EA017152B1 - СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ - Google Patents
СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ Download PDFInfo
- Publication number
- EA017152B1 EA017152B1 EA200970231A EA200970231A EA017152B1 EA 017152 B1 EA017152 B1 EA 017152B1 EA 200970231 A EA200970231 A EA 200970231A EA 200970231 A EA200970231 A EA 200970231A EA 017152 B1 EA017152 B1 EA 017152B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- zeg
- rgo
- cation exchange
- column
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 195
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 195
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 40
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 40
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 33
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 30
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 29
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 29
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 29
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 27
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 20
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 20
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 claims description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 181
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 30
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 22
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- -1 diethyl (2hydroxypropyl) aminoethyl Chemical group 0.000 description 9
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 8
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 8
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 8
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 8
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 101000831616 Homo sapiens Protachykinin-1 Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 6
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 4
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 4
- 101150106357 slc32a1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 101100427344 Mus musculus Usp10 gene Proteins 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000737052 Naso hexacanthus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 102000046929 human TAC1 Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101150018863 maa gene Proteins 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 101100446260 Arabidopsis thaliana At2g33705 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100119987 Arabidopsis thaliana FES1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100144258 Arabidopsis thaliana RALFL19 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032311 Aurora kinase A Human genes 0.000 description 1
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 description 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100040618 Eosinophil cationic protein Human genes 0.000 description 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 101000887487 Escherichia phage T7 Internal virion protein gp14 Proteins 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100040796 Glycoprotein hormones alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001057956 Homo sapiens 55 kDa erythrocyte membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000798300 Homo sapiens Aurora kinase A Proteins 0.000 description 1
- 101000837415 Homo sapiens DNA polymerase subunit gamma-2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001065272 Homo sapiens EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000884275 Homo sapiens Endosialin Proteins 0.000 description 1
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000595198 Homo sapiens Podocalyxin Proteins 0.000 description 1
- 101001072202 Homo sapiens Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 description 1
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000016551 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 description 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 1
- 101150084935 PTER gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000016025 Waldenstroem macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- CWHBCTLVWOCMPQ-UHFFFAOYSA-L disodium;2-[(3,5-diiodo-4-oxidophenyl)-(3,5-diiodo-4-oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C(C=1C=C(I)C([O-])=C(I)C=1)=C1C=C(I)C(=O)C(I)=C1 CWHBCTLVWOCMPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical class NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000057036 human EFEMP1 Human genes 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 108010043603 integrin alpha4beta7 Proteins 0.000 description 1
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950007278 lenercept Drugs 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008180 pharmaceutical surfactant Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу уменьшения концентрации свободных Fc-частиц в жидкости, содержащей Fc-содержащий белок, предусматривающему стадию катионообменной хроматографии.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области очистки белков. Более конкретно, оно относится к очистке Бе-содержащих белков посредством катионообменной хроматографии, в частности, для уменьшения количества свободных Бс-частей в препарате Бс-содержащего белка.
Уровень техники
Белки стали коммерчески важными в качестве лекарственных средств, которые обычно называют биологическими средствами. Одной из важнейших задач является развитие экономичных и эффективных способов для очистки белков в коммерческом масштабе. Хотя многие способы доступны теперь для крупномасштабного получения белков, неочищенные продукты, такие как супернатанты культур клеток, содержат на только желаемый продукт, но также примеси (загрязнения), которые трудно отделить от желаемого продукта. Хотя супернатанты культур клеток, экспрессирующих рекомбинантные белковые продукты, могут содержать меньше загрязнений, если эти клетки выращиваются в бессывороточной среде, белки клетки-хозяина (НСР) все еще требуют элиминации во время процесса очистки. Кроме того, органы здравоохранения требуют высоких стандартов чистоты для белков, предназначенных для введения человеку.
Известен ряд хроматографических систем, которые широко применимы для очистки белков.
Системы ионообменной хроматографии используются для разделения белков прежде всего на основе различий в заряде.
Анионообменники могут классифицироваться как слабые или сильные. Заряженной группой на слабом анионообменнике является слабое основание, которое становится депротонированным и, следовательно, теряет свой заряд при высоком рН. ДЭАЭ-сефароза является примером слабого анионообменника, где аминогруппа может быть положительно заряженной ниже рН ~9 и постепенно теряет свой заряд при более высоких величинах рН. Диэтиламиноэтил (ДЭАЭ) или диэтил(2гидроксипропил)аминоэтил (РАЕ) имеют, например, хлорид в качестве противоиона. С другой стороны, сильный анионообменник содержит сильное основание, которое остается положительно заряженным на протяжении диапазона рН, обычно используемого для ионообменной хроматографии (рН 1-14). рсефароза (Р обозначает четвертичный аммоний) является примером сильного анионообменника.
Катионообменники могут быть также классифицированы как слабые или сильные. Сильный катионообменник содержит сильную кислоту (например, сульфопропильную группу), которая остается заряженной от рН 1 до 14; тогда как слабый катионообменник содержит слабую кислоту (например, карбоксиметильную группу), которая постепенно теряет свой заряд, когда рН уменьшается ниже 4 или 5. Карбоксиметил (СМ) и сульфопропил (8Р) имеют, например, натрий в качестве противоиона.
Другая хроматографическая смола основана на нерастворимом гидроксилированном кальцийфосфатном матриксе, называемом гидроксиапатитом. Гидроксиапатитная хроматография является способом очистки белков, который использует нерастворимый гидроксилированный фосфат кальция (Са5(РО4)3ОН)2, который образует как матрикс, так и лиганд. Функциональные группы состоят из пар положительно заряженных ионов кальция (С-сайтов) и кластеров отрицательно заряженных групп (Рсайтов). Взаимодействия между гидроксиапатитом и белками являются комплексными и многообразными. В одном способе взаимодействия положительно заряженные аминогруппы на белках связываются с отрицательно заряженными Р-сайтами, а карбоксильные группы белка взаимодействуют посредством координационного комплексообразования с С-сайтами (ЗНсрагб с1 а1., 2000).
Кристаллический гидроксиапатит был первым типом гидроксиапатита, использованным в хроматографии. Хроматография на керамическом гидроксиапатите (СНА) является дальнейшим развитием гидроксиапатитной хроматографии. Керамический гидроксиапатит имеет высокий срок службы (высокую прочность), хорошую способность связывания белка и может быть использован при более высоких скоростях потока и давлениях, чем кристаллический гидроксиапатит (Уо1а с1 а1., 1993).
Гидроксиапатит использовали в хроматографическом разделении белков, нуклеиновых кислот, а также антител. В гидроксиапатитной хроматографии колонку уравновешивают обычным образом и наносят пробу в фосфатном буфере низкой концентрации и затем адсорбированные белки элюируют в градиенте концентраций фосфатного буфера (Сюуаишш с1 а1., 2000).
Еще один способ очистки белков основан на аффинности представляющего интерес белка в отношении другого белка, который иммобилизован на хроматографической смоле. Примерами таких иммобилизованных лигандов являются белки бактериальных клеточных стенок - белок А и белок С, имеющие специфичность в отношении Бс-части некоторых иммуноглобулинов. Хотя как белок А, так и белок С имеют сильную аффинность в отношении 1дС-антител, они имеют также варьирующиеся аффинности в отношении других классов и изотипов иммуноглобулинов.
Белок А является белком в 43000 Да, который продуцируется бактериями 81арйу1ососси5 аитеиз и содержит четыре сайта связывания с Бс-районами ЦС. Белок С продуцируется стрептококками группы С и имеет два сайта связывания для Бс-района 1дС. Оба белка были широко охарактеризованы в отношении их аффинности с различными типами иммуноглобулинов. Другим развитием является белок А/С, генетически сконструированный белок, который объединяет связывающие способности белка А и С. Белок Ь является следующим бактериальным белком, происходящим из Рер1о81тер1ососси8, связывающимся с
- 1 017152 иммуноглобулинами и их фрагментами, содержащими легкие цепи 1д (Акегйгот апй В)огк. 1989).
Белок А-. белок С- и белок-Ь-аффинная хроматография широко используется для выделения и очистки антител.
Поскольку сайты связывания для белка А и белка С находятся в Бе-районе иммуноглобулина. белок А- и белок С- (или белок А/С)-аффинная хроматография позволяет также очистку так называемых Бсслитых белков. Белок Ь связывается с легкими цепями 1д и. следовательно. может быть использован для очистки содержащих легкую цепь антител.
Антитела. или иммуноглобулины (1д). состоят из легких цепей и тяжелых цепей. связанных вместе дисульфидными связями. Первый домен. расположенный на аминоконце каждой цепи. является вариабельным в аминокислотной последовательности. обеспечивая обширный спектр связывающих специфичностей антитела. Эти домены известны как вариабельные тяжелые (УН) и вариабельные легкие (УБ) области. Другие домены каждой цепи являются относительно инвариантными в аминокислотной последовательности и известны как константные тяжелые (СН) и константные легкие (СЬ) области.
Основными классами антител являются 1дА. 1дЭ. 1дЕ. 1дС и 1дМ; и эти классы могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы). Например. класс 1дС имеет четыре подкласса. а именно 1дС1. 1дСз и 1§С4.
Различия между классами антител происходят из различий в константных областях тяжелой цепи. содержащих 1-4 константных домена (СН1-СН4). в зависимости от класса иммуноглобулина. Между СН1- и СН2-доменами расположена так называемая шарнирная область. Эта шарнирная область особенно чувствительна к протеолитическому расщеплению; такой протеолиз дает два или три фрагмента в зависимости от точного сайта расщепления. Часть константной области тяжелой цепи. содержащую СН2- и СНЗ-домены. называют также Бс-частью иммуноглобулина. Таким образом. антитела являются Бс-содержащими белками. Другим типом Бс-содержащих белков являются так называемые Бс-слитые белки.
Известны несколько антител. которые используются в качестве терапевтических белков. Примерами рекомбинантных антител на рынке являются. например. абциксимаб. ритуксимаб. базиликсимаб. даклицумаб. паливицумаб. инфликсимаб. трастуцумаб. алемтуцумаб. адалимумаб. цетуксимаб. эфалицумаб. ибритумомаб. бевацицумаб или омалицумаб.
Бс-слитые белки являются химерными белками. состоящими из эффекторного района белка. такого как БаЬ-район антитела или связывающий район рецептора. слитого с Бс-районом иммуноглобулина. который часто является иммуноглобулином С (1дС). Бс-слитые белки используются широко в качестве терапевтических средств. так как они предоставляют преимущества. придаваемые Бс-районом. такие как возможность очистки с использованием белка А- или белка С-аффинной хроматографии с аффинностями. варьирующимися в соответствии с изотипом 1дС. 1дС1. 1дС2 и 1дС4 человека связываются сильно с белком А. и все 1дС человека. в том числе 1дС3. связываются сильно с белком С;
увеличенное время полужизни в системе кровообращения. так как Бс-район связывается с рецептором спасения БсКи. который защищает от лизосомной деградации;
в зависимости от медицинского применения Бс-слитого белка могут быть желательными эффекторные функции Бс. Такие эффекторные функции включают в себя антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) через взаимодействия с Бс-рецепторами (БсуК) и комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) посредством связывания с компонентом комплемента 1с| (С1с.|). Изоформы 1дС проявляют различные уровни эффекторных функций. 1дС1 и 1дС3 человека имеют сильные эффекты АЭСС и СЭС. в то время как 1дС2 человека проявляет слабые эффекты АЭСС и СЭС. 1дС4 человека проявляет слабые эффекты АЭСС и не проявляет эффекты СЭС.
Время полужизни в сыворотке и эффекторные функции могут быть модулированы конструированием Бс-района для увеличения или уменьшения его связывания с БсКи. БсуК и С1с.| соответственно в зависимости от терапевтического применения. предполагаемого для Бс-слитого белка.
В АЭСС Бс-район антитела связывается с Бс-рецепторами (БсуК) на поверхности иммунных эффекторных клеток. таких как природные клетки-киллеры и макрофаги. приводя к фагоцитозу или лизису этих клеток-мишеней.
В СЭС эти антитела убивают клетки-мишени запуском каскада комплемента на поверхности клеток. Изоформы 1дС проявляют различные уровни эффекторных функций. увеличивающиеся в последовательности 1дС4 < 1дС2 < 1дС1 < 1дС3. 1дС1 человека проявляет высокие АЭСС и СЭС и является наиболее применимым для терапевтического применения против патогенов и раковых клеток.
При некоторых обстоятельствах. например. когда истощение клетки-мишени является нежелательным. могут потребоваться аннулирование или уменьшение эффекторных функций. Напротив. в случае антител. предназначенных для применения в онкологии. увеличение эффекторных функций может улучшать их терапевтическую активность (Сайег е( а1.. 2006).
Модификация эффекторных функций может достигаться конструированием Бс-района либо для улучшения. либо для уменьшения связывания антител с БсуК или факторами комплемента.
Связывание 1дС с активирующими (ТсуК!. БсуКЛа. БсуВШа и БсуКШЬ) и ингибирующими
- 2 017152 (ЕсуКИЬ) ΕογΚ. или первым компонентом комплемента (С1 с.|) зависит от остатков, локализованных в шарнирной области и СН2-домене. Два района СН2-домена являются решающими для ΕсγВ и связывания С 1с.| комплемента и имеют уникальные последовательности в 1дС2 и 1дС4. Например, замена остатков 1д62 в положениях 233-236 в 1дС1 сильно уменьшала АЭСС и СЭС (Агтоиг с1 а1., 1999 и 8Ые1Й8 с1 а1., 2001).
Многочисленные мутации были произведены в СН2-домене [дС и их действие на АЭСС и СЭС испытывали ίη νίΐτο (8Ые1Й8 е1 а1., 2001, Ии8од1е е1 а1., 2001 и 2000, 8!еигег е1 а1., 1995). В частности, сообщалось, что мутация аланина в Е333 увеличивала как ΑΌΟΟ. так и СЭС (Ии8од1е е1 а1., 2001 и 2000).
Увеличение времени полужизни терапевтического антитела является другим путем для улучшения его эффективности, делающим возможными более высокие уровни в кровотоке, менее частое введение и уменьшенные дозы. Это может быть достигнуто усилением связывания Ес-района с ЕсВ новорожденного (ЕсВп). ЕсВп, который экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток, связывает 1дС рНзависимым образом и защищает его от деградации. Было показано, что несколько мутаций, расположенных на границе между доменами СН2 и СН3, увеличивают время полужизни [дС1 (Ηίηΐοη е1 а1., 2004 и Уассато е! а1., 2005).
Следующая табл. 1 суммирует некоторые известные мутации Ес-района [дС (взятые из веб-сайта [тАодеп). ________________________________________
Сконстру-ированныи Рс | Изотип 1еС | Мутации | Свойства | Потенциальные преимущества | Применения |
П1®С1е1 | ΐ£θι человека | Т250О/М42ВЕ | Увеличенное время полужизни в плазме | Улучшенная локализация в отношении мишени; увеличенная эффективность; уменьшенная доза или частота введения | Вакцинация; терапевтическое применение |
Ш£б1е2 | 1«о1 человека | Μ252Υ/5254Τ7 Т256Е + Η433Κ/Ν434Ρ | Увеличенное время полужизни в плазме | Улучшенная локализация в отношении мишени; увеличенная эффективность; уменьшенная доза или частота введения | Вакцинация; терапевтическое применение |
Ы£б1еЗ | ио1 человека | Е233Р/Ь234У/ Ь235А/АО236 + А327О/А3308/ Ρ33Ι5 | Уменьшенные АОСС и СПС | Уменьшенные побочные действия | Терапевтическое применение без деплеции клеток |
Ы£61е4 | человека | ЕЗЗЗА | Увеличенные АИСС и СПС | Увеличенная эффективность | Терапевтическое применение без деплеции клеток |
Ы^С2е1 | человека | К322А | Уменьшенная СПС | Уменьшенные побочные действия | Вакцинация; терапевтическое применение |
В классе Ес-слитых белках, имеющих терапевтическую применимость, Ес-районы были слиты с внеклеточными доменами некоторых рецепторов, принадлежащих к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΒ-В) (ЬоскДеу е! а1., 2001, Войтег е! а1., 2002, Воккеп е! а1., 2006). Отличительным признаком членов суперсемейства ΤΝΕΕ является присутствие цистеин-богатых псевдоповторов во внеклеточном домене, описанных, например, Νηίκιηίΐΐι апй 8ртапд, 1998.
Два рецептора ΤΝΕ, р55 (ΤΝΕΕ1) и р75 ΤΝΕΕ (ΤΝΒΒ2), являются примерами таких членов суперсемейства ΤΝΕΒ. Этанерцепт является Ес-слитым белком, содержащим растворимую часть ΤΝΒΒ р75 (например, АО 91/03553, АО 94/06476). Под товарным названием ЕпЬге1® он продается для лечения эндометриоза, инфекции вируса гепатита С, инфекции ВИЧ, псориатического артрита, псориаза, ревматоидного артрита, астмы, анкилозирующего спондилита, сердечной недостаточности, реакции трансплантат против хозяина, пневмофиброза, болезни Крона. Ленерцепт является слитым белком, содержащим внеклеточные компоненты ΤΝΕ-рецептора р55 человека и Ес-часть 1дО человека, и предназначен для потенциального лечения тяжелого сепсиса и рассеянного склероза.
0X40 является также членом суперсемейства ΤΝΒΒ. Были получены слитые белки ЦХ40-[дС1 и ОХ40-ЫО4ти! для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как болезнь Крона.
Ес-слитый белок ВАЕЕ-В, также называемого ВВ3, названный ВВ3-Ес, является растворимым рецептором-ловушкой из серии ингибиторов ВАЕЕ (В-клеточного активирующего фактора семейства ΤΝΡ), развивается для потенциального лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (ВА) и системная красная волчанка (8ЬЕ).
ВСМА является следующим рецептором, принадлежащим к суперсемейству ΤΝΒΒ. Было описано, что слитый белок ВСМА-1д ингибирует аутоиммунное заболевание (Ме1сйет8, 2006).
Другим рецептором суперсемейства ΤΝΒ-В является ΤΑСI, трансмембранный активатор и взаимо
- 3 017152 действующий с СЛМЬ агент (νοη Βι.ι1ο\ν апй Вгат, 1997; И8 5969102, Отоев е! а1., 2000), который имеет внеклеточный домен, содержащий два цистеин-богатых псевдоповтора. ТЛС.Ч связывает два члена семейства лигандов фактора некроза опухолей (ΊΝΒ). Один лиганд был назван ВЬу8, ВЛВР, нейтрокин-а, ТЛЬЬ-1, ζΤΝΡ4 или ΤΗΑΝΚ (Мооге е! а1., 1999). Другой лиганд был назван АРК1Ь, лиганд 1 смерти ΤΝΚΡ или ΖΤΝΡ2 (НаЬпе е! а1., 1. Ехр.Мей. 188: 1185 (1998)).
Известны также слитые белки, содержащие растворимые формы рецептора ΤΑΟ, слитые с Рсрайоном 1дО, которые были названы ΤΑΟ-Рс (XVО 00/40716, XVО 02/094852). ΤΑΟ-Рс ингибирует связывание ВЬу8 и ΑΡΜΕ с В-клетками (Х1а е! а1., 2000). Он разрабатывается для лечения аутоиммунных заболеваний, в том числе системной красной волчанки (8ЬЕ), ревматоидного артрита (ΚΑ) и гематологических злокачественностей, а также для лечения рассеянного склероза (М8). Кроме этого, ΤΑΟΙ-Рс разрабатывается для лечения множественной миеломы (ММ) (Nονак е! а1., 2004; Могеаи е! а1., 2004) и неходжкинской лимфомы (ИНЬ), хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЬ) и макроглобулинемии Вальденстрема (^М).
Вследствие терапевтической применимости Рс-содержащих белков, в частности антител и Рсслитых белков, существует потребность в значительных количествах высокоочищенного белка, который является достаточным для введения человеку.
Сущность изобретения
Одной из проблем, которые могут встречаться во время получения Рс-содержащих белков, является присутствие свободных Рс-частиц, т.е. полипептидных фрагментов, происходящих из Рс-содержащего белка, который не содержит существенной части, происходящей из вариабельной области антитела или из другого специфического белка или домена, обычно присутствующих в Рс-слитом белке.
Данное изобретение нацелено на эту проблему. Оно основано на развитии способа очистки для жидкости, композиции или препарата Рс-содержащего белка, при помощи которого может быть уменьшено количество свободных Рс-частиц, которые могут присутствовать в качестве примеси.
Таким образом, это изобретение относится к способу уменьшения концентрации свободных Рсчастиц в жидкости, содержащей Рс-содержащий белок, причем этот способ предусматривает подвергание указанной жидкости катионообменной хроматографии.
Во втором аспекте это изобретение относится к применению катионообменной хроматографии для уменьшения свободного Рс в препарате Рс-содержащего белка.
В третьем аспекте это изобретение относится к очищенному Рс-содержащему белку, содержащему менее 5, или менее 2, или менее 1, или менее 0,5, или менее 0,2, или менее 0,1% свободных Рс-частиц.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает невосстанавливающий окрашенный серебром электрофорез в ДСН-ПААГ различных фракций, происходящих из катионообменной хроматографии, описанной в примере 2. Дорожка 1: маркеры молекулярной массы, дорожка 2: очищенный ΤΑΟΙ-Рс, дорожка 3: нанесенный препарат, дорожка 4: промывка 2, дорожка 5: элюат 2, дорожка 6: промывка 3, дорожка 7: элюат 3, дорожка 8: промывка 1, дорожка 9: элюат 1, дорожка 10: очищенный свободный Рс.
Фиг. 2 показывает хроматографический профиль катионообменной хроматографии, описанной в примере 2.
Краткое описание списка последовательностей
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 является цистеиновой последовательностью-фингерпринтом (богатым цистеином псевдоповтором), общим для членов суперсемейства ΤΝΕΈ;
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 является полноразмерной последовательностью рецептора ΤΑΟΙ человека (например, описанной в νΟ 98/39361);
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3 является примером Рс-последовательности человека этого изобретения (например, описанной в νΟ 02/094852);
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 является предпочтительным Рс-слитым белком этого изобретения, содержащим последовательности, произведенные из внеклеточной части ΤΑΟ и Рс-части человека (например, описанным в ΧΧΌ 02/094852);
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 является полинуклеотидом, кодирующим полипептид 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 является полинуклеотидом, кодирующим полипептид 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3;
8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7 является полинуклеотидом, кодирующим полипептид 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение основано на открытии, что катионообменная хроматография может уменьшать количество или степень свободных Рс-частиц, которые могут присутствовать в жидкости или композиции Рс-содержащего белка.
Таким образом, это изобретение относится к способу уменьшения концентрации свободных Рсчастиц в жидкости, содержащей Рс-содержащий белок, причем этот способ предусматривает подвергание указанной жидкости катионообменной хроматографии.
Жидкостью, содержащей Рс-содержащий белок, может быть любая композиция или любой препарат, такие как, например, биологическая жидкость, полученная из человека или животного, или жидкость, полученная из культуры клеток, такая как, например, супернатант культуры клеток. Этой жидко
- 4 017152 стью может быть также жидкость, полученная из другой стадии очистки, такая как, например, элюат или проходящая жидкость из стадии захвата или любой другой подходящей стадии очистки, как описано более подробно ниже.
Термин Рс-содержащий белок, в данном контексте, относится к любому белку, имеющему по меньшей мере один константный домен иммуноглобулина, выбранный из СН1-, шарнирного, СН2-, СН3, СН4-домена или их комбинации и предпочтительно шарнирного домена, СН2- и СНЗ-домена. Этот константный домен иммуноглобулина может быть произведен из любого из 1дС. 1дА, 1дЕ, 1дМ или их комбинации либо их изотипа. Предпочтительно он произведен из 1дС, например 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. Более предпочтительно он является 1дС1.
Рс-содержащий белок этого изобретения может быть мономером или димером. Рс-содержащий белок может быть также псевдодимером (иногда называемым мономером), содержащим димерную Рсчасть (например, димер из двух связанных дисульфидным мостиком конструкций шарнир-СН2-СН3), из которых только одна слита с дополнительной частью молекулы, такой как вариабельный домен иммуноглобулина, лигандсвязывающий и необязательно ингибирующий фрагмент рецептора, или любой другой белок. Примером такого псевдодимера является Рс-слитый белок, имеющий интерферон-β, слитый с одной из двух конструкций шарнирная часть-СН2-СН3 1дС, например, такой как описанный в \УО 2005/001025.
Рс-содержащий белок может быть гетеродимером, содержащим две разные части, не являющиеся иммуноглобулином, или вариабельные домены иммуноглобулина, или гомодимером, содержащим две копии единственной части не иммуноглобулина или вариабельного домена иммуноглобулина.
В соответствии с данным изобретением Рс-часть Рс-содержащего белка может быть также модифицирована для модуляции эффекторных функций.
Например, могут быть введены следующие мутации Рс согласно положениям ЕИ-индексов (КаЬа! с1 а1., 1991), если эта Рс-часть молекулы произведена из 1дС1:
Т250Р/М428Б
М252У/8254Т/Т256Е + Н433К/Ы434Р
Е233Р/Ь234У/Ь235А/ДС236 + А3276/А3308/Р3318
Е333А; К322А.
Дополнительными Рс-мутациями могут быть, например, замены в положениях ЕИ-индексов, выбранных из 330, 331, 234 или 235, или их комбинации. Аминокислотная замена в ЕИ-индекс-положении 297, расположенном в домене СН2, также может быть введена в Рс-часть в контексте данного изобретения с элиминацией потенциального сайта присоединения Ν-связанного углевода. Кроме того, остаток цистеина в ЕИ-индекс-положении 220 может быть также заменен остатком серина, исключающим остаток цистеина, который обычно образует дисульфидные связи с константной областью легкой цепи иммуноглобулина.
Согласно данному изобретению предпочтительно Рс-часть содержит 8ЕО Ш ΝΟ: 3 или состоит из 8ЕО Ш ΝΟ: 3 либо кодируется полинуклеотидом, содержащим 8ЕО Ш ΝΟ: 6.
В предпочтительном варианте осуществления Рс-содержащий белок содержит вариабельную область иммуноглобулина, например один или несколько вариабельных доменов тяжелой цепи и/или один или несколько вариабельных доменов легкой цепи.
Предпочтительно это антитело содержит один или два вариабельных домена тяжелой цепи. Более предпочтительно это антитело дополнительно содержит один или два вариабельных домена легкой цепи.
Предпочтительно этот Рс-содержащий белок является антителом.
Термин антитело относится к иммуноглобулину или его фрагменту и включает в себя любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий сайт. Этот термин включает в себя, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические, неспецифические, гуманизированные антитела, антитела человека, химерные, одноцепочечные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутированные, трансплантированные или генерированные ίη νίΐτο антитела. Это антитело может быть выбрано из любого из известных изотипов антител, например 1дА, 1д, 1§ϋ, 1дЕ, 1дМ. Это антитело может быть мономером, димером или мультимером, таким как тример или пентамер.
Примерами антител, которые могут быть очищены в соответствии с данным изобретением, являются абциксимаб, ритуксимаб, базиликсимаб, даклицумаб, паливицумаб, инфликсимаб, трастуцумаб, алемтуцумаб, адалимумаб, цетуксимаб, эфалицумаб, ибритумомаб, бевацицумаб или омалицумаб. Дополнительными примерами антител, которые могут быть подвергнуты катионообменной хроматографии в соответствии с данным изобретением, являются антитела против СИ2, СИ3, СИ4, СИ8, СИ11а, СИ14, СИ18, СИ20, СИ22, СИ23, СИ25, СИ33, СИ40, СИ44, СИ52, СИ80, СИ86, СИ147, СИ164, 1Ь-2-рецептора, 1Ь-4-рецептора, 1Ь-6-рецептора, ΙΕ-12-рецептора, субъединиц 1Ь-18-рецептора (1Е-18В-альфа, 1И-18Пбета), ТАС1, ВСМА, ВАРР-В, ЕСР-рецептора, УЕСР-рецептора, интегрина α4β7, интегрина УИА4, интегринов В2, ТВАЮ-рецепторов 1, 2, 3 и 4, ΡΆΝΚ, лиганда КАИК, адгезионной молекулы эпителиальных клеток (ЕрСАМ), молекулы 3 межклеточной адгезии (1САМ-3), СТБА4, Рс-гамма-Ι, II или IIIрецептора, НЬА-ЭВ 10 бета, антигена НЬА-ЭВ, Ь-селектина.
- 5 017152
Антитела, направленные против ΤΝΤ, В1у§ или интерферона-γ, являются дополнительными примерами представляющих терапевтический интерес антител.
Ес-слитые белки являются также Ее-содержащими белками, которые предпочтительно подвергают способу этого изобретения.
Термин Ес-слитый белок, в данном контексте, обозначает белки, в частности терапевтические белки, содержащие произведенную из иммуноглобулина часть молекулы, которая будет называться здесь Ес-частью, и часть молекулы, произведенную из второго, не являющегося иммуноглобулином белка, которая будет называться здесь терапевтической частью молекулы, независимо от того, предполагается или не предполагается лечение заболевания.
Терапевтические Ес-слитые белки, т.е. Ес-слитые белки, предназначенные для лечения или предупреждения заболевания животного или предпочтительно для лечения человека либо введения человеку, особенно пригодны для очистки в соответствии с этим изобретением.
Любой Ес-слитый белок может быть очищен в соответствии с данным изобретением, например интерферон-З-содержащий слитый белок. Предпочтительно способ этого изобретения является способом очистки Ес-слитого белка, содержащего лигандсвязывающий фрагмент, такой как весь внеклеточный домен или часть внеклеточного домена члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΤΚ).
Терапевтической частью Ес-слитого белка может быть, например, ЕРО, ТРО, гормон роста, интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, РЭСЕ-бета, УЕСЕ, 1Ь-1-альфа, 1Ь-1-бета, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-8, ΣΠ-10, 1Ь-12, ΙΏ-18, 1Ь-18-связывающий белок, ТСЕ-бета, ТСЕ-альфа или ΤΝΡ-бета или их производные.
Терапевтическая часть молекулы этого изобретения может быть также произведена из рецептора, например трансмембранного рецептора, может быть предпочтительно произведена из внеклеточного домена рецептора и, в частности, лигандсвязывающего и необязательно ингибирующего фрагмента внеклеточной части или домена конкретного рецептора. Примерами представляющих интерес рецепторов являются СЭ2, СЭ3, ΟΌ4, ΟΌ8, СП11а, ΟΌ14, ΟΌ18, ΟΌ20, ΟΌ22, ΟΌ23, ΟΌ25, ΟΌ33, ΟΌ40, ΟΌ44, СЭ52, СЭ80, СП86, СЭ147, СП164, 1Ь-2-рецептор, 1Ь-4-рецептор, ΙΕ-6-рецептор, 1Ь-12-рецептор, субъединицы ΙΏ-18-рецептора (1Ь-18К-альфа, 1Ь-18К-бета), ЕСЕ-рецептор, УЕСЕ-рецептор, интегрин альфа 4/бета 7, интегрин УЪА4, интегрины В2, ТРАШ-рецепторы 1, 2, 3 и 4, ΚΑΝΚ, лиганд ΚΑΝΚ, адгезионная молекула эпителиальных клеток (ЕрСАМ), молекула 3 межклеточной адгезии (1САМ-3), СТЬА4 (который является цитотоксическим Т-лимфоцит-ассоциированным антигеном), Ес-гамма-1-рецептор, НЬ ΑΏΕ 10 бета, антиген НЬА-ΏΚ, Ь-селектин.
Высокопредпочтительным является то, что терапевтическая часть молекулы этого изобретения произведена из рецептора, принадлежащего к суперсемейству ΤΝΤΚ. Эта терапевтическая часть молекулы может быть, например, внеклеточным доменом ΤΝΤΚ1 (р55), ΤΝΤΚ2 (р75), ОХ40, остеопротегерином, СЭ27, СЭ30, СЭ40, ΡΑΝΚ, ΏΚ3, Еак-лигандом, 'ГКАШ-ВТ, ΤΚΛΙΕ-Κ2, ΤΚΛΙΕ-Κ3, ТА1Е-И4, ЫСЕК, ΑΙΤΡ, ВАЕЕК, ВСМА, ΤΑΤΊ или может быть произведена из них.
Согласно данному изобретению эта терапевтическая часть молекулы, произведенная из члена суперсемейства ΤΝΤΚ, предпочтительно содержит весь внеклеточный домен этого члена ΤΝΤΚ или часть внеклеточного домена этого члена ΤΝΤΚ и более предпочтительно содержит лигандсвязывающий фрагмент такого члена ΤΝΤΚ.
Следующая табл. 5 содержит список членов суперсемейства ΤΝΤΚ, из которых может быть произведена терапевтическая часть молекулы в соответствии с данным изобретением и их соответствующих лигандов. Лигандсвязывающий фрагмент члена этого семейства ΤΝΤΚ может быть легко определен квалифицированным в данной области специалистом, например, в простом анализе ίη νίίτο, измерением связывания между белковым фрагментом этого рецептора и соответствующим лигандом. Таким анализом может быть, например, простой сэндвич-анализ ίη νίίτο типа К1А или ЕЬ1БА, в котором один из этих белков, например фрагмент рецептора, иммобилизуют с носителем (например, планшетом ЕЬ1БА) и инкубируют после подходящего блокирования сайтов связывания белка на этом носителе со вторым белком, например лигандом. После инкубирования связывание лиганда детектируют, например, с использованием радиоактивного мечения в сцинтилляционном счетчике. Связывание лиганда может быть также определено с меченым антителом или первым лиганд-специфическим антителом и вторым, меченым антителом, направленным против константной части первого антитела. Таким образом, связывание лиганда может быть легко определено в зависимости от используемой метки, например, в цветной реакции. Предпочтительно способ данного изобретения предназначен для очистки Ес-слитого белка, содержащего терапевтическую часть молекулы, произведенную из члена суперсемейства ΤΝΕΚ, выбранного из членов суперсемейства ΤΝΈΚ, приведенных в списке в табл. 5.
- 6 017152
Таблица 5
Суперсемейство ΤΝΤΚ (согласно ЬоскЦеу е! а1., 2001 и Во88еи е! а1., 2006)
Член суперсемейства ΤΝΓΕ | Лиганд |
КОЕК | |
ЕОАК | ΕϋΑ-ΑΙ |
ΧΕϋΑΕ | ЕЦА-А2 |
С040 | С04СЬ |
Раз | ГазЬ |
0x40 | ОХ40Г |
ΑΙΤΚ | А1ТКЬ |
СИТИ | стткь |
созо | соЗОь |
0Ώ40 | СО40Ь |
ΗνβΑ | ИСНТ, ЬТ-альфа |
4-1ВВ | 4-1ВВЕ |
ΤΝΓΚ2 | таг-альфа, ЬТ-альфа, ЬТ-альфа-бета |
ЬТ-бетаК | ЫСНТ, ЬТ-альфа, ЬТ-альфа-бета |
ϋΚ3 | ТЬ1А |
0027 | СО27Ъ |
та гм | таг-альфа, ЬТ-альфа, ЬТ-альфа-бета |
ьтвв | ЬТ-бета |
ΕΆΝΚ | КАККЬ |
ТАС1 | В1у5, АРМЕ |
ВСМА | В1у8, АРЕ1Ь |
ВАГГ-Е | ВАЕГ (= В1уЗ) ' |
ТЕА1БР1 | ТЕА1Ь |
ТЕА1БЕ2 | ТЕАТЬ |
ТЕА1ШЗ | ТВА1Ь |
ТНА1ЬН4 | ΤΚΑΙΕ |
Гп14 | ТИЕАК |
ОРС | ΒΑΝΚΕ, ΤΕΑΙΕ |
ΩΕ4 | ТКА1Ь |
ТНА1Ь | |
ϋοΗΙ | ТЙА1Ь |
0сЕ2 | ΤΕΑΙΕ |
ОсКЗ | ЕазЬ, ЫЗНТ, ТША |
В предпочтительном варианте осуществления Ес-слитый белок содержит терапевтическую часть, выбранную из внеклеточного домена ΤΝΕΚΤ, ΤΝΕΚ2 или их ΤΝΕ-связывающего и необязательно ингибирующего фрагмента.
В следующем предпочтительном варианте осуществления Ес-слитый белок содержит терапевтическую часть, выбранную из внеклеточного домена ВАЕЕ-К, ВСМА или ΤΑί,'Ι или их фрагмента, связывающего по меньшей мере один из В1у8 или АРВ1Ь.
Один анализ для тестирования способности связывания с В1у8 или АРВ1Ь описан, например, в Нуιηο\νίΙζ е! а1., 2006.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления терапевтическая часть Ес-слитого белка содержит богатый цистеином псевдоповтор 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1.
Предпочтительно эта терапевтическая часть молекулы произведена из ΤΑΟΙ. ΤΑί,'Ι является предпочтительно ΤΑί,'Ι человека. 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2 соответствует аминокислотной последовательности полноразмерного рецептора ΤΑί,'Ι (также вход δνίδδΡτοΐ 014836). Более предпочтительно эта терапевтическая часть молекулы содержит растворимую часть ΤΑί,'Ι. предпочтительно произведенную из внеклеточного домена ΤΑί,'Ι. Предпочтительно произведенная из ΤΑί,'Ι терапевтическая часть молекулы содержит, по меньшей мере, аминокислоты 33-67 8Е0 ΙΌ ΝΟ:2 и/или аминокислоты 70-104 8Е0 ΙΌ N0:2. В одном предпочтительном варианте осуществления внеклеточный домен ΤΑίΤ включенный в терапевтическую часть согласно данному изобретению, содержит аминокислоты (или состоит из них) 1-166 8Е0 ΙΌ N0: 2, или аминокислоты 30-166 8Е0 ΙΌ N0: 2, или аминокислоты 30-119 8Е0 ΙΌ N0: 2, или аминокислоты 30110 8Е0 ΙΌ N0: 2. Все из этих терапевтических частей молекул являются предпочтительными для получения Ес-слитого белка для очистки по способу этого изобретения и комбинируются с Ес-частями, описанными подробно выше, и, в частности, с Ес-частью молекулы, содержащей 8Е0 ΙΌ N0: 3 или состоя
- 7 017152 щей из 8ЕО ΙΌ N0: 3. Один высокопредпочтительный Ее-слитый белок, подлежащий очистке с использованием данного изобретения, содержит 8Е0 ΙΌ N0: 4 или состоит из 8Е0 ΙΌ N0: 4 либо кодируется полинуклеотидом 8Е0 ΙΌ N0: 7.
Таким образом, чрезвычайно предпочтительно, чтобы Ес-слитый белок содержал полипептид, выбранный из:
a) аминокислот 34-66 8Е0 ΙΌ N0: 2;
b) аминокислот 71-104 8Е0 ΙΌ N0: 2;
c) аминокислот 34-104 8Е0 ΙΌ N0: 2;
6) аминокислот 30-110 8Е0 ΙΌ N0: 2;
е) 8ЕО ΙΌ N0: 3;
I) 8ЕО ΙΌ N0: 4;
д) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с комплементом 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 6 либо 7 при условиях высокой строгости; и
II) мутеина любого из с)-е) или ί), имеющего по меньшей мере 80, или 85, или 90, или 95% идентичность последовательности с полипептидом с)-е) или ί);
причем этот полипептид связывается по меньшей мере с одним из В1уз или ΑΡΚ1Ε.
Термин свободные Ес-части, свободная Ес-часть или просто свободный Ес, в данном контексте, включает в себя любую часть Ес-содержащего белка, подлежащего очистке в соответствии с данным изобретением, которая произведена из константного домена или константных доменов иммуноглобулина, но не содержит полные дополнительные домены. Таким образом, если Ес-содержащий белок содержит вариабельные домены иммуноглобулина, свободный Ес не содержит существенных частей вариабельных доменов. Если Ес-содержащий белок является Ес-слитым белком, свободный Ес не содержит существенных частей терапевтической части этого Ес-слитого белка. Свободный Ес может содержать димеры шарнирной области, домены СН2 и СН3 Ι§0. которые не соединены или не связаны с существенными частями терапевтической части молекулы или вариабельных доменов иммуноглобулина, и соответствует, например, Ес-части, которая генерируется расщеплением папаином. Существенная часть может быть, например, не менее 80, 85, 90, 95, 98 или 99% полноразмерного вариабельного домена или терапевтической части молекулы, присутствующей в Ес-содержащем белке.
Мономеры, произведенные из Ес-части молекулы, могут также содержаться в этой фракции свободного Ес. Понятно, что свободный Ес может все еще содержать ряд аминокислотных остатков из терапевтической части молекулы, таких как, например, одну-пятьдесят, или одну-двадцать, или одну-десять, или одну-пять аминокислот, или одну или две отдельные аминокислоты, принадлежащие к терапевтической части молекулы или вариабельному домену, все еще слитых с Ес-частью.
Катионообменная хроматография может проводиться на любой подходящей катионообменной смоле, такой как, например, слабые или сильные катионообменники, как объясняется выше в разделе Уровень техники этого изобретения.
Предпочтительно катионообменную хроматографию проводят на сильной катионообменной смоле. Более предпочтительно катионообменный материал содержит сшитый метакрилат, модифицированный 803 --группами. Колонка, коммерчески доступная под товарным названием Егас1оде1 ЕМЭ 803 - (из Мегск), является примером катионообменной смолы, которая особенно пригодна в контексте данного способа.
Предпочтительно жидкость или композицию, содержащую Ес-содержащий белок, наносят на катионообменную колонку при рН по меньшей мере на одну единицу более низком, чем изоэлектрическая точка (ρΙ) указанного Ес-слитого белка.
Предпочтительно после нанесения эту колонку промывают буфером, имеющим проводимость 6-10 мСм/см и рН 5,5-7,5.
Этот буфер может, например, иметь проводимость 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 или 9,9 мСм/см.
Более предпочтительно проводимость находится в диапазонах от 7,6 до 9,2, т.е. 8,4 ± 0,8 мСм/см. Эту стадию промывания предпочтительно проводят при рН в диапазоне от 5,5 до 7,5, предпочтительно от 6,0 до 7,0.
рН этого буфера может быть, например, равен 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5.
В следующем предпочтительном варианте осуществления стадию промывания проводят в буфере, содержащем 60-140, предпочтительно 70-130, более предпочтительно 75-125 мМ фосфат натрия. Этот буфер может содержать 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135 или 140 мМ фосфат натрия.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления эту катионообменную колонку элюируют при рН в диапазоне от 7,0 до 8,5, предпочтительно 7,25-7,3, или 7,35, или 7,4, или 7,45, или 7,5, или 7,55, или 7,6, или 7,65, или 7,7, или 7,75, или 7,8, или 7,85, или 7,9, или 7,95, или 8,0, или 8,05, или 8,1, или 8,15, или 8,2, или 8,25, или 8,3, или 8,35, или 8,4, или 8,45, или 8,5.
- 8 017152
Элюция может предпочтительно проводиться при проводимости в диапазоне от 15 до 22 мСм/см. Например, проводимость может быть выбрана из 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 мСм/см.
Предпочтительным буфером для элюции является фосфатный буфер.
В соответствии с данным изобретением катионообменная хроматография может быть предпочтительно использована для элиминации или уменьшения свободного Ес в 5-15-кратном диапазоне. Таким образом, может быть достигнуто уменьшение концентрации свободного Ес в содержащих Ессодержащий белок жидкости, препарате или композиции до менее 20, или менее 15, или менее 10, или менее 5, или менее 2, или менее 1, или менее 0,8, или менее 0,5, или менее 0,3, или менее 0,2, или менее 0,1% общей концентрации белка.
В предпочтительном варианте осуществления катионообменная хроматография может быть использована в способе очистки, имеющем одну или несколько дополнительных стадий, предпочтительно выбранных из аффинной хроматографии, анионообменной хроматографии и гидроксиапатитной хроматографии.
В высокопредпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения используют в качестве второй стадии схемы очистки Ес-содержащего белка, включающей в себя следующие стадии:
a) подвергание жидкости, содержащей указанный Ес-содержащий белок, белок А-, или белок С-. или белок Ь-аффинной хроматографии;
b) подвергание элюата из стадии а) катионообменной хроматографии;
c) подвергание элюата из стадии Ь) анионообменной хроматографии и
') подвергание проходящей фракции стадии с) гидроксиапатитной хроматографии и сбор элюата для получения очищенного Ес-содержащего белка.
В соответствии с данным изобретением жидкость, содержащую Ес-содержащий белок, сначала подвергают белок А-, или белок С-, или белок Ь-, или белок А/С-аффинной хроматографии. Эта жидкость может быть предпочтительно материалом культуры клеток, например солюбилизированными клетками, более предпочтительно супернатантом культуры клеток. Термин супернатант культуры клеток относится, в данном контексте, к среде, в которой культивируются клетки и в которую секретируются белки при условии, что они содержат подходящие клеточные сигналы, так называемые сигнальные пептиды. Предпочтительно экспрессирующие Ес-содержащий белок клетки культивируют в условиях бессывороточного культивирования. Так, предпочтительно супернатант культуры клеток лишен компонентов сыворотки животных. Наиболее предпочтительно среда культуры клеток является средой с определенным химическим составом.
Белки А, С, А/С или Ь, используемые для аффинной хроматографии, могут быть, например, рекомбинантными. Они могут быть также модифицированы для улучшения его свойств (например, как в смоле, называемой МаЬ8е1ес1 8иВе, коммерчески доступной из СЕ НеаНйсате). В предпочтительном варианте осуществления стадию а) проводят на смоле, содержащей сшитую агарозу, модифицированную рекомбинантным белком А. Колонка, коммерчески доступная под названием МаЬ§е1ес1 Х1та (из СЕ Неа11йсаге), является примером аффинной смолы, которая особенно пригодна для стадии а) этого способа.
Белок А-, или белок С-, или белок Ь-аффинная хроматография используется предпочтительно в качестве стадии захвата и, следовательно, служит для очистки Ес-содержащего белка, в частности элиминации белков клетки-хозяина и агрегатов Ес-содержащего белка, и для концентрирования препарата Ессодержащего белка.
Термин агрегаты, в данном контексте, относится к агрегатам белка и включает в себя мультимеры (такие как димеры, тетрамеры или агрегаты более высокого порядка) Ес-содержащего белка, подлежащего очистке, и могут приводить, например, к высокомолекулярным агрегатам.
Аффинная хроматография имеет дополнительное преимущество уменьшения уровня агрегатов в 2-4 раза.
С использованием белка А-, или С-, или А/С-, или Ь-аффинной хроматографии уровни белков клетки-хозяина могут быть уменьшены в 100-300 раз.
В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения элюцию в стадии а) проводят при рН в диапазоне 2,8-4,5, предпочтительно 3,0-4,2, более предпочтительно при 3,5, 3,55, 3,6, 3,65, 3,7, 3,75, 3,8, 3,85, 3,9, 3,95, 4,0, 4,05, 4,1 или 4,15. Элюция в стадии а) может также проводиться градиентом рН, предпочтительно градиентом рН от 4,5 до 2,8.
В следующем предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии а) проводят в буфере, выбранном из ацетата натрия или цитрата натрия. Подходящие концентрации буфера выбраны, например, из 50, или 100, или 150, или 200, или 250 мМ.
Согласно данному изобретению элюат из белков А-, или С-, или А/С-, или Ь-хроматографии подвергают катионообменной хроматографии, описанной подробно выше.
Предпочтительно элюат катионообменной хроматографии, т.е. стадии (Ь), разбавляют или диализуют в подходящий буфер для нанесения перед нанесением его на анионообменную колонку. Анионообменную колонку предпочтительно также уравновешивают буфером для нанесения.
Предпочтительный рН для буфера нанесения является по меньшей мере на одну единицу более низким, чем р1. Подходящие величины рН находятся в диапазоне от 6,0 до 8,5, предпочтительно от 7,0 до
- 9 017152
8,0, например 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95 или 8,0. Предпочтительная проводимость для буфера для нанесения находится в диапазоне 3,0-4,6 мСм/см.
Подходящим буфером для уравновешивания/нанесения может быть, например, фосфат натрия при концентрации в диапазоне от 5 до 35, предпочтительно от 20 до 30 мМ. Например, концентрация буфера может быть 10, 15, 20, 25, 30 мМ. В рамках данного изобретения протекающую жидкость (также называемую проскакивающей жидкостью) анионообменной хроматографии, содержащую представляющий интерес Рс-содержащий белок, собирают.
Стадия с) этого способа данного изобретения дополнительно уменьшает агрегаты в 3-5 раз и белки клетки-хозяина в 30-70 раз.
Согласно данному изобретению проходящую жидкость анионообменной хроматографии стадии с) используют затем для дополнительной очистки гидроксиапатитной хроматографией. Любая гидроксиапатитная смола может быть использована для проведения стадии ά) способа по этому изобретению. В предпочтительном варианте осуществления стадию ά) проводят на керамической гидроксиапатитной колонке, такой как гидроксиапатитная смола типа I или типа II. Гидроксиапатитная смола может иметь частицы любого размера, например 20, 40 или 80 мкм. В высокопредпочтительном варианте осуществления эта керамическая гидроксиапатитная смола содержит частицы, имеющие размер 40 мкм. Гидроксиапатитной смолой, которая особенно пригодна для стадии ά) этого способа, является колонка, коммерчески доступная под названием Керамический гидроксиапатит типа I СНТ, 40 мкм.
В предпочтительном варианте осуществления проходящую жидкость из стадии с) непосредственно наносят на гидроксиапатитную смолу, т.е. без предварительного разведения или диализа в подходящий буфер для нанесения. Нанесение предпочтительно проводят при рН 6,5-7,5, например 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,1, 7,2, 7,3 или 7,4 и предпочтительно 7,0.
В следующем предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии ά) проводят в присутствии фосфата натрия в диапазоне от 2 до 10 мМ, предпочтительно в диапазоне от 1,75 до 5,25 мМ, например при 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5 мМ.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии ά) проводят при рН в диапазоне от 6,0 до 7,0, например при 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9.
В другом предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии ά) проводят в присутствии хлорида натрия в диапазоне от 0,4 до 1 М, предпочтительно при 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 М, наиболее предпочтительно при 0,6 М.
Согласно данному изобретению собирают элюат гидроксиапатитной хроматографии, содержащий окончательно очищенный препарат Рс-содержащего белка.
Подходящими материалами матрикса, т.е. материалами-носителями для хроматографических смол, используемых в стадиях а)-с), которые могут быть использованы в связи с данным изобретением, могут быть, например, агароза (сефароза, супероза), декстран (сефадекс), полипропилен, метакрилатцеллюлоза, полистирол/дивинилбензол или т.п. Эти материалы смол могут присутствовать в различных сшитых формах в зависимости от конкретного применения.
Объем смолы, длина и диаметр используемой колонки, а также динамическая емкость и скорость потока зависят от нескольких параметров, таких как объем обрабатываемой жидкости, концентрация белка в жидкости, подвергаемой способу этого изобретения, и т.д. Определение этих параметров для каждой стадии находится в пределах средней квалификации специалиста в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления данного способа очистки выполняют одну или несколько стадий ультрафильтрации. Ультрафильтрация применима для удаления малых органических молекул и солей в элюатах, происходящих из предыдущих хроматографических стадий, для уравновешивания Рс-содержащего белка в общем буфере или для концентрирования Рс-содержащего белка до желаемой концентрации. Такая ультрафильтрация может, например, выполняться на ультрафильтрационных мембранах с порами, позволяющими удаление компонентов, имеющих молекулярные массы ниже 5, 10, 15, 20, 25, 30 или более кДа.
Предпочтительно ультрафильтрацию проводят между стадиями Ь) и с) и/или после стадии ά). Более предпочтительно проводят две стадии ультрафильтрации, одну между стадиями Ь) и с) и одну после стадии ά).
Если белок, очищенный в соответствии с этим способом данного изобретения, предназначен для введения людям, полезно включить одну или несколько стадий удаления вирусов в этом способе. Предпочтительно стадию фильтрации для удаления вирусов проводят после стадии ά). Более предпочтительно этой стадией фильтрации для удаления вируса является стадия нанофильтрации, где этот фильтр имеет номинальный размер пор 20 нм. Способ по данному изобретению и, в частности, стадии а), с), ά) в комбинации с нанофильтрацией эффективно элиминируют вирусную нагрузку до объединенной ЬКУ (1одвеличины уменьшения) до приблизительно 15-25.
Для облегчения хранения или транспортировки, например, этот материал может быть замороженным и оттаиваться до и/или после любой стадии очистки этого изобретения.
Согласно данному изобретению рекомбинантный Рс-слитый белок может продуцироваться в эука
- 10 017152 риотической системе экспрессии, такой как клетки дрожжей, насекомого или млекопитающего, приводящей к гликозилированным Ес-содержащим белкам.
Согласно данному изобретению наиболее предпочтительно экспрессировать Ес-содержащий белок в клетках млекопитающих, таких как клеточные линии животных, или в клеточных линиях человека. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клеточная линия миеломы мыши N80 являются примерами клеточных линий, которые являются особенно подходящими для экспрессии Ес-содержащего белка, подлежащего очистке. Этот Ес-содержащий белок может также предпочтительно продуцироваться в клеточных линиях человека, таких как, например, клеточная линия фибросаркомы НТ1080 человека, клеточная линия ретинобластомы человека РЕК.С6 или клеточная линия эмбриональной почки человека 293 либо перманентная клеточная линия амниоцитов, как описано, например, в ЕР 1230354.
Если Ес-слитый белок, подлежащий очистке, экспрессируется клетками млекопитающих, секретирующими его, исходным материалом способа очистки этого изобретения является супернатант культуры клеток, также называемый сбором клеток или неочищенным сбором. Если клетки культивируют в среде, содержащей сыворотку животного, супернатант этой культуры клеток также содержит сывороточные белки в качестве загрязнений.
Предпочтительно экспрессирующие и секретирующие Ес-содержащий белок клетки культивируют в бессывороточных условиях. Ес-содержащий белок может также продуцироваться в среде с определенным химическим составом. В этом случае исходным материалом способа очистки является супернатант бессывороточной культуры клеток, который содержит в основном белки клеток-хозяев в качестве загрязнений. Если к среде культуры клеток добавляют факторы роста, такие как инсулин, эти белки будут также элиминироваться во время процесса очистки.
Для создания растворимых, секретируемых Ес-содержащих белков, которые высвобождаются в супернатант культуры клеток, используют либо природный сигнальный пептид терапевтической части Ессодержащего белка, либо предпочтительно гетерологичный сигнальный пептид, т.е. сигнальный пептид, произведенный из другого секретируемого белка, являющийся эффективным в этой конкретной системе экспрессии, такой как, например, сигнальный пептид бычьего или человеческого гормона роста либо сигнальный пептид иммуноглобулина.
Как упоминалось выше, предпочтительным Ес-содержащим белком для очистки согласно данному изобретению является Ес-содержащий белок, имеющий терапевтическую часть молекулы, произведенную из ТАС1 человека (8ЕО Ш N0: 2), и, в частности, из его внеклеточного домена (аминокислоты 1-165 8Е0 Ш N0: 2). Предпочтительный фрагмент содержит аминокислоты 30-110 8Е0 Ш N0: 2. В дальнейшем описании терапевтические части, произведенные из внеклеточного домена ТАС1, будут называться растворимым ТАС1 или кТАСГ1. Предпочтительная Ес-часть молекулы содержит 8Е0 Ш N0: 3, приводящую к Ес-слитому белку 8Е0 Ш N0: 4, в дальнейшем описании называемому ТАС1-Ес. Термин ТАС1-Ес, в данном контексте, включает в себя также мутеины ТАС1-Ес.
Термин мутеины, в данном контексте, относится к аналогам кТАС1 или ТАС1-Ес, в которых один или несколько из аминокислотных остатков кТАС1 или ТАС1-Ес заменены другими аминокислотными остатками или делетированы, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к первоначальной последовательности кТАС1 или ТАС1-Ес без существенного изменения активности полученных продуктов в сравнении с первоначальными кТАС1 или ТАС1-Ес. Эти мутеины получают известными способами синтеза и/или сайт-направленного мутагенеза либо любым другим способом, подходящим для этого.
Мутеины в соответствии с данным изобретением включают в себя белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с комплементом ДНК или РНК, который кодирует 5ТЛС1 или ТАС1-Ес в соответствии с любой из 8Е0 Ш N0: 2 или 4 при строгих условиях. Одним примером ДНК-последовательности, кодирующей ТАС1-Ес, является 8Е0 Ш N0: 7.
Термин строгие условия относится к гибридизации и последующим условиям промывки, которые специалисты с обычной квалификацией в данной области обычно называют строгими. См. Аи8иЬе1 с1 а1., СитгеШ Рто1осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, кирга, Шеткаеисе, N. Υ., § 6.3 аий 6.4 (1987, 1992). Без ограничения, примеры строгих условий включают в себя условия промывки, на 12-20°С ниже рассчитанной Тт исследуемого гибрида, например в 2 х 88С и 0,5% ДСН в течение 5 мин, 2 х 88С и 0,1% ДСН в течение 15 мин; 0,1 х 88С и 0,5% ДСН при 37°С в течение 30-60 мин и затем 0,1 х 88С и 0,5% ДСН при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисты с обычной квалификацией в данной области понимают, что условия строгости зависят также от длины ДНК-последовательностей, олигонуклеотидных зондов (например, 1040 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если используются смешанные зонды, предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С, см. Аи8иЬе1, кирга.
В другом варианте осуществления любой такой мутеин имеет по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 95% идентичность или гомологию с исходным белком.
Идентичность отражает родство между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определяемое сравнением этих после
- 11 017152 довательностей. Обычно идентичностью называют точное соответствие нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидов или двух полипептидных последовательностей соответственно на протяжении длины сравниваемых последовательностей.
Для последовательностей, где нет точного соответствия, может быть определена %-ная идентичность. Обычно, эти две сравниваемые последовательности сопоставляют для получения максимальной корреляции между этими последовательностями. Это может включать в себя инсертирование гэпов в любую одну из последовательностей или в обе последовательности для увеличения степени сопоставления, %-ная идентичность может быть определена на протяжении всей длины каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное сопоставление), которое особенно удобно для последовательностей одной и той же длины, или на протяжении коротких определенных длин (так называемое локальное сопоставление), которое особенно удобно для последовательностей неравной длины.
Способы для сравнения идентичности и гомологии двух или нескольких последовательностей хорошо известны в данной области. Так, например, программы, доступные в пакете ХУксопДп 8сс.|испсс Лиа1у818 Раскадс, усглоп 9.1 (Эстсгсих 1. с! а1., 1984), например программы ΒΕ8ΤΕΙΤ и ОЛР, могут быть использованы для определения %-ной идентичности между двумя полинуклеотидами и %-ной гомологии между двумя полипептидными последовательностями. ΒΕ8ΤΕΙΤ использует алгоритм локальной гомологии 8тйй апб \Уа1сгтап (1981 г.) и находит наилучший единственный район сходства между двумя последовательностями. Другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями также известны в данной области, например семейство программ ΒΣΆδΤ (Л118сйи1 8.Е. с! а1., 1990, Л118сйи1 8.Е. с! а1., 1997, доступное через домашнюю страницу ΝΟΒΙ в \\л\л\'.псЫ.п1т.ш11.доу). и ΕΆ8ΤΆ (Рсагаоп №.К, 1990).
Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дубликатную относительно последовательности δΤΛΟΙ или ΤΆΟΙ-Εο, чтобы иметь, по существу, одинаковую лигандсвязывающую активность с активностью белка 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 или 4. Например, одной активностью ΤΆΟΙ является его способность связывания с ЕБъ или ЛРК1Ь (Η\τηο\νίΙζ с! а1., 2006). Можно считать, что, пока этот мутеин имеет существенную связывающую ЛРШЬ или ЕБъ активность, он имеет, по существу, одинаковую активность в отношении ΤΆΟΙ. Таким образом, квалифицированный в данной области специалист может легко определить, имеет ли любой конкретный мутеин, по существу, ту же самую активность, что и белок 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 4, посредством рутинного экспериментирования.
Предпочтительные изменения для мутеинов согласно этому изобретению являются изменениями, которые известны как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены δΤΛΟΙ или ΤΆΟΙ-Ес могут включать в себя синонимичные аминокислоты в группе, которые имеют достаточно сходные физико-химические свойства, чтобы замена между членами этой группы сохраняла биологическую функцию этой молекулы (ОтапШат, 1974). Ясно, что инсерции и делеции аминокислот могут быть также произведены в вышеописанных последовательностях без изменения их функции, в частности, если эти инсерции или делеции включают в себя только небольшое число аминокислот, например менее тридцати, менее двадцати или предпочтительно менее десяти, и не удаляют или не заменяют аминокислоты, которые являются решающими для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, продуцируемые такими делениями и/или инсерциями, входят в сферу действия данного изобретения.
Предпочтительно этими консервативными группами аминокислот являются группы, определенные в табл. 2. Более предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. 3 и наиболее предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. 4.
Таблица 2
Предпочтительные группы синонимичных аминокислот
Аминокислота | Синонимичная | группа | ||||
Зег | Зег, | ТЬг, | С1у, | Азп | ||
Агд | Агд, | 31п, | ЬуЗ, | С1и, | Нтз | |
Ьеи | 11е, | РЬе, | Туг, | МеЬ, | Уа1, | Ьеи |
Рго | 61у, | А1а, | ТНг, | Рго | ||
ТЬг | Рго, | Зег, | А1а, | С1у, | Н1з, | С1п, |
А1а | С1у, | ТЬг, | Рго, | А1а | ||
ν^ι | МеЬ, | Туг, | РЬе, | Не, | Ьеи, | Уа1 |
С1у | А1а, | ТЬг, | Рго, | Зег, | С1у | |
Не | МеЬ, | Туг, | РЬе, | Уа1, | Ьеи, | 11е |
РЬе | Тгр, | МеЬ, | Туг, | 11е, | Уа1, | Ьеи, |
Туг | Тгр, | МеТ, | РЬе, | 11е, | \7а1, | Ьеи, |
Суз | Зег, | ТЬг, | Суз |
- 12 017152
Н15 | С1и, | Ьуз, | С1п, | ТЬг, | Агд, | ΗΪ5 | |
С1п | С1и, | Ьуз, | Азп, | ΗΪ3, | ТЬг, | Агд, | С1п |
Азп | С1п, | Азр, | Зег, | Азп | |||
Ьуз | С1и, | С1п, | Н13, | Агд, | Ьуз | ||
Азр | С1и, | Азп, | Азр | ||||
С1и | Азр, | Ьуз, | Азп, | С1п, | ΗΪ3, | Агд, | С1и |
Мео | РЬе, | Не, | Уа1, | Ьеи, | Мер | ||
Тгр | Тгр |
Таблица 3
Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот
Аминокислота | Синонимичная группа | ||||
Зег | Зег | ||||
Агд | Н1з, | Ьуз, | Агд | ||
Ьеи | Ьеи, | 11е, | РЬе, | МеЬ | |
Рго | А1а, | Рго | |||
ТЬг | ТЬг | ||||
А1а | Рго, | А1а | |||
Уа1 | Уа1, | МеЬ, | 11е | ||
С1у | С1у | ||||
11е | 11е, | Мер, | РНе, | Уа1, | Ьеи |
РЬе | Мер, | Туг, | 11е, | Ьеи, | РЬе |
Туг | РЬе, | Туг | |||
Суз | Суз, | Зег | |||
Н13 | ΗΪ3, | С1п, | Агд | ||
С1л | С1и, | С1п, | ΗΪ3 | ||
Азп | Азр, | Азп | |||
Ьуз | Ьуз, | Агд | |||
Азр | Азр, | Азп | |||
С1и | С1и, | С1п | |||
Мер | Мер, | РЬе, | 11е, | Уа1, | Ьеи |
Тгр | Тгр |
Таблица 4
Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот
Аминокислота | Синонимичная группа | ||
Зег | Зег | ||
Агд | Агд | ||
Ьеи | Ьеи, | 11е, | Ме£ |
Рго | Рго | ||
ТЬг | ТЬг | ||
А1а | А1а | ||
Уа1 | Уа1 | ||
С1у | С1у | ||
11е | Не, | Мео, | Ьеи |
РЬе | РЬе | ||
Туг | Туг | ||
Суз | Суз, | Зег | |
ΗΪ3 | Н1з | ||
С1п | С1п | ||
Азп | Азп | ||
Ьуз | Ьуз | ||
Азр | Азр | ||
С1и | |||
Мер | МеЬ, | 11е, | Ьеи |
Тгр | МеЬ |
Функциональное производное может быть получено из Ес-слитого белка, очищенного в соответствии с данным изобретением. Функциональные производные, в данном контексте, включают в себя производные Ес-содержащего белка, подлежащие очистке в соответствии с данным изобретением, которые могут быть получены из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на этих остатках, или Ν- или С-концевых групп, способами, известными в данной области, и включены в это
- 13 017152 изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность этого белка, которая является, по существу, одинаковой с этой активностью немодифицированного Ессодержащего белка, определенного выше, и не придают токсичные свойства содержащим его композициям.
Функциональные производные Ес-содержащего белка могут быть, например, конъюгированы с полимерами для улучшения свойств этого белка, таких как стабильность, время полужизни, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения этой цели Ессодержащий белок может быть связан, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ). ПЭГилирование может проводиться известными способами, описанными, например, в \УО 92/13095.
Функциональные производные могут также включать в себя, например, алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, образованные реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными частями молекул (например, алканоильной или карбоциклической ароильной группами) или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильных групп серильных или треонильных остатков), образованные с ацильными частями молекул.
В третьем аспекте это изобретение относится к белку, очищенному способом очистки в соответствии с данным изобретением. Далее такой белок называется также очищенным Ес-содержащим белком.
Такой очищенный Ес-содержащий белок является предпочтительно высокоочищенным Ессодержащим белком.
Высокоочищенный Ес-слитый белок определяют, например, по присутствию единственной полосы в окрашенном серебром, невосстановленном геле электрофореза в ДСН-ПААГ после нанесения белка в количестве 2 мкг на дорожку. Очищенный Ес-слитый белок может быть также определен по элюции в виде единственного пика в ВЖХ.
Препарат Ес-содержащего белка, полученный из процесса очистки этого изобретения, может содержать менее 20% загрязнений, предпочтительно менее 10, 5, 3, 2 или 1% загрязнений, или он может быть очищен до гомогенности, т. е. быть не содержащим каких-либо детектируемых белковых загрязняющих примесей согласно определению, например, электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром или ВЖХ, как объяснено выше.
Очищенные Ес-содержащие белки могут быть предназначены для терапевтического применения, в частности для введения пациентам-людям. Если очищенный Ес-содержащий белок вводят пациентам, его вводят предпочтительно системно и предпочтительно подкожно или внутримышечно либо местно, т.е. локально. Может быть удобным также ректальное или внутриоболочечное введение в зависимости от конкретного медицинского применения очищенного Ес-содержащего белка.
Для этой цели в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения очищенный Ессодержащий белок может быть приготовлен в виде фармацевтической композиции, т.е. вместе с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентами или т.п.
Определение фармацевтически приемлемый включает в себя любой носитель, который не препятствует эффективности биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным в отношении хозяина, которому его вводят.
Например, для парентерального введения этот активный белок (активные белки) могут быть приготовлены в унифицированной (стандартной) форме для инъекции в таких носителях, как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.
Активные ингредиенты фармацевтической композиции согласно этому изобретению могут вводиться индивидууму различными способами. Способы введения включают в себя интрадермальный, трансдермальный (например, в препаратах медленного высвобождения), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, внутричерепной, эпидуральный, местный, ректальный и интраназальный способы введения. Может быть использован любой другой терапевтически эффективный способ введения, например абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани или посредством генной терапии, где пациенту вводят (например, посредством вектора) ДНК-молекулу, кодирующую активный агент, что вызывает экспрессию и секрецию этого активного агента ίη νίνο. Кроме того, белок (белки) этого изобретения могут вводиться вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнители.
Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения, активный белок (активные белки) могут быть приготовлены в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка в ассоциации с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, солевым раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Этот препарат стерилизуют обычно используемыми способами.
Терапевтически эффективные количества активного белка (активных белков) будут зависеть от многих переменных, в том числе от типа Ес-содержащего белка, аффинности Ес-содержащего белка в отношении его лиганда, способа введения, клинического состояния пациента.
- 14 017152
Терапевтически эффективное количество является таким количеством, что при введении этот Бссодержащий белок приводит к ингибированию его лиганда терапевтической части этого Бс-слитого белка, как объяснялось выше, и в соответствии с табл. 5 выше.
Доза, вводимая в виде единственной дозы или в виде множественных доз индивидууму, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, включающих в себя фармацевтические свойства Бсслитого белка, способ введения, состояние и характеристики пациента (пол, возраст, массу тела, состояние здоровья, размер), степень симптомов, одновременные способы лечения, частоту введения доз и желаемый эффект. Корректирование установленных диапазонов доз и манипулирование ими находится вполне в рамках квалификации специалистов в данной области, так же, как и способы ίη ν Иго и ίη νί\Ό определения ингибирования его лиганда терапевтической части Бс-слитого белка в индивидууме.
Очищенный Бс-содержащий белок может быть использован в количестве 0,001-100, или 0,01-10, или 0,1-5, или 1-3, или 2 мг/кг массы тела.
В следующих предпочтительных вариантах осуществления очищенный белок Бс-слитый белок вводят один раз в день или каждый второй день либо три раза в неделю или один раз в неделю.
Суточные дозы обычно вводят в разделенных дозах или в виде формы задержанного высвобождения, эффективной для получения желаемых результатов. Второе или последующие введения могут выполняться в виде дозы, которая является той же самой, меньшей или большей, чем начальная или предыдущая доза, введенная этому индивидууму. Второе или последующее введение может выполняться во время или до проявления этого заболевания.
Данное изобретение относится также к применению катионообменной хроматографии для уменьшения концентрации свободных Бс-частиц в композиции, содержащей Бс-содержащий белок.
В предпочтительном варианте осуществления концентрация свободного Бс уменьшается до менее 20, или менее 15, или менее 10, или менее 5, или менее 2, или менее 1, или менее 0,8, или менее 0,5, или менее 0,2, или менее 0,1% общей концентрации белка указанной композиции.
После полного описания этого изобретения квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что оно может выполняться в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий без отклонения от идеи и объема этого изобретения и без чрезмерного экспериментирования.
Хотя это изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, будет понятно, что оно может быть подвергнуто дополнительным модификациям. Эта заявка предназначена для включения любых вариаций, применений или адаптации этого изобретения в соответствии, в общем, с принципами этого изобретения и с включением таких отклонений от данного описания, которые находятся в пределах известной или обычной практики в области, к которой относится это изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, описанным здесь выше, как следует из объема прилагаемой формулы изобретения.
Все цитируемые здесь ссылки, в том числе журнальные статьи или аннотации, опубликованные или неопубликованные заявки на патент США или иностранные заявки, выданные США, или иностранные патенты или другие ссылки включены здесь в качестве ссылки в полном виде, в том числе со всеми результатами, таблицами, чертежом и текстом, представленными в этих цитируемых ссылках. Кроме того, все содержание этих ссылок в цитируемых здесь документах включено здесь в полном виде.
Ссылка на известные стадии способа, общепринятые стадии способов, известные способы или общепринятые способы ни в коей мере не является признанием того, что любой аспект, любое описание или любой вариант осуществления этого изобретения описан, объяснен или высказан в качестве предположения в известном уровне техники.
Предыдущее описание конкретных вариантов осуществления будет настолько полно выявлять основной характер этого изобретения, что другие исследователи могут посредством использования знаний, даваемых квалификацией в данной области (в том числе приведенным содержанием цитируемых ссылок), легко модифицируют и/или адаптируют для различного применения такие конкретные варианты осуществления, без чрезмерного экспериментирования, без отклонения от общей концепции данного изобретения. Таким образом, предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в диапазоне эквивалентов этих описанных вариантов осуществления на основании утверждений и руководящих описаний, представленных в них. Должно быть понятно, что фразеология или терминология, применяемая здесь, служит цели описания, а не ограничения, так что эта терминология или фразеология данного описания должна интерпретироваться квалифицированным в данной области специалистом в свете объяснений и руководства, представленных здесь, в комбинации со знаниями специалиста с обычной квалификацией в данной области.
Примеры
Очистка рекомбинантного ТАС1-Ге человека из бессывороточного супернатанта клеток СНО
Перечень сокращений:
ВУ - объем слоя
СНО - яичник китайского хомячка
Ό8Ρ - процесс ниже по потоку
- 15 017152
ЕЭТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЕЬ18А - твердофазный иммуносорбентный анализ
НАС - гидроксиапатитная хроматография
НСР - белок клетки-хозяина
ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ίά - внутренний диаметр
К - калий кД - килоДальтон
МЕ8 - 2-морфолиноэтансульфоновая кислота
Ыа - натрий
ЫаАс - ацетат натрия
н.о. - не определяли
РА-8Е-НРЬС - белок А - гель-проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография
м. д. - миллионные доли
КО - обратный осмос
к. т. - комнатная температура
ДСН-ПААГ - додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель-электрофорез
8Е-НРЬС - гель-проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография
Т°С - температура
ТМАС - хлорид тетраметиламмония
УФ - ультрафиолет ^Е1 - вода для инъекций ^КО - водный обратный осмос
Пример 1. Стадия захвата. Аффинная очистка на белке А.
Исходным материалом был осветленный сбор клона клеток СНО, экспрессирующих ТАС1-Ес, культивируемых при бессывороточных условиях и хранящихся в замороженном виде до использования.
Стадию захвата на колонке МаЬ8е1ес1 Х1га™ (СЕ НеаИйсаге 17-5269-03) проводили в соответствии со следующим протоколом, на колонке, имеющей высоту слоя 17 см. Все операции выполняли при комнатной температуре, за исключением раствора для нанесения, который хранили при температуре ниже 15°С. Регистрировали сигнал УФ при 280 нм.
Дезинфицирование.
Колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 колоночными объемами (3 ВУ) 0,1 М уксусная кислота + 20% этанол в обратном потоке при 250 см/ч. Этот поток останавливали и выдерживали в течение 1 ч.
Стадия промывания.
Колонку промывали по меньшей мере 2 колоночными объемами (2 ВУ) КО воды в обратном потоке при 250 см/ч.
Уравновешивание.
Колонку уравновешивали по меньшей мере 5 колоночными объемами (5 ВУ) 25 мМ фосфат натрия + 150 мМ ЫаС1 рН 7,0 (пока параметры проводимости и рН находятся в указанном диапазоне: рН 7,0 ± 0,1, проводимость 18 ± 2 мСм/см) в направленном вниз потоке при 450 см/ч.
Нанесение.
На колонку наносили осветленный сбор, хранящийся при температуре ниже 15°С, до емкости 15 мг общего ТАС1-Ес, определенной анализом В1асоге, на 1 мл упакованной смолы при скорости потока 350 см/ч.
Стадия промывания.
Эту колонку промывали по меньшей мере 2 колоночными объемами (2 ВУ) буфера для уравновешивания при 350 см/ч, затем по меньшей мере 4 колоночными объемами (4 ВУ) буфера для уравновешивания (пока сигнал УФ не возвращался к линии фона) при 450 см/ч.
Элюция.
Этот материал элюировали различными буферами для элюции, как показано в табл. I, при скорости потока 350 см/ч. Фракцию элюата собирали от начала увеличения сигнала УФ до 6,0±0,5 ВУ элюции. Элюат инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при рН ниже 4,1 (доведенном добавлением раствора лимонной кислоты, если необходимо) и затем рН доводили до 5,0±0,1 добавлением 32% раствора ЫаОН.
Регенерация.
Колонку регенерировали по меньшей мере 3 колоночными объемами (3 ВУ) 50 мМ ЫаОН + 1 М ЫаС1 в обратном потоке при 450 см/ч, останавливали поток на 15 мин и затем снова запускали этот поток при 450 см/ч, по меньшей мере, в течение протекания 3 колоночных объемов (пока сигнал УФ не возвращался к линии фона).
С этой стадии колонка работала в режиме обратного потока.
- 16 017152
Стадия промывания.
Колонку промывали по меньшей мере 2 ВУ ΚΌ-воды при 450 см/ч. Дезинфицирование.
Колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ буфера для дезинфекции при 250 см/ч, поток останавливали и колонку инкубировали в течение 60 мин.
Конечные стадии промывания.
Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ ΚΌ-воды при 250 см/ч, затем по меньшей мере 3 ВУ буфера для уравновешивания при 250 см/ч и, наконец, по меньшей мере 2 ВУ Κϋ-воды при 250 см/ч.
Наконец, эту колонку хранили после промывания по меньшей мере 3 ВУ 20% этанола при 250 см/ч. Результаты.
Таблица I Результаты с использованием различных буферов для элюции
Номер опыта | Буфер для элюции | Выход ТАСТ-Ес Ш | Агрегаты (¾) | НСР (м.д.) |
1 | 50 мМ ЫаАс рНЗ, 7 | 47, 7 | 30, 3 | 5558 |
2 | 100 мМ ИаАс рНЗ, 8 | 55, 7 | 25,2 | не определяли |
3 | 200 мМ ТЯаАс рНЗ, 8 | 58,0 | 28,2 | не определяли |
4 | 100 мМ ИаАс рНЗ, 7 | 68 | 30, 0 | не определяли |
5 | 0,2М НаАсн150 мМ ЫаС1 рН4 | 75, 1 | 3,8 | не определяли |
6 | ЮОмМ КаАс рНЗ,7 | 84, 6 | 22 | 3491 |
7 | 250мМ ЫаАс рНЗ,7 | 82, 8 | 18,7 | 3318 |
8 | ЮОмМ Ка-цитрат рНЗ,7 | 79, 2 | 8,8 | 4710 |
9 | 250мМ Ыа-цитрат рНЗ,7 | 71, 9 | 23 | 2347 |
10 | ЮОмМ Ыа-цитрат рНЗ,75 | 82, 8 | 8, 5 | 1576 |
11 | ЮОмМ Ма-цитрат рНЗ,75 | 66, 6 | 9,0 | 664 |
12 | ЮОмМ ИаАс рНЗ, 85 | 83, 3 | 15,0 | не определяли |
13 | ЮОмМ Ка-цитрат рНЗ,75 | 81, 0 | 9,1 | 3490 |
14 | ЮОмМ Оа~цитрат рНЗ,65 | 75, 1 | 14, 6 | 2580 |
14 | 100 мМ На-цитраг рН.3,75 | 44, 7 | 18,4 | 3783 |
16 | 100 мМ Ыа-цитрат рНЗ,75 | 47, 1 | 15,8 | 3217 |
17 | 100 мМ Ка-цитрат рНЗ,75 | 50,7 | 9, 4 | 2349 |
18 | 100 мН Ыа-цитрат рНЗ,75 | 58, 0 | 10, 4 | 2550 |
19 | 100 мМ Ка-цитрат рНЗ,75 | 67, 1 | 28,7 | 2372 |
20 | 100 мМ Ка-цитрат рН.3,75 | 65, 6 | 17,5 | 2353 |
21 | 100 мМ Ма-цитрат рНЗ,75 | 75, 6 | 19,4 | 1807 |
22 | 100 мМ Ма-цитрат рНЗ,75 | 57, 1 | 20,7 | 2465 |
23 | 100 мМ Ма-цитрат рНЗ,75 | 51, 9 | 18,4 | 2030 |
24 | 100 мМ Ыа-цитрат рНЗ,75 | 58 | 11,5 | 1746 |
25 | 100 мН На-цитрат рНЗ,75 | 41, 8 | 22,9 | 3029 |
26 | 100 мМ Иа-цитрат рНЗ,9 | 39, 4 | 6,0 | 2424 |
27 | 100 мМ Ма-цитрат рНЗ, 9 | 31, 0 | 8,8 | 2936 |
28 | 100 мМ Иа Ас рН4,1 | 28, 3 | 25,0 | 3311 |
29 | 100 мМ Ыа-цитрат рНЗ,9 | 46, 4 | 9, 1 | не определяли |
30 | 100 мМ МаАс рН4,1 | 42, 8 | 13,4 | не определяли |
31 | 100 мМ Ма-цитрат рНЗ,75 | 57, 5 | 26, 5 | не определяли |
32 | 100 мМ МаАс рН4,2 | 38, 1 | 10, 1 | не определяли |
33 | 100 мМ Ка-цитрат рНЗ,9 | 43, 3 | 8,3 | 2011 |
34 | 100 мМ Иа-цитрат рНЗ,9 | 63, 6 | б, 6 | 1749 |
35 | 100 мМ Ыа-цитрат рНЗ,9 | 65, 7 | 7,3 | 1689 |
36 | 100 мМ Иа-цитрат рНЗ, 9 | 62, 7 | 7,4 | 1609 |
37 | 100 мМ Ка-цитрат рНЗ,9 | 61, 6 | 7,4 | 1479 |
38 | 100 мМ Ка-цитрат рН.3,9 | 60, 6 | 7,4 | 1623 |
39 | 100 мМ К1а-цитрат рНЗ, 9 | 64, 6 | 8,0 | 1497 |
Выводы.
ТАСНРс5 в осветленном сборе захватывали непосредственно на колонке МаЬ8е1ес1 Х1га при динамической емкости 15 г общего ΤΑΟ-Εο5 на 1 л упакованной смолы при скорости потока 350 см/ч. Условия элюции, в частности, рН, оптимизировали для максимизации извлечения продукта, при обеспечении значительного уменьшения уровней агрегатов. Был выбран буфер для элюции 0,1 М цитрат натрия рН 3,9, дающий приблизительно 5-10% уровни агрегатов, в сравнении с приблизительно 25-40% в осветлен
- 17 017152 ном сборе, без наблюдения мутности. Уровни НСР были обычно равны 1500-2000 м.д. Уровни НСР измеряли при помощи ЕЫ8А с использованием поликлональных антител. Эту смесь антител генерировали против белков клеток-хозяев, полученных из осветленного и концентрированного супернатанта культуры клеток нетрансфицированных клеток СНО.
Пример 2. Катионообменная хроматография.
Элюат из стадии захвата на белке А, диализованный в подходящий буфер для нанесения, использовали в качестве исходного материала для катионообменной хроматографии.
В этой стадии использовали колонку Ргас1оде1 ΕΜΌ 803 - (Мегск 1.16882.0010), имеющую высоту слоя 10 см. Может быть использована также колонка Егас1оде1 803 - с высотой слоя 15 см. В последнем случае динамическая емкость и скорость потока могут требовать адаптации, которая находится вполне в пределах обычных знаний специалиста в данной области.
Все операции выполняли при комнатной температуре и скорость потока поддерживали постоянной при 150 см/ч. При всех временных точках регистрировали сигнал УФ при 280 нм.
Стадия промывания.
Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ АР0 (водным обратным осмосом). Дезинфицирование.
Затем эту колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ 0,5М №10Н + 1,5 М №1С1 в режиме потока вверх.
Промывание.
Эту колонку промывали по меньшей мере 4 ВУ АР0 в режиме потока вниз.
Уравновешивание.
Колонку уравновешивали по меньшей мере 4 ВУ 100 мМ цитратом натрия рН 5,0 (или пока не достигались желаемая проводимость 12±1 мСм/см и рН 5,0±0,1).
Нанесение.
На колонку наносили материал после захвата при рН 5,0 (рН при 5,0±0,1, проводимость при 12±1 мСм/см) и при емкости не более 50 мг ТАСРЕс, как определено анализом 8Е-НРЬС, на 1 мл упакованной смолы.
Стадия промывания.
Затем колонку промывали по меньшей мере 5 ВУ 100 мМ фосфатом натрия рН 6,5.
Элюция.
Колонку элюировали различными буферами и при различных условиях, представленных в табл. ΙΙГУ ниже.
Регенерация и дезинфицирование.
Колонку регенерировали и дезинфицировали 4 ВУ 0,5 М №10Н + 1,5 М №1С1 в режиме потока вверх. Затем поток останавливали и выдерживали в течение 30 мин.
Промывание.
Колонку промывали по меньшей мере 4 ВУ ΑΚΌ.
Хранение.
Колонку хранили по меньшей мере в 3 ВУ 20% этанола.
Результаты.
Таблица ΙΙ
Действие рН и проводимости при элюции. Уровни НСР в нанесенном материале: 189 м.д.
рН | Проводимость (мС/см) | Извлечение ТАС1-Гс | НСР (м.д.) | Клиренс НСР (X) |
6, 5 | 15, 0 | 25% | 118 | 1, 6 |
7, 3 | 22, 5 | 100% | 50 | 3, 8 |
8, С | 15,0 | 95% | 34 | 5, 5 |
7, 3 | 22, 5 | 100% | 56 | 3, 4 |
7, 3 | 33, 0 | 98% | 133 | 1,4 |
7, 3 | 22,5 | 96% | 45 | 4,2 |
7,3 | 22,5 | 97% | 53 | 3, 6 |
7,3 | 12, 0 | 54% | 79 | 2, 4 |
6,3 | 22, 5 | 83% | 47 | 4, 1 |
8,0 | 30,0 | 96% | 108 | 1, 8 |
8, 2 | 22, 5 | 97% | 46 | 4,2 |
δ, 5 | 30, 0 | 91% | 116 | 1, 6 |
7, 3 | 22, 5 | 93% | 48 | 3, 9 |
7,3 | 22,5 | 95% | 40 | 4, 8 |
Табл. ΙΙΙ показывает извлечение ТАСТ-Рс и клиренс НСР при нанесении при емкости 10 и 32 мг ТАСТ-Рс на 1 мл смолы и элюировании в фосфатном буфере при проводимости 12-33 мСм/см. Сбор пика
- 18 017152 выполняли от начала увеличения УФ в течение 10±0.5 ВУ.
Таблица !!!
Действие оптимального рН и проводимости при элюции при нанесении при емкости 10 и 32 мг ТАС1-Бс на 1 мл. Уровни НСР в нанесенном материале: 201 м.д.
Емкость загрузки (мг/мл) | рН | Проводимость (мС/см) | Извлечение ТАСТ-Гс | НСР (м.д,) | Клиренс НСР (х) |
10 | 8,0 | 15, 0 | 91% | 67 | 3, 0 |
20,7 | 93% | 61 | 3,3 | ||
32 | 8,0 | 20,7 | 88% | 54 | 3,7 |
Табл. 1У показывает действие стадии промывания 50 или 100 либо 150 мМ фосфатом натрия с рН 6.5 на извлечение ТАС1-Бс и клиренс НСР.
Таблица !У
Действие условий стадии промывания на производительность колонки. Уровни НСР в загрузке: 190 м.д. и уровни агрегатов: 2.0%
Концентрация фосфата в | Выход ΤΑξΙΓσ в промывочном растворе | Выход ТАС1- Ес в элюате | Агрегаты в элюате | НСР в элюате (м.д.) | |
промывочном растворе | (мМ) | ||||
промывка (промывочной раствор) 1 | 50 | 0,7% | 99% | 2,8% | 62 |
промывка (промывочной раствор) 2 | 100 | 2, 1% | 98% | 2, 9% | 59 |
промывка (промывочной раствор) 3 | 150 | 9, 1% | 90% | 2, 7% | 49 |
Буфер. использованный в промывочном растворе 2. содержащий 100 мМ фосфат натрия рН 6.5. имел проводимость 8.4 мСм/см.
Фиг. 1 показывает окрашенный серебром. невосстановленный гель электрофореза в ДСН-ПААГ проб. полученных из экспериментов с использованием условий трехстадийного промывания. показанных в табл. !У на клиренсе свободного Бс.
Фиг. 2 показывает частично совпадающие хроматограммы экспериментов со стадиями очистки с фосфатом натрия при различных концентрациях.
Стадию промывания оптимизировали при рН 6.5 с увеличивающимися концентрациями фосфата натрия (50-150 мМ). Как можно видеть на фиг. 1. концентрация промывочного буфера 150 мМ (промывка 3. дорожка 6) приводила к потерям ТАС1-Бс. Концентрация промывочного буфера 50 мМ (промывка
1. дорожка 8) приводила к пику чистого ТАС1-Бс. однако этот элюат содержал следы свободного Бс. Стадия промывки с 100 мМ фосфатом натрия рН 6.5 приводила к 98% извлечению в основном пике элюции и только 2% потерям в этой промывке (фиг. 2). Клиренс НСР увеличивался в 3.2 раза. Анализ фракций промывки и элюата при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ показал. что стадия промывки содержала свободный Бс с некоторым количеством интактного ТАС1-Бс при концентрациях буфера 100 мМ или более высоких (фиг. 1. дорожки 4 и 6). Концентрация 100 мМ или более является необходимой для полного удаления свободного Бс из фракций элюата (фиг. 1. дорожки 5 и 7).
Выводы.
Катионообменную стадию вводили в качестве второй стадии очистки после стадии захвата. Элюат стадии захвата был при низком рН (5.0) и низкой проводимости и мог быть непосредственно нанесен на катионообменник. Была выбрана смола Бгас(оде1 ЕМЭ 8О3 - с загрузочной емкостью 50 мг/мл. Продукт не биологически активной деградации. свободный Бс. мог быть эффективно удален в стадии промывки 0.1 М фосфатом натрия рН 6.5. Условия элюции были оптимизированы для наилучшего клиренса НСР и высокого извлечения ТАС1-Бс (179 мМ фосфат натрия рН 8.0. проводимость 20.7 мСм/см).
Альтернативно. элюция может проводиться в 10 ВУ 20 мМ фосфата натрия и 180 мМ №С1. рН 8.0 от начала увеличения оптической плотности при 280 нм.
Пример 3. Анионообменная хроматография.
Исходным материалом. используемым для этой стадии очистки. был элюат из катионообменной стадии на Бгас(оде1 8О3 - (см. пример 2). разведенный или диализованный в подходящий буфер для нанесения.
Эту стадию анионообменной хроматографии проводили на колонке 8ОБКСЕ 300 (СЕ Неа1Шсаге 17-1275-01) с высотой слоя 10 см. В этой стадии может быть также использована колонка 8ОЦКСЕ 300 с высотой слоя 15 см. В последнем случае. динамическая емкость и скорость потока могут требовать адаптации. которая находится вполне в пределах обычных знаний специалиста в данной области.
Все операции выполняли при комнатной температуре и регистрировали сигнал УФ при 280 нм. Эти стадии проводили при скорости потока либо 150. либо 200 см/ч.
- 19 017152
Промывание.
Сначала эту колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ ВО воды при скорости потока 150 см/ч. Дезинфицирование.
Затем колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ 0,5 М ΝαΟΗ + 1,5 М ЫаС1.
Стадия промывания.
Колонку промывали по меньшей мере 3 ВУ, предпочтительно 4-10 ВУ 0,5 М фосфата Να рН 7,5 при скорости потока 200 см/ч.
Уравновешивание.
Колонку уравновешивали по меньшей мере 5 ВУ 10, 15, 20, 25 или 30 мМ фосфата натрия рН 7,5. Необязательно, эта колонка может быть предварительно уравновешена 3 ВУ 0,5 М фосфата натрия рН 7,5.
Нанесение, промывание и сбор загрязнителей ТАС1-Рс в проходящем потоке.
На колонку наносили материал, полученный после катионообмена, разведенный для получения концентрации фосфата 10-30 мМ, рН 7,5 при емкости не более 50 мг ТАС1-Рс, согласно определению при помощи анализа 8Е-НРЬС, на 1 мл упакованной смолы, собирая проходящий поток от начала увеличения УФ до конца этой стадии промывания, которую проводят в 4±0,5 ВУ буфера для уравновешивания.
Регенерация/дезинфицирование.
Эту колонку регенерировали и дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ 0,5 Μ ΝαΟΗ + 1,5 Μ №1С1 в режиме обратного потока (пока сигнал УФ не возвращается к линии фона) при скорости потока 150 см/ч. В конце этой регенерации насос останавливали на 30 мин.
Стадия промывания.
Эту колонку промывали по меньшей мере 3 ВУ ВО воды при скорости потока 200 см/ч.
Хранение.
Эту колонку хранили по меньшей мере в 3 ВУ 20% этанола (об./об.).
Результаты.
Следующая табл. У суммирует результаты, полученные с использованием способа очистки, описанного выше.
Таблица У
Действие концентрации используемого для нанесения (загрузки) фосфата
рН загрузки | Концентрация фосфата загрузки (мМ) | Концентрация ТАС1-ГС загрузки (мг/л) | Емкость загрузки (мг/мл) | Извлечение ТАС1-Гс | Агрегаты | НСР (м.д.) |
7,5 | 30 | 773 | 39 | 94% | 10,4% | 82, 8 |
7,5 | 25 | . 639 | 39 | 90% | 6, 9% | 50, 4 |
7,5 | 20 | 651 | 49 | 90% | 5, 6% | 43, 9 |
7,5 | 15 | 437 | 46 | 88% | 3, 4% | 45, 0 |
7, 5 | 10 | 283 | мё определяли | 82% | 2, 8% | 26, 3 |
Выводы.
Анионообменную стадию на колонке 8оигее 300 в проточном режиме оптимизировали для максимизации клиренса НСР и агрегатов. Нанесение элюата из катионообменника либо разведенного, либо диафильтрованного, в 20 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 7,5 давало наилучший компромисс между извлечением продукта (90%) и клиренсом НСР (приблизительно от 2000 до 44 м.д.) и агрегатов (приблизительно от 25 до 5,6%). Использовали динамическую емкость 50 мг ТАС1-Рс на 1 мл упакованной смолы при скорости потока 150-200 см/ч.
Пример 4. Гидроксиапатитная хроматография.
Исходным материалом, используемым для этой стадии очистки, был проходящий поток анионообменной хроматографии (см. пример 3).
Использовали СНТ Сегатю НубгохуараШе Туре I (СНТ керамический гидроксиапатит типа I), колонку 40 мкм (Вюгаб 157-0040) с высотой слоя 10 см.
Все операции проводили при комнатной температуре. Скорость потока поддерживали постоянной при 175 см/ч и регистрировали сигнал УФ при 280 нм. Все растворы стерильно фильтровали и оборудование дезинфицировали гидроксидом натрия перед использованием. Колонку хранили в 0,5 М растворе №ОН. когда ее не использовали.
Начальные стадии промывки (промывание и предварительное уравновешивание).
Эту колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ 20 мМ буфера фосфата натрия рН 7,5 и затем по меньшей мере 3 ВУ 0,5 мМ буфера фосфата натрия рН 7,5 для снижения рН.
Уравновешивание.
Колонку уравновешивали по меньшей мере 5 ВУ 20 мМ фосфата натрия рН 7,5 (или пока не достигались желаемая проводимость 3,0 ± 0,3 мСм/см и рН 7,5 ± 0,1).
- 20 017152
Нанесение.
На колонку наносили проходящий поток из колонки 8ΟυΚ£Β 300 с добавленным хлоридом кальция до конечной концентрации 0,1 мМ из исходного раствора при 0,5 М и рН доводили до 7,0 добавлением 85% ортофосфорной кислоты при емкости NМΤ 50 мг ΤΑΟ-Рс, определенной при помощи анализа БЕ-НРЬС, на 1 мл упакованной смолы. Можно также наносить проходящий поток из колонки §ΟυЯСΒ 300 без хлорида кальция с доведением до рН 7,0 на гидроксиапатитной колонке.
Стадии промывания.
Эту колонку промывали по меньшей мере 4 ВУ 3, 4 или 5 мМ фосфатом натрия, 10 мМ МЕ8, 0,1 мМ СаС12 рН 6,5. В этих стадиях можно также использовать тот же самый буфер без хлорида кальция.
Элюция.
Колонку элюировали 5, 4, 3 или 2 мМ натрий-фосфатным буфером (см. табл. УЦ, 10 мМ МЕ8, 0,1 мМ СаС12 и 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9 М КС1 рН 6,5 (см. табл. УП) от начала увеличения УФ для различных ВУ (см. табл. V и УН). Для элюции можно также использовать тот же самый буфер без хлорида кальция.
Промывание.
Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,5;
по меньшей мере 3 ВУ 0,5 М натрий-фосфатного буфера рН 7,5 и по меньшей мере 1 ВУ 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,5.
Хранение.
Эту колонку хранили по меньшей мере в 3 ВУ 0,5 М ΝηΟΗ.
Результаты.
Табл. УТ показывает действие концентрации фосфата (от 2 до 5 мМ) в буфере для элюции на клиренс агрегатов и извлечение продукта. Фракции пика элюции объединяли и анализировали при помощи Ж-НРЬС на концентрацию ΤΑΟ-Рс и уровни агрегатов.
Таблица УХ Действие концентрации фосфата в буфере для элюции
Концентрация фосфата (мМ) | Βν элюции | Выход ТАС1-ГС | Агрегаты |
5 | 12 | 73% | 0, 49% |
13 | 74¾ | 0, 52% | |
14 | 68% | 0, 65% | |
15 | 77% | 0, 67% | |
16 | 77% | 0, 70% | |
17 | 70% | 0,73% | |
18 | 76% | 0, 85% | |
4 | 12 | 68% | 0,34% |
13 | 67% | 0, 29% | |
14 | 66% | 0,36% | |
15 | 67% | 0, 39% | |
16 | 66% | 0,38% | |
17 | 66% | 0,32% | |
18 | 66% | 0, 40% | |
3 | 12 | 70% | 0, 46% |
13 | 76% | 0, 42% | |
14 | 73% | 0,51% | |
15 | 71% | 0, 52% | |
16 | 69% | 0, 55% | |
17 | 69% | 0, 50% | |
18 | 70% | 0,53% |
2 | 12 | 65% | 0,19% |
13 | 66% | 0, 00% | |
14 | 66% | 0,18% | |
15 | 68% | 0, 14% | |
16 | 66% | 0, 17% | |
17 | 71% | 0,19% | |
18 | 65% | 0,16% |
Табл. УП показывает действие концентрации КС1 в буфере для элюции на клиренс агрегатов и извлечение продукта. Исследовали две концентрации фосфата натрия: 2 и 3 мМ. Фракции пика элюции объединяли и анализировали при помощи Ж-НРЬС на концентрацию ΤΑΟΙ-Рс и уровни агрегатов.
- 21 017152
Таблица VII Действие концентрации хлорида калия в буфере для элюции
Концентрация фосфата (мМ) | Концентрация КС1 (М) | ВУ элюции | Выход ТАС1- Гс | Агрегаты |
3 | 0, 6 | 10 11 12 13 14 | 102% 109% 106% 105% 103% | 0, 48% 0, 46% 0,43% 0, 42% 0, 43% |
3 | 0,7 | 10 11 12 13 14 | 96% 97% 98% 96% 96% | 0, 42% 0, 40% 0, 41% 0,40% 0, 43% |
3 | 0,8 | 10 11 12 13 14 | 106% 110% 112% 101% 110% | 0, 58% 0,55% 0,57% 0,59% 0,57% |
2 | 0, 6 | 10 11 12 13 14 | 71% 79% 80% 80% 81% | 0, 29% 0,28% 0, 29% 0,29% 0,26% |
2 | 0, 9 | 10 11 12 13 14 | 64% 72% 73% 70% 66% | 0,27% 0, 25% 0,29% 0, 33% 0,24% |
Выводы.
Гидроксиапатитная хроматография обеспечивает надежный эффективный способ уменьшения уровней агрегатов ТАС1-Ес. С использованием в качестве исходного материала очищенного анионообменной хроматографией материала (см. пример 3) с уровнями агрегатов приблизительно 5-8% гидроксиапатитная хроматография может уменьшать эти уровни до менее 0,8% с извлечением ТАС1-Ес 8590%.
Ссылки.
1. Акегк!гот аик Вргк, I. Вю1. Скет. 1989, кос. 25; 264(33): 19740-6.
2. А1!кски1 8.Е. е1 а1., I. Мо1. Вю1., 215, 403-410, 1990.
3. А1!кски1 8.Е. е! а1., №(^10 Ас1кк Кек., 25:389-3402, 1997.
4. Агтоиг К.Ь. е! а1., 1999, КесотЬшаи! китаи 1дС то1еси1ек 1аскшд Есдатта гесер1ог I Ьтктд аик тоиосу!е (пддеппд аскуШек, Еиг. I. 1ттиио1. 29(8): 2613-24.
5. Воктег е! а1., Т1В8 27(1), 19-24.
6. Вокске!к, Е., 1иидЬаиег, 8ер. 8ск & Теск. 2 №. 15, Асак. Ргекк (2000) 53.
7. ВокскеШ е! а1., Сеиекс Еидтеекид, уо1. 20, №. 13, 1и1у, 2000.
8. Воккеи е! а1., 1ВС 281 (2), 13964-13971.
9. Вгат аик уои Ви1оте, И8 5969102 (1999).
10. Вгат е! а1., \Е0 98/39361.
11. Сайег Р.1., 2006, Ро!еи! аикЬоку !кегареикск Ьу кекди. №!иге Кеу1етек 1ттиио1оду. Акуаисе оикие риЬксакои.
12. Беуегеих I. е! а1., №с1е1с Ас1кк Кек., 12, 387-395, 1984.
13. Ееид е! а1., Вюргосеккшд, 2005, 1-7.
14. Сюуаитш, В|о1ес1то1оду аик Вюеидтеекид, 73:522-529 (2000).
15. СгаШкат е! а1., 8с1еисе, уо1. 185, р. 862-864 (1974).
16. Сгокк е! а1., №!иге 404(27), 995-999.
17. Сгокк е! а1., \\'0 00/40716.
18. Нт!ои Р.К. е! а1., 2004. Еидтеегек китаи 1дС аикЬоФек текк 1оидег кегит ка1Г-йуек ш ркта!ек. I. Вю1. Скет., 279(8):6213-6.
19. Нутотейг е! а1., 1ВС, 280(8), 7218-7227.
20. 1кикод1е Е.Е. е! а1., 2000, Марршд оГ !ке С1д Ьтктд кке ои гкихаи, а сЫтекс аикЬоку тейк а ки
- 22 017152 тап 1д61 Ес, 1. 1ттипо1., 164 (8):4178-84.
21. 1би8од1с Е.Е. с! а1., 2001, Епдтссгсб апбЬобкк \νί11ι тсгсаксб ас1Аку !о гссгш! сотр1стсп1. 1. 1ттипо1., 166(4):2571-5.
22. КаЬа!, Е.А., Аи, Т.Т., Рсггу, Н.М., 6о!!сктап, К.8., апб Еос11сг, С. (1991), 8сс.|испсс8 о£ Рго!стк о£ 1ттипо1од1са1 1п!сгск!, 5(Н Еб., №а!юпа1 1п5(11и(с8 о£ Нса1!к, ВсЛскба, ΜΌ.
23. Коскапск с! а1., ЕР 1230354.
24. ЬосЫсу с! а1., Сс11. 104, 487-501, 2001.
25. Мс1сксг8, Апп. Кксит. Όίκ, 2003, 62, 25-27.
26. Мооге с! а1., 8с1спсс, 285: 260-3.
27. Могсаи с! а1., В1ооб, 103(8), 3148-3157.
28. №а18тйк апб 8ргапд, Т1В8, 23, 74-79, 1998.
29. Nονак с! а1., В1ооб, 103(2), 689-694.
30. Рагксг с! а1., АО 02/094852.
31. Рсагкоп, Мсбюбк Еп7уто1., 1990, 183:63-98.
32. Рога!к, 1. Саг18коп, I. Оккоп, апб 6. ВсИгадс, №а1игс (Ьопбоп), 258, 598-599 (1975).
33. Рога!к апб В. Окп, В1оскстк!гу, 22, 1621-1630 (1983).
34. Ригсп с! а1., Ргос №аб Асаб δοΐ И8А, 1999 Маг. 2; 96(5):2256-61.
35. 8ксрагб, 1. о£ Скгота!одгарку, 891:93-98 (2000).
36. 81ис1бк К.Ь. с! а1., 2001, Н1дк гскокШоп тарртд о£ !1с Ьтбтд кйс оп китап 1д61 £ог Ес датта К1, Ес дат та КП, Ес датта КШ, апб ЕсКп апб бск1дп о£ 1д61 \гапап18 \νί11ι ппргсл'сб Ьтбтд !о !кс Ес датта К. 1. Вю1. Скст., 276(9):6591-604.
37. 8ткк с! а1., АО 91/03553.
38. 8ткк с! а1., АО 94/06476.
39. 8!апксг, 1. 1ттипо1одка1 Мс!кобк, 76:157-169 (1985) (10 тМ !о 30 тМ кобшт ркокрка!с с1и8юп дгабкп!).
40. 8!сигсг А. с! а1., 1995, Ех νί\Ό соабпд о£ к1с! сс11 акодгайк \νί11ι типпс СТЬА4/Ес ргото!ск дгай !о1сгапсс, 1. 1ттипо1., 155(3):1165-74.
41. 8ип с! а1., АО 2005/044856.
42. ТагбШ, 1. Скгота!одгарку, 599:13-20 (1992).
43. Уассаго С. с! а1., 2005, Епдтссппд !кс Ес гсдюп о£ 1ттипод1оЬикп 6 !о тоби1а!с т νί\Ό апбЬобу ктск, №а1 Вю!сскпо1., 23(10): 1283-8.
44. У1дсгк с! а1., №а!игс, 1997 Маг. 13; 386(6621):190-4.
45. Усбап!кат с! а1., АО 03/59935.
46. Уо1а с! а1., ВтТссктдиск, 14:650-655 (1993).
47. νοη Ви1о\у апб Вгат, 8с1спсс, 228: 138 (1997).
48. Ха с! а1., 1. Ехр. Мсб., 2000, 137-143.
- 23 017152
Список последовательностей <110> Агез ТгасИпд 5.А.
<120> Способ очистки Гс-содержащих белков <130> 1146 ИО/РСТ <150> ЕР06119611.9 <151> 2006-08-28 <150> 0560/842,542 <151> 2006-09-06 <160> 7 <170> РаеепС1п νεΓ3ίοη 3.3 <210> 1 <211> 40 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>
<221> ИСТОЧНИК <223> / примечание=описание искусственной последовательности; консенсусная последовательность, в которой конкретные аминокислоты в положениях 3 12, 14, 15, 18, 21, 25, 34 и 38 разделены любой аминокислотой <220>
<221> вариант <222> (1).,(2), (4)--(11), 13, (16)..(17), (19)..(20), (22)..(24), (26)..(33), (35)..(37) и (39)..(40) <223< Хаа может быть любой лриродно-встречающейся аминокислотой <400> 1
Хаа 1 | Хаа | Сув | Хаа | Хаа Хаа Хаа 5 | Хаа Хаа Хаа 10 | Хаа | Азр | Хаа | Ьеи | Ьеи Хаа 15 | |||||
Хаа | Сув | Хаа | Хаа | суз | Хаа | Хаа | Хаа | Суз | Хаа | Хаа | Хаа | Хаа | Хаа | Хаа | Хаа |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Хаа | суз | хаа | Хаа | Хаа | Суз | Хаа | Хаа | ||||||||
35 | 40 |
<210> | 2 |
<211> | 293 |
<212> | Белок |
<213> | Ьото зараепз |
<400> | 2 |
Мес 8ег <31у Ьеи С1у Агд Зег Агд Агд С1у 01у Агд 5ег Агд Уа1 Азр
10 15 <31п <31и 61и Агд РЬе Рго О1п <31у Ьеи Тгр ТЬг С1у Уа1 А1а МеЬ Агд
25 30
- 24 017152
Бег | Суз | Рго 35 | С1и | С1и | С1п | Туг | Тгр 40 | Азр | Рго | Ьеи | Ьеи | С1у 45 | ТЬг | Суз | МеС |
Зег | СуЗ | ЬуЗ | ТНг | 11е | Суз | Азп | Н1з | С1п | Зег | С1п | Агд | ТЬг | Суз | А1а | А1а |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
РЬе | □уз | Атд | Зег | Ьеи | Зег | Суз | Агд | Ьуз | С1и | С1п | С1у | Ьуз | РЬе | Туг | Азр |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
ΗΪ5 | Ьеи | Ьеи | Агд | Азр | Суз | 11е | Зег | Суз | А1а | Зег | 11е | Суз | С1у | С1п | Н13 |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Рго | Ьуз | <31п | Суз | А1а | Туг | РЬе | Суз | С1и | Азп | Ьуз | Ьеи | Агд | Зег | Рго | Уа1 |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Азп | Ьеи | Рго | Рго | С1и | Ьеи | Агд | Агд | С1п | Агд | Зет | С1у | С1и | Уа1 | С1и | Азп |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Азп | Зег | Азр | Азп | Зег | С1у | Агд | Туг | С1п | С1у | Ьеи | С1и | Ηί 5 | Агд | <31у | Зег |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
С1и | А1а | Зег | Рго | А1а | Ьеи | Рго | С1у | Ьеи | Ьуз | Ьеи | Зег | А1а | Азр | С1п | Уа1 |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
А1а | Ьеи | Уа1 | Тут | Зег | ТЬг | Ьеи | С1у | Ьеи | Суз | Ьеи | Суз | А1а | Уа1 | Ьеи | Суз |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Суз | РНе | Ьеи | ν&ι | А1а | Уа1 | А1а | Суз | РЬе | Ьеи | Ьуз | Ьуз | Агд | С1у | Азр | Рго |
1В0 | 185 | 190 | |||||||||||||
Суз | Зег | Суз | С1п | Рго | Агд | Зег | Агд | РГО | Агд | Й1п | Зег | ₽ГО | А1а | Ьуз | Зег |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Зег | С1п | Азр | ΗΪ3 | А1а | Мее | С1и | А1а | С1у | Зег | Рго | Уа1 | Зег | ТНг | Зег | Рго |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
С1и | Рго | Уа1 | С1и | ТЬг | Суз | Зег | Рке | Суз | РЬе | Рго | С1и | Суз | Агд | А1а | Рго |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
ТНг | 01п | 01и | Зег | А1а | Уа1 | ТЬг | Рго | С1у | ТЬг | Рго | Азр | Рго | ТЬг | Суз | А1а |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
С1у | Агд | Тгр | 31у | Суз | Ηΐε | ТЬг | Агд | ТЬг | ТНг | Уа1 | Ьеи | С1п | Рго | Суэ | Рго |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Н13 | Не | Рго | Азр | Зег | С1у | ьеи | <Э1у | Не | Уа1 | Суз | Уа1 | Рго | А1а | С1п | С1и |
275 | 280 | 285 |
□ 1у 31у Рго <31у А1а
290 <210> 3 <211> 251 <212> Белок <213 > искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> / примечание-описание искусственной последовательности: она является частью тяжелой цепи иммуноглобулина человека <400> 3
МеБ 1 | Буз | ΗΪ3 | Беи | Тгр 5 | РЬе | Рле | Беи | Беи | Беи 10 | Уа1 | А1а | А1а | Рго | Агд 15 | Тгр |
Уа1 | Беи | Зег | 61и | Рго | Буз | Бег | Зег | Азр | Буз | ТЫ | н1з | ТЬг | Суз | Рго | Рго |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Суз | Рго | А1а | Рго | С1и | А1а | С1и | <31у | А1а | Рго | Бег | νβΐ | РЬе | Беи | РЬе | Рго |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Рго | Буз | Рго | Буз | Азр | ТЬг | Беи | МеБ | Не | Бег | Агд | ТЬг | Рго | (31и | Уа1 | ТЬг |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Суз | Уа1 | ναΐ | ν&1 | Азр | Уа1 | Зег | ΗΪ5 | 0111 | Азр | Рго | С1и | ν^ι | Буз | РЬе | Азп |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Тгр | Туг | Уа1 | Азр | СЗХу | Уа1 | С1и | ν&ι | Ηίε | Азп. | А1а | Буз | ТЬг | Буз | Рго | Агд |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
С1и | С1и | С1п | Туг | Азп | Зег | ТЬг | Туг | Агд | Уа1 | Уа1 | Бег | Уа1 | Беи | ТЬг | νβΐ |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Беи | ΗΪΞ | С1п | Азр | Тгр | Беи | Азп | <31у | Буз | <31и | Туг | Буз | Суз | Буз | ν^Ι | Бег |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Азп | Буз | А1а | Беи | Рго | Бег | Зег | Не | С1и | Буз | ТЬг | Не | Зег | Буз | А1а | Ъуз |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
С1у | С1п | Рго | Агд | С1и | Рго | С1п | Уа1 | Туг | ТЬг | Беи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
<31χι | Беи | ТЫ | Буз | АзП | <31п | Уа1 | Зег | Беи | ТЬг | Суз | Беи | Уа1 | Буз | С1у | РЬе |
155 | 170 | 175 | |||||||||||||
Туг | Рго | Зег | Азр | Не | А1а | Уа1 | С1и | Тгр | <31и | Зег | АЗП | (31у | С1п | Рго | 31x1 |
- 26 017152
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Азп | Азп | Туг | Ьуз | ТИг | ТЬг | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр | □1у | Зег | РНе |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Рке | Ьеи | туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТЙГ | Уа1 | АЗр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | С51п | <21п | (31у |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Азп | Уа1 | РЬе | Зег | Суз | зег | Мес. | ΗΪΞ | О1и | А1а | Ьеи | Н1В | А5П | ΗΪ3 | Туг | |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
ТЬг | αΐη | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег | Рго | С1у | Ьуз | |||||
245 | 250 |
<210> 4 <211> 348 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=описание искусственной последовательности: она является последовательностью слитого белка, содержащей часть рецептора ТАС1 человека и часть последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека <400> 4
МеЬ 1 | Азр А1а | МеС | Ьуз Агд С1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи | Ьеи Ьеи | Суз 15 | С1у | |||||||||
5 | 10 | ||||||||||||||
А1а | Уа1 | РЬе | Уа1 | Зег | Ьеи | Зег | 31п | (31и | 11е | Н1з | А1а | С1и | Ьеи | Агд | Агд |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
РЬе | Агд | Агд | А1а | МеС | Агд | Зег | Суз | Рго | С1и | С1и | <31п | Туг | Тгр | Азр | Рго |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ьеи | Ьеи | 31у | тЬг | Суз | МеС | Бег | Суз | Ьуз | ТНг | Не | Суз | Азп | Н1з | С1п | Бег |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
С1п | Агд | ТЪг | Суз | А1а | А1а | рЬе | Сув | Агд | Бег | Ьеи | Зег | Суз | Агд | Ьуз | С1и |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
С1п | <31у | ьуз | РЪе | Туг | Азр | Н1з | Ьеи | Ьеи | Агд | Азр | Суз | Не | Зег | Суз | А1а |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Зег | Не | Суз | С1у | σΐη | Н13 | Рго | Ьуз | <31п | Суз | А1а | Туг | РЪе | Суз | <31 и | АЗП |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ьуз | Ьеи | Агд | Зег | С1и | РГО | Ьуз | Зег | Зег | Азр | Ьуз | ТЫ | ΗΪ3 | ТЙ.Г | Суз | Рго |
115 | 120 | 125 |
- 27 017152
Рго | Суз 130 | РГО | А1а | Рго | С1и | А1а 135 | О1и | (31у | А1а | Рго | Зег 140 | Уа1 | РЬе | Ьеи | РЬе |
Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Азр | ты | Ьеи | Мес | Х1е | Зег | Агд | ТЫ | РГО | (31и | Уа1 |
145 | 150 | 155 | 150 | ||||||||||||
ТЬг | Суз | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Азр | νδΐ | Зег | Н1е | С1и | Азр | Рго | (Ии | Уа1 | Ьуз | РЬе |
155 | 170 | 175 | |||||||||||||
Азп | Тгр | Туг | Уа1 | Азр | <31у | Уа1 | С1и | Уа1 | Н1з | Азп | А1а | Ьуз | ТЬг | Ьуз | Рго |
180 | 195 | 150 | |||||||||||||
Агд | С1и | С1и | С1п | Туг | Азп | Зег | ТЬг | Туг | Агд | Уа1 | Уа1 | Зег | ν^ΐ | Ьеи | ТЬг |
155 | 200 | 205 | |||||||||||||
ν«ι | Ьеи | Н1б | С1п | Азр | Тгр | Ьеи | Азп | С?1у | Ьуз | (Ни | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | Уа1 |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Зег | Азп | Ьуз | А1а | Ьеи | Рго | Зег | Зег | 11е | С1и | Ьуз | ТЫ | Не | Зет | Ьуз | А1а |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ьуз | С1у | С1п | Рго | Агд | С1и | РГО | С1П | Уа1 | Туг | ТЬг | ьеи | РГО | Рго | Зег | Агд |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Азр | С1и | Ьеи | ТЫ | Ьуз | Азп | σΐη | ναΙ | Зег | Ьеи | ТЫ | Суз | Ьеи | Уа1 | Ьуз | С1у |
250 | 265 | 270 | |||||||||||||
РНе | Туг | Рго | Зег | Азр | 11е | А1а | Уа1 | 31и | Тгр | С1и | Зег | Азп | 61у | Θΐη | Рго |
275 | 280 | 235 | |||||||||||||
С1и | Азп | Азп | Туг | Ьуз | ТЬг | ТЬг | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр | С1у | Зег |
250 | 295 | 300 | |||||||||||||
РНе | РЬе | Ьеи | Туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Азр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | С1п | С1П |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
□ 1у | Азп | Уа1 | РЬе | Зег | Суз | Зег | Уа1 | МеЬ | Ηϊε | С1и | А1а | Ьеи | Н13 | Азп | Η1Ξ |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Туг | ТНг | С1п | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег | Рго | С1у | Ьуз |
340 345
<210> <211> <212> <213> | 5 879 лнк Ното зартепз |
<400> | 5 |
аЕдадЕддсс | Едддссддад | саддсдаддЕ | ддссддадсс | дЕдЕддасса | ддаддадсдс | 60 |
ЕЕЕссасадд | дссЕдЕддас | дддддЕддсл | аЕдадаЕссЕ | дссссдаада | дсадЕасЕдд | 120 |
даЕссЕсЕдс | ЕдддЕасСЕд | салдЕссЕде | аааассаЕЕЕ | дсаассаЕса | дадссадсдс | 180 |
ассЕдЕдсад | ссЕЕссдсад | дЕсастсадс | Одссдсаадд | адсааддсаа | дЕЕсСаЕдас | 240 |
саЕсЕссЕда | дддасЕдсаЕ | садсЕдЕдсс | ЕссаЕсЕдЕд | дасадсассс | ЕаадсааЕдЕ | 300 |
дсаЕасЕЕсЕ | дЕдадаасаа | дсЕсаддадс | ссадЕдаасс | ЕЕссассада | дсЕсаддада | 360 |
садсддадЕд | дадаадЕЕда | ааасааЕЕса | дасаасЕсдд | дааддЕгюса | аддаЕЕддад | 420 |
сасададдсЕ | садаадсаад | ЕссадсЕсЕс | ссддддсЕда | адсЕдадЕдс | адаЕсаддЕд | 480 |
дсссЕддЕсЕ | асадсасдсЕ | ддддсЕсЕдс | сЕдЕдЕдссд | ЕСсЕсЕдсЕд | сЕЕссЕддЕд | 540 |
дсддЕддссЕ | дсЕЕссЕсаа | даададдддд | даЕсссЕдсЕ | СсЕдссадсс | ссдсЕсаадд | 600 |
ссссдЕсааа | дгссддссаа | дЕсЕЕсссад | даЕсасдсда | Еддаадссдд | садсссЕдЕд | 660 |
адсасасссс | ссдадссадЕ | ддадассЪдс | адсЕЕсЕдсЕ | ЕсссЕдадЕд | садддсдссс | 720 |
асдсаддада | дсдсадЕсас | дссЕдддасс | сссдасссса | сЕЕдЕдсЕдд | ааддЬддддд | 780 |
Едссаеасса | ддассасадЬ | ссЕдсадссЕ | Едсссасаса | Есссадасад | ЕддссЕЕддс | 840 |
аЕЕдЕдЕдЕд | ЕдссЕдссса | ддаддддддс | ссаддЕдса | 879 |
<210> 6 <211> 753 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> / примечание=описание искусственной последовательности: ДНК, кодирующая 5Εζ2 ΙΡ N0; 3 <400> б
аЕдаадсасс | ЕдЕддЕЕСЕЕ | ссЕссЕдсЕд | дЕддсддсЕс | ссадаЕдддЕ | ссЕдЕссдад | 60 |
сссаааЕсЕЕ | садасаааас | ЕсасасаЕдс | ссассдЕдсс | садсассЕда | адссдадддд | 120 |
дсассдЕсад | ЕсЕЕссЕсЕЕ | ссссссаааа | ссоааддаса | сссЕоаЕдаЕ | сЕссоддаос | 180 |
ссЕдаддЕса | саедсдЕддЕ | ддЕддасдЕд | адссасдаад | асесЕдаддЕ | оаадЕЕсаас | 240 |
ЬддЬасдЬдд | асддсдЕдда | ддЕдсаЕааЕ | дссаадасаа | адссдсддда | ддадсадЕас | 300 |
аасадсасдЕ | ассдЕдЕддЕ | садсдЕссЕс | ассдЕссЕдс | ассаддасЕд | дсЕдааЕддс | 360 |
ааддадСаса | адЕдсааддЕ | сЕссаасааа | дсссЕсссаЕ | ссСссаЕсда | даааассаСс | 420 |
сссааадсса | аадддсадсс | ссдадаасса | оаддЕдЕаСа | ссоЕдссссс | аЕсссдддаЕ | 480 |
дадсСдасса | адаассаддЕ | садссЕдасс | ЕдссЕддЕса | ааддсЕЕсЕа | Есосадсдас | 540 |
аЕсдоодЕдд | адЕдддадад | сааЕдддсад | ссддадааса | асЕасаадас | сасдссЕссс | 600 |
дедсЕддасЕ | ссдасддстс | сС-Ссеессес | Еасадсаадс | ЬсассдЕдда | саададсадд | 660 |
- 29 017152
Сддсадсадд ддаасдСсЕЕ сссаъдсбсс дьдаЕдсаЕд аддсСсЬдса саассасСас 720 асдсадаада дссЪсссссЪ дСсЕссдддЕ ааа753 <210?7 <211?1044 <212? ДНК <213? искусственная последовательность <220 >
<221> источник <223? / примечание^описание искусственной последовательности: ДНК, кодирующая белок 3Εβ Ιϋ N0: 4
<400? 7 аЕддаЕдсаа | Ъдаадададд | дсЕсодсЕдЕ | дЕдсЕдсЕдс | ЕдЕдкддсдс | сдЕсЕЕсдсЕ | 60 |
Есдсесадсс | аддааа&сса | ЕдссдадЕЕд | адасдсЕЕсс | дсададссас | дадаЕссЕдс | 120 |
сссдаададс | адЕасбддда | ЕссЕсЕдсЕд | ддЕассЕдса | ЕдЕссЕдсаа | аассаЕЕЕдс | 190 |
аассаЕсада | дссадсдсас | сЕдЕдсадсе | ЕЕсЕдсаддЕ | сасЕсадсЕд | ссдсаадда.д | 240 |
сааддсаадЪ | УсБаБдасса | ЕсЕссЕдадд | дасЕдсаЕса | дсЕдЕдссЕ.с | саЕсЕдЕдда | 300 |
садсасссСа | адсаабдбдс | аЕасЕЕсЕдЕ | дадаасаадс | Есаддадсда | дсссаааЕсЬ | 360 |
Ссадасаааа | сесасасаед | сссассдЕдс | ссадсассЕд | аадссдаддд | ддсассдЕса | 420 |
дссгсссссс. | Сссссссааа | асссааддас | асссЕсаЕда | ЕсЕсссддас | сссЕдаддЕс | 480 |
асабдсдгдд | СддЕддасде | дадссасдаа | дасссЕдадд | ЕсаадЕЕсаа | сЕддЕасдЕд | 540 |
дасддсдедд | аддт.дсаъаа | Едссаадаса | аадссдсддд | аддадсадЕа | саасадсасд | 600 |
ЬассдЬдСдд | ЕсадсдЕссЕ | сассдЕссбд | сассаддасЕ | ддсЕдааедд | сааддадсас | обо |
аадЕдсаадд | ЕсЕссаасаа | адсссЕссса | ЕссЕссаЕсд | адаааассаЕ | сЕссааадсс | 720 |
ааадддсадс | сссдадаасс | асаддЕдЕас | асссЕдсссс | саЕсссддда | ЕдадсЕдасс | 730 |
аадаассадд | ЕсадссЕдас | сЕдссЕддЕс | аааддсЕЕсЕ | аЕсссадсда | саЕсдссдЕд | 840 |
дадЕдддада | дсааЕдддса | дссддадаас | аасЕасаада | ссасдссЕсс | сдЕдсСддас | 900 |
бссдасддсЬ | ссЕЕсЕЕссЕ | сЕасадсаад | сЕсассдЕдд | асаададсад | дЕддсадсад | 960 |
дддаасдбсб | ЕсЕсаЕдсЕс | сдЕдаЕдсаЕ | даддсЕсЕдс | асаассасЕа | сасдсадаад | 1020 |
адссЕсБссс | ЕдЕсЕссддд | Еааа | 1044 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (22)
1. Способ уменьшения концентрации свободных Ес-частей в жидкости, содержащей Ессодержащий белок, в котором указанную жидкость подвергают катионообменной хроматографии, которая предусматривает выполнение следующих стадий:
(a) жидкость наносят на катионообменную смолу при рН по меньшей мере на одну единицу более низком, чем изоэлектрическая точка (ρΙ) указанного Ес-содержащего белка;
(b) катионообменную смолу со стадии (а) промывают буфером, имеющим проводимость 6-10 мСм/см и при рН 5,5-7,5;
(c) элюция Ес-содержащего белка при рН в диапазоне 7,0-8,5.
2. Способ по п.1, где стадию промывания проводят при проводимости 8,2-8,6 мСм/см.
3. Способ по п.1 или 2, где стадию промывания проводят при рН 6,0-7,0.
4. Способ по любому из пп.1-3, где стадию промывания проводят в буфере, содержащем 75-125 мМ фосфат натрия.
5. Способ по п.1, где стадию элюции проводят при проводимости 15-22 мСм/см.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где катионообменную хроматографию проводят на сильной катионообменной смоле.
7. Способ по п.6, где катионообменная смола содержит 803 --группы.
8. Способ по п.6 или 7, где катионообменная смола содержит сшитый метакрилатный матрикс.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию очистки, выбранную из аффинной хроматографии, анионообменной хроматографии и гидроксиапатитной хроматографии.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где Ес-содержащий белок содержит константную область иммуноглобулина (Ιβ).
11. Способ по п.10, где константная область является константной областью иммуноглобулина человека.
12. Способ по п.10, где иммуноглобулином является Ιβ6|.
13. Способ по любому из пп.10 или 11, где константная область содержит СН2- и СН3-домены.
- 30 017152
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, где Рс-содержащий белок содержит вариабельную область иммуноглобулина.
15. Способ по п.14, где Рс-содержащим белком является антитело.
16. Способ по любому из пп.1-13, где Рс-содержащим белком является Рс-слитый белок.
17. Способ по п.16, где Рс-слитый белок содержит лигандсвязывающую часть члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (ЮТК).
18. Способ по п.17, где лигандсвязывающая часть выбрана из внеклеточного домена Τ^ΚΤ, ЮТИТ или их таР-связывающего фрагмента.
19. Способ по п.17, где лигандсвязывающая часть выбрана из внеклеточного домена ВΑΡΡ-Κ, ВСМА, ΤΑΟ или их фрагмента, связывающего по меньшей мере один из В1у§ или ΑΡΚI^.
20. Способ по п.19, где Рс-слитый белок содержит полипептид, выбранный из:
a) аминокислот 34-66 ЖО ΙΌ ΝΟ: 2;
b) аминокислот 71-104 ЖР ΙΌ ΝΟ: 2;
c) аминокислот 34-104 ЖР ΙΌ ΝΟ: 2;
й) аминокислот 30-110 ЖР ΙΌ ΝΟ: 2;
е) ЖР Ιϋ ΝΟ: 3;
ί) ЖО ГО ΝΟ: 4;
д) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с комплементом ЖР ΙΌ ΝΟ: 5, или 6, или 7 при условиях высокой строгости;
11) мутеина любого из с)-е) или ί), имеющего по меньшей мере 80, или 85, или 90, или 95% идентичность последовательности с полипептидом с)-е) или (ί);
где этот полипептид связывается по меньшей мере с одним из В1у§ или ΑΡΚI^.
21. Применение катионообменной хроматографии, используемой в способе по любому из пп.1-20, для уменьшения концентрации свободных Рс-частиц в композиции, содержащей Рс-содержащий белок.
22. Применение по п.21, где концентрация свободного Рс уменьшается до менее 5, или менее 2, или менее 1, или менее 0,5, или менее 0,2, или менее 0,1% общей концентрации белка указанной композиции.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06119611 | 2006-08-28 | ||
US84254206P | 2006-09-06 | 2006-09-06 | |
PCT/EP2007/058887 WO2008025748A1 (en) | 2006-08-28 | 2007-08-27 | Process for the purification of fc-containing proteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200970231A1 EA200970231A1 (ru) | 2009-08-28 |
EA017152B1 true EA017152B1 (ru) | 2012-10-30 |
Family
ID=38610939
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200970231A EA017152B1 (ru) | 2006-08-28 | 2007-08-27 | СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8513393B2 (ru) |
EP (1) | EP2061803B2 (ru) |
JP (1) | JP2010501623A (ru) |
KR (1) | KR101770312B1 (ru) |
AR (1) | AR062570A1 (ru) |
AU (1) | AU2007291283B2 (ru) |
CA (1) | CA2661748C (ru) |
DK (1) | DK2061803T4 (ru) |
EA (1) | EA017152B1 (ru) |
ES (1) | ES2755386T5 (ru) |
FI (1) | FI2061803T4 (ru) |
HK (1) | HK1131400A1 (ru) |
HU (1) | HUE045898T2 (ru) |
IL (1) | IL197220A (ru) |
LT (1) | LT2061803T (ru) |
MX (1) | MX2009002014A (ru) |
PL (1) | PL2061803T5 (ru) |
PT (1) | PT2061803T (ru) |
SI (1) | SI2061803T2 (ru) |
UA (1) | UA99262C2 (ru) |
WO (1) | WO2008025748A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2698654C2 (ru) * | 2014-06-13 | 2019-08-28 | Люпин Лимитед | Способ очистки белка слияния |
RU2698671C2 (ru) * | 2014-07-18 | 2019-08-28 | Сандоз Аг | КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR058568A1 (es) | 2005-12-20 | 2008-02-13 | Bristol Myers Squibb Co | Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo |
US10508144B2 (en) | 2005-12-20 | 2019-12-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Carbohydrate content of CTLA4 molecules |
EP2061803B2 (en) † | 2006-08-28 | 2022-11-16 | Ares Trading S.A. | Process for the purification of fc-containing proteins |
US20090148435A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-06-11 | Genentech, Inc. | Antibody purification by cation exchange chromatography |
EP2346897A2 (en) * | 2008-10-20 | 2011-07-27 | Abbott Laboratories | Viral inactivation during purification of antibodies |
AU2009307735B2 (en) * | 2008-10-20 | 2014-12-04 | Abbvie Inc. | Antibodies that bind to IL-12 and methods of purifying the same |
TW201024318A (en) * | 2008-10-20 | 2010-07-01 | Abbott Lab | Isolation and purification of antibodies using protein A affinity chromatography |
WO2010048183A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | Abbott Laboratories | Antibodies that bind to il-18 and methods of purifying the same |
CN107188960A (zh) * | 2009-08-07 | 2017-09-22 | Emd密理博公司 | 从样品的一或多种杂质中纯化靶蛋白的方法 |
MX2012007103A (es) | 2009-12-18 | 2012-07-17 | Novartis Ag | Solucion y metodo de lavado por cromatografia de afinidad. |
EP2524215B1 (en) | 2010-01-15 | 2018-12-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Surface neutralization of apatite |
US8895707B2 (en) * | 2010-08-18 | 2014-11-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
JP5798307B2 (ja) * | 2010-09-03 | 2015-10-21 | 国立大学法人名古屋大学 | グロボトリアオシルセラミドを特異的に認識するモノクローナル抗体及びその作製法 |
CA2820095C (en) | 2010-12-21 | 2019-02-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Isoform enriched antibody preparation and method for obtaining it |
WO2012106449A1 (en) | 2011-02-02 | 2012-08-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite surface neutralization with alkali solutions |
KR102058254B1 (ko) | 2011-03-29 | 2019-12-20 | 글락소스미스클라인 엘엘씨 | 단백질 정제용 완충제 시스템 |
SG10201701224UA (en) * | 2012-03-12 | 2017-04-27 | Merck Patent Gmbh | Removal of protein aggregates from biopharmaceutical preparations in a flowthrough mode |
EP2855501B1 (en) | 2012-05-30 | 2018-04-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | In situ restoration of apatite-based chromatography resins |
EP2682168A1 (en) | 2012-07-02 | 2014-01-08 | Millipore Corporation | Purification of biological molecules |
WO2015200282A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite pretreatment |
EP3157863B1 (en) | 2014-06-23 | 2023-06-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite in-situ restoration |
SG11201707330RA (en) * | 2015-03-13 | 2017-10-30 | Bristol Myers Squibb Co | Use of alkaline washes during chromatography to remove impurities |
CN115812077A (zh) | 2020-05-08 | 2023-03-17 | 高山免疫科学股份有限公司 | April和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996041624A1 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Immunex Corporation | TNF-α CONVERTING ENZYME |
WO2004076485A1 (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-10 | Lonza Biologics Plc. | Antibody purification by protein a and ion exchange chromatography |
WO2005100394A2 (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PURIFIED INTERLEUKIN-15/Fc FUSION PROTEIN AND PREPARATION THEREOF |
EP1614693A1 (en) * | 2003-03-31 | 2006-01-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Purification of human monoclonal antibody and human polyclonal antibody |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991003553A1 (en) | 1989-09-05 | 1991-03-21 | Immunex Corporation | TUMOR NECROSIS FACTOR-α AND -β RECEPTORS |
US5447851B1 (en) * | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
WO1994006476A1 (en) | 1992-09-15 | 1994-03-31 | Immunex Corporation | Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists |
ES2129076T5 (es) * | 1993-12-27 | 2003-05-16 | Zlb Bioplasma Ag | Procedimiento para la preparacion de un concentrado de inmunoglobulina g anti-d y composicion farmaceutica que lo contiene. |
US6406901B1 (en) * | 1995-06-08 | 2002-06-18 | Immunex Corporation | TNF-a converting enzyme |
US5969102A (en) | 1997-03-03 | 1999-10-19 | St. Jude Children's Research Hospital | Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof |
IL121900A (en) | 1997-10-07 | 2001-12-23 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | A method for the purification of immunoglobulins |
AU760048B2 (en) | 1998-05-06 | 2003-05-08 | Genentech Inc. | Protein purification by ion exchange chromatography |
PT1084136E (pt) | 1998-06-01 | 2004-12-31 | Genentech Inc | Separacao de monomeros de anticorpos dos seus multimeros atraves da utilizacao de cromatografia de troca ionica |
IL140155A (en) | 1998-06-09 | 2005-12-18 | Statens Seruminstitut | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products |
PL393286A1 (pl) | 1999-01-07 | 2011-06-06 | Zymogenetics, Inc. | Rozpuszczalny receptor BR43x2 i sposoby jego zastosowania |
DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
EP1280826B1 (en) * | 2000-05-12 | 2007-05-02 | Amgen Inc. | Polypeptides for inhibiting april-mediated b- and t-cell proliferation. |
EA007275B1 (ru) * | 2001-05-24 | 2006-08-25 | Займодженетикс, Инк. | Слитые белки taci-иммуноглобулина |
DE60235989D1 (de) | 2001-06-26 | 2010-05-27 | Amgen Fremont Inc | Antikörper gegen opgl |
US7737260B2 (en) * | 2003-11-13 | 2010-06-15 | Hanmi Pharm. Co., Ltd | Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof |
WO2003059935A2 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
WO2003102132A2 (en) * | 2002-04-26 | 2003-12-11 | Genetech, Inc. | Non-affinity purification of proteins |
SI1561756T1 (sl) | 2002-09-11 | 2016-02-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Postopek čiščenja proteinov |
ES2629602T5 (es) | 2002-09-11 | 2021-06-08 | Genentech Inc | Purificación de proteínas |
TWI353991B (en) * | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
PL1678208T3 (pl) | 2003-10-27 | 2013-09-30 | Wyeth Llc | Usuwanie agregatów o wysokiej masie cząsteczkowej z użyciem chromatografii na hydroksyapatycie |
US8067182B2 (en) | 2005-03-11 | 2011-11-29 | Wyeth Llc | Method of weak partitioning chromatography |
NZ562949A (en) * | 2005-04-11 | 2009-05-31 | Medarex Inc | Protein purification using HCIC and ion exchange chromatography |
MX2007015952A (es) * | 2005-06-17 | 2008-03-07 | Elan Pharma Int Ltd | Metodos para purificar anticuerpos anti a beta. |
WO2009017491A1 (en) | 2006-06-14 | 2009-02-05 | Smithkline Beecham Corporation | Methods for purifying antibodies using ceramic hydroxyapatite |
EP2061803B2 (en) † | 2006-08-28 | 2022-11-16 | Ares Trading S.A. | Process for the purification of fc-containing proteins |
WO2008087184A2 (en) * | 2007-01-17 | 2008-07-24 | Merck Serono S.A. | Process for the purification of fc-containing proteins |
-
2007
- 2007-08-27 EP EP07802925.3A patent/EP2061803B2/en active Active
- 2007-08-27 DK DK07802925.3T patent/DK2061803T4/da active
- 2007-08-27 ES ES07802925T patent/ES2755386T5/es active Active
- 2007-08-27 UA UAA200902854A patent/UA99262C2/ru unknown
- 2007-08-27 JP JP2009526068A patent/JP2010501623A/ja active Pending
- 2007-08-27 LT LT07802925T patent/LT2061803T/lt unknown
- 2007-08-27 KR KR1020097006443A patent/KR101770312B1/ko active IP Right Grant
- 2007-08-27 AU AU2007291283A patent/AU2007291283B2/en active Active
- 2007-08-27 HU HUE07802925A patent/HUE045898T2/hu unknown
- 2007-08-27 FI FIEP07802925.3T patent/FI2061803T4/fi active
- 2007-08-27 US US12/377,122 patent/US8513393B2/en active Active
- 2007-08-27 PL PL07802925.3T patent/PL2061803T5/pl unknown
- 2007-08-27 PT PT78029253T patent/PT2061803T/pt unknown
- 2007-08-27 SI SI200732135T patent/SI2061803T2/sl unknown
- 2007-08-27 MX MX2009002014A patent/MX2009002014A/es active IP Right Grant
- 2007-08-27 EA EA200970231A patent/EA017152B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-08-27 WO PCT/EP2007/058887 patent/WO2008025748A1/en active Application Filing
- 2007-08-27 CA CA2661748A patent/CA2661748C/en active Active
- 2007-08-28 AR ARP070103817A patent/AR062570A1/es not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-02-24 IL IL197220A patent/IL197220A/en active IP Right Grant
- 2009-12-03 HK HK09111377.1A patent/HK1131400A1/xx unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996041624A1 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Immunex Corporation | TNF-α CONVERTING ENZYME |
WO2004076485A1 (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-10 | Lonza Biologics Plc. | Antibody purification by protein a and ion exchange chromatography |
EP1614693A1 (en) * | 2003-03-31 | 2006-01-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Purification of human monoclonal antibody and human polyclonal antibody |
WO2005100394A2 (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PURIFIED INTERLEUKIN-15/Fc FUSION PROTEIN AND PREPARATION THEREOF |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2698654C2 (ru) * | 2014-06-13 | 2019-08-28 | Люпин Лимитед | Способ очистки белка слияния |
RU2698671C2 (ru) * | 2014-07-18 | 2019-08-28 | Сандоз Аг | КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2008025748A1 (en) | 2008-03-06 |
FI2061803T4 (fi) | 2023-03-14 |
KR20090057296A (ko) | 2009-06-04 |
PL2061803T5 (pl) | 2023-03-27 |
US8513393B2 (en) | 2013-08-20 |
CA2661748A1 (en) | 2008-03-06 |
CA2661748C (en) | 2016-02-09 |
HK1131400A1 (en) | 2010-01-22 |
SI2061803T2 (sl) | 2023-01-31 |
AU2007291283B2 (en) | 2012-09-20 |
HUE045898T2 (hu) | 2020-01-28 |
PL2061803T3 (pl) | 2020-02-28 |
AR062570A1 (es) | 2008-11-19 |
EP2061803B2 (en) | 2022-11-16 |
EP2061803A1 (en) | 2009-05-27 |
EA200970231A1 (ru) | 2009-08-28 |
JP2010501623A (ja) | 2010-01-21 |
AU2007291283A1 (en) | 2008-03-06 |
ES2755386T5 (es) | 2023-04-05 |
IL197220A (en) | 2013-06-27 |
US20100190961A1 (en) | 2010-07-29 |
DK2061803T3 (da) | 2019-11-18 |
PT2061803T (pt) | 2019-11-21 |
KR101770312B1 (ko) | 2017-08-22 |
LT2061803T (lt) | 2019-11-25 |
MX2009002014A (es) | 2009-03-09 |
DK2061803T4 (da) | 2022-12-05 |
ES2755386T3 (es) | 2020-04-22 |
SI2061803T1 (sl) | 2019-12-31 |
UA99262C2 (ru) | 2012-08-10 |
IL197220A0 (en) | 2009-12-24 |
EP2061803B1 (en) | 2019-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA017152B1 (ru) | СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ | |
EA017733B1 (ru) | СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СЛИТЫХ БЕЛКОВ | |
US11472863B2 (en) | Human coagulation factor IX (FIX) fusion protein, preparation method therefor, and use thereof | |
JP2010516651A (ja) | Fc含有タンパク質の精製のための方法 | |
US20100249381A1 (en) | Method for Purifying FC-Fusion Proteins | |
CN1130353A (zh) | 蛋白质的纯化 | |
JP2011500757A (ja) | Fc含有タンパク質の精製方法 | |
CN113105562A (zh) | 突变型单链人凝血因子viii在制备融合蛋白中的应用 | |
EP1404428A4 (en) | PROCESSES RELATING TO THE PURIFICATION OF HIGHLY ANIONIC PROTEINS | |
BRPI0716382B1 (pt) | método para reduzir o teor de porções de fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo fc, e uso de cromatografia de troca catiônica | |
CN109678969A (zh) | 一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法 | |
JP2010501622A (ja) | Fc−融合タンパク質の精製法 | |
TW202012426A (zh) | 多肽之純化方法 | |
JPS62201582A (ja) | 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンG Fc領域蛋白質の製造法 | |
AU2002320065A1 (en) | Methods for purifying highly anionic proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY |