WO2020045477A1 - ポリペプチドの精製方法 - Google Patents

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WO2020045477A1
WO2020045477A1 PCT/JP2019/033649 JP2019033649W WO2020045477A1 WO 2020045477 A1 WO2020045477 A1 WO 2020045477A1 JP 2019033649 W JP2019033649 W JP 2019033649W WO 2020045477 A1 WO2020045477 A1 WO 2020045477A1
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WO
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target polypeptide
group
polypeptide
reducing agent
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/033649
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English (en)
French (fr)
Inventor
良 土井
松田　隆志
Original Assignee
Jsr株式会社
ジェイエスアール マイクロ インコーポレイテッド
ジェイエスアール マイクロ エヌ．ブイ．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jsr株式会社, ジェイエスアール マイクロ インコーポレイテッド, ジェイエスアール マイクロ エヌ．ブイ． filed Critical Jsr株式会社
Publication of WO2020045477A1 publication Critical patent/WO2020045477A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a polypeptide. More specifically, the present invention relates to a method for purifying a polypeptide and a treating agent used in the method.
  • Antibodies are an important component of the immune system of many animals, especially humans. In recent years, advances in recombinant technology have made it possible to produce antibodies against cancer cells, bacteria and viruses. For example, antibodies are produced using cell lines that are designed to express at high levels. The designed cell line is cultured in a culture containing a complex mixture of saccharides, amino acids, growth factors, and the like, in addition to polypeptides and proteins other than antibodies.
  • target polypeptides such as antibodies from cell by-products and culture solution components and use them for research purposes or as therapeutic or diagnostic agents
  • the purity of the antibody molecule is particularly important, such as when administering the antibody to a human as a drug.
  • One of the typical antibody purification methods is purification by affinity chromatography. In this method, an antibody in a sample such as a culture solution is bound to a ligand immobilized on a solid phase, a non-target polypeptide is removed from the solid phase using a washing solution, and then the antibody is eluted.
  • Patent Documents 5 and 6 As the washing solution used in the treatment for removing the unintended polypeptide from the solid phase, a solution containing benzalkonium chloride and a solution containing arginine have been proposed (Patent Documents 5 and 6). However, antibody purification using these liquids could not sufficiently remove undesired polypeptides.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for purifying a polypeptide which can efficiently remove a non-target polypeptide.
  • ⁇ 1> A method for purifying a target polypeptide from a sample containing the target polypeptide and the non-target polypeptide by affinity chromatography, comprising a step of treating the non-target polypeptide with a processing agent containing a reducing agent.
  • Method. ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the treatment agent has an oxidation-reduction potential (ORP) of ⁇ 500 to 50 mV.
  • ORP oxidation-reduction potential
  • ORP oxidation-reduction potential
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the reducing agent is a reducing agent capable of cleaving a disulfide bond.
  • the reducing agent is a reducing agent having one or two selected from a sulfanyl group and a phosphorus atom in a molecule.
  • the reducing agent is a non-amino acid-based reducing agent.
  • the non-target polypeptide is HCP.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the target polypeptide is an antibody, an antibody fragment, an Fc fusion protein or a fragment thereof.
  • the treatment step is a step of separating the non-target polypeptide from a solid phase to which a ligand bound to the target polypeptide in the sample is immobilized.
  • the described method. ⁇ 10> a step of bringing the ligand immobilized on the solid phase into contact with the sample containing the target polypeptide and the non-target polypeptide before the separation treatment step to bind the target polypeptide and the ligand;
  • the method according to ⁇ 9> The method according to ⁇ 9>.
  • ⁇ 11> The method according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, further comprising a step of recovering the target polypeptide from the solid phase using an elution buffer.
  • ⁇ 12> The method according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, wherein the ligand is an immunoglobulin-binding protein.
  • the immunoglobulin-binding protein is one or more selected from protein A, protein G, protein L, VHH antibody, Fc binding protein, and functional variants thereof.
  • the non-target polypeptide is separated from a solid phase to which a ligand bound to the target polypeptide in a sample is immobilized, and the target polypeptide is purified. Processing agent.
  • a non-target polypeptide can be efficiently removed, and a target polypeptide with little contamination of the non-target polypeptide can be obtained.
  • the treating agent used in the present invention is a treating agent used in a method for purifying a target polypeptide from a sample containing a target polypeptide and a non-target polypeptide by affinity chromatography, and is a processing agent containing a reducing agent. .
  • a reducing agent capable of cleaving a disulfide bond is preferable in order to remove an unintended polypeptide and increase the recovery rate of the undesired polypeptide.
  • the “reducing agent capable of cleaving a disulfide bond” may be any one that can cleave a disulfide bond of a non-target polypeptide having a disulfide bond in a molecule under the conditions for treating the non-target polypeptide.
  • the reducing agent may be water-soluble or water-insoluble, but is preferably a water-soluble reducing agent in order to prevent aggregation and denaturation of the target polypeptide by an organic solvent.
  • a reducing agent that dissolves in an amount of 1 g or more in 100 g of pure water at 23 ° C. is referred to as a water-soluble reducing agent.
  • the reducing agent may be a polymer (a polymerizing reducing agent such as a peptide-based reducing agent) or a non-polymer (a non-polymerizing reducing agent).
  • a non-polymerizing agent may be used. It is preferably a polymer.
  • the reducing agent can be roughly classified into a non-amino acid-based reducing agent and an amino acid-based reducing agent.However, in order to increase the effect of removing unintended polypeptides and the recovery rate of the target polypeptide, the non-amino acid-based reducing agent is used. Is preferred. Among such reducing agents, non-amino acid-based non-polymerizable reducing agents are preferred.
  • a reducing agent having one or two selected from a sulfanyl group (—SH) and a phosphorus atom in the molecule in order to enhance the effect of removing undesired polypeptides and the recovery of the target polypeptides.
  • Agents are preferred, and reducing agents having a sulfanyl group in the molecule are more preferred.
  • the reducing agent having a sulfanyl group in the molecule is preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2 and particularly preferably 2 to reduce the effect of removing the undesired polypeptide and increase the recovery of the undesired polypeptide.
  • the reducing agent having a phosphorus atom in the molecule preferably has one to three, more preferably one, phosphorus atom in the molecule in order to remove an undesired polypeptide and increase the recovery of the undesired polypeptide.
  • a reducing agent having a phosphorus atom in a molecule is preferably an organic phosphorus compound.
  • the reducing agent may have a substituent or a linking group other than those described above in the molecule.
  • Examples of the substituent other than the sulfanyl group include a hydroxy group, an amino group, a carboxy group, a cyano group, a sulfo group, and a nitro group
  • examples of the linking group other than a phosphorus atom include an ether bond, an ester bond, and an amide bond. And the like. In addition, these may have only one kind or two or more kinds of these substituents and linking groups.
  • the number of substituents other than the sulfanyl group is preferably from 0 to 10, more preferably from 1 to 5, particularly preferably from 2 to 5, in order to remove the undesired polypeptide and increase the recovery of the undesired polypeptide. There are four.
  • a hydroxy group, an amino group, and a carboxy group are preferable, and a hydroxy group is more preferable, in order to remove an unintended polypeptide and increase the recovery rate of the objective polypeptide.
  • the number of linking groups other than a phosphorus atom is preferably 0 to 10, more preferably 0 to 5, and particularly preferably 0 to 2.
  • the total number of carbon atoms contained in the molecule of the reducing agent is preferably from 1 to 50, more preferably from 1 to 30, still more preferably from 1 to 50, in order to remove the undesired polypeptide and increase the recovery of the undesired polypeptide. -20, more preferably 2-10, more preferably 3-8, particularly preferably 4-6.
  • a compound represented by the following formula (1), (2) or (3) or a derivative salt thereof is used in order to remove an undesired polypeptide and increase the recovery of the desired polypeptide.
  • the compound represented by the formula (1) or (2) or a derivative thereof is more preferable, and the compound represented by the formula (2) is particularly preferable.
  • the compound represented by the formula (1) has one sulfanyl group in the molecule.
  • R 1 represents a monovalent organic group (preferably a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms) A group having at least one linking group selected from an ether bond, an ester bond and an amide bond between carbon-carbon atoms, and more preferably a carbon group having 1 to 30 carbon atoms, which is substituted or unsubstituted by a hydroxy group.
  • R 2 represents a divalent organic group (preferably a substituted or unsubstituted divalent hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted divalent hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms) Is a group having at least one linking group selected from an ether bond, an ester bond and an amide bond between carbon-carbon atoms of a divalent hydrocarbon group, more preferably a carbon group substituted or unsubstituted by a hydroxy group.
  • R 3 , R 4 and R 5 each independently represent a monovalent organic group (preferably a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted hydrocarbon group; Is a group having at least one kind of linking group selected from an ether bond, an ester bond and an amide bond between carbon-carbon atoms of a hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, more preferably a hydroxy group is substituted.
  • a monovalent organic group preferably a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted hydrocarbon group
  • the carbon number of the monovalent organic group represented by R 1 , R 3 , R 4 and R 5 in the formulas (1) and (3) determines the effect of removing the unintended polypeptide and the recovery rate of the targeted polypeptide. In order to increase the value, it is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 8.
  • one or more linking groups selected from an ether bond, an ester bond, and an amide bond between carbon-carbon atoms of a hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms and a hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms can be used.
  • the number of the linking groups is preferably 0 to 10, more preferably 0 to 5, and particularly preferably 0 to 2.
  • An example of a case where a plurality of ether bonds are present between carbon-carbon atoms is an alkoxypolyoxyalkylene group.
  • the carbon number of the “hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms” is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, and more preferably 1 to 30, in order to increase the effect of removing undesired polypeptides and the recovery rate of the target polypeptide. It is preferably from 1 to 10, particularly preferably from 1 to 8.
  • the “hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms” is the same as the “hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms” except that the hydrocarbon group has 2 or more carbon atoms, and preferably has 2 to 30 carbon atoms. It is more preferably 2 to 20, further preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 8.
  • Examples of the “hydrocarbon group” for R 1 , R 3 , R 4 and R 5 include an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, a bridged hydrocarbon group, an aryl group, and an aralkyl group.
  • the carbon number of the alkyl group is preferably from 1 to 30, more preferably from 1 to 20, still more preferably from 1 to 10, and further preferably from 1 to 30, in order to remove the undesired polypeptide and increase the recovery of the undesired polypeptide. It is 1 to 8, particularly preferably 2 to 4.
  • the alkyl group may be linear or branched.
  • alkyl group examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, a pentyl group, a hexyl group, and a heptyl group.
  • the number of carbon atoms of the alkenyl group is preferably 2 to 30, more preferably 2 to 20, further preferably 2 to 10, further preferably 2 to 8, and particularly preferably 2 to 4.
  • the alkenyl group may be linear or branched. Specific examples of the alkenyl group include a vinyl group, a propenyl group, and a butenyl group.
  • the cycloalkyl group and the bridged ring hydrocarbon group preferably have 3 to 30 carbon atoms, more preferably 3 to 12 carbon atoms.
  • Specific examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group and a cyclohexyl group.
  • Examples of the bridged ring hydrocarbon group include an isobornyl group.
  • the aryl group preferably has 6 to 30 carbon atoms, and more preferably 6 to 12 carbon atoms.
  • a phenyl group and the like can be mentioned.
  • the aralkyl group preferably has 7 to 30 carbon atoms, and more preferably 7 to 13 carbon atoms.
  • a benzyl group, a phenethyl group and the like can be mentioned.
  • the “hydrocarbon group” in R 1 , R 3 , R 4 and R 5 may have a substituent.
  • a substituent containing a hetero atom is preferable, and examples thereof include a hydroxy group, an amino group, a carboxy group, a cyano group, a sulfo group, and a nitro group.
  • the number of substituents is preferably from 0 to 10, more preferably from 1 to 5, still more preferably from 1 to 4, in order to increase the effect of removing unintended polypeptides and the recovery of the targeted polypeptide.
  • it is one or two.
  • a hydroxy group, an amino group, and a carboxy group are preferable, and a hydroxy group is more preferable, in order to remove an unintended polypeptide and increase the recovery rate of the objective polypeptide.
  • the carbon number of the divalent organic group represented by R 2 in the formula (2) is preferably from 1 to 30, and more preferably from 30 to improve the effect of removing undesired polypeptides and the recovery of the targeted polypeptides. It is 1 to 20, more preferably 2 to 10, more preferably 3 to 8, and particularly preferably 4 to 6.
  • the divalent organic group is selected from a divalent hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms, an ether bond, an ester bond, and an amide bond between carbon-carbon atoms of the divalent hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms.
  • Groups having at least one kind of linking group are exemplified.
  • the number of the linking groups is preferably 0 to 10, more preferably 0 to 5, and particularly preferably 0 to 2.
  • a polyoxyalkylene group is an example of a case where a plurality of ether bonds are present between carbon-carbon atoms.
  • the carbon number of the “divalent hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms” is preferably from 1 to 30, more preferably from 1 to 30, in order to increase the effect of removing undesired polypeptides and the recovery of the targeted polypeptides. 20, more preferably 2 to 10, more preferably 3 to 8, particularly preferably 4 to 6.
  • the “divalent hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms” is the same as the “divalent hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms” except that the carbon number is 2 or more. It is preferably 2 to 30, more preferably 2 to 20, still more preferably 2 to 10, still more preferably 3 to 8, and particularly preferably 4 to 6.
  • Examples of the “divalent hydrocarbon group” for R 2 include an alkanediyl group, an alkenediyl group such as a vinylene group; a cycloalkanediyl group such as a cyclohexanediyl group; a divalent bridged ring hydrocarbon group; Arylene group.
  • the alkanediyl group and the alkenediyl group may be linear or branched. Among these, an alkanediyl group and an alkenediyl group are preferable, and an alkanediyl group is more preferable, in order to increase the effect of removing the non-target polypeptide and the recovery rate of the target polypeptide.
  • the carbon number of the alkanediyl group is preferably from 1 to 30, more preferably from 1 to 20, still more preferably from 2 to 10, in order to increase the effect of removing the undesired polypeptide and the recovery of the undesired polypeptide. Is from 3 to 8, particularly preferably from 4 to 6.
  • Examples of the alkanediyl group include methane-1,1-diyl, ethane-1,1-diyl, ethane-1,2-diyl, propane-1,1-diyl, and propane-1.
  • the “divalent hydrocarbon group” for R 2 may have a substituent.
  • a substituent containing a hetero atom is preferable, and examples thereof include a hydroxy group, an amino group, a carboxy group, a cyano group, a sulfo group, and a nitro group.
  • the number of substituents is preferably from 0 to 10, more preferably from 1 to 5, still more preferably from 1 to 4, in order to increase the effect of removing unintended polypeptides and the recovery of the targeted polypeptide. Preferably it is one or two.
  • a hydroxy group, an amino group, and a carboxy group are preferable, and a hydroxy group is more preferable, in order to remove an unintended polypeptide and increase the recovery rate of the objective polypeptide.
  • a hydrochloride is mentioned, for example.
  • the reducing agent include, for example, cysteine (L-cysteine, D-cysteine), cysteine hydrochloride, cysteamine, dithiothreitol, dithioerythritol, glutathione, 1-thioglycerol, 2-mercaptoethanol, 2-mercaptoacetic acid , 3-mercaptopropionic acid, 2-mercaptoethanesulfonic acid, 2-mercaptoethylamine hydrochloride, tris (2-cyanoethyl) phosphine, tris (2-carboxylethyl) phosphine, tris (3-hydroxypropyl) phosphine, tris (2 -Carboxyethyl) phosphine hydrochloride, tributylphosphine and the like.
  • cysteine L-cysteine, D-cysteine
  • cysteine hydrochloride cysteamine, dithiothreitol, dithioerythr
  • cysteine dithiothreitol, 1-thioglycerol, and tris (3-hydroxypropyl) phosphine are preferred, and dithiothreitol is preferred, in order to remove the undesired polypeptide and increase the recovery of the undesired polypeptide.
  • 1-thioglycerol is more preferred, and dithiothreitol is particularly preferred.
  • 1-thioglycerol also has an advantage that its safety is particularly high.
  • the concentration of the reducing agent is preferably 0.1 mM or more, more preferably 0.5 mM or more, in the treatment agent used in the present invention, in order to enhance the effect of removing unintended polypeptides and the recovery of the target polypeptide. It is preferably at least 1 mM, more preferably at least 5 mM, still more preferably at least 10 mM, more preferably at least 50 mM. In order to suppress a pressure increase during purification, in the treatment agent used in the present invention, preferably at most 10,000 mM , More preferably 5,000 mM or less, still more preferably 2500 mM or less, and still more preferably 1500 mM or less.
  • 0.1 to 2500 mM is preferable, 0.5 to 1500 mM is more preferable, and 1 to 1500 mM is still more preferable. 5 to 1500 mM is more preferable, 10 to 1500 mM is more preferable, and 50 to 1500 mM is more preferable.
  • concentration of the reducing agent having two or more sulfanyl groups in the molecule depends on the effect of removing the undesired polypeptide and the purpose.
  • the concentration is particularly preferably 500 mM or less. That is, when a reducing agent having two or more sulfanyl groups in a molecule is used, 100 to 500 mM is particularly preferable.
  • the concentration is particularly preferably 500 mM or more in the treating agent used in the present invention, in order to enhance the effect of removing the non-target polypeptide and the recovery rate of the target polypeptide. In order to increase the recovery rate of the target polypeptide, it is particularly preferably 1,000 mM or less in the treating agent used in the present invention.
  • the treating agent of the present invention may contain, in addition to the above components, water; inorganic salts such as sodium phosphate, sodium chloride, and sodium sulfate; surfactants; amino acids; In addition, these other components may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the inorganic salt is preferably 1 to 1500 mM, more preferably 5 to 1000 mM, still more preferably 10 to 750 mM, in the treating agent used in the present invention, in order to enhance the effect of removing the unintended polypeptide. , 200 to 750 mM are particularly preferred.
  • the content of water is preferably 70% by mass or more, more preferably 80% by mass or more, particularly preferably 90% by mass or more in the treating agent used in the present invention.
  • the oxidation-reduction potential (ORP) of the treating agent used in the present invention is preferably -500 mV or more, more preferably -450 mV or more, and still more preferably, in order to increase the effect of removing unintended polypeptides and the recovery rate of the targeted polypeptides. Is not less than -400 mV, more preferably not less than -350 mV, particularly preferably not less than -300 mV, and preferably not more than 50 mV, more preferably not more than 50 mV, in order to increase the effect of removing undesired polypeptides and the recovery rate of the desired polypeptides.
  • ORP oxidation-reduction potential
  • the oxidation-reduction potential means the oxidation-reduction potential (ORP) at pH 7.5, and may be measured using an ORP electrode. Specifically, it can be measured according to the method described in the examples.
  • the pH at 23 ° C. of the treating agent used in the present invention is preferably 5 or more, more preferably 6 or more, particularly preferably 7 or more, and preferably 9 or less, in order to increase the recovery of the target polypeptide. It is more preferably 8 or less.
  • the treating agent used in the present invention is preferably a liquid agent. Further, the viscosity at 23 ° C. of the treating agent used in the present invention is preferably 0.8 to 2.0 mPa ⁇ s, and more preferably 0.8 to 1.6 mPa ⁇ s.
  • the treating agent of the present invention is used in a method for purifying a target polypeptide from a sample containing the target polypeptide and a non-target polypeptide by affinity chromatography.
  • the treating agent is preferably a polypeptide treating agent, and more preferably a non-target polypeptide treating agent.
  • examples of the sample containing the target polypeptide and the non-target polypeptide include a sample solution such as a cell culture solution and a cell lysate.
  • a culture solution of CHO cells Choinese hamster ovary protein
  • a culture solution of a hybridoma containing the non-target polypeptide a culture solution of a hybridoma containing the non-target polypeptide
  • a cell lysate of genetically modified Escherichia coli is mentioned.
  • the CHO cell culture solution usually contains an IgG-type antibody containing an Fc region produced by the CHO cells, in addition to the non-target polypeptide.
  • target polypeptide examples include antibodies, antibody fragments, Fc fusion proteins, fragments thereof, and mutants and modifications thereof. Among them, an antibody, an antibody fragment, an Fc fusion protein, and a fragment thereof are preferable, and an antibody is more preferable.
  • An IgG-type antibody containing an Fc region (CH2 / CH3 region (CH2 region and CH3 region)) is further preferable.
  • the “antibody” in the present specification may include, for example, immunoglobulins of any class such as IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, and subclasses thereof, fragments thereof, and variants thereof.
  • the “antibody” in the present specification may be an antibody produced in animal cells, a chimeric antibody such as a humanized antibody, an antibody complex, or another modified immunoglobulin containing an antigen recognition site.
  • the “antibody fragment” in the present specification may be an antibody fragment containing an antigen recognition site or an antibody fragment not containing an antigen recognition site.
  • Antibody fragments that do not contain an antigen recognition site include, for example, proteins comprising only the Fc region of immunoglobulins, Fc fusion proteins, and mutants and modifications thereof.
  • Non-target polypeptides include HCP (Host Cell Protein), media-derived components, and the like.
  • HCP includes proteins derived from cell fragments of antibody-producing cells such as CHO cells.
  • the treating agent of the present invention is particularly suitable for removing HCP.
  • Purification of the target polypeptide may be performed in the same manner as known polypeptide purification, except that the non-target polypeptide is treated with a treating agent containing a reducing agent.
  • the treatment of the non-target polypeptide include a process of separating the non-target polypeptide.
  • the treating agent of the present invention may be added to a sample in advance, and the undesired polypeptide may be separated from the sample by a method such as passing the solution through an affinity column.
  • the non-target polypeptide may be separated from the solid phase by a method in which the target polypeptide in the sample is bound, and the treatment agent of the present invention is passed through the affinity column filled with the solid phase.
  • the ligand to which the target polypeptide is bound in the sample is immobilized in order to increase the effect of removing the non-target polypeptide and the recovery rate of the target polypeptide.
  • the step of separating the undesired polypeptide from the solid phase is preferred.
  • the step of separating the non-target polypeptide from the solid phase in this manner is sometimes referred to as intermediate washing.
  • intermediate washing when such intermediate washing is performed, the binding of an immunoglobulin such as protein A to the protein is prevented. It is particularly suitable for antibody purification by affinity chromatography using a sex protein as a ligand.
  • a state in which a solid phase in which a ligand bound to a target polypeptide in a sample is immobilized is filled in a column container is created according to a conventional method, and the treating agent of the present invention is passed through the state. Just do it.
  • the solid phase is not particularly limited as long as it is used for affinity chromatography.
  • the material of the solid phase include a synthetic polymer and a natural polymer, as well as silica and glass, but a synthetic polymer and a natural polymer are preferred.
  • synthetic polymers include polystyrene resins and methacrylate resins
  • natural polymers include those composed of polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose. Of these, agarose and methacrylate resins are preferred, and methacrylate resins are more preferred because they can be easily filled in a column container and scaled up.
  • the shape of the solid phase include particles, hollow fibers, nonwoven fabrics, filters, and monoliths, and particles are preferable.
  • the ligand may be selected in consideration of the affinity for the target polypeptide, but is preferably an immunoglobulin-binding protein, and is selected from protein A, protein G, protein L, VHH antibody, Fc binding protein and functional variants thereof. One or more selected ones are more preferable.
  • protein A is particularly preferred because it can be used in the production of antibody drugs. Since the treating agent of the present invention hardly dissociates an antibody from protein A, it is particularly suitable for antibody purification using protein A as a ligand.
  • the term "immunoglobulin-binding protein" refers to a protein having an activity of binding to an antibody or a fragment thereof.
  • immunoglobulin-binding proteins include a functional variant of protein A, a functional variant of protein G, a functional variant of protein L, a functional variant of VHH antibody, and the functions of other Fc-binding proteins. Sex mutants are included, and these “functional mutants” include a functional mutant of protein A, a functional mutant of protein G, a functional mutant of protein L, and a functional mutant of VHH antibody. And a functional variant of an Fc-binding protein other than these, which has immunoglobulin binding properties.
  • a step of bringing a ligand immobilized on a solid phase into contact with a sample containing a target polypeptide and a non-target polypeptide to bind the target polypeptide to the ligand Is preferred.
  • the binding step is usually performed before separating the non-target polypeptide from the solid phase to which the ligand bound to the target polypeptide in the sample is immobilized, or after adding the treating agent of the present invention to the sample. Note that the column may be equilibrated prior to the binding step.
  • the method for binding the ligand to the target polypeptide in the sample is not particularly limited.
  • a particulate solid phase in which the ligand is immobilized is filled in a column container, the sample is added to the column, and the target polypeptide and the ligand are And by bringing them into contact with each other.
  • the step of separating the non-target polypeptide from the solid phase to which the ligand bound to the target polypeptide in the sample is immobilized after the above-mentioned binding step is as described above.
  • the amount of the treating agent of the present invention is usually 1 to 10 column volumes, but preferably 2 to 5 column volumes.
  • the temperature for the above treatment (specifically, the temperature for the separation treatment) is usually from 0 to 50 ° C, preferably from 5 to 35 ° C, more preferably room temperature.
  • the solid phase is further washed using a washing solution obtained by adding an inorganic salt such as sodium chloride or sodium sulfate to a neutral buffer such as sodium phosphate or Tris-HCl buffer, if necessary. May be.
  • the target polypeptide can be recovered from the solid phase from which the non-target polypeptide has been removed.
  • a recovery step includes, for example, a method in which a target polypeptide is eluted with an elution buffer, and the target polypeptide is recovered using a fraction collector of a chromatography system.
  • the elution buffer include an acidic buffer when the ligand is protein A or the like.
  • Examples 1 to 6, Comparative Examples 1 to 4 A column container (Tricorn 5/200 column manufactured by GE Healthcare) was filled with Ampshale A3 (manufactured by JSR Life Science) at a packing height of about 20 cm to prepare a column. The obtained column was connected to AKTAprime plus (manufactured by GE Healthcare), and a 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) was passed through the column at 5 column volumes (5 times the column volume) at a flow rate of 1 mL / min. Equilibrated.
  • the CHO cell culture supernatant containing the biosimilar of the monoclonal antibody Trastuzumab was passed through the column at a flow rate of 1 mL / min at a load of about 40 g antibody / mL carrier.
  • a washing solution 1 a buffer solution (pH 7.5) containing 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride and the additives described in Table 1 was passed through the column at three column volumes at a flow rate of 1 mL / min.
  • the oxidation-reduction potential (ORP) of the cleaning liquid 1 was measured using a pH meter D-51 manufactured by Horiba, ORP electrode 9300-10D, and a potassium chloride solution (3.33 mol / L) as a reference electrode internal solution. did.
  • the results are shown in Table 1.
  • a 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) was passed through the column at 5 column volumes at a flow rate of 1 mL / min.
  • a 100 mM sodium acetate buffer (pH 3.3) was passed through the column at 5 column volumes at a flow rate of 1 mL / min to elute the monoclonal antibody trapped in the column.

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Abstract

目的外ポリペプチドを効率的に除去することができるポリペプチド精製方法を提供すること。　アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法であって、還元剤を含有する処理剤で目的外ポリペプチドを処理する工程を含む、方法。

Description

ポリペプチドの精製方法
　本発明は、ポリペプチドの精製方法に関する。より詳細には、ポリペプチドの精製方法、及び当該方法に用いられる処理剤に関する。
　抗体は、多くの動物、特にヒトの免疫系にとって重要な要素である。近年では、組換技術の進歩により、癌細胞、細菌及びウイルスに対する抗体の産生が可能になっている。例えば、抗体は、高レベルに発現するように設計されている細胞株を用いて産生される。また、設計された細胞株は、抗体以外のポリペプチドやタンパク質の他、糖類、アミノ酸、成長因子の複合混合物などを含む培養物中で培養される。
　抗体をはじめとする目的ポリペプチドを細胞副産物や培養液成分から分離して、研究用途にまたは治療薬・診断薬として使用するためには、純度を十分に高めることが必要となる。薬剤として抗体をヒトに投与するような場合、抗体分子の純度は特に重要である。
　代表的な抗体精製方法のひとつとして、アフィニティークロマトグラフィーによる精製がある。この方法は、培養液等の試料中の抗体を、固相上に固定されたリガンドに結合させ、洗浄液を使用して目的外ポリペプチドを固相から除去した後に、抗体を溶出させるという手法である（例えば、特許文献１～４）。
　固相から目的外ポリペプチドを除去する処理に使用される上記洗浄液として、塩化ベンザルコニウムを含む液剤やアルギニンを含む液剤が提案されている（特許文献５、６）。
　しかしながら、これら液剤を用いた抗体精製では、目的外ポリペプチドを充分には除去することができなかった。
米国特許第６８７００３４号明細書 特許第４０３１０４９号公報 特許第４４６０３０２号公報 特許第５１５０４８８号公報 国際公開第２０１４／１９２８７７号パンフレット 特開２０１７－１６０２１５号公報
　本発明が解決しようとする課題は、目的外ポリペプチドを効率的に除去することができるポリペプチド精製方法を提供することにある。
　上記の課題は下記の手段により解決された。
　＜１＞　アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法であって、還元剤を含有する処理剤で目的外ポリペプチドを処理する工程を含む、方法。
　＜２＞　前記処理剤の酸化還元電位（ＯＲＰ）が、－５００～５０ｍＶである、＜１＞に記載の方法。
　＜３＞　前記処理剤の酸化還元電位（ＯＲＰ）が、－５００～－２５０ｍＶである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜４＞　前記還元剤が、ジスルフィド結合を切断し得る還元剤である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法。
　＜５＞　前記還元剤が、スルファニル基及びリン原子から選ばれる１種又は２種を分子内に有する還元剤である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法。
　＜６＞　前記還元剤が、非アミノ酸系還元剤である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の方法。
　＜７＞　前記目的外ポリペプチドが、ＨＣＰである、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
　＜８＞　前記目的ポリペプチドが、抗体、抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質又はその断片である、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の方法。
　＜９＞　前記処理工程が、前記試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から前記目的外ポリペプチドを分離処理する工程である、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の方法。
　＜１０＞　前記分離処理工程の前に、固相上に固定されたリガンドと、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料とを接触させ、前記目的ポリペプチドと前記リガンドとを結合させる工程を含む、＜９＞に記載の方法。
　＜１１＞　さらに、溶出バッファーを用いて前記固相から目的ポリペプチドを回収する工程を含む、＜９＞又は＜１０＞に記載の方法。
　＜１２＞　前記リガンドが、イムノグロブリン結合性タンパク質である、＜９＞～＜１１＞のいずれかに記載の方法。
　＜１３＞　前記イムノグロブリン結合性タンパク質が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＶＨＨ抗体、Ｆｃ結合タンパク及びその機能性変異体から選ばれる１種又は２種以上である、＜１２＞に記載の方法。
　＜１４＞　アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法に用いられる処理剤であって、還元剤を含有する処理剤。
　＜１５＞　前記方法が、試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から前記目的外ポリペプチドを分離処理し、目的ポリペプチドを精製する方法である、＜１４＞に記載の処理剤。
　本発明のポリペプチド精製方法によれば、目的外ポリペプチドを効率的に除去することができ、目的外ポリペプチドの混入が少ない目的ポリペプチドを得ることができる。
　以下、本発明について詳細に説明する。なお、数値範囲等を表す「ａ～ｂ」等の表記は、特に断りのない限りａ及びｂをその数値範囲に含むものであり、「ａ以上、ｂ以下」と同義である。
［処理剤］
　本発明で用いる処理剤は、アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法に用いられる処理剤であって、還元剤を含有する処理剤である。
（還元剤）
　還元剤としては、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、ジスルフィド結合を切断し得る還元剤が好ましい。
　なお、上記「ジスルフィド結合を切断し得る還元剤」は、目的外ポリペプチドを処理する条件下で、ジスルフィド結合を分子内に有する目的外ポリペプチドのジスルフィド結合を切断できるものであればよい。
　また、還元剤は水溶性でも非水溶性でもよいが、有機溶媒による目的ポリペプチドの凝集や変性を防止するために、水溶性還元剤が好ましい。なお、本明細書においては、２３℃で純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解する還元剤を、水溶性還元剤というものとする。
　また、還元剤は、重合体（ペプチド系還元剤のような重合型還元剤）でも非重合体（非重合型還元剤）でもよいが、目的外ポリペプチドを除去する効果を高めるために、非重合体であることが好ましい。また、還元剤は、非アミノ酸系還元剤、アミノ酸系還元剤に大別することもできるが、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、非アミノ酸系還元剤が好ましい。このような還元剤の中では、非アミノ酸系非重合型還元剤が好ましい。
　また、還元剤としては、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、スルファニル基（－ＳＨ）及びリン原子から選ばれる１種又は２種を分子内に有する還元剤が好ましく、スルファニル基を分子内に有する還元剤がより好ましい。
　スルファニル基を分子内に有する還元剤は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～５個、より好ましくは１又は２個、特に好ましくは２個のスルファニル基を分子内に有する。
　リン原子を分子内に有する還元剤は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３個、より好ましくは１個のリン原子を分子内に有する。なお、このようなリン原子を分子内に有する還元剤は、有機リン化合物であることが好ましい。
　還元剤は、上記した以外の置換基や連結基を分子内に有していてもよい。スルファニル基以外の置換基としては、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、シアノ基、スルホ基、ニトロ基等が挙げられ、また、リン原子以外の連結基としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合等が挙げられる。なお、これら置換基や連結基のうち１種のみを有していても２種以上を有していてもよい。
　スルファニル基以外の置換基の個数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは０～１０個、より好ましくは１～５個、特に好ましくは２～４個である。スルファニル基以外の置換基の中では、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基が好ましく、ヒドロキシ基がより好ましい。また、リン原子以外の連結基の個数は、好ましくは０～１０個、より好ましくは０～５個、特に好ましくは０～２個である。
　還元剤の分子内に含まれる総炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～５０、より好ましくは１～３０、更に好ましくは１～２０、更に好ましくは２～１０、更に好ましくは３～８、特に好ましくは４～６である。
　また、還元剤としては、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、下記式（１）、（２）若しくは（３）で表わされる化合物又はそれらの誘導塩が好ましく、式（１）若しくは（２）で表わされる化合物又はそれらの誘導塩がより好ましく、式（２）で表わされる化合物が特に好ましい。なお、式（１）で表わされる化合物は、スルファニル基を分子内に１個有するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
〔式（１）中、Ｒ1は、１価の有機基（好ましくは置換若しくは非置換の炭素数１～３０の炭化水素基、又は置換若しくは非置換の炭素数２～３０の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基であり、より好ましくはヒドロキシ基が置換しているか若しくは非置換の炭素数１～３０の炭化水素基、又はヒドロキシ基が置換しているか若しくは非置換の炭素数２～３０の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基）を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
〔式（２）中、Ｒ2は、２価の有機基（好ましくは置換若しくは非置換の炭素数１～３０の２価の炭化水素基、又は置換若しくは非置換の炭素数２～３０の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基であり、より好ましくはヒドロキシ基が置換しているか若しくは非置換の炭素数１～３０の２価の炭化水素基、又はヒドロキシ基が置換しているか若しくは非置換の炭素数２～３０の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基）を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
〔式（３）中、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、１価の有機基（好ましくは置換若しくは非置換の炭素数１～３０の炭化水素基、又は置換若しくは非置換の炭素数２～３０の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基であり、より好ましくはヒドロキシ基が置換しているか若しくは非置換の炭素数１～３０の炭化水素基、又はヒドロキシ基が置換しているか若しくは非置換の炭素数２～３０の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基）を示す。〕
　式（１）、（３）中のＲ1、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5で示される１価の有機基の炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、更に好ましくは１～１０、特に好ましくは１～８である。
　１価の有機基としては、炭素数１以上の炭化水素基、炭素数２以上の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基が挙げられる。この連結基の個数は、好ましくは０～１０個、より好ましくは０～５個、特に好ましくは０～２個である。なお、炭素－炭素原子間にエーテル結合を複数有する場合の一例として、アルコキシポリオキシアルキレン基が挙げられる。
　上記「炭素数１以上の炭化水素基」の炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、更に好ましくは１～１０、特に好ましくは１～８である。また、「炭素数２以上の炭化水素基」は、炭素数が２以上であること以外は「炭素数１以上の炭化水素基」と同様であり、その炭素数は、好ましくは２～３０、より好ましくは２～２０、更に好ましくは２～１０、特に好ましくは２～８である。
　Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5における「炭化水素基」としては、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、橋かけ環炭化水素基、アリール基、アラルキル基が挙げられる。
　アルキル基の炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、更に好ましくは１～１０、更に好ましくは１～８、特に好ましくは２～４である。アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、２－エチルヘキシル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
　アルケニル基の炭素数は、好ましくは２～３０、より好ましくは２～２０、更に好ましくは２～１０、更に好ましくは２～８、特に好ましくは２～４である。アルケニル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルケニル基としては、具体的には、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基等が挙げられる。
　シクロアルキル基、橋かけ環炭化水素基の炭素数は、好ましくは３～３０、より好ましくは３～１２である。シクロアルキル基としては、具体的には、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基等が挙げられる。
　アリール基の炭素数は、好ましくは６～３０、より好ましくは６～１２である。例えば、フェニル基等が挙げられる。アラルキル基の炭素数は、好ましくは７～３０、より好ましくは７～１３である。例えば、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
　また、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5における「炭化水素基」は、置換基を有していてもよい。置換基としては、ヘテロ原子を含む置換基が好ましく、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、シアノ基、スルホ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基の個数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは０～１０個、より好ましくは１～５個、更に好ましくは１～４個、特に好ましくは１又は２個である。これら置換基の中では、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基が好ましく、ヒドロキシ基がより好ましい。
　式（２）中のＲ2で示される２価の有機基の炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、更に好ましくは２～１０、更に好ましくは３～８、特に好ましくは４～６である。
　２価の有機基としては、炭素数１以上の２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、エステル結合及びアミド結合から選ばれる１種以上の連結基を有する基が挙げられる。この連結基の個数は、好ましくは０～１０個、より好ましくは０～５個、特に好ましくは０～２個である。なお、炭素－炭素原子間にエーテル結合を複数有する場合の一例として、ポリオキシアルキレン基が挙げられる。
　上記「炭素数１以上の２価の炭化水素基」の炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、更に好ましくは２～１０、更に好ましくは３～８、特に好ましくは４～６である。また、「炭素数２以上の２価の炭化水素基」は、炭素数が２以上であること以外は「炭素数１以上の２価の炭化水素基」と同様であり、その炭素数は、好ましくは２～３０、より好ましくは２～２０、更に好ましくは２～１０、更に好ましくは３～８、特に好ましくは４～６である。
　Ｒ2における「２価の炭化水素基」としては、アルカンジイル基の他、ビニレン基等のアルケンジイル基；シクロヘキサンジイル基等のシクロアルカンジイル基；２価の橋かけ環炭化水素基；フェニレン基等のアリーレン基が挙げられる。なお、アルカンジイル基、アルケンジイル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
　これらの中では、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、アルカンジイル基、アルケンジイル基が好ましく、アルカンジイル基がより好ましい。
　アルカンジイル基の炭素数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、更に好ましくは２～１０、更に好ましくは３～８、特に好ましくは４～６である。アルカンジイル基としては、具体的には、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，１－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、ブタン－１，２－ジイル基、ブタン－１，３－ジイル基、ブタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基等が挙げられる。
　また、Ｒ2における「２価の炭化水素基」は、置換基を有していてもよい。置換基としては、ヘテロ原子を含む置換基が好ましく、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、シアノ基、スルホ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基の個数は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは０～１０個、より好ましくは１～５個、更に好ましくは１～４個、特に好ましくは１又は２個である。これら置換基の中では、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基が好ましく、ヒドロキシ基がより好ましい。
　なお、式（１）、（２）又は（３）で表わされる化合物の誘導塩としては、例えば、塩酸塩が挙げられる。
　還元剤の具体例としては、例えば、システイン（Ｌ－システイン、Ｄ－システイン）、システイン塩酸塩、システアミン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、グルタチオン、１－チオグリセロール、２－メルカプトエタノール、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、２－メルカプトエタンスルホン酸、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩、トリス（２－シアノエチル）ホスフィン、トリス（２－カルボキシルエチル）ホスフィン、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリブチルホスフィン等が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　これらの中では、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、システイン、ジチオトレイトール、１－チオグリセロール、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィンが好ましく、ジチオトレイトール、１－チオグリセロールがより好ましく、ジチオトレイトールが特に好ましい。なお、１－チオグリセロールについては、安全性が特に高いという利点もある。
　還元剤の濃度は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、本発明で用いる処理剤中、好ましくは０．１ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍＭ以上、更に好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上、更に好ましくは５０ｍＭ以上であり、また、精製する際の圧力上昇を抑えるために、本発明で用いる処理剤中、好ましくは１００００ｍＭ以下、より好ましくは５０００ｍＭ以下、更に好ましくは２５００ｍＭ以下、更に好ましくは１５００ｍＭ以下である。特に、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を効率よく改善させるためには、０．１～２５００ｍＭが好ましく、０．５～１５００ｍＭがより好ましく、１～１５００ｍＭが更に好ましく、５～１５００ｍＭが更に好ましく、１０～１５００ｍＭが更に好ましく、５０～１５００ｍＭが更に好ましい。
　特に、ジチオトレイトールのようなスルファニル基を分子内に２個以上有する還元剤を用いる場合、スルファニル基を分子内に２個以上有する還元剤の濃度は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、本発明で用いる処理剤中、特に好ましくは１００ｍＭ以上であり、また、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、本発明で用いる処理剤中、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。すなわち、スルファニル基を分子内に２個以上有する還元剤を用いる場合は、１００～５００ｍＭが特に好ましい。
　一方、スルファニル基を分子内に１個有する還元剤を用いる場合（特にスルファニル基を分子内に１個有する非アミノ酸系還元剤を用いる場合）は、スルファニル基を分子内に１個有する還元剤の濃度は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、本発明で用いる処理剤中、特に好ましくは５００ｍＭ以上であり、また、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、本発明で用いる処理剤中、特に好ましくは１０００ｍＭ以下である。すなわち、スルファニル基を分子内に１個有する還元剤を用いる場合（特にスルファニル基を分子内に１個有する非アミノ酸系還元剤を用いる場合）は、５００～１０００ｍＭが特に好ましい。
（その他の成分）
　本発明の処理剤は、上記成分の他に、水；りん酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機塩；界面活性剤；アミノ酸；糖等を含んでいてもよい。なお、これらその他の成分は、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、上記無機塩の濃度としては、目的外ポリペプチドを除去する効果を高めるために、本発明で用いる処理剤中、１～１５００ｍＭが好ましく、５～１０００ｍＭがより好ましく、１０～７５０ｍＭが更に好ましく、２００～７５０ｍＭが特に好ましい。
　また、水の含有量は、本発明で用いる処理剤中、好ましくは７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、特に好ましくは９０質量％以上である。
（酸化還元電位等）
　本発明で用いる処理剤の酸化還元電位（ＯＲＰ）は、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは－５００ｍＶ以上、より好ましくは－４５０ｍＶ以上、更に好ましくは－４００ｍＶ以上、更に好ましくは－３５０ｍＶ以上、特に好ましくは－３００ｍＶ以上であり、また、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは５０ｍＶ以下、より好ましくは３０ｍＶ以下、更に好ましくは０ｍＶ以下、更に好ましくは－２５ｍＶ以下、更に好ましくは－１００ｍＶ以下、更に好ましくは－１５０ｍＶ以下、更に好ましくは－２００ｍＶ以下、特に好ましくは－２５０ｍＶ以下である。特に、酸化還元電位（ＯＲＰ）を－２５０ｍＶ以下とした場合に、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率が大幅に改善される。
　目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を効率よく改善させるためには、－５００～５０ｍＶが好ましく、－５００～０ｍＶがより好ましく、－５００～－２５ｍＶが更に好ましく、－５００～－１００ｍＶが更に好ましく、－５００～－１５０ｍＶが更に好ましく、－５００～－２００ｍＶが更に好ましく、－５００～－２５０ｍＶが特に好ましい。
　本明細書において、酸化還元電位（ＯＲＰ）は、ｐＨ７．５のときの酸化還元電位（ＯＲＰ）を意味し、ＯＲＰ電極を用いて測定すればよい。具体的には、実施例に記載の方法に準じて測定することができる。
　本発明で用いる処理剤の２３℃におけるｐＨは、目的ポリペプチドの回収率を高めるために、好ましくは５以上、より好ましくは６以上、特に好ましくは７以上であり、また、好ましくは９以下、より好ましくは８以下である。
　本発明で用いる処理剤は、液剤であるのが好ましい。また、本発明で用いる処理剤の２３℃における粘度としては、０．８～２．０ｍＰａ・ｓが好ましく、０．８～１．６ｍＰａ・ｓがより好ましい。
　本発明における処理剤は、アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法に用いられる。処理剤は、好ましくはポリペプチド処理剤であり、より好ましくは目的外ポリペプチド処理剤である。
（試料）
　目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料としては、細胞培養液、細胞破砕液のような試料液が挙げられる。より具体的には、目的外ポリペプチドを含むＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣タンパク質）の培養液、目的外ポリペプチドを含むハイブリドーマの培養液、遺伝子組換え大腸菌の細胞破砕液が挙げられる。なお、ＣＨＯ細胞の培養液には、目的外ポリペプチドの他に、ＣＨＯ細胞が産生したＦｃ領域を含むＩｇＧ型の抗体が通常含まれる。
（目的ポリペプチド）
　目的ポリペプチドとしては、抗体、抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質、その断片の他、それらの変異体や修飾体が挙げられる。この中でも、抗体、抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質、その断片が好ましく、抗体がより好ましく、Ｆｃ領域（ＣＨ２／ＣＨ３領域（ＣＨ２領域及びＣＨ３領域））を含むＩｇＧ型の抗体が更に好ましい。
　ここで、本明細書における「抗体」は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、その断片、それらの変異体を含み得る。また、本明細書における「抗体」は、動物細胞で産生された抗体や、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。
　また、本明細書における「抗体断片」は、抗原認識部位を含む抗体の断片であっても、抗原認識部位を含まない抗体の断片であってもよい。抗原認識部位を含まない抗体断片としては、例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域のみからなるタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、及びそれらの変異体や修飾体などが挙げられる。
（目的外ポリペプチド）
　目的外ポリペプチドとしては、ＨＣＰ（Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、培地由来成分等が挙げられる。ＨＣＰには、ＣＨＯ細胞等の抗体産生細胞の細胞片由来のタンパク質が含まれる。
　本発明の処理剤は、ＨＣＰの除去に特に適する。
［ポリペプチド精製方法］
　目的ポリペプチドの精製は、還元剤を含有する処理剤で目的外ポリペプチドを処理すること以外は公知のポリペプチド精製と同様にして行えばよい。
　目的外ポリペプチドの処理としては、目的外ポリペプチドを分離する処理が挙げられる。例えば、本発明の処理剤を試料に予め添加しておき、これをアフィニティーカラムに通液するといった手法で試料から目的外ポリペプチドを分離してよく、また、固相上に固定されたリガンドに試料中の目的ポリペプチドを結合させ、この固相が充填されたアフィニティーカラムに本発明の処理剤を通液するといった手法で、固相から目的外ポリペプチドを分離してもよい。なお、これら両方を行ってもよい。
　本発明の処理剤で目的外ポリペプチドを処理する工程としては、目的外ポリペプチドを除去する効果や目的ポリペプチドの回収率を高めるために、試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から目的外ポリペプチドを分離処理する工程が好ましい。このようにして固相から目的外ポリペプチドを分離する工程は、中間洗浄と称されることがあるが、本発明においては、このような中間洗浄を行う場合に、プロテインＡ等のイムノグロブリン結合性タンパク質をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製に特に適したものとなる。中間洗浄は、例えば、試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相がカラム容器に充填された状態を常法に従い作出し、これに本発明の処理剤を通液するなどして行えばよい。
　固相は、アフィニティークロマトグラフィーに使用されるものであれば特に限定されない。固相の材質は、例えば、合成高分子、天然高分子の他、シリカ、ガラスなどが挙げられるが、合成高分子、天然高分子が好ましい。合成高分子としては、ポリスチレン樹脂、メタクリレート樹脂が挙げられ、天然高分子としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成されるものが挙げられる。この中でも、アガロース、メタクリレート樹脂が好ましく、カラム容器への充填やスケールアップが容易であるため、メタクリレート樹脂がより好ましい。
　固相の形状としては、粒子、中空繊維、不織布、フィルター、モノリスが挙げられるが、粒子が好ましい。
　リガンドは、目的ポリペプチドとの親和性を考慮して選択すればよいが、イムノグロブリン結合性タンパク質が好ましく、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＶＨＨ抗体、Ｆｃ結合タンパク及びその機能性変異体から選ばれる１種又は２種以上がより好ましい。これらの中でも、抗体医薬の製造において用いることが可能であるため、プロテインＡが特に好ましい。本発明の処理剤は、プロテインＡから抗体を解離させにくいため、プロテインＡをリガンドとする抗体精製に特に適する。
　なお、本明細書において「イムノグロブリン結合性タンパク質」とは、抗体又はその断片に対する結合活性を有するタンパク質をいう。
　また、イムノグロブリン結合性タンパク質には、プロテインＡの機能性変異体、プロテインＧの機能性変異体、プロテインＬの機能性変異体、ＶＨＨ抗体の機能性変異体、これら以外のＦｃ結合タンパクの機能性変異体が包含されるが、これら「機能性変異体」とは、プロテインＡの機能性変異体、プロテインＧの機能性変異体、プロテインＬの機能性変異体、ＶＨＨ抗体の機能性変異体、これら以外のＦｃ結合タンパクの機能性変異体のうち、イムノグロブリン結合性を有する変異体を意味する。
　ここで、本発明における目的ポリペプチドの精製方法の手順等について、一例を挙げてより具体的に説明する。
　本発明のポリペプチド精製方法としては、固相上に固定されたリガンドと、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料とを接触させ、目的ポリペプチドとリガンドとを結合させる工程（結合工程）を含む方法が好ましい。当該結合工程は、試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から目的外ポリペプチドを分離処理する前、或いは本発明の処理剤を試料に添加した後に通常行われる。なお、結合工程に先立ち、カラムを平衡化してもよい。
　リガンドと試料中の目的ポリペプチドとを結合させる方法は特に限定されないが、例えば、リガンドが固定された粒子状の固相をカラム容器に充填し、試料をカラムに添加し、目的ポリペプチドとリガンドとを接触させることで結合させる方法が挙げられる。
　上記結合工程の後に行われる、試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から目的外ポリペプチドを分離処理する工程については、上記したとおりである。
　本発明の処理剤の使用量は、カラムを用いる場合は、通常１～１０カラム容量であるが、２～５カラム容量が好ましい。上記処理する温度（具体的には分離処理する温度）は、通常０～５０℃であるが、５～３５℃が好ましく、常温がより好ましい。なお、本工程の前後に、りん酸ナトリウムやトリス塩酸緩衝液などの中性緩衝液に必要に応じて塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの無機塩を添加した洗浄液などを用いて、更に固相を洗浄してもよい。
　そして、溶出バッファーを用いることによって、目的外ポリペプチドが除去された固相から目的ポリペプチドを回収することができる。このような回収工程としては、例えば、溶出バッファーで目的ポリペプチドを溶出させ、クロマトグラフィーシステムのフラクションコレクターを用いて目的ポリペプチドを回収する方法が挙げられる。溶出バッファーとしては、リガンドがプロテインＡ等の場合は酸性緩衝液などが挙げられる。
　なお、精製した目的ポリペプチドを含む溶液中に還元剤が含まれる場合、回収工程の後、還元剤を除去してもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１～６、比較例１～４）
　カラム容器（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２００　ｃｏｌｕｍｎ）に、Ａｍｐｓｈｅｒｅ　Ａ３（ＪＳＲライフサイエンス社製）を充填高さ約２０ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に接続し、２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化した。
　次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのバイオシミラーを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約４０ｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　次いで、洗浄液１として、２０ｍＭりん酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム及び表１に記載の添加剤を含む緩衝液（ｐＨ７．５）を３カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。なお、洗浄液１の酸化還元電位（ＯＲＰ）は、堀場製作所社製ｐＨメータＤ－５１、ＯＲＰ電極９３００－１０Ｄ、及び比較電極内部液として塩化カリウム溶液（３．３３ｍｏｌ／Ｌ）を使用して測定した。結果を表１に示した。
　次いで、洗浄液２として、２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　その後、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．３）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、波長２８０ｎｍにおける光路長１ｍｍ当たりの吸光度が５０ｍＡｕ以上のフラクションを回収した。
　そして、Ｃｙｇｎｕｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製　ＣＨＯ　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）濃度を測定した。結果を表１に示した。
　また、分光光度計（バイオ・ラッド社製ＳｍａｒｔＳｐｅｃ　Ｐｌｕｓ）を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度を測定し、回収液量を乗ずることで抗体回収量を算出し、さらに添加抗体量で除することにより、抗体回収率を求めた。結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１中の各記号の定義は、以下に示すとおりである。
　ＤＴＴ：ジチオトレイトール
　ＴＧ：１－チオグリセロール
　Ｃｙｓ：Ｌ－システイン
　ＴＨＰＰ：トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン
　ＧＬ：グリセリン
　Ａｒｇ：Ｌ－アルギニン
　ＢＡＫ：塩化ベンザルコニウム
　表１に示すとおり、還元剤であるジチオトレイトール、１－チオグリセロール、Ｌ－システイン又はトリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィンを含有する液剤で処理した場合（実施例１～６）は、固相からＨＣＰを効率的に除去することができた。

Claims (15)

  1. 　アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法であって、還元剤を含有する処理剤で目的外ポリペプチドを処理する工程を含む、方法。
  2. 　前記処理剤の酸化還元電位（ＯＲＰ）が、－５００～５０ｍＶである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記処理剤の酸化還元電位（ＯＲＰ）が、－５００～－２５０ｍＶである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記還元剤が、ジスルフィド結合を切断し得る還元剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記還元剤が、スルファニル基及びリン原子から選ばれる１種又は２種を分子内に有する還元剤である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記還元剤が、非アミノ酸系還元剤である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記目的外ポリペプチドが、ＨＣＰである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記目的ポリペプチドが、抗体、抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質又はその断片である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記処理工程が、前記試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から前記目的外ポリペプチドを分離処理する工程である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記分離処理工程の前に、固相上に固定されたリガンドと、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料とを接触させ、前記目的ポリペプチドと前記リガンドとを結合させる工程を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 　さらに、溶出バッファーを用いて前記固相から目的ポリペプチドを回収する工程を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記リガンドが、イムノグロブリン結合性タンパク質である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記イムノグロブリン結合性タンパク質が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＶＨＨ抗体、Ｆｃ結合タンパク及びその機能性変異体から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　アフィニティークロマトグラフィーによって、目的ポリペプチド及び目的外ポリペプチドを含む試料から目的ポリペプチドを精製する方法に用いられる処理剤であって、還元剤を含有する処理剤。
  15. 　前記方法が、試料中の目的ポリペプチドが結合したリガンドが固定された固相から前記目的外ポリペプチドを分離処理し、目的ポリペプチドを精製する方法である、請求項１４に記載の処理剤。
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