 아르기닌, 1.5% 내지 2.5% 수크로오스 (w/v), 4.5% 내지 5.5% 만니톨 (w/v), 및 적어도 10 mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 측면에서, 제형은 10 mM 내지 30 mM 시트레이트, 1.5% 내지 2.5% 수크로오스 (w/v), 4.5% 내지 5.5% 만니톨 (w/v), 및 적어도 10 mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 측면에서, 제형은 40 mM 내지 50 mM 아르기닌, 1.5% 내지 2.5% 수크로오스 (w/v), 4.5% 내지 5.5% 만니톨 (w/v), 및 적어도 18, 19 또는 20 mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 측면에서, 제형은 10 mM 내지 30 mM 시트레이트, 1.5% 내지 2.5% 수크로오스 (w/v), 4.5% 내지 5.5% 만니톨 (w/v), 및 적어도 10 mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 측면에서, 제형은 하기를 포함하고: 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열을 포함한 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열을 포함한 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 약 10 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는다. 하나의 측면에서, 제형은 추가로 폴리소르베이트 80 (0.01% w/v 내지 0.02 % w/v) 및/또는 버퍼를 포함한다.
일부 측면에서, 제형은 하기를 포함하고: 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열을 포함한 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열을 포함한 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 약 20 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는다. 하나의 측면에서, 제형은 추가로 폴리소르베이트 80 (0.01% w/v 내지 0.02 % w/v) 및/또는 버퍼를 포함한다.
일부 측면에서, 폴리펩타이드는 천연 아미노산과 상이하도록 변형되는 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 제1 사슬의 잔기 Asp29는 Asp29에서 (3R)-3-하이드록시Asp로 변형된다. 일부 측면에서, 폴리펩타이드는 제1 및 제2 사슬의 각각에 대하여 적어도 인트라-사슬 디설파이드 결합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 하기를 포함하는 2-사슬 폴리펩타이드의 동결건조된 제형의 제조 방법이 또한 제공된다: 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합 (상기 기재된 바와 같이 수성 제형의 동결건조를 포함함).
또 다른 구현예는 본 개시내용의 수성 제형의 동결건조에 의해 제조된 동결건조된 조성물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 적어도 10% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한 동결건조된 조성물을 제공한다: 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합, 및 범위 (0.6-0.95):(1-3):(2-8)의 중량비로 아르기닌:수크로오스:만니톨, 또는 대안적으로 범위 (0.5-1.4):(1-3):(2-8)의 중량비의 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨.
일부 측면에서, 동결건조된 조성물은 적어도 15%, 16%, 17%, 18% 또는 19% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 측면에서, L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨의 중량비는 (0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)의 범위이다.
하기를 포함하는 적어도 10% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한 동결건조된 조성물이 또한 제공된다: 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합, 및 범위 (0.15-0.66):(1-3):(2-8)의 중량비로 시트레이트:수크로오스:만니톨. 일부 측면에서, 동결건조된 조성물은 적어도 10%, 15%, 16%, 17%, 18%, 또는 19% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 측면에서, 시트레이트:수크로오스:만니톨의 중량비는 (0.19-0.57):(1.5-2.5):(4.5-5.5)의 범위이다.
본 개시내용의 또 다른 구현예는 개시내용의 동결건조된 조성물의 용해에 의해 제조된 용액을 제공한다. 일부 측면에서, 용매는 물 또는 염수이다.
추가의 또 다른 구현예는 상기 대상체에게 개시내용의 유효량의 용액 투여를 포함한 인자 Xa 저해제로 항응고제 요법을 받는 대상체에서 출혈 감소 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 인자 Xa 저해제는 아픽사반, 리바록사반 또는 베트릭사반이다.
여전히, 하나의 구현예에서, 하기를 포함한 수성 제형이 또한 제공된다: 서열식별번호. 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호. 3에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 가용화제, 안정제, 및 결정성 성분, 상기 제형은 동결건조 동안 붕괴하지 않는다.
일부 측면에서, 결정성 성분은 만니톨이다. 일부 측면에서, 만니톨은 2% 내지 8% (w/v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 가용화제 아르기닌 또는 시트레이트이고 안정제는 수크로오스이다. 일부 측면에서, 수성 제형은 추가로 계면활성제 및 버퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형의 동결건조에 의해 제조된 동결건조된 조성물이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 다음과 같다:
[1] 10 mM 내지 55 mM 아르기닌, 1% 내지 3% 수크로오스 (w/v), 2% 내지 8% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 상기 아미노산 서열을 포함한 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열을 포함한 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 적어도 5 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함 수성 제형으로서, 상기 제형은 7.5 내지 8의 pH를 갖는 수성 제형.
[2] [1]에 있어서, 40 mM 내지 50 mM 아르기닌, 1.5% 내지 2.5% 수크로오스 (w/v), 4.5% 내지 5.5% 만니톨 (w/v), 및 적어도 10 mg/mL의 상기 폴리펩타이드를 포함한, 제형.
[3] [2]에 있어서, 적어도 18 mg/mL의 상기 폴리펩타이드를 포함한, 제형.
[4] [2]에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 천연 아미노산과 상이하도록 변형되는 아미노산 잔기를 포함하는, 제형.
[5] [4]에 있어서, 상기 제1 사슬의 잔기 Asp29가 Asp29에서 (3R)-3-하이드록시Asp로 변형되는, 제형.
[6] [1]에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 각각의 상기 제1 및 제2 사슬에 대하여 적어도 하나의 인트라-사슬 디설파이드 결합을 포함하는, 제형.
[7] 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 상기 아미노산 서열을 포함한 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열을 포함한 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 약 10 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한, 수성 제형으로서, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는, 수성 제형.
[8] 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 상기 아미노산 서열을 포함한 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열을 포함한 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 약 20 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한, 수성 제형으로서, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는, 수성 제형.
[9] 10 mM 내지 55 mM 아르기닌, 1% 내지 3% 수크로오스 (w/v), 2% 내지 8% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 상기 아미노산 서열을 포함하거나 서열식별번호. 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호: 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 적어도 5 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한, 수성 제형으로서, 상기 제형은 7.5 내지 8의 pH를 갖는, 수성 제형.
[10] [9]에 있어서, 상기 2-사슬 폴리펩타이드가 상기 야생형 fXa 단백질과 비교시 상기 Gla 도메인 및 상기 활성 부위에 대한 변형을 갖고, fXa 저해제에 결합할 수 있지만 프로트롬빈분해효소 복합체로 조립하지 않는, 제형.
[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 따른 동결건조 상기 수성 제형을 포함한, 동결건조된 제형의, 제조 방법.
[12] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 따른 상기 수성 제형의 동결건조에 의해 수득가능한, 동결건조된 조성물.
[13] 하기를 포함하는 적어도 10% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한, 동결건조된 조성물: 서열식별번호. 4의 상기 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합, 및 범위 (0.5-1.4):(1-3):(2-8)의 중량비의 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨.
[14] [13]에 있어서, 적어도 18% (w/w)의 상기 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한, 동결건조된 조성물.
[15] [13]에 있어서, L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨의 상기 중량비가 (0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)의 상기 범위인, 동결건조된 조성물.
[16] 하기를 포함하는 적어도 10% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함한, 동결건조된 조성물: 서열식별번호. 4의 상기 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 상기 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합, 및 약 0.95:2:5의 중량비로 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨.
[17] 수성 용매에 [13] 내지 [16] 중 어느 하나에 따른 상기 동결건조된 조성물을 용해시킴으로써 제조된 용액을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 인자 Xa 저해제로 항응고제 요법을 받는 대상체에서 출혈의, 감소 방법.
[18] [17]에 있어서, 상기 인자 Xa 저해제가 아픽사반, 리바록사반 또는 베트릭사반인, 방법.
[19] 서열식별번호. 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호. 3에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 가용화제, 안정제, 및 결정성 성분을 포함하는 수성 제형으로서, 상기 제형은 동결건조 동안 붕괴하지 않는, 수형 제형.
[20] [19]에 있어서, 상기 결정성 성분이 2% 내지 8% (w/v)의 농도로 존재한 만니톨이고, 상기 가용화제가 아르기닌이고 상기 안정제가 수크로오스인, 제형.
[21] [19] 또는 [20]에 있어서, 추가로 계면활성제 및 버퍼를 포함한, 제형.
도면의 간단한 설명
도 1a-f는 상이한 조건 (pH, 가용화제, 이온 강도)하에서 r-해독제의 용해도를 나타내는 차트이다. 그늘진 바는 단백질 침전이 관측되었음을 지시하고 비어있는 바는 단백질 침전이 관측되지 않았음을 지시한다.
도 2는 1 ℃ /min에서 냉각 및 -32 ℃에서 트리스에 대하여 결정화 발열을 보여주는 10 mm 트리스 용액에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 3은 95 mm 아르기닌으로 10 mm 트리스의 냉각 동안 DSC 온도기록도이다. 트리스에 대한 결정화 발열 없음.
도 4는 10 mm 트리스, 2% 수크로오스, 및 대략 -18 ℃에서 만니톨의 결정화를 보여주는 2% 만니톨을 함유한 용액에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 5는 10 mm 트리스, 95 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 -42 ℃에서 수크로오스에 대해 tg'를 보여주는 2% 만니톨의 용액에 대한 DSC 온도기록도이다. 용액은 -20 ℃에서 5 시간 동안 어닐링된다.
도 6은 결정화 발열의 증거 없이 10 mm 트리스, 95 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 5 시간 동안 -20 ℃에서 어닐링 단계를 보여주는 2% 만니톨의 용액에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 7은 대략 -10 ℃에서 나트륨 포스페이트에 대하여 결정화 발열을 보여주는 10 mm 나트륨 포스페이트 용액에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 8은 대략 -33 ℃에서 개시와 결정화 발열을 보여주는 2% 수크로오스 및 2% 만니톨로 10 mm 나트륨 포스페이트에 대한 DSC 비-가역성 열류 온도기록도이다.
도 9는 얼음 용융 흡열 외에 열적 사례를 나타내는 10 mm 나트륨 포스페이트, 95 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 2% 만니톨에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 10은 -25 ℃에서 대략 24 분의 개시와 결정화 발열을 보여주는 10 mm 트리스, 10 mm 시트레이트, 2% 수크로오스, 및 5% 만니톨에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 11은 -25 ℃에서 대략 30 분의 개시와 결정화 발열을 보여주는 10 mm 트리스, 20 mm 시트레이트, 2% 수크로오스, 및 5% 만니톨에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 12는 T0에서 동결건조된 제형과 비교된 최대 2 주 동안 5 ℃에서 저장된 트리스 및 포스페이트 용액 제형에 대한 UV 농도 데이터이다.
도 13은 T0에서 동결건조된 제형과 비교된 최대 2 주 동안 25 ℃에서 저장된 트리스 및 포스페이트 용액 제형에 대한 UV 농도 데이터이다.
도 14는 T0에서 용액 제형과 비교된 25 ℃에서 저장된 트리스 및 포스페이트 동결건조된 제형에 대한 UV 농도 데이터이다.
도 15는 -22 ℃에서 70 분 (어닐링의 개시 시간)에서 만니톨의 결정화의 개시를 보여주는 10 mm 트리스, 9.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 2% 만니톨, 및 0.01% PS80 제형에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 16은 -25 ℃에서 30 분에서 만니톨의 결정화의 개시를 보여주는 10 mm 트리스, 47.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 4% 만니톨, 및 0.01% PS80 제형에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 17은 10 mm 트리스, 47.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% PS80 용액이 -40 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각되는 경우 만니톨에 대한 DSC 결정화 발열이다.
도 18은 10 mm 트리스, 47.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% PS80 용액이 -25 ℃에서 어닐링되는 경우 만니톨에 대한 DSC 결정화 발열을 보여준다. 결정화의 개시는 대략 23 분이다.
도 1a-f는 상이한 조건 (pH, 가용화제, 이온 강도)하에서 r-해독제의 용해도를 나타내는 차트이다. 그늘진 바는 단백질 침전이 관측되었음을 지시하고 비어있는 바는 단백질 침전이 관측되지 않았음을 지시한다.
도 2는 1 ℃ /min에서 냉각 및 -32 ℃에서 트리스에 대하여 결정화 발열을 보여주는 10 mm 트리스 용액에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 3은 95 mm 아르기닌으로 10 mm 트리스의 냉각 동안 DSC 온도기록도이다. 트리스에 대한 결정화 발열 없음.
도 4는 10 mm 트리스, 2% 수크로오스, 및 대략 -18 ℃에서 만니톨의 결정화를 보여주는 2% 만니톨을 함유한 용액에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 5는 10 mm 트리스, 95 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 -42 ℃에서 수크로오스에 대해 tg'를 보여주는 2% 만니톨의 용액에 대한 DSC 온도기록도이다. 용액은 -20 ℃에서 5 시간 동안 어닐링된다.
도 6은 결정화 발열의 증거 없이 10 mm 트리스, 95 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 5 시간 동안 -20 ℃에서 어닐링 단계를 보여주는 2% 만니톨의 용액에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 7은 대략 -10 ℃에서 나트륨 포스페이트에 대하여 결정화 발열을 보여주는 10 mm 나트륨 포스페이트 용액에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 8은 대략 -33 ℃에서 개시와 결정화 발열을 보여주는 2% 수크로오스 및 2% 만니톨로 10 mm 나트륨 포스페이트에 대한 DSC 비-가역성 열류 온도기록도이다.
도 9는 얼음 용융 흡열 외에 열적 사례를 나타내는 10 mm 나트륨 포스페이트, 95 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 2% 만니톨에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 10은 -25 ℃에서 대략 24 분의 개시와 결정화 발열을 보여주는 10 mm 트리스, 10 mm 시트레이트, 2% 수크로오스, 및 5% 만니톨에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 11은 -25 ℃에서 대략 30 분의 개시와 결정화 발열을 보여주는 10 mm 트리스, 20 mm 시트레이트, 2% 수크로오스, 및 5% 만니톨에 대한 DSC 열류 온도기록도이다.
도 12는 T0에서 동결건조된 제형과 비교된 최대 2 주 동안 5 ℃에서 저장된 트리스 및 포스페이트 용액 제형에 대한 UV 농도 데이터이다.
도 13은 T0에서 동결건조된 제형과 비교된 최대 2 주 동안 25 ℃에서 저장된 트리스 및 포스페이트 용액 제형에 대한 UV 농도 데이터이다.
도 14는 T0에서 용액 제형과 비교된 25 ℃에서 저장된 트리스 및 포스페이트 동결건조된 제형에 대한 UV 농도 데이터이다.
도 15는 -22 ℃에서 70 분 (어닐링의 개시 시간)에서 만니톨의 결정화의 개시를 보여주는 10 mm 트리스, 9.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 2% 만니톨, 및 0.01% PS80 제형에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 16은 -25 ℃에서 30 분에서 만니톨의 결정화의 개시를 보여주는 10 mm 트리스, 47.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 4% 만니톨, 및 0.01% PS80 제형에 대한 DSC 온도기록도이다.
도 17은 10 mm 트리스, 47.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% PS80 용액이 -40 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각되는 경우 만니톨에 대한 DSC 결정화 발열이다.
도 18은 10 mm 트리스, 47.5 mm 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% PS80 용액이 -25 ℃에서 어닐링되는 경우 만니톨에 대한 DSC 결정화 발열을 보여준다. 결정화의 개시는 대략 23 분이다.
상세한 설명
I.
정의
범위를 포함하여, 모든 숫자로 나타낸 지정, 예를 들면, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 0.1 또는 10%의 증분으로 (+) 또는 (-) 가변되는 근사치이다. 비록 항상 명백하게 언급되지 않아도 모든 숫자로 나타낸 지정이 용어 "약"에 의해 선행되는 것이 이해되어야 한다. 비록 항상 명백하게 언급되지 않아도, 본원에서 기재된 시약이 단지 예시적이라는 것 및 상기의 등가물이 당해 기술에 공지되어 있다는 것이 또한 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 맥락이 명확히 다르게는 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는, 이의 혼합물을 포함하여, 복수의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 한정하기 위해 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 의도한 용도를 위한 조합에 대해 임의의 필수적인 유의성의 다른 요소의 배제를 의미할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터 미량 오염물질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 포스페이트 완충된 염수, 보존제, 등등을 배제하지 않을 것이다. "으로 이루어지는"은 본 개시내용의 조성물 투여를 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 원소 이상으로 배제를 의미할 것이다. 각각의 이들 이행 용어로 정의된 구현예는 본 개시내용의 범위내이다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되고 그의 가장 넓은 의미로 2 이상의 서브유니트 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드모사의 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 서브유니트는 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 서브유니트는 다른 결합, 예를 들면, 에스테르, 에테르, 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고 단백질의 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한을 두지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "아미노산"은, 글리신 및 모든 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩타이드모사를 포함하여, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다. 천연 발생 아미노산의 단일 문자 및 3개의 문자 약어는 아래 열거된다.
"인자 Xa" 또는 "fXa" 또는 "fXa 단백질"은 혈액 응고 경로에서 세린 프로테아제이고, 이는 불활성 인자 X로부터 생산된다 (fX, 서열식별번호. 1, 표 1). 뉴클레오타이드 서열 코딩 인간 인자 X ("fX")는 아래에서 발견될 수 있다: 유전자은행 수탁 번호 "NM_000504". 중쇄의 제1 52 잔기의 촉매적 절단시, fX는 fXa로 활성화된다. FXa는 경쇄 및 중쇄를 함유한다. 제1 45 아미노산 잔기 (서열식별번호. 1의 잔기 1-45)의 경쇄가 Gla 도메인으로 칭해지는 것은 11 번역후에 변형된 -카복시글루탐산 잔기 (Gla)를 함유하기 때문이다. 짧은 (6 아미노산 잔기) 방향족 스택 서열을 또한 함유한다 (서열식별번호. 1의 잔기 40-45). 키모트립신 소화는 선택적으로 Gla-도메인없는 fXa를 초래한 1-44 잔기를 제거한다. fXa의 세린 프로테아제 촉매적 도메인은 C-말단 중쇄에 위치한다. fXa의 중쇄는 다른 세린 프로테아제 예컨대 트롬빈, 트립신, 및 활성화된 단백질 C에 매우 상동성이다.
"원상태 fXa" 또는 "야생형 fXa"는 플라즈마에서 천연적으로 존재하는 또는 그의 최초, 비변형된 형태에서 단리된 fXa를 지칭하고, 이는 활성화 프로트롬빈의 생물학적 활성을 가공하여 따라서 응혈의 형성을 촉진한다. 용어는 조직 샘플로부터 단리된 천연 발생 폴리펩타이드 뿐만 아니라 재조합으로 생산된 fXa를 포함한다. "활성 fXa"는 활성화 프로트롬빈의 응혈원 활성을 갖는 fXa를 지칭한다. "활성 fXa"는 응혈원 활성을 보유하는 원상태 fXa 또는 변형된 fXa일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "fXa 유도체"는 프로트롬빈분해효소 복합체에 조립에서 fXa와 경쟁하지 않는 및 감소된 또는 응혈원이나 촉매적 활성이 없는, 및 추가로 항응고제, 예컨대 fXa 저해제를 결합하는 및/또는 실질적으로 중화하는 변형된 fXa 단백질을 지칭한다. fXa 단백질 또는 fXa 유도체의 "응혈원 활성"은, 일부 측면에서, 야생형 활성 fXa 폴리펩타이드가 운반하는 효소 활성을 지칭한다. fXa 유도체의 예는 하기에서 제공되고: US 특허 번호8,153,590, 및 PCT 공개 WO2009/042962 및 WO2010/056765, 그리고 추가로 예컨대 하기가 본원에서 제공된다: 서열식별번호: 2 및 3 및 이들의 생물학적 등가물.
fXa 폴리펩타이드 또는 이들의 유도체의 "효소 활성"은 기질과 직접적인 상호작용을 통해 기질과 생화학적 반응을 촉매화하기 위한 폴리펩타이드의 능력을 지칭한다.
서열식별번호: 2는 야생형 fXa에 비하여 3 돌연변이를 함유한다. 제1 돌연변이는 fX의 Gla-도메인에서 6-39 aa의 결실이다. 제2 돌연변이는 -RKR-로 활성화 펩타이드 서열 143-194 aa의 대체이다. 이는 하기의 -RKRRKR-를 생성한다 (서열식별번호: 6) 하기와 경쇄를 연결하는 링커 (서열식별번호: 4) 및 중쇄 (서열식별번호: 5). 분비시, 상기 링커는 절단되어 하기의 2-사슬 폴리펩타이드를 초래한다: 서열식별번호: 3 (r-해독제). 제3 돌연변이는 Ala 잔기에 대한 활성 부위 잔기 S379의 돌연변이다. 상기 아미노산 치환은 하기의 아미노산 296 및 290에 상응한다: 서열식별번호: 1 및 3, 각각.
용어 "r-해독제"는 하기의 가공된 2-사슬 폴리펩타이드 가공 생성물을 지칭한다: 서열식별번호: 2 (링커의 절단 이후). 이는 하기로 나타난다: 서열식별번호: 3. r-해독제는, 예를 들면, 하기에 개시된다: US 8,153,590 (이의 내용은 본 개시내용 참고로 편입된다). r-해독제는 하기를 포함한다: 경쇄 (서열식별번호. 4) 및 중쇄 (서열식별번호. 5) (경쇄의 시스테인 98 (Cys98)과 중쇄의 시스테인 108 (Cys108) 사이에서 연결됨). 야생형 fXa 같이, 특정 생산 배치에서, r-해독제는 특정 아미노산 잔기, 예를 들면, 하기에서 당화를 초래하는 번역후 변형을 겪는다: 경쇄 Ser56, Ser72, Ser76 및 중쇄의 Thr82 및 Thr249, 그리고 변형된 잔기, 경쇄의 Asp29에서 (3R)-3-하이드록시Asp. 추가로, 인터-사슬 디설파이드 결합에 더하여, 경쇄의 시스테인 16 및 27, 21 및 36, 38 및 47, 55 및 66, 62 및 75, 및 77 및 90 사이에서, 및 중쇄의 시스테인 7 및 12, 27 및 43, 156 및 170, 및 181 및 209 사이에서 형성된 인트라-사슬 디설파이드 결합일 수 있다.
표 1. 불활성 인간 인자 X의 폴리펩타이드 서열 (서열식별번호: 1)
표 2. (서열식별번호. 6) 링커의 -RKRRKR- 제거에 앞서 r-해독제의 폴리펩타이드 서열 (서열식별번호: 2)
표 3. (서열식별번호. 6) 링커의 -RKRRKR- 제거 이후 인간 인자 Xa 삼중 돌연변이체의 폴리펩타이드 서열 (서열식별번호: 3)
본 개시내용 또한 r-해독제의 다양한 생물학적 등가물을 제공한다 (또는 서열식별번호: 2로 나타낸 그것의 전구체), 또는 대안적으로 서열식별번호: 3에 대해 특정 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드. 하나의 측면에서, 상기 생물학적 등가물은 서열식별번호: 3의 구조적 특징, 즉, 변형된 활성 부위 및 결실된 또는 변형된 Gla 도메인을 보유한다. 또 다른 측면에서, 상기 생물학적 등가물은 서열식별번호: 3의 기능적 특징을 보유한다, 즉, 프로트롬빈분해효소 복합체에 조립에서 fXa와 경쟁하지 않음 및 응혈원 (예를 들면, 효소 또는 촉매적) 활성이 감소되거나 없음.
용어 "활성 부위"는 화학적 반응이 발생하는 효소 또는 항체의 일부를 지칭한다. "변형된 활성 부위"는 증가된 또는 감소된 화학적 반응성 또는 특이성을 활성 부위에 제공하기 위해 구조적으로 변형되고 있는 활성 부위이다. 활성 부위의 예는, 비제한적으로, 235-488 아미노산 잔기를 포함한 인간 인자 X의 촉매적 도메인, 및 195-448 아미노산 잔기를 포함한 인간 인자 Xa의 촉매적 도메인을 포함한다. 변형된 활성 부위의 예는, 비제한적으로, 서열식별번호: 1에서 195-448 아미노산 잔기를 포함한 인간 인자 Xa의 촉매적 도메인을 포함한다 (위치 Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414, 또는 Arg424에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 가짐).
"조성물"은 활성제 및 또 다른 화합물 또는 조성물, 불활성 (예를 들어, 검출가능한 제제 또는 표지) 또는 활성, 예컨대 아쥬반트의 조합을 의미하는 의도이다.
"약제학적 조성물"은, 시험관내, 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 적합한 조성물을 제조하는, 불활성 또는 활성인, 캐리어와 활성제의 조합을 포함할 의도이다.
용어 "동결건조된 제형"은 냉동-건조된 해당 폴리펩타이드를 포함한 약제학적 제형 또는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "팽화제"는 동결건조된 제형에 벌크를 제공하는 성분을 지칭한다. 팽화제의 예는, 비제한적으로, 만니톨, 트레할로오스, 락토오스, 수크로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스, 글루코오스, 글리신, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 고체 PEGs 및 이들의 유도체 및 혼합물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 제형(formlation)은 팽화제를 선택적으로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 케이크"는 특정 바람직한 특징, 예를 들면 약학적으로 허용가능한, 장기간 안정성, 짧은 재구성 시간, 품격있는 외관 및 재구성시 최초 용액의 특징 유지를 갖는 동결건조후 잔류하는 비-붕괴된 고체 의약품을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 케이크는 고체, 분말 또는 과립 물질일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 케이크는 케이크의 최대 5 중량 퍼센트 물을 또한 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동결건조" 또는 냉동 건조는 냉동된 이후 및 진공하에서 배치된 이후 물이 생성물로부터 제거되어, 액체상을 통한 통과 없이 고체로부터 증기로 얼름을 직접적으로 변화시키는 공정을 지칭한다. 공정은 3개의 별도, 독특한, 및 상호의존적 공정으로 이루어진다; 냉동, 1차 건조 (승화), 및 2차 건조 (탈착). 본 개시내용에서 사용된 폴리펩타이드의 동결건조 방법은 본 명세서에 기재되어 있고 당해 기술에서 잘 알려진다.
용어 "버퍼"는 본원에서 사용된 바와 같이 약제학적 제제의 pH를 안정화시키는 약학적으로 허용가능한 부형제를 나타낸다. 적합한 버퍼는 당해 기술에서 잘 알려지고 문헌에서 발견될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 버퍼는 비제한적으로 트리스-버퍼, 아르기닌-버퍼, 히스티딘-버퍼, 시트레이트-버퍼, 석시네이트-버퍼 및 포스페이트-버퍼를 포함한다. 사용된 버퍼와 독립적으로, pH는 당해 기술에서 공지된 산 또는 염기, 예를 들면, 석신산, 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 석시네이트, 시트레이트, 트리스 염기, 히스티딘, 히스티딘 HCl, 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 조정될 수 있다. 적합한 버퍼는, 비제한적으로, 히스티딘 버퍼, 2-모폴리노에탄설폰산 (MES), 카코딜레이트, 포스페이트, 아세테이트, 석시네이트, 및 시트레이트를 포함한다. 버퍼의 농도는 약 4 mM 내지 약 60 mM, 또는 대안적으로 약 4 mM 내지 약 40 mM, 또는 대안적으로 약 5 mM 내지 약 25 mM일 수 있다.
"동결보호제"는 당해 기술에 공지되어 있고 비제한적으로, 예를 들면, 수크로오스, 트레할로오스, 및 글리세롤을 포함한다. 생물학적 시스템에서 저독성을 나타내는 동결보호제는 일반적으로 사용된다.
용어 "장성 제제"는 본원에서 사용된 바와 같이 제형의 장성을 조절하기 위해 사용된 약학적으로 허용가능한 제제를 나타낸다. 등장성은 일반적으로 용액에 비해, 보통 인간 혈청의 것에 비해 삼투압에 관련한다. 제형은 저장성, 등장성 또는 고장성일 수 있다. 하나의 측면에서, 제형은 등장성이다. 등장성 제형은 고체 형태, 예를 들면 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 또는 액체이고 비교되는 일부 다른 용액으로서 동일한 장성을 갖는 용액, 예컨대 생리적 염 용액 및 혈청을 나타낸다. 적합한 등장성 제제는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 비제한적으로 염화나트륨, 칼륨 클로라이드, 글리세린 및 아미노산의 그룹으로부터 임의의 구성요소, 당, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 약학적으로 허용가능한 유기 서브스턴스를 지칭하고; 즉, 대향하는 용해도 경향의 그룹, 전형적으로 오일용해성 탄화수소 사슬 및 수-가용성 이온 그룹으로 구성된다. 계면활성제는, 표면-활성 모이어티의 전하에 따라, 음이온성, 양이온성, 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 습윤, 에멀젼화, 가용화, 및 다양한 약제학적 조성물용 분산제로서 그리고 생물학적 물질의 제조를 위하여 종종 사용된다. 본원에서 기재된 약제학적 제형의 일부 구현예에서, 계면활성제의 양은 중량/용적 퍼센트 (w/v %)로 발현된 백분율로서 기재된다. 적합한 약학적으로 허용가능한 계면활성제는 비제한적으로 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 (Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르 (Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머 (Poloxamer, Pluronic), 또는 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)의 그룹을 포함한다. 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트 20, (상표명 Tween 20™ 하에 판매됨) 및 폴리소르베이트 80 (상표명 Tween 80™ 하에 판매됨). 폴리에틸렌-폴리프로필렌 코폴리머는 명칭 Pluronic® F68 또는 Poloxamer 188™ 하에 판매된 것을 포함한다. 폴리옥시에틸렌 알킬 상표명 Brij™ 하에 판매된 것을 포함한다. 알킬페놀폴리옥시에틸렌 에테르는 상표명 Triton-X 하에 판매된 것을 포함한다.
"동결건조보호제"는 동결건조 (급속 냉동 및 고진공에서 건조의 공정) 동안 단백질을 안정화하는 약학적으로 허용가능한 서브스턴스를 지칭한다. 동결건조보호제의 예는, 비제한적으로, 수크로오스, 트레할로오스 또는 만니톨을 포함한다.
"항산화제"는 다른 분자의 산화를 저속화 또는 방지할 수 있는 분자를 지칭한다. 산화는 서브스턴스로부터 산화제로 전자를 전하는 화학적 반응이다. 산화 반응은 단백질 치료제를 탈안정화시키는 및 생성물 활성에 궁극적으로 영향을 미치는 사슬 반응을 시작하는, 자유 라디칼을 생산할 수 있다. 항산화제는 자유 라디칼 중간체의 제거에 의해 이들 사슬 반응을 종결하고, 자체 산화에 의해 다른 산화 반응을 저해한다. 그 결과, 항산화제는 종종 환원제, 킬레이트제 및 산소 포착제 예컨대 시트레이트, EDTA, DPTA, 티올, 아스코르브산 또는 폴리페놀이다. 항산화제의 예는 하기를 포함한다: 아스코르브산 (AA, E300), 티오설페이트, 메티오닌, 토코페롤 (E306), 프로필 갈레이트 (PG, E310), 3차 부틸하이드로퀴논 (TBHQ), 부틸화된 하이드록시아니솔 (BHA, E320) 및 부틸화된 하이드록시톨루엔 (BHT, E321).
"보존제"는 미생물 성장에 의해 또는 요망되지 않는 화학적 변화에 의해 분해를 방지하기 위해 생성물에 부가되는 천연 또는 합성 화학제품 예컨대 식품, 의약품, 페인트, 생물학적 샘플, 목재, 등이다. 보존제 첨가제는 단독으로 또는 보존의 다른 방법과 함께 사용될 수 있다. 보존제는 박테리아 및 진균의 성장을 저해하는 항미생물 보존제, 또는 구성요소의 산화를 저해하는 항산화제 예컨대 산소 흡수제일 수 있다. 공통의 항미생물 보존제는 하기를 포함한다: 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 콜로로(choloro)헥시딘, 글리세린, 페놀, 칼륨 소르베이트, 티메로살, 설파이트 (이산화황, 중아황산나트륨, 칼륨 수소 설파이트, 등) 및 디나트륨 EDTA. 다른 보존제는 패턴테럴 단백질 예컨대 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 또는 메틸파라벤에서 통상적으로 사용된 것을 포함한다.
용어 "계면활성제"는 본원에서 사용된 바와 같이 2개 액체 사이 또는 액체와 고체 사이에서 표면 장력 (또는 계면 장력)을 저하시키는 화합물을 의미한다. 계면활성제는 세제, 습윤제, 유화제, 발포제, 및 분산제로서 작용할 수 있다.
계면활성제의 예는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트 80, 지방산 및 알킬 설포네이트; 벤즈에타늄 클로라이드, 예를 들면, Lonza, Inc.로부터 HY 아민 1622 (Fairlawn, N.J.); 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들면, Uniqema (Wilmington, Del)로부터 TWEEN 시리즈; 및 천연 계면활성제, 예컨대 나트륨 타우로콜산, 1-팔미토일-2-Sn-글리세로-3-포스포콜린, 레시틴 및 다른 인지질.상기 계면활성제는, 예를 들면, 생성물의 재구성 동안 동결건조된 입자의 응집을 최소화한다. 이들 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 5% w/v를 포함할 수 있다.
II. 제형
제공된 바와 같이, 야생형 fXa는 2-사슬 폴리펩타이드이다. 하기의 r-해독제를 포함하여, 많은 형태의 fXa 해독제도 동일하다: (서열식별번호: 3) (하기를 포함한다: 경쇄 (서열식별번호. 4) 및 중쇄 (서열식별번호. 5) (경쇄의 시스테인 98 (Cys98)과 중쇄의 시스테인 108 (Cys108) 사이에서 연결됨). 또한 야생형 fXa 처럼, 세포에서 발현된 r-해독제는 하기에서 당화를 초래하는 번역후 변형을 경험한다: 특정 아미노산 잔기, 예를 들면, 경쇄 Ser56, Ser72, Ser76 및 중쇄의 Thr82 및 Thr249, 그리고 변형된 잔기, 경쇄의 Asp29에서 (3R)-3-하이드록시Asp. 추가로, 인터-사슬 디설파이드 결합에 더하여, 경쇄의 시스테인 16 및 27, 21 및 36, 38 및 47, 55 및 66, 62 및 75, 및 77 및 90 사이에서, 및 중쇄의 시스테인 7 및 12, 27 및 43, 156 및 170, 및 181 및 209 사이에서 형성된 하나 이상의 인트라-사슬 디설파이드 결합이 있을 수 있다.
fXa 해독제의 2-사슬 구조 및 다양한 번역후 변형이 주어지면, 허용가능한 오스몰농도를 안정성 및 가용성 용액에 제공하는 안정성 동결건조된 제형이 위대한 도전을 나타내는 것이 본원에서 보여진다.
예로서 r-해독제를 이용하여, 실험적인 데이터는 가용화제의 고농도가 r-해독제에 대하여 합리적인 용해도를 유지하도록 요구되는 것을 보여주었다. 특히, 실시예 4에서 용해도 연구는 모든 시트레이트 및 아르기닌이 r-해독제의 용해도를 유의미하게 증가시킴을 보여준다. 추가로, 실시예는 아르기닌의 농도가 95 mM, 또는 적어도 10 mM인 경우 r-해독제가 용액에서 가용성일 수 있음을 보여주었다.
추가로, 동결건조 공정 동안, 허용가능한 동결건조된 샘플 (실시예 6)을 수득하기 위해 결정된 붕괴 온도 (약 -40 ℃) 미만으로 유지되기 위해 단백질의 온도가 필요하다는 것이 결정되었다. 상기 낮은 생성물 온도의 유지는, 그러나, 실시에서 실행가능하지 않다. 따라서, 데이터는 결정화 구성요소 (예를 들면, 만니톨)가 냉동 건조 동안 및 이후 대신 비정질 단백질 물질을 유지할 수 있는 스캐폴드로서 작용하도록 요구되는 것을 입증한다.
그러나, 하기의 아르기닌의 고 농도의 존재가 하기하였음을 추가로 발견되었다: (예를 들면, 95 mM) 만니톨의 결정화를 방지하였음 (실시예 7). 그 동안에, 만니톨의 존재는 제형에서 당의 총 농도를 증가시켜, 용액의 허용될 수 없는 오스몰농도를 초래한다 (실시예 7).
r-해독제에 대한 적합한 동결건조된 형성의 개발은, 따라서, 가용화제로서 아르기닌, 결정화 제제로서 만니톨, 및 안정제로서 수크로오스의 농도에 대하여 갈등 요건을 가졌다. 기껏해야, 상기 요건이 허용가능한 동결건조된 형성을 발생하기 위해 조화될 수 있는지는 예측할 수 없었다.
놀랍게도 및 예상외로, 그러나, 본 발명자들은 단백질 용해도, 안정성, 케이크 구조 및 오스몰농도를 조화시키는 용액에 도달할 수 있었다. 더 구체적으로, 적합한 동결건조된 형성을 발생하기 위해, r-해독제 용액의 예는 약 45 mM 아르기닌 (10-55 mM), 약 2% 수크로오스 (1-3%), 및 약 5% 만니톨 (2-8%)을 포함한다. 추가로, 용액은 하기의 r-해독제의 원하는 양과 함께 약 10 mM 트리스, 및 0.01%-0.02% PS80을 포함하고: (예를 들면, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL 또는 50 mg/mL), 및 약 7.8의 pH를 갖는다.
추가로, 치료적 단백질용 양호한 가용화제로서 공지됨에도 불구하고, 시트레이트는 항응고 활성을 갖는 것으로 보여졌다. 참고, 예를 들면, Wright 등, Nephrology (Carlton). 2011 May; 16(4):396-402. 따라서, r-해독제가 항응고제에 대한 해독제 (fXa 저해제)로서 의도되기 때문에, 시트레이트는 r-해독제로 사용에 적합하지 않은 것으로 고려되었다. 예상외로, 시트레이트가 실제로 r-해독제의 생체내 활성을 방해하지 않는 것이 본원에서 발견된다. 시트레이트의 적합한 농도는 동결건조에 적합한 용액에서 약 2% 수크로오스 (1-3%), 및 약 5% 만니톨 (2-8%)에 더하여 약 10 mM 내지 약 25 mM이도록 발견된다.
따라서, 용액이 동결건조된 경우, (0.5-1.4):(1-3):(2-8)의 범위로 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨의 중량비를 포함하는 건조 조성물을 형성할 것이다. 5 mg/mL 내지 50 mg/mL r-해독제가 용액에서 사용되면, 예를 들어, (0.5-1.4):(1-3):(2-8):(0.5-5)의 범위에서 아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨:r-해독제의 중량비.
반대로, 그와 같은 동결건조된 제형이 물, 염수, 또는 다른 유사한 용매에서 용해되면, 약 10-55 mM 아르기닌, 약 1-3% 수크로오스, 및 약 2-8% 만니톨을 갖는 용액을 제공할 수 있다.
마찬가지로, 가용화제로서 시트레이트를 이용한 용액이 동결건조된 경우, (0.15-0.66):(1-3):(2-8)의 범위에서 시트레이트:수크로오스:만니톨의 중량비를 포함하는 건조 조성물을 형성할 것이다. 5 mg/mL 내지 50 mg/mL r-해독제가 용액에서 사용되면, 예를 들어, (0.15-0.66):(1-3):(2-8):(0.5-5)의 범위에서 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨:r-해독제의 중량비. 반대로, 그와 같은 동결건조된 제형이 물, 염수, 또는 다른 유사한 용매에서 용해된 경우, 약 8-35 mM 시트레이트, 약 1-3% 수크로오스, 및 약 2-8% 만니톨을 갖는 용액을 제공할 수 있다.
r-해독제로 관측된 결과는 r-해독제의 생물학적 등가물을 포함한 유사한 구조를 갖는 다른 fXa 해독제에 쉽게 외삽될 수 있다: (또는 서열식별번호: 2로 나타낸 그것의 전구체). 하나의 측면에서, 상기 생물학적 등가물은 서열식별번호: 3에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는다. 하나의 측면에서, 상기 생물학적 등가물은 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5, 각각에 대해 각각 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 2개의 펩타이드 사슬을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 생물학적 등가물은 서열식별번호: 3의 구조적 특징을 보유한다, 즉, 변형된 활성 부위 및 결실된 또는 변형된 Gla 도메인. 또 다른 측면에서, 상기 생물학적 등가물은 서열식별번호: 3의 기능적 특징을 보유한다, 즉, 프로트롬빈분해효소 복합체에 조립에서 fXa와 경쟁하지 않음 및 응혈원 (예를 들면, 효소 또는 촉매적) 활성이 감소되거나 없음.
또한, 아르기닌이 또 다른 가용화제로 치환될 수 있음, 만니톨이 또 다른 결정화 제제로 치환될 수 있음, 및 수크로오스가 또 다른 안정제로 치환될 수 있음이 고려되고, 이들 각각의 적절한 예는 당해 기술에서 이용가능하고 본 개시내용에서 제공된다.
A.
동결건조에 적합한 폴리펩타이드 용액
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 동결건조에 적합한 수성 제형을 제공하고, 이 제형은 가용화제, 안정제 (또는 안정제), 및 결정성 제제와 함께 본원에서 개시된 바와 같은 fXa 해독제 또는 그의 생물학적 등가물을 포함한다. 제형은 추가로 계면활성제 및/또는 버퍼를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어, 냉동-건조 온도가 -40 ℃, -30 ℃, -20 ℃, -10 ℃, 0 ℃, 5 ℃, 10 ℃, 또는 15 ℃보다 높거나, 20 ℃ 또는 25 ℃만큼 높은 경우, 각각의 이들 제제들의 존재는 동결건조 동안 붕괴로부터 fXa 해독제를 방지한다.
개시내용의 하나의 구현예는 동결건조에 사용될 수 있는 수성 제형을 제공한다. 수성 제형은 fXa 유도체 폴리펩타이드, 예를 들면, 서열식별번호. 3의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드 또는 서열식별번호. 3에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩타이드에 더하여, 제형은 추가로 가용화제, 안정제, 및 결정성 성분을 포함한다. 그와 같은 제형은 원하는 조건하에서 동결건조 동안 붕괴하지 않는다. 하나의 측면에서, 원하는 조건은 -40 ℃보다 높은, 또는 대안적으로 -40 ℃, -30 ℃, -20 ℃, -10 ℃, 0 ℃, 5 ℃, 10 ℃, 또는 15 ℃보다 높은 온도에서 냉동 건조이다. 또 다른 측면에서, 원하는 조건은 25 ℃보다 낮은, 또는 대안적으로 20 ℃, 15 ℃, 10 ℃, 또는 5 ℃보다 낮은 온도에서 냉동 건조이다.
하나의 측면에서, fXa 유도체 폴리펩타이드는 야생형 fXa 단백질에 비교시 Gla 도메인 및 활성 부위에 대한 변형을 갖는다. 하나의 측면에서, fXa 유도체 폴리펩타이드는 fXa 저해제에 결합하는 fXa의 능력을 보유하지만 프로트롬빈분해효소 복합체에 조립하지 않는다. 하나의 측면에서, fXa 유도체 폴리펩타이드는 하기를 포함하는, 서열식별번호. 3의 아미노산 서열을 갖는 2-사슬 폴리펩타이드이다: 경쇄의 시스테인 98 (Cys98)과 중쇄의 시스테인 108 (Cys108) 사이에서 연결 경쇄 (서열식별번호. 4) 및 중쇄 (서열식별번호. 5). 하나의 측면에서, 수성 제형은 적어도 5 mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 측면에서, 수성 제형은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 측면에서, 결정성 성분은 냉동 건조 공정 동안 결정성 매트릭스 형성에 적합한 농도로 제형에 포함된다. 결정성 매트릭스의 제형은 실시예에서 입증된 바와 같이 붕괴 방지에 유용하다.
"결정성 성분"은 냉동 건조 공정 동안 폴리펩타이드를 포함하는 제형에서 결정성 매트릭스를 형성하는 분자를 지칭한다. 결정성 성분의 비-제한 예는 만니톨 및 글리신을 포함한다.
일부 측면에서, 결정성 성분은 만니톨 (예를 들면, 결정성 만니톨)이다. 하나의 측면에서, 수성 제형내 결정성 성분의 농도는 적어도 1% (w/v)이다. 하나의 측면에서, 수성 제형내 결정성 성분의 농도는 적어도 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5% 또는 4% (w/v)이다. 하나의 측면에서, 수성 제형내 결정성 성분의 농도는 8% 이하, 또는 대안적으로 7%, 6.5%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5% 또는 4% (w/v)이하이다. 하나의 측면에서, 수성 제형내 결정성 성분의 농도는 하기이다: 약 1% 내지 약 8%, 또는 약 2% 내지 약 6%, 또는 약 3% 내지 약 5.5%, 또는 약 4.5% 내지 약 5.5%, 또는 약 4.6% 내지 약 5.4%, 또는 약 4.7% 내지 약 5.3%, 또는 약 4.8% 내지 약 5.2%, 또는 약 4.9% 내지 약 5.1%, 또는 약 4%, 4.5%, 또는 5% (w/v).
일부 측면에서, 가용화제는 수성 제형에 포함된다. 용어 "가용화제"는, 용액에 존재한 경우, 용액에서 또 다른 분자 (예를 들면, 활성 성분)의 용해도를 증가시키는 염, 이온, 탄수화물, 착화 제제, 폴리머 및 다른 화합물을 지칭한다. 가용화제의 비-제한 예는 아르기닌 및 시트레이트를 포함한다. 하나의 측면에서, 가용화제는 아르기닌이다. 하나의 측면에서, 가용화제는 시트레이트이다.
가용화제의 존재는 제형에서 fXa 폴리펩타이드를 가용성 및 안정성이도록 하는데 유용함이 본원에서 입증된다. 일부 측면에서, 가용화제 (예를 들면, 아르기닌)의 농도는 적어도 10 mM, 또는 대안적으로 적어도 20 mM, 25 mM, 30 mM, 36 mM, 또는 40 mM이다. 일부 측면에서, 가용화제 (예를 들면, 아르기닌)의 농도는 100 mM, 96 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM 또는 50 mM이하이다. 일부 측면에서, 가용화제의 농도는 하기이다: 약 10 mM 또는 20 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 또는 20 mM 내지 약 55 mM, 약 35 mM 내지 약 55 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 41 mM 내지 약 49 mM, 약 42 mM 내지 약 48 mM, 약 43 mM 내지 약 47 mM, 약 44 mM 내지 약 46 mM, 또는 약 40 mM, 45 mM 또는 50 mM.본원에서 사용된 바와 같이, 용어 아르기닌이 아미노산 뿐만 아니라 이들의 염 (예를 들면, 아르기닌 HCl)을 참조함이 주목된다. 아르기닌은 약 174.2 달톤의 분자량을 갖고 아르기닌 HCl (예를 들면, L-아르기닌 HCl)은 약 210.7 달톤의 분자량을 갖는다.
하나의 구현예에서, 가용화제는 시트레이트 또는 이들의 염이다. 시트레이트의 염은 나트륨 시트레이트이다. 하나의 측면에서, 시트레이트는 농도 약 1.0 mM 내지 약 200.0 mM을 포함한다. 하나의 추가 측면에서, 시트레이트의 농도는 약 25 mM이다. 또 다른 측면에서, 시트레이트의 농도는 약 50 mM이다. 추가 구현예에서, 시트레이트의 농도는 약 5 mM, 10 mM, 또는 20 mM이다. 또 다른 구현예에서, 시트레이트는 약 0.05 M 내지 약 0.2 M의 농도를 포함한다.
일부 측면에서, 안정제는 수성 제형에 포함된다. 용어 "안정제"는, 제조, 보관 및 적용 동안 화학적 및/또는 물리적 분해로부터 활성 성분 (예를 들면, fXa 유도체 폴리펩타이드) 및/또는 제형을 보호하는, 약제학적 허용가능한 부형제를 나타낸다. 안정제의 예는 아마도 수크로오스, 아르기닌, 시트레이트, 만니톨, 트레할로오스, 글리신, 염화나트륨, 덱스트란 및 글루코오스를 포함한다. 하나의 측면에서, 안정제는 수크로오스이다.
하나의 측면에서, 수성 제형에서 안정제 (예를 들면, 수크로오스)의 농도는 적어도 약 0.5% (w/v)이다. 하나의 측면에서, 수성 제형에서 안정제 (예를 들면, 수크로오스)의 농도는 적어도 약 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9% 또는 2% (w/v)이다. 하나의 측면에서, 수성 제형에서 안정제 (예를 들면, 수크로오스)의 농도는 약 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5% 또는 2% (w/v) 이하이다. 하나의 측면에서, 수성 제형에서 안정제 (예를 들면, 수크로오스)의 농도는 하기이다: 약 1% 내지 약 5%, 또는 약 1% 내지 약 4%, 또는 약 1% 내지 약 3%, 또는 약 1.5% 내지 약 2.5%, 또는 약 1.6% 내지 약 2.4%, 또는 약 1.7% 내지 약 2.3%, 또는 약 1.7% 내지 약 2.2%, 또는 약 1.9% 내지 약 2.1%, 또는 약 1%, 1.5%, 2%, 2.5% 또는 3% (w/v).
일부 측면에서, 수성 제형은 계면활성제, 버퍼, 장성 제제, 동결보호제, 계면활성제, 동결건조보호제, 보존제 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 수성 제형은 6 이상, 또는 6.5 이상, 또는 7 이상, 또는 7.5 이상인 pH를 갖는다. 일부 측면에서, pH는 9, 8.5, 또는 8 이하이다. 일부 측면에서, pH는 하기이다: 6 내지 9, 6.5 내지 8.5, 7 내지 8.5, 7.5 내지 8.2, 7.6 내지 8.1, 7.7 내지 7.9, 또는 약 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.
하나의 측면에서, 수성 제형은 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 약 10 mg/mL의 2-사슬 r-해독제를 포함하고, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는다. 하나의 측면에서, 수성 제형은 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 약 20 mg/mL의 2-사슬 r-해독제를 포함하고, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는다. 하나의 측면에서, 수성 제형은 약 45 mM 아르기닌, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 약 40 mg/mL의 2-사슬 r-해독제를 포함하고, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는다. 하나의 측면에서, 수성 제형은 추가로 0.01%-0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80 및 버퍼를 포함한다.
B. 동결건조 및 동결건조된 조성물
일부 구현예에서, 본 개시내용의 수성 제형의 동결건조 방법이 또한 제공된다. 하나의 측면에서, 개시내용은 표 8.2에서 예시된 바와 같이 보존적 동결건조 사이클을 제공하고, 이는 냉동 단계, 등온 단계, 어닐링 단계, 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 동결건조 사이클은 표 6에서 기재된 바와 같은 단계를 포함한다. 일단 동결건조에 적합한 수성 용액이 확인되면, 용액의 동결건조 방법이 당해 기술에 공지된 방법으로 따라서 유도될 수 있음이 추가로 주목된다. 하나의 측면에서, 하나, 또는 그 이상 또는 모든 건조 단계가 -40 ℃ 이상의 온도에서 수행된다. 하나의 측면에서, 건조 단계는 -35 ℃, -30 ℃, -25 ℃, -20 ℃, -10 ℃ 또는 0 ℃ 이상, 그러나 10 ℃, 15 ℃, 20 ℃ 또는 25 ℃ 이하의 온도에서 수행된다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 수성 제형의 동결건조에 의해 제조된 동결건조된 조성물이 또한 제공된다. 수성 제형에서 각 제제의 농도에 기반하여, 동결건조된 조성물에서 제제의 상대 함량은 쉽게 결정될 수 있다.
하나의 측면에서, 동결건조된 조성물은 적어도 5%, 또는 대안적으로 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 35% (w/w)의 fXa 유도체 폴리펩타이드를 포함한다. 그 다음, 다른 주요 성분 중에서, 예를 들어, (0.5-1.4):(1-3):(2-6)의 범위로 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨에 대한 중량비가 있을 수 있다. 일부 측면에서, L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨의 중량비는 하기의 범위이다: (0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5), 또는 (0.91-0.99):(1.6-2.4):(4.6-5.4), 또는 (0.92-0.98):(1.7-2.3):(4.7-5.3), (0.93-0.97):(1.8-2.2):(4.8-5.2), 또는 (0.94-0.96):(1.9-2.1):(4.9-5.1). 일부 측면에서, 동결건조된 조성물은 추가로 계면활성제 및/또는 버퍼의 고형부를 포함한다.
여전히, 일부 측면에서, 용매에서 본 개시내용의 동결건조된 조성물을 용해시킴으로써 제조된 용액이 제공된다. 일부 측면에서, 용매는 물 또는 염수이다. 하나의 측면에서, 용매는 물이다. 하나의 측면에서, 용액은 적어도 5 mg/ml 또는 대안적으로 적어도 10 mg/ml의 표적 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 10% (w/w)의 r-해독제, 및 약 0.95:2:5의 중량비로 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨을 포함한 동결건조된 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 20% (w/w)의 r-해독제, 및 약 0.95:2:5의 중량비로 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨을 포함한 동결건조된 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용은은 적어도 40% (w/w)의 r-해독제, 및 약 0.95:2:5의 중량비로 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨을 포함한 동결건조된 조성물을 제공한다.
III. 제형의 이용 방법
본 개시내용은 또한 적합한 용매에서 용해될 때 유효량의 동결건조된 제형을 대상체에게 투여하는 것을 포함한 fXa 저해제로 항응고제 요법을 받는 대상체에서 출혈 치료, 방지 또는 감소의 치료적 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 해독제 또는 유도체가 선택 또는 비상 상황에서 사용되는 단기-지속시간 약물일 수 있음이 고려되고, 이는 부상에 대한 증식성 혈관 반응의 유해한 혈류역학 부작용 또는 악화의 유발 없이 fXa 저해제의 종래의 항응고제 특성을 안전하게 및 특이적으로 중화시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료" 등등은 원하는 약리학적 및/또는 생리적 효과 수득을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 효과는 이들의 장애 또는 징후 또는 증상의 완전히 또는 부분적으로 방지에 관하여 예방적일 수 있고, 및/또는 장애 및/또는 장애에 기인하는 역효과에 대하여 부분 또는 완벽한 치유에 관하여 치료적일 수 있다.
"치료하는"은 포유동물에서 장애의 임의의 치료를 또한 포괄하고, 하기를 포함한다: (a) 장애에 취약할 수 있는, 그러나, 예를 들면, 항응고제 과투약의 환자에서 출혈을 방지하는 것으로 아직 진단되지 않을 수 있는 대상체에서 발생으로부터 장애 방지; (b) 장애 제어, 즉, 그의 발달 저지, 예를 들면, 출혈 저해; 또는 (c) 장애의 경감 또는 완화, 예를 들면, 출혈 감소.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는" 것은 추가로 병리학과 관련된 증상의 전신 완화 및/또는 증상 개시의 지연을 포함한다. "치료"의 임상 및 하위-임상 증거는 병리학, 개체 및 치료에 따라 다양할 것이다.
"투여"는 치료의 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 영향받을 수 있다. 가장 유효한 수단 및 투여의 복용량 걸정의 방법은 당해 분야의 숙련가에 공지되고 요법에 사용된 조성물, 요법의 목적, 치료되는 표적 세포, 및 치료될 대상체에 따라 다양할 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적합한 복용량 제형 및 제제의 투여 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 진단 또는 치료의 "대상체"는 인간을 포함하여 세포 또는 포유동물이다. 진단 또는 치료 처리되는 비-인간 동물은, 예를 들어, 쥣과, 예컨대 랫트, 마우스, 갯과, 예컨대 개, 토낏과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물, 및 애완동물을 포함한다.
본 개시내용의 제제 및 조성물은 약제학적 조성물에서 종래의 절차에 따른, 예컨대 활성 성분의 투여에 의해 인간 및 다른 동물의 치료를 위하여 및 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 제제는 임의의 적합한 경로로, 특이적으로 친계 (피하, 근육내, 정맥내 및 진피내 포함) 투여로 요법을 위하여 투여될 수 있다. 바람직한 경로가 수령체의 상태 및 연령, 그리고 치료받는 질환에 따라 다양할 것임이 또한 인정될 것이다.
어구 "약학적으로 허용가능한 폴리머"는 본원에서 기재된 하나 이상의 폴리펩타이드에 콘주게이션될 수 있는 화합물의 그룹을 지칭한다. 폴리펩타이드에 폴리머의 콘주게이션이 생체내 및 시험관내 폴리펩타이드의 반감기를 확대할 수 있다는 것이 고려된다. 비-제한 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 셀룰로오스 유도체, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 당, 폴리올 및 이들의 혼합물을 포함한다.
"항응고제 제제" 또는 "항응고제"는 응혈 형성을 저해하는 제제이다. 항응고제 제제의 예는, 비제한적으로, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa 또는 인자 VIIa, 헤파린 및 유도체, 비타민 K 길항제, 및 항-조직 인자 항체의 특이적 저해제를 포함한다. 트롬빈의 특이적 저해제의 예는 히루딘, 바이발리루딘 (Angiomax®), 아르가트로반 및 레피루딘 (Refludan®)을 포함한다. 헤파린 및 유도체의 예는 미분획화 헤파린 (UFH), 낮은 분자량 헤파린 (LMWH), 예컨대 에녹사파린 (Lovenox®), 달테파린 (Fragmin®), 및 다나파로이드 (Orgaran®); 및 합성 펜타사카라이드, 예컨대 폰다파리눅스 (Arixtra®)를 포함한다. 비타민 K 길항제의 예는 와파린 (Coumadin®), 페노코우마롤, 아세노쿠마롤 (Sintrom®), 클로린디온, 디쿠마롤, 디페나디온, 에틸 비스코움아세테이트, 펜프로쿠몬, 펜인디온, 및 티오클로마롤을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항응고제는 인자 Xa의 저해제이다. 하나의 구현예에서, 항응고제는 베트릭사반이다.
"항응고제 요법"은 원하지 않는 응혈 또는 혈전증을 예방하기 위해 환자에 투여되는 치료법을 지칭한다. 항응고제 요법은 환자에서 원하지 않는 응혈 또는 혈전증의 치료 또는 예방에 적합한 복용량 및 계획으로 2 이상의 항응고제 제제 또는 다른 제제의 하나 또는 조합의 투여를 포함한다.
용어 "인자 Xa 저해제" 또는 "인자 Xa의 저해제"는 시험관내 및/또는 생체내 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환 촉진의 응고 인자 Xa의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 저해할 수 있는 화합물을 지칭한다.
"직접적인 인자 Xa 저해제"는 fXa에 직접적으로 결합하고 비-제한 예는 하기를 포함한다: NAP-5, rNAPc2, 조직 인자 경로 저해제 (TFPI), DX- DX-9065a (예를 들면, 하기에 기재됨: Herbert, J.M., 등, J Pharmacol Exp Ther. 1996 276(3):1030-8), YM-60828 (예를 들면, 하기에 기재됨: Taniuchi, Y., 등, Thromb Haemost.1998 79(3):543-8), YM-150 (예를 들면, 하기에 기재됨: Eriksson, B.I. 등, Blood 2005;106(11), Abstract 1865), 아픽사반, 리바록사반, TAK-442, PD-348292 (예를 들면, 하기에 기재됨: Pipeline Insight:Antithrombotics - Reaching Untreated Prophylaxis Market, 2007), 오타믹사반, 에독사반 (예를 들면, 하기에 기재됨: Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9):778-783), LY517717 (예를 들면, 하기에 기재됨: Agnelli, G., 등, J.Thromb. Haemost. 2007 5(4):746-53), GSK913893, 라작사반, 베트릭사반 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이들의 조합. 하나의 특정 측면에서, 직접적인 인자 Xa 저해제는 리바록사반이다. 일부 측면에서, 직접적인 fXa 저해제는 소분자 화학적 화합물이다.
fXa 활성의 "간접적인 인자 Xa 저해제'" 저해는 하나 이상의 다른 인자에 의해 매개된다. 간접적인 인자 Xa 저해제의 비-제한 예는 폰다파리눅스, 이드라파리눅스, 바이오티닐화된 이드라파리눅스, 에녹사파린, 프라그민, 틴자파린, 낮은 분자량 헤파린 ("LMWH"), 및 이들의 조합을 포함한다. 하나의 특정 측면에서, 간접적인 인자 Xa 저해제는 에녹사파린이다.
하나의 구현예에서, 인자 Xa 저해제는 하기로부터 선택된다: 베트릭사반, 리바록사반, LMWH, DX-9065a, YM-60828, YM-150, PD-348292, 오타믹사반, 에독사반, LY517717, GSK913893, 라작사반, 아픽사반, 및 이들의 조합.
용어 "베트릭사반"은 화합물 "[2-({4-[(디메틸아미노)이미노메틸]페닐}카보닐아미노)-5-메톡시페닐]-N-(5-클로로(2-피리딜))카복사마이드" 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다. "[2-({4-[(디메틸아미노)이미노메틸]페닐}카보닐아미노)-5-메톡시페닐]-N-(5-클로로(2-피리딜))카복사마이드"는 하기 구조를 갖는 화합물을 지칭한다:
또는 호변이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
베트릭사반은 하기에 기재된다: U.S.특허 번호6,376,515 및 6,835,739 및 U.S.특허 출원 공개 번호2007/0112039 (2006년 11월 7일 출원) (이들의 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다). 베트릭사반은 인자 Xa의 특이적 저해제인 것으로 공지된다.
fXa의 저해제의 활성을 "중화하다", "가역하다" 또는 "반작용하다" 또는 유사한 어구는 fXa 저해제의 인자 Xa 저해성 또는 항응고성 기능을 저해 또는 차단하는 것을 지칭한다. 상기 어구는 기능의 부분 저해 또는 차단, 뿐만 아니라 시험관내 및/또는 생체내 대부분 또는 모든 fXa 저해제 활성의 저해 또는 차단을 지칭한다.
"유효한 양"은 원하는 생물학적 및/또는 치료적 결과를 유도하기에 충분한 유도체의 양을 지칭한다. 그 결과는 생물학적 시스템의 징후, 증상, 또는 질환의 원인, 또는 임의의 다른 원하는 변경의 완화일 수 있다. 본 개시내용에서, 결과는 전형적으로 하나 이상의 하기를 포함할 것이다: 환자에 투여되는 fXa 저해제의 중화, fXa 저해제의 항응고제 활성의 가역, 플라즈마로부터 fXa 저해제의 제거, 지혈의 회복, 및 출혈의 감소 또는 중단. 유효한 양은 사용된 특이적 해독제 제제, 상기 대상체에 투여되는 특이적 fXa 저해제, fXa 저해제의 투약 레지멘, 해독제의 투여 타이밍, 치료받는 상기 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여의 방식 등에 따라 다양할 것이고, 이들 모두는 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
특정 측면에서, 용액은 fXa 유도체 (예를 들면, r-해독제)의 양을 약 10 밀리그램 (mg) 내지 약 2 그램 (g) 전달하기 위해 투여된다. 사용된 r-해독제의 다른 양은 약 100 mg 내지 약 1.5 g; 약 200 mg 내지 약 1 g; 및 약 400 mg 내지 약 900 mg을 포함한다. 일부 측면에서, 사용된 r-해독제의 양은 약 400 mg 또는 960 mg이다. 일부 측면에서, 사용된 r-해독제의 양은 약 10 mg 내지 약 100 mg; 약 15 mg 내지 약 95 mg; 및 약 20 mg 내지 약 80 mg이다.
또 다른 구현예에서, 중화에서 투여된 용액은 적어도 약 30 분의 기간 동안 인자 Xa 저해제의 순환 농도에 대한 r-해독제의 순환 농도의 적어도 약 1:1 배 몰비인 양이다. 다른 구현예에서 몰비는 약 1:1 또는 약 2:1 또는 약 4:1이다.
투여된 경우 제형은 인자 Xa 저해제를 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 중화시킨다.
방법, 즉, 인자 Xa 저해제의 저해 또는 역전이 수많은 시험관내 검정, 예컨대 트롬빈 생성 검정, 및 임상 응고 검정 예컨대 aPTT, PT 및 ACT에 의해 달성되면, 결정할 수 있다.
본 개시내용의 하나의 측면은 동결건조된 제형의 유효량의 용액을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 fXa 저해제로 항응고제 요법을 받는 대상체에서 외인성으로 투여된 fXa 저해제를 선택적으로 결합 및 저해하는 방법에 관한 것이다. 상기 요법에 적합한 환자는 사전 항응고제 요법을 받고, 예를 들어, 이들은 하나, 또는 그 이상의 항응고제, 예컨대 fXa의 직접적인 또는 간접적인 저해제가 투여된다.
일부 구현예에서, 용액은 fXa 저해제의 과용량의 투여 이후 또는 수술에 앞서 투여되고, 이는 출혈의 위험에 대상체를 노출시킬 수 있다. 상기 대상체는 세포 또는 포유동물, 예컨대 인간일 수 있다.
또 다른 측면에서 방법은 상기 대상체에게 동결건조된 제형의 용액 투여를 포함하는 인자 Xa 저해제로 항응고제 요법을 받는 대상체에서 외인성으로 투여된 인자 Xa 저해제를 선택적으로 결합 및 저해하는 것을 본원에서 제공한다. 상기 대상체는 세포 또는 포유동물, 예컨대 인간일 수 있다.
본원에서 기재된 용해된 동결건조된 제형의 투여로부터 이로울 대상체 및 동반하는 방법은 임상 주요 출혈 사례 또는 임상적으로 유의미한 비-주요 출혈 사례를 경험하는, 또는 이에 취약한 것을 포함한다. 임상 주요 출혈 사례의 예는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 출혈, 생명유지에 필요한 기관으로의 출혈, 재-수술 또는 신규 치료적 절차가 필요한 출혈, 및 관련된 공공 출혈과 ≥ 2.0의 출혈 지수(Turpie AGG, 등, NEJM, 2001, 344:619-625.). 추가로, 상기 대상체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 비-주요 출혈 사례를 경험할 수 있거나 또는 이에 취약할 수 있다: 지속적 또는 반복되는 및 실질적인 양인 또는 개입 없이 멈추지 않을 비출혈, 치료적 절차가 필요한 수준까지 발생하지 않는 직장 또는 요로 출혈, 자발적인 또는 사소한 트라우마로 발생하는 주사 부위 또는 다른 곳에서 실질적인 혈종, 배출이 필요 없는 수술 과정과 보통 관련된 이상의 실질적인 혈액 손실, 및 비계획된 수혈이 필요한 출혈.
일부 구현예에서, 용해된 동결건조된 제형은 fXa 저해제의 과용량의 투여 이후 또는 수술에 앞서 투여되고, 이는 출혈의 위험에 대상체를 노출시킬 수 있다.
본원에서 기재된 임의의 방법에서, 심지어 항상 명백하게 언급되지 않아도, 유효량의 용해된 동결건조된 제형이 상기 대상체에게 투여되는 것이 이해되어야 한다. 양은 치료 의사에 의해 실험적으로 결정될 수 있고 대상체의 연령, 성별, 중량 및 건강에 따라 다양할 것이다. 치료 의사에 의해 고려되는 추가의 인자는, 투여될 수 있는, 인자 Xa 저해제의 동일성 및/또는 양, 동결건조된 제형이 상기 대상체에게에 투여될 방법 또는 방식, 및 환자에 대한 치료적 말단 지점을 비제한적으로 포함한다. 이들 변수를 고려하여, 기술 중 하나는 치료받는 상기 대상체에게 치료적으로 유효한 양을 투여할 것이다.
실시예
개시내용은, 개시내용의 순수하게 예시적이도록 의도되는, 하기 실시예를 참고로 추가로 이해된다. 본 개시내용은 예시된 구현예에 의해 범위가 제한되지 않고, 단지 개시내용의 단일 측면의 실례로서 의도된다. 기능적으로 등가물인 임의의 방법은 개시내용의 범위내이다. 본 명세서에서 기재된 것에 더하여 개시내용의 다양한 변형은 이전의 설명 및 수반하는 도면으로부터 당해 분야의 숙련가에 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 해당한다.
다르게 언급되지 않는 한 모든 온도는 섭씨 온도이다. 또한, 이들 실시예 및 다른 곳에서, 약어는 하기 의미를 갖는다:
실시예 1. r-해독제의 제조
(NaCl로 조정된) 0.15의 이온 강도를 갖는 시트레이트-포스페이트 (20 mM) 버퍼는 하기를 이용하여 제조되었고: 시트르산 1수화물 (Fisher, Pittsburgh, PA) 및 나트륨 포스페이트 2염기성, 무수물 (Sigma, St. Louis, MO) 그리고 pH는 6 M HCl 또는 6 M NaOH를 이용하여 조정되었다. 추가의 염 없이 포스페이트 (20 mM) 버퍼는 2.0 L의 Mili-Q 물 및 7.5까지 조정된 pH에서 6.61 g의 나트륨 포스페이트 2염기성 무수물을 용해시킴으로써 제조되었다. 염 (I=0.15 M)을 함유한 포스페이트 (20 mM) 버퍼에 대하여, 14.8 g NaCl은 상기 기재된 포스페이트 버퍼에 부가되었다. 모든 다른 시약은 다르게 지적되지 않는 한 하기로부터 구매되었다: Sigma (St. Louis, MO).
r-해독제의 폴리펩타이드 (서열식별번호. 3)는 10 mM 트리스내 대략 5 mg/ml의 농도, 2% 아르기닌을 함유한 pH 8.0의 원액에 보관되었다. r-해독제의 투석은 선택된 pH 값의 시트레이트-포스페이트 버퍼에 대해 Slide-A-Lyzer® 투석 카세트, 3000 MWCO (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 4 ℃에서 수행되었다. 투석 동안 응집을 방지하기 위해, 단백질 원액은 카세트에 부하에 앞서 여과된 투석 버퍼로 0.5 mg/ml까지 희석되었다. 투석 이후, r-해독제는 0.3 mg/ml까지 희석되었고 단백질 농도는 1.16 mlㆍmg-1ㆍcm-1의 소멸 계수를 이용하여 UV 흡광도 분광법 (A280)로 측정되었다. 상기 방법으로 생산된 r-해독제는 하기 실시예에서 사용되었다.
실시예 2. 안정성 모니터링을 위한 시차주사열량계 (DSC)
시차주사열량계 (DSC)는 온도 제어된 샘플 부하 챔버가 있는 Microcal 모세관 오토-DSC를 이용하여 수행되었다. 열적 램프는 60 ℃/hr의 스캐닝 속도 및 25 분 사전-스캐닝 평형 기간으로 6-100 ℃에서 수행되었다. 적절한 매칭 버퍼는 참조 세포에서 사용되었고, 반면에 매칭 버퍼에서 전형적인 샘플 농도는 ~0.6 mg/mL이었다. 버퍼 대 버퍼 참조 스캔은 모든 샘플 스캔으로부터 공제되었고 온도기록도는 분석에 앞서 정규화된 농도이었다. 데이터는 Microcal로부터 공급된 소프트웨어를 이용하여 가공되었다. 흡열 피크는 비 2-상태 적합화 함수를 이용하여 단일 피크로 맞춰졌고, 전이 온도 (Tm) 값은 적합화 함수에 의해 계산되었다. 개시 온도 (Tonset) 값은 낮은 온도 기준선으로부터 흡열 피크의 편차에 의해 결정되었다.
DLS는 이종 샘플에서 다중 집단의 존재를 보여주기 위해 종종 이용된다. Wyatt 플레이트 리더 DLS 기기를 이용하여, 상이한 pH 조건 10-20 μL의 단백질 용액 (0.3 mg/mL)은 20 ℃에서 실험의 단일 세트에서 측정되었다. 샘플은 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리되어 임의의 기포를 제거하였고, 20 초 각각의 5 스캔은 획득되어 평균 샘플 반경을 제공하였다. pH 5.0-7.5에서, 유체역학적 반경 ~3 nm의 단일 집단은 관측되었다.
실시예 3. 안정제의 확인
실시예 2로부터 데이터는 r-해독제가 pH 7.5에서 전반적으로 안정하였음을 입증하였다. 따라서, 부형제 스크리닝 연구는 20 mM 포스페이트 버퍼내 pH 7.5에서 수행되었다. 단백질의 유체역학적 직경은 Dynapro 동적 광 산란 플레이트 리더 기기 (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)를 이용하여 측정되었다. 유체역학적 직경은 누적률의 방법 (로그 정규 수 기반)을 이용한 Stokes-Einstein 방정식으로 확산 계수로부터 계산되었다. 측정은 공급된 샘플의 균질성을 평가하기 위해 사용되었다.
SpectraMax M3 플레이트 리더는 부형제와 또는 없이 0.3 mg/ml 단백질로 60 ℃, pH 7.5에서 단백질 응집 동력학 모니터링에 의해 잠재적 안정성 부형제를 확인하기 위해 먼저 이용되었다. 전체로, Generally-Regarded-As-Safe (GRAS) 부형제의 라이브러리로부터 32 부형제는 표 4.1에 열거된 바와 같이 시험되었다.
표 4.1 OD 350 nm 동력학 연구에 의해 시험된 부형제 목록 및 농도
시험된 부형제, 수크로오스, 소르비톨 및 시트레이트가 최대 안정화 효과를 가졌다는 것이 결정되었다. 단백질 안정성에 관한 부형제 조합의 효과의 후속의 시험은 표 4.2에 요약된 바와 같이 이들 3 부형제에 기반되었다. OD 350 nm 용융물은 반복하여 실시되었고 각 제형에 대한 ΔT 값은 상기에서 기재된 바와 같이 계산되었다. 표 2에서 보여준 ΔT 값에 기반하여, 제형 3, 4, 5 및 6은 최대 안정화 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
표 4.2 시험된 부형제 조합의 목록 및 상응하는 ΔT 값 및 용액 오스몰농도
이들 제형에서 치료적 단백질의 응집 특성은 이들 조합 제형에서 NaCl 없이 pH 7.5에서 20 mM 포스페이트 버퍼내 OD 350 nm 용융 방법을 이용하여 추가로 연구되었다. 일반적으로, 응집의 정도는 NaCl 없이 훨씬 더 낮다. 사실상, OD 350 nm 용융은 초기에 35 - 75 ℃에서 실시되었고, 및 명백한 응집이 관측되지 않았기 때문에, 용융 실험은 75 내지 100 ℃에서 동일한 샘플로 재-실시되었다. 따라서, 파괴는 상기 온도에서 ~ 10 min 잔류 때문에 75 ℃에서 OD 350 nm 곡선으로 관측될 수 있다. 명백한 응집은 심지어 최대 100 ℃ 램핑 이후 제형 3, 4, 5 및 6에서 단백질에 대하여 관측되지 않았다. 추가의 NaCl 제거의 또 다른 이점은 제형의 상응하는 오스몰농도가 NaCl이 있는 제형과 비교되어 훨씬 더 낮다는 것이다.
실시예 4. 용해도 시험
상기 실시예는 pH, 온도, 안정제 (예를 들면, 시트레이트, 아르기닌, 글리신, 및 라이신) 및 r-해독제의 용해도에 관한 이온 강도의 효과를 시험한다.
물질 & 방법
사용된 물질은 10 mM 트리스 pH8.0내 r-해독제 (4.8 mg/ml), 및 2% 아르기닌의 용액이었다. 실온 (RT)에서 용해도에 대하여, 시험은 적어도 1-2 시간 동안 물리적 관찰에 의해 수행되었다. 5 ℃에서 용해도에 대하여, 샘플은 5 ℃에서 밤새 평형화되었고 물리적 관찰은 샘플상에서 수행되었다. 또한, 샘플은 5 ℃에서 15분 동안 원심분리되었고 상청액에서 단백질 농도는 UV A280 nm (이중 희석)에 의해 분석되었다. 최초 원액은 매일 대조군으로서 분석되었다.
단백질 침전이 관측된 경우, 상청액 농도로부터 결정된 용해도는 <XX mg/mL (상응하는 도에서 그늘진 바)로서 해석되었다. 이는 단백질 존재의 과잉량 및 버퍼 pH에 근접한 PI를 갖는 단백질의 하위-집단의 우선적인 침전 때문이다. 단백질 침전이 관측되지 않는 경우, 용액 농도로부터 결정된 용해도는 > XX mg/mL (도에서 비어있는 바)로서 해석되었다.
실온에서 용해도에 관한 pH의 영향은 5.0, 6.0, 7.0 및 8.0을 포함하여 상이한 pH로 시험되었다. 도 1A에서 보이는 바와 같이, r-해독제는 pH 8.0 (가시적인 침전 없이 42.2 mg/mL)에서 최고 용해도를 가졌다. 반대로, 용해도는 pH 5.0, 6.0 및 7.0, 각각에서 3.5 mg/mL (침전 없음), 12.3 mg/mL (침전 관측됨) 및 24.4 mg/mL (침전 관측됨)이었다.
표 5.1은 5 ℃에서 용해도에 대하여 시험된 샘플을 열거한다. 보이는 바와 같이, UF 버퍼는 42 mM MES, 4 mM 나트륨 포스페이트, 833 mM NaCl, 8 mM 트리스, 및 ~5 mg/mL까지 농축된 58 mM 아르기닌으로 구성된다.
표 5.1 상이한 가용화제 (시트레이트 또는 아르기닌)으로 상이한 pH에서 r-해독제 용해도에 대하여 시험된 샘플
pH 7.3에서, 10 mM 시트레이트는 해독제 5 ℃ 용해도를 약간 개선하였다. 시트레이트 또는 아르기닌 없이, 5 ℃ 용해도는 하기 등급 순서를 가졌다: pH 7.55 > pH 7.80 > pH 7.30 (도 1B). UF 버퍼 (pH 7.48)는 적합한 pH, 7.5에서 58 mM Arg+833 mM NaCl의 존재 때문처럼 최상의 용해도 (50 mg/mL)를 갖는 것으로 보여졌다 (도 1B).
표 5.2는 pH 7.55에서 아르기닌 대 시트레이트의 효과 시험에 대한 샘플을 열거한다. 도 1C에서 보이는 바와 같이, pH 7.55에서, 모든 시트레이트 및 아르기닌은 r-해독제 5 ℃ 용해도를 유의미하게 개선하였다. 추가로, 시트레이트가 동일한 몰농도에서 아르기닌보다 더 효과적인 것으로 보여졌다: -10 mM 시트레이트 ~ 50 mM 아르기닌 > 20 mM 아르기닌 > 10 mM 아르기닌.
표 5.2 pH 7.55에서 시트레이트 및 아르기닌내 r-해독제 용해도에 대하여 시험된 샘플
아르기닌 대 시트레이트의 효과는 표 5.3에서 샘플을 이용하여 pH 7.8 및 8.0에서 추가로 시험되었다. 도 1D는 r-해독제가 5 ℃에서 pH 7.8보다 pH 8.0에서 약간 더 가용성이었음을 보여준다. 모든 10 mM 시트레이트 및 20 mM 아르기닌(Argnine)은 pH 7.8 및 8.0에서 적어도 15 mg/mL까지 용해도를 개선하였다.
표 5.3 pH 7.8 및 8에서 시트레이트 및 아르기닌내 r-해독제 용해도에 대하여 시험된 샘플
아르기닌의 효과는 pH 7.8 (표 5.4)에서 글리신 및 라이신과 또한 비교되었고 이 결과는 도 1E에서 보여진다. 도에서 보여지는 바와 같이, 글리신 및 라이신은 5 ℃에서 r-해독제 용해도에 관한 효과를 갖지 않았고 5 ℃에서 pH 8.0 대 pH 7.55에서 20 mM Arg에 대하여 더욱 가용화 효과가 관측되었다.
표 5.4 pH 7.8에서 글리신, 라이신 및 아르기닌내 r-해독제 용해도에 대하여 시험된 샘플
r-해독제의 용해도에 관한 이온 강도의 효과는 또한 시험되었다 (표 5.5). 도 1F에서 보이는 바와 같이, 이온 강도는 아르기닌 또는 시트레이트의 부재하에 5 ℃에서 r-해독제 용해도를 증가하였고, 효과는 이온 강도 > 0.10 M에서 두드러지게 나타났다.
표 5.5 pH 7.8에서 상이한 이온 강도에서 r-해독제 용해도에 대하여 시험된 샘플
요약하면, 상기 실시예는 실온에서 가용화제 예컨대 아르기닌 및 시트레이트의 부재하에 r-해독제가 pH 8.0에서 최고 용해도를 갖는다는 것을 입증한다. 5 ℃에서, pH 8.0은 r-해독제에 대하여 최상이었다. 추가로, 모든 시트레이트 및 아르기닌은 r-해독제의 5 ℃ 용해도를 유의미하게 개선한다. 글리신 및 라이신 이 둘 모두는 r-해독제에 대하여 Tm을 증가시키지만, 그러나, 용해도에 관한 효과는 없다. 전반적으로, 5 ℃에서 r-해독제의 최고 용해도는 pH 7.8에서 95 mM 아르기닌으로 달성되었다. 침전은 10 일 후에 관측되지 않았다.
실시예 5. 초기 동결건조 공정
동결건조 공정은 동결건조 사이클의 상이한 단계에서 제형 구성요소의 물리적 성질의 이해에 기반된 합리적인 접근법을 이용하여 개발되었다. DSC 및 냉동 건조 현미경검사 (FDM)를 포함한 열적 특성규명 방법은 Tg' (냉동된 농축물의 유리전이온도) 및 Tc (1차 건조 동안 붕괴 온도)를 측정하기 위해 사용되었다. 표 6에서 보이는 사이클은 동결건조된 제형의 동결건조를 위하여 선택되었다. 어닐링 단계는 생성물 온도가 1차 건조 동안 붕괴 온도 아래로 떨어지지 않는 것을 확인하기 위해 만니콜의 결정화를 허용한다. 1차 건조 온도는 1차 건조의 합리적인 지속시간으로 케이크 붕괴를 피하기 위해 선택되었다. 2-단계 2차 건조 조건은 <1%의 수분 수준으로 동결건조된 제형을 생산하기 위해 개발되었다.
표 6. 동결건조 사이클
실시예 6. 결정화 구성요소 없이 동결건조
실험적인/연구 설계
10개의 상이한 제형은 버퍼 조성물, pH, 안정제, 및 용해도에 관한 약물 농도 및 r-해독제의 안정성의 효과를 시험하기 위해 제조되었다 (표 7). 제형은 pH 7.8 및 8.2에서 트리스 또는 포스페이트 버퍼를 이용하여 제조되었다. 용액은 원심 여과를 이용하여 10 mg/mL 및 25 mg/mL까지 농축되었다.
트리스 또는 포스페이트 버퍼에서 제조된 농축된 용액의 샘플은 2 주 동안 2-8 ℃ 및 25 ℃에서 단기 안정성있게 배치되었다. 동시에, 각 용액의 샘플은 냉동/해동 연구에 사용되었고 침전 및 응집에 대하여 조사되었다. 냉동/해동 연구용 샘플은 2 mL, 유형 I, 유리 튜우빙 바이알에서 0.5 mL의 각 제형으로 이루어졌다. 0.5 mL 샘플은 냉동에 앞서 및 각 냉동/해동 사이클 이후 시각적으로 점검되었다. 각 샘플은 -80 ℃에서 대략 2 시간 동안 배치되었고, 대략 15 내지 30 분 동안 실온에서 해동되었고, 대략 1-2 분 동안 시각적으로 점검되었고, -80 ℃ 냉동고에 다시 넣었다. 각 제형의 250 L 샘플은 제3 냉동 사이클 이후 제거되었고 검정을 위하여 실험실에 제출되었다. 잔여 용액은 2개의 추가 냉동 사이클 처리되었고 그 다음 검정을 위하여 실험실에 제출되었다.
모든 잔류 용액은 보존적 사이클을 이용하여 0.25 mL 샘플로서 동결건조되었고 샘플은 25 ℃ 및 40 ℃에서 가속화된 안정성으로 배치되었다.
2개의 추가 제형은 폴리소르베이트-없는 용액을 이용하여 제조되어 보호성 제제의 존재 없이 분자 상에서 냉동/해동 및 동결건조의 효과를 시험하였다 (표 7에서 제형 5 및 6). 용액의 샘플은 준비되었고 조절된 DSC 및 냉동 건조 현미경검사를 이용하여 열적 특성규명에 사용되었다.
표 7. 제형 수, 구성요소, 농도, 및 pH 값
제형은 폴리소르베이트 80 (PS80) 있거나 없이 3 mg/mL, 3.3 mg/mL, 및 4.8 mg/mL에서 공급된 벌크단위 약물질을 이용하여 제조되었다.
제형 5 및 6은 각 제형에 대하여 벌크 약물 용액의 19 mL를 이용하여 먼저 제조되었다. 벌크의 용적은 10 K 막을 갖는 투석 카세트에 배치되었고 카세트는 pH 7.8에서 10 mM 트리스 또는 10 mM 나트륨 포스페이트 버퍼의 2 L에 배치되었다. 용액은 대략 2 시간 동안 투석하였고, 투석 용액은 또 다른 신선한 2 L의 버퍼 용액으로 대체되었고 적어도 또 다른 2 시간 동안 투석되었다. 용액은 각 카세트로부터 제거되었고 Amicon Ultra Ultracel 10K 원심 필터 튜브에 배치되었다. 용액은 대략 30 분 동안 3/4 속도로 원심분리되었다. 잔여 용액은 원심관으로부터 제거되었고 95 mM 아르기닌은 부가되었고 그 다음 농축된 용액의 pH 및 용적을 조정하였다.
동일한 절차가 사용되어 제형 1A 내지 4A 및 1B 내지 4B를 제조하였다. 3 mg/mL로 벌크 용액을 이용하여 제조된 제형은 13.5 mL의 벌크를 사용하여 10 mg/mL 용액을 제조하였고 33.5 mL의 벌크를 사용하여 25 mg/mL 용액을 제조하였다. 4.8 mg/mL 벌크 용액을 사용한 제형은 8.4 mL의 벌크를 사용하여 10 mg/mL 용액을 제조하였고 20.9 mL의 벌크를 사용하여 25 mg/mL 용액을 제조하였다.
샘플 용액의 최종 용적에 필요한 수크로오스 및 아르기닌의 농도는 용액의 농축 이후 벌크 용액에 부가되었고 그 다음 용액은 적절한 pH 및 최종 용적으로 조정되었다. PS80은 최종 샘플 용액에 스파이킹되어 PS80의 1% 용액을 이용하여 0.01%의 농도를 창출하였다.
용액은 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과되었고 바이알로 분할되었다. 2 mL 바이알 각각은 250 L의 용액으로 충전되었고 하기 조건을 이용하여 동결건조되었다:
1. -40 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각
2. -40 ℃에서 1시간 동안 유지 그 다음 100 mTorr에서 진공 시작
3. -35 ℃까지 0.5 ℃/min으로 램프 및 Pirani 게이지 측정이 100 mTorr의 커패시턴스 마노미터 측정을 매칭시키고 생성물 온도가 선반 온도를 달성할 때까지 유지.
4. 20 ℃까지 0.5 ℃/min으로 램프 및 Pirani 게이지 측정이 100 mTorr의 커패시턴스 마노미터 측정을 매칭시키고 생성물 온도가 선반 온도를 달성할 때가지 유지.
스토퍼는 고정되었고 바이알은 동결건조 이후 캡핑되었다. 샘플은 초기 시점 (T0) 시험을 위하여 제출되었고 잔여 바이알은 안정성 있게 배치되었다.
조절된 시차주사열량계 (DSC)
용액 샘플의 열적 행동은 조절된 및 표준 DSC를 이용하여 조사되었다. 샘플은 Tzero 팬에 12 L의 용액의 배치 및 용융밀봉으로 조사되었다. 용액은 -40 ℃까지 1 ℃ / min으로 냉각되었고 5 분 동안 등온으로 유지되었다. 샘플의 온도는 10 ℃까지 0.5 ℃/min으로 매 120 초 1 ℃의 조절로 램프되었다. 일부 샘플은 어닐링 단계를 이용하여 조사되었다. 상기 샘플은 -40 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각, 5분 동안 등온으로 유지, -15 ℃ 또는 -20 ℃까지 1 내지 5 ℃/min으로 온도 램핑 및 적어도 60 분 동안 등온으로 유지에 의해 조사되었다. 샘플의 온도는 -40 ℃까지 5 ℃/min으로 되돌려졌고, 5분 동안 등온으로 유지되었고, 0.5 ℃/min으로 매 120 초 1 ℃의 조절로 램프되었다.
냉동-건조 현미경검사
샘플은 Linkam 냉동-건조 현미경 단계에서 2 유리 커서슬립 사이에 2 내지 4 L의 용액을 배치함으로써 냉동-건조 현미경검사를 이용하여 조사되었다. 샘플은 -40 ℃이하까지 1 ℃/min으로 냉각되었고 2 min 동안 등온으로 유지되었다. 진공은 100 마이크론에서 개시되었고 샘플은 편광 현미경 상에서 실장된 비디오 카메라를 이용하여 시각적으로 조사되었다. 샘플은 건조된 물질이 가시적이었고 촬영될 때까지 그 온도에서 냉동 건조되었다. 그 후, 샘플의 온도는 2 ℃ 증분으로 증가되었고 각 온도에서 유지되어 냉동 건조된 샘플을 관찰하였다. 샘플의 온도는 완벽한 붕괴가 관측될 때까지 증가되었다.
분석 방법
A. UV-Vis에 의한 농도
용액의 농도는 Nano 드롭 2000 분광측정기 (Thermo Scientific)를 이용하여 측정되었다. 스캔은 시험 플랫폼 상에 2 L의 용액을 배치시키고 280 nm의 범위에서 스캐닝함으로써 수행되었다.
B. pH
용액의 pH는 Orion pH 미터 모델 920A를 이용하여 측정되었다. 미터 / 프로브는 Thermo Scientific으로부터 구매된 미리 만들어진 버퍼 용액을 이용하여 pH 7 내지 pH 10의 범위로 보정되었다.
C.SEC-HPLC
크기 배제 HPLC 분석은 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 이용하여 수행되었다. pH 7.4에서 0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.75 M 아르기닌 하이드로클로라이드로 제조된 이동상은 분리에 사용되었다. 사용된 분석적 칼럼은 YMC-팩 디올-200, 300 x 4.6 mm, 5 μm 평균 입자 크기이었다. 칼럼을 포함한, HPLC 시스템의 적합성은 참조 물질의 6개 복제 주사를 이용하여 확인되었고 주요 단백질 피크에 대한 체류 시간, 면적, 및 퍼센트 면적에 대하여 평가되었다. 추가로, 겔 여과 표준이 사용되어 칼럼의 분리 능력을 평가하였다. 샘플은 제형 버퍼를 이용하여 1 mg/mL 단백질로 희석되었고 주사되어 주사 당 50 μg의 단백질 부하의 칼럼을 수득하였다.
D. RP-HPLC
역상 HPLC 분석은 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 이용하여 수행되었다. 방법은 HPLC 등급 물내 0.1% 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴내 0.08% 트리플루오로아세트산으로 제조된 이동상을 이용한 분리용 구배를 사용한다. 사용된 분석적 칼럼은 Vydac C18 칼럼, 150 x 4.6 mm, 5 μm 평균 입자 크기이었다. 칼럼을 포함한 HPLC 시스템의 적합성은 참조 물질의 6개 복제 주사 및 주요 단백질 피크의 체류 시간, 면적, 및 퍼센트 면적의 평가를 이용하여 확인되었다. 샘플은 제형 버퍼를 이용하여 1 mg/mL 단백질로 희석되었고 주사되어 25 μg의 단백질/주사 부하의 칼럼을 수득하였다.
E. IEX
이온 교환 HPLC 분석은 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 이용하여 수행되었다. 방법은 pH 6.5에서 20 mM 나트륨 포스페이트 및 pH 6.5에서 20 mM 나트륨 포스페이트, 1 M 염화나트륨으로 제조된 이동상을 이용한 구배를 사용한다. 사용된 분석적 칼럼은 Dionex Propac WCX-10, 250 x 4 mm이었다. 칼럼을 포함한 HPLC 시스템의 적합성은 참조 물질의 6개 복제 주사 및 피크 #2로서 표지된 피크에 대한 체류 시간, 면적, 및 퍼센트 면적의 평가를 이용하여 확인되었다. 샘플은 제형 버퍼를 이용하여 1 mg/mL 단백질로 희석되었고 주사되어 주사 당 50 μg의 단백질 부하의 칼럼을 수득하였다.
결과:
용액 샘플의 서브셋은 보존적 사이클을 이용하여 동결건조되었고 25 ℃ 및 40 ℃에서 2 개월 동안 안정성있게 배치되었다. 동결건조 사이클은 낮은 충전 용적 때문에 대략 20 시간 내에 완료되었다. 모든 동결건조된 케이크는 가능하게는 필터 인열 때문에 제형 2A를 제외하고 허용가능하게 보여졌다.
일반적으로, SEC 및 RP를 이용하여 수득된 데이터는 제형 사이에서 차이를 식별하기 위해 보여졌다. 이는 방법이 안정성 표시이고 샘플 비교에 사용될 수 있음을 제안한다. 데이터는 r-해독제의 안정성이 pH에 의해 영향을 받음을 지지한다. 데이터는 pH 7.8에서 제조된 제형의 안정성이 pH 8.2에서 제조된 제형의 안정성보다 더 양호함을 입증한다. 이는 40 ℃에서 보관된 샘플에 특히 사실이다.
상기 연구는 r-해독제의 안정성에 관한 버퍼 유형의 비교를 포함하였다. 버퍼는 pH 7.8 및 8.2에서 제조된 트리스 및 포스페이트를 포함하였다. 데이터는 버퍼 유형이 r-해독제의 안정성에 영향을 미치지 않음 및 안정성의 차이가 주로 pH의 함수이었음을 제안한다.
연구에서 2개의 제형 (제형 5 및 6)은 수크로오스 및 폴리소르베이트 80 없이 제조되었다. 수크로오스는 동결건조보호제로서 사용되고 폴리소르베이트 80은 바이알의 벽과의 상호작용 및 냉동 단계 동안 얼음과 상호작용 때문에 단백질의 응집을 방지하기 위해 사용된다. 보호제 없이 제조된 제형은 40 ℃에서 1개월의 보관 이후 SEC에 의해 결정된 바와 같이 퍼센트 응집물에서 증가를 나타냈다. 데이터는 제형에서 부형제에 대한 필요성을 지지하여 단백질의 안정성을 개선한다.
안정성 연구는 또한 동결건조된 샘플이 용액으로서 제조된 제형보다 더욱 안정함을 지지한다. 용액 샘플의 비교는 용액 샘플의 안정성이 더 높은 온도에서 보관된 경우보다 5 ℃에서 보관된 경우 더 양호함을 입증한다.
안정성 연구를 위한 샘플은 2 mL 바이알 당 0.25 mL를 이용하여 제조되었다. 붕괴는 샘플 2A에서 케이크를 지지하기 위해 존재한 불충분한 고형물이 있는 경우 단지 관측되었다. 모든 다른 샘플은 허용가능하게 보여지지만, 그러나 상기 낮은 충전 용적을 사용한 경우 케이크 수축의 정도를 결정하는 것이 실행가능하지 않았다. 열적 특성규명 연구는 안정성 연구와 동반하여 수행되어 전체 규모로 제형의 동결건조의 실행성을 결정하였다.
제형 5 및 6은 조절된 DSC를 이용하여 조사되었다. 모든 제형은 대략 25 mg/mL r-해독제 및 95 mM 아르기닌 HCl을 함유하지만, 그러나 제형 5는 10 mM 트리스로 제조되었고 제형 6은 10 mM 포스페이트로 제조되었다. 열적 사례는 총 열류, 비-가역성 열류, 또는 가역성 열류를 이용하여 관측된 경우 램프 가온 동안 관측되지 않았다. 총 열류 온도기록도는 모든 동력학적으로 관련된 사례 및 비-동력학적으로 관련된 사례를 보여줄 것이다. 비-가역성 열류 온도기록도는 동력학적으로 관련된 사례 예컨대 결정화를 보여줄 것이고 가역성 열류 온도기록도는 비-동력학적으로 관련된 사례 예컨대 유리전이를 보여줄 것이다. 관측가능한 사례의 부족은 구성요소의 농도가 충분한 세기의 신호를 생산하기에 너무 낮음을 제안할 수 있다.
냉동 건조 현미경검사 실험은 수행되어 붕괴 온도가 MDSC를 이용하여 결정된 Tg'에 대하여 관측된 결과와 매칭하는지를 결정하였다. 모든 샘플의 열적 행동이 유사한 것으로 기대되는 것은 모두가 유사한 농도에서 동일한 부형제를 가졌기 때문이다.
제형 5 및 6은 대략 25 mg/mL의 a r-해독제 농도로 제조되었고 모두 pH 7.8에서 95 mM 아르기닌을 함유하였다. 제형 사이에서 단지 차이는 버퍼이었다. 제형 5는 10 mM 트리스를 함유하였고 제형 6은 10 mM 포스페이트를 함유하였다. 제형 5는 -40 ℃에서 붕괴를 나타내었고 제형 6은 -39 ℃에서 붕괴를 나타내었다. 데이터는 생성물의 온도가 결정된 붕괴 온도 미만으로 유지될 필요가 있어서 허용가능한 동결건조된 샘플을 수득하는 것을 지지한다. 상기 낮은 생성물 온도의 유지는 실험실 또는 전체 규모 동결건조기에서 실행가능하지 않다.
동결건조된 제형에 대한 안정성 데이터가 허용가능하게 보여도, 열적 특성규명 데이터는 제형이 낮은 붕괴 온도 때문에 규모확대에 잘 받아들여지지 않았음을 입증하였다. MDSC 및 냉동 건조 현미경검사를 이용하여 수득된 열적 특성규명은 제형이 냉동 및 건조 이후 비정질로 잔류함 및 구성요소의 조합이 낮은 붕괴 온도를 초래함을 제안한다. 규모 확대에 잘 받아들이는 제형을 창출하기 위한 유일한 방식은 결정화 구성요소를 부가하여 냉동 건조 동안 및 이후 대신 비정질 물질을 유지할 수 있는 스캐폴드로서 작용하는 것이다. 약제학적 제형에 부가된 가장 흔한 결정화 구성요소는 만니톨이다. 모든 추가 제형 및 공정 개발 작업은 상이한 농도에서 만니톨의 부가를 조사하였다. 만니톨을 함유한 제형의 개발 및 제형에 대한 안정성 연구는 별도의 개발 보고서에 기재된다.
결론
버퍼 유형, pH, 안정제, 및 r-해독제의 안정성에 관한 단백질 농도의 효과는 용액 및 동결건조된 제형으로서 조사되었다. 용액 샘플은 5 ℃ 및 25 ℃에서 최대 2 주 동안 보관되었고 동결건조된 샘플은 25 ℃ 및 40 ℃에서 최대 2 개월 동안 보관되었다. 2 mL 바이알에서 0.25 mL로서 동결건조된 제형은 2 개월 후 허용가능한 안정성을 나타내었다. 그러나, 열적 특성규명 실험은 모든 제형이 -37 ℃ 이하의 붕괴 온도를 가졌고 규모 확대에 잘 받아들여지지 않았음을 입증하였다. 데이터는 결정화 구성요소가 붕괴를 방지하기 위해 및 더 높은 온도에서 동결건조를 허용하기 위해 제형에서 필요함을 제안한다.
실시예 7. 제형의 열적 행동 및 안정성에 관한 버퍼 유형 및 만니톨의 효과.
실시예 6으로부터 데이터는 결정화 구성요소가 냉동 건조 동안 붕괴를 방지하기 위해 r-해독제 제형에서 필요하였음을 제안하였다. 상기 실시예는 제형의 열적 행동 및 동결건조된 케이크 외관에 관해 만니톨 및 아르기닌 농도의 효과를 조사하였다. 2% 내지 4% 만니톨을 함유한 제형은 아르기닌의 농도 감소와 함께 조사되었다. 아르기닌은 농도가 47.5 mM 이하가 아니라면 만니톨의 결정화를 방지하였다. 연구는 10 mM 트리스, 10 mg/mL r-해독제, 45 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유한 제형이 허용가능한 외관, 및 물리적 및 화학적 안정성을 갖는 동결건조된 케이크를 초래하였음을 알아내었다. 동결건조 연구는 -25 ℃에서 3 시간 동안 어닐링 이후 -25 ℃의 1차 건조 선반 온도 이용을 지지하기 위해 데이터를 제공하였다. 2-단계 2차 건조 공정은1% 미만의 잔류 수분 값을 갖는 케이크를 초래한다.
실험/연구 설계
연구는 제형의 열적 행동을 동반하여 조사하도록 및 보존적 사이클을 이용하여 동결건조되었던 제형의 화학적 안정성을 비교하도록 설계되었다. 초기 제형은 pH 7.8에서 95 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 2% 만니톨, 및 10 mM 트리스 또는 10 mM 포스페이트 버퍼로 제조되었다. 제형은 10 또는 25 mg/mL에서 활성 성분을 또한 함유하였다 (표 8.1).
표 8.1 pH 7.8에서 만니톨로 제조된 초기 제형.
해동된 약물 용액의 분액은 3K 분자량 컷오프 (MWCO) 막을 가진 투석 카세트에 배치되었다. 카세트는 아르기닌, 수크로오스, 및 만니톨과 트리스 또는 포스페이트를 함유한 버퍼 용액에 배치되었다. 약물 용액을 함유한 각 카세트는 2L의 버퍼 용액에 배치되었고 4 시간 동안 투석되었다. 버퍼 용액은 2 시간 후에 재생되었고 용액은 또 다른 4 시간 동안 또는 밤새 2-8 ℃에서 투석되었다. 용액은 18G 니들을 갖는 BD 주사기를 이용하여 투석 카세트로부터 제거되었고 3K MWCO 막을 갖는 원심 여과 튜브에 배치되었다. 튜브는 대략 3000 RPM에서 20 내지 30 분 동안 원심분리되었고 용액의 농도는 NanoDrop 2000 분광측정기를 이용하여 체크되었다. 용액은 10 mg/mL 또는 25 mg/mL 초과로 농축되었고 적절한 버퍼 용액을 이용하여 적절한 농도로 희석되었고 폴리소르베이트 농도는 폴리소르베이트 80의 1% 용액을 이용하여 0.01%까지 조정되었다. 용액은 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과되었고 바이알 당 0.25 mL 및 0.8 mL로 3 mL 유리, 튜우빙 바이알에 충전되었다. 용액은 보존적 사이클 (표 8.2)을 이용하여 냉동 건조되었고 25 ℃ 및 40 ℃에서 최대 2 개월 동안 안정성있게 배치되었다.
표 8.2 만니톨 함유 제형에 사용된 보존적 동결건조 사이클.
냉동 건조에 앞서 각 용액의 샘플은 DSC 및 FDM을 이용하여 열적 분석에 준비되었다.
추가의 열적 분석 및 동결건조 사이클 개발 연구는 단백질 없이 제조된 버퍼 용액을 이용하여 완료되었다. 실험은 수행되어 제형에서 필요한 아르기닌의 최소 농도를 결정하여 단백질을 가용화시키면서 만니톨의 결정화를 방해하지 않았다. 용해도 연구는 의뢰인에 의해 수행되어 단백질을 가용화하기 위해 필요한 아르기닌의 최소 농도를 결정하였다.1 실험은 Baxter에 의해 수행되어 열적 행동, 동결건조 사이클 조건, 및 케이크 외관에 관한 아르기닌 및 만니톨 농도의 효과를 시험하였다. 버퍼 용액은 pH 7.8에서 2% 수크로오스와 10 mM의 트리스를 함유하였다. 아르기닌 농도는 95 mM 내지 9.5 mM로 다양하였고 만니톨 농도는 2% 내지 5%에서 다양하였다.
양호한 제형 후보자는 열적 행동, 케이크 외관, 및 단기 가속화된 안정성 데이터에 기반되어 확인되었다. 추가 개발을 위한 제안된 제형은 10-25 mg/mL r-해독제, pH 7.8에서 10 mM 트리스, 45 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유한다. 초기 연구는 0.2 mL 내지 1 mL per 3 mL 바이알을 사용하였다. 낮은 아르기닌 제형을 이용한 초기 안정성 연구는 25 mg/mL의 약물 농도를 이용하여 수행되었고 보존적 사이클을 이용하여 동결건조되었다. 샘플은 25 ℃ 및 40 ℃에서 최대 3 개월 동안 안정성있게 배치되었다.
공정을 확인하기 위해 수행된 사이클은 바이알 당 5 mL로 10 mL 바이알에 충전된 약물 용액을 사용하였다. 동일한 바이알 및 충전 용적은 2차 건조의 연구 동안 수분 함량의 효과 연구에 사용되었다. 이들 연구를 위한 제형은 실험실-규모 접선 유동 여과 (TFF) 유니트를 이용한 적절한 버퍼에 교환되었던 약물 용액을 이용하여 제조되었다. TFF 유니트는 튜우빙을 갖는 접촉 유동 필터에 연결되었던 용액을 위한 유지 용기로 구비되었다. 용기는 약물 용액으로 충전되었고, 적절한 버퍼로 교환되었고, 10 KDa MWCO 막을 통한 필터링에 의해 10 내지 25 mg/mL까지 농축되었다. 1% 폴리소르베이트 80 (PS80)의 충분한 양이 부가되어 0.01% PS80 농도를 창출하였다. 최종 용액은 0.22 μm 주사기 필터 또는 진공 여과 시스템을 통해 여과되었다.
동결건조 사이클은 공정 파라미터 예컨대 냉각 경사 속도 및 1차와 2차 건조 사이의 경사 속도 뿐만 아니라 어닐링 및 1차 건조 동안 선반 온도를 조사하였다. 잔류 수분 연구는 2차 건조의 시작에서 및 40 ℃에서 4, 8, 및 10 시간 이후 샘플의 제거로 수행되었다. 제2 연구는 40 ℃에서 8 시간 이후 및 50 ℃에서 1 및 2 시간 이후 샘플의 제거로 수행되었다. 샘플은 칼 피셔 분석을 이용하여 잔류 수분에 대해 시험되었고 건조는 잔류 수분에 대한 값이 안정기를 달성한 경우 완벽하게 고려되었다. 제형의 안정성에 관한 잔류 수분의 효과는 특이적 잔류 수분 값에 상응하는 2차 건조 동안 시간에서 샘플의 제거로 시험되었다. 샘플은 40 ℃에서 최대 2 개월 동안 및 50 ℃에서 1 주 동안 안정성있게 배치되었다.
동결건조 사이클 설계 공간은 10 mg/mL r-해독제, 10 mM 트리스, 45 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 pH 7.8에서 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유한 제안된 의약품 제형에 대하여 창출되었다. 제형은 바이알 당 5 mL 용액을 이용한 10 mL 유리, 튜우빙 바이알에 충전되었다. 설계 공간의 개발은 제형의 붕괴 온도 및 바이알용 열 전달 계수와 조합된 장비 능력의 지식을 필요로 한다. 바이알용 열 전달 계수는 생성물에 사용된 정확한 유리, 튜우빙 바이알 이용, 바이알을 물로 충전, 및 생성물의 건조를 위한 선반 온도 이용으로 결정하였다. 생성물 온도 및 질량 유량 데이터는 수집되었고 반면에 챔버 압력은 대략 25 mTorr 내지 대략 400 mTorr로 다양하였다. 질량 유량 데이터는 조절가능 다이오드 레이저 흡수 분광법 (TDLAS)을 이용하여 각 압력에서 수집되었고 압력을 이용한 질량 유량 속도의 변화는 사용되어 바이알용 열 전달 계수를 계산하였다.
결과:
1. 시차주사열량계 (DSC)
각 버퍼 구성요소의 개별적인 용액은 제조되었고 DSC를 이용하여 시험되어 버퍼 제형의 열적 행동에 관한 각 구성요소의 영향을 결정하였다. 전형적으로, 제형의 열적 행동은 최고 농도에서 존재한 구성요소에 의해 지시된다. 열적 행동에서의 변화는 다른 부형제 또는 약물의 부가와 함께 발생할 수 있다. 예를 들어, 염의 부가는 제형에서 비정질 물질의 Tg'를 감소시킬 수 있다. 제안된 약물 제형은 만니톨을 함유한다. 만니톨은 부형제로서 동결건조된 제형에 부가되어 결정화 팽화제로서 작용한다. 만니톨은 용액에서 초기에 냉동된 경우 비정질이다. 어닐링 단계는 냉동 동안 전형적으로 포함되어 만니톨의 결정화를 촉진시켜 케이크용 구조를 제공할 수 있다. 제형에서 다른 부형제 및/또는 활성 성분은 만니톨의 결정화를 방지 또는 지연시킬 수 있다. 상기 섹션에서 논의된 연구는 만니톨의 결정화 및 용액의 열적 행동에 관한 트리스, 포스페이트, 및 아르기닌의 효과를 조사하였다.
pH 7.8에서 제조된 10 mM 트리스 용액은 DSC를 사용하여 1 ℃/min로 -50 ℃까지 냉각되었다 (도 2). 온도기록도는 대략 -20 ℃에서 시작하는 얼음에 대한 결정화 발열 그 다음 -32 ℃에서 트리스에 대한 결정화 발열을 보여준다.
결정화 발열은 95 mM 아르기닌이 제형에 포함된 경우 더 이상 존재하지 않는다 (도 3). 얼음에 대한 용융 흡열 이외에 열적 사례는 상기 연구를 위한 온도 범위 내에서 관측되었다.
대략 -42 ℃의 중간점을 갖는 Tg'는 10 mM 트리스, 95 mM 아르기닌 제형이 4% 수크로오스를 함유하는 경우 관측된다. 수크로오스 단독에 대한 Tg'의 중간점은 전형적으로 -33 ℃ 부근이다. 연구는 트리스 / 아르기닌 혼합물이 수크로오스에 대한 Tg'를 감소시키는 것을 입증한다. -40 ℃ 미만의 Tg'를 갖는 용액은 동결건조를 위한 양호한 후보자가 아니다. 1차 건조 동안 그와 같은 낮은 생성물 온도를 유지하는 것은 어렵다. 결정화 구성요소, 예컨대 만니톨의 부가는, 만니톨이 1차 건조의 시작 전에 결정화하는 한 동결건조의 기회를 개선할 수 있고 구조를 제공할 수 있다.
만니톨은 제형에 2% W/V로 부가되었고 수크로오스 농도는 2%까지 감소되어 제형에서 총 당 함량이 4%로 유지되었다. 10 mM 트리스, 2% 수크로오스 및 2% 만니톨로 제조된 용액은 만니톨이 대략 -20 ℃에서 결정화하기 시작할 것을 입증한다 (도 4). 만니톨의 결정화는 95 mM 아르기닌이 용액에 부가된 경우 방지된다 (도 5). 만니톨은 심지어 냉동된 용액이 -20 ℃에서 최대 5 시간 동안 어닐링된 경우조차 결정화하지 않았다 (도 6).
열적 분석의 동일한 세트는 10 mM 나트륨 포스페이트로 제조된 용액에 수행되어 제형의 열적 행동에 관한 버퍼의 효과를 시험하였다. 나트륨 포스페이트는 pH 7.8에서 10 mM 용액으로서 제조된 경우 냉각 단계 동안 결정화되었다 (도 7).
95 mM 아르기닌 및 4% 수크로오스와 10 mM 나트륨 포스페이트의 혼합물은 대략 -38 ℃에서 중간점을 갖는 Tg'를 나타낸다.
트리스 용액과 유사하게, 수크로오스 및 만니톨을 함유한 포스페이트 용액은 만니톨에 대한 결정화 발열을 나타낸다 (도 8). 결정화 발열은 95 mM 아르기닌이 혼합물에 부가된 경우 관측되지 않는다 (도 9). 트리스로 제조된 제형과 유사하게, 결정화 발열은 심지어 포스페이트 제형이 -20 ℃에서 5 시간 동안 어닐링된 경우조차 만니톨에 대해 관측되지 않았다.
연구는 트리스 또는 포스페이트를 함유한 제형에 95 mM 아르기닌의 부가가 수크로오스에 대한 Tg'를 급격하게 감소시킬 것 및 만니톨의 결정화를 방지할 것을 입증한다. 데이터는 제형에 대한 변화가 성공적인 동결건조된 케이크를 위하여 만니톨의 결정화를 촉진시키기 위해 필요하였음을 입증하였다. 상기 연구의 시간에, 데이터는 95 mM 아르기닌 또는 10 mM 내지 20 mM 시트레이트가 단백질의 용해도를 유지하기 위해 필요하였음을 제안하였다. 따라서, 연구는 제형에서 아르기닌에 대한 대안으로서 2% 수크로오스 및 5% 만니톨과 10 mM 트리스내 10 mM 또는 20 mM 시트레이트를 함유한 용액을 이용하여 수행되었다. 만니톨 농도는 증가되었고 수크로오스 농도는 감소되어 만니톨 결정화의 가능성을 증가시켰다. 아르기닌과 함께 5% 만니톨과 2% 수크로오스를 이용한 연구는 이 보고서에서 나중에 기재된다.
시트레이트를 함유한 용액은 -25 ℃에서 어닐링되었다. 결정화 발열은 -25 ℃에서 10 mM 시트레이트에서 24 분의 개시 (도 10) 및 -25 ℃에서 20 mM 시트레이트에서 30 분의 개시 (도 11)와 함께 관측되었다.
2. 냉동 건조 현미경검사 (FDM)
pH 7.8에서 10 mM 포스페이트 또는 10 mM 트리스 with 10 mg/mL r-해독제, 95 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 2% 만니톨로 제조된 제형은 FDM을 이용하여 조사되었다. 트리스 제형으로 수행된 실험은 -25 ℃에서 최대 3 시간 동안 어닐링된 경우 대략 -34 ℃에서 제형에 대한 붕괴의 개시를 보여주었다.
10 mM 포스페이트를 함유한 제형은 더 높은 붕괴 온도를 가졌다. 일치된 건조 층은 -32 ℃에서 관측되었고 붕괴의 개시는 -30 ℃에서 관측되었다.
FDM 데이터는 모든 제형이 일상적인 생산에 잘 받아들이는 조건을 이용하여 동결건조될 수 있음을 제안한다. 이는 DSC를 이용하여 수득된 데이터와 상관하지 않는다. FDM를 이용하여 수행된 실험은 온도 제어된 단계와 직접 접촉으로 2개의 유리 커서슬립 사이에서 용액의 박층을 이용한다. 이들 조건은 건조의 용이성을 제안하고, 따라서, DSC 데이터와 상관하는데 실패하였고, 이는 주어진 그의 관련성의 후속의 시험에 대하여 관련되었다.
3. 동결건조 및 안정성
95 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 pH 7.8에서 2% 만니톨과, 10 mg/mL 및 25 mg/mL r-해독제로 제조된 포스페이트 및 트리스 제형은 용액 및 동결건조된 샘플로서 안정성에 관해 조사되었다. 각 용액은 바이알 당 0.20 mL로 3 mL 바이알에 충전되었다. 샘플의 부분은 5 ℃ 및 25 ℃에서 최대 2 주 동안 보관되었고 샘플의 다른 부분은 보존적 사이클을 이용하여 동결건조되었고 25 ℃에서 최대 3 개월 동안 및 40 ℃에서 최대 2 개월 동안 안정성있게 배치되었다.
샘플은 -30 ℃에서 동결건조 전에 -25 ℃에서 1시간 동안 어닐링되었다. 2차 건조는 20 ℃ 선반 온도를 갖는 보존적 조건을 또한 이용하여 수행되었다. 보존적, 비-종래의 사이클이 사용되었던 것은 단백질의 온도 민감성에 대해 거의 공지되지 않았기 때문이다. 동결건조 사이클은 대략 21 시간 내에 완료되었다. 바이알은 동결건조기로부터 제거 전에 스토퍼로 밀봉되었고, 캡핑되었고, 안정성있게 배치되었다.
동결건조된 케이크는 붕괴의 증거 없이 허용가능하게 보여졌고 정제수로 빠르게 재구성되었다. 약물 없이 동일한 제형을 이용한 제2 연구는 동반하여 수행되어 만니톨의 결정화가, 만일 발생했다면, 바이알의 파손을 초래하지 않았음을 확인하였다. 위약 제형은 10 mL의 용액 각각으로 20 mL 바이알에 충전되었다. 하나의 가득찬 접시의 바이알은 1 ℃/min으로 -40 ℃까지 냉각되었고, 등온으로 120 분 동안 유지되었고 그 다음 -25 ℃까지 1 ℃/min으로 어닐링의 3 시간 동안 램프되었다. 바이알의 제2 세트는 -25 ℃까지 냉각되었고, 등온으로 3 시간 동안 유지되었고, -35 ℃까지 냉각되었고 그 다음 가득찬 접시의 바이알을 함유한 건조기에 이동되었다. 모든 바이알은 -30 ℃에서 동결건조되었고 25 ℃에서 2차 건조 동안 건조되었다. 붕괴는 모든 제형을 함유한 바이알에서 관측되었다.
이는 만니톨이 결정화하지 않았음을 제안하고 아르기닌이 만니톨의 결정화 방지였다는 DSC를 이용한 열적 분석 동안 작성된 결론을 지지한다. 따라서, FDM 결과 보다는, 제형 개발에 대한 그의 관련성이 주어지면, DSC 및 동결건조 데이터는 미래의 실험에 대하여 의존되었다.
다음 실시예에서 기재된 연구는 아르기닌의 감소 그리고 단백질의 용해도 및 만니톨의 결정화에 관한 그의 효과에 집중하였다. 상기 기재된 95 mM 아르기닌으로 제조된 포스페이트 및 트리스 제형은 안정성있게 잔류하여 초기 데이터를 제공하였다.
농도의 손실은 5 ℃ 및 25 ℃에서 최대 2 주 동안 보관된 경우 용액 샘플에서 관측되지 않았고 T0에서 액체 및 동결건조된 샘플 사이에서 농도 차이는 없었다 (도 12 및 13).
유사하게, 농도 손실은 25 ℃에서 최대 3 개월 동안 (도 14) 또는 40 ℃에서 최대 2 개월 동안 보관된 임의의 동결건조된 제형에서 관측되지 않았다.
SEC 데이터는 용액 제형이 5 ℃에서 최대 2 주 동안 보관된 경우 주요 피크 손실이 없었음을 보여준다. 퍼센트 주요 피크는 25 ℃에서 최대 2 주 동안 보관된 경우 10 mg/mL 샘플에서 1% 초과만큼 및 25 mg/mL 샘플에서 3% 초과만큼 감소하였다.
따라서, 제형의 화학적 안정성이 허용가능하게 보여도, 제형에 대한 변화는 동결건조 동안 좋지 못한 물리적 안정성 때문에 필요하였다. 좋지 못한 물리적 안정성은 위약 제형에 대하여 관측된 붕괴된 케이크에 의해 입증되었다. DSC 실험으로부터 데이터는 아르기닌 농도 감소 및 만니톨 농도 증가가 만니톨의 결정화를 촉진시킬 수 있고 동결건조된 케이크의 물리적 안정성을 개선할 수 있음을 제안한다.
실시예 8. 동결건조된 샘플의 열적 행동 및 외관에 관한 아르기닌 및 만니톨 농도의 효과
상기 실시예는 수행되어 위약 제형을 이용하여 열적 행동 및 케이크 외관에 관한 아르기닌 농도 및 만니톨 농도의 효과를 조사하였다. 연구는 트리스 버퍼로 제조된 위약 제형에 집중하였다. 트리스 버퍼가 선택되었던 것은 벌크 약물 용액을 제조하기 위해 사용된 버퍼이기 때문이고 트리스 및 나트륨 포스페이트로 제조된 샘플의 화학적 안정성에서 차이가 없기 때문이다.
하기 연구는 9.5 mM 내지 95 mM의 아르기닌 농도 범위 및 2% 내지 5%의 만니톨 농도 범위를 이용하여 조사하였다.
1. 열적 분석
열적 분석 실험의 목표는 제형에서 고형물의 농도의 실질적으로 증가 없이 만니톨의 결정화를 촉진하였던 아르기닌 및 만니톨의 농도를 결정하는 것이었다. 고 농도의 고형물은 동결건조 동안 물질 전달에 내성을 증가시킬 수 있고 과도하게 장기 동결건조 사이클을 창출할 수 있다.
아르기닌 농도는 10 mM 트리스, 2% 수크로오스, 2% 만니톨, 및 0.01% PS80 제형에서 감소되었고 반면에 만니톨 농도를 일정하게 유지하였다. 제형은 -15 ℃ 내지 -25 ℃에서 최대 5 시간 동안 어닐링되어 결정화를 촉진시켰다. 만니톨의 결정화는, 아르기닌 농도가 9.5 mM까지 감소되었고 어닐링 온도가 -22 ℃ 이상이었던 경우, 단지 관측되었다. 만니톨의 결정화는 -22 ℃에서 어닐링의 개시에서 시작하였다 (도 15).
만니톨에 대한 결정화의 개시는, 농도가 4%까지 증가되고 아르기닌 농도가 95 mM 내지 47.5 mM 감소된 경우, -25 ℃에서 30 분의 어닐링 이후 발생한다 (도 16). 더 낮은 어닐링 온도가 조사되었던 것은 동결건조된 케이크의 외관에 대한 변화가 어닐링이 더 높은 온도에서 발생된 경우 관측되었기 때문이다. 외관에 대한 변화는 어닐링이 -15 ℃에서 수행되었던 경우 케이크 수축을 포함하였다.
제형에서 2%의 농도를 이용한 경우, 만니톨의 결정화는 아르기닌의 농도가 47.5 mM 초과인 경우 지연 또는 방지된다. 만니톨의 결정화에 영향 없이 제형에 포함될 수 있는 아르기닌의 최대 농도는 47.5 mM이다. 상기 서술은 2% 만니톨 및 47.5 mM, 71 mM, 또는 85.5 mM 아르기닌을 갖는 위약 제형을 이용하여 수행되었던 동결건조 실험을 이용하여 확인되었다. 47.5 mM 아르기닌으로 제조된 샘플은 약학적으로 허용가능하였지만, 그러나 더 많은 아르기닌으로 제조된 샘플은 붕괴를 나타냈다. 만니톨의 농도 증가는 결정화의 가능성을 증가시킬 수 있다. 냉동된 용액의 어닐링은 아르기닌의 농도가 47.5 mM 초과인 경우 만니톨의 농도를 4% 및 5%까지 증가 경우 결정화를 촉진하기 위해 요구된다.
만니톨은 5% 만니톨 및 47.5 mM 아르기닌을 함유한 제형에서 쉽게 결정화하였다. 10 mM 트리스, 47.5 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 및 0.01% PS80을 함유한 제형은 -40 ℃까지 1 ℃/min으로 서서히 냉각되었다 (도 17). 만니톨에 대한 결정화 발열은 제형이 1 ℃/min으로 냉각되었던 경우 냉각 단계 동안 관측되었다.
제형의 샘플은 -40 ℃까지 빠르게 냉각되었고 (10 ℃/min보다 더 빠르게 냉각되었고) 그 다음 -25 ℃에서 어닐링되었다 (도 18). 만니톨은 용액이 -25 ℃에서 어닐링되었던 경우 23 분 후에 결정화되었다. 실험은 아르기닌 농도가 47.5 mM 미만인 한 만니톨이 제형에서 쉽게 결정화하지 않을 것을 입증한다.
열적 분석 데이터는 아르기닌 농도가 47.5 mM 이하이면 4% 이상의 농도에서 만니톨이 동결건조 공정 동안 합리적인 기간으로 쉽게 결정화할 수 있음을 지지한다.
2. 동결건조
동결건조 연구는 열적 분석 실험과 동반하여 수행되었다. 위약 용액은 10 mM 트리스, 9.5 mM 내지 23.75 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 2% 내지 4% 만니톨로, 또는 4% 수크로오스 있거나 없이 47.5 mM 아르기닌과 10 mM 트리스로 제조되었다. 10 mM 트리스, 47.5 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 및 5% 만니톨을 함유한 제형은 또한 포함되었다. 용액은 바이알 당 3 mL 용액을 이용하여 20 mL 바이알에 충전되었다. 보존적, 비-종래의 동결건조 사이클은 허용가능한 케이크가 생산될 수 있는지를 결정하기 위해 사용되었다. 샘플은 -20 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각되었고, 3 시간 동안 어닐링되었고, -40 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각되었고, 2 시간 동안 유지되었다. 진공은 100 mTorr에서 개시되었고 선반 온도는 -30 ℃까지 0.5 ℃/min으로 램프되었다. Pirani 게이지 값이 커패시턴스 마노미터 (CM) 값에 매칭될 때까지 샘플은 -30 ℃에서 유지되었고 그 다음 25 ℃에서 0.5 ℃/min으로 2차 건조까지 진전되었다. 2차 건조는 Pirani 게이지 값이 매칭된 CM 값에 매칭된 경우 완벽하였다. 1차 건조는 대략 30 시간 이후 완벽하였고 2차 건조는 단지 몇 시간 요구되었다.
트리스 및 아르기닌 단독으로 제조된 샘플은 완벽한 붕괴를 나타내었고 4% 수크로오스를 포함한 것은 케이크 수축을 나타내었다.
47.5 mM 이하 아르기닌 및 2% 내지 5%의 만니톨을 함유한 모든 제형은 허용가능한 케이크로 보여졌다.
연구는 10 mL 충전 용적을 이용한 냉각 램프 동안 어닐링의 효과를 시험하기 위해 포함되었다. 연구는 23.75 mM 및 47.5 mM 아르기닌, 및 2% 내지 5% 만니톨과 10 mM 트리스, 2% 수크로오스로 제조된 샘플을 사용하였다. 용액은 1 ℃ / min으로 -25 ℃까지 냉각되었고, 3 시간 동안 유지되었고, 진공은 100 mTorr에서 개시되었고, 선반 온도는 -20 ℃까지 0.5 ℃/min으로 증가되었다. 샘플은 -20 ℃에서 건조되었고 선반은 내지 25 ℃까지 2차 건조 동안 가온되었다. 모든 샘플은 붕괴 없이 허용가능하게 보여졌다.
동일한 제형은 동결건조된 케이크의 외관에 관한 냉각 속도의 효과를 조사하기 위해 사용되었다. 한 세트의 샘플은 -25 ℃까지 1 ℃/min으로 냉각되었고 3 시간 동안 어닐링되었다. 제2 세트의 샘플은 -25 ℃에서 5 ℃/min으로 냉각되었고 3 시간 동안 어닐링되었다. 샘플의 세트는 단일 건조기에서 조합되었고 1차 건조로 -30 ℃에서 그 다음 2차 건조로 25 ℃에서 동결건조되었다.
모든 샘플은 붕괴의 증거 없이 허용가능하게 보여졌다. 데이터는 1 ℃/min 및 5 ℃/min 사이의 냉각 속도가 샘플의 외관에 영향을 미치지 않음을 지지한다.
의뢰인에 의해 수행된 용해도 연구는 아르기닌의 농도가 7.5 내지 8.2의 pH 범위에서 36 mM 이상이면 단백질이 용액에서 가용성임을 지지하였다. 45 mM 아르기닌을 함유하였던 용액을 사용하는 것이 결정되었던 것은 단백질의 완벽한 용해도를 확인하면서 또한 만니톨의 결정화를 방지할 농도 미만이기 때문이다. 만니톨 농도는 사이클 동안 쉽게 결정화되는 것을 확인하기 위해 5%로서 선택되었다. 따라서, 최상의 제형 후보자는 pH 7.8에서 제조된 0.01% PS80과, 10 mM 트리스, 10 mg/mL 또는 25 mg/mL r-해독제, 45 mM 아르기닌, 2% 수크로오스, 5% 만니톨이었다.
위약 용액으로 완료된 동결건조 연구는 아르기닌 농도가 2% 이상의 만니톨을 갖는 47.5 mM 이하인 경우 허용가능한 케이크가 생산될 수 있음을 입증하였다용액은 붕괴의 증거 없이 -20 ℃ 만큼 높은 선반 온도를 이용하여 동결건조되었다. 샘플은 케이크의 외관에 관한 효과 없이 -40 ℃에서 냉각 단계 동안 또는 냉동 단계 이후 -20 ℃에서 3 시간 동안 어닐링되었다. 보존적 및 종래의 접근법은 -40 ℃에서 샘플을 먼저 냉동 그 다음 1차 건조로 어닐링 단계이다. 상기 접근법은 동결건조 사이클로 선택되었다. 1차 건조는 -20 ℃에서 어닐링 단계 이후 수행되었고 그 다음 0.5 ℃/min으로 25 ℃까지 2차 건조 동안 선반 온도를 증가하였다. 후속의 동결건조 개발 연구는 적절한 2차 건조 선반 온도 및 지속시간에 집중하였다.
동결건조된 제형의 개발 목표는 (1) 적어도 10 mg/mL의 단백질 농도; (2) 2-8 ℃에서 개선된 안정성; (3) ≤ 5 min의 재구성 시간; 및 (4) 강력한 동결건조 공정을 포함하였다.
몇 개 라운드의 제형 스크리닝은 수행되어 (동결건조된 케이크로서 및 용액에서 모두) 단백질 안정성에 관한 개별적인 변수의 효과 및 5 ℃에서 용해도를 평가하였다. 보존적 동결건조 사이클은 제형 스크리닝 동안 사용되었다. 동결건조 공정 개발은 병렬적으로 수행되었다.
시험은, 단백질 농도에 관하여, 더 높은 농도를 입증하였다 (예를 들면, 25 mg/mL) 용액이 더 낮은 것보다 덜 안정하였다 (예를 들면, 10 mg/mL) 실온에서 2 일 후 (즉, SEC에 의해 총 응집물에서 및 RP-HPLC에 의해 % 베타 피크에서 더 큰 증가). (동결건조된 생성물 및 용액에서) r-해독제 안정성에 대한 최적의 pH는 pH 7.80 ± 0.3인 것이 확인되었다.
안정성에서 유의차는 다른 안정화 구성요소 (즉, 수크로오스 및 아르기닌)의 존재하에 트리스 및 포스페이트 버퍼 사이에서 관측되지 않았다.
안정제 유형 및 농도에 관하여, 모든 2% 및 4% w/w 수크로오스는 양호한 안정화 효과를 제공하였다. ≥36 mM의 아르기닌 농도는 5 ℃, pH 7.80 ± 0.3에서 ≥50 mg/mL로 r-해독제의 용해도를 유지하도록 요구된다.
(10 mM 트리스, 2% w/w 수크로오스, 45 mM 아르기닌의 존재하에) ≥ 4% w/w의 농도로 결정성 성분 (팽화제), 만니톨은 1차 건조 동안 케이크 붕괴를 피하기 위해 중요하다. 추가로, 소량의 폴리소르베이트 80의 존재는 전단 조건 (실온에서 흔들기) 하에서 용액내 r-해독제 안정성을 확인하는데 결정적이다.
아래 보여진 조성물은 동결건조에 적합한 용액을 예시한다.
표 8.3 주사 50 mg/바이알
2
용 r-해독제의 조성물
동결건조된 제형은 r-해독제 의약품의 안정성을 개선하고 2-8 ℃에서 보관될 수 있다. 하기 표는 냉동된 액체 의약품 및 재구성된 동결건조된 의약품의 조성물을 비교한다. 100 mg/바이알 및 400 mg/바이알 동결건조된 의약품의 조성물의 예 및 재구성된 조성물의 예를 나타낸다.
표 8.4 r-해독제 냉동된 액체 의약품의 제형, 주사용, 3 mg/mL
표 8.5 r-해독제 동결건조된 의약품의 제형, 주사용, 50 mg/바이알
표 8.6 r-해독제 동결건조된 의약품의 제형, 주사용, 100 mg/바이알
표 8.7 r-해독제 동결건조된 의약품의 제형, 주사용, 400 mg/바이알
냉동 건조 현미경검사는 2개의 상이한 제형 상에서 수행되었다. 대략 0.15 mL의 용액은 온도-제어된 냉동-건조 단계에 배치되었던 유리 세포에 분배되었다. 열전쌍은 세포의 최하부 및 중심에 배치되어 샘플 온도를 모니터하였다. 액체는 0.5 ℃/min의 속도로 -50 ℃까지 냉각되었고, -20 ℃에서 1시간 동안 어닐링되었고, -50 ℃까지 재냉동되었다. 챔버는 진공처리되었고 0.5 ℃/min의 속도로 가열되었다. 상기 붕괴 온도에 기반하여, 붕괴 온도 미만의 생성물 온도를 초래하는 냉동 건조 온도 및 압력의 조합은 붕괴 없이 케이크를 생산할 것이다. 예를 들어 100 mTorr로 최대 20 ℃의 생성물 온도는 붕괴 없이 케이크를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
SWFI로 주사용 r-해독제 재구성 이후, 50 mg/바이알은 pH 7.8, ~ 480 mOsm/kg의 오스몰농도이다. 따라서 재구성된 DP는 정맥내 투여에 허용가능하다.
r-해독제 BDS는 3.0 mg/mL로 10 mM 트리스, pH 7.8 ± 0.3, 4% 수크로오스, 95 mM 아르기닌에서 제형화되고 -60 ℃ 이하에서 냉동 보관된다. 주사용 r-해독제의 제조는 3 mg/mL r-해독제 BDS의 해동 및 풀링, 10 mg/mL의 최종 농도로 제형 버퍼 (10 mM 트리스, 2% 수크로오스, 5% 만니톨, 45 mL 아르기닌 HCl, pH 7.8)에 대한 한외여과/정용여과, 0.01% w/w까지 폴리소르베이트 80의 스파이킹, 무균성 충전, 동결건조, 스토퍼링, 캡핑 및 주사 컨테이너 마감 시스템용 r-해독제에 라벨링으로 이루어진다.
주사 제조 공정용 r-해독제는 다른 멸균된 액체 의약품의 생산용으로 개발되었던 절차를 이용한다. 주사용 r-해독제를 생산하기 위해 사용된 멸균 방법은 0.2 μm 여과이다. r-해독제는 열 불안정하고; 따라서 0.2 μm 여과는 주사용 멸균된 r-해독제 생산의 가장 적절한 수단이다.
동결건조 공정은 동결건조 사이클의 상이한 단계에서 제형 구성요소의 물리적 성질의 이해에 기반된 합리적인 접근법을 이용하여 개발되었다. 시차주사열량계 (DSC) 및 냉동 건조 현미경검사 (FDM)를 포함한 열적 특성규명 방법은 Tg' (냉동된 농축물의 유리전이온도) 및 Tc (1차 건조 동안 붕괴 온도)를 평가하기 위해 사용되었다. 아래 표에서 보여준 사이클은 원형 배치 J7128의 동결건조를 위해 선택되었다. 어닐링 단계는 생성물 온도가 1차 건조 동안 붕괴 온도 아래로 떨어지지 않는 것을 확인하기 위해 만니콜의 결정화를 허용한다. 1차 건조 온도는 1차 건조의 합리적인 지속시간으로 케이크 붕괴를 피하기 위해 선택되었다. 2-단계 2차 건조 조건은 <1%의 수분 수준을 갖는 동결건조된 DP를 생산하기 위해 개발되었다 (참고, 예를 들면, 표 6).
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<212> PRT
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<400> 1
Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu
1 5 10 15
Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu
20 25 30
Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp
35 40 45
Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly
50 55 60
Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn
65 70 75 80
Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys
85 90 95
Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala
100 105 110
Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly
115 120 125
Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val
130 135 140
Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp
145 150 155 160
Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp
165 170 175
Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu
180 185 190
Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp
195 200 205
Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr
210 215 220
Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln
225 230 235 240
Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu
245 250 255
Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn
260 265 270
Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu
275 280 285
Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro
290 295 300
Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile
305 310 315 320
Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg
325 330 335
Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu
340 345 350
Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp
355 360 365
Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
370 375 380
Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly
385 390 395 400
Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr
405 410 415
Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro
420 425 430
Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys
435 440 445
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 2
Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys
1 5 10 15
Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly
20 25 30
Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu
35 40 45
Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln
50 55 60
Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly
65 70 75 80
Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr
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115 120 125
Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser
130 135 140
Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg
145 150 155 160
Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly
165 170 175
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180 185 190
Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro
195 200 205
Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp
210 215 220
Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly
225 230 235 240
Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met
245 250 255
Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser
260 265 270
Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln
275 280 285
Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe
290 295 300
Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys
305 310 315 320
Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu
325 330 335
Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys
340 345 350
Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys
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<210> 3
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 3
Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys
1 5 10 15
Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly
20 25 30
Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu
35 40 45
Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln
50 55 60
Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly
65 70 75 80
Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr
85 90 95
Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys
100 105 110
Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn
115 120 125
Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr
130 135 140
Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly
145 150 155 160
Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val
165 170 175
Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe
180 185 190
Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn
195 200 205
Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu
210 215 220
Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu
225 230 235 240
Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val
245 250 255
Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn
260 265 270
Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly
275 280 285
Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val
290 295 300
Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr
305 310 315 320
Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser
325 330 335
Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val
340 345 350
Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys
355
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 4
Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys
1 5 10 15
Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly
20 25 30
Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu
35 40 45
Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln
50 55 60
Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly
65 70 75 80
Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr
85 90 95
Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg
100 105
<210> 5
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 5
Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu
20 25 30
Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys
35 40 45
Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly
50 55 60
Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe
65 70 75 80
Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg
100 105 110
Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser
115 120 125
Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys
130 135 140
Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser
145 150 155 160
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Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg
180 185 190
Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly
195 200 205
Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe
210 215 220
Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala
225 230 235 240
Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys
245 250
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 6
Arg Lys Arg Arg Lys Arg
1 5
Claims (15)
10 mM 내지 55 mM 아르기닌 또는 8 mM 내지 35 mM 시트레이트, 1% 내지 3% 수크로오스 (w/v), 2% 내지 8% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 2-사슬 폴리펩타이드를 포함하는 수성 제형으로서, 상기 제형은 7.5 내지 8의 pH를 갖는, 수성 제형.
청구항 1에 있어서, 40 mM 내지 50 mM 아르기닌 또는 10 mM 내지 30 mM 시트레이트, 1.5% 내지 2.5% 수크로오스 (w/v), 4.5% 내지 5.5% 만니톨 (w/v), 및 적어도 5 mg/mL의 상기 폴리펩타이드를 포함하는, 제형.
청구항 2에 있어서, 적어도 10 mg/mL의 상기 폴리펩타이드를 포함하는, 제형.
청구항 1에 있어서, 상기 제1 사슬의 잔기 Asp29가 (3R)-3-하이드록시Asp인, 제형.
약 45 mM 아르기닌 또는 약 10 mM 시트레이트, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 2-사슬 폴리펩타이드를 포함하는 수성 제형으로서, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는, 수성 제형.
약 45 mM 아르기닌 또는 약 10 mM 시트레이트, 약 2% 수크로오스 (w/v), 약 5% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 약 5 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함하는 수성 제형으로서, 상기 제형은 약 7.8의 pH를 갖는, 수성 제형.
10 mM 내지 55 mM 아르기닌 또는 8 mM 내지 35 mM 시트레이트, 1% 내지 3% 수크로오스 (w/v), 2% 내지 8% 만니톨 (w/v), 및 서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 적어도 5 mg/mL의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함하는 수성 제형으로서, 상기 제형은 7.5 내지 8의 pH를 갖는, 수성 제형.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 수성 제형을 동결건조하는 것을 포함하는, 동결건조된 제형의 제조 방법.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 수성 제형의 동결건조에 의해 수득가능한, 동결건조된 조성물.
서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 2-사슬 폴리펩타이드, 및 범위 (0.5-1.4):(1-3):(2-8)의 중량비의 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨 또는 범위 (0.15-0.66):(1-3):(2-8)의 중량비의 시트레이트:수크로오스:만니톨을 포함하는, 동결건조된 조성물.
청구항 10에 있어서, 적어도 18% (w/w)의 2-사슬 폴리펩타이드를 포함하는, 동결건조된 조성물.
청구항 10에 있어서, L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨의 상기 중량비가 (0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)의 범위이거나, 또는 시트레이트:수크로오스:만니톨의 상기 중량비가 (0.19-0.57):(1.5-2.5):(4.5-5.5)의 범위인, 동결건조된 조성물.
서열식별번호. 4의 아미노산 서열의 제1 사슬, 서열식별번호. 5의 아미노산 서열의 제2 사슬, 및 서열식별번호. 4의 위치 98 (Cys98)에서 제1 시스테인 잔기와 서열식별번호. 5의 위치 108 (Cys108)에서 제2 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함하는 2-사슬 폴리펩타이드, 및 약 0.95:2:5의 중량비의 L-아르기닌 HCl:수크로오스:만니톨 또는 약 (0.19-0.57):(1.5-2.5):(4.5-5.5)의 중량비의 시트레이트:수크로오스:만니톨을 포함하는, 동결건조된 조성물.
수성 용매에 청구항 10 내지 13 중 어느 한 항에 따른 상기 동결건조된 조성물을 용해시킴으로써 제조되는 용액을 포함하는, 인자 Xa 저해제로 항응고제 요법을 받는 대상체에서 출혈을 감소시키기 위한 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 인자 Xa 저해제가 아픽사반, 리바록사반 또는 베트릭사반인, 조성물.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462039809P | 2014-08-20 | 2014-08-20 | |
US62/039,809 | 2014-08-20 | ||
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