BRPI0622251A2

BRPI0622251A2 - método para obtenção de uma composição compreendendo uma população isolada de moléculas de ctla4-ig de um meio de cultura lìquido e para isolamento de uma composição compreendendo moléculas de ctla4-ig e composição

Info

Publication number: BRPI0622251A2
Application number: BRPI0622251-0A
Authority: BR
Inventors: J. Leister Kirk; J. Schaefer Eugene; Bates Ronald; A. Bramhall Elizabeth; M. Didio David; Donaldson Robert; R. Flesher Alan; G. Haggerty Helen; H. Kirkley David; M. Tabor John; K. Tay Lee; Thammana Pallaiah; Velayudhan Ajoy; E. Smolin David; J. Russell Reb; Vanden Boom Thomas; Schrimsher Jeffrey; Whitehead Joyce; Brownell Dean
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2011-07-19
Also published as: NO20082716L; TWI423986B; PL2253644T3; PL1969007T3; CA2836123C; ZA200805301B; HRP20130975T1; ES2433092T3; EA200801571A1; CN106589132B; JP5097194B2; IL229904A0; JP2010116402A; IL192098A; PL1969007T4; BRPI0620178A2; HK1121173A1; CA2634760A1; EP1969007B1; EP2253644B1

Abstract

MéTODO PARA OBTENçãO DE UMA COMPOSIçãO COMPREENDENDO UMA POPULAçãO ISOLADA DE MOLéCULAS DE CTLA4-IG DE UM MEIO DE CULTURA LIQUIDO E PARA ISOLAMENTO DE UMA COMPOSIçãO COMPREENDENDO MOLéCULAS DE CTLA4-IG E COMPOSIçãO. A presente invenção refere-se a células de mamífero capazes de produzir CTLA4-Ig recombinante e variantes da mesma. A invenção também proporciona composições compreendendo CTLA4-Ig e formulações da mesma. A invenção ainda proporciona métodos para produção em massa de CTLA4-Ig a partir de células de mamífero capazes de produzir essa proteina recombinante e purificação da CTLA4-Ig.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PA-RA OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA POPULA-ÇÃO ISOLADA DE MOLÉCULAS DE CTLA4-IG DE UM MEIO DE CULTURA LÍ-QUIDO E PARA ISOLAMENTO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDOMOLÉCULAS DE CTLA4-IG E COMPOSIÇÃO".

Dividido do PI0620178-4, depositado em 19.12.2006.O presente pedido de patente reivindica prioridade do N0 de Sé-rie U.S. 60/752.267, depositado em 20 de Dezembro de 2005, N0 de SérieU.S. 60/849.543, depositado em 5 de Outubro de 2006 e N0 de Série U.S.60/752.150, depositado em 20 de Dezembro de 2005, todos os quais sãoaqui incorporados por referência em suas totalidades. O presente pedidotambém incorpora, por referência e em sua totalidade, o pedido de patenteintitulado "Stable Protein Formulations" com o Número de Documento doProcurador 10739 PCT depositado em 19 de Dezembro de 2006.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações menciona-dos aqui, são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

A presente descrição contém material que está sujeito à prote-ção de copyright. O proprietário de copyright não tem objeção à reproduçãopor fac-símile por qualquer um do documento de patente ou descrição depatente uma vez que ele aparece no arquivo ou registro de patentes do U.S.Patent and Trademark Office mas, de outro modo, se reserva a qualquer etodos os direitos de copyright.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4), um membro da su-perfamília de imunoglobulina, é uma molécula expressa por células T ativa-das. O CTLA4 é similar à molécula coestimulatória de células T CD28 e am-bas as moléculas se ligam B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) sobre células queapresentam antígeno (APCs). Contudo, o CTLA4 transmite um sinal inibitórioà células T1 enquanto que CD28 transmite um sinal estimulatório.

Moléculas de CTLA4-lg são proteínas de fusão do domínio de li-gação a ligante do antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e uma regiãoconstante de cadeia pesada de imunoglobulina (Ig). Essa molécula solúvelexerce seus efeitos fisiológicos através de ligação a antígenos B7 (CD80 eCD86) sobre a superfície de várias células apresentando antígeno (APC)1assim, bloqueando a interação funcional de B7-1 e B7-2 com CD28 sobre asuperfície de células T. Esse bloqueio resulta na supressão de ativação e,consequentemente, na supressão da resposta imune. Moléculas de CTLA4-Ig podem, portanto, proporcionar um método para inibição de rejeições atransplante de órgão sólido e/ou tecidual, bem como um uso terapêutico pa-ra doenças ou distúrbios que se relacionam à respostas imunes desregula-das em geral, incluindo autoimunidade. Por exemplo, moléculas de CTLA4-Ig podem suprimir a produção de anticorpos anti-dsDNA e diminuir a nefriteem camundongos propensos a lúpus; pode reduzir a proteinúria e prolongara sobrevivência em camundongos com nefrite avançada e podem melhoraros resultados clínicos para psoríase e artrite reumatoide.

Para melhorar a utilidade terapêutica de moléculas de CTLA4-lg,é importante determinar alterações moleculares que podem ser feitas paraintensificar a eficácia das moléculas como um inibidor de estimulação decélulas T, por exemplo, através de aumento da avidez e potência da molécu-la por antígenos B7. Um aumento na avidez e potência de moléculas de C-TLA4-lg pode permitir a administração de uma quantidade diminuída de mo-léculas de CTLA4-lg a um paciente para obter um efeito terapêutico deseja-do (isto é, administração de uma menor dose). Um aumento na avidez e po-tência de moléculas de CTLA4-lg também pode diminuir o número de dosesou a freqüência de doses que são administradas a um paciente para obterum efeito terapêutico desejado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à composições e métodos para aprodução de composições de CTLA4-lg. A invenção é dirigida à moléculasde CTLA4-lg, composições aperfeiçoadas compreendendo moléculas deCTLA4-lg e métodos aperfeiçoados para a produção (incluindo produção emmassa) de moléculas de CTLA4-lg e outras proteínas recombinantes.

A invenção inclui quaisquer permutações e/ou combinações dequalquer um dos elementos e características descritos aqui, quer descritosunicamente ou em determinadas combinações ou permutações.

Células: A invenção proporciona um população de células deOvário de Hamster Chinês capaz de produzir CTLA4-lg. A invenção propor-ciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês capaz deproduzir CTLA4-lg, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de umcassete de expressão de CTLA4-lg. A invenção também proporciona umapopulação de células de Ovário de Hamster Chinês capaz de produzir C-TLA4-lg, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de um cassete deexpressão de CTLA4-lg, em que as 30 ou mais cópias são integradas emum único sítio no genoma de cada célula. A invenção proporciona uma po-pulação de células de Ovário de Hamster Chinês clonais capaz de produzirCTLA4-lg, em que um cassete de expressão de CTLA4-lg é estável durantecerca de 105 passagens. Em uma modalidade, a CTLA4-lg é codificada porum cassete de expressão compreendendo uma seqüência de ácido nucleicodescrita por Koduri R., e outros (Gene. 2001, 280: 87-95) e Patentes U.S.N0S 6.800.457 e 6.521.419, os quais são aqui incorporados por referênciaem suas totalidades. Em outra modalidade, a CTLA4-lg é codificada por umcassete de expressão integrado em um genoma celular da população decélulas em um Iocus específico descrito por Koduri R., e outros (Gene, 2001,280: 87-95) nas Patentes U.S. N0S 6.800.457 e 6.521.419, os quais são aquiincorporados por referência em suas totalidades. Em uma modalidade, apopulação compreende uma subpopulação de células compreendendo 33 oumais cópias do cassete de expressão de CTLA4-lg, em que as peptídeo deobjetivação ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma decada célula da subpopulação.

A invenção proporciona uma população de células de Ovário deHamster Chinês clonal capaz de produzir CTLA4-lg em que pelo menos 75%da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressãode CTLA4-lg, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítiono genoma de cada célula dos 75% da população. A invenção proporcionauma população de células de Ovário de Hamster Chinês clonal capaz deproduzir CTLA4-lg em que pelo menos 85% da população de células tem 30ou mais cópias de um cassete de expressão de CTLA4-lg, em que as 30 oumais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos85% da população. A invenção proporciona uma população de células deOvário de Hamster Chinês clonal capaz de produzir CTLA4-lg em que pelo menos 95% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassetede expressão de CTLA4-lg, em que as 30 ou mais cópias são integradas emum único sítio no genoma de cada célula dos 95% da população. Em umamodalidade, a população de célula é capaz de produzir mais de 0,5 ou maisgramas de proteína CTLA4-lg por litro de cultura líquida e em que a CTLA4- lg exibe características de carboidrato aceitáveis, onde a proporção molar deácido siálico para CTLA4-lg é de cerca de 6 a cerca de 14 em uma escala decultura de 1.000 L ou mais. Em outra modalidade, a população de células foiadaptada a um meio isento de soro quimicamente definido. Em outra moda-lidade, CTLA4-lg produzida a partir da cultura da população de células temuma coeficiente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU ml_ cm-1 mg-1. Em outramodalidade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, é ca-paz de produzir polipeptídeos de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 90% dospolipeptídeos de CTLA4-lg compreendem uma seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10%dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cercade 4% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de amino-ácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a Iisina no resíduo número 383, (d)cerca de 96% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número382; e, opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos deCTLA4-lg compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 come-çando com a metionina no resíduo número 25.

A invenção proporciona uma célula de prole da célula clonal, emque a célula de prole produz CTLA4-lg. Em uma modalidade, a célula deprole é obtida a partir de cultura da célula precursora clonal durante pelomenos 5 gerações. Em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partirde cultura de uma célula durante pelo menos 10 gerações, durante pelo me-nos 20 gerações, durante pelo menos 40 gerações, durante pelo menos 50gerações, durante pelo menos 75 gerações ou durante pelo menos 100 ge-rações. A invenção proporciona uma linhagem de célula produzida a partirda célula clonal. Em uma modalidade, a linhagem de célula é clonal. A in-venção proporciona uma linhagem de célula capaz de produzir: (a) uma pro-teína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 10 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de a-minoácido 382; figuras 1A e 1B); (b) uma proteína de fusão de CTLA4-lgtendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (metionina na posi-ção de aminoácido 27 e Iisina na posição de aminoácido 383; figuras 1A e1B); (c) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de ami-noácido de SEQ ID NO: 9 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina naposição de aminoácido 382; figuras 1A e 1B); (d) uma proteína de fusão deCTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (alanina naposição de aminoácido 26 e Iisina na posição de aminoácido 383; figuras 1Ae 1B); (e) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de ami-noácido de SEQ ID NO: 8 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicinana posição de aminoácido 382; figuras 1A e 1B); ou (f) uma proteína de fu-são de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5(metionina na posição de aminoácido 25 e Iisina na posição de aminoácido383; figuras 1A e 1B). Em outra modalidade, a linhagem de célula é capazde produzir proteínas de fusão de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 90% dospolipeptídeos de CTLA4-lg compreendem uma seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10%dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cercade 4% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de amino-ácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a Iisina no resíduo número 383, (d)cerca de 96% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número382; e opcionalmente (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos deCTLA4-lg compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 come-çando com a metionina no resíduo número 25.

Em uma modalidade, as proteínas de fusão de CTLA4-lg, asquais são produzidas a partir de cultura a linhagem de célula, têm um coefi-ciente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1. A invenção proporcionauma população de célula derivada da linhagem de célula clonal. Em umamodalidade, a população de célula consiste em pelo menos uma alteraçãogenética adicional quando comparado com a linhagem de célula clonal origi-nal e em que a população de célula derivada é capaz de produzir CTLA4-lg.

Em outra modalidade, a população de célula consiste em pelo menos 2, pelomenos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelomenos 8, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 alterações gené-ticas adicionais quando comparado com a célula precursora e em que a po-pulação de célula derivada é capaz de produzir CTLA4-Ig. Em uma modali-dade, a alteração genética compreende pelo menos uma mutação não con-servativa no genoma celular ou no cassete de expressão recombinante quecodifica CTLA4-lg. Em outra modalidade, a alteração genética compreendepelo menos um ácido nucleico recombinante adicional dentro da célula. Emuma outra modalidade, a alteração compreende uma mutação do genomacelular. Em outra modalidade, a alteração compreende a adição de um ácidonucleico ao genoma celular ou como um ácido transnucleico, o qual codificaum polipeptídeo antiapoptótico. Em outra modalidade, o polipeptídeo antia-poptótico se refere à glicosilação. Em outra modalidade, a alteração genéticacompreende pelo menos uma mutação do genoma celular ou do cassete deexpressão recombinante que codifica CTLA4-lg.

Composições: A invenção proporciona uma população de mo-léculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siá-lico para dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 18. Ainvenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo umaproporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula deCTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 18. A invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de gruposácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 11 a cercade 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lgtendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero oumolécula de CTLA4-lg de cerca de 12 a cerca de 18. A invenção proporcionauma população de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar mé-dia de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-lg de cercade 13 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculasde CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico paradímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 14 a cerca de 18. A invençãoproporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo uma propor-ção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de C-TLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 17. A invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de gruposácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 16. A inven- ção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg, em que mais de95% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em uma modalidade, mais de98% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em outra modalidade, maisde 99% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em outra modalidade,mais de 99,5% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em outra modali-dade, de cerca de 95% a cerca de 99,5% das moléculas são dímeros deCTLA4-lg e cerca de 0,5% a cerca de 5% das moléculas são tetrâmeros deCTLA4-lg ou espécies de elevado peso molecular. Em outra modalidade,cerca de 98,6% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg e cerca de 1,2%das moléculas são tetrâmeros de CTLA4-lg ou espécies de elevado pesomolecular e cerca de menos do que 0,7 % das moléculas são monômeros deCTLA4-lg. A invenção proporciona uma população consistindo em dímerosde CTLA4-lg. A invenção proporciona uma população de moléculas de C-TLA4-lg, em que a população é substancialmente isenta de monômero deCTLA4-lg. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg, em que a população é substancialmente isenta de tetrâmero de CTLA4-lg. A invenção proporciona uma população de monômeros de moléculas deCTLA4-lg substancialmente isenta de dímero e tetrâmero de CTLA4-lg. Emuma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-lg tem pelomenos 3 grupos ácido siálico. Em outra modalidade, cada monômero de ca-da dímero de CTLA4-lg tem de pelo menos 3 grupos ácido siálico a pelomenos 8 grupos ácido siálico. A invenção proporciona uma população purifi-cada de tetrâmeros de moléculas de CTI_A4-lg, a população sendo substan-cialmente isenta de dímero de CTLA4-lg e opcionalmente em que a popula-ção compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. Ainvenção proporciona uma população purificada de tetrâmeros de moléculasde CTLA4-lg, a população sendo substancialmente isenta de monômero deCTLA4-lg e opcionalmente em que a população compreende uma quantida-de que é mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada moléculatetramérica compreende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-lg, em quecada polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOS: 5-10 e em que cada membro do par de poli-peptídeos é covalentemente ligado ao outro membro e em que os dois paresde polipeptídeos são não-covalentemente associados um ao outro. Em outramodalidade, cada molécula tetramérica é capaz de ligação a um CD80 ouCD86. Em uma outra modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo me-nos uma avidez 2 vezes maior pelo CD80 ou CD86 quando comparado comum dímero de molécula de CTLA4-lg. Em outra modalidade, cada moléculatetramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ouativação de células T quando comparado com um dímero de molécula deCTLA4-lg. A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que a composição compreende isoformas dominan-tes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétrica de CTLA4-lg o qualtem um ponto isoelétrico, pl, menos de ou igual a 5,1 conforme determinadoatravés de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, a invenção propor-ciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que acomposição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gelde focalização isoelétrica de CTLA4-lg o qual tem um ponto isoelétrico, pl,menos de ou igual a 5,8 conforme determinado através de focalização isoe-létrica. Em uma modalidade, o pl aumenta após tratamento com neuramini-dase. Em uma modalidade, a composição compreende isoformas dominan-tes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétrica de CTLA4-lg o qualtem um ponto isoelétrico, pl, menos de ou igual a 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2,5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 ou 4,5 conforme determinado através de focaliza-ção isoelétrica. Em outra modalidade, pelo menos 40% das moléculas deCTLA4-lg exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em outra mo-dalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-lg exibem um pontoisoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 conforme determinadoatravés de focalização isoelétrica. Em outra modalidade, pelo menos 90%das moléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétrico de menos do queou igual a cerca de 2,5 conforme determinado através de focalização isoelé-trica. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lgtendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção propor-ciona uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de4,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 4,3 ± 0,2 a cerca de 5,0 ±0,2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg ten-do um pl de cerca de 3,3 ± 0,2 a cerca de 4,7 ± 0,2. A invenção proporcionaum método para preparo de uma composição, a composição compreenden-do uma molécula de CTLA4-lg com um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de5,0 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição de uma mistura de molécu-las de CTLA4-lg à eletroforese em gel de focalização isoelétrica, em queuma única banda sobre o gel representa uma população de moléculas deCTLA4-lg com um pl em particular e (b) isolamento da população de molécu-las de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2 demodo a preparar a composição.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadaspor uma proporção molar média de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lgou para molécula de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molarmédia de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de C-TLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma com-posição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar média de galactosepor mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg de cerca de8 a cerca de 17. A invenção proporciona uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracteriza-das por uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4- lg ou para molécula de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de 8,3. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molarmédia de manose por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de C-TLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22. A invenção proporciona uma compo- sição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de C-TLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálicopor mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg de cerca de6 a cerca de 12.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé- cuias de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média deGIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cercade 15 a cerca de 35; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico pormol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 6 a cercade 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculasde CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAcpor mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTI_A4-lg de cerca de 15 acerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc por mol de dímerode CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; e (c)uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção propor-ciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracteriza-da por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc por mol de dímero deCTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) umaproporção molar média de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou molé-cula de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molarmédia de galactose por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; e (d) uma proporção molar média de ácidosiálico por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar médiade GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg decerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc pormol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cer-ca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímerode CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) umaproporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg ou molé-cuia de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; e (e) uma proporção molarmédia de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de C-TLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composi-ção compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma pro-porção molar média de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou moléculade CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar médiade GaINAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 1,7 acerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de díme-ro ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporçãomolar média de fucose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg de cercade 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol dedímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; e (f) umaproporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg oumolécula de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporcionauma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que a com-posição exibe um pico por cromatograma de NGNA de cerca de 9,589+/-0,3e um pico por cromatograma de NANA de cerca de 10,543+/-0,3. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA-Ig exibem um perfil de carboidrato conformemostrado na figura 68. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg exibemum perfil de carboidrato dos Domínios I - V (por exemplo, l-IV), em que oDomínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio II compreende picos os quais representam oligossaca-rídeos monossialilados, o Domínio III compreende picos os quais represen-tam oligossacarídeos dissialilados e o Domínio IV compreende picos osquais representam oligossacarídeos trissialilados. O Domínio V compreendepicos que representam oligossacarídeo tetrassialilados. Em uma modalida-de, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-Iigados entreum primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio Il é de cercade 22 a cerca de 28 minutos. A invenção proporciona uma composição com-preendendo dímeros de moléculas de CTLA4-lg, em que pelo menos 0,5 %dos dímeros de moléculas de CTI_A4-lg são cisteinilados. Em uma modali-dade, pelo menos 1,0% dos dímeros de moléculas de CTLA4-lg são cisteini-lados. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTI_A4-lg,em que a população exibe um perfil de espectrometria de massa conformemostrado nas figuras 8 e 10. A invenção proporciona uma população de mo-léculas de CTI_A4-lg, em que a população exibe um perfil de eletroforesecapilar conforme mostrado nas figuras 20 e 21. A invenção proporciona umacomposição de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar médiade grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de18. A invenção proporciona uma composição de CTLA4-lg obtida através dequalquer um dos métodos descritos aqui. A invenção proporciona uma popu-lação de moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas são glicosiladas emum resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 2, umresíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 2, umresíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO: 2, umresíduo de aminoácido serina na posição 155 de SEQ ID NO: 2 ou um resí-duo de aminoácido serina na posição 165 de SEQ ID NO: 2.

A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporçãomolar média de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou molécula de C-TLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média deGaINAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cercade 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero oumolécula de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molarmédia de fucose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol dedímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma pro-porção molar média de ácido siálico por mol de dímero ou molécula de C-TLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pl, conforme determinado a par-tir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa decerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou iguala 5 ppm; (i) menos de 3,0 % de tetrâmero (por exemplo, 2,5% de espéciesde elevado peso molecular ou tetrâmero, 2,0% de espécies de elevado pesomolecular ou tetrâmero; (j) menos de 0,5% de monômero; (k) polipeptídeosde CTLA4-lg da população tendo uma seqüência de aminoácido pelo menos95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 2-8; (I) em que moléculas deCTLA4-lg dentro da população são capazes de ligação a CD80 e CD86.

Composições: A invenção proporciona uma composição com-preendendo uma quantidade eficaz das moléculas de CTLA4-lg da invençãoe um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona umacomposição compreendendo excipientes conforme descrito no Pedido U.S.No. 60/752,150, depositado em 20 de Dezembro de 2005. Em uma modali-dade, a composição inclui CTLA4-lg. Em uma modalidade, a composiçãoainda compreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamenteaceitável. Em outra modalidade, a composição ainda compreende maltose,mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido desódio e água estéril. Em outra modalidade, a composição compreende saca-rose, poloxâmero, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, fosfato desódio anídrico dibásico, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água estéril.

Formulações e Kits: A invenção proporciona uma mistura Iiofili-zada de CTLA4-lg compreendendo pelo menos 95% de dímero de CTLA4-lge não mais do que 5% de tetrâmero de CTLA4-lg. Em uma modalidade, amistura compreende pelo menos 98% de dímero de CTLA4-lg e não mais doque 2% de espécies de elevado peso molecular ou tetrâmero de CTLA4-lg.

Em outra modalidade, a mistura compreende pelo menos 99% de dímero deCTLA4-lg e não mais do que 1% de espécies de elevado peso molecular outetrâmero de CTLA4-lg. Em outra modalidade, a mistura compreende pelomenos 8,0 mois de ácido siálico por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg. Em outra modalidade, a mistura compreende cerca de 15,7 a cerca de 31mois de GIcNAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg. Em outra mo-dalidade, a mistura compreende cerca de 1,6 a cerca de 3,2 mois de GaINAcpor mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg. Em outra modalidade, a mistu-ra compreende cerca de 9,3 a cerca de 15,5 mois de galactose por mol dedímero ou molécula de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compre-ende cerca de 3,6 a cerca de 7,9 mois de fucose por mol de dímero ou mo-lécula de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de9,7 mois de manose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-lg. A inven-ção também proporciona um kit farmacêutico compreendendo: (a) um recipi-ente contendo uma mistura Iiofilizada de CTLA4-lg da invenção; e (b) instru-ções para reconstituição da mistura Iiofilizada de CTLA4-lg em solução parainjeção.

Métodos ilustrativos de Tratamento: A invenção proporcionaum método para inibição de proliferação de células T (ou ativação), o méto-do compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz deuma composição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um mé-todo para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método com-preendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A invençãoproporciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno emum indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo queprecisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de C-TLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um método para tratamentode inflamação em um indivíduo, o método compreendendo administração, aum indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de umacomposição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um métodopara tratamento de artrite reumatoide compreendendo administração, a umindivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma compo-sição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um método paratratamento de psoríase em um indivíduo, o método compreendendo adminis-tração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz deuma composição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um mé- todo para tratamento de lúpus em um indivíduo, o método compreendendoadministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporcio-na um método para tratamento de ou prevenção de uma alergia em um indi-víduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg dainvenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou pre-venção de doença enxerto vs hospedeiro em um indivíduo, o método com-preendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejeição de umórgão transplantado em um indivíduo, o método compreendendo administra-ção, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz deuma composição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um mé-todo para tratamento de esclerose múltipla em um indivíduo, o método com-preendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A invençãoproporciona um método para tratamento de Doença de Crohn em um indiví-duo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de diabetesdo tipo I em um indivíduo, o método compreendendo administração, a umindivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma compo-sição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um método paratratamento de doença inflamatória do intestino em um indivíduo, o métodocompreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, deuma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A in-venção proporciona um método para tratamento de ooforite em um indiví-duo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg dainvenção. A invenção proporciona um método para tratamento de glomeru-Ionefrite em um indivíduo, o método compreendendo administração, a umindivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma compo-sição de CTLA4-lg da invenção. A invenção proporciona um método paratratamento de encefaIomielite alérgica em um indivíduo, o método compre-endendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg da invenção. A invençãoproporciona um método para tratamento de miastenia gravis em um indiví-duo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lg dainvenção.

A invenção proporciona o uso de uma população de moléculasde CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico paradímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 18 na fabricaçãode um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de umdistúrbio imune. A invenção proporciona o uso de uma população de molé-culas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siáli-co para dímero ou molécula de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 18 nafabricação de um agente antiartrite reumatoide em uma embalagem juntocom instruções para seu uso no tratamento de artrite reumatoide.

Terapias combinadas ilustrativas: A invenção proporciona ummétodo para inibição de proliferação de células T (ou ativação), o métodocompreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz deuma composição de CTLA4-lg da invenção em combinação com metotrexa-to. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imuneem um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduoque precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição deCTLA4-lg da invenção em combinação com metotrexato. A invenção propor-ciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno em umindivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que pre-cisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-lgda invenção em combinação com metotrexato.

Métodos para produção de CTLA4-lg: A invenção proporcionaum método para produção de uma proteína recombinante, o método com-preendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma prote-ína recombinante, em que a expansão é de uma cultura originária para umacultura líquida, em que a concentração de proteína recombinante é de pelomenos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recom-binante da cultura líquida. A cultura líquida pode ser de pelo menos 1.000 L,pelo menos 5.000 L, pelo menos 10.000 L, pelo menos 15.000 L, pelo me-nos 20.000 L, pelo menos 25.000 L, pelo menos 30.000 L, pelo menos40.000 L. Em uma modalidade, a expansão da etapa (a) compreende: (i)cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido compelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular depelo menos cerca de 1,0 χ 105 células viáveis por ml_, em que cada estágiode semente começa em cerca de 2 χ 105 por mL e vai até 1-2 mil células pormL; (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente paraproduzir, a partir da cultura, pelo menos cerca de 0,5 g / L. Em uma modali-dade, a proteína é uma glicoproteína. Em uma modalidade, a proteína é umaproteína de CTLA4-lg. Em uma modalidade, as células de mamífero são aprole de uma linhagem de célula clonal CHO capaz de produzir proteínas defusão de CTLA4-lg, em que as células de CHO têm, estavelmente integra-das em seu genoma, pelo menos 30 cópias de um cassete de expressão deCTLA4-lg. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual aviabilidade das células não cai abaixo de 30%. Em outra modalidade, o tem-po suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixode 40%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual aviabilidade das células não cai abaixo de 50%. Em outra modalidade, o tem-po suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixode 60%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual aviabilidade das células não cai abaixo de 70% ou 80% ou 90% ou 95%.

Em uma outra modalidade, as pelo menos quatro passagenscompreendem: (i) crescimento das células em um volume de cultura de pelomenos 50 mL até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5mil células por mL ser atingida, (ii) crescimento das células em um volumede cultura de pelo menos 10 L até uma densidade celular de cerca de 1 mi-lhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida; (iii) crescimentodas células em um volume de cultura de pelo menos 100 L até uma densi-dade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mLser atingida; e (iv) crescimento das células em um volume de cultura de 200L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão decélulas por mL ser atingida. Em uma modalidade, galactose é adicionada aomeio isento de soro quimicamente definido. Em uma modalidade, a manu-tenção de compreende (i) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°Cpara 34±2°C; e (ii) diminuição da temperatura da cultura de 34±2°C para32±2°C. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de32±2°C durante pelo menos 5 dias. Em outra modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 6 dias. Em outramodalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pe-lo menos 7 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro dafaixa de 32±2°C durante pelo menos 8 dias. Em outra modalidade, a tempe-ratura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 9 dias. Emoutra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C duran-te pelo menos 10 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida den-tro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 11 dias. Em outra modalidade, atemperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 12dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de32±2°C durante pelo menos 13 dias. Em outra modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 14 dias. Em outramodalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pe-lo menos 15 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro dafaixa de 32±2°C durante pelo menos 16 dias. Em outra modalidade, a tem-peratura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 17 dias.

Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°Cdurante pelo menos 18 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantidadentro da faixa de 32±2°C durante até 18 dias. Em outra modalidade, a tem-peratura é mantida dentro da faixa de 32±2°C até a densidade celular dacultura ser de cerca de 30 χ 105 a cerca de 79 χ 105 células por mL de cultu-ra líquida.

A invenção proporciona um método para produção de uma pro-teína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células demamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originá-ria para uma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína re-combinante seja de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isola-mento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento o-corre apenas quando a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de6,0 mois de NANA por mol de proteína ou dímero de CTLA4-lg. A invençãoproporciona um método para produção de uma proteína recombinante, ométodo compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretamuma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líqui-da, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante dacultura líquida, em que o isolamento ocorre apenas quando a cultura líquidatem uma densidade celular de cerca de 33 χ 105 a cerca de 79 χ 105 célulaspor mL. A invenção proporciona um método para produção de uma proteínarecombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamí-fero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária parauma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína recombinanteseja de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da pro-teína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento ocorre quando aviabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20%ou cerca de 30% ou cerca de 38%. A invenção proporciona um método paraprodução de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) ex-pansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante deuma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L1 demodo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 gra-ma / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultu-ra líquida, em que o isolamento ocorre apenas quando a endotoxina é me-nos de ou igual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida. A invençãoproporciona um método para produção de uma proteína recombinante, ométodo compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretamuma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líqui-da de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína re-combinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamentoda proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L,em que o isolamento ocorre apenas quando a bioburden é menos de 1 uni-dade de formação de colônia por mL de cultura líquida. A cultura líquida dainvenção pode ser de um volume de pelo menos 5.000 L, pelo menos 10.000L, pelo menos 15.000 L, pelo menos 20.000 L, pelo menos 25.000 L, pelomenos 30.000 L, pelo menos 40.000 L, pelo menos 50.000 L, pelo menos60.000 L.

A invenção proporciona um método para produção de uma pro-teína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células demamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originá-ria para uma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína re-combinante seja de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isola-mento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento o-corre apenas se pelo menos duas das seguintes condições são reunidas: (i)a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mois de NANA pormol de proteína, (ii) a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de33 χ 105 a cerca de 79 χ 105 células por mL, (iii) a viabilidade celular na cul-tura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de 38% ou (iv) aquantidade de CTLA4-lg na cultura é mais de 0,5 g / L. Em uma modalidade,o isolamento compreende: (i) obtenção de um sobrenadante de cultura decélula; (ii) sujeição do sobrenadante à cromatografia de troca de ânions paraobter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína elu-ído da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obterum produto de proteína enriquecido; (iv) sujeição do produto de proteína en-riquecido à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteínaenriquecido eluído; e (v) sujeição do produto de proteína enriquecido eluídode (iv) à cromatografia de troca de ânions. Em outra modalidade, o produtode proteína enriquecido obtido na etapa (iii) é caracterizado pelo fato de queum percentual de qualquer contaminante de elevado peso molecular é me-nos de 25% em peso. Em outra modalidade, a cromatografia de troca deânions da etapa (ii) é realizada usando um tampão de lavagem compreen-dendo HEPES a cerca de 75 mM e NaCI a cerca de 360 mM e tendo um pHde cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânionsda etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HE-PES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 325 mM e tendo um pH de cercade 7,0. Em outra modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica daetapa (iii) é realizada usando um único tampão de lavagem compreendendoHEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 850 mM e tendo um pH de cer-ca de 7,0. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv)é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo Tris a cerca de25 mM e NaCI a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outramodalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usandoum tampão de eluição compreendendo Glicina a cerca de 100 mM e tendoum pH de cerca de 3,5. Em outra modalidade, a cromatografia de troca deânions da etapa (v) é realizada usando um tampão de lavagem compreen-dendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI de cerca de 120 mM a NaCI a cer-ca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cro-matografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando um tampão deeluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 200mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografiade troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando uma coluna tendo umaresina de troca de ânions tendo um grupo amina primária, secundária, terciá-ria ou quaternária. Em outra modalidade, a resina tem um grupo funcionalamina quaternária. Em outra modalidade, a cromatografia de interação hidro-fóbica da etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofóbicatendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Emoutra modalidade, o grupo funcional é um grupo funcional fenila. Em outramodalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usandouma coluna contendo Proteína A.

A invenção proporciona um método para preparo de CTLA4-lg,o método compreendendo purificação de CTLA4-lg de uma cultura de célulalíquida, de modo que a CTLA4-lg purificada (a) tem cerca de 38 ng de MCP-1 por mg de dímero de CTLA4-lg e (b) compreende menos do que 2,5% deespécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg (por exemplo, tetrâmero)em peso. A invenção proporciona um método para produção de CTLA4-lg, ométodo compreendendo: (a) expansão de células de prole ou células deCHO que são capazes de produzir CTLA4-lg, em que a expansão é de umacultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que aconcentração de CTLA4-lg é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e(b) isolamento de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L,em que a cromatografia é sobre uma coluna com resina de interação hidro-fóbica com pelo menos um grupo funcional fenila, em que o isolamentocompreende uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica realizadausando um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25mM e NaCI a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0.

Moléculas de CTLA4-lg incluem moléculas de beta polipeptídeo.CTI_A4A29YL104E-lg é uma molécula de beta polipeptídeo. A presente invençãose refere a métodos para produção de (incluindo produção em massa) com-posições de beta polipeptídeo ou composições de molécula de beta polipep-tídeo e composições aperfeiçoadas. A invenção é dirigida à moléculas debeta polipeptídeo, composições aperfeiçoadas compreendendo moléculasde beta polipeptídeo e métodos aperfeiçoados para produção de (incluindoprodução em massa) moléculas de beta polipeptídeo e outras glicoproteínasrecombinantes.

Métodos para produção de beta polipeptídeos e outras gli-coproteínas: A invenção proporciona um método para produção de umaglicoproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de cé-lulas de mamífero que secretam uma glicoproteína recombinante, em que aexpansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo me-nos cerca de 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante épelo menos cerca de 0,5 g/L de cultura líquida, em que a expansão de com-preende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densida-de celular de pelo menos cerca de 1,0 χ 105 células viáveis por ml_, em quecada estágio de semente começa em cerca de 2 χ 105 por mL e vai até cer-ca de 1-2 milhão células por mL, em que a cultura compreende: (1) culturadas células em um meio de inóculo isento de soro quimicamente definidodurante de cerca de 15 dias a cerca de 25 dias; então, (2) cultura das célulasem um meio basal isento de soro quimicamente definido até uma densidadecelular de cerca de pelo menos 4 milhão células por mL ser atingida; e (ii)manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produ-zir a proteína recombinante da cultura de pelo menos cerca de 0,5 g/L; e (b)isolamento da proteína recombinante da cultura líquida de pelo menos cercade 10.000 L.

A invenção proporciona um método para produção de uma gli-coproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de célu-las de mamífero que secretam uma glicoproteína recombinante, em que aexpansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo me-nos cerca de 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante épelo menos cerca de 0,5 g/L de cultura líquida, em que a expansão de com-preende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamentedefinido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densida- de celular de pelo menos cerca de 1,0 χ 105 células viáveis por mL, em quecada estágio de semente começa em cerca de 2 χ 105 por mL e vai até cer-ca de 1-2 milhão células por mL; e (ii) manutenção das células em culturadurante um tempo suficiente para produzir a proteína recombinante da cultu-ra de pelo menos cerca de 0,5 g/L, em que a manutenção de compreende:(1) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°C para 34±2°C; e (2) adi-ção de um composto polianiônico à cultura; e (b) isolamento da proteína re-combinante da cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L.

A invenção proporciona um método para produção de uma gli-coproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de célu-las de mamífero que secretam uma glicoproteína recombinante, em que aexpansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo me-nos cerca de 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante épelo menos cerca de 0,5 g/L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteínarecombinante da cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L, em que oisolamento compreende: (i) obtenção de uma fração solúvel da cultura daetapa (a); (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade paraobter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína elu-ído da etapa (ii) à cromatografia de troca de ânions de modo a obter um pro-duto de proteína enriquecido eluído; e (iv) sujeição do produto de proteínaenriquecido à cromatografia de interação hidrofóbica para obter um produtode proteína enriquecido.

Em uma modalidade da invenção, a proteína compreende umaCTLA4-lg. Em outra modalidade, a proteína compreende um beta polipeptí-deo ou moléculas de beta polipeptídeo. Em outra modalidade, a proteínacompreende beta polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.

Em uma modalidade da invenção, as pelo menos quatro passa-gens compreendem: (i) crescimento das células em um volume de cultura depelo menos 50 mL até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cercade 2,5 milhão células por mL ser atingida; (ii) crescimento das células em umvolume de cultura de pelo menos 10 L até uma densidade celular de cercade 1 milhão a cerca de 2,5 milhão células por mL ser atingida; (iii) cresci-mento das células em um volume de cultura de pelo menos 100 L até umadensidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão células por mLser atingida; e (iv) crescimento das células em um volume de cultura de 200L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão cé-lulas por mL ser atingida.

Em uma modalidade da invenção, o isolamento compreende: (i)obtenção de uma fração solúvel da cultura da etapa (a); (ii) sujeição da fra-ção solúvel à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteínaeluído; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatogra-fia de troca de ânions de modo a obter um produto de proteína enriquecidoeluído; e (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia deinteração hidrofóbica para obter um produto de proteína enriquecido.

Em uma modalidade, o produto de proteína enriquecido obtidona etapa (iv) é caracterizado pelo fato de que um percentual de qualquermultímero de elevado peso molecular é menos de 25% em peso. Em outramodalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada u-sando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM eNaCI a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em outra modalida-de, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando umtampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCI a cer-ca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em outra modalidade, a croma-tografia de interação hidrofóbica da etapa (iv) é realizada usando um tampãode lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e (NH4)2SO4 a cercade 1,2 M e tendo um pH de cerca de 7. Em outra modalidade, a cromatogra-fia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de lavagemcompreendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 150 mM etendo um pH de cerca de 7,5. Em outra modalidade, a cromatografia por afi-nidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreen-dendo Glicina a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 3. Em outramodalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada u-sando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo a -mina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em outra modalidade, aresina tem um grupo funcional amina quaternária. Em outra modalidade, acromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando umaresina de interação hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propi-la, alcóxi, butila ou isoamila. Em outra modalidade, o grupo funcional é umgrupo funcional fenila. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidadeda etapa (ii) é realizada usando uma coluna contendo Proteína A.

Em outra modalidade, a expansão de compreende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo me-nos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo me-nos cerca de 1,0 χ 105 células viáveis por ml_, em que cada estágio de se-mente começa em cerca de 2 χ 105 por mL e vai até cerca de 1-2 milhão cé-lulas por ml_; e (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir a proteína recombinante da cultura de pelo menoscerca de 0,5 g/L. Em outra modalidade, a cultura compreende: (i) cultura dascélulas em um meio de inóculo isento de soro quimicamente definido durantede cerca de 15 dias a cerca de 25 dias; então, (ii) cultura das células em ummeio basal isento de soro quimicamente definido até uma densidade celular de cerca de pelo menos 4 milhão células por mL ser atingida.

Em outra modalidade, a manutenção de compreende (i) diminui-ção da temperatura da cultura de 37±2°C para 34±2°C; e (ii) adição de umcomposto polianiônico à cultura. Em uma modalidade, o composto polianiô-nico é sulfato de dextrano e em que o sulfato de dextrana é adicionado àcultura em uma concentração final de cerca de 50 mg/ml. Em outra modali-dade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo me-nos 5 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixade 34±2°C durante pelo menos 6 dias. Em outra modalidade, a temperaturaé mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 7 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pe-lo menos 8 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro dafaixa de 34±2°C durante pelo menos 9 dias. Em outra modalidade, a tempe-ratura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 10 dias. Emoutra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C duran- te pelo menos 11 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida den-tro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 12 dias. Em outra modalidade, atemperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 13dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de34±2°C durante pelo menos 14 dias. Em outra modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 15 dias. Em outramodalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pe-Io menos 16 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro dafaixa de 34±2°C durante pelo menos 17 dias. Em outra modalidade, a tem-peratura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 18 dias.

Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°Cdurante pelo menos 19 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantidadentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 20 dias. Em outra modalida-de, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos21 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de34±2°C durante pelo menos 22 dias. Em outra modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 23 dias. Em outramodalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pe-lo menos 24 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro dafaixa de 34±2°C durante pelo menos 25 dias. Em outra modalidade, a tem-peratura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 26 dias.

Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°Cdurante pelo menos 27 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantidadentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 28 dias. Em outra modalida-de, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante até 28 dias.

Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°Caté a densidade celular da cultura ser de cerca de 30 χ 105 a cerca de 79 χ105 células por ml_ de cultura líquida.

Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual aviabilidade das células não cai abaixo de 30%. Em outra modalidade, o tem-po suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixode 40%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual aviabilidade das células não cai abaixo de 50%. Em outra modalidade, o tem-po suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixode 60%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual aviabilidade das células não cai abaixo de 70% ou 80% ou 90% ou 95%.

Em uma modalidade, galactose é adicionada ao meio isento desoro quimicamente definido. Em outra modalidade, isolamento ocorre quan-do a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6 mois de ácido siá-lico por mol de proteína. Em outra modalidade, isolamento ocorre quando acultura líquida contém de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 mois de ácido siálicopor mol de proteína. Em outra modalidade, o isolamento ocorre quando acultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 χ 10^5 a cerca de 79χ 10^5 células por mL. Em outra modalidade, o isolamento ocorre quando aviabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 37%.

Em outra modalidade, o isolamento ocorre quando a endotoxina é menos deou igual a cerca de 4,8 EU por mL de cultura líquida. Em outra modalidade, oisolamento ocorre quando a bioburden é menos de cerca de 1 unidade deformação de colônia por mL (cfu/ml) de cultura líquida. Em outra modalidade,o isolamento ocorre se pelo menos duas das seguintes condições são reuni-das: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6 mois de ácidosiálico por mol de proteína, (ii) a cultura líquida tem uma densidade celularde cerca de 33 χ 105 a cerca de 79 χ 105 células por mL, (iii) a viabilidadecelular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 37% ou (iv) aquantidade de glicoproteína na cultura é de cerca de 0,46 g/L a cerca de0,71 g/L.

Em uma modalidade, as células de mamífero são a prole deuma linhagem de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produzqualquer combinação de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptí-deo, em que cada polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15ou 16, em que as células de Ovário de Hamster Chinês têm, cada uma, es-tavelmente integradas em seu genoma, pelo menos 30 cópias de um casse-te de expressão compreendendo SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a cul-tura líquida compreende uma célula de ou uma célula de prole de uma célulade uma linhagem de célula de produção da invenção.

A invenção proporciona um beta polipeptídeo compreendendoSEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 obtido através de um método propor-cionado pela invenção. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cadapolipeptídeo compreende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 obtido atra-vés de um método proporcionado pela invenção. A invenção proporciona um beta polipeptídeo obtido através de um método proporcionado pela inven-ção.

Células: A invenção proporciona uma célula clonal de Ovário deHamster Chinês compreendendo um ácido nucleico que codifica um betapolipeptídeo ou uma molécula de beta polipeptídeo. A invenção proporcionauma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produzbeta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo. Em uma modalidade,o beta polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. A in-venção proporciona uma célula clonal de Ovário de Hamster Chinês com-preendendo um ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15ou 16. Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende SEQ IDNO: 3. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário deHamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo, em que o beta polipeptídeo é expresso a partir de uma seqüência de nucleotídeo derivada de um plasmídeo tendo No. de Acesso ATCC PTA-2104 depositado sob as condições do Tratado de Budapeste em 19 de Ju-nho de 2000 com a American Type Cultura Collection (ATCC), 10801 Uni-versity Blvd., Manassas, VA, 20110.

A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ová- rio de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou moléculas debeta polipeptídeo, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de umcassete de expressão de beta polipeptídeo. A invenção proporciona umapopulação de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um be-ta polipeptídeo ou moléculas de beta polipeptídeo, cada célula compreen-dendo 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de beta polipeptídeo,em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genomade cada célula. A invenção proporciona uma população de célula clonal deOvário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou moléculas debeta polipeptídeo, em que um cassete de expressão de beta polipeptídeo éestável durante cerca de 105 passagens. Em uma modalidade, o beta poli-peptídeo é codificado por um cassete de expressão integrado em um geno-ma de célula.

A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ová-rio de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo, em que pelo menos75% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de ex-pressão de beta polipeptídeo por célula, em que as 30 ou mais cópias sãointegradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 75% da popula-ção. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário deHamster Chinês que produz um beta polipeptídeo, em que pelo menos 85%da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressãode beta polipeptídeo por célula, em que as 30 ou mais cópias são integradasem um único sítio no genoma de cada célula dos 85% da população. A in-venção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de HamsterChinês que produz um beta polipeptídeo, em que pelo menos 95% da popu-lação de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de betapolipeptídeo por célula, em que as 30 ou mais cópias são integradas em umúnico sítio no genoma de cada célula dos 95% da população. Em uma mo-dalidade, o cassete de expressão é derivado de um plasmídeo depositadocomo No. de Acesso ATCC PTA-2104. Em outra modalidade, o cassete deexpressão compreende um ácido nucleico tendo a seqüência de SEQ IDNO: 3. Em uma modalidade, a população de célula produz pelo menos cercade 0,5 grama do beta polipeptídeo por litro de cultura líquida e em que o betapolipeptídeo tem uma proporção molar de ácido siálico para dímero de betapolipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em outra modalidade, a popu-lação de célula produz pelo menos 5, pelo menos 10 ou pelo menos 20 gra-mas do beta polipeptídeo por litro de cultura líquida. Em outra modalidade, obeta polipeptídeo tem uma proporção molar de ácido siálico para dímero debeta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5 a cerca de10 em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em outra modalidade, apopulação de célula foi adaptada a um meio isento de soro quimicamentedefinido. Em outra modalidade, um beta polipeptídeo produzido a partir dacultura da população de célula tem um coeficiente de extinção de 1,0 ± 0,05AU mL cm"1 mg"1, Em outra modalidade, a população de célula, quando de-senvolvida em cultura, produz beta polipeptídeos, em que: (a) cerca de 90%ou cerca de 80% dos beta polipeptídeos compreendem uma seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a metionina no resíduo 27;(b) cerca de 10% ou cerca de 20% dos beta polipeptídeos compreendem aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a alanina noresíduo número 26; (c) de cerca de 4% a cerca de 8% dos beta polipeptí-deos compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminan-do com a Iisina no resíduo número 383; (d) de cerca de 92% a cerca de 96%dos beta polipeptídeos compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 4 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente,(e) cerca de menos do que 1% dos beta polipeptídeos compreendem a se-qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a metionina noresíduo número 25.

A invenção proporciona uma célula de prole de uma populaçãode célula da invenção, em que a célula de prole produz um beta polipeptí-deo. Em uma modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura deuma célula durante pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo me-nos 40, pelo menos 50, pelo menos 75 gerações. Em outra modalidade, acélula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante 27 gera-ções.

A invenção proporciona uma linhagem de célula produzida apartir de qualquer célula proporcionada pela invenção. Em uma modalidade,a linhagem de célula é clonal. Em uma modalidade, a linhagem de célulaproduz: (a) um beta polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 16 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posiçãode aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); (b) um beta polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (metionina na posição de ami-noácido 27 e Iisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (c) umbeta polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15(alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoácido382 de SEQ ID NO: 4); (d) um beta polipeptídeo tendo uma seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 12 (alanina na posição de aminoácido 26 e Iisinana posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (e) um beta polipeptídeotendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 (metionina na posi-ção de aminoácido 25 e Iisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO:4); (f) um beta polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 14 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicina na posição de a-minoácido 382 de SEQ ID NO: 4); ou (g) qualquer combinação dos mesmos.Em uma modalidade, a linhagem de célula produz beta polipeptídeos ou mo-léculas de beta polipeptídeo, em que: (a) cerca de 90% ou cerca de 80% dosbeta polipeptídeos compreendem uma seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 4 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% ou cer-ca de 20% dos beta polipeptídeos compreendem a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 4 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) decerca de 4% a cerca de 8% dos beta polipeptídeos compreendem a seqüên-cia de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a Iisina no resíduo nú-mero 383; (d) de cerca de 92% a cerca de 96% dos beta polipeptídeos com-preendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com aglicina no resíduo número 382; e opcionalmente, (e) cerca de menos do que1% dos beta polipeptídeos compreendem a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo número 25, Em uma modalidade, em que os beta polipeptídeos, os quais são produzidos a partirde cultura a linhagem de célula, têm um coeficiente de extinção de 1,0 ±0,05 AU mL cm-1 mg-1.

A invenção proporciona uma população de célula derivada deuma célula da invenção. Em uma modalidade, as células da população con-

têm pelo menos uma alteração genética adicional quando comparado com acélula da invenção da qual a população foi derivada e em que as célulasproduzem um beta polipeptídeo. Em outra modalidade, as células da popu-lação contêm pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pe-lo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 oupelo menos 20 alterações genéticas adicionais quando comparado com acélula da invenção da qual a população foi derivada e em que as célulasproduzem um beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a alteração genéticacompreende pelo menos uma mutação não conservativa no genoma celularou no cassete de expressão que codifica o beta polipeptídeo. Em outra mo-dalidade, a alteração genética compreende pelo menos um ácido nucleicorecombinante adicional dentro da célula. Em outra modalidade, a alteraçãogenética compreende uma mutação do genoma celular. Em outra modalida-de, a alteração genética compreende adição de um ácido nucleico a um ge-noma de célula ou como um ácido transnucleico e em que o ácido nucleicocodifica um polipeptídeo antiapoptótico. Em outra modalidade, o polipeptídeoantiapoptótico se refere à glicosilação. Em outra modalidade, a alteraçãogenética compreende pelo menos uma mutação do genoma celular ou docassete de expressão que codifica um beta polipeptídeo. Em outra modali-dade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, produz: (a)um beta polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:16 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoá-cido 382 de SEQ ID NO: 4); (b) um beta polipeptídeo tendo uma seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 7 (metionina na posição de aminoácido 27 eIisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (c) um beta polipep-tídeo tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (alanina naposição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQID NO: 4); (d) um beta polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 12 (alanina na posição de aminoácido 26 e Iisina na posição deaminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (e) um beta polipeptídeo tendo uma se-qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 (metionina na posição de amino-ácido 25 e Iisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (f) umbeta polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14(metionina na posição de aminoácido 25 e glicina na posição de aminoácido382 de SEQ ID NO: 4); ou (g) qualquer combinação dos mesmos.Composições: A invenção proporciona uma população isoladade beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16,tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero debeta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5 a cerca de10. Em uma modalidade, a proporção molar média de grupos ácido siálicopara dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo é de cer-ca de 5,5 a cerca de 8,5. Em uma modalidade, a proporção molar média degrupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de betapolipeptídeo é de cerca de 5,2 a cerca de 7,6. A invenção proporciona umapopulação isolada de beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compre-ende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma pro-porção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptí-deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6. A invenção proporcionauma população isolada de beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeocompreende a seqüência de SEQ ID N011, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em quemais de 95% dos polipeptídeos são transformados em dímeros. Em umamodalidade, mais de 98%, mais de 99% ou mais de 99,5% dos polipeptídeossão transformados em dímeros. Em outra modalidade, de cerca de 95% acerca de 99,5% dos polipeptídeos são transformados em dímeros e cerca de0,5% a cerca de 5% dos polipeptídeos são transformados em tetrâmeros ouespécies de elevado peso molecular. Em outra modalidade, cerca de 98,6%dos polipeptídeos são transformados em dímeros e cerca de 1,2% dos poli-peptídeos são transformados em tetrâmeros ou espécies de elevado pesomolecular e cerca de menos do que 0,7 % dos polipeptídeos são monôme-ros. Em outra modalidade, cerca de 95% dos polipeptídeos são transforma-dos em dímeros e cerca de 4% dos polipeptídeos são transformados em te-trâmeros ou espécies de elevado peso molecular e cerca de 1 % dos polipep-tídeos são a população isolada de dímeros de beta polipeptídeo, em quecada monômero de polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma modalidade, a população é substancial-mente isenta de monômero de beta polipeptídeo. Em outra modalidade, apopulação é substancialmente isenta de tetrâmero de beta polipeptídeo. Ainvenção proporciona uma população isolada de monômeros de beta poli-peptídeos substancialmente isenta de dímero de tetrâmero de beta polipep-tídeos. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de beta poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14,15 ou 16 etem pelo menos 2,5 grupos ácido siálico.

A invenção proporciona uma população isolada de beta polipep-tídeos, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma potência de cerca de 70% a cerca de130% em um ensaio de ligação a B7, comparado com um padrão de CTLA4-Ig, em que o ensaio compreende medição através de ressonância de plas-mônio em superfície. A invenção proporciona uma população isolada de betapolipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma potência de cerca de 50% a cer-ca de 150% em um ensaio de inibição de IL-2 em célula humana, compara-do com um padrão. A invenção proporciona uma população purificada detetrâmeros de beta polipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular, emque cada monômero de polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ IDNO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, a população sendo substancialmente isenta dedímeros de beta polipeptídeo e opcionalmente em que a população compre-ende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. A invenção pro-porciona uma população purificada de tetrâmeros de beta polipeptídeo ouespécies de elevado peso molecular, em que cada monômero de polipeptí-deo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, apopulação sendo substancialmente isenta de monômero de beta polipeptí-deo e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade queé mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada molécula tetra-mérica compreende dois pares de beta polipeptídeos, em que cada monô-mero de polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13,14, 15 ou 16 e em que cada membro do par de polipeptídeos é covalente-mente ligado ao outro membro e em que os dois pares de polipeptídeos sãonão-covalentemente associados um ao outro. Em uma modalidade, cadamolécula tetramérica é capaz de ligação a um CD80 ou CD86. Em uma mo-dalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezesmaior pelo CD80 ou CD86 quando comparado com um dímero de beta poli-peptídeo, em que cada monômero de polipeptídeo do dímero compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em outra modalidade,cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezes maior peloCD80 ou CD86 quando comparado com a tetrâmero de molécula de CTLA4-lg compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade,cada molécula tetramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ou ativação de células T quando comparado com um dímero debeta polipeptídeo, em que cada monômero de polipeptídeo do dímero com-preende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em outra mo-dalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezesmaior de proliferação ou ativação de células T quando comparado com atetrâmero de molécula de CTLA4-lg compreendendo a seqüência de SEQ IDNO: 2.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis so-bre um gel de focalização isoelétrica o qual tem um ponto isoelétrico, pl, me-nos de ou igual a 5,5 conforme determinado através de focalização isoelétri-ca. Em uma modalidade, o pl aumenta após tratamento com neuraminidase.Em uma modalidade, pelo menos 40% dos beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou iguala cerca de 5,3 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Emuma modalidade, pelo menos 70% dos beta polipeptídeos ou moléculas debeta polipeptídeo exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual acerca de 5,3 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 90% dos beta polipeptídeos ou moléculas debeta polipeptídeo exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual acerca de 5,3 conforme determinado através de focalização isoelétrica. A in-venção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou molé-culas de beta polipeptídeo tendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2± 0,2. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeosou moléculas de beta polipeptídeo tendo um pl de cerca de 4,5 ± 0,2 a cercade 5,2 ± 0,2. A invenção proporciona uma população isolada de beta poli-peptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo tendo um pl de cerca de 4,7 ±0,2 a cerca de 5,1 ± 0,2. A invenção proporciona um método para preparo deuma composição, a composição compreendendo beta polipeptídeos ou mo-léculas de beta polipeptídeo com um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2± 0,2, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 ou 16, o método compreendendo: (a) sujeição de umamistura de beta polipeptídeos à eletroforese em gel de focalização isoelétri-ca, em que uma única banda sobre o gel representa uma população de betapolipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo com um pl em particular e(b) isolamento da população de beta polipeptídeos ou moléculas de betapolipeptídeo tendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2 de modoa preparar a composição.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 eem que os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar médiade GIcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo de cerca de 24 a cerca de 28. A invenção proporciona uma compo-sição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeocompreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em queos polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média deGaINAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma com-posição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptí-deo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e emque os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média degalactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo de cerca de 11 a cerca de 13. A invenção proporciona uma compo-sição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeocompreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em queos polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de fu-cose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0. A invenção proporciona uma composi-ção isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeocompreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em queos polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de ma-nose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 14 a cerca de 16. A invenção proporciona uma composiçãoisolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo com-preende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que asmoléculas são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siáli-co por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeode cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composiçãoisolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo com-preende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que asmoléculas são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siáli-co por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeode cerca de 5 a cerca de 10. A invenção proporciona uma composição isola-da compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compre-ende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os poli-peptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de Glc-NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 24 a cerca de 28; e (b) uma proporção molar média de áci-do siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma com-posição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptí-deo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e emque as moléculas são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média deGIcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep-tídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de Gal-NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de á-cido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta po- lipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma com-posição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptí-deo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e emque as moléculas são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média deGIcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep-tídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de Gal-NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de ga-lactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep-tídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (d) uma proporção molar média deácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de betapolipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona umacomposição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 eem que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molarmédia de GIcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molarmédia de GaINAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molarmédia de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molarmédia de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de be-ta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; e (e) uma proporção molarmédia de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou moléculade beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cadapolipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporçãomolar média de GIcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou moléculade beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molarmédia de GaINAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molarmédia de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molarmédia de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de be-ta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar mé-dia de manose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de betapolipeptídeo de cerca de 14 a cerca de 16; e (f) uma proporção molar médiade ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de betapolipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona umacomposição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 eem que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molarmédia de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar mé-dia de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula debeta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; e (c) um perfil de carboi-drato substancialmente o mesmo conforme na figura 8. A invenção propor-ciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou molé-culas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a se-qüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeossão caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por molde dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cercade 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de ácido siálico por molde dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cercade 5,5 a cerca de 8,5; (c) um perfil de carboidrato substancialmente o mes-mo conforme na figura 8; e (d) um teor de tetrâmero de beta polipeptídeo demenos do que cerca de 5%. A invenção proporciona uma composição isola-da compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo,em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12,13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) umaproporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeoou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (b) umaproporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptí-deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A in-venção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipep-tídeos, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por:

(a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta po-lipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13;

(b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de betapolipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de8,5; e (c) um teor de tetrâmero de beta polipeptídeo de menos do que cercade 5%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendobeta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência deSEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que polipeptídeos são caracteri-zadas por: (a) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de díme-ro de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 acerca de 8,5; e (b) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo con-forme na figura 8. A invenção proporciona uma composição isolada compre-endendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a se-qüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeossão caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por molde dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cercade 11 a cerca de 13; e (b) um perfil de carboidrato substancialmente o mes-mo conforme na figura 8. A invenção proporciona uma composição isoladacompreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreendea seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que polipeptídeossão caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de ácido siálico pormol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 5,5 a cerca de 8,5; e (b) um teor de tetrâmero de beta polipeptídeoou espécies de elevado peso molecular de menos do que cerca de 5%. Ainvenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta poli-peptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeocompreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em queos polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média degalactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (b) um teor de tetrâmero de betapolipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular de menos do que cercade 5%.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada poli-peptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14,15 ou 16 eem que os polipeptídeos exibem um perfil de carboidrato substancialmente omesmo conforme na figura 8. A invenção proporciona uma composição iso-lada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compre-ende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os poli-peptídeos exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - IV, em que oDomínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio Il compreende picos os quais representam oligossaca-rídeos monossialilados, o Domínio Ill compreende picos os quais represen-tam oligossacarídeos dissialilados e Domínio IV compreende picos os quaisrepresentam oligossacarídeos trissialilados. Em uma modalidade, a diferen-ça nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-Iigados entre um primeiropico no Domínio I e um pico principal no Domínio Il é de cerca de 11 a cercade 13 minutos. Em uma modalidade, a soma dos Domínios Ill e IV compre-ende cerca de 25% a cerca de 36% do perfil total de carboidrato.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do dímeros de beta polipeptídeo ou moléculas de beta polipeptídeo, em quecada monômero de polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que pelo menos cerca de 0,5 % das moléculassão cisteinilados. A invenção proporciona uma população isolada de betapolipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a população exibe um perfil deespectrometria de massa conforme mostrado na figura 11. A invenção pro-porciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou moléculas de betapolipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ IDNO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma proporção molar média de gruposácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep-tídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5, em que o dímero de beta polipeptídeoou moléculas de beta polipeptídeo são produzidas a partir de células de umalinhagem de célula de produção. A invenção proporciona uma composiçãoisolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo com-preende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, em que ospolipeptídeos são glicosilados em um resíduo de aminoácido asparagina naposição 102 de SEQ ID NO: 4, um resíduo de aminoácido asparagina naposição 134 de SEQ ID NO: 4, um resíduo de aminoácido asparagina naposição 233 de SEQ ID NO: 4. A invenção proporciona uma composiçãoisolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo com-preende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que asmoléculas são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de Glc-NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de Gal-NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí-deo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de ga-Iactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep-tídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fuco-se por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeode cerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manosepor mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 14 a cerca de 16; (f) uma proporção molar média de ácido siálicopor mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 5,5 a cerca de 8,5; (g) um pl, conforme determinado a partir de vi-sualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cercade 2,4 + 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5ppm; (i) menos de 5% de tetrâmero ou espécies de elevado peso molecular;0) menos de beta polipeptídeo 1 % de monômero; e (k) beta polipeptídeos oumoléculas de beta polipeptídeo da população tendo uma seqüência de ami-noácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 4, 11,12, 13, 14, 15 ou 16, em que os beta polipeptídeos dentro da população sãocapazes de ligação a CD80 e CD86. A invenção proporciona uma populaçãoisolada de beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a se-qüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a população demoléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAcpor mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GaINAc pormol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactosepor mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose pormol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manose pormol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 14 a cerca de 16; (f) uma proporção molar média de ácido siálicopor mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo decerca de 5,5 a cerca de 8,5; (g) um pl, conforme determinado a partir de vi-sualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cercade 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5ppm; (i) menos de 5% de tetrâmero de beta polipeptídeo ou espécies de ele-vado peso molecular; Q) menos de 1% de monômero; e (k) beta polipeptí-deos da população tendo um aminoácido pelo menos 95% idêntica a qual-quer uma de SEQ ID NOS: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, em que moléculas debeta polipeptídeo dentro da população são capazes de ligação a CD80 eCD86; ou equivalentes farmacêuticos dos mesmos.

A invenção proporciona uma composição compreendendo umaquantidade eficaz do beta polipeptídeo da invenção e um veículo farmaceuti-camente aceitável. A invenção proporciona uma composição compreenden-do excipientes conforme descrito no Pedido U.S. No. 60/752.150; depositadoem 20 de Dezembro de 2005. Em uma modalidade, a composição inclui mo-léculas de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a composição aindacompreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.Em uma modalidade, a composição ainda compreende sacarose, mono-hi-drato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido de sódio,ácido clorídrico e água estéril. Em outra modalidade, a composição compre-ende sacarose, poloxâmero, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio,fosfato de sódio anídrico dibásico, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e á-gua estéril. Em uma modalidade, a composição é liofilizada. A invenção pro-porciona uma composição liofilizada compreendendo uma quantidade eficazdos beta polipeptídeos da invenção, sacarose, mono-hidrato monobásico defosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e ácido clorídrico.

Formulações e kits: A invenção proporciona uma mistura liofili-zada de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a se-quência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, compreendendo pelo me-nos 95% de dímero de beta polipeptídeo e não mais do que 5% de tetrâmerode beta polipeptídeo (espécies de elevado peso molecular). Em uma modali-dade, a mistura compreende pelo menos 98% de dímero de beta polipeptí-deo e não mais do que 2% de tetrâmero de beta polipeptídeo (espécies deelevado peso molecular). Em uma modalidade, a mistura compreende pelomenos 99% de dímero de beta polipeptídeo e não mais do que 1% de tetrâ-mero de beta polipeptídeo (espécies de elevado peso molecular). Em umamodalidade, a mistura compreende pelo menos 5 mois de ácido siálico pormol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. Emuma modalidade, a mistura compreende cerca de 24 a cerca de 28 mois deGIcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo (espécies de elevado pesomolecular). Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 2,7 a cercade 3,6 mois de GaINAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou moléculade beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de11a cerca de 13 mois de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeoou molécula de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mistura compre-ende cerca de 6,4 a cerca de 7,0 mois de fucose por mol de dímero de betapolipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mis-tura compreende cerca de 14 a cerca de 16 mois de manose por mol de dí-mero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. A invençãotambém proporciona um kit farmacêutico compreendendo: (a) um recipientecontendo a mistura Iiofilizada de beta polipeptídeo da invenção e (b) instru-ções para reconstituição da mistura Iiofilizada de beta polipeptídeo em solu-ção para injeção.

Métodos ilustrativos de tratamento: um método para inibiçãode proliferação de células T1 ativação ou ambos, o método compreendendocontato de uma célula T com uma quantidade eficaz de uma composição debeta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para ini-bição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendoadministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invençãoproporciona um método para tratamento de um distúrbio imune em um indi-víduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptí-deo da invenção. A invenção proporciona um método para indução de tole-rância imune a um antígeno em um indivíduo, o método compreendendoadministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invençãoproporciona um método para tratamento de inflamação em um indivíduo, ométodo compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mes-mo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo dainvenção. A invenção proporciona um método para tratamento de artritereumatoide compreendendo administração, a um indivíduo que precisa domesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeoda invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de psoría-se em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indiví-duo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composiçãode beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método paratratamento de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo administra-ção, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz deuma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporcionaum método para tratamento de ou prevenção de uma alergia em um indiví-duo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptí-deo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ouprevenção de doença enxerto versus hospedeiro em um indivíduo, o métodocompreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, deuma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da inven-ção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevençãode rejeição de um órgão transplantado em um indivíduo, o método compre-endendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. Ainvenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejei-ção a tecido transplantado em um indivíduo, o método compreendendo ad-ministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade efi-caz de a composição uma composição de beta polipeptídeo da invenção. Ainvenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejei-ção de uma célula transplantada em um indivíduo, o método compreenden-do administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. Em uma moda-lidade, a célula transplantada é uma célula de medula óssea. Em outra mo-dalidade, a célula transplantada é uma célula de ilhota. Em outra modalida-de, a célula transplantada é uma célula pancreática que produz insulina. Ainvenção proporciona um método para tratamento de esclerose múltipla emum indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo queprecisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de betapolipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para trata-mento de Doença de Crohn em um indivíduo, o método compreendendoadministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invençãoproporciona um método para tratamento de diabetes do tipo I em um indiví-duo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptí-deo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento dedoença inflamatória do intestino em um indivíduo, o método compreendendoadministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invençãoproporciona um método para tratamento de ooforite em um indivíduo, o mé-todo compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo,de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da in-venção. A invenção proporciona um método para tratamento de glomerulo-nefrite em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indi-víduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composiçãode beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método paratratamento de encefalomielite alérgica em um indivíduo, o método compre-endendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. Ainvenção proporciona um método para tratamento de miastenia gravis emum indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo queprecisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de betapolipeptídeo da invenção.

A invenção proporciona o uso de uma população de beta poli-peptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeocompreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em quea população tem uma proporção molar média de grupos ácido siálico paradímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5a cerca de 10 na fabricação de um medicamento para o tratamento terapêu-tico e/ou profilático de um distúrbio imune. A invenção proporciona o uso deuma população de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, emque cada polipeptídeo compreende a seqüência de SEQ ID N011, 12, 13,14, 15 ou 16 e em que a população tem uma proporção molar média de gru-pos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli-peptídeo de cerca de 5 a cerca de 10 na fabricação de um agente antiartritereumatoide em uma embalagem junto com instruções para seu uso no tra-tamento de artrite reumatoide. Em uma modalidade, a população tem umaproporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipep-tídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5.

Terapias combinadas ilustrativas: A invenção proporciona ummétodo para inibição de proliferação de células T, ativação ou ambos, o mé-todo compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficazde uma composição de beta polipeptídeo da invenção em combinação commetotrexato. A invenção proporciona um método para inibição de uma res-posta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, aum indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de umacomposição de beta polipeptídeo da invenção em combinação com metotre-xato. A invenção proporciona um método para indução de tolerância imune aum antígeno em um indivíduo, o método compreendendo administração, aum indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de umacomposição de beta polipeptídeo da invenção em combinação com metotrexato.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As figuras 1A-1B apresentam a seqüência de nucleotídeo (SEQID NO: 1) de uma porção de um cassete de expressão para a molécula deCTLA4-lg. Também mostrada é a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 2)codificada pelo ácido nucleico. Moléculas de CTLA4-lg que podem ser pro-duzidas a partir desse cassete de expressão incluem moléculas tendo a se-qüência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 26-382 de SEQ ID NO:2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2, O cassete deexpressão compreende as seguintes regiões: (a) uma seqüência sinalizado-ra de Oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio extracelular de Humano CTLA4 (nu-cleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO: 2);(c) uma porção modificada de região constante de IgGI humana (nucleotí-deos 464-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-383 de SEQ ID NO: 2),incluindo uma região de dobradiça modificada (nucleotídeos 464-508 deSEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2), um domínio CH2 deIgGI humana (nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2) e um domínio CH3 de IgGI humana (nucleotídeos839-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).

A figura 2 apresenta as seqüências de ácido nucleico (fileirasuperior) e aminoácido (fileira inferior) correspondendo a CTLA4A29YL104E-lg.A seqüência de aminoácido contém uma alteração de aminoácido da se-qüência mostrada na figura 1, em que as alterações estão na posição 29 (Aa Y) e na posição 104 (L a E) comparado com aquela de SEQ ID NO: 2, emque a numeração dos resíduos de aminoácido começa na Metionina (M)marcada por "+1". A seqüência de nucleotídeo de CTI_A4A29YL104E-lg é mos-trada nessa figura começando de A na posição 79 (isto é, a posição marca-da pelo "+1" abaixo de M) a A na posição de nucleotídeo 1149 (SEQ ID NO:3). Em particular, a seqüência de nucleotídeo que codifica CTI_A4A29YL104E-lgé do nucleotídeo na posição 79 ao nucleotídeo na posição 1149, designadaSEQ ID NO: 3. A seqüência de nucleotídeo completa mostrada na figura 2 édesignada SEQ ID NO: 23 e inclui a seqüência de ácido nucleico que codifi-ca o peptídeo sinalizador Oncostatina M.

A figura 3 apresenta a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 4)da molécula de CTLA4A29YL104E-lg, incluindo uma pró-sequência de Oncosta-tina M (vide itálico em negrito). Polipeptídeos que podem ser produzidos quesão moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg incluem moléculas tendo a seqüência deaminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ IDNO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.

A figura 4 é um modelo de uma CTI_A4A29YL104E-lg mostrada comos sítios de glicosilação N-Iigados (N76, N108 e N207), a ligação de dissulfe-to C120-C120 e as duas substituições de aminoácido feitas no domínio deCTLA-4 (L104E e A29Y).

A figura 5 representa a seqüência de aminoácido cDNA-derivada teórica de uma CTI_A4A29YL104E-lg (SEQ ID NO: 4). Duas substitui-ções de aminoácido foram feitas no domínio extracelular de CTLA-4 (L104Ee A29Y) para gerar CTUMa29yl1 04E-lg. A seqüência identifica o peptídeo si-nalizador (pró-sequência) de oncostatina M junto com os sítios de glicosila-ção N-ligados.

A figura 6 é um gráfico representando a ligação de amostras deCTLMa28yl1'°4E-lg a um anticorpo de Fc anti-lgG humana de bezerro. A liga-ção de amostras de CTLA4A29YL104E-lg foi detectada através de medição daresposta obtida sobre essa superfície, comparado com uma superfície dechip sensor não modificada. Os vários lotes representam três amostras deCTLA4A29YL104E-lg diferentes.

A figura 7 é um gráfico que mostra os pesos moleculares evi-dentes os quais correspondem às frações de multímero, tetrâmero e dímerode um pico de clarificação por HIC de CTLA4-lg, conforme determinado a-través de uma sobreposição de SEC com duas colunas com detecção pordispersão dinâmica de luz (DSL) e tempo de retenção sobre SEC.

As figura 8A (superior) e 8B (inferior) mostram géis de IEF re-presentativos de frações de moléculas de CTLA4-lg glicosiladas (compreen-dendo monômeros de SEQ ID NO: 2) isoladas e purificadas de um pico declarificação por HIC. A ordem de carregamento para o gel superior é: fileira1, marcadores de pl (Amersham); fileira 2, padrão de dímero de CLTA4-lg;fileira 3, eluato de Proteína A; fileira 4, Multímero; fileira 5, tetrâmero; fileira6, dímero. A ordem de carregamento para o gel inferior é: fileira 1, marcadorde pl (Amersham); fileira 2, padrão de dímero de CLTA4-lg; fileira 3, tetrâme-ro; fileira 4, tetrâmero dissociado. Os painéis mostram que o tetrâmero émenos sialilado do que o dímero.

A figura 9 mostra as estruturas de carboidrato predominantes equantidades relativas de carboidratos observadas sobre um dímero de C-TLA4-lg compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. A numeração deresíduo de aminoácido na figura não é consistente com SEQ ID NO: 2. Paraque a numeração de resíduo de aminoácido na figura seja consistente comSEQ ID NO: 2, a numeração precisa aumentar em 26, isto é, N76 é N102.

A figura 10 INTENCIONALMENTE DEIXADA EM BRANCO.A figura 11 mostra um gel de IEF representativo (pH de 4,0 a6,5) de um dímero de CTLA4-lg compreendendo monômeros de SEQ IDNO: 2. As fileiras 1 e 5 mostram um padrão de calibração, a fileiras 2, 3, 4mostram, cada uma, 20 μg/μl de dímero de CLTA4-lg.

A figura 12 mostra um gel de IEF representativo (pH de 4,0 a6,5) de um dímero de CTLA4A29YL104E-lg compreendendo monômeros deSEQ ID NO: 4. As fileiras 1 e 8 mostram um padrão de calibração, as fileira2-7 mostram, cada uma, 10 μg/μl de dímero de CTI_A4A29YL104E-lg.

A figura 13 mostra o perfil de carboidrato N-Iigado de uma popu-lação de moléculas de CTLA4-lg compreendendo monômeros de SEQ IDNO: 2. Os carboidratos foram coletados de glicopeptídeos e separados u-sando a técnica de oligossacarídeo N-Iigado PGC por LC/MS. Os cromato-gramas proporcionam o perfil de população para cada sítio de fixação de N-ligação. A) Os carboidratos Asn76 (Asn102 de SEQ ID NO: 2) do peptídeo T5e B) os carboidratos Asn108 (Asn134 de SEQ ID NO: 2) do peptídeo T7 mos-tram ambos distribuições dentre espécies mono- e multissialiladas. C) Oscarboidratos Asn207 (Asn 233 de SEQ ID NO: 2) do peptídeo T14 consistempredominantemente em espécies asialiladas. D) A distribuição de carboidra-tos N-Iigados para moléculas de CTLA4-lg é mostrada. E) Um espectro pri-mário selecionado do peptídeo T5 mostra um pico principal correspondendoà estrutura monossialilada biantenária representada. F) Um espectro primá-rio selecionado do T14 mostra um pico principal correspondendo à estruturaasialo biantenária. G) Um espectro primário selecionado de uma espéciemenor a qual coelui com o pico a 64,23 minutos, o qual corresponde à estru-tura dissialilada tri-antenária. H) Um espectro primário selecionado revela aespécie principal no pico a 64,23 minutos, o qual corresponde à estruturadissialilada biantenária.

As figuras 14A-B mostram um traço por UV e TIC de um perfilde oligossacarídeo N-Iigado de um monômero de SEQ ID NO: 2 de CTLA4-lg a partir de cromatografia PGC sob condições de eluição ácida (TFA a0,05%). O traço da figura 14A mostra a contagem total de íons negativos(TIC) para o cromatograma PGC sob condições de eluição ácida (TFA a0,05%). O traço da figura 14B mostra o traço por UV a 206 nm para croma-tograma PGC sob condições de eluição ácida (TFA a 0,05%).

As figuras 15A-B mostram um traço por UV e TIC de um perfilde oligossacarídeo N-Iigado de um monômero de SEQ ID NO: 2 de CTLA4-Ig a partir de cromatografia PGC sob condições de eluição básica (NH4OH a0,4%). O traço da figura 15A mostra a contagem total de íons negativos(TIC) para cromatograma PGC sob condições de eluição básica (NH4OH a0,4%). O traço da figura 15B mostra o traço por UV a 206 nm para cromato-grama PGC sob condições de eluição básica (NH4OH a 0,4%).

A figura 16 representa os perfis de carboidrato e oligossacarí-deo N-Iigado para moléculas de CTLA4A29YL104E-lg compreendendo SEQ IDNO: 4. Quatro domínios de oligossacarídeo são observados: o Domínio Icontém espécies não-sialiladas, enquanto que os Domínios II, Ill e IV contêmespécies monossialiladas, dissialiladas e trissialiladas, respectivamente. Iso-lamento dos oligossacarídeos cromatograficamente e análise dos mesmosatravés de espectroscopia de massa determinaram os domínios.

A figura 17 mostra um perfil por HPAEC-PAD de oligossacarí-deos N-Iigados de moléculas de CTLA4-lg compreendendo monômeros deSEQ ID NO: 2. Os domínios são mostrados na ordem crescente de teor deácido siálico para os oligossacarídeos. Os Domínios I, II, Ill e IV contêm es-truturas de oligossacarídeo tendo 0, 1, 2 e 3 ácidos siálicos, respectivamen-te. Os rótulos de pico representam estruturas de oligossacarídeo atribuídasatravés de determinação de perfil por HPAEC-PAD de picos coletados a par-tir de determinação de perfil por PGC. A identificação estrutural da estruturade carboidrato é consistente com determinações anteriores.

As figuras 18A-B mostram um perfil por PGC de moléculas deCTLA4-lg compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. O perfil é obtido apartir de injeção direta de mistura de digestão de carboidrato preparada con-forme descrito no Exemplo 3. Injeção direta resulta em detecção da estruturaP4144 eluindo a 130 minutos. A estrutura tetrassialilada P4144 não é obser-vada em perfis de oligossacarídeos os quais são isolados antes de injeção.

A figura 19 apresenta um espectro por eletropulverização positi-va de desconvolução por LC/MS para o fragmento T9 de um monômero deSEQ ID NO: 2. O espectro ilustra três principais estruturas O-ligadas. O es-pectro ilustra o peptídeo de base com Iadder de açúcar consistente com aestrutura O-Iigada (GalNAc)i(Gal)i(NeuAc)i. A porção em negrito do espec-tro foi intensificada 10 vezes com relação à porção não em negrito do espec-tro e ilustra duas estruturas O-Iigadas adicionais com (GalNAc)i(Gal)i (NeuAc)2 e(GalNAc)1(GIcNAc)I(GaI)2(NeuAc)2.

A figura 20 mostra os pontos de fixação e populações relativasde estruturas de carboidrato O-Iigado de uma cadeia simples de CTLA4-lg tendo a seqüência monomérica SEQ ID NO: 2. As quantidades relativas emcada local mostram dados gerados através de duas ou mais técnicas orto-gonais e estão sujeitas à variabilidade. A localização da cisteinilação cova-Iente também é representada.

A figura 21 representa um mapa do plasmídeo intermediário piLN-huCTLA4-lg. Esse plasmídeo compreende uma seqüência que podecodificar uma molécula de CTLA4-lg humana (huCTLA4-lg) (isto é, SEQ IDNO: 1) flanqueada pelos sítios de enzima de restrição Hindlll e Xbal.

A figura 22 representa um mapa do plasmídeo pD16LEA29Y.Esse plasmídeo compreende uma seqüência que pode codificar uma molé- cuia de CTLA4A29YL104E-lg humana (isto é, SEQ ID NO: 4).

A figura 23 é uma fotografia de uma Southern blot de DNA extra-ído de células de CHO expressando o cassete de expressão de CTLA4-lgderivado de 1D5-100A1 (por exemplo, clone 17). As fileiras para o gel daesquerda para a direita são: fileira M1 marcador de peso molecular de DNA;fileira N, DNA de CHO digerido com EcoRI/Xbal (5 mg); fileira 1, DNA deCHO digerido com EcoRI/Xbal não transfectado (2,5 pg) + 1 ng de pcS-DhuCTLA4-lg; fileira 2, DNA de CHO digerido com EcoRI/Xbal não transfec-tado (2,5 pg) + 0,5 ng de pcSDhuCTLA4-lg; fileira 3, DNA de CHO digeridocom EcoRI/Xbal não transfectado (2,5 pg) + 0,25 ng de pcSDhuCTLA4-lg; fileira 4, DNA de CHO digerido com EcoRI/Xbal não transfectado (2,5 pg) +0,125 ng de pcSDhuCTLA4-lg; fileira 5, DNA de CHO digerido com Eco-RI/Xbal não transfectado (2,5 pg) + 0,0625 ng de pcSDhuCTLA4-lg; fileira 6,DNA de CHO digerido com EcoRI/Xbal não transfectado (2,5 Mg) + 0,03125ng de pcSDhuCTLA4-lg; fileira 7, DNA digerido com EcoRI/Xbal: MCB (5,0pg); fileira 8, DNA digerido com EcoRI/Xbal: Número de Lote EPCBC20030618A-01 (5,0 pg); fileira 9, DNA digerido com EcoRI/Xbal: Númerode Lote EPCB C20030712A-01 (5,0 pg); fileira 10, DNA digerido com Eco-RI/Xbal: Número de Lote EPCB C20030801A-01 (5,0 pg); fileira 11, DNAdigerido com EcoRI/Xbal: MCB (2,5 Mg); fileira 12, DNA digerido com Eco-RI/Xbal: Número de Lote EPCB C20030618A-01 (2,5 Mg); fileira 13, DNAdigerido com EcoRI/Xbal: Número de Lote EPCB C20030712A-01 (2,5 Mg);fileira 14, DNA digerido com EcoRI/Xbal: Número de Lote EPCBC20030801A-01 (2,5 Mg); fileira 15, DNA digerido com EcoRI/Xbal: MCB(1,25 M9); fileira 16, DNA digerido com EcoRI/Xbal: Número de Lote EPCBC20030618A-01 (1,25 Mg); fileira 17, DNA digerido com EcoRI/Xbal: Númerode Lote EPCB C20030712A-01 (1,25 Mg); fileira18, DNA digerido com Eco-Rl/Xbal: Número de Lote EPCB C20030801A-01 (1,25 Mg)-

A figura 24 representa um fluxograma de um processo de cultu-ra em escala de produção. Esse processo permite a produção em massa deproteínas recombinantes em um biorreator de produção de 25.000 L.

A figura 25 mostra um cromatograma representativo do padrãode adequabilidade de sistema de NGNA e NANA. O pico a ~9,7 min é NGNAe o pico a ~10,7 min é NANA.

A figura 26 mostra um cromatograma representativo de molécu-las de CTLA4-lg hidrolisadas compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2.O pico a ~8,4 min é o pico de solvente. O pico a -9,6 min é NGNA. O pico a~10,5min é NANA. O pico a ~11,3 min é NANA degradado, resultante dascondições de hidrólise. As contagens de área são combinadas para cálculosda proporção molar de NANA.

As figuras 27A, 27B e 27C mostram os espectros por MALDI depeptídeos cisteinilados de CTLA4-lg. Os espectros por MALDI foram obtidospara fragmentos de tripsina/quimiotripsina de CTLA4-lg contendo Cys146 deSEQ ID NO: 2. A figura 27A mostra o espectro de peptídeo com cadeia sim-ples ilustrando a modificação por cisteinilação. A figura 27B mostra o espec-tro do peptídeo com cadeia simples após redução e demonstra que a modifi-cação ocorre em Cys146. A figura 27C mostra a alquilação do peptídeo comcadeia simples reduzido, o qual demonstra que a cisteinilação ocorre emCys146

A figura 28 apresenta um esquema de clonagem útil para a ge-ração do vetor pcSD. pcDNA3 foi digerido com a enzima de restrição Naelde forma a isolar um fragmento de 3,821 Kb que contém o promotor deCMV1 um gene de resistência à ampicilina e uma origem de replicação paraE. coli. pSV2-dhfr foi digerido com as enzimas de restrição Pvull e BamHI deforma a isolar um fragmento de 1,93 Kb, o qual contém o promotor SV40 e ogene dhfr e teve a extremidade subseqüentemente cega. Para gerar o pcSD,ambos os fragmentos foram ligados. O mapa do plasmídeo pcSD é mostra-do no fundo da figura.

A figura 29 apresenta um esquema de clonagem útil para gera-ção do vetor de expressão pcSDhuCTLA4-lg. pcSD foi digerido com as en-zimas de restrição EcoRV e Xbal. piLN-huCTLA4-lg foi digerido com a enzi-ma de restrição Hindlll, teve a extremidade cega e, então, digerido com aenzima de restrição Xbal de forma a isolar o fragmento huCTLA4-lg de 1,2Kb. Para gerar o pcSDhuCTLA4-lg, o fragmento de CTLA4-lg foi ligado aovetor pcSD digerido. O mapa do plasmídeo pcSDhuCTLA4-lg é mostrado noinferior da figura. Esse plasmídeo foi Iinearizado e transfectado em célulasde CHO que não têm um gene dhfr funcional. Uma vez que o plasmídeocontém um gene dhfr funcional, transfectantes estáveis podem ser selecio-nados com base na sobrevivência celular. O pcSDhuCTLA4-lg no cassetede expressão compreendendo o promotor de CMV, uma seqüência que codi-fica uma molécula de CTLA4-lg humana (huCTLA4-lg) (isto é, SEQ ID NO:1) e uma seqüência de cauda poli(A) de BGH.

A figura 30 mostra um eletroferograma de amino monossacarí-deos da adequabilidade do sistema representado como unidades de fluores-cência relativa (RFU) versus tempo (min).

A figura 31 mostra um eletroferograma de monossacarídeosneutros da adequabilidade de sistema representada como unidades de fluo-rescência relativa (RFU) versus tempo (min).

A figura 32 representa um mapa do peptídeo trípitico de C-TUMa29yl104e-Iq com peptídeos rotulados. A Tabela 23 corresponde aospeptídeos rotulados.

A figura 33 mostra uma análise por hibridização de Northern daCTUMa29yl1 04E-lg. O Painel A representa um gel de ágarose corado combrometo de etídio em que a Fileira M é marcador de RNA; a Fileira 1 é RNAtotal de CHO; a Fileira 2 é RNA total de MCB; e a Fileira 3 é RNA total deEPCB. O Painel B é o autorradiograma correspondente, em que a Fileira M émarcador de RNA; a Fileira 1 é RNA total de CHO; a Fileira 2 é RNA total deMCB; e a Fileira 3 é RNA total de EPCB.

A figura 34A-C representa cromatogramas por exclusão de ta-manho, os quais distinguem dímeros de CTI_A4A29YL104E-lg de espécies dealto e baixo peso molecular.

A figura 35 mostra uma análise por SDS-PAGE (Reduzida eNão-Reduzida) de CTI_A4A29YL104E-lg corada com Coomassie Blue. A Fileira1 é carregada com marcadores de peso molecular; as Fileiras 2, 7 e 12 sãoplacebo; as Fileiras 3-6 são amostras de CTI_A4A29YL104E-lg (reduzida); asFileiras 8-11 são amostras de CTI_A4A29YL104E-lg (não-reduzida).

A figura 36 mostra uma análise por SDS-PAGE (Reduzida eNão-Reduzida) de CTI_A4A29YL104E-lg submetida à coloração com prata. AFileira 1 é carregada com marcadores de peso molecular; as Fileiras 2, 7 e12 são placebo; as Fileiras 3-6 são amostras de CTLA4A29YL104E-lg (reduzi-da); as Fileiras 8-11 são amostras de CTI_A4A29YL104E-lg (não-reduzida).

A figura 37 representa um mapa peptídico de CTLA4A29YL104E-lgnão reduzida usando uma combinação de digestão com tripsina e quimio-tripsina.

A figura 38 representa um mapa peptídico de CTI_A4A29YL104E-lgnão-reduzida usando uma combinação de digestão com tripsina e elastase.

A figura 39 é um diagrama que representa pacientes com res-postas anti-CTLA4-lg ou anti-CTLA-4. A resposta de anticorpo à molécula deCTLA4-lg inteira (CTLA-4 e porção de Ig) e à porção de CTLA-4 apenas foideterminada usando os Ensaios A e B, conforme esboçado no Exemplo 32.

A figura 40 é um esquema mostrando a distribuição de elimina-ção e o volume de compartimento central através do estado de imunogenici-dade.

A figura 41 é um gráfico demonstrando perfis de concentraçõesmédias de CTLA4-lg no soro (SD) com o tempo em macacos administrados10 mg/kg de substância de fármaco produzida através de um processo dainvenção.

A figura 42 é um gráfico de um cromatograma por cromatografiade exclusão de tamanho (SEC) de Proteína A (MAbSeIect) purificada docontrole e material de CTLA4-lg desagregado.

A figura 43 é um gráfico de uma análise de N-glicana compa-rando o Material Processado de Desagregação (ii) com o Controle (i).

A figura 44 é um gráfico representando as concentrações mé-dias de CTLA4-lg no soro ^g/ml] versus o tempo (mais de 71 dias).

A figura 45 mostra um eletroferograma de monossacarídeosneutros representado como unidades de fluorescência relativa (RFU) versuso tempo (min).

A figura 46 mostra um eletroferograma de amino monossacarí-deos representado como unidades de fluorescência relativa (RFU) versus otempo (min).

A figura 47 representa os perfis de carboidrato de oligossacarí-deo N-Iigado para moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg compreendendo SEQ IDNO: 4. Quatro domínios de oligossacarídeo são observados, em que o Do-mínio I contém espécies não-sialiladas, enquanto que os Domínios Il1 Ill e IVcontêm espécies monossialiladas, dissialiladas e trissialiladas, respectiva-mente.

A figura 48 é um gráfico de uma separação por eletroforese ca-pilar de CTLA4-lg que foi misturada a 1:1 com CTLA4A29YL104E-lg. Os temposde migração do pico principal são de aproximadamente 0,8 minuto de inter-valo.

A figura 49 é um cromatograma de material CTI_A4A29YL104E-lghidrolisado, em que um pico de NANA é observado a 3,4 minutos.

A figura 50 representa várias das estruturas de carboidrato N-Iigadas encontradas em proteínas de mamífero. Todas as cadeias comparti-lham uma estrutura central em comum contendo dois resíduos de GIcNAc etrês de manose.

A figura 51 é um gráfico representando a exposição de CTLA4-Ig (AUC) como uma função de sialilação da glicoproteína (proporção de NA-NA).

A figura 52 é um gráfico representando a exposição de CTLA4-Ig (AUC) como uma função do perfil de carboidrato de CTLA4-lg. Um grandenúmero de picos foi gerado através de HPLC de troca de ânions, os quaisforam decompostos em quatro ou cinco domínios. Os domínios 1 e 2 sãoestruturas grandemente asialiladas e monossialiladas, enquanto que os do-mínios 3 e 4 são estruturas grandemente di- e trissialiladas.

A figura 53 representa um mapa de peptídeo tríptico de C-TLA4A29YL104E-lg com peptídeos rotulados. A Tabela 56 corresponde aospeptídeos rotulados.

A figura 54 representa os perfis de carboidrato N-Iigado compa-rativos para moléculas de CTLA4-lg compreendendo SEQ ID NO: 2. Quatrodomínios de oligossacarídeo são observados, em que o Domínio I contémespécies não-sialiladas, enquanto que os Domínios II, Ill e IV contêm espé-cies monossialiladas, dissialiladas e trissialiladas, respectivamente.

As figuras 55A-D são um gráfico que representa os perfis de oli-gossacarídeo de CTLA4-lg e Peptídeos T5, T7 e T14 através de HPAEC-PAD.

A figura 56 é um gráfico representando o perfil de oligossacarí-deo rotulado de CTLA4-lg obtida de uma coluna de PGC (Hypercarb).

A figura 57 representa um gráfico dos dados de farmacocinéticamostrando AUC de macaco sobre o eixo Yeo percentual de glicosilação N-ligada, conforme mostrado nos Domínios I e Il a partir de um perfil de car-boidrato sobre o eixo X. Veja métodos de determinação do perfil de carboi-drato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. À medida que opercentual dos Domínios Iell aumenta (e o percentual dos Domínios III1 IV eV diminui), a eliminação aumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4-lgcom baixo teor de ácido siálico, é eliminado muito rapidamente. Note que avariante de CTLA4-lg, LEA (CTI_A4-lgA29YL104E-lg), é incluída nesse gráfico.

As figura 58 A e 58 B representam um traço de um cromato-grama de carboidrato N-Iigado dos carboidratos N-Iigados liberados deCTA4-lg (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritosnos Exemplos 3, 44, 22 e 37). O traço na figura 58A é de uma análise deCTLA4-lg produzida em um método de cultura sem galactose extra adicio-nado à cultura. O traço na figura 58 B tem galactose adicionada à cultura. Ospercentuais de carboidratos N-Iigados em cada domínios são mostrados natabela em anexo.

A figura 59 representa um traço de um cromatograma de carboi-drato N-Iigado dos carboidratos N-Iigados liberados de CTA4-lg (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44,22 e 37). Esse é de uma análise de CTLA4-lg produzida em um método decultura com galactose adicionada à cultura no dia 8. Esse traço é de umaanálise de CTLA4-lg produzida em um método de cultura sem galactose ex-tra adicionado à cultura. Os percentuais de carboidratos N-Iigados em cada domínio são mostrados na tabela em anexo.

A figura 60 representa um traço de um cromatograma de carboi-drato N-Iigado dos carboidratos N-Iigados liberados de CTA4-lg (conformeobtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44,22 e 37). Esse é de uma análise de CTLA4-lg produzida em um método decultura com galactose adicionada à cultura no dia 14. Esse traço é de umaanálise de CTLA4-lg produzida em um método de cultura sem galactose ex-tra adicionado à cultura. Os percentuais de carboidratos N-Iigados em cadadomínios são mostrados na tabela em anexo.

As figuras 61A e 61B representa um traço de um cromatograma de carboidrato N-Iigado dos carboidratos N-Iigados liberados de CTA4-lg(conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos E-xemplos 3, 44, 22 e 37). A figura 61A é de uma análise de CTLA4-lg produ-zida em um método de cultura sem galactose adicionada e a figura 61B é deuma análise onde galactose foi adicionada à cultura no dia 14. Esse traço éde uma análise de CTLA4-lg produzida em um método de cultura sem galac-tose extra adicionado à cultura. Os percentuais de carboidratos N-Iigados emcada domínios são mostrados na tabela em anexo.

A figura 62 representa um traço de um cromatograma de carboi-drato N-Iigado dos carboidratos N-Iigados liberados de CTA4-lg (conformeobtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44,22 e 37). Esse traço foi obtido de material CTLA4-lg que foi recuperado daetapa de lavagem da coluna de QFF, produzindo uma fração de material deCTLA4-lg com baixo teor de ácido siálico. A quantidade relativa de DomíniosI e Il é aumentada e os Domínios Ill e Iv são diminuídos, comparado com ostraços mostrados nas figuras 61, 60 e 59. Os percentuais de carboidratos N-Iigados em cada domínio são mostrados na tabela em anexo.

A figura 63 mostra o mapa de peptídeo tríptico de CTLA4-lg,indicando que T8 elui ao final do fronte de solvente e T9 elui na extremidade("shoulder") de T27.

A figura 64 é um gráfico que representa o espectro todo demassa correspondendo ao glicopeptídeo T8 de CTLA4-lg.

A figura 65 é um gráfico que representa o espectro todo demassa correspondendo ao glicopeptídeo T9 de CTLA4-lg.

A figura 66 é um gráfico que representa os dados de MALDI-TOF para o fragmento de peptídeo T9 de CTLA4-lg.

A figura 67A-B representa cromatogramas de íons e espectrosde massa de peptídeos trípticos nativos e oxidados de CTLA4-lg.

A figura 68 representa um perfil de oligossacarídeo N-Iigadotípico (Domínios I, II, III, IV e V e Picos 1A e 1B dentro de 5% das médiasdos lotes). Os picos 1A, 1B e 1C representam as estruturas de asialo oligos-sacarídeo N-Iigados de GO, G1 e G2. Os dados para o perfil estão na tabeladiretamente abaixo. Veja Exemplo 44.

<table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>

A figura 69 representa um gel de focalização isoelétrica de C-TLA4-lg. As bandas são caracterizadas por:

<table>table see original document page 63</column></row><table>

A figura 70 representa um relatório de análise quantitativa emgel de focalização isoelétrica representativo de CTLA4-lg. A quantificação dogel foi realizada e os dados são como segue:

<table>table see original document page 63</column></row><table>Relativa da amostra (%) | 100 | |

Relativa da amostra (%) = Amostra % Internsidade da banda/Ref. % Internsidade da bandaNOTA: Para a faixa de pi de 4,3 a 5,3

A figura 71 A representa uma injeção de 20 μL típica do padrãode adequabilidade de sistema sobre uma coluna TOSO HAAS 3000 SWXLequipada com uma coluna de proteção. A figura 71B representa uma injeçãode 20 μL de material de referência CTLA4-lg sobre a coluna TOSO HAAS3000 SWXL equipada com uma coluna de proteção.

Fig. 72 - Exemplo de imagem digitalmente adquirida de análisepor SDS-PAGE de CTLA4-lg através de eletroforese em gel de poliacrilami-da corado com Coomassie Blue (4-20).

<table>table see original document page 64</column></row><table>

A figura 73 representa um exemplo de um relatório de análisequantitativa para SDS-PAGE corado com Coomassie Blue.

A figura 74 mostra uma tabela apresentando a análise quantita-tiva do gel de SDS-PAGE corado na figura 73.

A figura 75 representa um exemplo de uma imagem intensifica-da de análise por SDS-PAGE de um gel corado com Coomassie Blue deCTLA4-lg para ilustração das posições de migração das bandas principais emenores esperadas com relação aos marcadores de peso molecular.

A figura 76 é uma representação de um perfil de carboidrato N-ligado de material padrão/referência de CTLA4-lg. Esse é um perfil de car-boidrato representativo da operação sobre o sistema Waters. Os tempos deretenção são dependentes do sistema.

A figura 77 é uma representação de um cromatograma de ade-quabilidade de sistema por estaquiose representativo.

A figura 78 é um traço de um cromatograma representativo dematerial CTLA4-lg hidrolisado.

A figura 79 representa uma imagem em gel de análise por SDS-PAGE de CTLA4A29YL104E-lg em eletroforese em gel de poliacrilamida coradocom Coomassie Blue (4-20%).

<table>table see original document page 65</column></row><table>

A figura 80 representa um fluxograma das etapas de coleta. Ve-ja Exemplo 28.

A figura 81 representa um eletroferograma da adequabilidadede sistema de amino monossacarídeos. Veja Exemplo 16.

A figura 82 representa um gráfico de dados farmacocinéticosmostrando a AUC de macaco sobre o eixo Yeo percentual de glicosilaçãoN-Iigada1 conforme mostrado no Domínios I e Il de um perfil de carboidratosobre o eixo X. Veja métodos de determinação do perfil de carboidrato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. À medida que o percentu-al dos Domínios I e Il aumenta (e o percentual dos Domínios III, IV e V dimi-nui), a AUC aumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4-lg com baixoteor de ácido siálico, é eliminado muito rapidamente. Note que a moléculamutante de CTLA4-lg, CTI_A4-lgA29YL104E-lg (designada LEA), é incluída nes-se gráfico.

A figura 83 representa um gráfico de dados farmacocinéticosmostrando a AUC sobre o eixo Yeo percentual de glicosilação N-ligada,conforme mostrado no Domínios Ill e IV (conforme determinado a partir deum perfil de carboidrato N-ligado) sobre o eixo X. À medida que o percentualdos Domínios Ill e IV aumenta, a AUC aumenta. Note que o controle negati-vo, a CTLA4-lg com baixo teor de ácido siálico, é eliminado muito rapida-mente. Veja métodos de determinação do perfil de carboidrato N-ligado, porexemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. Note que a molécula mutante de C-TLA4-lg, CTI_A4-lgA29YL104E-lg (designada LEA), é incluída nesse gráfico.

A figura 84 representa outro gráfico de dados farmacocinéticosmostrando a AUC sobre o eixo Yeo percentual de glicosilação N-ligada,conforme mostrado no Domínios Ill e IV de um perfil de carboidrato sobre oeixo X. À medida que o percentual dos Domínios Ill e IV aumenta, a AUCaumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4-lg com baixo teor de ácidosiálico, é eliminado muito rapidamente. Veja métodos de determinação doperfil de carboidrato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37.Note que a molécula mutante de CTLA4-lg, CTI_A4-lgA29YL104E-lg (designadaLEA), é incluída nesse gráfico.

A figura 85 representa um Mapeamento Tríptico de padrão deCTLA4-lg (veja Tabela no final do Exemplo 65) para atribuições de pico. Umpequeno pico rotulado T1+A é o peptídeo tríptico T1 estendido por um resí-duo de alanina N-terminal. O pequeno pico rotulado T31+K é o peptídeo tríp-tico T31 estendido por um resíduo de Iisina C-terminal.

A figura 86 representa uma sobreposição de dados a 280 nmpara um Mapeamento Tríptico de padrão de CTLA4-lg mais Same Spikedcom 5% em mois de Peptídeo Indicador T6ox, Met(O) 85 (84-93). Veja E-xemplo 65.

A figura 87 representa uma vista expandida de dados a 215 nmpara um Mapeamento Tríptico de padrão de CTLA4-lg mais o mesmo refor-ço com 5% em mois de Peptídeo Indicador T26deaml, isoAsp294(281-302).

Veja Exemplo 65.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Moléculas de CTLA4-lg podem ser usadas para tratar uma vari-edade de distúrbios, incluindo distúrbios relacionados a fenômenos imuno-proliferativos e imunorreativos anormais, tais como autoimunidade e alergia.A invenção proporciona composições de CTLA4-lg que compreendem, porexemplo, populações de moléculas de CTLA4-lg tendo particulares modifi-cações de glicosilação, em particular, tendo perfis ou características de car-boidrato em particular, tendo estruturas multiméricas em particular e/ou ten-do resistências de avidez em particular. Documentos que são aqui incorpo-rados por referência em sua totalidade que também descrevem moléculasde CTLA4-lg, usos e métodos das mesmas, incluem Patente U.S. No.5.434.131; 5.851.795; 5.885.796; 5.885.579; e 7.094.874.

A invenção também proporciona linhagens de células que sãocapazes de produzir grandes quantidades de moléculas de CTLA4-lg via osmétodos de produção em massa e cultura proporcionados aqui. Uma linha-gem de célula em particular da invenção é uma linhagem de célula clonalque pode ser usada para produzir em massa moléculas de CTI_A4-lg, demodo que elas tenham um perfil de carboidrato e glicosilação em particular.Quando comparado com a população de célula heterogênea e não-clonaltendo No. de Acesso ATCC 68629 (veia Patente U.S. No. 5.434.131, a qualé incorporada aqui por referência em sua totalidade), as linhagens de célulasclonais da invenção podem secretar uma população de moléculas de C-TLA4-lg tendo um perfil de glicosilação ou carboidrato mais consistente oumais uniforme. Ainda, quando comparado com a população de células hete-rogênea e não-clonal tendo No. de Acesso ATCC 68629, as linhagens decélulas clonais da invenção podem secretar uma maior quantidade de molé-culas de CTLA4-lg, em parte porque as presentes linhagens de célula clonalsão selecionadas para ter um maior número de cópias de cassetes de ex-pressão de CTLA4-lg integrados em um único sítio no genoma da célula.

A invenção proporciona a descoberta de que a avidez e potênciade CTLA4-lg (SEQ ID NO: 2) pode ser aumentada fazendo duas substitui-ções de aminoácido na região de ligação B7 do domínio de ligação de C-TLA-4: (i) alanina na posição 29 de SEQ ID NO: 2 é substituída por tirosina(A29Y) e (ii) Iisina na posição 104 de SEQ ID NO: 2 é substituída por gluta-mato (L104E). A invenção proporciona um subgênero de moléculas de C-TLA4-lg, denominado "moléculas de beta polipeptídeo," as quais compreen-dem beta polipeptídeos os quais têm atividade de ligação a B7 e podemcompreender a seqüência de aminoácido em SEQ ID NO: 24 ( domínio ex-tracelular de CTLA4 com mutações A29Y e L104E), ligados a uma regiãoconstante de imunoglobulina ou porção da mesma.SEQ ID NO: 24

M HVAQ PAWLASS RG IAS FVC EYASPG KYTEVRVTVLRQ ADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD

SEQ ID NO: 18 - Um domínio extracelular CTLA4MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD

Termos

Conforme usado aqui, o termo "clonal" se refere a uma popula-ção de célula que é expandida a partir de uma única célula. Com relação auma linhagem de célula clonal ou população de célula clonal capaz de ex-pressar a molécula de CTLA4-lg, a linhagem ou população de célula clonal éexpandida a partir de uma única célula que foi isolada de uma população decélulas que foram transfectadas com um vetor de expressão que codifica amolécula de CTLA4-lg. A população transfectada de células pode ser umapopulação heterogênea. Uma linhagem ou população de célula clonal podeser considerada como sendo homogênea no sentido de que todas as célulasna população se originam de um único transfectante.Conforme usado aqui, o termo "B7-1" se refere a CD80; o termo"B7-2" se refere a CD86; e o termo "B7" se refere a um ou ambos de B7-1 eB7-2 (CD80 e CD86). O termo "B7-1-lg" ou "B7-1lg" se refere a CD80-lg; otermo "B7-2-lg" ou "B7-2lg" se refere a CD86-lg.

Conforme usado aqui, os termos "CTLA4-lg" ou "molécula deCTLA4-lg" ou "molécula de CTLA4lg" ou "proteína CTLA4-lg" ou "Proteínade CTLA4lg" são usados permutavelmente e se referem a uma molécula deproteína que compreende pelo menos um polipeptídeo de CTLA4-lg tendoum domínio extracelular de CTLA4 e uma região constante de imunoglobuli-na ou porção da mesma. Em algumas modalidades, por exemplo, um poli-peptídeo de CTLA4-lg compreende pelo menos a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 18. Em determinadas modalidades, o domínio extracelularde CTLA4 e a região constante de imunoglobulina ou porção da mesma po-de ser do tipo silvestre ou mutante ou modificada. Um polipeptídeo de C-TLA4-lg mutante é um polipeptídeo de CTLA4-lg compreendendo um domí-nio extracelular de CTLA4 mutante. Uma molécula mutante de CTLA4lgcompreende pelo menos um polipeptídeo de CTLA4-lg mutante. Em algu-mas modalidades, o domínio extracelular de CTLA4 e a região constante deimunoglobulina ou porção da mesma pode ser de mamífero, incluindo de serhumano ou camundongo. Em algumas modalidades, um domínio extracelu-lar de CTLA4 mutante pode ter uma seqüência de aminoácido que é pelomenos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao do-mínio extracelular de CTLA4 mostrado na figura 1 ou SEQ ID NO: 18. Emalgumas modalidades, uma região constante de imunoglobulina mutante ouporção da mesma pode ter uma seqüência de aminoácido que é pelo menos75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à região cons-tante de imunoglobulina (g) conforme mostrado na figura 1. O polipeptídeopode ainda compreender domínios de proteína adicionais. A molécula deCTLA4-lg pode se referir a um monômero do polipeptídeo de CTLA4-lg etambém pode se referir a formas multiméricas do polipeptídeo, tais comodímeros, tetrâmeros e hexâmeros, etc. (ou outras espécies de elevado pesomolecular). Moléculas de CTLA4-lg são também capazes de ligação a CD80e/ou CD86, moléculas de CTLA4-lg incluem moléculas mutantes de CTLAIg1tais como "moléculas de beta polipeptídeos," por exemplo, CTUMa29yl104e-Ig. Por exemplo, CTLA4-lg compreende moléculas de CTLA4-lg e C-TLA4A29YL104E-lg compreende moléculas de beta polipeptídeos (um exemplode moléculas mutantes de CTLA4-lg).

Conforme usado aqui, o termo "domínio extracelular de CTLA4"se refere a um domínio de proteína compreendendo toda ou uma porção daseqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 18, que se liga a B7-1(CD80) e/ou B7-2 (CD86). Em algumas modalidades, um domínio extracelu-lar de CTLA4 pode compreender um polipeptídeo tendo uma seqüência deaminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%ou 99% idêntica aos aminoácidos 27-150 de SEQ ID NO: 2, os quais são osmesmos aminoácidos mostrados em SEQ ID NO: 18. O aminoácido 151 deSEQ ID NO: 2 é um aminoácido de junção.

Conforme usado aqui, o termo "beta polipeptídeo" se refere aum polipeptídeo de CTLA4-lg mutante que (1) compreende seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 18 em que o aminoácido na posição 29 sofreumutação para tirosina e o aminoácido na posição 104 sofreu mutação paraglutamato, opcionalmente com várias mutações adicionais e uma regiãoconstante de imunoglobulina ou uma porção da mesma; e (2) é capaz deligação a CD80 e/ou CD86. Em algumas modalidades, por exemplo, um betapolipeptídeo compreende pelo menos a seqüência de aminoácido do domí-nio extracelular de CTLA4A29YL104E-lg (conforme mostrado em SEQ ID NO:24). Exemplos não-limitativos de beta polipeptídeos incluem belatacept eSEQ ID NOS: 4 e 11-16. Em determinadas modalidades, a região constantede imunoglobulina ou porção da mesma pode ser do tipo silvestre ou mutan-te ou modificada. Em determinadas modalidades, a região constante de i-munoglobulina ou porção da mesma pode ser de mamífero, incluindo de serhumano ou camundongo. Exemplos não-limitativos adicionais de beta poli-peptídeos incluem um beta polipeptídeo compreendendo uma ou mais muta-ções de aminoácido na região constante de imunoglobulina ou porção damesma (por exemplo, substituição de cisteína 120 de SEQ ID NO: 4) e umbeta polipeptídeo compreendendo outras mutações em uma ou mais dasposições de aminoácido 25, 30, 93, 96, 103 ou 105 de SEQ ID NO: 18. Umamolécula de beta polipeptídeo compreende um beta polipeptídeo. Uma mo-lécula de beta polipeptídeo pode se referir a um monômero do beta polipep-tídeo e formas multiméricas do beta polipeptídeo, tais como dímeros, tetrâ-meros e hexâmeros, etc. Por exemplo, belatacept compreende moléculas debeta polipeptídeo. Moléculas de beta polipeptídeo são ainda descritas noPedido Provisório U.S. No. 60/849.543 depositado em 5 de Outubro de2006, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Conforme usado aqui, os termos "glutamato" e "ácido glutâmico"são usados permutavelmente.

Conforme usado aqui, o termo "dímero" se refere a uma proteí-na de CTLA4-lg ou molécula de CTLA4-lg composta de dois polipeptídeosde CTLA4-lg ou monômeros ligados ou unidos juntos. A ligação entre mo-nômeros de um dímero pode ser uma ligação ou interação não covalente,uma ligação ou interação covalente ou ambos. Um exemplo de um dímerode CTLA4-lg é mostrado na figura 4. Uma proteína de CTLA4-lg ou moléculade CTLA4-lg composta de dois monômeros idênticos é um homodímero. Umhomodímero de CTLA4-lg também abrange uma molécula compreendendodois monômeros que podem diferir ligeiramente quanto à seqüência. Umhomodímero abrange um dímero onde os monômeros unidos juntos têmsubstancialmente a mesma seqüência. Os monômeros compreendendo umhomodímero compartilham homologia estrutural considerável. Por exemplo,as diferenças na seqüência podem ser em virtude de modificações de pro-cessamento N-terminais do monômero.

Conforme usado aqui, "mutação conservativa" se refere a umaalteração em uma seqüência de ácido nucleico que substitui um aminoácidopor outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoácidonão polar por outro, tais como isoleucina, valina, Ieucina ou metionina; ousubstituição de um aminoácido polar por outro, tais como substituição dearginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por as-paragina).Conforme usado aqui, "mutação não conservativa" se refere auma alteração em uma seqüência de ácido nucleico que substitui um amino-ácido por outro de uma classe diferente (por exemplo, substituição de umaminoácido básico, tal como lisina, arginina ou histidina, por um aminoácidoácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico). Por exemplo, um ami-noácido pode ser bioquimicamente dissimilar de outro aminoácido baseadono tamanho, carga, polaridade, reatividade ou outras de tais característicasdos aminoácidos.

Conforme usado aqui, "isolado" se refere a uma molécula que étirada de seu ambiente nativo e está em um ambiente diferente daquele noqual a molécula ocorre naturalmente ou uma substância (por exemplo, umaproteína) que é parcial ou completamente recuperada ou separada de outroscomponentes de seu ambiente, de modo que a substância (por exemplo,proteína) é a espécie predominante (por exemplo, espécie de proteína) pre-sente na composição, mistura ou coleção de componentes resultantes (porexemplo, em uma base molar, ela é mais abundante do que qualquer outraespécie individual na composição). Por exemplo, um preparado pode consis-tir em mais de cerca de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95% de CTLA4-lg isolada. "Iso-lada" não exclui misturas de moléculas de CTLA4-lg com outras moléculasde CTLA4-lg do ambiente no qual a molécula ocorre naturalmente. "Isolada"não exclui excipientes farmaceuticamente aceitáveis combinados com C-TLA4-lg, em que a CTLA4-lg foi recuperada de seu ambiente, tal como umacultura de célula, uma cultura em batelada ou um biorreator, etc. Conformeusado aqui, "isolamento" se refere à realização de um processo ou métodopara obter uma molécula de CTLA4-lg isolada.

Conforme usado aqui, o termo "CTLA4 solúvel" significa umamolécula que pode circular in vivo ou CTLA4 a qual não é ligada a umamembrana celular. Por exemplo, a CTLA4 solúvel pode incluir CTLA4-lg aqual inclui a região extracelular de CTLA4 ligada a uma Ig.

Conforme usado aqui, o termo "fração solúvel de uma cultura decélula" se refere à porção líquida de uma outra cultura de célula que não oua qual é substancialmente isenta de componentes insolúveis, em partículasou sólidos da cultura de célula, tais como células, membranas celulares enúcleos. A fração solúvel pode ser, por exemplo, o sobrenadante resultanteapós centrifugação da cultura de célula ou o filtrado resultante após filtraçãoda cultura de célula.

Conforme usado aqui, o termo "cassete de expressão" se referea um ácido nucleico tendo pelo menos a região regulatória 5' (por exemplo,promotor) operavelmente ligada a uma seqüência de nucleotídeo que codifi-ca um polipeptídeo e opcionalmente uma região de término não traduzida 3'(por exemplo, códon terminal e seqüência de poliadenilação). Sob condiçõesapropriadas, um polipeptídeo codificado por um cassete de expressão é pro-duzido pelo cassete de expressão. Um cassete de expressão pode tambémter uma ou mais seqüências de nucleotídeo que objetivam a integração docassete de expressão em um sítio específico no genoma de uma célula hos-pedeira (por exemplo, veja Koduri e outros, (2001) Gene 280: 87-95). Porexemplo, um cassete de expressão de polipeptídeo de CTUMa29yl1 04E-lgderivado de um plasmídeo depositado como No. de Acesso ATCC PTA-2104, é um exemplo de um cassete de expressão que codifica uma C-

TLA4A29YL104E_|g

Conforme usado aqui, o termo "substancialmente purificada" serefere a uma composição compreendendo a molécula de CTLA4-lg ou umapopulação selecionada de moléculas de CTLA4-lg que é removida de seuambiente natural (por exemplo, é isolada) e é pelo menos 90% isenta, 91%isenta, 92% isenta, 93% isenta, 94% isenta, 95% isenta, 96% isenta, 97%isenta, 98% isenta, 99% isenta, 99,5% isenta ou 99,9% isenta de outroscomponentes, tais como material celular ou meio de cultura, com o qual elaestá naturalmente associada. Por exemplo, com relação a uma molécula deproteína de CTLA4-lg recombinantemente produzida, o termo "substancial-mente purificada" pode também se referir a uma composição compreenden-do uma proteína de molécula de CTLA4-lg que é removida do ambiente deprodução, de modo que a molécula de proteína é pelo menos 90% isenta,91% isenta, 92% isenta, 93% isenta, 94% isenta, 95% isenta, 96% isenta,97% isenta, 98% isenta, 99% isenta, 99,5% isenta ou 99,9% isenta de molé-culas de proteína as quais não são polipeptídeos de SEQ ID NO: 2 ou poli-peptídeos mutantes de SEQ ID NO: 2 os quais são de interesse. "Substanci-almente purificada" não exclui misturas de moléculas de CTLA4-lg (tais co-mo dímeros) com outras moléculas de CTLA4-lg (tais como tetrâmeros)."Substancialmente purificada" não exclui excipientes ou veículos farmaceuti-camente aceitáveis combinados com moléculas de CTLA4-lg, em que asmoléculas de CTLA4-lg foram tiradas de seu ambiente nativo.

Conforme usado aqui, o termo "processo em larga escala" éusado permutavelmente com o termo "processo em escala industrial". Otermo "vaso de cultura de semeadura" é usado permutavelmente com "bior-reator", "reator" e "tanque".

Uma "cultura líquida" se refere a células (por exemplo, célulasde bactérias, planta, inseto, Ievedo ou animal) desenvolvidas sobre suportesou desenvolvidas em suspensão em um meio nutriente líquido.

Uma "cultura de semeadura" se refere a uma cultura de céluladesenvolvida de forma a ser usada para inocular volumes maiores de meiode cultura. A cultura de semeadura pode ser usada para inocular volumesmaiores de meios de forma a expandir o número de células em crescimentona cultura (por exemplo, células desenvolvida em suspensão).

Conforme usado aqui, "cultura" se refere ao crescimento de umaou mais células in vitro sob condições definidas ou controladas. Exemplos decondições de cultura as quais podem ser definidas incluem temperatura,mistura de gás, tempo e formulação de meio.

Conforme usado aqui, "expansão" se refere à cultura de uma oumais células in vitro para fins de obtenção de um número maior de célulasna cultura.

Conforme usado aqui, "população" se refere a um grupo de duasou mais moléculas ("população de moléculas") ou células ("população decélulas") que são caracterizadas pela presença ou ausência de uma ou maispropriedades mensuráveis ou detectáveis. Em uma população homogênea,as moléculas ou células na população são caracterizadas pela mesma ousubstancialmente as mesmas propriedades (por exemplo, as células de umalinhagem de célula clonal). Em uma população heterogênea, as moléculasou células na população são caracterizadas por pelo menos uma proprieda-de que é a mesma, onde as células ou moléculas podem também exibir pro-priedades que não são as mesmas (por exemplo, uma população de molé-culas de CTLA4-lg tendo um teor médio de ácido siálico substancialmentesimilar, mas tendo um teor de manose não similar).

Conforme usado aqui, "agregado de espécies de elevado pesomolecular" é usado permutavelmente com "espécies de elevado peso mole-cular" para se referir a uma molécula de CTLA4-lg compreendendo pelo me-nos três monômeros de CTLA4-lg. Por exemplo, um agregado de espéciesde elevado peso molecular pode ser um tetrâmero, um pentâmero ou umhexâmero.

"Rendimento percentual (%)" se refere ao rendimento real dividi-do pelo rendimento teórico e esse valor multiplicado por 100. O rendimentoreal pode ser fornecido como o peso em grama ou em molécula (por exem-plo, um rendimento molar). O rendimento teórico pode ser fornecido como orendimento ideal ou matematicamente calculado.

Conforme usado aqui uma quantidade de MCP-1" se refere a (1)uma quantidade de MCP-1 (Proteína-1 quimiotática de monócito, especial-mente MCP-1 de hamster) sozinha ou (2) uma quantidade de proteína "se-melhante a MCP-1", fragmentos de MCP-1, e/ou fragmentos de proteínashomólogas a MCP-1 (por exemplo, em cada um dos casos antes menciona-dos, conforme pode ser de reação cruzada com um ensaio de anticorpo (porexemplo ELISA policlonal para a detecção de MCP-1). A ausência de MCP-1(e/ou proteínas homólogas a MCP-1, fragmentos de MCP-1 e/ou fragmentosde proteínas homólogas a MCP-1) é considerada onde nenhum limite míni-mo é proporcionado com relação a uma faixa de quantidades de MCP-1.

Conforme usado aqui, "teor de glicosilação" se refere a umaquantidade de resíduos de açúcar N-Iigados ou O-Iigados covalentementepresos a uma molécula de proteína, tal como uma glicoproteína, tal comouma molécula de CTLA4-lg.Conforme usado aqui, o termo "proporção molar de ácido siálicopara proteína" é calculado e fornecido como o número de mois de moléculasde ácido siálico por mois de proteína (moléculas ou dímero de CTLA4-lg).

Conforme usado aqui, o termo "glicoproteína" se refere a umaproteína que é modificada através da adição de um ou mais carboidratos,incluindo a adição de um ou mais resíduos de açúcar.

Conforme usado aqui, o termo "sialilação" se refere à adição deum resíduo de ácido siálico a uma proteína, incluindo uma glicoproteína.

Conforme usado aqui, o termo "isoforma de glicoproteína" serefere a uma molécula caracterizada por seu teor de carboidrato e ácido siá-lico, conforme determinado através de eletroforese em gel de focalizaçãoisoelétrica (IEF) ou outros métodos adequados para distinguir diferentes pro-teínas em uma mistura por seu peso molecular, carga e/ou outras caracterís-ticas. Por exemplo, cada banda distinta observada sobre um gel de IEF re-presenta moléculas que têm um ponto isoelétrico (pl) em particular e, assim,a mesma carga global líquida. Uma isoforma de glicoproteína pode ser umabanda distinta observada sobre um gel de IEF, onde cada banda pode seruma população de moléculas que tem um pl em particular.

"Tolerância imune" se refere a um estado de não responsividadea um antígeno ou grupo de antígenos específico ao qual uma pessoa é nor-malmente responsiva (por exemplo, um estado no qual uma célula T nãopode mais responder ao antígeno).

"Potência" se refere a uma medida da resposta como uma fun-ção da concentração de ligante. Por exemplo, potência agonista é quantifi-cada como a concentração de ligante que produz metade do efeito máximo(EC50). Uma definição farmacológica não Iimitativa de potência inclui compo-nentes de afinidade e eficácia, onde eficácia é capacidade de um fármaco deestimular uma resposta uma vez ligado. Potência está relacionada à afinida-de, mas a potência e a afinidade são diferentes medidas de ação de fármaco.

Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" serefere a um veículo para um agente farmacologicamente ativo. O veículofacilita a distribuição do agente ativo ao local alvo sem terminar a função doagente. Exemplos não-limitativos de formas adequadas do veículo incluemsoluções, cremes, géis, emulsões de gel, geleias, pastas, loções, unguentos,sprays, pomadas, pós, misturas sólidas, aerossóis, emulsões (por exemplo,água em óleo ou óleo em água), soluções aquosas de gel, soluções aquo-sas, suspensões, linimentos, tinturas e emplastros adequados para adminis-tração tópica.

Conforme usado aqui, a frase "composição farmaceuticamenteaceitável" (ou "composição farmacêutica") se refere a uma composição queé aceitável para administração farmacêutica, tal como a um ser humano. Talcomposição pode incluir substâncias que são impuras em um nível não ex-cedendo a um nível aceitável para administração farmacêutica, tal nível in-cluindo uma ausência de tais impurezas) e pode incluir excipientes, veículos,carreadores e outros ingredientes inativos farmaceuticamente aceitáveis, porexemplo, para formular tal composição para facilidade de administração, a-lém de qualquer (quaisquer) agente(s) ativo(s). Por exemplo, uma composi-ção de CTLA4-lg farmaceuticamente aceitável pode incluir MCP-1 ou DNA,desde que essas substâncias estejam em um nível aceitável para adminis-tração a seres humanos.

"Substância de fármaco" é o ingrediente farmacêutico ativo con-tido em uma composição farmacêutica. O termo "substância de fármaco"inclui um ingrediente farmacêutico ativo em solução e/ou na forma tampona-da. "Produto de fármaco" é uma composição farmacêutica contendo subs-tância de fármaco formulada para administração farmacêutica. Para fins dosensaios contidos nos Exemplo e em qualquer parte aqui, a qual possa sereferir a uma substância de fármaco e/ou produto de fármaco, substânciasde fármaco e produtos de fármaco exemplificativos que podem ser ensaia-dos são como segue.

Uma substância de fármaco exemplificativa para moléculas de CTLA4-lg compreendendo SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18, é proteínade CTLA4-lg em uma concentração de 50 mg/mL, em uma solução aquosatamponada (fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5).Um produto de fármaco exemplificativo para moléculas de C-TLA4-lg compreendendo SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18 é 250 mg deproteína de CTLA4-lg liofilizada, 500 mg de maltose, 17,2 mg de fosfato desódio monobásico e 14,6 mg de cloreto de sódio, pH de 7,0 - 8,0; ou

Composição de produto de fármaco de proteína de CTLA4-lg liofilizada (250 mg / frasco)

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Uma substância de fármaco exemplificativa para moléculas deCTLA4-lg compreendendo SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 24 éproteína de CTLA4-lg em uma concentração de 25 mg/ml, em uma soluçãoaquosa tamponada (fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pHde 7,5).

Um produto de fármaco exemplificativo para moléculas de C-TLA4-lg compreendendo SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 24:

Composição de produto de fármaco de CLTA4A29YL104E-lgliofilizada -100 mg / frasco

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Conforme usado aqui, os termos "meio de cultura" e "meio decultura de célula" e "meio de alimentação" e "meio de fermentação" se refe-rem à soluções nutrientes usadas para desenvolvimento ou manutenção decélulas, especialmente células de mamífero. Sem limitação, essas soluçõesproporcionam, comumente, pelo menos um componente de uma ou maisdas seguintes categorias: (1) uma fonte de energia, usualmente na forma deum carboidrato, tal como glicose; (2) todos os aminoácidos essenciais e u-sualmente o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína; (3) vitami-nas e/ou outros compostos orgânicos requeridos em baixas concentrações;

(4) ácidos graxos livres ou lipídios, por exemplo, ácido linoleico; e (5) ele-mentos vestigiais, onde elementos vestigiais são definidos como compostosinorgânicos ou elementos que ocorrem naturalmente que são, tipicamente,requeridos em concentrações muito baixas, usualmente na faixa de micro-molar. A solução nutriente pode ser suplementada eletivamente com um oumais componentes de qualquer uma das seguintes categorias: (1) hormôniose outros fatores de crescimento, tais como soro, insulina, transferrina e fatorde crescimento epidérmico; (2) sais, por exemplo, magnésio, cálcio e fosfato(3) tampões, tal como HEPES; (4) nucleosídeos e bases, tais como adenosi-na, timidina e hipoxantina; (5) proteína e hidrolisatos teciduais, por exemplo,peptona ou misturas de peptona as quais podem ser obtidas de gelatina pu-rificada, material vegetal ou subprodutos animais; (6) antibióticos, tais comogentamicina; (7) agentes protetores de células, por exemplo, poliol pluronic;e (8) galactose.

O termo "inoculação", conforme usado aqui, se refere à adiçãode células a um meio de cultura no início de cultura.

O termo "fase de crescimento" de uma cultura de célula, confor-me usado aqui, se refere ao período de crescimento celular exponencial (porexemplo, a fase log), onde as células estão primariamente em divisão rapi-damente. Durante essa fase, a taxa de aumento na densidade de célulasviáveis é maior do que em qualquer outro ponto de tempo.

Conforme usado aqui, o termo "fase de produção" de uma cultu-ra de célula se refere ao período de tempo durante o qual o crescimento ce-lular está estacionário ou é mantido em ou próximo de um nível constante. Adensidade de células viáveis permanece aproximadamente durante um de-terminado período de tempo. O crescimento de célula logarítmico terminou ea produção de proteína é a atividade primária durante a fase de produção. Omeio, nesse momento, geralmente é suplementado para suportar produçãocontínua de proteína e obter o produto de glicoproteína desejado.

Conforme usado aqui, os termos "expressão" ou "expressa" sãousados para se referir à transcrição e tradução que ocorrem dentro de umacélula. O nível de expressão de um produto genético em uma célula hospe-deira pode ser determinado com base na quantidade de mRNA correspon-dente que está presente na célula ou na quantidade de uma proteína codifi-cada pelo produto genético que é produzido por uma célula ou ambos. Con-forme usado aqui, "glicosilação" se refere à adição de estruturas de oligos-sacarídeos complexos em uma proteína em sítios específicos dentro da ca-deia polipeptídica. Glicosilação de proteínas e o subsequente processamen-to dos carboidratos adicionados pode afetar a estrutura e duplicação da pro-teína, a estabilidade da proteína, incluindo meia-vida da proteína e proprie-dades funcionais de uma proteína. Glicosilação de proteína pode ser divididaem duas classes em virtude do contexto de seqüência onde a modificaçãoocorre: glicosilação N-Iigada e glicosilação O-ligada. Polissacarídeos O-Iigados são ligados a um grupo hidroxila, usualmente ao grupo hidroxila deum resíduo de serina ou treonina. O-glicanas não são adicionadas a cadaresíduo de serina e treonina. Oligossacarídeos O-Iigados são usualmentemono ou biantenários, isto é, eles compreendem uma ou no máximo duasramificações (antenas) e compreendem de um a quatro tipos diferentes deresíduos de açúcar, os quais são adicionados um por um. PolissacarídeosN-Iigados são presos ao nitrogênio da amida de uma asparagina. Apenasasparaginas que são partes de uma de duas seqüências tripeptídicas, querasparagina-X - serina ou asparagina - X - treonina (onde X é qualquer ami-noácido exceto prolina), são alvos para glicosilação. Oligossacarídeos N-Iigados podem ter de uma a quatro ramificações referidas como mono -, bi-,tri- e tetra-antenárias. As estruturas de resíduos de açúcar encontradas emoligossacarídeos O- e N-Iigados são diferentes. A despeito dessa diferença,o resíduo terminal sobre cada ramificação de um polissacarídeo O- e N-ligado pode ser modificado através de uma molécula de ácido siálico, umamodificação referida como revestimento de ácido siálico. O ácido siálico éum nome comum para uma família de monossacarídeos com nove carbonosúnicos, os quais podem ser ligados a outros oligossacarídeos. Dois mem-bros na família são ácido N-acetil neuramínico, abreviado como Neu5Ac ouNANA e ácido N-glicolil neuramínico, abreviado como Neu5Gc ou NGNA. Aforma mais comum de ácido siálico em seres humanos é NANA. Ácido N-acetil neuramínico (NANA) é a espécie de ácido siálico primária presente emmoléculas de CTLA4-lg. Contudo, deve ser notado que níveis mínimos, masdetectáveis de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) também estão presentesem moléculas de CTLA4-lg. Além disso, o método descrito aqui pode serusado para determinar o número de mois de ácido siálico para NANA e NG-NA e, portanto, os níveis de NANA e NGNA são determinados e reportadospara moléculas de CTLA4-lg. Oligossacarídeos O- e N-Iigados têm diferen-tes números de ramificações, as quais proporcionam diferentes números deposições às quais moléculas de ácido siálico podem ser presas. Oligossaca-rídeos N-Iigados podem proporcionar até quatro posições de fixação paraácidos siálicos, enquanto que oligossacarídeos O-Iigados podem proporcio-nar 2 sítios para fixação de ácido siálico.

Conforme usado aqui, o termo "processo em larga escala" podeser usado permutavelmente com o termo "processo em escala industrial".Além disso, o termo "vaso de cultura de semeadura" pode ser usado permu-tavelmente com "biorreator", "reator" e "tanque".

Conforme usado aqui, a frase "solução(ões) de trabalho" se re-fere a soluções que são usadas em um método. Exemplos não-limitativos desoluções de trabalho incluem tampões.

Conforme usado aqui, "material de referência" se refere a ummaterial que é usado como um padrão em um método. Por exemplo, um ma-terial de referência pode ser usado como um padrão com o qual amostrasexperimentais são comparadas.

A ausência de uma substância é considerada onde nenhum limi-te mínimo é proporcionado com relação a uma faixa de quantidades de talsubstância.

Conforme usado aqui, as temperaturas mencionadas em referência à culturade células se referem ao ajuste de temperatura sobre o instrumento que re-gula a temperatura do biorreator. Naturalmente, a temperatura da culturalíquida em si adotará o ajuste de temperatura sobre o instrumento que regulaa temperatura para o biorreator. Onde a temperatura se refere a uma culturade células que é mantida sobre uma prateleira em uma incubadora, a tempe-ratura, então, se refere à temperatura da prateleira da incubadora.Modalidades não Iimitativas da invenção:

A invenção proporciona composições de moléculas de CTLA4-lge composições de moléculas mutantes de CTLA4-lg, tais como C-TUMa29yl104e-Iq. A invenção proporciona composições com determinadascaracterísticas, tais como determinadas quantidades de endotoxina bacteri-ana, bioburden, um pl dentro de uma faixa determinada (ou determinadasbandas de IEF dentro de uma faixa determinada de pl), uma determinadaquantidade de monômero (cadeia simples), dímero ou espécies de elevadopeso molecular (tal como tetrâmero), um determinado padrão de peptídeotríptico, um determinado conjunto de bandas principais sobre SDS-PAGE,um determinado teor de DNA, uma quantidade de MCP-1 não excedendoum determinado máximo, uma quantidade de proteína celular não exceden-do a um determinado máximo, uma quantidade de Triton X-100 não exce-dendo a um determinado máximo, uma quantidade de Proteína A não exce-dendo a um determinado máximo, um determinado perfil de carboidratos N-ligados, uma determinada composição de amino monossacarídeos (GlcNac,GaINAc), uma determinada composição de monossacarídeos neutros (galac-tose, fucose, manose), uma determinada quantidade de ligação a B7, umadeterminada quantidade de atividade em um ensaio celular de inibição de IL-2 e /ou uma determinada composição de ácido siálico (NANA, NGNA), emcada caso onde as referidas determinadas quantidades podem ser uma faixaou faixas. A invenção proporciona composições com qualquer uma das ca-racterísticas antes mencionadas ou mais de uma das características antesmencionadas, até e incluindo todas as características antes mencionadasem qualquer e todas as possíveis permutações ou combinações. A invençãoinclui todas as composições da invenção na forma isolada ou substancial-mente purificada ou não na forma isolada ou substancialmente purificada. Ainvenção proporciona composições as quais são composições farmacêuticas.

Em um aspecto, a invenção é dirigida a um método para obten-ção de uma composição compreendendo uma população isolada de molécu-las de CTLA4-lg de um meio de cultura líquida, o meio compreendendo umapopulação inicial de moléculas de CTLA4-lg, em que (1) moléculas de C-TLA4-lg da população inicial têm um ou mais resíduos de ácido siálico, (2) onúmero de resíduos de ácido siálico por molécula de CTLA4-lg varia dentroda população inicial e (3) a população inicial compreende dímero de CTLA4-Ig e agregado de espécies de elevado peso molecular e o método compre-ende (a) coleta, do meio de cultura líquida, de uma cultura de células demamífero expressando moléculas de CTLA4-lg; (b) separação das molécu-las de CTLA4-lg dos componentes celulares; (c) separação de dímeros deCTLA4-lg de agregados moleculares de espécies de elevado peso molecularde CTLA4-lg; e (d) separação das moléculas de CTLA4-lg em duas ou maisfrações, em que pelo menos uma fração tem uma maior proporção molar deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg comparado com pelo menos umaoutra fração e em que as etapas (b), (c) e (d) são realizadas simultaneamen-te ou em qualquer ordem, de modo a obter a referida composição.

Em uma modalidade do método da invenção, a coleta na etapa(a) compreende obtenção de uma fração solúvel da cultura líquida. Em outramodalidade, as etapas (c) e (d) do método compreendem o uso de cromato-grafia em coluna de modo a obter frações de moléculas de CTLA4-lg tendodiferentes teores de ácido siálico. Em ainda outra modalidade, o método ain-da compreende uso de cromatografia em coluna para reduzir o teor de MCP-1 na composição.

Em algumas modalidades do método da invenção, as moléculasde CTLA4-lg compreendem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2,5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outras modalidades, as moléculas de CTLA4-lg com-preendem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15ou 16.

Em algumas modalidades do método da invenção, a fração em(d) tendo a maior proporção molar de ácido siálico para moléculas de C-TLA4-lg exibe uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 14. Em modalidades específicas, aproporção molar média é de cerca de 8 a cerca de 11, de cerca de 8 a cercade 10 ou de cerca de 8 a cerca de 9.

A invenção proporciona um método para isolamento de molécu-las de CTLA4-lg, o método compreendendo: (i) obtenção de uma fração so-lúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produ-zem composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg; (ii) sujeição dafração solúvel à cromatografia de troca de ânions para obter uma composi-ção eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; (iii) sujeição da compo-sição da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obteruma composição enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-lg; (iv)sujeição da composição de (iii) à cromatografia por afinidade para obter umacomposição adicionalmente enriquecida compreendendo moléculas de C-TLA4-lg; e (v) sujeição da composição de (iv) à cromatografia de troca deânions. Em uma modalidade, a composição obtida na etapa (ii) é caracteri-zada por: (a) uma média de 6,0-10,1 mois de NANA por mol de molécula deCTLA4lg; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,57 por cento de es-pécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg conforme determinado atra-vés de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotomé-trica. Em outra modalidade, a composição obtida na etapa (iii) é caracteriza-da por: (a) uma média de 6,8-11,4 mois de NANA por mol de molécula deCTLA4lg; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento de espé-cies de elevado peso molecular de CTLA4-lg conforme determinado atravésde cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.

Em uma outra modalidade, a composição obtida na etapa (iv) é caracteriza-da por: (a) uma média de 8,0-11,0 mois de NANA por mol de molécula deCTLA4-lg; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento de es-pécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg. Em outra modalidade, acomposição obtida na etapa (v) é caracterizada por: (a) uma média de 8,Ο-11,9 mois de NANA por mol de molécula de CTLA4-lg; e (b) uma área demenos do que ou igual a 2,0 por cento sendo espécies de elevado peso mo-lecular de CTLA4-lg conforme determinado através de cromatografia porexclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica (SPD). Em uma moda-lidade, um exemplo de SPD pode ser a 280 nm.

A presente invenção também proporciona um método para iso-lamento de uma composição de moléculas de CTLA4-lg compreendendo: (i)obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo célu-las de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lg e, em qualquer or-dem, (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo molé-culas de CTLA4-lg; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de intera-ção hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida e eluídacompreendendo moléculas de CTLA4-lg; (iv) sujeição da fração solúvel àcromatografia por afinidade de modo a obter uma composição enriquecida eeluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; e (v) sujeição da fração so-lúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composiçãoenriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg. Em outro as-pecto, a presente invenção proporciona um método para isolamento de umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, o método compreen- dendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreen-dendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lg; (ii) sujei-ção da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions para obter umacomposição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; (iii) sujeição deum produto de proteína da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbi-ca, de modo a obter uma composição enriquecida compreendendo molécu-las de CTLA4-lg; (iv) sujeição de um produto de proteína de (iii) à cromato-grafia por afinidade para obter uma composição adicionalmente enriquecidacompreendendo moléculas de CTLA4-lg; e (v) sujeição de um produto deproteína de (iv) à cromatografia de troca de ânions, de modo a isolar umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a composição compreendendo moléculasde CTLA4-lg obtida na etapa (ii) do método é caracterizada por: (a) umaproporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4lg de 6,0 a 10,1e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento espécies de eleva-do peso molecular de CTLA4-lg conforme determinado através de cromato-grafia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em outramodalidade, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtidana etapa (iii) do método é caracterizada pelo fato de que (a) a área de espé-cies de elevado peso molecular de CTLA4-lg é menos de cerca de 2,5%conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica, (b) proteína celular é menos de cerca de 95ng/ml e (c) MCP-1 é menos de cerca de 5 ppm. Em uma modalidade adicio-nal, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtida na etapa(iii) do método é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de NANApara moléculas de CTLA4-lg de 6,8 a 11,4 e (b) uma área de menos do queou igual a 2,5 por cento espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lgconforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica. Em uma outra modalidade, a composiçãocompreendendo moléculas de CTLA4-lg obtida na etapa (iv) do método écaracterizada por: (a) uma proporção molar média de NANA para moléculasde CTLA4-lg de 8,0 a 11,0 e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5por cento espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg conforme de-terminado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecçãoespectrofotométrica. Em ainda outra modalidade, a composição obtida naetapa (iii) da invenção é caracterizado pelo fato de que a área percentual deespécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg é menos de 2,5% confor-me determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detec-ção espectrofotométrica. Em ainda outra modalidade, a proteína composiçãocompreendendo moléculas de CTLA4-lg na etapa (v) do método é caracteri-zada por: (a) uma proporção molar média de NANA para moléculas de C-TLA4-lg de 8,0 a 11,9 e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,0 porcento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg conforme deter-minado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção es-pectrofotométrica.A invenção também proporciona, em outro aspecto, um métodopara isolamento de uma composição de moléculas de CTLA4-lg, compreen-dendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreen-dendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lg e, emqualquer ordem, (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca deânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatogra-fia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida eeluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; (iv) sujeição da fração solú-vel à cromatografia por afinidade de modo a obter uma composição enrique-cida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; e (v) sujeição da fra-ção solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma com-posição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque a composição obtida na etapa (iii) é caracterizada pelo fato de que opercentual da área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg émenos de cerca de 2,5%, proteína celular é menos de 95 ng/ml e MCP-1 émenos de cerca de 5 ppm.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método pa-ra isolamento de uma composição de moléculas de CTLA4-lg, o métodocompreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquidacompreendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lge, em qualquer ordem, (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de tro-ca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída com-preendendo moléculas de CTLA4-lg; (iii) sujeição da fração solúvel à croma-tografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enrique-cida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; (iv) sujeição da fraçãosolúvel à cromatografia por afinidade de modo a obter uma composição en-riquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg; e (v) sujeição dafração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter umacomposição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg,em que a composição obtida na etapa (iii) é caracterizado pelo fato de que opercentual da área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg émenos de cerca de 2,5%, proteína celular é menos de 95 ng/ml, MCP-1 émenos de cerca de 5 ppm e a proporção molar média de NANA para molé-culas de CTLA4-lg é de cerca de 8,0 a cerca de 12.

Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da eta-pa (ii) do método é realizada usando um tampão de lavagem compreenden-do HEPES a cerca de 75 mM e NaCI a cerca de 360 mM e tendo um pH decerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions daetapa (ii) da invenção é realizada usando um tampão de eluição compreen-dendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 850 mM e tendo um pHde cerca de 7,0. Em uma modalidade adicional, a cromatografia de interaçãohidrofóbica da etapa (iii) do método é realizada usando um único tampão delavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 850mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma outra modalidade, a cromato-grafia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usando um tampãode lavagem compreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 250mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em ainda outra modalidade, a cromato-grafia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usando um tampãode eluição compreendendo glicina a cerca de 100 mM e tendo um pH decerca de 3,5. Em ainda outra modalidade, a cromatografia de troca de â-nions da etapa (v) do método é realizada usando um tampão de lavagemcompreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI de cerca de 120 mM aNaCI a cerca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em ainda outramodalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) do método érealizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de25 mM e NaCI a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em aindaoutra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) do méto-do é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânionscompreendendo um grupo funcional amina primária, secundária, terciária ouquaternária. Em uma modalidade específica, a resina compreende um grupofuncional amina quaternária. Em ainda outra modalidade, a cromatografia deinteração hidrofóbica da etapa (iii) do método é realizada usando uma resinade interação hidrofóbica compreendendo um grupo funcional fenila, octila,propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma modalidade específica, o grupofuncional compreende um grupo funcional fenila. Em ainda outra modalida-de, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usandouma resina de cromatografia por afinidade compreendendo Proteína A.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método pa-ra preparo de uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg,compreendendo purificação de moléculas de CTLA4-lg de uma cultura decélula líquida, em que uma composição purificada de CTLA4-lg compreende(a) uma quantidade farmaceuticamente aceitável de MCP-1 por mg de molé-cuias de CTLA4-lg e (b) uma área de menos do que 2,5% de espécies deelevado peso molecular de CTLA4-g conforme determinado através de cro-matografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Emuma modalidade, a quantidade farmaceuticamente aceitável de MCP-1 com-preende cerca de 40 a cerca de 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg. Emoutra modalidade, a quantidade farmaceuticamente aceitável de MCP-1compreende cerca de 35 a cerca de 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg.Em uma modalidade adicional, a quantidade farmaceuticamente aceitável deMCP-1 compreende cerca de 10 a cerca de 0,5 ng/mg de moléculas de C-TLA4-lg. Em uma outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa(iv) do método é realizada usando uma coluna compreendendo uma resinacapaz de reduzir a MCP-1 no produto de proteína eluído. Em ainda outramodalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) do méto-do é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica, em que a resinaé capaz de (a) separação de dímeros de CTLA4-lg de espécies de elevadopeso molecular de CTLA4-lg; (b) aumento do teor de ácido siálico das molé-culas eluídas de CTLA4-lg; ou (c) ambos (a) e (b). Em ainda outra modalida-de, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) ou etapa (iv) ou ambas,é realizada usando uma resina de troca de ânions, em que a resina é capazde (a) diminuir o teor de agregados de espécies de elevado peso molecularde CTLA4-lg da composição eluída; (b) aumentar o teor de ácido siálico dacomposição eluída; ou (c) ambos (a) e (b).

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para iso-lamento de uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, o mé-todo compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma culturalíquida compreendendo células de mamífero que produzem moléculas deCTLA4-lg e, em qualquer ordem; (ii) sujeição da fração solúvel à cromato-grafia por afinidade de modo a obter uma composição eluída compreenden-do moléculas de CTLA4-lg; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia detroca de ânions de modo a obter uma composição eluída e enriquecida com-preendendo moléculas de CTLA4-lg; e (iv) sujeição da fração solúvel à cro-matografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição eluí-da e enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-lg. Em uma modali-dade, a cromatografia por afinidade etapa é realizada primeiro. Em outramodalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) do método é realiza-da usando uma resina compreendendo Proteína A. Em uma modalidade adi-cional, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando umtampão de eluição compreendendo guanidina. Em uma outra modalidade, acromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão deeluição compreendendo uréia. Em ainda outra modalidade, a cromatografiapor afinidade da etapa (ii) resulta em um aumento em dímeros de CTLA4-lgna composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-lg.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método pa-ra isolamento de composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg delíquido coletado de uma cultura de células de mamífero, em que as célulasproduzem moléculas de CTLA4-lg, o método compreendendo: (i) obtençãode uma fração solúvel do líquido coletado; (ii) sujeição da fração solúvel àcromatografia por afinidade para obter uma composição eluída compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg; (iii) sujeição da composição da etapa (ii) àcromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição eluída eenriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-lg; e (iv) sujeição da com-posição da etapa (iii) à cromatografia de interação hidrofóbica para obteruma composição adicionalmente enriquecida compreendendo moléculas deCTLA4-lg. Em uma modalidade, a composição obtida na etapa (iv) do méto-do é caracterizada pelo fato de que o percentual de espécies de elevadopeso molecular é uma área de menos do que cerca de 2,5% conforme de-terminado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecçãoespectrofotométrica e o percentual de proteína celular é menos de cerca de95 ng/ml e o percentual de MCP-1 é menos de cerca de 5 ppm. Em outramodalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada u-sando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM eNaCI a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em uma modalidadeadicional, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usan-do um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCIa cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em uma modalidade es-pecífica, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizadausando uma resina de interação hidrofóbica compreendendo um grupo fun-cional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma outra modali-dade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iv) é realizada u-sando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e(NH4)2SO4 a cerca de 1,2 M e tendo um pH de cerca de 7. Em ainda outramodalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usandoum tampão de lavagem compreendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCIa cerca de 150 mM e tendo um pH de cerca de 7,5. Em ainda outra modali-dade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tam-pão de eluição compreendendo glicina a cerca de 250 mM e tendo um pH decerca de 3. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da e-tapa (iii) é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânionscompreendendo um grupo funcional amina primária, secundária, terciária ouquaternária. Em uma modalidade específica, a resina compreende um grupofuncional amina quaternária.

Em uma modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbicada etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica com-preendendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoami-Ia. Em uma modalidade, o grupo funcional compreende um grupo funcionalfenila. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é rea-lizada usando uma resina compreendendo Proteína A. A invenção propor-ciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtida atra-vés de qualquer um dos métodos da invenção. Em uma modalidade, a com-posição compreende um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7,8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais po-lipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. A invenção pro-porciona um plasmídeo de expressão de CTLA4-lg tendo a seqüência deácido nucleico de SEQ ID NO: 17. A invenção proporciona uma composiçãosubstancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácidosiálico para proteína de CTLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de 18. A invençãoproporciona uma composição substancialmente purificada compreendendomoléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma propor-ção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de5,5 a cerca de 9,5.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 5 a cerca de 10. A invenção proporciona umacomposição substancialmente purificada compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 18. Ainvenção proporciona uma composição substancialmente purificada compre-endendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têmuma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 8 a cerca de 18.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 12. A invenção proporciona umacomposição substancialmente purificada compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 11. Ainvenção proporciona uma composição substancialmente purificada compre-endendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têmuma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 7 a cerca de 12.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 7 a cerca de 11. A invenção proporciona umacomposição substancialmente purificada compreendendo moléculas de Ο-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 18.A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada com-preendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têmuma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 12 a cerca de 18,

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 13 a cerca de 18. A invenção proporciona umacomposição substancialmente purificada compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 14 a cerca de 18.A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada com-preendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têmuma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 15 a cerca de 17.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 16. A invenção proporciona uma composição subs-tancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que asmoléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média de ácido siálicopara moléculas de CTLA4-lg de cerca de 10. A invenção proporciona umacomposição substancialmente purificada compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6. Em uma modali-dade, o ácido siálico é ácido N-acetil neuramínico (NANA). A invenção pro-porciona uma composição substancialmente purificada compreendendo mo-léculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporçãomolar média de NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de12. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificadacompreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lgtêm uma proporção molar média de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) pa-ra moléculas de CTLA4-lg de menos do que ou igual a cerca de 1,5.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg têm uma proporção molar média de NGNA para moléculas de C-TLA4-lg de cerca de 0,5 a cerca de 1,5. A invenção proporciona uma com-posição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig1 em que as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deNGNA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 1,0 a cerca de 1,5. A inven-ção proporciona uma composição substancialmente purificada compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cer-ca de 6 a cerca de 18.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siáli-co por mol de moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12.

A invenção proporciona uma composição substancialmente puri-ficada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeoda molécula compreende seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16e em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporçãomolar média de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-lg de cerca de5,5 a cerca de 9,5. Em uma modalidade, a proporção molar de ácido siálicopor mol de moléculas de CTLA4-lg é determinada através de hidrólise ácidae HPLC. Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-lg compreendem umou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-lg compreendemum ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Ainvenção proporciona uma composição substancialmente purificada compre-endendo moléculas de CTLA4-lg, em que mais de ou igual a 95% das molé-culas de CTLA4-lg são dímeros de CTLA4-lg. Em uma modalidade, mais deou igual a 98% das moléculas de CTLA4-lg são dímeros de CTI_A4-lg. Emuma modalidade, mais de ou igual a 99% das moléculas de CTLA4-lg sãodímeros de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, mais de ou igual a 99,5% das moléculasde CTLA4-lg são dímeros de CTLA4-lg. Em uma modalidade, de cerca de95% a cerca de 99,5% das moléculas de CTLA4-lg são dímeros de CTLA4-Ig e uma área de cerca de 0,5 por cento a uma área de cerca de 5 por centodas moléculas são espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg con-forme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e de-tecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, cerca de 98,6% das molé-cuias são dímeros de CTLA4-lg e uma área de cerca de 1,2 por cento dasmoléculas são espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg e uma áreade menos do que cerca de 0,7 por cento das moléculas são monômeros deCTLA4-lg conforme determinado através de cromatografia por exclusão detamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, cerca demenos do que 0,3% das moléculas são multímeros compreendendo cinco oumais monômeros de CTLA4-lg. A invenção proporciona uma composiçãoconsistindo essencialmente em dímeros de CTLA4-lg. A invenção proporcio-na uma composição consistindo essencialmente em moléculas de CTLA4-lg,em que a população é substancialmente isenta de monômeros de CTLA4-lg.

A invenção proporciona uma composição consistindo essencialmente emmoléculas de CTLA4-lg, em que a população é substancialmente isenta deespécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg. A invenção proporcionauma composição consistindo essencialmente em monômeros de CTLA4-lgsubstancialmente isenta de dímeros e espécies de elevado peso molecularde CTLA4-lg. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de C-TLA4-lg tem pelo menos 3 grupos ácido siálico. Em uma modalidade, cadamonômero de cada dímero de CTLA4-lg tem pelo menos 2,5 grupos ácidosiálico. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-lgtem de pelo menos 3 grupos ácido siálico a pelo menos 8 grupos ácido siáli-co.

Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de Ο-TLA4-lg tem de pelo menos 2,5 grupos ácido siálico a pelo menos 5 gruposácido siálico. Em uma modalidade, cada dímero compreende dois polipeptí-deos de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeo tem uma seqüência de amino-ácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5-16. Em umamodalidade, a composição compreende um ou mais polipeptídeos tendoSEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a composição com-preende um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15ou 16. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendotetrâmeros de CTLA4-lg, a qual é substancialmente isenta de dímeros deCTLA4-lg. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendotetrâmeros de CTLA4-lg a qual é substancialmente isenta de monômeros deCTLA4-lg. Em uma modalidade, a composição existe como uma quantidadeque é mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada tetrâmerocompreende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-lg, em que cada polipep-tídeo tem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindoem SEQ ID NOS: 5-10. Em uma modalidade, cada tetrâmero compreendedois pares de polipeptídeos de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeo temuma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNOS: 11-16. Em uma modalidade, cada tetrâmero é capaz de ligação a umCD80 ou CD86. A invenção proporciona uma composição farmaceuticamen-te aceitável compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composiçãoé substancialmente isenta de MCP-1. A invenção proporciona uma composi-ção farmaceuticamente aceitável compreendendo moléculas de CTLA4-lg,em que a composição compreende não mais do que cerca de 25 ppm deMCP-1. Em uma modalidade, a composição compreende não mais do que10 ppm de MCP-1. Em uma modalidade, a composição compreende cercade 0,2 ng/ml de MCP-1 a cerca de 10 ng / ml de MCP-1. Em uma modalida- de, a invenção proporciona uma composição farmaceuticamente aceitávelcompreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende(a) de cerca de 0,2 ng/ml de MCP-1 a cerca de 10 ng/ml de MCP-1 e (b) nãomais do que 25 ng/ml de proteína de CHO ou não mais do que 10 ng/ml deproteína de CHO. Em uma modalidade, a composição compreende não maisdo que cerca de 20 pg/ml de DNA.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do moléculas de CTLA4-lg em que, quando administrada a um indivíduo emuma dose intravenosa de cerca de 10 mg/kg, as moléculas de CTLA4-lg sãocapazes de exibir: uma área sob a curva (AUC) de cerca de 44400 μg.h/ml;um volume de distribuição de cerca de 0,09 L/kg; uma concentração de pico(Cmax) de cerca de 292 μg/ml; e uma taxa de eliminação de cerca de 0,23ml/h/kg. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendomoléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende isoformas domi-nantes de moléculas de CTLA4-lg visualizáveis sobre um gel de focalizaçãoisoelétrica o qual tem um ponto isoelétrico, pl, menor do que ou igual a 5,1 ±0,2 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma moda-lidade, o pl médio da composição aumenta após tratamento com neuramini-dase. Em uma modalidade, pelo menos 40% das moléculas de CTLA4-lgexibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 ± 0,2conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalida-de, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétri-co de menos do que ou igual a cerca de 5,1 ± 0,2 conforme determinadoatravés de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 90%das moléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétrico de menos do queou igual a cerca de 5,1 ± 0,2 conforme determinado através de focalizaçãoisoelétrica. A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,0± 0,2. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo mo-léculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 4,3 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 3,3 ± 0,2 a cerca de 4,7± 0,2. Em uma modalidade, a composição é substancialmente purificada. Ainvenção proporciona um método para preparo de uma composição, a com-posição compreendendo uma molécula de CTLA4-lg com um pl de cerca de3,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição deuma mistura de moléculas de CTLA4-lg à eletroforese em gel de focalizaçãoisoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma populaçãode moléculas de CTLA4-lg com um pl em particular e (b) isolamento da po-pulação de moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 3,0 ± 0,2 a cer-ca de 5,0 ± 0,2 de modo a preparar uma composição. A invenção proporcio-na uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobreum gel de focalização isoelétrica o qual tem um ponto isoelétrico, pl, menordo que ou igual a 5,5 ± 0,2 conforme determinado através de focalizaçãoisoelétrica. Em uma modalidade, o pl médio da composição aumenta apóstratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, pelo menos 40% dasmoléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétrico de menos do que ouigual a cerca de 5,3 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoe-létrica. Em uma modalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-lgexibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 ± 0,2conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalida-de, pelo menos 90% das moléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétri-co de menos do que ou igual a cerca de 5,3 ± 0,2 conforme determinadoatravés de focalização isoelétrica. A invenção proporciona uma composiçãoisolada compreendendo moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 3,0± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 4,5 + 0,2 a cerca de 5,2± 0,2. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo mo-léculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 4,7 ± 0,2 a cerca de 5,1 ± 0,2.Em uma modalidade, a composição é substancialmente purificada.

A invenção proporciona um método para preparo de uma com-posição, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg com um plde cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2, o método compreendendo: (a)sujeição de uma mistura de moléculas de CTLA4-lg à eletroforese em gel defocalização isoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa umapopulação de moléculas de CTLA4-lg com um pl em particular e (b) isola-mento da população de moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2 de modo a preparar uma composição. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molarmédia de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 17 a cerca de28. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por umaproporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de17 a cerca de 25. A invenção proporciona uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracteriza-das por uma proporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lgde cerca de 15 a cerca de 35.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeo da molécula compreende aseqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculasde CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar média de GIcNAcpara moléculas de CTLA4-lg de cerca de 24 a cerca de 28. A invenção pro-porciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em queas moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar mé-dia de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6.A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a seqüência deSEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-lgsão caracterizadas por uma proporção molar média de GaINAc para molécu-las de CTLA4-lg de cerca de 2,7 a cerca de 3,6.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadaspor uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-lgde cerca de 8 a cerca de 17. A invenção proporciona uma composição com-preendendo moléculas de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeo da moléculacompreende a seqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em queas moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar mé-dia de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 13.

A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por umaproporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de3,5 a cerca de 8,3.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeo da molécula compreende aseqüência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculasde CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar média de fucosepara moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6,4 a cerca de 7,0. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molarmédia de manose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 7,7 a cerca de22. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a seqüênciade SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-lgsão caracterizadas por uma proporção molar média de manose para molécu-las de CTLA4-lg de cerca de 14 a cerca de 16.

Em uma modalidade, a proporção molar de GIcNAc para molé-culas de CTLA4-lg é determinada através de eletroforese capilar. Em umamodalidade, a proporção molar de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg édeterminada através de eletroforese capilar. Em uma modalidade, a propor-ção molar de galactose para moléculas de CTLA4-lg é determinada atravésde eletroforese capilar.Em uma modalidade, a proporção molar de fucose para molécu-las de CTLA4-lg é determinada através de eletroforese capilar. Em uma mo-dalidade, a proporção molar de manose para moléculas de CTLA4-lg é de-terminada através de eletroforese capilar. Em uma modalidade, as molécu- Ias de CTLA4-lg são obtidas através de fixação enzimática de um ou maiscarboidratos à molécula. A invenção proporciona uma composição compre-endendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas compreendem resí-duos de carboidrato presos às moléculas enzimaticamente in vitro. A inven-ção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc para molécu-las de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; e (b) uma proporção molarmédia de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc paramoléculas de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporçãomolar média de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cer-ca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cer-ca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc para mo-léculas de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção mo-lar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cercade 17; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas deCTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma compo-sição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) umaproporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar médiade galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d)uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-lg de cercade 3,5 a cerca de 8,3; e (e) uma proporção molar média de ácido siálico paramoléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporcionauma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por:(a) uma proporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg decerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc paramoléculas de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporçãomolar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cer-ca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de C-TLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média demanose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; e (f)uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compre-endendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molarmédia de GlcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 24 a cerca de28; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de Ο-TLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de 9,5. A invenção proporciona uma com-posição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) umaproporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GaINAc para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar mé-dia de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de9,5. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc paramoléculas de CTLA4-lg de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporçãomolar média de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 2,7 a cer-ca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas deCTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 13; e (d) uma proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de 9,5.

A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de C-TLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc paramoléculas de CTLA4-!g de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporçãomolar média de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 2,7 a cer-ca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas deCTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média defucose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; e (e)uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 5,5 a cerca de 9,5. A invenção proporciona uma composição com-preendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporçãomolar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 24 a cercade 28; (b) uma proporção molar média de GaINAc para moléculas de C-TLA4-lg de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 13; (d)uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-lg de cercade 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manose para pro-teína de CTLA4-lg de cerca de 14 a cerca de 16; e (f) uma proporção molarmédia de ácido siálico para proteína de CTLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de9,5.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são glicosiladas emum resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 2 ou4, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 2ou 4, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO:2 ou 4, um resíduo de aminoácido serina na posição 155 de SEQ ID NO: 2ou 4 ou um resíduo de aminoácido serina na posição 165 de SEQ ID NO: 2ou 4. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculasde CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são glicosiladas e em quepelo menos cerca de 2 % da massa total de glicosilação é glicosilação O-ligada.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que a composição exibe um pico por cromatogramade NGNA de cerca de 9,6 ± 0,3 e um pico por cromatograma de NANA decerca de 10,5 ± 0,3. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg exibemum perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 68. Ainvenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA-Ig exibem um perfil de carboidratoconforme mostrado na figura 68. A invenção proporciona uma composiçãoconsistindo essencialmente em moléculas de CTLA4-lg, em que as molécu-las de CTLA4-lg exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - IV, em que o Domínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio Il compreende picos os quais representam oligossaca-rídeos monossialilados, o Domínio Ill compreende picos os quais represen-tam oligossacarídeos dissialilados, o Domínio IV compreende picos os quaisrepresentam oligossacarídeos trissialilados e Domínio V compreende picos os quais representam oligossacarídeos tetrassialilados e em que o perfil éum cromatograma de oligossacarídeos liberados de CTLA4-lg. Em uma mo-dalidade, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-Iigadosentre um primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio Il é decerca de 10 a cerca de 12 minutos. Em uma modalidade, a diferença nostempos de retenção de oligossacarídeos N-Iigados entre um primeiro pico noDomínio I e um pico principal no Domínio Il é de cerca de 11 a cerca de 13minutos. Em uma modalidade, glicosilação dos Domínios Ill e IV compreen-de cerca de 25% a cerca de 36% de glicosilação N-Iigada conforme medidoatravés de HPAEC. Em uma modalidade, glicosilação do Domínio I compre- ende cerca de 24,5% a cerca de 35,2% de glicosilação N-Iigada conformemedido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosilação do Domínio Ilcompreende cerca de 26,3% a cerca de 34,1% de glicosilação N-Iigada con-forme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosilação do Do-mínio Ill compreende cerca de 21,9% a cerca de 31,5% de glicosilação N-ligada conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosila-ção do Domínio IV e Domínio V compreende cerca de 7,9% a cerca de18,6% de glicosilação N-Iigada conforme medido através de HPAEC.

Em uma modalidade: (a) o Domínio I exibe uma área percentualde pelo menos cerca de 31; (b) o Domínio Il exibe uma área percentual de pelo menos cerca de 33; (c) o Domínio Ill exibe uma área percentual de pelomenos cerca de 24; (iv) o Domínio IV exibe uma área percentual de pelomenos cerca de 9,4, (ν) o Domínio V exibe uma área percentual de pelo me-nos cerca de 67; ou em que a área é medida a partir de um cromatogramade oligossacarídeos liberados de CTLA4-lg.

Em uma modalidade: (a) o Domínio I exibe pelo menos cerca depicos; (b) o Domínio Il exibe pelo menos cerca de 5 picos; (c) o Domínio Illexibe pelo menos cerca de 5 picos; (d) o Domínio IV exibe pelo menos cercade 6 picos ou (e) o Domínio V exibe pelo menos cerca de 6 picos e em queos picos são exibidos sobre um cromatograma. A composição em que oDomínio I exibe pelo menos dois picos, em que um primeiro pico tem umaárea mínima de cerca de 4,5% e uma área máxima de cerca de 11,2% e emque um segundo pico tem uma área mínima de cerca de 8,7% e um máximode cerca de 11,8%.

Em uma modalidade, os Domínios Ill e IV exibem uma área per-centual de cerca de 25% a cerca de 36% conforme medido através de HPA-EC. Em uma modalidade, o Domínio I exibe uma área percentual de cercade 24,5% a cerca de 35,2% conforme medido através de HPAEC. Em umamodalidade, o Domínio Il exibe uma área percentual de cerca de 26,3% acerca de 34,1% conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade,o Domínio Ill exibe uma área percentual de cerca de 21,9% a cerca de31,5% conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, o Domi-nio IV exibe uma área percentual de cerca de 7,9% a cerca de 18,6% con-forme medido através de HPAEC.

A invenção proporciona uma composição compreendendo poli-peptídeos de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 80% dos polipeptídeos têmglicosilação N-Iigada biantenária; (b) cerca de 14% dos polipeptídeos têmglicosilação N-Iigada tri-antenária; e (c) cerca de 6% dos polipeptídeos têmglicosilação N-Iigada tetra-antenária. Em uma modalidade, a glicosilação N-Iigada é determinada através de cromatografia de troca de ânions em pHelevado com detecção amperométrica pulsada (HPEAC-PAD). A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg ca-racterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; e (b) uma proporção molar médiade NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A inven-ção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lgcaracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para molé-culas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molarmédia de NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; e(c) uma área percentual de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 3% conforme determinado através de croma-tografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. A inven-ção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lgcaracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para molé-culas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molarmédia de NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; e(c) uma proporção molar média de NGNA para moléculas de CTLA4-lg demenos do que ou igual a cerca de 1,5.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (b) umaproporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6a cerca de 12; (c) uma área de teor de agregados de espécies de elevadopeso molecular de CTLA4-lg de menos do que cerca de 3 por cento confor-me determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detec-ção espectrofotométrica; e (d) um perfil de carboidrato substancialmente omesmo conforme aquele da figura 68. A invenção proporciona a composiçãocompreendendo moléculas de CTI_A4-lg caracterizada por: (a) uma propor-ção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 acerca de 17; (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas deCTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; (c) uma área de teor de agregadosde espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg de menos do que cercade 3 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusãode tamanho e detecção espectrofotométrica; e (d) um teor de glicosilação noDomínios III, IV e V de pelo menos cerca de 29,8% a cerca de 50,1% de gli-cosilação N-Iigada conforme determinado através de HPAEC. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg ca-racterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculasde CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar médiade NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; e (c)uma área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg de menos do que cerca de 3 por cento conforme determinado através de cromatografiapor exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modali-dade, as moléculas são ainda caracterizadas por uma proporção molar mé-dia de NANA para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 12.

Em uma modalidade, as moléculas são ainda caracterizadaspor: (a) cerca de 80% de glicosilação N-Iigada biantenária; (b) cerca de 14%glicosilação N-Iigada tri-antenária; e (c) cerca de 6% de glicosilação N-Iigadatetra-antenária. Em uma modalidade, as moléculas ainda compreendemqualquer combinação de um ou mais de: (a) a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 10 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (b) a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 7 (metionina na posição de aminoácido 27 e Iisina na posiçãode aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); (c) a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 9 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição deaminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); e (d) a seqüência de aminoácido de SEQID NO: 6 (alanina na posição de aminoácido 26 e Iisina na posição de ami-noácido 383 de SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade, (a) cerca de 90% dasmoléculas compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 co-meçando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% das moléculascompreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começandocom a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% das moléculas com-preendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com aIisina no resíduo número 383; e (d) cerca de 96% das moléculas compreen-dem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicinano resíduo número 382. A invenção proporciona uma composição compre- endendo polipeptídeos de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 80 % dos polipep-tídeos têm glicosilação N-Iigada biantenária; (b) cerca de 14 % dos polipep-tídeos têm glicosilação N-Iigada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptí-deos têm glicosilação N-Iigada tetra-antenária; e (d) uma proporção molarmédia de NGNA para moléculas de CTLA4-lg de menos do que ou igual a1,5. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeosde CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 80 % dos polipeptídeos têm glicosilaçãoN-Iigada biantenária; (b) cerca de 14 % dos polipeptídeos têm glicosilação N-Iigada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptídeos têm glicosilação N-Iigada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de GIcNAc para mo-léculas de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35. A invenção proporcionauma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-lg, em que: (a)cerca de 80% dos polipeptídeos têm glicosilação N-Iigada biantenária; (b)cerca de 14% dos polipeptídeos têm glicosilação N-Iigada tri-antenária; (c)cerca de 6% dos polipeptídeos têm glicosilação N-Iigada tetra-antenária; e(d) uma proporção molar média de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg decerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma composição com-preendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporçãomolar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 acerca de 13; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico para molécu-las de CTLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de 9,5.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-cuias de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 13; (b)uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 5,5 a cerca de 9,5; e (c) uma área de espécies de elevado pesomolecular de CTLA4-lg de menos do que cerca de 5 por cento conforme de-terminado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecçãoespectrofotométrica. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molarmédia de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de13; (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de C-TLA4-lg de cerca de 5,5 a cerca de 9,5; (c) uma área de teor de espécies deelevado peso molecular de CTLA4-lg de menos do que cerca de 5 por centoconforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica; e (d) um perfil de carboidrato substancialmen-te o mesmo conforme aquele da figura 68. A invenção proporciona umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a)uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg decerca de 11 a cerca de 13; (b) uma proporção molar média de ácido siálicopara moléculas de CTLA4-lg de 5,5 a cerca de 9,5; (c) uma área de teor deespécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg de menos do que cerca de5 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusão detamanho e detecção espectrofotométrica; e (d) um teor de glicosilação noDomínios III, IV e V de pelo menos cerca de 29,8% a cerca de 50,1% de gli-cosilação N-Iigada conforme determinado através de HPAEC.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 11 a cerca de 13; (b)uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg decerca de 5,5 a cerca de 9,5; e (c) um teor de espécies de elevado peso mo-lecular de CTLA4-lg de menos do que cerca de 5 por cento conforme deter-minado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção es-pectrofotométrica. Em uma modalidade, as moléculas são ainda caracteriza-das por: (a) cerca de 80% de glicosilação N-Iigada biantenária; (b) cerca de14% de glicosilação N-Iigada tri-antenária; e (c) cerca de 6% de glicosilaçãoN-Iigada tetra-antenária, em outra modalidade, as moléculas ainda compre-endem qualquer combinação de um ou mais de: (a) a seqüência de aminoá-cido de SEQ ID NO: 16 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina naposição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); (b) a seqüência de aminoáci-do de SEQ ID NO: 13 (metionina na posição de aminoácido 27 e Iisina naposição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (c) a seqüência de aminoáci-do de SEQ ID NO: 15 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na po-sição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); e (d) a seqüência de aminoáci-do de SEQ ID NO: 12 (alanina na posição de aminoácido 26 e Iisina na posi-ção de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4), em outra modalidade, (a) cercade 90% das moléculas compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 4 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% das mo-léculas compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 come-çando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% das moléculascompreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando coma Iisina no resíduo número 383; e (d) cerca de 96% das moléculas compre-endem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a gli-cina no resíduo número 382. A invenção proporciona uma composição com-preendendo polipeptídeos de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 80 % dos poli-peptídeos têm glicosilação N-Iigada biantenária; (b) cerca de 14 % dos poli-peptídeos têm glicosilação N-Iigada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos poli-peptídeos têm glicosilação N-Iigada tetra-antenária; e (d) uma proporção mo-lar média de GIcNAc por mol de proteína de CTLA4-lg de cerca de 24 a cer-ca de 28. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipep-tídeos de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 80 % dos polipeptídeos têm glico-silação N-Iigada biantenária; (b) cerca de 14 % dos polipeptídeos têm glicosi-lação N-Iigada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptídeos têm glicosila-ção N-Iigada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de GaINAcpara moléculas de CTLA4-lg de cerca de 2,7 a cerca de 3,6, em outra moda-lidade, a composição é uma composição substancialmente purificada. A in-venção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que menos de ou igual a cerca de 2,5 % das moléculas de CTLA4-lgsão oxidadas. A invenção proporciona uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, em que menos de ou igual a cerca de 2,0 % dasmoléculas de CTLA4-lg são desamidadas. A invenção proporciona umacomposição compreendendo dímeros de moléculas de CTLA4-lg, em quepelo menos 0,5 % dos dímeros de moléculas de CTLA4-lg são cisteinilados.Em uma modalidade, pelo menos 1,0% dos dímeros de moléculas de C-TLA4-lg são cisteinilados. A invenção proporciona uma população de molé-culas de CTLA4-lg, em que a população exibe um perfil de espectrometriade massa substancialmente o mesmo conforme na figura 64, 65 ou 67. Ainvenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg, em que apopulação exibe um perfil de eletroforese capilar substancialmente o mesmoconforme na figura 48.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que a composição é caracterizada por: (a) uma pro-porção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 15a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc para moléculas deCTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) umaproporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose para molécu-Ias de CTLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar mé-dia de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de12; (g) um pl, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel defocalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ±0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 3 ppm; (i) uma área de menos doque 2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular conforme determi-nado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espec-trofotométrica; (j) uma área de menos do que 0,5 por cento de monômeroconforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica; (k) polipeptídeos de CTLA4-lg tendo um ami-noácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 5-10; (I)moléculas de CTLA4-lg capaz de ligação a CD80 e CD86. A invenção pro-porciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em quea população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar mé-dia de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35;(b) uma proporção molar média de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg decerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactosepara moléculas de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporçãomolar média de fucose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cercade 8,3; (e) uma proporção molar média de manose para moléculas de C-TLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; (g)um pl, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focali-zação isoelétrica, em uma faixa de cerca de 3,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2;(h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm; (i) uma área de menos do que2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular conforme determinadoatravés de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofo-tométrica; (j) uma área de menos do que 0,5 por cento de monômero con-forme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e de-tecção espectrofotométrica; (k) polipeptídeos de CTLA4-lg tendo um amino-ácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 5-10; (I)moléculas de CTLA4-lg capaz de ligação a CD80 e CD86; ou equivalentesfarmacêuticos dos mesmos.

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do moléculas de CTLA4-lg tendo uma incidência de imunogenicidade demenos do que ou igual a 7,4%. Em uma modalidade, a incidência de imuno-genicidade é de cerca de 2,1% a cerca de 7,4%. Em uma modalidade, a in-cidência de imunogenicidade é menos de ou igual a 3,7%. Em uma modali-dade, a incidência de imunogenicidade é menos de ou igual a 3,0%. Em umamodalidade, a incidência de imunogenicidade é de cerca de 2,8% a cerca de3,0%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo mo-léculas de CTLA4-lg em que, após administração da composição a sereshumanos, a produção de anticorpos que se ligam às moléculas de CTLA4-lgocorre em uma incidência, em seres humanos, de menos do que ou igual a7,4%. Em uma modalidade, a incidência é de cerca de 2,1% a cerca de7,4%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 3,7%. Emuma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 3,0%. Em uma modali-dade, a incidência é de cerca de 2,8% a cerca de 3,0%. A invenção propor-ciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-lg emque, após administração da composição a seres humanos, a produção deanticorpos que se ligam às porções de CTLA4 das moléculas de CTLA4-lgocorre, em seres humanos, em uma incidência de menos do que ou igual a4,9%. Em uma modalidade, a incidência é de cerca de 0,5% a cerca de4,9%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 1,2%. Emuma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 1,0%. Em uma modali-dade, a incidência é de cerca de 0,9% a cerca de 1,0%. Em uma modalida-de, a incidência é medida em um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado(ELISA). Em uma modalidade, em que a incidência é medida em um ensaiode eletroquimioluminescência (ECL).

A invenção proporciona uma composição isolada compreenden-do moléculas de CTLA4-lg, em que, após administração da composição aseres humanos, a produção de anticorpos que neutralizam as moléculas deCTLA4-lg ocorre em uma incidência de menos do que ou igual a 75% dosseres humanos tendo anticorpos que se ligam à porção de CTLA4 da molé-cula de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a incidência é 40-75%. Em umamodalidade, a incidência é menos de ou igual a 40%. Em uma modalidade, aincidência é medida em um ensaio repórter de Iuciferase baseado em célula.

A invenção proporciona um método para produção de proteínade CTLA4-lg, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamí-fero que produzem proteína de CTLA4-lg, em que a expansão é de uma cul-tura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteí-na de CTLA4-lg ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de0,5 grama de proteína de CTLA4-lg por litro de cultura líquida, conforme de-terminado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isola-mento da proteína de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a cultura líquida exibe mais deou igual a cerca de 6,0 mois de NANA por mol de dímero de CTLA4-lg oupara molécula de CTLA4-lg, conforme determinado através de ensaio deuma alíquota da cultura líquida. O método também proporciona um métodopara produção de proteína de CTLA4-lg, o método compreendendo: (a) ex-pansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-lg, emque a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelomenos 10.000 L até a proteína de CTLA4-lg ser produzida em um rendimen-to de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-lg por litro decultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota dacultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-lg de uma cultura lí-quida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a culturalíquida exibe de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 mois de ácido siálico por mol dedímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg, conforme determinadoatravés de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. O método tambémproporciona um método para produção de proteína de CTLA4-lg, o métodocompreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem prote-ína de CTLA4-lg, em que a expansão é de uma cultura originária para umacultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-lg ser pro-duzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína deCTLA4-lg por litro de cultura líquida, conforme determinado através de en-saio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de C-TLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamen-to ocorre quando a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33χ 105 células viáveis por ml_ de cultura líquida a cerca de 79 χ 105 célulaspor mL de cultura líquida. A invenção também proporciona um método paraprodução de proteína de CTLA4-lg, o método compreendendo: (a) expansãode células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-lg, em que a ex-pansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos10.000 L até a proteína de CTLA4-lg ser produzida em um rendimento depelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-lg por litro de culturalíquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da culturalíquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-lg de uma cultura líquida depelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a viabilidade celu-lar na cultura liquida não é menos de cerca de 38%. A invenção tambémproporciona um método para produção de proteína de CTLA4-lg, o métodocompreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem prote-ína de CTLA4-lg, em que a expansão é de uma cultura originária para umacultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-lg ser pro-duzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína deCTLA4-lg por litro de cultura liquida, conforme determinado através de en-saio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de C-TLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamen-to ocorre quando a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cer-ca de 37%. O método também proporciona um método para produção deproteína de CTLA4-lg, o método compreendendo: (a) expansão de célulasde mamífero que produzem proteína de CTLA4-lg, em que a expansão é deuma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até aproteína de CTLA4-lg ser produzida em um rendimento de pelo menos cercade 0,5 grama de proteína de CTLA4-lg por litro de cultura líquida, conformedeterminado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) iso-lamento da proteína de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos10.000 L1 em que o isolamento ocorre quando a endotoxina é menos de ouigual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida, conforme determinadoatravés de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. O método tambémproporciona um método para produção de proteína de CTLA4-lg, o métodocompreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem prote-ína de CTLA4-lg, em que a expansão é de uma cultura originária para umacultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-lg ser pro-duzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína deCTLA4-lg por litro de cultura líquida, conforme determinado através de en-saio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de C-TLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamen-to ocorre quando a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 4,8 EU pormL de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alí-quota da cultura líquida. A invenção também proporciona um método paraprodução de proteína de CTLA4-lg, o método compreendendo: (a) expansãode células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-lg, em que a ex-pansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos10.000 L até a proteína de CTLA4-lg ser produzida em um rendimento depelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-lg por litro de culturalíquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da culturalíquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a biobur-den é menos de 1 unidade de formação de colônia por mL de cultura líquida,conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida.A invenção também proporciona um método para produção de proteína deCTLA4-lg, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamíferoque produzem proteína de CTLA4-lg, em que a expansão é de uma culturaoriginária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína deCTLA4-lg ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5grama de proteína de CTLA4-lg por litro de cultura líquida, conforme deter-minado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamen-to da proteína de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L,em que o isolamento ocorre quando pelo menos duas das seguintes condi-ções são reunidas: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de6,0 mois de NANA por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de C-TLA4-lg; (ii) a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 χ105 células viáveis por mL de cultura líquida a cerca de 79 χ 105 células viá-veis por mL de cultura líquida; (iii) a viabilidade celular na cultura líquida nãoé menos de cerca de 38%; ou (iv) o rendimento de proteína de CTLA4-lg émais de cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-lg por litro de cultura lí-quida, em que a concentração de NANA em (i) e o rendimento em (iv) sãodeterminados através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. A inven-ção também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig1 o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero queproduzem proteína de CTLA4-lg, em que a expansão é de uma cultura origi-nária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de C-TLA4-lg ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 gramade proteína de CTLA4-lg por litro de cultura líquida, conforme determinadoatravés de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento daproteína de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, emque o isolamento ocorre quando pelo menos duas das seguintes condiçõessão reunidas: (i) a cultura líquida contém de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 moisde ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-Ig; (ii) a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 37%;ou (iii) o rendimento de proteína de CTLA4-lg é mais de cerca de 0,5 gramade proteína de CTLA4-lg por litro de cultura líquida, em que o teor de ácidosiálico em (i) e o rendimento em (iii) são determinados através de ensaio deuma alíquota da cultura líquida.Seqüências:

SEQ ID NO: 1 - Seqüência de nucleotídeo de CTLA4-lg, vejafigura 1

figura 1

SEQ ID NO: 2 - Seqüência de aminoácido de CTLA4-lg, veja

SEQ ID NO: 3 - Seqüência de nucleotídeo de CTUMa29yuiD4E-lgcompreende nucleotídeos 79 a 1149 da seqüência de ácido nucleico mos-trado em figura 2

SEQ ID NO: 23 é a seqüência de nucleotídeo de comprimentototal mostrada em figura 2. Essa seqüência de nucleotídeo inclui a seqüên-cia de codificação para a pró-sequência.

SEQ ID NO: 4 - Seqüência de aminoácido CTLA4A29YL104E-lg,figura 3, sem a pró-sequência

SEQ ID NO: 5 - aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 2MAMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 6 - aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 2AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 7 - aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 2MHVAQPA WLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 8 - aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 2MAM HVAQ PAWLASS RG IAS FVC EYASPG KATEVRVTVLRQADSQ VTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 9 - aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 2AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 10 - aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 2MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 11 - aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 4MAMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 12 - aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 4AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 13 - aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 4M H VAQ PAWLASS RGIASFVCEYAS PG KYTEVRVTVLRQADSQVTE VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 14 - aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 4MAM HVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 15 - aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 4AM HVAQ PAWLASSRG IAS FVC EYAS PGKYTE VRVTVLRQADSQ VTE VC AATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 16 - aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 4MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 18 - domínio extracelular da seqüência de CTLA4M HVAQ PAWLASSRG IASF VC EYAS PG KYTEVRVTVLRQADSQVTE VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD

SEQ ID NO: 19

5'-AGAAAAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGTGGTTAAGAGCA-3'SEQ ID NOS: 20-22

SEQ ID NO: 20 - 5'-GTACTCAGG

SEQ ID NO: 21 - AGTCAGAGAC

SEQ ID NO: 22 - CGGCAGATCTCTGTGAGTTTGAGGC-CAGCCTGG TCTACAAAGCAAGTT-3'

Monômeros e Multímeros de CTLA4-lg

Em determinadas modalidades, a invenção proporciona linha-gens de células tendo um cassete de expressão que compreende SEQ IDNO: 1 (FIG. 1A). Tal cassete de expressão, quando expresso em células demamífero, incluindo células de CHO1 pode resultar na produção de variantesN- e C- terminais, de modo que as proteínas produzidas a partir do cassetede expressão podem ter a seqüência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO:2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2 (FIG. 1A). Essas proteínas podem ser re-feridas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 2" ou monômeros "tendo aseqüência SEQ ID NO: 2." Esses monômeros de SEQ ID NO: 2 podem di-merizar, de modo que combinações de dímero possam incluir, por exemplo:(i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e(iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e(v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinaçõesde dímero podem também se associar umas com as outras para formar mo-léculas de CTLA4-lg tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros eoutros multímeros podem ser referidos aqui como "proteínas de SEQ ID NO:2" ou proteínas "tendo a seqüência SEQ ID NO: 2". Embora a linhagem decélulas possa produzir essas variantes imediatamente quando de tradução,as variantes podem, mais tipicamente, ser um produto de ações pós-traducionais nas células. A linhagem de célula também secreta moléculas deCTLA4-lg. Abatacept se refere a proteínas de SEQ ID NO: 2.

Moléculas de CTLA4-lg podem incluir, por exemplo, proteínas deCTLA4-lg nas formas de monômero, dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero,hexâmero ou outras multiméricas. Moléculas de CTLA4-lg podem compre-ender uma fusão de proteína com pelo menos um domínio extracelular deCTLA4 e uma região constante de imunoglobulina. Moléculas de CTLA4-lgpodem ter seqüências do tipo silvestre ou mutantes, por exemplo, com rela-ção ao domínio extracelular de CTLA4 e seqüências de região constante deimunoglobulina. Monômeros de CTLA4-lg, sozinhos ou na forma de dímero,tetrâmero ou outro multímero, podem ser glicosilados.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg que têm pelo menos um determinado percen-tual de dímero ou outras moléculas multiméricas. Por exemplo, a invençãoproporciona populações de moléculas de CTLA4-lg que são mais de 90%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dímeros de CTLA4-lg. Em umamodalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de C-TLA4-lg que compreende cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímero de C-TLA4-lg e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmero de CTLA4-lg. Emoutra modalidade, a população de moléculas de CTLA4-lg compreende cer-ca de 98 % de dímero de CTLA4-lg, cerca de 1,5% de tetrâmero de CTLA4-Ig e cerca de 0,5% de monômero de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg em que a população é substancialmente isenta demonômeros de moléculas de CTLA4-lg. Substancialmente isenta de monô-meros de moléculas de CTLA4-lg pode se referir a uma população de molé-culas de CTLA4-lg que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg, em que a população é substancialmente isenta de multímeros de CTLA4-lg que são maiores do que dímeros, tais como tetrâ-meros, hexâmeros, etc. (por exemplo, espécies de elevado peso molecular).Substancialmente isenta de moléculas multiméricas de CTLA4-lg maiores doque dímeros pode se referir a uma população de moléculas de CTLA4-lgque têm menos de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de multímerosde CTLA4-lg (por exemplo, espécies de elevado peso molecular) maiores doque a forma dimérica.

Um monômero de molécula de CTLA4-lg pode ter, por exemplo,a seqüência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 deSEQ ID NO: 2 (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO:2. Quando um cassete de expressão compreendendo a seqüência de ácidonucleico de SEQ ID NO: 1 é expresso em células de CHO1 a forma monomé-rica predominante expressa tem o resíduo de aminoácido metionina no N-término (resíduo 27 de SEQ ID NO: 2), o qual corresponde ao resíduo deaminoácido no N-término da Humano CTLA4 do tipo silvestre. Contudo, emvirtude do fato de SEQ ID NO: 1 também incluir a seqüência de codificaçãopara uma seqüência sinalizadora de oncostatina M (nucleotídeos 11-88 deSEQ ID NO: 1), a proteína expressa de SEQ ID NO: 1 contém uma seqüên-cia sinalizadora de oncostatina Μ. A seqüência sinalizadora é clivada da pro-teína expressa durante o processo de exportação de proteína do citoplasmaou secreção da célula. Mas clivagem pode resultar em variantes N-terminais,tal como clivagem entre resíduos de aminoácido 25 e 26 de SEQ ID NO. 2(resultando em um N-término de resíduo 26, isto é, a "variante Ala") ou entreresíduos de aminoácido 24 e 25 de SEQ ID NO. 2 (resultando em um N-término de resíduo 25, isto é, a "variante Met-Ala"), em oposição à clivagementre resíduos de aminoácido 26 e 27 de SEQ ID NO. 2 (resultando em umN-término de resíduo 27). Por exemplo, a variante Met-Ala pode estar pre-sente em uma mistura de moléculas de CTLA4-lg em cerca de 1% e a vari-ante Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4-lg emcerca de 8-10%. Além disso, a proteína expressa de SEQ ID NO: 1 pode tervariantes C-terminais em virtude de processamento incompleto. O C-términopredominante é a glicina no resíduo 382 de SEQ ID NO: 2. Em uma misturade moléculas de CTLA4-lg, monômeros tendo Iisina no C-término (resíduo383 de SEQ ID NO: 2) podem estar presentes, por exemplo, em cerca de 4-5%.

Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-lg tem a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 5 como segue (a qual é a mesma conformeos aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 2):

SEQ ID NO: 5MAM HVAQ PAWLASS RGIASFVC EYAS PGKATE VRVTVLRQ ADSQ VTE VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Em outra modalidade, a molécula de CTLA4-lg tem a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 6 como segue (a qual é a mesma conformeos aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 2):

SEQ ID NO: 6

AM HVAQ PAWLASSRGIAS FVC E YASPG KATE VRVTVLRQADSQVTE VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Em outra modalidade, a molécula de CTLA4-lg tem a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 7 como segue (a qual é a mesma conformeos aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 2):SEQ ID NO: 7

M HVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.Em outra modalidade, a molécula de CTLA4-lg tem a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 8 como segue (a qual é a mesma conformeos aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 2):SEQ ID NO: 8

MAMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG;

Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-lg tem a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 9 como segue (a qual é a mesma conformeos aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 2):SEQ ID NO: 9

AM HVAQ PAWLASSRGIASFVC E YAS PG KATE VRVTVLRQADSQVTEVC AATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-lg tem a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 10 como segue (a qual é a mesma conformeos aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 2):SEQ ID NO: 10

MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

Um monômero de molécula de CTLA4-lg pode compreender umdomínio extracelular de Humano CTLA4. Em uma modalidade, o domínioextracelular pode compreender a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos89-463 de SEQ ID NO: 1 que codifica os aminoácidos 27-151 de SEQ IDNO: 2. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender se-qüências de Humano CTLA4 mutante. Em outra modalidade, o domínio ex- tracelular pode compreender alterações de nucleotídeo para os nucleotídeos89-463 de SEQ ID NO: 1, de modo que alterações conservativas de aminoá-cido sejam feitas. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode com-preender uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos nucleotídeos 89-463 de

SEQ ID NO: 1.

Um monômero de molécula de CTLA4-lg pode compreenderuma região constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constan-te pode ser uma porção de uma região constante; essa região constante po-de ter uma seqüência do tipo silvestre ou mutante. A região constante podeser de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAI, lgA2, IgD ou IgE humana. A regi-ão constante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de umaimunoglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG1 IgD ouIgA. A região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domí-nios de região constante: Cl, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3. Onde a regiãoconstante é de IgM ou IgE, a região constante pode compreender um oumais dos seguintes domínios de região constante: Cl, Ch1, Ch2, Ch3 ouCh4. Em uma modalidade, a região constante pode compreender um oumais domínios de domínios de região constante de IgG, IgD, IgA, IgM ou lgE-

Em uma modalidade, dímeros de CTLA4-lg são compreendidosde dois monômeros, em que cada monômero pode ter a mesma ou uma se-qüência de aminoácido diferente e onde a seqüência pode ser a seqüênciade aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2,(iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 deSEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Tais monômeros de CTLA4-lgpodem dimerizar através do domínio extracelular da Humano CTLA4 via umresíduo de aminoácido de cisteína na posição 146 de SEQ ID NO: 2.

A molécula de CTLA4-lg pode multimerizar através da interaçãodos domínios de região constante de IgM ou IgA com uma proteína de ca-deia J. IgM e IgA são usualmente produzidas como multímeros em associa-ção com uma cadeia polipeptídica adicional, a cadeia J. Em IgM pentaméri-ca, os monômeros são ligados cruzadamente através de ligações de dissul-feto uns aos outros no domínio CH3 e à cadeia J através do domínio CH4.IgM pode também formar hexâmeros que carecem de uma cadeia J1 ondemultimerização é obtida através de ligações de dissulfeto uns aos outros. EmIgA dimérica, os monômeros têm ligações de dissulfeto a uma cadeia J viaseu domínio CH3 e não uns aos outros. Assim, em uma modalidade, a in-venção proporciona multímeros de CTLA4-lg, incluindo dímeros, pentâmerose hexâmeros, em que a porção de Ig compreende uma região constante deIgM ou porção da mesma ou uma região constante de IgA ou porção damesma. Tais multímeros de CTLA4-lg baseados em IgM ou IgA podem in-cluir a cadeia J.

Em uma modalidade, um monômero de molécula de CTLA4-lg(No. de Acesso da CTLA4 ao GenBank 113253) compreende uma região dedobradiça de IgGI humana modificada (nucleotídeos 464-508 de SEQ IDNO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2) em que as serinas nos resí-duos de aminoácido 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 2 foram manipuladasdas cisteínas presentes na seqüência do tipo silvestre.

Em uma modalidade, um monômero de molécula de CTLA4-lgcompreende uma região CH2 de IgGI humana modificada e uma regiãoCH3 do tipo silvestre (o domínio CH2 de IgGI humana modificado tendo osnucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 167-276 de SEQ IDNO: 2; o domínio CH3 de IgGI tendo os nucleotídeos 839-1159 de SEQ IDNO: 1 e aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4-lgcompreende monômeros tendo uma seqüência mostrado em qualquer umaou mais das figuras 7, 8 ou 9 do pedido de Patente U.S. publicado como Pu-blicação No. US 2002/0182211 A1 e nos pedidos de Patente U.S. publicadoscomo Publicações N°s US20030083246 e US20040022787, cada um dosquais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Em uma modalidade, um tetrâmero de molécula de CTLA4-lgcompreende dois pares ou dois dímeros de polipeptídeos de CTLA4-lg, emque cada polipeptídeo tem uma das seguintes seqüências de aminoácido: (i)26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi)25-383 de SEQ ID NO: 2. Cada membro do par de polipeptídeos ou dímeroé covalentemente ligado ao outro membro e os dois pares de polipeptídeossão não-covalentemente associados um ao outro, desse modo, formandoum tetrâmero. Tais moléculas tetraméricas são capazes de ligação ao CD80ou CD86. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem se ligarao CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes mais a avidezde ligação de um dímero de CTLA4-lg (cujos monômeros têm uma das se-qüências de aminoácido acima) ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade,tais moléculas tetraméricas podem se ligar ao CD80 ou CD86 com uma avi-dez que é pelo menos 2 vezes mais a afinidade ou avidez de ligação da C-TLA4 do tipo silvestre ao CD80 ou CD86. Essa maior avidez pode contribuirpara maior eficácia no tratamento de distúrbios imunes e outras doençasconforme descrito abaixo, bem como em inibição rejeições a transplante detecido e/ou órgão sólido. Além disso, avidez maior ou aperfeiçoada podeproduzir o resultado de maior potência de um fármaco. Por exemplo, umacomposição terapêutica compreendendo tetrâmero de CTLA4-lg teria umamaior avidez e, portanto, maior potência do que a mesma quantidade deuma composição terapêutica tendo monômero de CTLA4-lg. Em outra mo-dalidade, tais moléculas tetraméricas podem ter pelo menos uma inibição 2vezes maior sobre a proliferação de células T quando comparado com umdímero de CTLA4-lg (cujos monômeros têm uma das seqüências de amino-ácido acima). Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem terpelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células Tquando comparado com uma molécula de CTLA4 do tipo silvestre.Monômeros. Dímeros e Multímeros de CTLA4A29YL104E-lqCTI_A4A29YL104E-lg são formas modificadas de CTLA4-lg (FIG.

1A; SEQ ID NOS: 1-2). A modificação consiste em mutações de ponto queresultam em duas substituições de aminoácido (L104E e A29Y) conformemostrado na figura 2 (correspondendo às posições de aminoácido 55 e 130na figura 3; SEQ ID NO: 4). Com relação a CTLA4-lg, CTI_A4A29YL104E-lg (porexemplo, SEQ ID NOS: 5-10) se liga ao CD80 (B7-1) com avidez aproxima-damente 2 vezes aumentada e se liga CD86 (B7-2) com avidez aproxima-damente 4 vezes aumentada. CTLA4A29YL104E-lg são aproximadamente 10vezes mais eficaz do que a CTLA4-lg na inibição de proliferação de célulasT1 produção de citocina e morte CD28-dependente de células alvo por célu- las assassinas naturais. CTLA4A29YL104E-lg causa inibição modesta de prolife-ração de células T B7-1-mediada, mas é acentuadamente mais potente doque CTLA4-lg no bloqueio de proliferação de células T B7-2-mediada. A po-tência aumentada é comparável, quer através de bloqueio de B7-2 apenasou bloqueio de B7-1 e B7-2, sugerindo que a atividade imunomodulatóriaintensificada de CTl_A4A29YL104E-lg pode mais provavelmente ser à potênciaintensificada para bloqueio de B7-2.

CTI_A4A29YL104E-lg é uma proteína de fusão geneticamente modi-ficada, a qual consiste no domínio de ligação funcional da CTLA-4 humanamodificada e o domínio Fc da imunoglobulina humana da classe IgGI (FIG.3A-B). Duas substituições de aminoácido foram feitas na região de ligação aB7 do domínio de CTLA-4 (L104E e A29Y) para gerar uma molécula de C-TLA4A29YL104E_|g ym d(me|O de CTLA4A29YL104E_|g é compreendjdo de dU3Scadeias de CTLA4A29YL104E-lg glicosiladas. Ela existe como um dímero cova-lente ligado através de uma ligação de dissulfeto intercadeia. Um modelomolecular de uma molécula de CTI_A4A29YL104E-lg é mostrado na figura 4.Uma molécula de CTLA4A29YL104E-lg tem uma massa média de aproximada-mente 91.800 Da, conforme determinado através de espectrometria de mas-sa por desabsorção-ionização a laser matriz-assistida time-of-flight (MALDI-TOF).

Em determinadas modalidades, a invenção proporciona umalinhagem de células tendo um cassete de expressão que compreende SEQID NO: 3. Tal cassete de expressão, quando expresso em células de mamí-fero, por exemplo, células de CHO1 pode resultar na produção de VariantesN- e C-terminais, de modo que os polipeptídeos produzidos a partir do cas-sete de expressão podem ter a seqüência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ IDNO: 4 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Esses polipeptídeos podem serreferidos aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 4" ou monômeros "tendo aseqüência SEQ ID NO: 4".

Esses monômeros de SEQ ID NO: 4 podem dimerizar, de modoque combinações de dímero possam incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i)e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e(vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e (vi); (v)e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímero podemtambém se associar umas com as outras para formar moléculas tetraméricasde CTLA4A29YL104E-lg. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outros mul-tímeros podem ser referidos aqui como "polipeptídeos de SEQ ID NO: 4" oupolipeptídeos "tendo a seqüência SEQ ID NO: 4". Embora a linhagem decélulas possa produzir essas variantes imediatamente quando de tradução,as variantes podem, mais tipicamente, ser um produto de ações pós-traducionais nas células. Dímeros pode ser covalentemente unidos juntos,não-covalentemente unidos juntos ou ambos. A invenção proporciona com-posições que consistem essencialmente de dímeros que são covalentemen-te ligados juntos. Por exemplo, a invenção proporciona composições ondepelo menos 50% dos dímeros de CTLA4-lg são compostos de monômeroscovalentemente unidos. A invenção também proporciona composições ondepelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou100% dos dímeros de CTLA4-lg são compostos de monômeros covalente-mente unidos. A invenção também proporciona composições de moléculasde CTLA4-lg, em que as moléculas estão predominantemente na forma dedímero e os dímeros são predominantemente formados através de ligaçõescovalentes. Por exemplo, a invenção proporciona uma composição em que a maioria dos dímeros de CTLA4-lg é covalentemente unida. É possível quealguma fração dos dímeros de CTLA4-lg na composição seja unida não-covalentemente.

Moléculas de CTLA4A29YL104E-lg podem incluir, por exemplo, C-TLA4A29YL104E-lg nas formas de monômero, dímero, trímero, tetrâmero, pen-tâmero, hexâmero ou outras multiméricas. Moléculas de CTLA4A29YL104E-lgpodem compreender uma fusão de proteína com pelo menos um domínioextracelular de CTLA4 modificado (SEQ ID NO: 18) e uma região constantede imunoglobulina. Moléculas de CTLA4A29YL104E-lg podem ter seqüênciasmutantes, por exemplo, com relação ao domínio extracelular de CTLA4 mo-dificado e seqüências de região constante de imunoglobulina. Monômerosde CTLA4A29YL104E-lg, sozinhos ou na forma de dímero, tetrâmero ou outromultímero, podem ser glicosilados.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg que têm pelo menos um determinado percentual de dímero ou outras moléculas multiméricas. Por exemplo, a in-venção proporciona populações de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg que sãomais de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dímeros de C-TI_A4A29YL104E-lg. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTUUa29yl104e -Ig que compreende cerca de 95% acerca de 99,5% de dímeros de CTLA4A29YL104E-lg e de cerca de 0,5% a cercade 5% de tetrâmeros de CTLA4A29YL104E-lg. Em uma outra modalidade, a in-venção proporciona uma população de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg quecompreende cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímeros de CTI_A4A29YL104E-Ig, de cerca de 0,5% a cerca de 2,5% de monômeros de CTLA4A29YL104E-lg ede cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmeros de CTI_A4A29YL104E-lg. Emoutra modalidade, a população de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg compre-ende cerca de 96% de dímeros de CTI_A4A29YL104E-lg, cerca de 2,5% de te-trâmeros de CTLA^9yli04e-Iq e cerca de 0,5% de monômeros de C-TLMa29yli04e-I9.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLMa29yl104e-Iq em que a população é substancialmenteisenta de monômeros de CTLMa29yl1 04E-lg. Substancialmente isenta de mo-nômeros de CTLMa29yu04e-Iq pode se referir a uma população de moléculasde CTLAAa29yL104E-lg que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.

Em outra modalidade, a invenção proporciona uma populaçãode moléculas de CTLMa29yl1 04E-lg em que a população é substancialmenteisenta de multímeros de CTI_A4A29YL104E-lg que são maiores do que dímeros,tais como tetrâmeros, hexâmeros, etc. Substancialmente isenta de multíme-ros de CTLAAa29yl104e-Iq maiores do que dímeros pode se referir a uma po-pulação de moléculas de CTLAAa29yl104e-Iq que têm menos de 6%, 5%, 4%,3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de multímeros de CTLAAa29yl104e-Iq maiores doque dímeros.

Um monômero de CTLAAa29yl104e-Iq pode ter, por exemplo, aseqüência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: A, (ii) 26-382 deSEQ ID NO: A (iii) 27-383 de SEQ ID NO: A ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: Aou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: A ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO:A, Quando um cassete de expressão compreendendo a seqüência de ácidonucleico de SEQ ID NO: 3 ou 23 é expresso em células de CHO, a formamonomérica predominante expressa tem o resíduo de aminoácido metioninano N-término (resíduo 27 de SEQ ID NO: A), o qual corresponde ao resíduode aminoácido no N-término de Humano CTLAA. Contudo, em virtude dofato de que SEQ ID NO: 23 também inclui a seqüência de codificação parauma seqüência sinalizadora de oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQID NO: 23), a proteína expressa de SEQ ID NO: 23 contém uma seqüênciasinalizadora de oncostatina M.

A seqüência sinalizadora é clivada da proteína expressa duranteo processo de exportação de proteína do citoplasma ou secreção da célula,mas clivagem pode resultar em variantes N-terminais, tais como clivagementre resíduos de aminoácido 25 e 26 de SEQ ID NO: A (resultando em umN-término de resíduo 26, isto é, a "variante Ala") ou entre resíduos de ami-noácido 24 e 25 SEQ ID NO: 4 (resultando em um N-término de resíduo 25,isto é, a "variante Met-Ala"), em oposição à clivagem entre resíduos de ami-noácido 26 e 27 SEQ ID NO: 4 (resultando em um N-término começandocom o resíduo de Met na posição de aminoácido 27). Por exemplo, a varian-te Met-Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de C-em cerca de 1% e a variante Ala pode estar presente emuma mistura de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg em cerca de 10-20%.

Além disso, a proteína expressa a partir de um ácido nucleicocompreendendo SEQ ID NO: 3 pode ter variantes C-terminais em virtude deprocessamento incompleto. O C-término predominante é a glicina no resíduo382 de SEQ ID NO: 4. Em uma mistura de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg,monômeros tendo Iisina no C-término (resíduo 383 de SEQ ID NO: 4) podemestar presente, por exemplo, em cerca de 4-8%.

Em uma modalidade, uma molécula de CTI_A4A29YL104E-lg com-preende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 como segue (a qualé a mesma conforme os aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 4):

SEQ ID NO: 11

MAMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Em outra modalidade, uma molécula de CTI_A4A29YL104E-lg com-preende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como segue (a qualé a mesma conforme os aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 4):

SEQ ID NO: 12

MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIWIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Em uma outra modalidade, uma molécula de CTLJMa29yl1 04E-lgcompreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 como segue (aqual é a mesma conforme os aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 4):SEQ ID NO: 13

MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Em outra modalidade, uma molécula de CTLjMa29yl1 04E-lg com-preende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 como segue (a qualé a mesma conforme os aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 4):SEQ ID NO: 14

MAMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

Em uma modalidade, uma molécula de CTI_A4A29YL104E-lg tem aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 como segue (a qual é a mesmaconforme os aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 4):SEQ ID NO: 15

AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

Em uma outra modalidade, uma molécula de CTI_A4A29YL104E-lgtem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 como segue (a qual é amesma conforme os aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 4):SEQ ID NO: 16

M HVAQ PAWLASS RGIASFVC EYAS PG KYTEVRVTVLRQADSQVTE VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

Um monômero de CTI_A4A29YL104E-lg compreende um domínioextracelular de Humano CTLA4, em que duas substituições de aminoácidoforam feitas no domínio de CTLA-4 (L104E e A29Y) (FIG. 5). Em uma moda-lidade1 o domínio extracelular pode compreender a seqüência de nucleotídeodos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23 que codificam os aminoácidos27-151 de SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, o domínio extracelular podecompreender seqüências de Humano CTLA4 mutante (tais como mutantesem um único, em dois e três sítios nos aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO:4). Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender altera-ções de nucleotídeo para os nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23, demodo que alterações conservativas de aminoácido sejam feitas. Em umaoutra modalidade, o domínio extracelular pode compreender alterações denucleotídeo para os nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23, de modo quealterações não conservativas de aminoácido sejam feitas. Em outra modali-dade, o domínio extracelular pode compreender uma seqüência de nucleotí-deo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%idêntica aos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23.

Um monômero de CTLA4A29YL104E-lg pode compreender umaregião constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constantepode ser uma porção de uma região constante. Essa região constante tam-bém pode ter uma seqüência do tipo silvestre ou mutante. A região constan-te pode ser de IgGi, IgG2, IgG3, IgG4l IgM, IgA1, IgA2l IgD ou IgE humana. Aregião constante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada deuma imunoglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG1IgD ou IgA, a região constante pode compreender um ou mais dos seguintesdomínios de região constante: CL, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3, Onde a regi-ão constante é de IgM ou IgE1 a região constante pode compreender um oumais dos seguintes domínios de região constante: CLl CH1, CH2, CH3 ouCh4. Em uma modalidade, a região constante pode compreender um oumais domínios de região constante de IgG, IgD1 IgA, IgM ou IgE.

Em uma modalidade, dímeros de CTI_A4A29YL104E-lg são compre-endidos de dois monômeros, em que cada monômero pode ter a mesma ouuma seqüência de aminoácido diferente e onde a seqüência pode ser a se-qüência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Tais monômeros deCTI_A4A29YL104E-lg podem dimerizar através do domínio extracelular da se-qüência de Humano CTLA4 via um resíduo de aminoácido de cisteína naposição 146 de SEQ ID NO: 4 (ou resíduo de aminoácido de cisteína na po-sição 120 da figura 5).

Uma molécula de CTLA4A29YL104E-lg pode multimerizar atravésda interação de domínios de região constante de IgM ou IgA com uma prote-ína de cadeia J. IgM e IgA são usualmente produzidas como multímeros emassociação com uma cadeia polipeptídica adicional, a cadeia J. Em IgM pen-tamérica, os monômeros são ligados cruzadamente através de ligações dedissulfeto uns aos outros no domínio CH3 e a uma cadeia J através do domí-nio Ch4. IgM também pode formar hexâmeros que carecem de uma cadeiaJ, onde multimerização é obtida através de ligações de dissulfeto uns aosoutros. Em IgA dimérica, os monômeros têm ligações de dissulfeto à cadeiaJ via seu domínio CH3 e não uns aos outros. Assim, em uma modalidade, ainvenção proporciona multímeros de CTLA^9yl1 04E-lg, incluindo dímeros,pentâmeros e hexâmeros, em que a porção de Ig compreende uma regiãoconstante de IgM ou porção da mesma ou uma região constante de IgA ouporção da mesma. Tais multímeros de CTIjMa29yl1 04E-lg baseados em IgMou IgA podem incluir a cadeia J.

Em uma modalidade, um monômero de CTLA4A29YL104E-lg com-preende uma região de dobradiça de IgGI humana modificada (nucleotídeos464-508 de SEQ ID NO: 23; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 4) em queos resíduos de serina nas posições 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 4 forammanipulados com relação aos resíduos de cisteína presentes na seqüênciado tipo silvestre.

Em uma modalidade, um monômero de CTI_A4A29YL104E-lg com-preende uma região CH2 de IgGI humana modificada e uma região CH3 dotipo silvestre (o domínio CH2 de IgGI humana modificado tendo os nucleotí-deos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2; odomínio CH3 de IgGI humana modificado tendo os nucleotídeos 839-1159de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).

Em uma modalidade, uma população de moléculas de C-TI_A4A29YL104E-lg compreende monômeros tendo uma seqüência mostradanas Publicações de Pedido de Patente U.S. N0S U.S. 2002/0039577, U.S.2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S. 2005/0019859 e U.S. 2005/0084933 ePatente U.S. N0. 7.094.874, cada uma das quais é incorporada aqui por refe-rência em sua totalidade.

Em uma modalidade, um tetrâmero de CTI_A4A29YL104E-lg com-preende dois pares ou dois dímeros de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg, emque cada polipeptídeo tem uma das seguintes seqüências de aminoácido: (i)26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi)25-383 de SEQ ID NO: 4. Cada membro do par de polipeptídeos ou dímeroé covalentemente ligado ao outro membro e os dois pares de polipeptídeossão não-covalentemente associados um ao outro desse modo formando umtetrâmero. Tais moléculas tetraméricas são capazes de ligação ao CD80 ouCD86. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem se ligar aoCD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes maior do que aavidez de ligação de um dímero de CTI_A4A29YL104E-lg (cujos monômeros têmuma das seqüências de aminoácido acima) ao CD80 ou CD86.

Essa maior avidez pode contribuir para maior eficácia no trata-mento de distúrbios imunes e outras doenças conforme descrito abaixo, bemcomo em inibição de rejeições a transplante de tecido e/ou órgão sólido. A-lém disso, avidez maior ou aperfeiçoada pode produzir o resultado de maiorpotência de um fármaco. Por exemplo, uma composição terapêutica com-preendendo tetrâmero de

CTLA4A29YL104E

lg teria uma maior avidez e, por-tanto, maior potência do que a mesma quantidade de uma composição tera-pêutica tendo monômero de CTI_A4A29YL104E-lg. Em outra modalidade, taismoléculas tetraméricas podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maiorsobre a proliferação de células T quando comparado com um dímero de C-TLA4A29YL104E-lg (cujos monômeros têm uma das seqüências de aminoácidoacima). Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas pode ter pelo me-nos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T quandocomparado com um tetrâmero de molécula de CTLA4-lg.

Caracterização de moléculas de CTLA4-lg e CTLA4A29YL104E-lg

A proliferação de células T pode ser medida usando ensaios-padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, uma das formas mais comunspara avaliar a proliferação de células T é estimular células T via um antígenoou anticorpos agonísticos ao TCR e medir, por exemplo, a incorporação detimidina tritiada (3H-TdR) em células T em proliferação ou a quantidade decitocinas liberadas por células T em proliferação em cultura. O efeito inibitó-rio de moléculas de CTLA4-lg ou CTLMa29yli04e-Iq sobre a ativação ou proli-feração de células T pode, desse modo, ser medido.

A afinidade da molécula de CTLA4-lg é a resistência de ligaçãoda molécula a um único ligante, incluindo CD80, CD86 ou proteínas de fusãode CD80lg ou CD86lg. A afinidade de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg a Ii-gantes pode ser medida, por exemplo, usando análise de interação de liga-ção (BIA) baseada na técnica de plasmônio em superfície. Além de mediçãoda resistência de ligação, ela permite determinação em tempo real da cinéti-ca de ligação, tal como constantes de associação e dissociação. Um chipsensor, consistindo em uma lâmina de vidro revestida com um filme fino demetal, ao qual uma matriz de superfície está covalentemente presa, é reves-tido com um dos agentes de interação, isto é, CTLA4-lg, CTI_A4A29YL104E-lgou um dos ligantes. Uma solução contendo o outro agente de interação édeixada fluir sobre sua superfície. Um feixe de luz contínuo é dirigido contrao outro lado da superfície e seu ângulo de reflexão é medido. Quando deligação de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg ao ligante, o ângulo de ressonân-cia do feixe de luz muda (uma vez que ele depende do índice refrativo domeio próximo ao lado reativo do sensor o qual, por sua vez, está diretamentecorrelacionado à concentração do material dissolvido no meio). Ela é subse-quentemente analisada com o auxilio de um computador.

Em uma modalidade, experimentos de ligação de CTLA4-lg po-dem ser realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (S-PR) sobre um instrumento BYAcore (BIAcore AG, Uppsala, Suécia). CTLA4-Ig pode ser covalentemente acoplada, através de grupos amina primária, auma matriz de dextrana carboximetilada sobre um chip sensor BIAcore, des-se modo, imobilizando o CTLA4-lg ao chip sensor. Alternativamente, um an-ticorpo antirregião constante pode ser usado para imobilizar CTLA4-lg indire-tamente à superfície do sensor via o fragmento de Ig. Após o que, os ligan-tes são adicionados ao chip para medir a ligação de CTLA4-lg aos ligantes.

Medições de afinidade podem ser realizadas, por exemplo, conforme descri-to em van der Merwe, P. e outros, J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404, oqual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em outra modali-dade, experimentos de ligação de CTI_A4A29YL104E-lg podem ser realizadosusando a tecnologia de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) con-forme descrito acima (FIG. 6; veja Exemplo 21).

A avidez de moléculas de CTLA4-lg ou CTLA^9yl1 04E-lg podetambém ser medida. A avidez pode ser definida como a soma total da resis-tência de ligação de duas moléculas ou células umas às outras em múltiplossítios. A avidez é distinta de afinidade, a qual é a resistência de ligação deum sítio sobre uma molécula a seu ligante. Sem estar preso pela teoria,maior avidez de moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YU04E-lg pode levar àpotência aumentada de inibição por moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YLio4E_|g Q0I3re a proliferação e ativação de células Τ. A avidez pode sermedida, por exemplo, através de duas categorias de ensaios em fase sólida:a) ensaios de inibição competitiva e b) ensaios de eluição, em ambos osquais o ligante é preso a um suporte sólido. No ensaio de ligação competiti-va, moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg são, então, adicionadas emsolução em uma concentração fixa, junto com ligante livre, em diferentesconcentrações e a quantidade de ligante a qual inibe a ligação em fase sóli-da em 50%, é determinada. Quanto menos ligante necessário, mais forte aavidez. Em ensaios de eluição, o ligante é adicionado em solução. Após ob-tenção de um estado de equilíbrio, um caotropo ou agente desnaturante (porexemplo isotiocianato, uréia ou dietilamina) é adicionado em diferentes con-centrações para romper interações CTLA4-lg/ligante ou interações C-TLA4A29YLi04E.,g /Iigante A quantidade de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lgque resiste à eluição é determinada, depois disso, com um ELISA. Quantomaior a avidez, mais agente caotrópico é necessário para eluir uma determi-nada quantidade de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg. A avidez relativa deuma mistura heterogênea de moléculas de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lgpode ser expressa como o índice de avidez (Al), igual à concentração deagente de eluição necessário para eluir 50% das moléculas de CTLA4-lg ouCTI_A4A29YL104E-lg ligadas. Análise refinada de dados pode ser realizada a-través de determinação dos percentuais de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lgeluída em diferentes concentrações do agente de eluição.Um processo de cromatografia em coluna de Fluxo Rápida emfenil Sefarose 4, Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), pode ser u-sado para reduzir a quantidade de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg eluídas em uma etapa de purificação por HIC (veja Exemplo 15).

Portanto, o pico de clarificação da coluna de HIC é enriquecido em espéciesde CTLA4-lg de HMW. Por exemplo, SEC HPLC em coluna preparativa úni-ca ou aleatória pode ser empregada para purificar as subpopulações de dí-mero, tetrâmero e multímero do material de pico de clarificação por HIC. Emuma modalidade, os componentes purificados são dímeros, tetrâmeros ehexâmeros de CTLA4-lg. Caracterização de componentes de espécies deelevado peso molecular de CTLA4-lg presentes em um pico de clarificaçãopor HIC pode ser feita através de técnicas de dispersão estática e dinâmicade luz. Amostras tomadas em uma etapa de processo de cromatografia deinteração hidrofóbica (HIC) revelaram a presença de dímeros, tetrâmeros emultímeros em vários pontos de amostragem. Espécies de hexâmero podemser detectadas apenas em amostras correspondendo ao "início do pico declarificação" e "OD máxima de pico de clarificação". Espécies decaméricasforam detectadas na "OD máxima de pico de clarificação. A massa molar eformação de raio dinâmico podem ser determinadas através de fracionamen-to via cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) empregando dispersãode luz em múltiplos ângulos (MALS) acoplada com detecção por dispersãode luz quasi elástica (QELS).

Com relação a moléculas de CTLA4-lg produzidas a partir deuma linhagem de célula, SEC mostra um eluato de proteína A que é umamistura de componentes de multímero, tetrâmero e dímero. Fracionamentodessa mistura sobre uma coluna de SEC aleatória preparativa permite iso-lamento de quantidades de espécies multiméricas, tetraméricas e diméricas.A recuperação de área percentual para cada componente em análise porSEC das frações isoladas resulta em 93-98% de homogeneidade para cadafração. Em um aspecto, purificação dos componentes individuais permitecomparação das propriedades físico-químicas de componentes de materialde CTLA4-lg de HMW daqueles de dímeros de CTLA4-lg. A figura 7 mostraos pesos moleculares evidentes, os quais correspondem às frações de mul-tímero, tetrâmero e dímero do pico de clarificação de CTLA4-lg por HIC, con-forme determinado através de SEC com detecção por dispersão dinâmica deluz (DSL) e tempo de retenção sobre SEC. Em uma modalidade, a atividadede ligação bioespecífica de componentes purificados do pico de clarificaçãopor HIC é comparável à atividade de ligação determinada através de um en-saio de ligação de B7-lg imobilizado baseado em BIAcore. Em outro aspec-to, a proporção molar de ácido siálico para componentes isolados do pico declarificação por HIC está na faixa de 4,9 a 7,6, enquanto que a proporçãomolar de ácido siálico de moléculas ou dímeros de CTLA4-lg (não no pico declarificação por HIC) está na faixa de 8-10. Análise em um gel de IEF indicamobilidade reduzida de isoformas de CTLA4-lg purificadas de um pico declarificação por HIC comparado com a migração de dímeros de CTLA4-lg.Isso é consistente com menores proporções de ácido siálico observadas pa-ra as frações de pico de clarificação por HIC de CTLA4-lg (FIG. 8).

A escolha das condições de cultura de células pode influenciar aformação de espécies com cadeia simples (isto é, monômeros) e de elevadopeso molecular (isto é, dímeros, tetrâmeros, etc.) de um produto de proteínarecombinante. Condições de crescimento também incluindo, mas não Iimita-do a, composição do meio, são fatores que podem afetar a formação de ca-deia simples e o nível de cisteinilação. Isso é, provavelmente, o resultado dapresença de agentes que levam à redução da ligação de dissulfeto. A su-plementação de cisteína diretamente ou meio contendo cisteína a célulasque secretam CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg pode resultar em uma rápidaformação de espécies de cadeia simples e de elevado peso molecular. Ataxa é proporcional à quantidade de cisteína adicionada. Em outra modali-dade, a suplementação de iodoacetamida, um composto que reage com assulfidrilas livres, bloqueia a formação de espécies de elevado peso molecularde CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg que são dependentes de ligações de dis-sulfeto.

Por exemplo, a via de espécies de elevado peso molecular sen-síveis e não-sensíveis à iodoacetamida destaca dois mecanismos principaise distintamente diferentes pelos quais espécies de elevado peso molecularpodem se formar em CTLA4-lg. A suplementação de altas concentrações desal (0,5M) a soluções de CTLA4-lg resulta em uma taxa rápida, sustentadade formação de espécies de elevado peso molecular. EDTA1 ConAcidSoI Il eisolados de Ievedo aumentam a formação de cadeia simples (veja Exemplo 5).

Em determinadas modalidades, a invenção proporciona métodospara a geração de populações de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg, em que misturas contendo predominantemente monômeros oudímeros de CTLA4-lg são suplementadas com alta concentração de sal, demodo que a mistura tenha uma concentração de sal de mais de cerca de0,3, 0,4, 0,45, 0,5 ou 0,6M. Em uma modalidade, tais métodos geram umamistura compreendendo uma população de CTLA4-lg que tem pelo menos50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de moléculastetraméricas de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população deespécies de CTLA4-lg com cadeia simples contendo uma modificação sobrea Cys146, de modo que ela seja cisteinilada (veja Exemplo 4). Cisteinilação éuma modificação pós-traducional em que a cisteína dentro de uma cadeiapolipeptídica é modificada através da fixação de outra cisteína via uma liga-ção de dissulfeto. Cisteinilação de proteínas implica em modificação de bioa-tividade da proteína, incluindo imunogenicidade e antigenicidade de determi-nantes virais restritas à Classe I do MHC. Em uma modalidade, a invençãoproporciona uma composição que compreende pelo menos 1, 5, 10, 15, 20,25, 50, 75, 90 ou 95% de moléculas de CTLA4-lg cisteiniladas com cadeiasimples. Em outra modalidade da invenção, uma população de CTLA4-lgtem não mais do que cerca de 1% de monômeros de moléculas de CTLA4-lgou, em outra modalidade, menos de 0,6% de monômeros de CTLA4-lg.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg de cer-ca de 5 a cerca de 18. Em algumas modalidades, a proporção molar médiade ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg está entre cerca de X a cercade Y1 inclusive de X e Y, onde X é cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16 ou 17 eYé cerca de 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18.Em outras modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para mo-léculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cerca de Y1 inclusive de X eY1 onde X é cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 ou 6,0 e Y é cerca de 8,0, 8,5, 9,0, 9,5ou 10,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de ácido siálicopara moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusivede X e Y, onde X é cerca de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ou 9,0 e Y é cerca de11,0, 11,5, 12,0, 12,5 ou 13,0. Em outras modalidades, a proporção molarmédia de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de 6 a cercade 14, de cerca de 7 a cerca de 13, de cerca de 8 a cerca de 12 ou de cercade 9 a cerca de 11. Em outras modalidades, a proporção molar média deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de 5 a cerca de 9, decerca de 5,5 a cerca de 9,5, de cerca de 6 a cerca de 9, de cerca de 6 a cer-ca de 10 ou de cerca de 7 a cerca de 10. Em outras modalidades, a propor-ção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-lg é mais de ouigual a 5 ou mais de ou igual a 8. Em determinadas modalidades, o ácidosiálico é ácido N-acetil neuramínico (NANA).

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) para molécu-las de CTLA4-lg de menos do que ou igual a 2,5, menos de ou igual a 2,0,menos de ou igual a 1,5, menos de ou igual a 1,0 ou menos de ou igual a0,5.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são maisde ou igual a uma área de 93,0 por cento, mais de ou igual a uma área de93,5 por cento, mais de ou igual a uma área de 94,0 por cento, mais de ouigual a uma área de 94,5 por cento, mais de ou igual a uma área de 95,0 porcento, mais de ou igual a uma área de 95,5 por cento, mais de ou igual auma área de 96,0 por cento, mais de ou igual a uma área de 96,5 por centoou mais de ou igual a uma área de 97,0 por cento de dímeros de CTLA4-lg,conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica. Em algumas modalidades, a composiçãocompreende moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg sãomais de ou igual a uma área de 95,0 por cento de dímeros de CTLA4-lg emenos de ou igual a uma área de 4,0 por cento de espécies de elevado pesomolecular, conforme determinado através de cromatografia por exclusão detamanho e detecção espectrofotométrica. Em algumas modalidades, a com-posição compreende moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de Ο-TLA4-lg são mais de ou igual a uma área de 95,0 por cento de dímeros deCTLA4-lg e menos de ou igual a uma área de 5,0 por cento de espécies deelevado peso molecular, conforme determinado através de cromatografia porexclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são deuma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, uma área de menos doque ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,0 porcento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento para monôme-ros de CTLA4-lg (isto é, cadeia simples), conforme determinado através decromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são umaárea de menos do que ou igual a 5,0 por cento, uma área de menos do queou igual a 4,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,0 por cento,uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento, uma área de menos doque ou igual a 3,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,5 porcento, uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, uma área demenos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do que ou iguala 1,0 por cento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento deespécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg (por exemplo, tetrâmero),conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica. Em algumas modalidades, especialmente a-quelas envolvendo composições concentradas compreendendo moléculasde CTLA4-lg (tais como, por exemplo, aquelas para administração subcutâ-nea), as moléculas de CTLA4-lg são de uma área de menos do que ou iguala 10 por cento, uma área de menos do que ou igual a 9 por cento, uma áreade menos do que ou igual a 8 por cento, uma área de menos do que ou iguala 7 por cento, uma área de menos do que ou igual a 6 por cento de espéciesde elevado peso molecular de CTLA4-lg, conforme determinado através decromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende umaquantidade de MCP-1 ou material semelhante a MCP-1 de menos do que ouigual a 50 ppm, menos de ou igual a 40 ppm, menos de ou igual a 38 ppm,menos de ou igual a 30 ppm menos de ou igual a 20 ppm, menos de ou iguala 10 ppm, 5 ppm, menos de ou igual a 4 ppm, menos de ou igual a menos de ou igual a 3 ppm, menos de ou igual a 2 ppm ou menos de ou igual a 1ppm. A presente invenção proporciona uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende MCP-1 ou mate-rial semelhante a MCP-1 em menos de ou igual a 50 ng/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 40 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menosde ou igual a 38 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 30ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 20 ng/mg de molécu-las de CTLA4-lg, menos de ou igual a 10 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg,menos de ou igual a 5 ng/mg, menos de ou igual a 4 ng/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 3 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 2 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg ou menos de ou igual a 1ng/mg de moléculas de CTLA4-lg. A presente invenção proporciona umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg e uma quantidade deMCP-1 (incluindo a ausência de MCP-1) em que a referida composição éuma composição farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg de cercade 6 a cerca de 19. Em algumas modalidades, a proporção molar média deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de X a cerca de Y, on-de X é cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 e Yé cerca de7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19. Em outras modalidades, aproporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-lg está entrede cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 6,0, 6,5, 7,0,7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10,0 e Y é cerca de 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0,14,5, 15,0, 15,5 ou 16,0. Em outras modalidades, a proporção molar médiade galactose para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cercade Y, inclusive de X e Y, em que X é cerca de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 e Y écerca de 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5 ou 19,0. Em outrasmodalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de C-TLA4-lg é de cerca de cerca de 7 a cerca de 15, de cerca de 8 a cerca de14, de cerca de 9 a cerca de 13, de cerca de 10 a cerca de 12. Em outrasmodalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de C-TLA4-lg é de cerca de 7 a cerca de 18, de cerca de 8 a cerca de 17, de cer-ca de 9 a cerca de 17, de cerca de 9 a cerca de 16 ou de cerca de 10 a cer-ca de 15. Em outras modalidades, a proporção molar média de galactosepara moléculas de CTLA4-lg é mais de ou igual a 8.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de0,5 a cerca de 12. Em algumas modalidades, a proporção molar média deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cercade Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 ou4,5 e Y é cerca de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 ou 10,5. Em outras moda-lidades, a proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-lgestá entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 2,9,3,1, 3,3, 3,5, 3,7, 3,9 ou 4,1 e Y é cerca de 7,9, 8,1, 8,3, 8,5, 8,7, 8,9 ou 9,1.

Em outras modalidades, a proporção molar média de fucose para moléculasde CTLA4-lg está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, em que X écerca de 1,0, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1, 2,3 ou 2,5 e Y é cerca de 8,7, 8,9, 9,1, 9,3,9,6, 9,9, 10,1, 10,3 ou 10,5. Em outras modalidades, a proporção molar mé-dia de fucose para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de cerca de 3,3 a cer-ca de 8,5, de cerca de 3,5 a cerca de 8,3, de cerca de 3,7 a cerca de 8,1, decerca de 3,9 a cerca de 7,9. Em outras modalidades, a proporção molar mé-dia de fucose para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de 1,5 a cerca de 9,5,de cerca de 1,7 a cerca de 9,3, de cerca de 1,9 a cerca de 9,1 ou de cercade 2,1 a cerca de 8,9. Em outras modalidades, a proporção molar média defucose para moléculas de CTLA4-lg é mais de ou igual a 1,7.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-lg de cerca de5 a cerca de 25. Em algumas modalidades, a proporção molar média de áci-do siálico para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cerca deY, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20 ou 21 e Y é cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24. Em outras modalidades, a proporção molarmédia de manose para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X pa-ra Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 6,5, 7,0, 7,5, 7,7, 7,9, 8,1, 8,3,8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5 ou 12,0 e Y é cerca de 17,0, 17,5, 18,0,18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23, 23,5 ou 24,0. Em ou-tras modalidades, a proporção molar média de manose para moléculas deCTLA4-lg está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cer-ca de 8, 8,5, 9,0, 9,5 10,0 ou 11,0 e Y é cerca de 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0,19,5 ou 20,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de manosepara moléculas de CTLA4-lg é de cerca de cerca de 6 a cerca de 23, de cer-ca de 7 a cerca de 22, de cerca de 7,7 a cerca de 22, de cerca de 8 a cercade 21, de cerca de 9 a cerca de 20, de cerca de 10 a cerca de 19, de cercade 11 a cerca de 19 e de cerca de 11 a cerca de 17. Em outras modalidades,a proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-lg é de cer-ca de 8 a cerca de 19, de cerca de 9 a cerca de 18, de cerca de 10 a cercade 17 ou de cerca de 11 a cerca de 16. Em outras modalidades, a proporçãomolar média de manose para moléculas de CTLA4-lg é mais de ou igual a 7.A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são deuma área de menos do que ou igual a 5,0 por cento, uma área de menos doque ou igual a 4,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento, uma área demenos do que ou igual a 3,0 por cento, uma área de menos do que ou iguala 2,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, umaárea de menos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do queou igual a 1,0 por cento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 porcento de espécies oxidadas. A presente invenção proporciona uma compo-sição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de C-TLA4-lg são de uma área de menos do que ou igual a 5,0 por cento, umaárea de menos do que ou igual a 4,5 por cento, uma área de menos do queou igual a 4,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,0 por cento, uma área de menos doque ou igual a 2,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,0 porcento, uma área de menos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área demenos do que ou igual a 1,0 por cento ou uma área de menos do que ouigual a 0,5 por cento de espécies desamidadas. Em algumas modalidades, a composição compreende moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas deCTLA4-lg são de uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento de es-pécies oxidadas e uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento deespécies desamidadas.

A presente invenção proporciona uma composição compreen- dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende endoto-xina bacterianas LAL em menos de ou igual a 0,7 EU/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 0,6 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg, me-nos de ou igual a 0,5 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou iguala 0,42 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 0,4 EU/mg demoléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 0,35 EU/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 0,3 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg, me-nos de ou igual a 0,25 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou iguala 0,20 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 0,15 EU/mgde moléculas de CTLA4-lg ou menos de ou igual a 0,05 EU/mg de moléculasde CTLA4-lg.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende uma bio-burden em menos de ou igual a 2 CFU/10 mL, menos de ou igual a 1,5CFU/10 mL, menos de ou igual a 1 CFU/10 mL ou menos de ou igual a 0,5CFU/10 mL.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende DNA emmenos de ou igual a 25 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou i-gual a 20 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 15 pg/mgde moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 10 pg/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 5,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg, menosde ou igual a 4,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 3,5pg/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 3,0 pg/mg de molé-culas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 2,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ouigual a 1,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg ou menos de ou igual a 0,5pg/mg de moléculas de CTLA4-lg ou menos de ou igual a 0,20 pg/ml molé-culas de CTLA4-lg.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende proteínacelular (por exemplo, proteína de CHO ou CHOP) em menos de ou igual a200 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 150 ng/mg demoléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 125 ng/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 100 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, me-nos de ou igual a 90 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a80 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, 70 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg,menos de ou igual a 60 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou i-gual a 50 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 40 ng/mgde moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 30 ng/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 25 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menosde ou igual a 20 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 15ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 10 ng/mg de molécu-las de CTLA4-lg ou menos de ou igual a 5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg.

A presente invenção proporciona uma composição compreendendo molécu-las de CTLA4-lg, em que a composição compreende proteína celular emmenos de ou igual a 200 ppm, menos de ou igual a 150 ppm, menos de ouigual a 125 ppm, menos de ou igual a 100 ppm, menos de ou igual a 90ppm, menos de ou igual a 80 ppm, 70 ppm, menos de ou igual a 60 ppm,menos de ou igual a 50 ppm, menos de ou igual a 40 ppm, menos de ou i-gual a 30 ppm, menos de ou igual a 25 ppm, menos de ou igual a 20 ppm,menos de ou igual a 15 ppm, menos de ou igual a 10 ppm ou menos de ouigual a 5 ppm.

A presente invenção proporciona uma composição compreen- dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende Triton-X(por exemplo, Triton X-100) em menos de ou igual a 4,0 ng/mg de moléculasde CTLA4-lg, menos de ou igual a 3,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg,menos de ou igual a 3,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou i-gual a 2,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 2,0 ng/mgde moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 1,5 ng/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 1,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg oumenos de ou igual a 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg. A presente in-venção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende Triton-X em menos de ou igual a 4,0ppm, menos de ou igual a 3,5 ppm, menos de ou igual a 3,0 ppm, menos deou igual a 2,5 ppm, menos de ou igual a 2,0 ppm, menos de ou igual a 1,5ppm, menos de ou igual a 1,0 ppm ou menos de ou igual a 0,5 ppm.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que a composição compreende ProteínaA em menos de ou igual a 8,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos deou igual a 7,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 7,0ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 6,5 ng/mg de molé-cuias de CTLA4-lg, menos de ou igual a 6,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 5,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ouigual a 5,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 4,5 ng/mgde moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 4,0 ng/mg de moléculas deCTLA4-lg, menos de ou igual a 3,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menosde ou igual a 3,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 2,5ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 2,0 ng/mg de molé-culas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 1,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg, menos de ou igual a 1,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg ou menos deou igual a 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg. A presente invenção pro-porciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em quea composição compreende Proteína A em menos de ou igual a 8,0 ppm,menos de ou igual a 7,5 ppm, menos de ou igual a 7,0 ppm, menos de ouigual a 6,5 ppm, menos de ou igual a 6,0 ppm, menos de ou igual a 5,5 ppm,menos de ou igual a 5,0 ppm, menos de ou igual a 4,5 ppm, menos de ouigual a 4,0 ppm, menos de ou igual a 3,5 ppm, menos de ou igual a 3,0 ppm,menos de ou igual a 2,5 ppm, menos de ou igual a 2,0 ppm, menos de ouigual a 1,5 ppm, menos de ou igual a 1,0 ppm ou menos de ou igual a 0,5ppm.

A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de10 a cerca de 40. Em algumas modalidades, a proporção molar média deGIcNAc para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cerca de Y,inclusive de X e Y, onde X é qualquer número inteiro entre 10 e 39 e Y équalquer número inteiro entre 11 e 40. Em outras modalidades, a proporçãomolar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca deX para Y, inclusive de X e Y1 onde X é cerca de 12, 14, 14, 15, 16 ou 17 e Yé cerca de 32, 33, 34, 35, 36 ou 37. Em outras modalidades, a proporçãomolar média de GIcNAc para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de 12 acerca de 35, de cerca de 13 a cerca de 35, de cerca de 14 a cerca de 35, decerca de 15 a cerca de 35.A presente invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg têm umaproporção molar média de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg de cerca de0,5 a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a proporção molar média deGaINAc para moléculas de CTLA4-lg está entre de cerca de X a cerca de Y,inclusive de X e Y, onde X é 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5,1.6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0 e Y é 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0. Em outrasmodalidades, a proporção molar média de GaINAc para moléculas de Ο-TLA4-lg está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cercade 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 e Y é cerca de 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1ou 4,2. Em outras modalidades, a proporção molar média de GaINAc paramoléculas de CTLA4-lg é de cerca de 0,7 a cerca de 4,1, de cerca de 0,8 acerca de 4,0, de cerca de 0,9 a cerca de 3,9 ou cerca de 1,0 a cerca de 3,8ou cerca de 1,1 a cerca de 3,7. Em outras modalidades, a proporção molarmédia de GaINAc para moléculas de CTLA4-lg é de cerca de 1,6 a cerca de

3.7, de cerca de 1,7 a cerca de 3,6, de cerca de 1,8 a cerca de 3,5 ou cercade 1,9 a cerca de 3,4.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-cuias de CTLA4-lg, em que a composição de CTLA4-lg exibe bandas emfaixas de pl conforme determinado sobre um gel de focalização isoelétrica(gel IEF) como segue : de cerca de 10 a cerca de 22 bandas na faixa de plde cerca de 4,3 a cerca de 5,6; intensidade de banda cumulativa de cerca de90% a cerca de 110% em uma faixa de pl de cerca de 4,3 a cerca de 5,3 ecerca de 3m, bandas principais em uma faixa de pl de cerca de 4,5 a cercade 5,2. Em uma modalidade, as bandas na faixa de cerca de 4,3 a cerca de5,6 são de cerca de 5 a cerca de 30, de cerca de 6 a cerca de 29, de cercade 7 a cerca de 28, de cerca de 8 a cerca de 27, de cerca de 9 a cerca de26, de cerca de 10 a cerca de 25, de cerca de 11 a cerca de 24, de cerca de12 a cerca de 23, de cerca de 13 a cerca de 22, de cerca de 14 a cerca de21, de cerca de 15 a cerca de 20, de cerca de 16 a cerca de 19, de cerca de17 a cerca de 20, de cerca de 18 a cerca de 19.Moléculas de CTLA4-lq e CTLA4A29YL104E-lq Glicosiladas e Populaçõesdas Mesmas

Sem limitação, glicosilação pode se referir à adição de estruturasde oligossacarídeo complexas a uma proteína em sítios específicos dentroda cadeia polipeptídica. Glicosilação de proteínas e o subsequente proces-samento de carboidratos adicionados pode afetar a duplicação e estruturade proteína, estabilidade de proteína, incluindo meia-vida da proteína e pro-priedades funcionais de uma proteína. A glicosilação de proteína pode serdividida em duas classes em virtude do contexto de seqüência onde a modi-ficação ocorre, glicosilação O-Iigada e glicosilação N-ligada. PolissacarídeosO-Iigados são ligados a um grupo hidroxila, usualmente ao grupo hidroxilade um resíduo de serina ou treonina. O-glicanas não são adicionadas a cadaresíduo de serina e treonina. Oligossacarídeos O-Iigados são usualmentemono ou biantenários, isto é, eles compreendem uma ou no máximo duas ramificações (antenas) e compreendem de um a quatro tipos diferentes deresíduos de açúcar, os quais são adicionados um a um.

Polissacarídeos N-Iigados são presos ao nitrogênio da amida deuma asparagina. Apenas asparaginas que são parte de uma de duas se-qüências tripeptídicas, quer asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina(onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina), são alvos para glicosilação.Oligossacarídeos N-Iigados podem ter de uma a quatro ramificações referi-das como mono-, bi-, tri- e tetra-antenárias. As estruturas de resíduos deaçúcar encontrados em oligossacarídeos N- e O-Iigados são diferentes. Adespeito dessa diferença, o resíduo terminal sobre cada ramificação de po-lissacarídeos N- e O-Iigados pode ser modificado através de uma moléculade ácido siálico, uma modificação referida como revestimento de ácido siáli-co. O ácido siálico é um nome comum para uma família de monossacarídeoscom nove carbonos únicos, os quais podem ser ligados a outros oligossaca-rídeos. Dois membros na família são ácido N-acetil neuramínico, abreviadocomo Neu5Ac ou NANA e ácido N-glicolil neuramínico, abreviado comoNeu5Gc ou NGNA.

A forma mais comum de ácido siálico em seres humanos é NA-NA. Ácido N-acetil neuramínico (NANA) é a espécie de ácido siálico primáriapresente em moléculas de CTLA4-lg. Contudo, deve ser notado que níveismínimos, mas detectáveis, de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) tambémestão presentes em moléculas de CTLA4-lg. Além disso, o método descritoaqui pode ser usado para determinar o número de mois de ácido siálico paraNANA e NGNA e, portanto, os níveis de NANA e NGNA são determinados ereportados para moléculas de CTLA4-lg. Oligossacarídeos N- e O-Iigadostêm diferentes números de ramificações, as quais proporcionam diferentesnúmeros de posições às quais moléculas de ácido siálico podem ser presas.

Oligossacarídeos N-Iigados podem proporcionar até quatro posições de fixa-ção para ácidos siálicos, enquanto que oligossacarídeos O-Iigados podemproporcionar dois sítios para fixação de ácido siálico.

Proteínas glicosiladas (glicoproteínas), muitas das quais foramproduzidas através de métodos de tecnologia de DNA recombinante, são degrande interesse como agentes diagnósticos e terapêuticos. Muitas proteí-nas transmembrana eucariotas destinadas a uma superfície celular e proteí-nas secretadas são pós-traducionalmente modificadas para incorporar gru-pos carboidrato N-Iigado e O-ligado. Oligossacarídeos N-Iigados são presosa resíduos de asparagina quando eles são parte do motivo peptídico Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina. Oligossacarí-deos O-Iigados são presos a resíduos de serina ou treonina. As estruturasde oligossacarídeos N-Iigados e O-ligados, bem como os resíduos de açúcarencontrados em cada um podem ser diferentes. Um tipo de açúcar que écomumente encontrado em ambos é ácido N-acetil neuramínico (NANA; aquidepois referido como ácido siálico). Usualmente, ácido siálico é o resíduoterminal de oligossacarídeos N-Iigados e O-ligados. A glicoproteína, em vir-tude de sua carga negativa, pode exibir propriedades ácidas.

Supõe-se que proteínas glicosiladas exercem papéis em dupli-cação aumentada de proteína, regulação de seleção e tráfego celular, pre-venção de agregação de proteína, mediação de adesão célula-célula e au-mento de resistência à proteólise. Em organismos eucariotas, a natureza eextensão de glicosilação pode ter um impacto profundo sobre a meia-vidaem circulação e bioatividade de produtos terapêuticos de glicoproteína atra-vés de processos os quais envolvem endocitose mediada por receptor e de-puração. Acredita-se que sistemas receptor-mediados exerçam um papelprincipal na eliminação de glicoproteínas no soro através de reconhecimentode vários componentes de anticorpo do oligossacarídeo. O grupo ácido siáli-co terminal de uma glicoproteína pode afetar a absorção, meia-vida e clea-rance no soro. Assim, estratégias de produção de glicoproteína, as quaismantêm o componente ácido siálico terminal da proteína glicosilada, podemaumentar a biodisponibilidade e meia-vida no soro de uma proteína. Váriosparâmetros de processo de produção foram investigados referentes à sínte-se de glicoproteína, especialmente o efeito da composição do meio e desvi-os de temperatura em várias estratégias de produção.

Dímeros de CTLA4-lg composta de monômeros tendo a se-qüência de aminoácido de resíduos (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO:2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2 podem terum MW teórico previsto de cerca de 78.000 a cerca de 79.000 Dáltons. Con-tudo, o MW para tais dímeros obtidos através de MALDI-TOF é de aproxi-madamente 91.000 Dáltons. Essa diferença no MW de aproximadamente13.000-14.000 Dáltons é em virtude, pelo menos em parte, de glicosilação aqual, em uma modalidade, responde por aproximadamente 15% da massadesse monômero de molécula de CTLA4-lg em particular. Os monômerosespecificados acima têm três sítios de glicosilação N-Iigada que foram con-firmados, através de mapeamento peptídico, como ocorrendo em asparagi-nas nos resíduos 102, 134 e 233 de SEQ ID NO: 2. Moléculas de carboidratoque são ligadas através de asparagina pode ser clivadas seletivamente u-sando a enzima Glicosidase F de Peptídeo-N (PNGase F). Em um caso, tra-tamento do monômero tendo a seqüência 27-383 de SEQ ID NO: 2 comPNGase F resultou em uma espécie com um MW de aproximadamente80.200 Dáltons e, em virtude do fato de o MW teórico desse monômero sercerca de 80.200, o tratamento sugeriu que os 1.400 Dáltons não contados(80.200 - 78.800 = 1.400) podem ser em virtude de glicosilação O-ligada.Embora existam i números resíduos de serina e treonina que têm o potencialde ser sítios de glicosilação, apenas dois sítios O-Iigados foram identifica-dos: Ser155 e Ser165 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a glicana pre-dominante presa nesses dois sítios é HexNAc-Hex-NeuAc.

Por exemplo, a figura 9 apresenta uma visão geral das estrutu-ras de carboidrato N-Iigadas e O-Iigadas sobre moléculas de CTLA4-lg com-preendidas de monômeros tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 2 (isto é,um monômero tendo uma das seguintes seqüências: (i) 26-383 de SEQ IDNO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382de SEQ ID NO: 2), (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ IDNO: 2 em que, em uma modalidade, tais moléculas com as característicasde carboidrato mostradas são produzidas através de uma linhagem de célulada invenção ou prole da mesma de acordo com o método de produção des-crito nos Exemplos 14-15 e também mostrada na figura 10. As principaisestruturas listadas para cada sítio são baseadas em técnicas ortogonais (ve-ja aqui). Para cada estrutura, é estimado um percentual dessa estrutura ob-servada durante esses experimentos. Esses percentuais representam asmelhores estimativas a partir de técnicas ortogonais.

Dímeros de CTLA4A29YL104E-lg compostos de monômeros tendoa seqüência de aminoácido de resíduos (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ IDNO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4 podemter um MW teórico previsto de cerca de 78,000 a cerca de 79.000 Dáltons.Contudo, o MW para tais dímeros obtidos através de MALDI-TOF é de apro-ximadamente 91.500 Dáltons. Essa diferença no MW de aproximadamente12.000-13.000 Dáltons é em virtude, pelo menos em parte, de glicosilação.Os monômeros especificados acima têm três sítios de glicosilação N-Iigadaque foram confirmados através de mapeamento por peptídeo como ocorren-do nas asparaginas nos resíduos 102, 134 e 233 de SEQ ID NO: 4 (N76,N108 e N207 da figura 4). Moléculas de carboidrato que são ligadas atravésde asparagina podem ser clivadas seletivamente usando a enzima Glicosi-dase F de Peptídeo-N (PNGase F). Embora existam i números resíduos deserina e treonina que têm o potencial de ser sítios de glicosilação, apenastrês sítios O-Iigados foram identificados: Ser149, Ser155 e Ser165 de SEQID NO: 4 (veja Tabela 25 no EXEMPLO 22). Em uma modalidade, a glicanapredominante presa a esses sítios é HexNAc-Hex-NeuAc.

Em determinadas modalidades, moléculas de CTLA4-lg ou C-TI_A4A29YL104E-lg são glicoproteínas que podem ser produzidas através dosmétodos de cultura da invenção. Em uma modalidade, glicoproteínas de C-TLA4-lg são modificadas com oligossacarídeos que representam aproxima-damente 15% (peso/peso) da molécula. Esses oligossacarídeos podem e-xercer um papel importante nos parâmetros farmacocinéticos (PK) de umaglicoproteína de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg. Além disso, diferentes per-fis de oligossacarídeo podem influenciar a estabilidade e degradação de pro-teínas. Por exemplo, oligossacarídeos O-Iigados podem intensificar a estabi-lidade de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg impedindo a autolise na região dedobradiça da região constante de imunoglobulina.

A distribuição de oligossacarídeo sobre uma população de molé-culas de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg pode ser de natureza heterogêneaem virtude da complexidade da cultura de célula e processos. A heteroge-neidade pode estar presente em virtude de sítios de glicosilação sendo com-pletamente ocupados e não ocupados e pelo fato de que qualquer sítio es-pecífico pode ser habitado com muitas estruturas de oligossacarídeo diferen-tes, as quais podem ainda mostrar variação no padrão de modificação deácido siálico.

Em uma modalidade, a porção ácido siálico primária sobre mo-léculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg é ácido N-acetil neuramínico(NeuAc, NANA) e a porção ácido siálico secundária é ácido N-glicolil neura-mínico (NGNA). A natureza carregada do ácido siálico e as estruturas com-plexas contendo ácido siálico podem resultar em múltiplas isoformas de C-TLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg, respectivamente, onde tais isoformas podemser evidentes em um perfil de focalização isoelétrica (IEF). Por exemplo, vejafigura 11 e Exemplo 3 para perfil de IEF de CTLA4-lg. Adicionalmente, vejafigura 12 e EXEMPLO 22 para perfil de IEF de CTLA4A29YL104E-lg.Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg que têm uma isoforma de CTLA4-lg dominante ten-do um ponto isoelétrico (pl) que é menos de ou igual a 5,1 ou 5,0, o qual po-de ser determinado, por exemplo, através de IEF. Em outra modalidade, éproporcionada uma população de moléculas de CTUMa29yu 04E-lg é que temisoformas de CTLA4A29YL104E-lg dominantes tendo um ponto isoelétrico (pl)que é menos de ou igual a 5,5, o qual pode ser determinado, por exemplo,através de IEF (FIG. 12).

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg que têm um pl de cerca de 4,2 a cerca de 5,7, decerca de 4,25 a cerca de 5,5, de cerca de 4,3 a cerca de 5,3 ou de cerca de4,5 a cerca de 5,2. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma popu-lação de moléculas de CTLA4-lg que têm um pl de cerca de 4,45 a cerca de5,30. Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg que têm um pl de cerca de 4,3 a cerca de 5,1. Emuma modalidade em particular, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg que têm um pl de cerca de 4,45 a cerca de 5,0. Emuma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas deCTLA4-lg onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% dasmoléculas na população exibem um ponto isoelétrico de menos do que ouigual a cerca de 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5,4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8,2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 ou 2,1 conforme determinado através de IEF(esses valores podem ter um desvio-padrão de ± 0,2). Em uma modalidade,a invenção proporciona um método para preparo de uma população de mo-léculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 4,45 a cerca de 5,30 ou decerca de 4,45 a cerca de 5,1 ou de cerca de 4,45 a cerca de 5,0, em que ométodos envolve sujeição de uma população de moléculas de CTLA4-lg àeletroforese em gel de IEF, em que uma única banda sobre o gel representa a subpopulação de moléculas de CTLA4-lg tendo um pl em particular e iso-lamento da subpopulação de moléculas de CTLA4-lg tendo o pl em particu-lar através de excisão da banda do gel e subsequente purificação das prote-ínas da banda de gel excisada.

Em outras modalidades, a invenção proporciona uma populaçãode moléculas de CTUMa29yl1°4E-lg que têm um pl de cerca de 4,5 a cerca de5,2. Em outras modalidades, a invenção proporciona uma população de mo-léculas de CTLA4A29YL104E-lg que têm um pl de cerca de 4,7 a cerca de 5,1.Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculasde CTI_A4A29YL104E-lg que têm um pl de cerca de 2,0 a cerca de 5,2. Em umamodalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de C-TLA4A29YL104E_|g onde pelo menos 40% 50% 60% 70% 80% 90% ou 95%das moléculas na população exibem um ponto isoelétrico de menos do queou igual a cerca de 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3,4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 ou 3,0 conforme deter-minado através de IEF (esses valores podem ter um desvio-padrão de ±0,2). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para preparode uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg tendo um pl de cercade 4,5 a cerca de 5,2; de cerca de 4,7 a cerca de 5,1; de cerca de 2,0 a cer-ca de 5,2, em que o método envolve sujeição de uma população de molécu-las de CTLA4A29YL104E-lg à eletroforese em gel de IEF, em que uma únicabanda sobre o gel representa uma subpopulação de moléculas de C-TLA4A29YL104E-lg tendo um pl em particular e isolamento da subpopulação demoléculas de CTI_A4A29YL104E-lg tendo o pl em particular através de excisãoda banda do gel e subsequente purificação das proteínas da banda de gelexcisada.

Em determinadas modalidades, a invenção proporciona umapopulação de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média demois de grupos ácido siálico para mois de moléculas de CTLA4-lg de: cercade 6 a cerca de 32, cerca de 8 a cerca de 32, cerca de 11 a cerca de 30,cerca de 12 a cerca de 20, cerca de 13 a cerca de 19, cerca de 14 a cercade 18, cerca de 15 a cerca de 17, cerca de 6 a cerca de 16, cerca de 8 acerca de 16, cerca de 8 a cerca de 14, cerca de 8 a cerca de 12.

Em algumas modalidades, um máximo permissível de proteínade célula hospedeira de CHO de < 25 ppm a < 10 ng/mg caracteriza a com-posição de moléculas de CTLA4-lg. Em outra modalidade, a composição demoléculas de CTLA4-lg é caracterizada por DNA de célula hospedeira emum nível de <2,5 pg/mg a <1,0 pg/mg. Em outra modalidade, a composiçãode moléculas de CTLA4-lg é caracterizada por Triton X-100 em um nível de<1,0 ng/mg ou <1,0 ppm. A concentração de Triton X-100 pode ser determi-nada através de extração do Triton X-100 usando extração em fase sólidasobre Waters OASIS-HLB, seguido por lavagem com água para remover aproteína residual. O Triton X-100 ligado é removido através de eluição comacetonitrila. O eluato de acetonitrila é analisado através de cromatografia defase reversa usando uma coluna SAS Hypersil de 5 μηι e uma fase móvelconsistindo em acetonitrila: água (80: 20). Detecção é através de absorbân-cia de UV a 225 nm. Em uma modalidade, a composição de moléculas deCTLA4-lg é caracterizada por deamidação uma área de oxidação <2,5% euma área de <2,0%. Em outra modalidade, a composição de moléculas deCTLA4-lg é caracterizada por uma área de oxidação <3,0% e uma área dedeamidação <2,5%. O método de mapeamento com peptídeo tríptico foi u-sado para quantificação de oxidação e deamidação. Os dados de oxidaçãopercentual foram determinados através do uso de um ensaio de mapeamen-to tríptico por RP-HPLC que quantifica a área de oxidação percentual deMet85 na proteína de CTLA4-lg em sulfóxido de metionina. A oxidação per-centual no método é obtida através de medição por UV das áreas de pico nomapeamento tríptico por RP-HPLC para o peptídeo tríptico T6, compreendi-do dos resíduos 84-93 contendo Met85 e o peptídeo tríptico oxidado corres-pondente T6ox, contendo Met(0)85. A área de oxidação percentual deMet85 em Met(0)85 é proporcional à área percentual do pico de T6ox: Oxi-dação percentual = 100 * AT6oχ/ (AT6ox + AT6), onde, AT6 = área de picopara peptídeo tríptico T6, (84-93). AT6ox = área de pico para peptídeo trípti-co T6ox, Met(0)85(84-93). Os dados de deamidação percentual, adquiridosatravés de uso de um ensaio de mapeamento tríptico por RP-HPLC quequantifica a área de oxidação e deamidação percentual, é obtida através demedição por UV das áreas de pico no mapeamento tríptico por RP-HPLCpara o peptídeo tríptico T26, compreendido dos resíduos 281-302 contendoAsn294 e o peptídeo tríptico desamidado correspondente T26deam1, con-tendo isoAsp294. A área percentual deamidação de Asn294 em isoAsp294,então, é proporcional à área percentual do pico de T26deam1: onde, AT26 =área de pico para T26, (281-302), AT26deam1 = área de pico paraT26deam1, isoAsp294(281-302). AT26deam2 = área de pico para T26deam2,Asp299(281 -302). AT26deam3 = área de pico para T26deam3, Asp294(281-302). AT26deam4 = área de pico para T26deam4, Asu294(281-302).

Em outra modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-lgé caracterizada por N-Acetil glicosamina (GIcNAc) de 15 a 35 Mols: Mol deproteína de CTLA4-lg ou N-Acetil galactosamina (GaINAc) de 1,7 a 3,6 Mols:Mol de proteína de CTLA4-lg. Os amino monossacarídeos são quantificadosatravés de eletroforese capilar (CE) após liberação da proteína através dehidrólise ácida. Os amino monossacarídeos liberados são re-acetilados efluorescentemente rotulados com ácido aminopireno trissulfônico (APTS)para facilitar sua detecção e quantificação. N-Acetil manosamina é adiciona-da à amostra e padrões de amino monossacarídeo para servir como um pa-drão interno. As áreas de pico dos amino monossacarídeos nas amostrassão normalizados usando o padrão interno e quantificados através de com-paração com sua respectiva área de pico de amino monossacarídeos nor-malizada no padrão. A proporção molar de cada monossacarídeo com rela-ção à molécula de CTLA4-lg é então, calculada.

Em uma modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-lg écaracterizada pelas seguintes especificações de perfil de oligossacarídeo N-ligado:

Especificações de perfil de Oligossacarídeo N-Iigado

<table>table see original document page 162</column></row><table>

Em uma modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-lg écaracterizada por monossacarídeos neutros onde a composição tem propor-ções de cerca de:Galactose: 8,0 a 17 Mols: Mol de proteína de CTLA4-lgFucose: 3,5 a 8,3 Mols: Mol de proteína de CTLM-IgManose: 7,7 a 22 Mols: Mol de proteína de CTLA4-lg ouGalactose: 9,0 a 17 Mols: Mol de proteína de CTLA4-lgManose: 11 a 19 Mols: Mol de proteína de CTLA4-lg.

Composição ilustrativa de Monossacarídeo neutro: Mols: Mol de Proteína deGalactose, Fucose e Manose

<table>table see original document page 163</column></row><table>

Em outra modalidade, a faixa de proporção molar de monossa-carídeo para uma composição de CTI_A4A29YL104E-lg é como segue : manosede cerca de 10-20 mols/mol de proteína; fucose de cerca de 4,2 -7,0mols/mol de proteína; e galactose de cerca de 9,2 -17 mols/mol de proteína.

Em outra modalidade, a composição de CTI_A4A29YL104E-lg é caracterizadapor uma proporção molar de NANA de cerca de 5,0 -10,0 mol de NANA/molde proteína. Em outra modalidade, a composição de CTI_A4A29YL104E-lg é ca-racterizada por uma proporção molar de NGNA de < 1,5 mol NGNA/mol deproteína. Em algumas modalidades, o desvio % da proporção molar paraácido siálico é < 15% ou < 20% ou < 30%.

Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4-lgpode compreender monômeros de CTLA4-lg que cada um tem pelo menos 3grupos ácido siálico. Em outra modalidade, uma população de moléculas deCTLA4-lg compreende monômeros de CTLA4-lg que cada um tem de 3 a 8grupos ácido siálico.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%ou 95% das moléculas na população exibem um ponto isoelétrico de menosdo que ou igual a cerca de 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7,4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 ou 3,0.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de moisde NANA para mois de moléculas de CTLA4-lg ou dímejo de: cerca de 6 acerca de 16, cerca de 6 a cerca de 14, cerca de 6 a cerca de 12, cerca de 8a cerca de 12, cerca de 8 a cerca de 14, cerca de 8 a cerca de 16.

Em outras modalidades, a invenção proporciona uma populaçãode moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de mois deNGNA para mois de moléculas de CTLA4-lg ou dímero de menos do que ouigual a cerca de 2, 1,8, 1,6, 1,5, 1,4, 1,0, 0,8 ou 0,5.

Em modalidades particulares, a invenção proporciona uma popu-lação de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg tendo uma proporção molar médiade mois de grupos ácido siálico para mois de moléculas ou dímeros de C-TI_A4A29YL104E-lg de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. Em outra modalidade, a in-venção proporciona uma população de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg ten-do uma proporção molar média de mois de grupos ácido siálico para mois demoléculas ou dímeros de CTI_A4A29YL104E-lg de cerca de 5 a cerca de 10.

Em uma modalidade, uma população de moléculas de C-TLA4A29YLi04E_|g pode compreender monômeros de CTLA4A29YL104E-lg quetêm, cada um, pelo menos 2,5 grupos ácido siálico. Em outra modalidade,uma população de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg compreende monômerosde CTI_A4A29YL104E-lg que têm, cada um, de 2,5 a 5 grupos ácido siálico.

Em outras modalidades, a invenção proporciona uma populaçãode moléculas de CTLA4-lg que se distinguem por uma proporção molar mé-dia da população de mois de amino monossacarídeos e/ou monossacarí-deos neutros e/ou ácido siálicos para mois de moléculas ou dímeros de C-TLA4-lg. Em modalidades particulares, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg que se distinguem por uma propor-ção molar média da população de mois de amino monossacarídeos e/oumonossacarídeos neutros e/ou ácido siálicos para mois de moléculas ou dí-meros de CTLA4A29YL104E-lg. Amino monossacarídeos incluem N-acetil galac-tosamina (GaINAc) e N-acetil glicosamina (GIcNAc). Monossacarídeos neu-tros incluem manose, fucose e galactose. Ácidos siálicos incluem ácido N-acetil neuramínico (NANA) e ácido N-glicolil neuramínico (NGNA).

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg que são caracterizadas por uma proporção molarmédia de mois de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou para moléculade CTLA4-lg que é de cerca de 10 a cerca de 40, de cerca de 15 a cerca de35, de cerca de 15 a cerca de 25 ou de cerca de 15 a cerca de 20. Em outramodalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de C-TLA4-lg onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das mo-léculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média demois de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de C-TLA4-lg que é menos de ou igual a cerca de 40, 38, 35, 30, 25, 20, 18 ou 15.

Em outra modalidade, a invenção proporciona uma populaçãode moléculas de CTLA4-lg que são caracterizadas por uma proporção molarmédia de mois de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg ou para moléculade CTLA4-lg que é de cerca de 1,5 a cerca de 8,5, de cerca de 1,7 a cercade 3,0, de cerca de 1,7 a cerca de 4,0, de cerca de 1,7 a cerca de 5,0, decerca de 1,7 a cerca de 6,0, de cerca de 1,7 a cerca de 7,0, de cerca de 1,7a cerca de 8,0 ou de cerca de 1,7 a cerca de 8,3. Em outra modalidade, ainvenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg onde pelomenos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na popula-ção são caracterizadas por uma proporção molar média de mois de GaINAcpor mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg que é menosde ou igual a cerca de 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4,0, 3,8, 3,6, 3,5, 3,0,2,5, 2,0, 1,7 ou 1,5.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg que são caracterizadas por uma proporçãomolar média de mois de galactose por mol de dímero de CTLA4-lg ou paramolécula de CTLA4-lg que é de cerca de 7,5 a cerca de 20,0, de cerca de8,0 a cerca de 19,0, de cerca de 8 a cerca de 18,0, de cerca de 8,0 a cercade 17,0, de cerca de 8,5 a cerca de 17,0 ou de cerca de 9,0 a cerca de 17,0.

Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculasde CTLA4-lg onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% dasmoléculas na população são caracterizadas por uma proporção molar médiade mois de galactose por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula deCTLA4-lg que é menos de ou igual a cerca de 20,0, 19,0, 18,0, 17,0, 16,0,15,0, 14,0, 13,0, 12,0, 11,0, 10,0, 9,0, 8,5, 8,0 ou 7,5.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg que são caracterizadas por uma proporçãomolar média de mois de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg ou para mo-lécula de CTLA4-lg que é de cerca de 3 a cerca de 8,5, de cerca de 3,5 acerca de 8,5, de cerca de 3,5 a cerca de 8,3, de cerca de 3,5 a cerca de 8,0,de cerca de 3,5 a cerca de 7,5 ou de cerca de 3,5 a cerca de 7,0. Em outramodalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de Ο-TLA4-lg onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das mo-léculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média demois de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-Ig que é menos de ou igual a cerca de 8,5, 8,3, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5,5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,2 ou 3,0.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg que são caracterizadas por uma proporçãomolar média de mois de manose por mol de dímero de CTLA4-lg ou paramolécula de CTLA4-lg que é de cerca de 7 a cerca de 23, de cerca de 7,5 acerca de 23, de cerca de 7,7 a cerca de 23, de cerca de 7,7 a cerca de 22,5,de cerca de 7,7 a cerca de 22, de cerca de 7,7 a cerca de 20, de cerca de7,7 a cerca de 18, de cerca de 7,7 a cerca de 16, de cerca de 8,0 a cerca de16,0, de cerca de 9,0 a cerca de 17,0, de cerca de 10 a cerca de 19,0 ou decerca de 11 a cerca de 19,0. Em outra modalidade, a invenção proporcionauma população de moléculas de CTLA4-lg onde pelo menos 40%, 50%,60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população são caracteriza-das por uma proporção molar média de mois de manose por mol de molécu-las ou dímeros de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg que é menos deou igual a cerca de 23, 22,5, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,10, 9,5,9, 8,5, 8,7,7,7,5,7,3 ou 7.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma populaçãoglicosilada de CTLA4-lg que exibe valores de PK aumentados, tal como ex-posição aumentada conforme medido através da área sob a curva (AUC), talcomo resultante de ou conforme demonstrado pela clearance diminuída dosoro, ao mesmo tempo em que retém a bioatividade. Em outra modalidade,a invenção proporciona uma população de CTI_A4A29YL104E-lg glicosilada queexibe valores de farmacocinética (PK) aumentados conforme demonstradoatravés da clearance diminuída do soro, ao mesmo tempo em que retém abioatividade.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona análogos demoléculas solúveis de CTLA4-lg, as quais têm sítios de glicosilação adicio-nais. Em outras modalidades, a invenção proporciona análogos de molécu-las solúveis de CTI_A4A29YL104E-lg, as quais têm sítios de glicosilação adicio-nais. Sítios de glicosilação adicionais proporcionam pontos de fixação paraestruturas de carboidrato adicionais que podem ser sialiladas. Teor aumen-tado de ácido siálico pode levar a valores de PK aumentados e/ou estabili-dade aumentada da glicoproteína. Maior teor de ácido siálico é benéfico.Métodos de pós-purificação in vitro que usam enzimas para adicionar maisácidos siálicos podem ser realizados para produzir outras modalidades dasmoléculas de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg da invenção.

As modalidades da invenção incluem qualquer uma das faixasdescritas aqui em combinação com qualquer uma ou mais faixas descritasaqui. As modalidades da invenção incluem qualquer característica ou propri-edade de CTLA4-lg descritas aqui em combinação com qualquer uma oumais características ou propriedades de CTLA4-lg descritas aqui.Métodos para análise e Isolamento de glicoproteínas de CTLA4-lg eCTLA4A29YL104E-lq

Os métodos descritos aqui a seguir podem ser usados para dis-tinguir, identificar ou isolar populações de moléculas de CTLA4-lg ou C-TI_A4A29YL104E-lg em particular com base em vários perfis de açúcar incluin-do, mas não limitado a, uma proporção molar média da população de moisde amino monossacarídeos e/ou monossacarídeos neutros e/ou ácidos siáli-cos por mol moléculas ou dímeros de CTLA4-lg ou CTLA^9yli04e-Iq.

Uma glicoproteína que é secretada de células cultivadas podeser isolada do meio de cultura ou sobrenadante. A glicoproteína produzidapelas células é coletada, recuperada, isolada e/ou purificada ou substanci-almente purificada, conforme desejado, ao final do período de cultura de cé-lula total usando métodos de isolamento e purificação conforme conhecido epraticado na técnica ou conforme descrito aqui. Em uma modalidade, umaglicoproteína da invenção, a qual é expressa pela célula mas não secretadapela célula, ainda pode ser recuperada das células, por exemplo, fazendoIisatos de célula e isolando a glicoproteína e/ou usando métodos que sãoconhecidos e praticados na técnica e conforme ainda descritas abaixo.

A glicoproteína produzida através de um processo de cultura decélula da presente invenção compreende carboidratos complexos que po-dem ser analisados através de várias técnicas de análise de carboidrato. Porexemplo, técnicas tais como blotting de lectina, bem-conhecidos na técnica,revelam proporções de manose terminal ou outros açúcares, tais como ga-lactose. Término de oligossacarídeos mono-, bi-, tri- ou tetra-antenários porácidos siálicos pode ser confirmado através de liberação de açúcares daproteína usando hidrazina anídrica ou métodos enzimáticos e fracionamentode oligossacarídeos através de cromatografia de troca de íons, cromatogra-fia por exclusão de tamanho ou outros métodos que são conhecidos na téc-nica.

Existem dois tipos principais de ligações glicosídicas encontra-das em glicoproteínas, N- e O-ligação. N-glicosilações são criadas atravésda ligação covalente da glicana ao nitrogênio da amida de um resíduo deasparagina. Ligações O-glícosídicas são criadas através da ligação covalen-te do grupo hidroxila de serina, treonina, hidroxilisina ou hidroxiprolina à gli-cana. As porções de carboidrato de glicoproteínas estão envolvidas em nu-merosos fenômenos de reconhecimento molecular, incluindo interaçõeshospedeiro-patógeno, clearance do soro e direcionamento de diferentes te-cidos. Com relação à moléculas de CTLA4-lg e CTLMa29yl104e"^ porçõesde carboidrato podem afetar pelo menos a ligação entre moléculas de C-TLA4-lg e CD80 ou CD86 ou entre moléculas de CTLA4A29YL104E-lg e CD80ou CD86.

Estruturas de carboidrato ocorrem, tipicamente, sobre uma pro-teína expressa como carboidratos N-Iigados ou O-ligados. Os carboidratosN-Iigados e O-Iigados diferem primariamente quanto às suas estruturas cen-trais. glicosilação N-Iigada se refere à fixação da porção de carboidrato, viaGIcNAc, a um resíduo de asparagina na cadeia peptídica. Em uma modali-dade, os carboidratos N-Iigados contêm todos uma estrutura central deMan1-6(Man1-3)Manp1-4Glc- NAcpI-4GlcNAcp-R em comum, onde R nessaestrutura central representa um resíduo de asparagina. A seqüência peptídi-ca da proteína produzida conterá uma asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido, excetoprolina.

Em contraste, carboidratos O-Iigados são caracterizados poruma estrutura central em comum, a qual contém GaINAc presa ao grupohidroxila da treonina ou serina. Dos carboidratos N-Iigados e O-ligados, osmais importantes são os carboidratos N- e O-ligados complexos. Tais car-boidratos complexos contêm várias estruturas antenárias. As estruturas mo-no·, bi-, tri, - e tetra-antenárias são importantes para a adição de ácidos siá-Iicos terminais. Tais estruturas de cadeia externa proporcionam sítios adicio-nais para os açúcares específicos e ligações que compreendem os carboi-dratos dos produtos de proteínas.

Glicoproteínas terapêuticas são freqüentemente produzidas u-sando técnicas de cultura de células de DNA recombinante. A distribuição deglicosilação de proteína em cultura de células pode ser afetada por varia-ções no pH, densidade celular, concentrações de nutriente e concentraçõesde metabólito. A sensibilidade de distribuições de glicana a efeitos ambien- tais torna necessário monitorar cuidadosamente a distribuição de glicanadurante desenvolvimento e produção de produto de forma a assegurar queum produto reproduzível seja fabricado.O desenvolvimento de glicoproteínas recombinantes - derivadaspara uso terapêutico levou a uma demanda crescente por métodos para ca-racterizar e obter um perfil de suas estruturas de carboidrato. Mapeamentode oligossacarídeos foi usado para caracterização inicial de proteínas re-combinantes para comparação com a proteína nativa, para identificar estru-turas de oligossacarídeos presentes, para monitorar a consistência da com-posição de oligossacarídeo, para avaliar alterações que podem resultar deuma mudança na cultura de células ou processo de produção e identificaralterações na glicosilação que ocorrem como um resultado de expressão emdiferentes linhagens de células.

Uma variedade de técnicas está disponível para avaliar distribui-ções estruturais de carboidrato. Essas incluem filtração em gel, técnicas deseparação cromatográficas e eletroforéticas acopladas com uma ampla faixade técnicas de detecção. Se as quantidades de amostra são limitadas, asglicoproteínas são, freqüentemente, derivatizadas com reagentes fluorescen-tes, tais como ácido 2-aminobenzóico e 2-aminopiridina de forma a melhorara detecção. Contudo, derivatização e purificação dos derivados pode con-sumir tempo. Quando o tamanho de amostra não é um problema, avaliaçãodireta de distribuições estruturais de carboidrato é possível.

Análise do teor de oligossacarídeo de uma qlicoproteína

Uma glicoproteína em particular pode mostrar heterogeneidadede carboidratos. A heterogeneidade pode ser observada em vários níveis:sítios de glicosilação podem variarde completamente ocupados a desocupa-dos e qualquer sítio específico pode ter uma população de muitas estruturasde oligossacarídeo diferentes, em que cada estrutura pode ser modificadapor moléculas de ácido siálico, tais como NANA ou NGNA.

O teor de carboidrato da proteína da presente invenção pode seranalisado através de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodosdescritos nos Exemplos aqui. Vários métodos são conhecidos na técnicapara análise de glicosilação e são úteis no contexto da presente invenção.

Esses métodos proporcionam informação com relação à identidade e acomposição do oligossacarídeo preso ao peptídeo produzido. Métodos paraanálise de carboidrato úteis com relação à presente invenção incluem, masnão estão limitados a, cromatografia de Iecitina1 cromatografia de troca deíons de elevado desempenho combinada com detecção amperométrica pul-sada (HPAEC-PAD), a qual usa cromatografia de troca de ânions em pHelevado para separar oligossacarídeos baseado na carga; RMN; Espectro-metria de Massa; HPLC; cromatografia em carbono grafítico poroso (GPC).

Métodos para liberação de oligossacarídeo são conhecidos. Es-ses métodos incluem 1) métodos enzimáticos, os quais são comumente rea-lizados usando N-glicosidase F/ endo-a-galactosidase; 2) métodos de β-eliminação, usando o ambiente rigoroso alcalino para liberar principalmenteestruturas O-ligadas; e 3) métodos químicos usando hidrazina anídrica paraliberar oligossacarídeos O-Iigados e N-ligados. Métodos para análise podemcompreender as seguintes etapas: 1. diálise da amostra contra água desio-nizada para remover todos os sais de tampão, seguido por liofilização. 2.Liberação de cadeias de oligossacarídeos intactas com hidrazina anídrica. 3.tratamento das cadeias de oligossacarídeos intactas com HCI anídrico meta-nólico para liberar monossacarídeos individuais como derivados de O-metila.4. N-acetilação de quaisquer grupos amino primários. 5. Derivatização paraproporcionar glicosídeos de per-O-trimetil-silil metila. 6. Separação dessesderivados através de cromatografia gasosa - líquido capilar (GLC) sobre umacoluna de CP-SIL8. 7. Identificação de derivados de glicosídeo individuais a-través do tempo de retenção a partir de GLC e espectrometria de massa,comparado com padrões conhecidos. 8. Quantificação de derivados individu-ais através de FID com um padrão interno (triase -O- metil- D- glicose).

A presença de açúcares neutros e amino açúcares pode ser de-terminada usando cromatografia de troca de ânions de elevado desempenhocombinada com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD Carbohy-drate System; Dionex Corp.). Por exemplo, açúcares podem ser liberadosatravés de hidrólise em ácido trifluoroacético a 20% (v/v) a 100°C durante 6horas. Os hidrolisatos são, então, secos através de liofilização ou com umSpeed-Vac (Savant Instruments). Resíduos são, então, dissolvidos em solu-ção de tri-hidrato de acetato de sódio a 1% e analisados sobre uma colunade HPLC-AS6 (conforme descrito por Anumula e outros, 1991, Anal. Bio-chem., 195: 269-280).

Alternativamente, análise de carboidrato por imunoblot pode serrealizada. Neste procedimento, os carboidratos proteína-ligados são detec- tados usando um sistema de detecção de glicana comercial (Boehringer), oqual é baseado no procedimento de imunoblot oxidativo descrito por Hasel-beck e outros (1993, Glvcoconiuqate J.. 7: 63). O protocolo de coloração re-comendado pelo fabricante é seguido, exceto que a proteína é transferidapara uma membrana de difluoreto de polivinilideno ao invés de uma mem- brana de nitrocelulose e os tampões de bloqueio contêm albumina de sorobovino a 5% em tampão de Tris a 10 mM, pH de 7,4 com cloreto de sódio a0,9%. Detecção é realizada com anticorpos antidigoxigenina ligados com umconjugado de fosfatase alcalina (Boehringer), diluição a 1: 1000 em soluçãosalina tamponada com Tris usando os substratos de fosfato, cloreto de 4- nitroblue tetrazólio, 0,03% (p/v) e 5-bromo-4 cloro-3-indolil-fosfato 0,03%(p/v) em tampão de TRIS a 100 mM, pH de 9,5, contendo cloreto de sódio a100 mM e cloreto de magnésio a 50 mM. As bandas de proteína contendocarboidrato são, usualmente, visualizadas em cerca de 10 a 15 minutos.

Carboidratos associados à proteína também podem ser clivados através de digestão com peptídeo-N-glicosidase F. De acordo com esse pro-cedimento, o resíduo é suspenso em 14 μΙ_ de um tampão contendo SDS a0,18%, beta-mercaptoetanol a 18 mM, fosfato a 90 mM, EDTA a 3,6 mM, emum pH de 8,6 e aquecido a 100°C durante 3 minutos. Após esfriar até a tem-peratura ambiente, a mistura de reação é dividida em duas partes aproxima-damente iguais. Uma parte, a qual ainda não foi tratada, serve como umcontrole. A outra parte é ajustada com detergente NP-40 a cerca de 1%, se-guido pela adição de 0,2 unidade de peptídeo-N-glicosidase F (Boehringer).Ambas as partes são aquecidas a 37°C durante 2 horas e, então, analisadasatravés de eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS.

Mapeamento de glicana de glicoproteínas tem se tornado cres-centemente aceito. A metodologia descrita permite a rápida caracterizaçãode oligossacarídeos em termos de tipo de glicana, extensão de sialilação enúmero de ramificações sobre a extremidade de não redução dos carboidra-tos. Assim, em determinadas modalidades, a invenção proporciona uma po-pulação de CTLA4-lg caracterizada por perfis de oligossacarídeo em particu-lar. Definição de perfil de oligossacarídeo é, tipicamente, feita através deseparação cromatográfica dos oligossacarídeos, seguido por detecção equantificação relativa. Uma alternativa à definição de perfil cromatográfica éa análise direta de oligossacarídeos através de infusão por ESI após dessa-linização online.

Definição de perfil de oligossacarídeos através de PGC pode serusada para caracterizar os oligossacarídeos N-Iigados a partir de moléculasde CTLA4-lg. Existem 31 classes estruturais de oligossacarídeos identifica-dos a partir de moléculas de CTLA4-lg (SEQ ID NO: 2) , incluindo uma clas-se estrutural contendo grupos ácido siálico O-acetilados. Verificação daclasse estrutural é obtida através do uso de MS/MS e MS no modo de íonspositivo. Quantificação relativa de classes estruturais é possível através daintegração do traço de UV a 206 nM. Comparação dos perfis de subpopula-ção a partir de sítios de N-ligação individuais é conhecida, revelando dife-renças significativas de populações entre sítios de N-ligação. Definição deperfil de oligossacarídeo usando PGC proporciona uma alternativa rica eminformação conveniente aos métodos de definição de perfil mais tradicionais,tal como HPAEC.

Estruturas N-Iiqadas em moléculas de CTLA4-lg compreendendo mo·nômeros de SEQ ID NO: 2

Existem três sítios de glicosilação N-Iigada por cadeia (isto é, pormonômero) sobre um multímero ou dímero de CTLA4-lg, em que o monôme-ro tem uma seqüência de SEQ ID NO: 2, por exemplo: (i) 26-383 de SEQ IDNO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ IDNO: 2). As variações na glicosilação por sítio são analisadas através de iso-lamento de fragmentos peptídicos contendo glicanas N-Iigadas a partir deuma digestão tríptica da proteína. Os sítios de glicosilação N-Iigada sobreuma proteína estão localizados em Asn102l Asn134 e Asn233, contidos nosfragmentos trípticos 5, 7 e 14, respectivamente. Liberação enzimática deoligossacarídeos N-Iigados a partir dos fragmentos peptídicos isolados, se-guido por definição de perfil por PGC dos oligossacarídeos liberados, resultanos perfis mostrados na figura 13. Está claro a partir do perfil das glicanasliberadas de Asn233 (fragmento tríptico 14, T14) que a população de oligos-sacarídeo é enriquecida nas estruturas de asialo (estruturas que não têmácidos siálicos). Os perfis de oligossacarídeos das glicanas presas emAsn102 e Asn134 (T5 e T7) contêm a parte principal das estruturas sialiladas.

Oligossacarídeos isolados liberados da glicoproteína são direta-mente injetados no sistema de LC/UV/MS de carbono grafítico poroso. Asfiguras 14 e 15 mostram os cromatogramas por TIC e UV de um perfil porPGC típico gerado através de gradientes de acetonitrila contendo aditivosácidos e básicos. Na maioria dos casos, os espectros de massa de um únicopico cromatográfico contêm picos de massa para um único oligossacarídeo.

Trinta classes estruturais de oligossacarídeos são identificadas a partir doperfil de eluição contendo TFA. Apenas dezesseis classes estruturais de oli-gossacarídeos são identificadas a partir do perfil de eluição contendoNH4OH. Dentro de cada classe estrutural existem estruturas variantes con-tendo substituição de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) em lugar de ácidoN-acetil neuramínico (NANA) bem como diferentes graus de acetilação deácido siálico. Embora somente informação quantitativa possa ser obtida apartir de comparação das contagens de íons para as classes de oligossaca-rídeos, é evidente que as principais classes estruturais dentro de cada umdos quatro domínios são P2100, P2111, P2122 e P3133. Isso é consistentecom os valores de integração obtidos a partir do traço de UV a 206 nm. Veri-ficação estrutural adicional pode ser obtida a partir do espectrograma demassa de íons positivos. A ionização no modo de íons positivo promove umafragmentação em fonte de oligossacarídeo, principalmente nas ligações gli-cosídicas. Em virtude do fato de haver boa separação de oligossacarídeos,conforme determinado através dos espectros de massa de íons negativos,os espectros fragmentados do modo de íons positivo imitam os espectros deMS/MS de íons positivos. O Domínio Ill (estruturas dissialiladas) contémuma quantidade significativa de P2122-Ac O-acetilada. Dados de m/s de í-ons positivos sustentam a O-acetilação de um dos ácidos siálicos sobre aestrutura. O sítio de O-acetilação mais comum de resíduos de ácido siálicoestá nas posições C-7 e C-9 (Shi WX, Chammas R., Varki A., J. Biol. Chem.271 (1996) 15130-15188). Em um pH extracelular fisiológico, O-acetil éste-res em C-7 migram espontaneamente para C-9. O sítio de O-acetilação maisprovável é, portanto, C-9.

Análise do teor de oligossacarídeos N-ligados: As técnicasanalíticas podem compreender clivagem e isolamento de oligossacarídeosN-ligados através de cromatografia em coluna a qual, em uma modalidadenão limitativa, usa uma coluna Hypercarb. Glicanas submetidas à cromato-grafia em Hypercarb são isoladas e podem ser analisadas através de HPA-EC-PAD, cuja análise determina os tipos de carboidratos que modificam umaglicoproteína em particular. Caracterização analítica dos oligossacarídeos N-ligados pode também ser obtida através de Cromatografia de Líqui-do/Espectrometria de Massa (LC/MS ) usando um Carbono Grafítico Poroso(PGC). Análise de carboidrato pode também incluir mapeamento peptídicocom tripsina, Asp-N e Tripsina/Quimiotripsina para determinar os peptídeosos quais compreendem estruturas de carboidrato.

Estruturas de oligossacarídeo N-Iigado podem ser analisadasusando uma série de técnicas de espectrometria de massa ortogonal eHPAEC-PAD (veia Exemplos). Essas técnicas incluem várias clivagens comendopeptidase, seguido por análise através de LC/MS/MS. Com relação amonômeros de CTLA4-lg tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 2, os trêsprincipais sítios de glicosilação N-Iigada foram caracterizados usando LC/MSe ionização por eletropulverização LC/MS/MS e as principais estruturas emcada sítio de N-ligação foram determinadas. Esses dados são resumidos nafigura 9. Existem pelo menos três pontos principais de fixação para oligossa-carídeos N-Iigados em Asn102, Asn134 e Asn233 Além disso, descobriu-se queAsn233 contém uma população de estruturas N-Iigadas que não contêm gru-pos ácido siálico que ocorrem cerca de 80% das vezes.

Estruturas de oligossacarídeo N-Iigado de CTLA4~lg deter-minadas através de LC/MS dos glicopeptídeos, LC/MS dos oligossaca-rídeos e HPAEC-PAD: Os carboidratos N-Iigados estão associados a ummotivo de seqüência de consenso de Asn -X- Ser/Thr. Essa seqüência apa-rece três vezes sobre cadeias monoméricas de CTLA4-lg tendo uma dasseguintes seqüências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ IDNO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. O motivo de seqüência deconsenso aparece em SEQ ID NO: 2 em: Asn102 Leu103 Thr104; Asn134 Gly135Thr136; e Asn233 Ser234 Thr235. Baseado na seqüência de consenso, existem seis sítios de carboidrato N-Iigado por molécula dimérica que são formadosde qualquer uma ou duas das seguintes seqüências monoméricas: (i) 26-383de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2,(iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 deSEQ ID NO: 2.

Carboidratos N-Iigados podem ser de três variedades gerais:com alto teor de manose, híbridos e/ou complexos. Uma técnica de LC/MSpara a análise de glicopeptídeo foi desenvolvida. Clivagem de monômerosendoproteolítica com tripsina (tendo uma das seqüências (i) 26-383 de SEQID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ IDNO: 2) resulta em três peptídeos que contêm glicosilação N-ligada. Todos ostrês sítios de N-ligação têm uma população de estruturas de carboidrato. Ofragmento tríptico T5, correspondendo aos aminoácidos 65-109 de SEQ IDNO: 2, contém uma glicosilação sobre Asn102. O fragmento tríptico T7, cor-respondendo aos aminoácidos 120-154 de SEQ ID NO: 2, contém uma gli-cosilação sobre Asn134. O fragmento tríptico T14, correspondendo aos ami-noácidos 229-237 de SEQ ID NO: 2, contém uma glicosilação sobre Asn233.

De forma a determinar os tipos específicos de glicosilação sobrecada sítio, carboidratos foram obtidos de cada sítio específico através deaumento da escala de digestão e separação de proteína, seguido por coletados peptídeos T5, T7 e T14. Os picos de peptídeo tríptico de interesse foramtratados com PNGase F e processados para análise através de LC/MS so-bre uma coluna Hypercarb. Os resultados mostraram uma população hete-rogênea de estruturas bi-, tri- e tetra-antenárias complexas em cada sítio.Essas podem ser observadas na figura 13, onde a cromatografia separa osaçúcares em cinco domínios: estruturas asialo, monossialo, dissialo, trissialoe tetrassialo (referidos como Domínios I, II, III, IV e V, respectivamente). Umcromatograma (FIG. 13, painel A) para os carboidratos Asn102 (T5) ilustrauma série de estruturas mono- e dissialo no sítio. Um cromatograma (FIG.13, painel B) para Asn134 (T7) ilustra duas estruturas dissialo principais comuma população de estruturas monossialo. Um cromatograma (FIG. 13, pai-nel C) para Asn233 (T14) ilustra pouca sialilação. Para cada um dos sítios decarboidrato N-ligado, um espectro por MS e estrutura correspondente sãomostrados para o pico principal em cada cromatograma (veja figura 13, pai-néis E, F, H). Na figura 13, painel D, o perfil de carboidratos N-Iigados totaisde CTLA4-lg é mostrado no cromatograma. A massa e estruturas de picosselecionados são listadas na Tabela 1. Os dados de LC/MS para oligossaca-rídeo foram sustentados através de análise em profundidade do mapeamen-to peptídico. Asn102 (peptídeo T5) tem o maior grau de heterogeneidade decarboidrato oscilando de estruturas biantenárias, não-sialiladas a estruturastetra-antenárias, tetrassialiladas. Asn134 (peptídeo T7) contém primariamenteestruturas biantenárias. Esse sítio contém muito menos heterogeneidade doque o sítio Asn102. O sítio Asn233 (peptídeo T14) contém pouca sialilação.Uma terceira técnica analítica, HPAEC-PAD, foi também empregada parasustentar duas descobertas por LC/MS ortogonal.

Tabela 1: As principais estruturas N-Iigadas e estruturas complexasmenores selecionadas observadas usando métodos de LC/MS

<table>table see original document page 177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table>

*As espécies asialo são detectadas como adutos de TFA.

A população de carboidratos N-Iigados totais foi analisada usan-do HPAEC-PAD. Os dados obtidos através desse método são listados nasTabelas 2 e 3. Na Tabela 2, os percentuais de área relativa de domínios asi-alo a trissialo são listados dentro de cada sítio (Asn102l Asn134 e Asn233 deSEQ ID NO: 2). Na Tabela 3, os percentuais de área de domínio de oligos-sacarídeo são listados como uma fração da população total de oligossacarí-deos.

Tabela 2: Os percentuais de área para cada domínio observado atravésde HPAEC-PAD

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Tabela 3: Os percentuais de área para cada domínio expres-sos como a média calculada ponderada sobre o conjunto de dados naTabela 2

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Admitindo glicosilação total.

Estruturas de oligossacarídeo N-Iigado de moléculas deCTLA4A29YL104E-lg determinadas através de LC/MS dos glicopeptídeos,LC/MS dos oligossacarídeos e HPAEC-PAD: Os carboidratos N-Iigadosestão associados a um motivo de seqüência de consenso de Asn -X-Ser/Thr. Essa seqüência aparece três vezes sobre cadeias monoméricas deCTUMa29yl1 04E-lg tendo uma das seguintes seqüências: (i) 26-383 de SEQID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ IDNO: 4. O motivo de seqüência de consenso aparece em SEQ ID NO: 4 em:Asn102 Leu103 Thr104; Asn134 Gly135 Thr136; e Asn233 Ser234 Thr235 Baseado naseqüência de consenso, existem seis sítios de carboidrato N-Iigado por mo-lécula dimérica que são formados de qualquer uma ou duas das seguintesseqüências monoméricas: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ IDNO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.

Carboidratos N-Iigados podem ser de três variedades gerais: comalto teor de manose, híbridos e/ou complexos. Uma técnica de LC/MS para aanálise de glicopeptídeo foi desenvolvida. Clivagem endoproteolítica comtripsina de monômeros (tendo uma das seqüências (i) 26-383 de SEQ IDNO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO:4) resultou em três peptídeos que contêm glicosilação N-Iigada (veja Tabela25 no Exemplo 22). Todos os três sítios N-Iigados têm populações de estru-turas de carboidrato. O fragmento tríptico T5, correspondendo aos aminoáci-dos 65-109 de SEQ ID NO: 4, contém uma glicosilação sobre Asn102. Ofragmento tríptico T7, correspondendo aos aminoácidos 120-154 de SEQ IDNO: 4, contém uma glicosilação sobre Asn134. O fragmento tríptico T14, cor-respondendo aos aminoácidos 229-237 de SEQ ID NO: 4, contém uma gli-cosilação sobre Asn233 (veja Tabela 25 no Exemplo 22).

De forma a determinar os tipos específicos de glicosilação sobrecada sítio, carboidratos foram obtidos de cada sítio específico através deaumento da escala de digestão e separação de proteína, seguido por coletados peptídeos T5, T7 e T14. Os picos de peptídeo tríptico de interesse foramtratados com PNGase F e processados para análise através de LC/MS so-bre uma coluna Hypercarb. Os resultados mostraram uma população hete-rogênea de estruturas bi-, tri- e tetra-antenárias complexas em cada sítio.Essas podem ser observadas na figura 16, onde a cromatografia separa osaçúcares em quatro domínios: estruturas asialo, monossialo, dissialo e tris-sialo (referidos como Domínios I, II, Ill e IV, respectivamente). As caracterís-ticas de um perfil de carboidrato que podem ser analisadas e comparadasentre moléculas ou populações glicosiladas ou composições compreenden-do moléculas glicosiladas incluem área de pico percentual, área de domíniopercentual, distância vale a vale ou distância pico a pico.Caracterização por LC/MS de oligossacarídeos N-Iiqados de CTLA4-lgCromatografia em carbono grafítico poroso (PGC) por LC/MS éum método para definição de perfil de oligossacarídeos N-Iigados que podeproporcionar vantagens com relação à cromatografia de troca de ânions empH elevado (HPAEC). Algumas dessas vantagens incluem: obtenção diretade perfil a partir de misturas de digestão, o que minimiza a degradação deamostra; a interface de MS direta proporciona um método para caracteriza-ção e análise rápida de oligossacarídeos; resolução aumentada através decromatografia por PGC permite comparações interdomínio, bem como análi-se intradomínio mais sutil.

O método de PGC por LC/MS permite a obtenção rápida de per-fil e caracterização de oligossacarídeos em termos de tipo de glicana e de-terminação da extensão de sialilação e ramificação sobre a extremidade denão-redução dos carboidratos. Assim, os espectros de MS no modo de íonsnegativo produzem dados que são simples de interpretar, com fragmentaçãomínima dos oligossacarídeos, enquanto que ionização no modo positivopermite verificação da classe estrutural. O método descrito aqui pode seraplicado a misturas inteiras de digestão de glicoproteínas, bem como a a-mostras de oligossacarídeo previamente isoladas sem a necessidade dederivatização. As fases móveis cromatográficas usadas permitem coleta depicos dos perfis e concentração até secagem, sem manipulação adicionalpara caracterização mais detalhada. Em uma modalidade, o método é usadopara caracterizar oligossacarídeos N-Iigados de CTLA4-lg. Usando o métodode PGC por LC/MS, trinta e uma classes distintas de oligossacarídeos po-dem ser identificadas sobre moléculas de CTLA4-lg compreendidas de mo-nômeros tendo seqüências de SEQ ID NO: 2, por exemplo, SEQ ID NO: 5, 6,7, 8, 9 ou 10.

Cromatografia de troca de ânions em pH elevado (HPAEC) foiusada extensivamente para obter um perfil de oligossacarídeos liberados deglicoproteínas sem a necessidade de derivatização. A alta resolução deHPAEC e o fato de que a separação é influenciada pelo tipo de resíduo deaçúcar presente, tipo de ligação e o tamanho da glicana são razões para ouso difundido da técnica. O fator dominante na separação é a carga, oligos-sacarídeos altamente carregados eluindo depois das glicanas menos carre-gadas. Os perfis cromatográficos são freqüentemente divididos em domíniosdefinidos pelo número de espécies carregadas, tipicamente resíduos de áci-do siálico, sobre as glicanas (FIG. 17).

Para obter mais informação sobre a estrutura dos oligossacarí-deos desconhecidos, os picos de HPAEC podem ser coletados, dessaliniza-dos e caracterizados por MS e/ou RMN. Uma consideração sobre a defini-ção de perfil por HPAEC-PAD de distribuições de oligossacarídeo é a varia-bilidade inerente do modo de detecção. Envelhecimento de célula eletroquí-mica e incrustação da superfície de eletrofose resultam em variabilidade doperfil. Foi também reportado que estruturas de oligossacarídeo e o grau desialilação podem causar variabilidade entre células de detecção quando u-sando HPAEC com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Essavariabilidade pode afetar os resultados relativamente quantitativos usadospara avaliar o efeito de alterações de processo ou determinar a consistêncialote a lote. Em virtude de sua velocidade e especificidade, espectrometria demassa (MS) tem obtido popularidade como uma técnica para avaliação deperfis de oligossacarídeo de glicoproteínas. Embora os perfis por MS nãopossam ser usados diretamente para determinar a configuração anoméricaou padrões de ramificação, os dados de MS podem ser usados para identifi-car classes estruturais e detectar alterações qualitativas nas distribuições deglicoforma.

O método de definição de perfil por cromatografia em carbono gra-fítico poroso (PGC) para oligossacarídeos N-Iigados enzimaticamente libera-dos usa detecção por ultravioleta (UV) e por espectrometria de massa (MS)para obter o perfil e caracterizar oligossacarídeos N-ligados, diretamente apartir de misturas de digestão enzimática ou de oligossacarídeos isolados.Esse método pode ser usado para obter um perfil e caracterizar oligossaca-rídeos liberados de glicoproteínas de CTLA4-lg. O método de PGC porLC/MS pode avaliar a consistência das distribuições de oligossacarídeo re-sultantes do processo de produção, bem como quaisquer alterações nasdistribuições de oligossacarídeo resultantes de modificações do processo.

Em uma microanálise cromatográfica de oligossacarídeos N-Iigados de mo-léculas de CTLA4-lg, oligossacarídeos N-Iigados enzimaticamente liberadospodem ser prontamente separados através da coluna de PGC de forma aaumentar a sialilação e aumentar o tamanho. A faixa de estruturas presentese as quantidades relativas de cada classe de estrutura são determinadasatravés da combinação de análise por MS e UV (Exemplo 3).

Para otimizar o método de PGC por LC/MS, otimização das condi-ções espectrais de massa pode ser útil. Otimização pode incluir uma sériede experimentos de mapeamento de superfície de forma a avaliar os efeitosda composição de solvente e parâmetros de ionização por MS quando dedetecção de oligossacarídeo. Parâmetros da composição de solvente paraavaliação compreendem percentual de acetonitrila (em volume) e aditivoseluentes (ácido trifluoroacético e hidróxido de amônio). Os parâmetros deionização por MS considerados para avaliação incluem os ajustes de tempe-ratura de dessolvatação, tensão de capilar e tensão de cone para a fonte deeletropulverização.

Os parâmetros de ionização podem exercer um papel significativona resposta de sinal. O modelo resultante da determinação por mapeamentode superfície foi usado para ajustar os parâmetros de ionização durante adeterminação cromatográfica. Maiores valores para a temperatura de des-solvatação e tensão de cone resultam em maior resposta. A tensão ótima docapilar varia, dependendo do aditivo eluente, o sistema de solvente contendoTFA tendo uma tensão ótima de capilar ligeiramente maior. O fator com omaior efeito é o volume percentual de acetonitrila, um maior teor de acetoni-trila resultando em maiores respostas.

Cromatoqrafia em Carbono Grafitico Poroso

Carbono Grafítico Poroso (PGC) foi usado para dessalinização porextração em fase sólida de oligossacarídeos. PGC também é conhecida co-mo um meio cromatográfico eficaz para separação de oligossacarídeo sobcondições de eluição ácidas e básicas. Condições cromatográficas para de-finição de perfil ácido e básico de oligossacarídeos enzimaticamente libera-dos de moléculas de CTLA4-lg tendo seqüências monoméricas de SEQ IDNO: 2 foram desenvolvidas. Cada condição é compatível com detecção porUV e MS. Conforme foi observado nos experimentos de infusão, as condi-ções de eluição ácida resultam em sensibilidade do MS maior do que ascondições básicas. A resposta do MS para oligossacarídeos neutros eluídossob condições ácidas, detectados como adutos de TFA1 são cinco a novevezes a intensidade do pico correspondente eluído sob condições básicas. A diferença na resposta de sinal é menos dramática para os oligossacarídeosácidos, em média três vezes a resposta de sinal para glicanas monossialila-das e uma resposta de sinal igual para glicanas dissialiladas. O número au-mentado de picos no cromatograma eluído com TFA (FIGS. 14A-B) compa-rado com o cromatograma eluído com NH4OH (FIG. 15A-B) é um resultadode separação de formas anoméricas de oligossacarídeos. Coleta e concen-tração de picos individuais eluídos do gradiente com TFA resultam em divi-são do pico único em dois picos de massa idêntica quando de reinjeção. Elu-ição básica dos oligossacarídeos da coluna de PGC resulta em um perfilmais simples (FIG. 15A-B). As condições de eluição básica não resultam emseparação anomérica completa, contudo, ampliação de pico significativa éobservada. A resolução de pico pode ser aumentada através de aumento datemperatura da coluna, o que irá acelerar a intertroca de formas anoméricas(Itoh S. e outros, J. Chromatoqr. A. 2002 968(1 -2), 89-100). Contudo, a sen-sibilidade (contagem de íons) para os oligossacarídeos detectados perma-nece reduzida, comparado com as condições de eluição ácida. Foi reportadoque a adição de sais, tal como acetato de amônio, aumenta a sensibilidade(Churms SC, J. Chromatoqr. A. 500 (1990) 555-583).

A adição de acetato de amônio, trifluoroacetato de amônio ou for-miato de amônio resulta em resposta aumentada, mas também resulta em ampliação assimétrica de pico. A ampliação de pico e interferência potencialdo sal adicionado com a detecção por UV resultantes tornaram a adição desal uma opção não atraente. Um meio alternativo de eliminação de separa-ção anomérica é reduzir os oligossacarídeos aos alditóis correspondentes.

Maior sensibilidade e resolução cromatográfica tornam as condi-ções de eluição ácida úteis para definição de perfil de oligossacarídeo. Umsistema de definição de perfil em particular consiste em uma coluna LunaC18 acoplada através de duas válvulas de admissão com seis orifícios deposições duplas à coluna Hypercarb de 5 μΜ (100 χ 4,6 mm). A coluna Hy-percarb é acoplada a um detector de UV (Waters 2996 PDA) em série comum Q-ToF Micro (Micromass) com uma sonda de ESI padrão. Através decontrole de comutação apropriado, a definição de perfil de amostras de Ο-TLA4-lg pré-purificadas pode ser realizada usando somente a coluna Hyper-carb ou o perfil de misturas de digestão pode ser obtido através de injeçãodireta da mistura de digestão sobre a Luna C18 em série com a coluna Hy-percarb. Tipicamente, os perfis são obtidos dos oligossacarídeos N-Iigadosliberados de 10 a 20 nmols de proteína.

Em determinadas modalidades, a invenção proporciona uma po-pulação de moléculas de CTLA4-lg que têm um cromatograma de acordocom qualquer um ou mais dos cromatogramas tendo picos representativos.Cromatogramas de perfil de oligossacarídeo representativos de moléculasde CTLA4-lg tendo monômeros com seqüências de SEQ ID NO: 2 são mos-trados na figura 13, figuras 14A-B, figuras 15A-B (PGC), figura 17 (HPA-EC/PAD) e figuras 18A-B. Ambos esses perfis cromatográficos podem serdecompostos em quatro domínios distintos contendo estruturas de oligossa-carídeo com graus crescentes de sialilação nos últimos domínios de eluição.

O sistema cromatográfico de PGC permite a interface direta com um detec-tor de massa. A resolução de massa e proporções de sinal para interferênciasão aceitáveis para oligossacarídeos os quais estão presentes em baixospercentuais. Resolução cromatográfica de estruturas de oligossacarídeosindividuais parece maior na separação cromatográfica por PGC quandocomparado com a HPAEC.

Coleta de picos do método de HPAEC requer dessalinização e oelevado pH empregado introduz a possibilidade de reações de descamaçãoque poderiam interferir com a identificação estrutural precisa de picos. Emvirtude do fato de as condições cromatográficas usadas com cromatografiapor PGC serem isentas de sais, os picos de oligossacarídeo eluídos podemser coletados e concentrados com manipulação mínima. Isso permite a cole-ta e concentração de picos eluídos, seguido por injeção dos oligossacarí-deos coletados sobre o sistema de HPAEC. Reinjeção dos oligossacarídeoscoletados sobre um sistema de HPAEC-PAD permite a atribuição estruturalde alguns dos picos presentes no perfil por HPAEC (FIG. 17). Em virtude deresolução de pico incompleta sobre a coluna de troca de ânions, nem todosos picos isolados puderam ser mapeados ao perfil por HPAEC.

Os perfis resultantes de injeção direta de misturas de digestão eaqueles para oligossacarídeos isolados da mesma amostra de proteína nãosão idênticos. Os perfis resultantes de injeção direta (FIGS. 18A-B) têm dife-rentes proporções de anômero, sugerindo que a concentração de oligossa-carídeos coletados é resultante de anomerização aumentada. De modo maisimportante, o perfil resultante de injeção direta contém um pico, o qual cor-responde a uma estrutura tetrassialilada. Essa estrutura não é identificadano perfil de oligossacarídeos coletados e isolados. Além de menor tempo deensaio, definição de perfil diretamente das misturas de digestão pode resul-tar em uma representação mais precisa da distribuição de oligossacarídeo,evitando degradação de glicana durante coleta e concentração.

Quantificação Relativa

O mapeamento de superfície realizado sobre amostras de infusãoindica que o volume percentual de acetonitrila tem um efeito significativo so-bre a eficiência de ionização dos oligossacarídeos em eluição. A dependên-cia da intensidade de sinal sobre o teor de acetonitrila na fase móvel torna aquantificação relativa de oligossacarídeos através de MS dependente dotempo de retenção do pico de eluição. Variações na condição da coluna po-dem afetar os tempos sobre colunas de PGC. Por essa razão, seria difícilobter quantificação relativa consistente a partir do perfil de eluição no croma-tograma de íons. O traço de UV a 206 nm não deverá ser afetado pela com-posição de solvente até o mesmo ponto em que o traço de íons. A quantifi-cação relativa foi realizada usando o traço de UV, o traço de íons foi usadopara caracterização e comparações qualitativas apenas. Injeção repetidapara os oligossacarídeos isolados de um único lote de glicoproteína resultouem percentuais de desvio-padrão relativo (% de RSD) de menos do que 4%para cada um dos quatro domínios de oligossacarídeo quantificados.

Estruturas O-Iiqadas em moléculas de CTLA4-lg compreendendo mo-nômeros de SEQ ID NO: 2

Além dos carboidratos N-Iigados1 moléculas de CTLA4-lg podemconter carboidratos O-ligados. As estruturas de oligossacarídeo O-Iigadopodem ser analisadas usando uma série de técnicas de espectrometria de massa ortogonal. Essas técnicas incluem várias clivagens com endopeptida-se, seguido por análise através de LC/MS/MS.

Com relação a moléculas de CTLA4-lg formadas de monômerostendo uma seqüência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, os dois principaissítios de glicosilação O-Iigada foram caracterizados usando ionização poreletropulverização de massa exata e as principais estruturas em cada sítiode O-ligação foram determinadas. Esses dados são resumidos na figura 9.Os dados são consistentes com a existência de três principais estruturas O-ligadas: (GaINAc)i (GaI)i (NeuAc)1; (GalNAc)i (GaI)1 (NeuAc)2; (GaINAc)1(GIcNac)1 (GaI)2 (NeuAc)2. Cada estrutura é observada em diferentes quan- tidades sobre cada sítio. Essas quantidades são relativamente quantitativase representam dados obtidos de múltiplas análises. Os oligossacarídeos O-Iigados contribuem para uma quantidade substancial de ácido siálico paraCTLA4-lg. Existem dois pontos de fixação principais de oligossacarídeo O-ligado por cadeia. O sítio primário de ocorrência para oligossacarídeos O-ligados é Ser165, o qual é ocupado em cerca de 95% das vezes. O sítio se-cundário de ocorrência para oligossacarídeos O-Iigados é Ser155n56, o qual éocupado = 25% das vezes. Os dados ortogonais apresentados aqui propor-cionam uma visão geral das estruturas de carboidrato predominantes pre-sentes sobre tais moléculas de CTLA4-lg e são resumidos na figura 9.

Em geral, os carboidratos O-Iigados têm heterogeneidade de es-trutura muito maior do que está presente em carboidratos N-ligados. Alémdisso, não há seqüência de consenso para fixação de O-ligação. Assim, umasérie de técnicas ortogonais foi desenvolvida para uso na caracterizaçãoestrutural dos oligossacarídeos O-ligados: análise intacta por LC/MS e análi-se de glicopeptídeo por LC/MS.

Baseado na degradação de Edman e MALDI, um sítio de O-ligação foi reportado como sendo Ser165 (com relação à SEQ ID NO: 2). Paraobter dados diretos com relação à presença de glicosilação Ser165, sequen-ciamento por MS/MS usando a série de íons b' e y" sobre o peptídeo T9 (ve-ja Tabela 4 e Tabela 5) foi realizado. A Tabela 4 lista a série de íons para opeptídeo T9 em quatro estados diferentes de glicosilação. Em todos os qua-tro estados, a série de íons b', íons b1... b6, está em concordância. Contudo,a série de íons b', b7... bmax, varia através dos diferentes estados de glicosi-lação em b7 (Ser165). Como uma confirmação, a série de íons y" correspon-dente é reportada. Em todas as quatro séries de íons y", os íons y1....y19estão em completa concordância. Contudo, a série de íons y", y20...ymax,varia através dos diferentes estados de glicosilação em y20 (Ser139). A sériede íons b' e y", tomados juntos, sustenta a implicação do sequenciamento deEdman de que Ser139 é o sítio de glicosilação O-Iigada primário sobre o pep-tídeo T9. T9 é um peptídeo que contém vários resíduos de serina e treonina.

A Tabela 4 apresenta íons b' e y' de LC/MS/MS para o peptídeoT9 com e sem o Iadder O-Iigado de (GalNAc)i (GaI)1 (NeuAc)i. A série deíons b' é idêntica para todos os espectros até b7, onde o espectro, então,difere pela estrutura de carboidrato O-Iigado listada acima de cada série. Asérie de íons y' é idêntica para todos os espectros até y19, onde o espectro,então, difere pela estrutura de carboidrato O-Iigado listada acima de cadasérie.<table>table see original document page 188</column></row><table>Tabela 5: Fragmentos de glicopeptídeo O-Iigado com os números deseqüência correspondentes, seqüências de aminoácido e massas teó-ricas

<table>table see original document page 189</column></row><table>

As estruturas O-Iigadas de carboidrato em Ser165 representamuma população heterogênea de três espécies principais. Na figura 19, o gli-copeptídeo T9 é observado no espectro com desconvolução. Há um pico debase a 2689,2 amu, o qual está em concordância com a massa teórica paraesse peptídeo, 2689,11 amu. O espectro ilustra três principais estruturas O-ligadas. O espectro ilustra o peptídeo de base com um Iadder de açúcarconsistente com a estrutura O-Iigada (GalNAc)i (Gal)i (NeuAc)-i. A porçãoampliada em negrito do espectro foi intensificada 10 vezes e identifica duasestruturas O-Iigadas adicionais consistentes com (GaINAc)1 (Gal)i (NeuAc)2e (GaINAc)1 (GIcNAc)1 (GaI)2 (NeuAc)2.

Espectrometria de massa foi usada para avaliar a abundância rela-tiva de cada espécie O-ligada. Na figura 19, a glicana (GalNAc)i (GaI)1 (Neu-AcJ1 é observada em uma proporção de 10:1 com a glicana (GaINAc)1 (GaI)1(NeuAc)2 e em uma proporção de 30:1 com a glicana (GaINAc)1 (GIcNAc)1(GaI)2 (NeuAc)2. Em uma modalidade, portanto, a invenção proporciona umapopulação compreendendo moléculas de CTLA4-lg que têm uma proporçãode 10:1 de glicana (GaINAc)1 (GaI)1 (NeuAc)1 para glicana (GaINAc)1 (GaI)1(NeuAc)2. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma populaçãocompreendendo moléculas de CTLA4-lg que têm uma proporção de 30:1 deglicana (GaINAc)1 (GaI)1 (NeuAc)1 para glicana (GaINAc)1 (GIcNAc)1 (GaI)2(NeuAc)2. A glicana (GaINAc)1 (GaI)1 (NeuAc)2 é observada em umaproporção de 20:1 com a glicana (HexNAc)2 (GaI)2 (NeuAc)2. Em outramodalidade, a invenção proporciona uma população compreendendo molé-culas de CTLA4-lg que têm uma proporção de 20:1 da glicana (GaINAc)1(Gal)i (NeuAc)2 para glicana (HexNAc)2 (GaI)2 (NeuAc)2. Em outra modali-dade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lgque compreendem todas as referidas proporções nesse parágrafo. Além dis-so, um espectro por eletropulverização de íons negativa confirma essas trêsestruturas predominantes; a abundância relativa de cada uma é mostrada nafigura 9.

Com relação a moléculas de CTLA4-lg compreendendo monô-meros de SEQ ID NO: 2, além do sítio Ser165, um segundo sítio de O-ligaçãoé observado em Ser155 ou Ser156. Esse sítio é referido como Ser155/156. Opeptídeo D8 contendo Ser155'156 foi gerado a partir de uma digestão comAspN e corresponde aos aminoácidos 150-156 de SEQ ID NO: 2. O peptí-deo é separado e detectado através de LC/MS. O espectro (não mostradoaqui) para o glicopeptídeo O-Iigado D8 mostra um pico de base de 790,2amu que está em concordância com a massa teórica de 790,8 amu. O es-pectro ilustra o íon de peptídeo e uma série de íons os quais são consisten-tes com a estrutura (GalNAc)i (GaI)1 (NeuAc)i. O peptídeo é predominante-mente não-glicosilado; a espécie glicosilada (GalNAc)i (Gal)i (NeuAc)i cons-titui aproximadamente 22% da área de pico.

As estruturas de oligossacarídeo O-Iigado da CTLA4-lg com ca-deia simples foram caracterizadas usando uma série de técnicas de espec-trometria de massa ortogonal. Essas técnicas incluem clivagens com endo-peptidase com análise por LC/MS dos dois sítios de glicosilação O-Iigadapredominantes com o uso de ionização por eletropulverização para determi-nar as estruturas predominantes em cada sítio de O-ligação. Esses dadossão resumidos na figura 20. Podem existir quatro estruturas O-Iigadas pre-dominantes: (GaINAc)1(GaI)I(NeuAc)I; (GaINAc)1(GaI)1 (NeuAc)2; (Hex-NAc)2(Gal)2(NeuAc)2; (HexNAc)2(GaI)2l(NeuAc)3. Essas estruturas são de-tectadas em diferentes quantidades sobre cada sítio. Mais de 95% da C-TLA4-lg com cadeia simples têm pelo menos (HexNAc)2 (GaI)2 (NeuAc)2.

Outro ensaio foi desenvolvido para confirmar os carboidratos O-Iigados e buscar estruturas menos prevalentes. Essa técnica utilizou codi-gestão com tripsina e quimiotripsina para produzir um peptídeo confirmadoatravés de MS/MS como sendo THTSPPSPAPELL (aminoácidos 159-171 deSEQ ID NO: 2). Esse peptídeo permitiu a identificação de uma espécie O-ligada monossialilada, duas dissialiladas e uma trissialilada. Uma estruturadefinitiva não foi elucidada para as espécies trissialiladas, contudo, duaspossibilidades são propostas: um peptídeo contendo uma estrutura com 2núcleos com 3 ácidos siálicos ou duas estruturas com 1 núcleo presentessobre dois resíduos de aminoácido diferentes.

Uma técnica complementar, análise intacta através de MS, foiusada para confirmar a presença de glicosilações O-ligadas heterogêneasde moléculas de CTLA4-lg. Dímeros de CTLA4-lg e CTLA4-lg de cadeiasimples foram tratados com PNGase F para remover os oligossacarídeos N-ligados. A molécula foi, então, detectada através do espectrômetro de massae os íons correspondentes foram submetidos à desconvolução no espectro.No material com cadeia simples, a composição de glicana predominante é(HexNAc)2(Hex)2(NeuAc)2, enquanto que a referência é predominantemen-te (HexNAc)1 (Hex)1 (NeuAc)1. As composições de glicosilação estão emconcordância com aquelas observadas durante a análise de peptídeo porLC/MS. Além de uma alteração na glicosilação O-Iigada sobre o padrão,uma segunda modificação principal foi observada. Um desvio de massa de113±4ué observado entre as espécies não-reduzidas com cadeia simplese o padrão de CTLA4lg reduzido. O desvio de massa de 113 ± 4 u desapa-receu quando de redução com DTT. No material dimérico, o envoltório deíons resultante foi submetido à desconvolução em um espectro (não mostra-do aqui) com um pico principal a 79944 amu, o qual corresponde à presençade duas estruturas (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 . O próximo maior pico, a80600 amu, corresponde a três estruturas O-Iigadas ou uma combinação deno máximo uma estrutura O-ligada ramificada. O terceiro maior pico corres-ponde à quatro estruturas O-ligadas ou uma combinação contendo no má-ximo duas estruturas O-ligadas ramificadas.

Determinação do teor de ácido siálico

Outro aspecto de caracterização de glicoproteína é determina-ção de ácido siálico. O teor de ácido siálico pode ser uma assinatura carac-terística da glicoproteína. O teor de ácido siálico de uma glicoproteína dapresente invenção pode ser avaliado através de métodos convencionais. Porexemplo, ácido siálico pode ser separadamente determinado através de ummétodo colorimétrico direto (Yao e outros, 1989, Anal. Biochem.. 179: 332-335), usando pelo menos amostras em triplicata. Outro método de determi-nação de ácido siálico envolve o uso de ácido tiobarbatúrico (TBA), confor-me descrito por Warren e outros, 1959, J. Biol. Chem.. 234: 1971-1975. Ain-da outro método envolve cromatografia de elevado desempenho, conformedescrito por Η. K. Ogawa e outros, 1993, J. Chromatographv. 612: 145-149.

Em uma modalidade, um método para determinar a quantidadede ácido N-Acetil Neuramínico (NANA) e ácido N-Glicolil Neuramínico (NG-NA) é através de tratamento por hidrólise ácida da glicoproteína de interesse(por exemplo, veja Exemplo 3). Nesse método, NANA e NGNA são clivadosda proteína através de hidrólise ácida. Em uma modalidade , a glicoproteínaé substancialmente purificada através de métodos adequados para sua puri-ficação. O NANA e NGNA liberados são separados através de HPLC sobreuma coluna Rezex Monosacharide RHM e detectados através de absorbân-cia de UV (206 nm). NANA e NGNA são quantificados baseado nos fatoresde resposta de padrões de NANA e NGNA concorrentemente operados. Osresultados podem ser reportados como proporções molares (MR) de NANAe NGNA respectivamente, para proteína.

A finalidade do método de medição do teor de ácido siálico porhidrólise ácida é medir a quantidade total de ácido siálico (NANA e NGNA)para proteína em amostras de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg (proporçõesmolares). É importante notar, contudo, que essas proporções molares deácido siálico incluem NANA e NGNA livre e ligado. Os resultados da propor-ção molar são obtidos baseado na comparação da área de pico de NANA eNGNA de amostras de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg hidrolisadas versuspadrões de NANA e NGNA. Padrões de NANA e NGNA hidrolisados tam-bém podem ser usados.

Por exemplo, proporções molares foram obtidas para moléculasde CTLA4-lg tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2. Sem hidróli-se, o pico de interesse em cromatogramas de padrões de NANA e NGNAaparece como um único pico. Quando o padrão de NANA e amostras deCTLA4-lg são hidrolisados, os cromatogramas resultantes mostram NANAcomo um pico principal, seguido intimamente por um pequeno pico extra(<10% da principal área de pico; referido como "NANA degradado"); a mes-ma concentração de padrões de NANA com e sem hidrólise resultou em á-reas de pico muito próximas, incluindo o degradante. Nenhum pico é clara-mente observado nos cromatogramas para as espécies de NGNA degrada-das, enquanto que as contagens de área do pico de NGNA em um padrãode NGNA hidrolisado foram observadas como diminuindo aproximadamente8 - 9%. Experimentos de espectrometria de massa (MS) demonstraram queo "degradante NANA" em um padrão de NANA hidrolisado e nas amostrasde CTLA4-lg hidrolisadas resultam de perda de 18 Dáltons (água) do NANA.

Portanto, o método inclui, apropriadamente, o pequeno pico extra na inte-gração do pico de NANA em CTLA4-lg hidrolisada. Foi também demonstra-do, através de experimentos de MS, que o NGNA degrada quando de hidró-lise, com uma perda de 18 Dáltons. O degradante NGNA eluído entre NANAe o degradante NANA, de modo que UV não pode detectá-lo. No material deCTLA4-lg, o teor de NGNA é de aproximadamente 5% do teor de NANA e,como um resultado, coeluição do degradante NGNA causa menos de 0,5%de alteração na área de pico de NANA, o que está dentro da faixa de variabi-Iidade da área de pico de NANA. O método não pode incluir a área do NGNAdegradado no resultado de NGNA; portanto, o resultado de NGNA pode serbaixo em < 10%, também dentro da variabilidade do método.

Em virtude de se acreditar que o NGNA é mais imunogênico doque o NANA, há uma preferência clínica por um produto terapêutico recom-binante que contém uma baixa proporção molar de NGNA. Em uma modali-dade da invenção, a preponderância de ácido siálico em uma população demoléculas de CTLA4-lg é NANA e não NGNA em que, nessa população, aproporção molar de mois de ácido siálico por mol de moléculas ou dímerosde CTLA4-lg é de cerca de 5 a cerca de 18. Em outra modalidade, a pre-ponderância de ácido siálico em uma população de moléculas de C-TUMa29yl104e-Iq é NANA e não NGNA em que, nessa população, a propor-ção molar de mois de ácido siálico por mol de moléculas ou dímeros de C-

TLA4A29YL104E_|g é de ^ca de 5 5 g ^fcg de 35

Cassetes de expressão de CTLA4-lg e CTLA4A29YL104E-lq

A invenção proporciona um ácido nucleico que codifica uma mo-lécula de CTLA4-lg, o qual é um cassete de expressão em uma modalidade.

A invenção também proporciona um ácido nucleico que codifica uma molé-cula de CTLA4A29YL104E-lg. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifi-ca a molécula de CTLA4-lg está contido dentro de um cassete de expressão.

Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica a molécula de CTLA4-lgestá contido dentro de um cassete de expressão derivado de um plasmídeotendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17. Em uma outra modali-dades, o ácido nucleico que codifica a molécula de CTI_A4A29YL104E-lg estácontido dentro de um cassete de expressão. Em determinadas modalidades,o ácido nucleico que codifica a molécula de CTLA4A29YL104E-lg está contidodentro de um cassete de expressão derivado de um plasmídeo depositadocomo No. de Acesso ATCC PTA-2104.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser uma molécula deácido nucleico de CDNA, cDNA-semelhante, DNA ou RNA de interesse emum formato passível de expressão, tal como um cassete de expressão, oqual pode ser expresso a partir do promotor natural ou derivado do mesmoou um promotor totalmente heterólogo. Alternativamente, o ácido nucleico deinteresse pode codificar um RNA antissenso. O ácido nucleico de interessepode codificar uma proteína (por exemplo, uma glicoproteína, tal como umaglicoproteína de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg) e pode ou não incluir ín-trons.

Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica um peptídeotendo atividade de CTLA4 pode ser obtido de DNA genômico de células T oude mRNA presente em linfócitos T ativados. Em outra modalidade, o ácidonucleico que codifica um CTl_A4A29YL104E-lg também pode ser obtido de DNAgenômico de células T ou de mRNA presente em linfócitos T ativados. Emoutra modalidade da invenção, o gene que codifica uma proteína de interes-se, por exemplo CTLA4 ou CTLA4A29YL104E-lg, pode ser clonado de uma bi-blioteca genômica ou ao cDNA de acordo com protocolos-padrão que versa-dos na técnica praticam. Um cDNA, por exemplo, que codifica CTLA4 ouCTLA4A29YL104E-lg, pode ser obtido através de isolamento de mRNA total deuma linhagem de célula adequada. Usando métodos conhecidos na técnica,cDNAs de fita dupla podem ser preparados a partir de mRNA total e subse-qüentemente podem ser inseridos em um vetor de bacteriófago ou plasmí-deo adequado. Genes podem também ser clonados usando métodos dePCR bem-estabelecidos na técnica. Em uma modalidade, um gene que codi- fica CTLA4 ou CTLA4A29YL104E-lg pode ser clonado via PCR de acordo com ainformação de seqüência de nucleotídeo proporcionada pela presente inven-ção.

Em outra modalidade, um vetor de DNA contendo o cDNA deCTLA4 ou CTI_A4A29YL104E-lg pode atuar como um modelo em reações dePCR em que iniciadores de oligonucleotídeo projetados para amplificar umaregião de interesse podem ser usados para obter um fragmento de DNA iso-lado abrangendo essa região. Em uma modalidade particular da invenção, aregião de interesse direcionada no cDNA de CTLA4 pode ser o domínio ex-tracelular de CTLA4, incluindo o domínio extracelular de Humano CTLA4.Em determinadas modalidades, a região de interesse direcionada em umcDNA de CTI_A4A29YL104E-lg pode ser o domínio extracelular de CTLA4 comalterações de aminoácido nas posições de aminoácido 55 e 130 de SEQ IDNO: 2 (por exemplo, veja SEQ ID NO: 18), incluindo o domínio extracelularde Humano CTLA4 abrigando as alterações de aminoácido descritas acima.

Para expressar uma proteína de fusão no contexto da presenteinvenção, a fusão de gene quimérico em uma modalidade (por exemplo, umgene que codifica uma proteína de fusão de CTLA4-imunoglobulina (CTLA4-lg) ou proteína de fusão CTLA4A29YL104E-lg) inclui uma seqüência de nucleo-tídeo, a qual codifica a seqüência sinalizadora pelo que, quando de transcri-ção e tradução do gene quimérico, direciona a proteína de fusão recente-mente sintetizada para secreção. Em uma modalidade, uma seqüência sina-lizadora de CTLA4 nativa (por exemplo, a seqüência sinalizadora de Huma-no CTLA4 descrita em Harper, K. e outros (1991, J. Immunol. 147,1037-1044) pode ser usada. Em uma modalidade alternativa da invenção, umaseqüência sinalizadora heteróloga pode ser usada para dirigir a secreção deCTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg (por exemplo, a seqüência sinalizadora deoncostatina-M (Malik N., e outros, 1989, Mol Cell Biol 9(7), 2847-2853) ouuma seqüência sinalizadora de imunoglobulina). Versados na técnica com-preenderão que a seqüência de nucleotídeo correspondendo à seqüênciasinalizadora pode ser inserida na fusão de gene quimérico através de técni-cas padrão de DNA recombinante, tais como realizando uma ligação em-rede da seqüência sinalizadora na extremidade 5' de uma seqüência de áci-do nucleico que codifica CTLA4.

Sob as condições do Tratado de Budapeste, DNA que codifica aseqüência de aminoácido correspondendo a uma proteína de fusão de C-TLA4-lg foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), 10801University Blvd., Manassas, VA, 20110, em 31 de Maio de 1991. A ele foiatribuído No. de Acesso ATCC 68629. Adicionalmente, um plasmídeo deexpressão compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica aseqüência de aminoácido correspondendo a uma CTLA4A29YL104E-lg foi de-positado sob as condições do Tratado de Budapeste em 19 de Junho de2000 na ATCC. Ao plasmídeo depositado foi atribuído o No. de AcessoATCC PTA-2104. O plasmídeo depositado é também referido como pD16LEA29Y e pD16 L104EA29Y. CTI_A4A29YL104E-lgs são ainda descritas na Pa-tente U.S. No. 7.094.874 e Pedidos de Patente U.S. copendentes N0S09/579.927, 60/287.576 e 60/214.065 e Na Publicação de Patente Interna-cional No. WO 01/923337 A2, todos os quais são incorporados por referên-cia ao presente pedido em suas totalidades.

Um vetor de expressão da invenção pode ser usado para trans-fectar células, eucariotas (por exemplo, células de levedo, de mamífero ouinseto) ou procariotas, de forma a produzir proteínas (por exemplo, proteínasde fusão, tais como moléculas de CTLA4-lg, CTI_A4A29YL104E-lg e semelhan-tes) codificadas por seqüências de nucleotídeo do vetor. Versados na técni-ca compreenderão que a expressão de produtos de proteína desejados emprocariotas é mais freqüentemente realizada em E. coli com vetores quecontêm promotores constitutivos ou induzíveis. Alguns vetores de expressãode E. coli (também conhecidos na técnica como vetores de fusão) são proje-tados para adicionar uma série de resíduos de aminoácido, usualmente aoN-término da proteína recombinante expressa. Os referidos vetores de fusãopodem servir a três funções: 1) aumentar a solubilidade da proteína recom-binante desejada; 2) aumentar a expressão da proteína recombinante deinteresse; e 3) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando co-mo um Iigante em purificação por afinidade. Alguns exemplos de vetores deexpressão de fusão incluem, mas não estão limitados a: a) pGEX (AmradCorp., Melbourne1 Austrália), o qual funde glutationa S-transferase à proteínadesejada; b) pcDNA™3,1/V5-His A B & C (Invitrogen Corp, Carlsbad1 CA), oqual funde 6x-His a uma proteína recombinante de interesse; e c) pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.), o qual funde proteína de ligação àmaltose E à proteína recombinante alvo.

As células adequadas para cultura de acordo com os processose métodos da presente invenção podem abrigar vetores de expressão intro-duzidos (estruturas), tais como plasmídeos e semelhantes. As estruturas devetor de expressão podem ser introduzidas via transfecção, lipofecção,transformação, injeção, eletroporação ou infecção. Os vetores de expressãopodem conter seqüências de codificação ou porções das mesmas, que codi-ficam as proteínas para expressão e produção em um processo de cultura.Tais vetores de expressão podem incluir os componentes requeridos para atranscrição e tradução da seqüência de codificação inserida. Vetores de ex-pressão contendo seqüências que codificam as proteínas e polipeptídeosproduzidos, bem como os elementos de controle de transcrição e traduçãoapropriados, podem ser gerados usando métodos bem-conhecidos e prati-cados por versados na técnica. Esses métodos incluem técnicas de DNArecombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo, osquais são descritos em J. Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning. ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. e em F. M.Ausubel e outros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York, N.Y.

Um marcador selecionável pode ser usado em um vetor de ex-pressão recombinante (por exemplo, um plasmídeo), em que o vetor é esta-velmente integrado no genoma da célula, para conferir resistência a célulasabrigando o vetor. Isso permite sua seleção em um meio de seleção apropri-ado. Vários sistemas de seleção podem ser usados incluindo, mas não limi-tado a, os genes de hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT), atimidina quinase do Vírus do Herpes Simplex (HSV TK) (Wigler e outros,1977, ÇeN, 11: 223), (Szybalska e Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 48: 202) e adenina fosforibosil transferase (APRT) (Lowy e outros,1980, Celll 22: 817), os quais podem ser empregados em células hgprt-, tk-ou aprt-, respectivamente.

Os seguintes Exemplos não-limitativos de genes marcadores, osquais podem estar contidos dentro de um vetor de expressão, podem tam-bém ser usados como a base de seleção para resistência antimetabólito:gpt, o qual confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg, 1981,Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78: 2072); dhfr, o qual confere resistência ao me-totrexato (Wigler e outros, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 357; e O1Ha-re e outros, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 1527); hygro, o qual confe-re resistência à higromicina (Santerre e outros, 1984, Gene. 30: 147); e neo,o qual confere resistência ao aminoglicosídeo G418 (Clinicai Pharmacv. 12:488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy. 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev.Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science. 260: 926-932;Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem.. 62: 191-21; Maio de 1993, TIB Tech.11 (5): 155-215). Técnicas de DNA recombinante comumente conhecidas natécnica podem ser rotineiramente aplicadas para escolher os clones de célu-la recombinante desejados. Tais métodos são descritos, por exemplo, emAusubel e outros (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfection and Expression. ALaboratory Manual, Stockton Press, NY; nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli eoutros (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994); Colberre-Garapin e outros, 1981, J. Mol. Biol., 150: 1, os quais sãoincorporados por referência aqui em suas totalidades.

Os níveis de expressão de uma molécula de proteína expressapodem ser aumentados via amplificação do vetor de expressão (para umarevisão, veja Bebbington e Hentschel, "The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNAcloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987). Um aumento no nível deum inibidor presente na meio de cultura de uma célula hospedeira aumenta-rá o número de cópias do gene marcador quando um marcador no sistemade vetor de expressão expressando uma proteína de interesse é amplificá-vel. Uma vez que a região amplificada está associada a um gene que codifi-ca proteína, produção de proteína aumentará concomitantemente (Crousar eoutros, 1983, Mol. Cell. Biol.. 3: 257). Vetores que abrigam as seqüências deácido nucleico que codificam os marcadores selecionáveis glutamina sintasede (GS) ou di-hidrofolato reductase (DHFR) podem ser amplificados na pre-sença dos fármacos metionina sulfoximina ou metotrexato, respectivamente.

Uma vantagem de tais vetores é a disponibilidade de linhagens de células,por exemplo, a linhagem de células de mieloma de murino, a linhagem decélulas NSO e de Ovário de Hamster Chinês, CHO, DG44, as quais são ne-gativas para glutamina sintase e negativas para di-hidrofolato reductase,respectivamente.

Em uma modalidade da presente invenção, uma seqüência deácido nucleico que codifica uma CTLA4 solúvel ou molécula de proteína defusão CTI_A4A29YL104E-lg pode ser inserida em um vetor de expressão proje-tado para expressão de seqüências estranhas em um hospedeiro eucariota.

Os componentes regulatórios do vetor podem variar de acordo com o hos-pedeiro eucariota escolhido para uso. Vetores usados para expressar CTLA4solúvel ou CTLA4A29YL104E-lg em células hospedeiras eucariotas podem in-cluir seqüências intensificadoras para otimização de expressão de proteína.

Células de mamífero (tais como células de BHK, células de VE-RO, células de CHO e semelhantes) podem abrigar um vetor de expressão(por exemplo, um que contém um gene que codifica as proteínas de fusãode CTLA4-lg ou a proteína de fusão CTLA4A29YL104E-lg) via introdução dovetor de expressão em uma célula hospedeira apropriada. Consequente-mente, a invenção abrange vetores de expressão contendo uma seqüênciade ácido nucleico que codifica uma CTLA4-lg ou proteína de fusão C-TUMa29yl104e-Iq e abrange células hospedeiras nas quais tais vetores deexpressão podem ser introduzidos via métodos conhecidos na técnica. Con-forme descrito aqui, um vetor de expressão da invenção pode incluir se-qüências de nucleotídeo que codificam uma CTLA4-lg ou proteína de fusãoCTUMa29yl104e-Iq ligada a pelo menos uma seqüência regulatória de umamaneira que permita a expressão da seqüência de nucleotídeo em uma cé- lula hospedeira. Para versados na técnica, seqüências regulatórias são bem-conhecidas e podem ser selecionadas para dirigir a expressão de uma prote-ína de interesse em uma célula hospedeira apropriada, conforme descritoem Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Seqüências regulatórias podem compreender o seguinte: intensificadores, promotores, sinais de poliadenila-ção e outros elementos de controle de expressão. Os praticantes na técnicacompreenderão que o design de um vetor de expressão pode depender defatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transfectada e/ou otipo e/ou a quantidade desejada de proteína a ser expressa.

Plasmídeos de clonagem e expressão (por exemplo, pcSD epiLN) são construídos conforme descrito no Exemplo 11. Em uma modalida-de da presente invenção, um fragmento de DNA isolado do plasmídeopS\/2dhfr- é ligado à parte principal do vetor pcDNA3, gerando o vetor deexpressão pcSD. O vetor pcSD é compreendido das seguintes característi-cas: um promotor de citomegalovírus (CMV), seguido por um sítio de clona-gem múltipla (MCS); um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimentobovino (BGH) e uma seqüência de término de transcrição; uma seqüência decDNA de dhfr de camundongo para seleção e amplificação; um gene de re-sistência à ampicilina; e uma origem de replicação pUC para seleção e ma-nutenção em Escherichia coli. O vetor piLN é construído contendo cDNAsque codificam porções da seqüência de aminoácido correspondendo a umfragmento do domínio extracelular do receptor de Humano CTLA4, Exemplo11, onde ο cDNA que codifica uma primeira seqüência de aminoácido é uni-do ao DNA que codifica uma segunda seqüência de aminoácido, a qual cor-responde a uma região de IgC que permite a expressão do gene do receptorde CTLA4 através de alteração da solubilidade da proteína de CTLA4 ex-pressa (veia figura 1 e breve descrição para figura 1 para resíduos corres-pondendo à porção extracelular de CTLA4 e região constante de IgGI). Emuma modalidade, uma seqüência de peptídeo sinalizador de oncostatina Mpode ser fundida a uma seqüência de aminoácido correspondendo ao domí-nio extracelular de CTLA4, o qual é subseqüentemente fundido a uma se-gunda seqüência de aminoácido correspondendo a um domínio de Ig (porexemplo, o domínio lgCYi humano) conforme previamente descrito na figura1. A seqüência sinalizadora de oncostatina M permite que formas solúveisdo gene de produto de proteína de CTLA4 (por exemplo CTLA4-lg) sejamgeradas.

Para construir um vetor de expressão pcSD contendo um geneque codifica a proteína de fusão de CTLA4-imunoglobulina, métodos conhe-cidos na técnica (por exemplo, subclonagem em sítio de restrição) podemser usados. O material de iniciação para uma modalidade da invenção podeser um fragmento de DNA digerido e excisado do vetor de clonagem piLNdescrito no Exemplo 11. Em outra modalidade, o fragmento de DNA excisa-do do referido vetor contém a seqüência de aminoácido da seqüência sinali-zadora de oncostatina Mea proteína de fusão de CTLA4, em que o referidofragmento de DNA é ligado ao vetor pcSD digerido. O fragmento de DNA deoncostatina M-CTLA4-lg pode ser inserido entre o promotor de CMV e umcassete contendo o sinal de poliadenilação de BGH e uma seqüência detérmino de transcrição. Isso colocaria um produto genético de CTLA4 sob ocontrole do promotor de CMV no plasmídeo designado pcSDhuCTLA4-lg(FIG. 21; SEQ ID NO: 17).

Adicionalmente, plasmídeos de expressão e clonagem (por e-xemplo, pD16LEA29Y) podem ser derivados do plasmídeo pcDNA3 da Invi-trogen. O vetor pD16LEA29Y (FIG. 22) compreende as seguintes caracterís-ticas: o gene de resistência à neomicina do pcDNA3 foi substituído pelo ge-ne de di-hidrofolato reductase de murino (DHFR) sob o controle do promotorSV40 sem intensificador (enfraquecido); o gene que codifica uma C-TI_A4A29YL104E-lg =é expresso a partir do promotor de CMV e o sinal de polia-denilação é do gene do hormônio de crescimento bovino; o cassete de ex-pressão para o gene de interesse é flanqueado por seqüências de términode transcrição, isto é, 5' ao promotor e 3' ao sítio poli A; os vetores contêmdois poliligantes de sítio de restrição distintos, um 3' ao promotor para clona-gem do gene de interesse e um 5' ao promotor para linearização do vetorantes de transfecção; o vetor contém um gene de resistência à ampicilina ea origem de replicação CoIEI para propagação de plasmídeo em E. co//'; aseqüência de CTUMa29yl1'04tMg (SEQ ID NO: 3) é precedida pelo peptídeosinalizador de oncostatina M e montado no vetor de expressão conhecidocomo vetor pD16LEA29Y.

O vetor é construído contendo cDNAs que codificam porções daseqüência de aminoácido correspondendo a um fragmento do domínio ex-tracelular do receptor de CTLA4 humano (SEQ ID NO: 2), em que o aminoá-cido Ala na posição 55 é substituído pelo aminoácido Tyr e o aminoácidoLeu na posição 130 é substituído pelo aminoácido Glu (FIG. 3). Essas alte-rações de aminoácido são representadas na seqüência de aminoácido C-TI_A4A29YL104E-lg tendo SEQ ID NO: 4. O cDNA que codifica uma primeiraseqüência de aminoácido (por exemplo, a seqüência que codifica a C-TI_A4A29YL104E-lg) é unido ao DNA que codifica uma segunda seqüência deaminoácido, a qual corresponde a uma região de IgC que permite a expres-são do gene do receptor de CTLA4A29YL104E-lg alterando a solubilidade daproteína de CTLA4A29YL104E-lg expressa (veja figura 3 e a breve descriçãopara a figura 3 para resíduos correspondendo à porção extracelular de C-TLA4 modificada e a região constante de IgGI) tendo SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade, uma seqüência de peptídeo sinalizador deoncostatina M pode ser fundida a uma seqüência de aminoácido correspon-dendo ao domínio extracelular de CTLA4 o qual, subseqüentemente, é fun-dido a uma segunda seqüência de aminoácido correspondendo a um domí-nio de ingrediente (por exemplo, o domínio lgCYi humano) conforme previa-mente descrito na figura 3. A seqüência sinalizadora de oncostatina M permi-te que formas solúveis do produto de proteína do gene de CTLA4 (por e-xemplo, uma CTI_A4A29YL104E-lg) sejam geradas.Transfeccão Estável para Gerar Linhagem de Célula

Vetores que contêm DNA que codifica uma proteína de interesse(por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) podem sertransformados em células hospedeiras adequadas (por exemplo, célulasbacterianas) de forma a produzir grandes quantidades de DNA clonado. Al-guns exemplos não-limitativos de células bacterianas para transformaçãoincluem a linhagem de célula bacteriana das cepas DH5a ou MC1061/p3 deE. coli (Invitrogen Corp., San Diego, Calif.), a qual pode ser transformadausando procedimentos-padrão praticados na técnica e colônias podem, en-tão, ser selecionadas para a expressão em plasmídeo apropriada.

Vetores de expressão para células eucariotas, tais como célulasde mamífero, podem incluir promotores e seqüências de controle compatí-veis com células de mamífero. Em uma modalidade da invenção, esses ele-mentos regulatórios podem ser, por exemplo, um promotor de CMV encon-trado no vetor pcSD ou pD16LEA29Y ou o vírus sarcoma de aves (ASV) lo-calizado no vetor piLN. Outros promotores precoces e tardios comumenteusados incluem, mas não estão limitados a, aqueles do Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, e outros, 1973, Nature 273: 113) ou outros promotores virais, taiscomo aqueles derivados de papiloma bovina, polioma e Adenovírus 2. Opromotor regulado hMTII (Karin, e outros, 1982, Nature 299: 797-802) podetambém ser usado, além de outros conhecidos na técnica. Pára expressãode proteína recombinante, em células de inseto cultivadas (por exemplo, cé-lulas SF 9), alguns vetores de baculovírus disponíveis incluem a série pVL(Lucklow, V. A. e Summers, M. D., 1989, Viroloqy 170: 31-39) e a série pAc(Smith e outros, 1983, Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165). Versados na técnicatambém compreenderão que regiões intensificadoras (aquelas seqüênciasencontradas a montante ou a jusante da região promotora em regiões deDNA de não-codificação) são também importantes para otimizar a expres-são. Origens de replicação podem ser empregadas, se necessário, a partirde fontes virais, por exemplo, por exemplo, se utilizando um hospedeiro pro-cariota para introdução do DNA de plasmídeo. Contudo, integração cromos-sômica é um mecanismo comum para replicação de DNA em organismoseucariotas.

Embora, em uma modalidade da presente invenção, célulashospedeiras de mamífero (tais como células de CHO) sejam empregadaspara expressão da proteína desejada (por exemplo, proteínas de fusão, gli-coproteína e semelhantes), outros organismos eucariotas também podemser usados como hospedeiros. Cepas de laboratório do Ievedo de germina-ção Saccharomyces cerevisiae (também conhecido como Ievedo de padariaou Ievedo de pão) podem ser usadas, bem como outras cepas de levedo,tais como o levedo de fissão Schizosaccharomyces pombe. Vetores de leve-do abrigando DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo,construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-lg ouCTUMa29yl1°4E-lg) podem utilizar a origem de replicação 2μ de Broach, Me-th. Enz. 101: 307 (1983) ou outras origens de replicação compatíveis comlevedo (por exemplo, Stinchcomb e outros, 1979, Nature 282: 39; Tschempee outros, 1980, Gene 10: 157; e Clarke e outros, 1983, Meth. Enz. 101: 300).

Um elemento regulatório contido dentro de vetores de levedo pode ser umpromotor para síntese de enzimas glicolíticas (Hess e outros, 1968, J. Adv.Enzvme Reg. 7: 149; Holland e outros, 1978, Biochemistrv 17: 4900).

Aqueles versados na técnica podem também utilizar outros pro-motores em que as condições de crescimento podem regular a transcriçãodo referido gene regulável e podem incluir os seguintes exemplos não-limitativos: Isocitocroma C, desidrogenase 2 de álcool, enzimas responsá-veis pela utilização de maltose e galactose, fosfatase ácida e enzimas de-gradativas associadas ao metabolismo de nitrogênio. Similar aos sistemasde expressão de mamífero, seqüências terminadoras em vetores de expres-são de levedo também são desejáveis na extremidade 3' das seqüências decodificação e são encontradas na região não traduzida 3' após a rede deleitura aberta em genes derivados de levedo. Alguns exemplos não-limita-tivos de vetores de levedo adequados para expressão de proteína recombi-nante em levedo (por exemplo, em S. cerevisiae) incluem pMFa (Kurjan eHerskowitz, (1982) CeH 30: 933-943), pJRY88 (Schultz e outros, 1987, Gene54: 113-123), pYepSed (Baldari, e outros, 1987, Embo J. 6: 229-234),pYES2 (Invitrogen Corporação, San Diego, Calif.), bem como aqueles per-tencendo à família pRS de vetores de levedo.

Clones, por exemplo, clones bacterianos, os quais contêm DNAque codifica uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão,glicoproteínas e semelhantes) obtidos conforme descrito acima podem, en-tão, ser transfectados em células hospedeiras adequadas, tais como célulasde mamífero, para expressão do produto desejado. Técnicas de transfecçãosão realizadas usando técnicas-padrão estabelecidas na técnica apropriadaspara as referidas células hospedeiras, em que a técnica de transfecção de-pende da célula hospedeira usada. Por exemplo, transfecção de célula demamífero pode ser realizada usando lipofecção, fusão de protoplasto, trans-fecção mediada por DEAE- dextrana, coprecipitação com CaPC^i eletropo-ração, microinjeção direta, bem como outros métodos conhecidos na técni-ca, os quais podem compreender: raspagem, captação direta, choque osmó-tico ou com sacarose, fusão de Iisozima ou fusão de eritrócito, microinjeçãoindireta, tal como via técnicas eritrócito-mediadas e/ou submetendo as célu-las hospedeiras a correntes elétricas. Como outras técnicas para a introdu-ção de informação genética em células hospedeiras serão desenvolvidas, alista acima mencionada de métodos de transfecção não é considerada comosendo exaustiva.

Expressão de DNA que codifica uma proteína de interesse (porexemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) em célulashospedeiras eucariotas derivadas de organismos multicelulares (por exem-plo, originárias de mamífero) é particularmente utilizada no contexto da pre-sente invenção (Tissue Cultures, Academic Press, Cruz e Patterson, Eds.(1973)). Células hospedeiras derivadas de organismos multicelulares têm acapacidade de realizar combinação de íntrons e, assim, podem ser usadasdiretamente para expressar fragmentos de DNA genômico. Conforme esta-belecido anteriormente, linhagens de células hospedeiras úteis incluem, masnão estão limitadas a, Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de BHK,rim de macaco (COS), células de VERO e HeLa. Na presente invenção, li-nhagens de células expressando estavelmente uma proteína de interesse(por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) são usa-das. Em uma modalidade, a linhagem de célula de mamífero (tal como umalinhagem de célula de CHO) é transfectada (por exemplo, através de eletro-poração) com um vetor de expressão (por exemplo, pcSDhuCTLA4-lg,pD16LEA29Y e semelhantes) contendo a Seqüência de DNA que codificauma glicoproteína de interesse. Em uma modalidade, a glicoproteína de inte-resse pode ser uma proteína de CTLA4-lg, incluindo a proteína de CTLA4-lgtendo uma seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NO: 2, codificadapor uma porção da seqüência de nucleotídeo em SEQ ID NO: 1. Em outramodalidade, a glicoproteína de interesse pode ser a CTLA4A29YL104E-lg, inclu-indo a CTI_A4A29YL104E-lg tendo uma seqüência de aminoácido contida emSEQ ID NO: 4, codificada por uma porção da seqüência de nucleotídeo emSEQ ID NO: 23.

Uma proteína recombinante, tal como CTLA4-lg ou C-TLA4A29YL104E_|g

pode ser expressa em células hospedeiras eucariotas, taiscomo células de mamífero (por exemplo, células de CHO, BHK, VERO ouNSO), células de inseto (por exemplo, usando um vetor de baculovírus) oucélulas de levedo. Versados na técnica podem usar outras células hospedei-ras adequadas, tais como aquelas descritas anteriormente, no contexto dapresente invenção. Em uma modalidade, expressão eucariota, ao invés deprocariota, de uma proteína de fusão recombinante (tal como CTLA4-lg ouCTLMa29yl1 04E-lg) é empregada. Expressão de proteínas recombinanteseucariotas, tal como CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg humana, em célulaseucariotas, tais como células de CHO, pode levar à glicosilação parcial e/oucompleta, bem como à formação de ligações de dissulfeto intra- ou interca-deia. Para amplificação transitória e expressão de uma proteína desejada, um vetor abrigando DNA que codifica uma proteína de interesse (por exem-plo construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-lgou CTI_A4A29YL104E-lg) é distribuída em células eucariotas através de um mé-todo de transfecção conhecido na técnica, mas não integrado no genoma dacélula. Expressão de genes transfectados pode ser medida dentro de 16-96horas. Células de mamífero (tais como células de COS) podem ser usadasem conjunto com vetores, tais como pCDM8, para expressar transitoriamen-te uma proteína desejada (Gluzman, Y., 1981, CeH 23: 175-182; Seed1 B.,1987. Nature 329: 840).

É compreendido na técnica que, para transfecção estável de cé-lulas de mamífero, uma pequena fração de células pode integrar o DNA emseus genomas e integração com sucesso pode depender do vetor de ex-pressão e do método de transfecção utilizado. Para amplificação e expres-são estável de uma proteína desejada, um vetor abrigando DNA que codificauma proteína de interesse (por exemplo construtos de fusão, glicoproteínase semelhantes, tais como CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg) é estavelmenteintegrado no genoma de células eucariotas (tais como células de mamífero),resultando na expressão estável de genes transfectados. De forma a identifi-car e selecionar clones expressando estavelmente um gene que codificauma proteína de interesse, um gene que codifica um marcador selecionável(por exemplo, resistência a antibióticos) pode ser introduzido nas célulashospedeiras junto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis usa-dos por versados na técnica podem ser aqueles que conferem resistência afármacos, tais como G418 e higromicina. O gene que codifica um marcadorselecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira em um plasmí-deo distinto ou pode ser introduzido sobre o mesmo plasmídeo que o genede interesse. Células contendo o gene de interesse podem ser identificadasatravés de seleção com fármaco, em que células que incorporaram o genemarcador selecionável sobreviverão na presença do referido fármaco, en-quanto que células que não incorporaram o gene marcador selecionávelmorrerão. As células que sobrevivem podem, então, ser selecionadas para aprodução da proteína desejada (por exemplo, uma proteína de CTLA4-lg ouCTLA4A29YL104E-lg).

Conforme descrito anteriormente, células de CHO deficientesquanto à expressão do gene de di-hidrofolato reductase (d/7fr) podem sobre-viver apenas com a adição de nucleosídeos. Quando as referidas célulassão estavelmente transfectadas com um vetor de DNA abrigando o genedhfr, as células são, então, capazes de produzir os nucleosídeos desejados.

Usando o dhfr como o marcador selecionável, versados na técnica compre-enderão que, na presença do antimetabólito, metotrexato, amplificação degene dhfr, bem como o gene de interesse transfectado (por exemplo, C-TLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg) ocorre prontamente. Em uma modalidade dapresente invenção, células de mamífero, tais como células de CHO dhfr-,são transfectadas com um vetor de expressão, tal como pcSDhuCTLA4-lg(Exemplos 11-13) ou pD16LEA29Y, para gerar uma população de célulasque podem ser estavelmente amplificadas e que podem expressar estavel-mente um produto de proteína desejado, (tal como beta polipeptídeos deCTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg, respectivamente). Em outra modalidade, alinhagem de célula dhfr- negativa DG44 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) po-de ser empregada para a transfecção estável. Em outra modalidade da pre-sente invenção, transfecção pode ocorrer via eletroporação.

Conforme é prontamente praticado na técnica, células de mamí-fero transfectadas (por exemplo, células de CHO dhfr- negativas) são manti-das em meio não seletivo contendo soro durante 1-2 dias pós transfecção.

As células são, então, tratadas com tripsina e recolocadas em meio conten-do soro, na presença de uma pressão seletiva (por exemplo, um fármaco talcomo metotrexato). As células são cultivadas em meio contendo soro seleti-vo durante 2-3 semanas, com trocas freqüentes de meio de forma a eliminarresíduos e células mortas, até que colônias distintas possam ser visualiza-das. Colônias individuais podem, então, ser tripsinizadas e colocadas emlâminas com múltiplas cavidades para propagação adicional e amplificaçãona presença de meio seletivo de forma a identificar produtores que expres-sam um alto nível da proteína desejada (por exemplo, construtos de fusão,glicoproteínas e semelhantes) via métodos estabelecidos na técnica, taiscomo ELISAs ou imunoprecipitação. Em uma modalidade da presente in-venção, o método descrito acima foi realizado para transfecção de células deCHO dhfr- negativas (por exemplo, células DG44) de forma a estabeleceruma linhagem de célula estável expressando uma proteína recombinante deinteresse (por exemplo, uma proteína de CTLA4-lg) (veja, por exemplo, E-xemplos 12-13). Em outra modalidade, uma linhagem de célula estável ex-pressando uma CTI_A4A29YL104E-lg foi estabelecida (veja Exemplo 23).

Uma linhagem de célula de CHO estável da invenção expressaestavelmente moléculas de proteína de CTLA4-lg como monômeros de C-TLA4-lg tendo a seqüência (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Essa linhagem de cé-lula pode secretar uma população de moléculas de CTLA4-lg que podemexistir como formas multiméricas (tais como, dímeros, tetrâmeros e seme-lhantes), em que a forma multimérica pode ter diferentes seqüências mono-méricas de SEQ ID NO: 2. O cassete de expressão integrado nessa linha-gem de célula compreende SEQ ID NO: 1 e está contido dentro do pcS-DhuCTLA4-lg.

A invenção também proporciona uma linhagem de célula deCHO estável, a qual expressa estavelmente uma CTI_A4A29YL104E-lg. Em umamodalidade, a linhagem de célula expressa monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig tendo a seqüência (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO:4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 deSEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, a linha-gem de célula pode secretar uma população de moléculas de C-TI_A4A29YL104E-lg que podem existir como formas multiméricas (tais como dí-meros, tetrâmeros e semelhantes), em que a forma multimérica pode ter di-ferentes seqüências monoméricas de SEQ ID NO: 4. O cassete de expres-são integrado nessa linhagem de célula compreende SEQ ID NO: 3 e estácontido dentro do pD16LEA29Y.

Subclonaqem para Gerar uma População de Clonal Células

Células identificadas como sendo produtoras de uma proteínadesejada (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes)são isoladas de cultura de células e subseqüentemente amplificadas sobcondições de produção equivalentes, em que o meio de cultura pode contersoro, métodos de subclonagem conhecidos na técnica tais como, mas nãolimitado a, clonagem em ágar macio, podem ser empregados. Os clones decélula recombinantes estáveis obtidos podem, então, ser ainda multiplicadossob condições isentas de soro e produto animal. De acordo com a presenteinvenção, um clone de célula estável expressando o produto de proteína de-sejado (por exemplo, CTLA4-lg, a CTLjMa29yl1 04E-lg e semelhantes) é obtidovia obtenção de um clone de célula recombinante de uma cultura de célulaque é obtida após cultura de um clone de célula original recombinante emmeio contendo soro e readaptação das células a um meio isento de soro eproduto animal. Em uma modalidade, os clones de célula expressando C-TLA4-lg podem continuar a ser cultivados em meio isento de soro e produtoanimal através de pelo menos 50 gerações. Em outra modalidade da inven-ção, os clones de célula expressando CTLA4-lg podem continuar a ser culti-vados conforme descrito acima através de pelo menos 75 gerações. De a-cordo com a invenção, os clones de célula também podem continuar a sercultivados em meio isento de soro e produto animal através de pelo menos100 gerações.

Em uma outra modalidade, clones de célula expressando a C-TLA4A29YL104E-lg podem continuar a ser cultivados em meio isento de soro eproduto animal através de pelo menos 27 gerações. Em outra modalidade osclones de célula podem continuar a ser cultivados como descrito acima atra-vés de pelo menos 75 gerações. Adicionalmente, os clones de célula podemser cultivados em meio isento de soro e produto animal através de pelo me-nos 100 gerações.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma linhagem decélula que produz moléculas de CTLA4-lg compreendendo monômeros deSEQ ID NO: 2, em que a linhagem de célula é estável durante mais de 100gerações e em que a estabilidade da linhagem de célula compreende: (1)tempo de duplicação na geração 100 é menor do que cerca de 24,5 ± 2,6horas; (2) a viabilidade celular na geração 100 é maior do que 95%, (3) titu-lação de produto para CTLA4-lg em biorreatores de 5-L é maior do que 1,69mg/mL na geração 100; (4) proporção molar de ácido siálico para proteína écerca de 9,3 a cerca de 11,0 na geração 105.

O clone de célula recombinante estável da presente invençãoestá presente em uma forma isolada, em que isolamento ocorre de acordocom métodos praticados na técnica (por exemplo, clonagem em ágar macioou clonagem por diluição limitada ou semelhante). Na presente invenção, oclone de célula recombinante estável é derivado de uma célula recombinantede mamífero (por exemplo, uma célula de CHO) que contém seqüências deDNA que codificam uma proteína recombinante de interesse (por exemplo,construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-lg ouCTUMa29yl1'°4E-lg), a qual pode crescer em suspensão ou aderentemente.Uma proteína recombinante expressa pela linhagem de célula da presenteinvenção pode ser uma glicoproteína terapêutica, tal como CTLA4-lg ou C-TLA4A29YL104E-lg. De acordo com a presente invenção, clones de célula re-combinante estáveis derivados de células eucariotas (tais como de célulasde mamífero, células de CHO, células de DG44 ou células de CHO dhfr- ne-gativas), as quais contêm a seqüência de DNA que codifica uma glicoproteí-na recombinante, tal como CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg e as quais sãocapazes de expressar estavelmente a glicoproteína recombinante durantevárias gerações são úteis.

Em uma modalidade da invenção, uma população de célulashospedeiras de mamífero expressando estavelmente uma proteína de inte-resse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, taiscomo CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg) é obtida sob condições isentas de so-ro e produto animal via amplificação das células estavelmente transfectadas.

De acordo com a invenção, um clone de célula recombinante pode, então,ser caracterizado pelo fato de que ele é estável em meio de cultura isento desoro e produto animal através de pelo menos 105 gerações, por exemplo.

Em uma modalidade da invenção, a população de células clo-nais produz moléculas de CTLA4-lg. Algumas das características específicasdessa população de moléculas de CTLA4-lg são listadas abaixo na Tabela6. Uma população de moléculas de CTLA4-lg pode pelo menos incluir díme-ros de moléculas de CTLA4-lg que compreendem duas moléculas monomé-ricas que, cada uma, pode ter uma das seguinte seqüências: (i) 26-383 deSEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2,(iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 deSEQ ID NO: 2. Assim, a população de moléculas de CTLA4-lg pode incluirpredominantemente homodímeros ou heterodímeros. A população pode in-cluir homodímeros e heterodímeros. Em uma modalidade, a invenção pro-porciona uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo as característicasmostradas na Tabela 6 ou um equivalente farmacêutico das mesmas. Con-forme usado aqui, um equivalente farmacêutico é onde uma população demoléculas tem um perfil seguro e eficaz equivalente à população original(população padrão) para tratamento de um paciente, conforme seria com-preendido por uma agência governamental, tal como o FDA. Por exemplo, apopulação de CTLA4-lg da presente invenção pode ter as característicasmostradas na Tabela 6. Em outra modalidade, a população de moléculas deCTLA4-lg da invenção pode ter as características mostradas na Tabela 6 ouequivalentes das mesmas unicamente em qualquer combinação ou permu-tação das mesmas.

Em outra modalidade, o clone de interesse pode também sercaracterizado de acordo com o produto recombinante expresso e suas ca-racterísticas bioquímicas (por exemplo, CTLA4-lg tendo um valor de coefici-ente de extinção em particular). Um valor de coeficiente de extinção (tam-bém referido como um valor de capacidade de absorção (as)) pode ser deri-vado teórica ou experimentalmente. A 280 nm, o valor da capacidade de ab-sorção (as) de CTLA4-lg foi determinado como sendo de 1,01 mL mg"1 cm"1usando o método de Mach e outros (Analytical Biochemistry, Vol. 200, pági-nas 74-80, 1992) conforme detalhado abaixo.

A Equação 1 foi usada para determinar a capacidade de absorçãomolar (ε).

Equação 1: ε = [(Número de ligações de dissulfeto χ 134) + (Nú-mero de resíduos de Triptofano χ 5,540) + (Número de resíduos de Tirosinaχ 1,480)]

CTLA4-lg tem 9 ligações de dissulfeto, 8 resíduos de triptofano e32 resíduos de tirosina a fim de proporcionar uma capacidade de absorçãomolar (ε) de 92,886 M"1 cm"1, conforme mostrado em Equação 2.

Equação 2: ε = (9 χ 134) + (8 χ 5,540) + (32 χ 1,480)] = 92,886M-1cm^1

A constante da capacidade de absorção (as) foi calculada divi-dindo a capacidade de absorção molar (ε) pelo peso molecular, onde o pesomolecular foi determinado através de MALDI-TOF, conforme mostrado naEquação 3.

Equação 3: as =t/Peso molecular = 92,886 M1Cm-1 / 92,278 Da= 1,01 mL mg"1 cm"1

Uma comparação do valor de capacidade de absorção teorica-mente derivado com os valores de capacidade de absorção experimentalmen-te determinados sobre dois lotes de material de CTLA4-lg (compreendendoSEQ ID NO: 2) foi realizada usando análise de aminoácido. A constante decapacidade de absorção média calculada experimentalmente determinada éde 1,00 ± 0,05 mL mg"1 cm"1 O valor experimental confirma o valor teórico de1,01 mL mg'1 cm"1 dentro do erro da determinação experimental. Assim, emuma modalidade, a invenção proporciona uma linhagem de célula que produzmoléculas de CTLA4-lg que têm uma valor de capacidade de absorção oucoeficiente de extinção de cerca de 1,00 ± 0,05 mL mg1 cm1

De acordo com a presente invenção, o clone recombinante deinteresse pode também ser caracterizado de acordo com o número de sítiosna seqüência de DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo,construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-lg) quesão integrados no genoma da célula hospedeira. Versados na técnica com-preenderão que técnicas-padrão de hibridização de Southern permitirão talanálise. Em uma modalidade da invenção, um único fragmento de hibridiza-ção de aproximadamente 1,2 kb foi detectado em cada uma das digestõescom EcoRI e Xbal do DNA genômico preparado a partir do clone de célularecombinante da invenção, consistente com o tamanho esperado do gene deCTLA4-lg (híbrido de Southern; figura 23). A representação na figura é con-sistente com um único sítio de integração do plasmídeo, bem como não ha-vendo inserções ou deleções no gene de CTLA4-lg sendo detectáveis atra-vés de análise por hibridização de Southern.

Em uma modalidade, a invenção proporciona populações de cé-lula de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4-lg, em que cada célu-la da população compreende pelo menos 30 cópias de um ácido nucleicoque codifica uma proteína de CTLA4-lg, em que as 30 ou mais cópias sãointegradas aleatoriamente em um único sítio no genoma da célula e em quea população de células é clonal. Em outras modalidades, as populações decélula de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4-lg compreendemuma população em que pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dascélulas nas populações compreendem pelo menos 30 cópias de um ácidonucleico que codifica uma proteína de CTLA4-lg.

Em outras modalidades, a invenção proporciona uma linhagemde célula que, quando cultivada em condições de acordo com figura 10 ouExemplo 14, produz moléculas de CTLA4-lg compreendidas de SEQ ID NO:2 em uma quantidade que é pelo menos 1,0, 1,3, 1,6, 1,8, 2,0 ou 2,5 gramasde moléculas de CTLM-Ig por litro de cultura de células no estágio de pro-dução.

De acordo com a invenção, a linhagem de célula de mamífero(por exemplo, uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) é gerada, aqual expressa uma proteína desejada (por exemplo, uma proteína de C-TLA4-lg) que, quando desenvolvida em uma cultura suspensa, pode produziruma população de moléculas que é secretada no sobrenadante de cultura.Essa população de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todasas seguintes características listadas na Tabela 6.

Tabela 6. Características Ilusl rativas de CTLA4-lg

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De acordo com a Tabela 6, o percentual de dímero de CTLA4-lg,percentual de espécies de HMW (por exemplo, multímeros de CTLA4-lg, talcomo um tetrâmero) e percentual de espécies de LMW (por exemplo, mo-nômero de CTLA4-lg) são com relação a uma população de moléculas deCTLA4-lg. Os mois de açúcares e os mois de ácido siálico descritos na Ta-bela 6 são com relação ao mol de moléculas ou dímeros de CTLA4-lg. Opercentual de ligação a B7 encontrado na Tabela 6 é em referência a expe-rimentos de ligação a CTLA4-lg realizados através de ressonância de plas-mônio em superfície (SPR) sobre um instrumento BIAcore descrito anterior-mente, em que o percentual é uma comparação da ligação a B7 com umcontrole de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a linhagem de célula de mamífero (tal co-mo uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) gera uma população demoléculas de CTLA4-lg mostrando atributos característicos números 1-5 daTabela 6. Em outra modalidade da invenção, a linhagem de célula de mamí-fero gera uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo atributos caracte-rísticos números 1-10 da Tabela 6. Em outras modalidades, a linhagem decélula de mamífero gera uma população de moléculas de CTLA4-lg mos-trando atributos característicos números 1-15 da Tabela 6. Em uma outramodalidade, a quantidade de grupos sulfidrila livres sobre a CTLA4-lg é cer-ca de £ 0,20 tiol livre por molécula.

Quando de purificação do sobrenadante de cultura de célula quecontém a proteína desejada (por exemplo uma proteína de CTLA4-lg) secre-tada por uma população de células de mamífero transfectadas (por exemplo,uma célula de CHO dhfr negativa), a população de moléculas pode ter ou-tras características. Além daquelas características listadas na Tabela 6, essapopulação de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas asseguintes características: uma faixa de pH de cerca de 7,0 - 8,0; capacidadede inibir a atividade de IL-2 em células humanas em 50 - 150%; proteínaquimiotática de monócito (MCP-1) presente no produto purificado final a < 5ng/mg de dímero de CTLA4-lg ou moléculas de CTLA4-lg; concentração deDNA presente no produto purificado final a ú 2,5 pg/mg de dímero de C-TLA4-lg; proteína de célula hospedeira CHO presente no produto purificadofinal a ^ 50 ng/mg de dímero de CTLA4-lg; concentração de Triton X-100 noproduto purificado final a ^ 1,0 ppm; quantidade de Proteína A a £ 5 ng/mgde dímero de CTLA4-lg; quantidade de endotoxinas bacterianas no produtopurificado final a £ 0,3 EU/mg de dímero de CTLA4-lg; quantidade de Bio-burden no produto purificado final a £ 3,0 CFU/10 ml_.

Em uma modalidade, proteína quimiotática de monócito (MCP-1)está presente no produto purificado final a < 3 ng/mg de dímero de CTLA4-lgou moléculas de CTLA4-lg; a concentração de DNA presente no produtopurificado final a <1,0 pg/mg de dímero de CTLA4-lg; proteína de célula hos-pedeira CHO presente no produto purificado final a < 10 ng/mg de dímero deCTLA4-lg; quantidade de Proteína A a < 1 ng/mg de dímero de CTLA4-lg;quantidade de endotoxinas bacterianas no produto purificado final a < 0,15EU/mg de dímero de CTLA4-lg; e quantidade de Bioburden no produto puri-ficado final a <1,0 CFU/10 mL; uma faixa de pH de cerca de 7,2 - 7,8. Emuma modalidade particular, proteína quimiotática de monócito (MCP-1) estápresente no produto purificado final a < 1 ng/mg de dímero de CTLA4-lg oumoléculas de CTLA4-lg, em uma outra modalidade, moléculas de CTLA4-lginibem a atividade de IL-2 em células humanas em 60 -140%.

Em outra modalidade da invenção, a população de células cio-nais produz moléculas de CTUMa29yl104e-Iq. Algumas das característicasespecíficas dessa população de moléculas de CTLjMa29yl1 04E-lg são listadasna Tabela 7. Uma população de moléculas de CTIjMa29yli04e-Iq pode pelomenos incluir moléculas diméricas de CTUMa29yl104e-Iq que compreendemduas moléculas monoméricas que, podem ter, cada uma, uma das seguintesseqüências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii)27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Assim, a população de moléculasde CTI_A4A29YL104E-lg pode incluir predominantemente homodímeros ou hete-rodímeros ou qualquer mistura dos mesmos. Em uma modalidade, a inven-ção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg tendo ascaracterísticas mostradas na Tabela 7 ou um equivalente farmacêutico dasmesmas. Conforme usado aqui, um equivalente farmacêutico é onde umapopulação de moléculas tem um perfil de segurança e eficácia à população original (população padrão) para tratamento de um paciente, conforme seriacompreendido por uma agência governamental, tal como o FDA. Por exem-plo, a população de CTLA4A29YL104E-lg da presente invenção pode as carac-terísticas mostradas na Tabela 7. Em outra modalidade, a população de mo-léculas de CTI_A4A29YL104E-lg da invenção pode ter as características mostra- das na Tabela 7 ou equivalentes das mesmas unicamente ou em qualquercombinação ou permuta dos mesmos.

Em uma modalidade, a invenção proporciona populações de cé-lulas de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4A29YL104E-lg, em quecada célula da população compreende pelo menos 30 cópias de um ácido nucleico que codifica uma proteína de CTLA4A29YL104E-lg, em que as 30 oumais cópias são integradas aleatoriamente em um único sítio no genoma dacélula e em que a população de células é clonal. Em outras modalidades, aspopulações de células de CHO capazes de produzir moléculas de C-TLA4A29YL104E-lg compreendem uma população em que pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% das células nas populações compreendempelo menos 30 cópias de um ácido nucleico que codifica a CTLA4A29YL104E-lg.

Em outras modalidades, a invenção proporciona uma linhagemde células que, quando cultivada em condições de acordo com figura 24 ouExemplos 19-20, produz moléculas de CTUMa29yl1 04E-lg compreendidas deSEQ ID NO: 4 em uma quantidade que é pelo menos 22, 22,5, 23, 27,5 ou28 gramas de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg por litro cultura de células noestágio de produção.

De acordo com a invenção, uma linhagem de célula de mamífero(por exemplo, uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) é gerada, aqual expressa uma proteína desejada (por exemplo, a CTLA4A29YL104E-lg)que, quando desenvolvida em uma cultura suspensa, pode produzir umapopulação de moléculas que é secretada no sobrenadante de cultura. Essapopulação de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas asseguintes características listadas na Tabela 7.

Tabela 7. Características ilustrativas da CTI_A4A29YL104E-lg

<table>table see original document page 218</column></row><table>

De acordo com a Tabela 7, o percentual de dímero de C-TLA4A29YL104E-lg, percentual de espécies de HMW (por exemplo, multímerosde CTLA4A29YL104E-lg, tal como um tetrâmero) e percentual de espécies deLMW (por exemplo, monômeros de CTI_A4A29YL104E-lg) são com relação auma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg. Os mois de açúcares eos mols de ácido siálico descritos na Tabela 7 são com relação ao mol demoléculas ou dímero de CTUMa29yl104e-Iq. O percentual de ligação a B7encontrado na Tabela 7 é em referência aos experimentos de ligação deCTLA4A29YL104E-lg realizados através de ressonância de plasmônio em su-perfície (SPR) sobre um instrumento BIAcore descrito anteriormente, em queo percentual é uma comparação com a ligação a B7 com um controle de

CTLA4A29YL104E.|g

Em uma modalidade, a linhagem de célula de mamífero (tal co-mo uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) gera uma população demoléculas de CTLA^9yl1 04E-lg mostrando atributos característicos números1-5 da Tabela 7. Em outra modalidade da invenção, a linhagem de célula demamífero gera uma população de moléculas de CTUMa29yu 04E-lg tendo a-tributos característicos números 1-10 da Tabela 7. Em outras modalidades, alinhagem de célula de mamífero gera uma população de moléculas de C-TLMa29yl1'°4E-lg mostrando atributos característicos números 1-13 da Tabela7.

Quando de purificação de um sobrenadante de cultura de célulaque contém a proteína desejada (por exemplo, a CTUMa29yl104e-Iq) secreta-da por uma população de células de mamífero transfectadas (por exemplo,uma célula de CHO dhfr negativa), a população de moléculas pode ter outrascaracterísticas. Além daquelas características listadas na Tabela 7, essa po-pulação de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas as se-guintes características: Proteína quimiotática de monócito (MCP-1) presenteno produto purificado final a ^ 5 ng/mg de dímero de CTUMa29yu04e-Iq; con-centração de DNA presente no produto purificado final a < 2,5 pg/mg de dí-mero de CTLMa2byl1'°4E-lg; e proteína de célula hospedeira CHO presenteno produto purificado final a < 50 ng/mg de dímero de CTUMa29yu04e-Iq.

Cultura geral de linhagens de células

De acordo com presente invenção, células de mamífero são cul-tivadas para produzir uma proteína desejada, incluindo uma glicoproteína,conforme convencionalmente conhecidos por versados na técnica. As célu-las de mamífero expressando uma glicoproteína de interesse expressam ouseriam manipuladas para expressar as enzimas apropriadas de modo que,sob condições satisfatórias, modificações pós-traducionais mais pertinentesà glicosilação ocorrem in vivo. As enzimas incluem aquelas necessárias paraa adição e término de carboidratos N- e O-ligados, tais como aqueles descri-tos em Hubbard e Ivatt, Ann. Rev. Biochem.. 50: 555-583(1981) para oligos-sacarídeos N-ligados. As enzimas incluem, opcionalmente, oligossacaril-transferase, alfa-glicosidase I, alfa-glicosidase II, alfa(1,2)manosidase de ER,alfa-manosidase I de Golgi, N-acetili glicosaminil transferase I, alfa-mano-sidase Il de Golgi, N-acetilglicosaminiltransferase II, alfa(1,6)fucosiltransfera-se, beta (1,4)galactosiltransferase e uma sialiltransferase apropriada.

Um retardo na apoptose (morte celular programada) pode ter umefeito de aumentar a viabilidade celular durante processos de cultura de cé-lulas. Uma diminuição na apoptose e, por sua vez, um aumento na vida útilde uma célula em particular pode aumentar a produção de proteína a partirde uma cultura de célula. Eventos apoptóticos podem ser inibidos em umacélula através de introdução, na célula (tal como uma célula de mamífero,uma célula de inseto ou uma célula de levedo), de uma ou mais proteínasantiapoptóticas, as quais inibem a apoptose em células em pontos precisosao longo da via apoptótica. Outro método para inibir a apoptose é inibir aliberação de moléculas pró-apoptóticas das mitocôndrias na célula. Varian-tes de proteínas pró-apoptóticas conhecidas na técnica, tais como uma for-ma dominante-negativa de caspase-9, podem ser usadas como um inibidorde apoptose em uma célula. Tal proteína variante pode ser introduzida emuma célula a fim de impedir a morte célula programada. Inibição de apoptosede uma célula, por sua vez, prolonga o tempo durante o qual uma célula emparticular produz proteína, resultando em um aumento global na produçãode uma proteína desejada por uma célula em particular. Vários genes quecodificam inibidores de caspase (tais como o inibidor de apoptose X-Iigado(XIAP) ou variantes do mesmo) ou genes antiapoptóticos (por exemplo, Bcl-2 e BcI-Xl ou variantes dos mesmos) podem ser transfectados em células demamífero geneticamente manipuladas (tais como células de CHO, célulasdeVERO, células de BHK e semelhantes) (Sauerwald, T. e outros, 2003, Bio1technol Bioenq. 81: 329-340; Sauerwald, Τ. e outros, 2002, Biotechnol Bio-eng. 77: 704-716; Mastrangelo, A., e outros, 2000, Biotechnol Bioenq. 67:544-564; Kim1 N., e outros, 2002, J Biotechnol. 95: 237-248; Figueroa, B., eoutros, 2001, Biotechnol Bioenq. 73: 211-222).

Em uma modalidade, células de mamífero as quais produzemuma proteína recombinante podem ser transfectadas com um vetor contendoum gene antiapoptótico (tal como bcl-2). Em outra modalidade, células demamífero recombinantes podem ser transfectadas com um plasmídeo quecontém um gene que codifica um inibidor de caspase ou um gene que codifi-ca uma variante de uma molécula pró-apoptótica, conforme descrito acima,um gene que codifica uma proteína que é conhecida por versados na técnicapor possuir atividade antiapoptótica ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outra modalidade, qualidade global de produto (por exemplo,glicosilação intensificada) de uma proteína recombinante desejada (tal comouma proteína terapêutica) pode ser intensificada. Para aumentar a glicosila-ção de uma proteína recombinante, células de mamífero (por exemplo, célu-las de CHO, células de VERO, células de BHK e semelhantes) pode sertransfectada com ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas queestão envolvidas em glicosilação (tais como a2,3-sialiltransferase, β1,4-galactosiltransferase e semelhantes) de proteínas (Weikert e outros, 1999,Nature Biotechnol 17: 1116-21). Em uma modalidade, um plasmídeo quecodifica β1,4-galactosiltransferase pode ser introduzido em células de mamí-fero expressando uma proteína de interesse. Em outra modalidade, umplasmídeo que codifica a2,3-sialiltransferase pode ser introduzido em célulasde mamífero expressando uma proteína de interesse.

Vários parâmetros de cultura podem ser usados com relação àcélula hospedeira que está sendo cultivada. Condições de cultura apropria-das para células de mamífero são bem-conhecidas na técnica (Cleveland eoutros, J. Immunol. Methodos, 56: 221-234 (1983)) ou podem ser determina-das por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Animal Cell Culture:A Practical Approach, 2ad Ed., Rickwood, D. e Hames1 B. D., eds. (OxfordUniversity Press: New York, 1992)) e variam de acordo com a célula hospe-deira selecionada em particular.

Sem limitação, meio de cultura de células (tais como meio deinóculo, meio de alimentação, meio basal e semelhantes) pode se referir auma solução nutriente usada para crescimento de e ou manutenção de célu-Ias, especialmente células de mamífero. Essas soluções comumente propor-cionam pelo menos um componente de uma ou mais das seguintes catego-rias: (1) uma fonte de energia, usualmente na forma de um carboidrato, talcomo glicose; (2) todos os aminoácidos essenciais e usualmente o conjuntobásico de vinte aminoácidos mais cisteína; (3) vitaminas e/ou outros com-postos orgânicos requeridos em baixas concentrações; (4) ácidos graxoslivres ou lipídios, por exemplo, ácido linoleico; e (5) elementos vestigiais, on-de elementos vestigiais são definidos como compostos inorgânicos ou ele-mentos que ocorrem naturalmente que são, tipicamente, requeridos em con-centrações muito baixas, usualmente na faixa micromolar. A solução nutrien-te pode ser suplementada eletivamente com um ou mais componentes dequalquer uma das seguintes categorias: (1) hormônios e outros fatores decrescimento, tais como soro, insulina, transferrina e fator de crescimento e-pidérmico; (2) sais, por exemplo, magnésio, cálcio e fosfato; (3) tampões,tais como HEPES; (4) nucleosídeos e bases, tais como adenosina, timidina ehipoxantina; (5) proteína e hidrolisatos teciduais, por exemplo, peptona oumisturas de peptona as quais podem ser obtidas de gelatina purificada, ma-terial vegetal ou subprodutos animais; (6) antibióticos, tais como gentamici-na; (7) agentes protetores de célula, por exemplo, poliol Pluronic; e (8) galac-tose. Um exemplo de meio basal pode ser Meio Basal de Crescimento Celu-lar. Um exemplo de meio de inóculo pode ser Meio Basal de Crescimento deCélulas de Inóculo. Um exemplo de meio de alimentação pode ser Meio dealimentação para Produção em Biorreator.

Meios comercialmente disponíveis podem ser utilizados e inclu-em, por exemplo, Meio Mínimo Essencial (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.);Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma); Meio F10 de Ham(Sigma); meio de cultura de células HyCIone (HyClone, Logan, Utah); MeioRPMI-1640 (Sigma); e meio quimicamente definido (CD), os quais são for-mulados para tipos de célula particulares, por exemplo, Meio CD-CHO (Invi-trogen, Carlsbad, Calif.). Qualquer um desses meios pode ser suplementadoconforme necessário com os componentes ou ingredientes suplementarespreviamente definidos, incluindo componentes opcionais, em concentraçõesou quantidades apropriadas, conforme necessário ou desejado. A cultura decélulas de mamífero que pode ser usada com a presente invenção é prepa-rada em um meio adequado para a célula que está sendo cultivada em parti-cular. Em uma modalidade, um meio de cultura de célula pode ser um da-queles antes mencionados que geralmente é isento de soro de qualquer fon-te de mamífero (por exemplo, soro fetal bovino (FBS)). Em outra modalidadeda presente invenção, a cultura de células de mamífero pode ser desenvol-vida no meio (CD)-CHO quimicamente definido comercialmente disponível,suplementado com componentes adicionais especificados na Tabela 15. Emuma outra modalidade, a cultura de células de mamífero pode ser desenvol-vida em Meio CD-CHO, suplementado com componentes adicionais especi-ficados na Tabela 20 ou 21.

Os métodos da presente invenção incluem a cultura de inúmerostipos de célula. Em uma modalidade da invenção, as células são de animalou de mamífero. Em outra modalidade, as células podem expressar e secre- tar grandes quantidades de uma proteína desejada. Em outra modalidade dainvenção, células podem expressar e secretar grandes quantidades de umaglicoproteína de interesse no meio de cultura. As células de animal ou mamí-fero podem também ser molecularmente modificadas para expressar e se-cretar uma proteína de interesse. A proteína produzida pela célula hospedei-ra pode ser endógena ou homóloga à célula hospedeira. A proteína tambémpode ser heteróloga (por exemplo, estranha) à célula hospedeira, pelo que ainformação genética que codifica a proteína de interesse é introduzida nacélula hospedeira via métodos-padrão na técnica (por exemplo, através deeletroporação, transfecção e semelhantes). Em uma modalidade, a glicopro-teína de mamífero pode ser produzida e secretada por uma célula hospedei-ra de Ovário de Hamster Chinês (CHO) no meio de cultura.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg produzida através dos métodos de produçãodiscutidos aqui, incluindo o método de produção em massa que é descrito noExemplo 14 e mostrado na figura 10. O processo pode resultar na produçãode espécies de elevado peso molecular (HMW) de moléculas de CTLA4-lg(por exemplo, veja Exemplos 14 e 15). Em outra modalidade, populações demoléculas de CTI_A4A29YL104E-lg são proporcionadas que são produzidas a-través dos métodos de produção discutidos acima, tais como o método deprodução em massa que é descrito nos Exemplos 19 e 20 e mostrado nafigura 24. O processo pode resultar na produção de moléculas de Ο-TLA4A29YL104E-lg de elevado peso molecular (HMW) (por exemplo, veja E-xemplos 19 e 20). Em algumas modalidades, as espécies de HMW podemser cerca de 15-25% das moléculas ou dímeros produzidos através de ummétodo para produção, incluindo um processo de fermentação de (CD)-CH01 quimicamente modificado. Em outras modalidades, a presente inven-ção proporciona métodos para isolamento, purificação e caracterização decomponentes de HMW de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg produzidos atra-vés do processo de fermentação de CD-CH01. Componentes de HMW deCTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg são multímeros (isto é, tetrâmeros, hexâme-ros, etc.), os quais têm um peso molecular maior do que dímeros de CTLA4-Ig ou CTU^a29yl104e-I9.

Células hospedeiras de animal ou de mamífero capazes de abri-gar, expressar e secretar grandes quantidades de uma glicoproteína de inte-resse no meio de cultura para subsequente isolamento e/ou purificação in-cluem, mas não estão limitadas a, células de Ovário de Hamster Chinês(CHO), tais como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin e outros, 1986,Som. Cell Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar e outros, 1997, Biochemistrv,36: 10901-10909; e WO 01/92337 A2), células de CHO negativas para di-hidrofolato reductase (OHOIdhfr-, Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 77: 4216) e células de CHO.dp12 (Patente U.S. N0. 5.721.121);células CV1 de rim de macaco transformadas através do SV40 (células deCOS, COS-7, ATCC CRL-1651); células de rim embriônico humano (por e-xemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultu-ra em suspensão, Graham e outros, 1977, J. Gen. Virol.. 36: 59); células derim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL-10); células de rim de macaco (CV1,ATCC CCL-70); células de rim de macaco African green (VERO-76, ATCCCRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células de Sertoli de camundongo (TM4,Mather, 1980, Biol. Reprod.. 23: 243-251); células de carcinoma cervicalhumano (HELA, ATCC CCL-2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL-75); células de hepato-ma humano (HEP-G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo(MMT 060562, ATCC CCL-51); células de fígado de rato (BRL 3A, ATCCCRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci.. 383: 44-68);células MCR 5; células FS4. Em um aspecto da presente invenção, célulasde CHO são utilizadas, particularmente células de CHOIdhfr- e célulasDG44.

Exemplos de glicoproteínas de mamífero que podem ser produ-zidas através dos métodos da presente invenção incluem, sem limitação,citocinas, receptores de citocina, fatores de crescimento (por exemplo, EGF,HER-2, FGF-a, FGF-β, TGF- a, TGF-β, PDGF, IGF-1, IGF-2, NGF, NGF- β);receptores de fator de crescimento, incluindo proteínas de fusão ou quiméri-cas. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a, hormônios decrescimento (por exemplo, hormônio de crescimento humano, hormônio decrescimento bovino); insulina (por exemplo, cadeia A de insulina e cadeia Bde insulina), pró-insulina; eritropoietina (EPO); fatores de estimulação decolônia (por exemplo, G-CSF, GM-CSF, M-CSF); interleucinas (por exemplo,IL-1 a IL-12); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seu receptor(VEGF-R); interferons (por exemplo, IFN-α, β ou γ); fator de necrose de tu-mor (por exemplo, TNF-α e TNF-β) e seus receptores, TNFR-1 e TNFR-2;trombopoietina (TPO); trombina; peptídeo natriurético cerebral (BNP); fatoresde coagulação (por exemplo, Fator VIII, Fator IX, fator de von Willebrands esemelhantes); fatores anticoagulação; ativador de plasminogênio tecidual(TPA), por exemplo, uroquinase ou urina humana ou TPA do tipo tecidual;hormônio de estimulação de folículo (FSH); hormônio de luteinização (LH);calcitonina; proteínas de CD (por exemplo, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19,etc.); proteínas de CTLA (por exemplo, CTLA4); proteínas do receptor decélulas T e células B; proteínas morfogênicas ósseas (BNPs, por exemplo,BMP-1, BMP-2, BMP-3, etc.); fatores neurotróficos, por exemplo, fator neuro-trófico derivado de osso (BDNF); neurotrofinas, por exemplo, 3-6; renina;fator reumatoide; RANTES; albumina; relaxina; proteína inibitória de macró-fago (por exemplo, MIP-1, MIP-2); proteínas ou antígenos virais; proteínasna membrana de superfície; proteínas do canal de íons; enzimas; proteínasregulatórias; anticorpos; proteínas imunomodulatórias (por exemplo, HLA,MHC, a família B7); receptor residente ("homing receptor"); proteínas detransporte; dismutase de superóxido (SOD); proteínas de receptor acopladasà proteína G (GPCRs); proteínas neuromodulatórias; proteínas e peptídeosassociados ao mal de Alzheimer (por exemplo, Α-beta), bem como outrosconhecidos na técnica. Proteínas, polipeptídeos e peptídeos adequados quepodem ser produzidos através dos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, proteínas de fusão, polipeptídeos, proteínas qui-méricas, bem como fragmentos ou porções ou mutantes, variantes ou aná-logos de qualquer uma das proteínas e polipeptídeos antes mencionados.

Os métodos da invenção podem também ser usados para pro-duzir moléculas de CTLA4-lg as quais são variantes de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-lg pode compreenderum monômero tendo uma ou mais alterações nos resíduos 55 (A55Y) e 130(L130E) (os resíduos mencionados são de SEQ ID NO: 2). Veja as descri-ções de variantes e mutantes de CTLA4-lg descritas na Publicação U.S. No.2002/0182211 A1, a qual é incorporada aqui por referência em sua totalida- de. Em outra modalidade, uma variante de CTLA4-lg pode compreender amolécula de CTLA4-lg tendo uma mutação dentro da região de CTLA-4 ouuma mutação na região de Ig ou qualquer combinação dos mesmos. Emuma modalidade, uma molécula variante de CTLA4-lg compreende a molé-cula de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%,cerca de 95% ou cerca de 99% idêntica à SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.Em uma modalidade, a molécula variante de CTLA4-lg é capaz de ligaçãoao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, a variante é capaz de formar umdímero. Em uma outra modalidade, a variante exibe um perfil de carboidratosimilar àquele exibido por uma população de moléculas de CTLA4-lg semmutação. Em uma modalidade, as moléculas variantes de CTLA4-lg têm osmesmos sítios potenciais de glicosilação N-ligada e O-Iigada presentes emSEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, uma molécula variante de CTLA4-lgtem os mesmos sítios de glicosilação N-Iigada e O-Iigada presentes em SEQID NO: 2 e tem sítios de glicosilação adicionais. As mutações podem incluir,mas não estão limitadas a, deleções, inserções, adições de nucleotídeo; de-leções, substituições, adições de aminoácido; desvios de rede de ácido nu-cleico; as substituições podendo ser não conservativas (por exemplo, a glici-na substituída por um triptofano) ou substituições conservativas (por exem-plo, uma Ieucina substituída por uma isoleucina).

Moléculas variantes de CTLA4-lg incluem, mas não estão Iimita-das a, CTLA4-L104EA29Ylg (usando o sistema de numeração de resíduo deacordo com SEQ ID NO: 2, CTLA4-L104EA29Ylg aqui é referida como C-TLA4-L130EA55Ylg), bem como aquelas moléculas variantes de CTLA4-lgconforme descrito nos Pedidos de Patente U.S. N0S de Série 09/865.321(Pub. U.S. No. US2002/0182211), 60/214.065 e 60/287,576; no WO01/92337 A2; nas Patentes U.S. N0S 6.090.914, 5.844.095 e 5.773.253; econforme descrito em R. J. Peach e outros, 1994, J Exp Med. 180: 2049-2058. Em uma modalidade, moléculas variantes de CTLA4-lg produzidasnos presentes métodos podem ser secretadas de uma célula que compre-ende um vetor de expressão que codifica uma proteína variante de CTLA4-Ig.

Uma variante de CTLA4-lg, L130EA55Y-lg, é uma proteína defusão geneticamente modificada similar, quanto à estrutura, à molécula deCTAL4-lg. L130EA55Y-lg tem o domínio de ligação extracelular funcional daCTLA-4 humana modificada e o domínio Fc da imunoglobulina humana daclasse lgG1. Duas modificações de aminoácido, Ieucina para ácido glutâmi-co na posição 104 (L104E) de uma variante L104EA29Y, a qual correspondeà posição 130 de SEQ ID NO: 2 e alanina para tirosina na posição 29 (A29Y)de uma variante L104EA29Y, a qual corresponde à posição 55 de SEQ IDNO: 2, foram feitas na região de ligação a B7 do domínio de CTLA-4 paragerar a L130EA55Y. L130EA55Y-lg pode compreender duas cadeias poli-peptídicas glicosiladas homólogas de aproximadamente 45.700 Dáltons ca-da, as quais são mantidas juntas por uma ligação de dissulfeto intercadeia einterações não covalentes. DNA que codifica L130EA55Y-lg foi depositadocomo DNA que codifica L104EA29Y-lg em 20 de Junho de 2000 na Ameri-can Type Culture Collection (ATCC) sob as condições do Tratado de Buda-peste. A ele foi atribuído número de acesso a ATCC PTA-2104. L104EA29Y-Ig (correspondendo a L130EA55Y-lg no presente pedido) é ainda descritanos pedidos de patente copendentes U.S. N0S de Série 09/579.927,60/287.576 e 60/214.065 e 09/865.321 e no WO/01/923337 A2, todos osquais são incorporados por referência no presente pedido em suas totalida-des.

Uma vez que a proteína recombinante L130EA55Y-lg é diferentepor apenas 2 aminoácidos (Tyr na posição de aminoácido 55 e Glu na posi-ção de aminoácido 130) comparado com monômeros de CTLA4-lg tendouma Ala na posição de aminoácido 55 e Leu na posição de aminoácido 130de SEQ ID NO: 2 e em virtude do fato de essas 2 mutações não afetarem aglicosilação N- ou O-ligada, populações de moléculas variantes de CTLA4-lgcompreendendo L130EA55Y-lg podem ter o mesmo perfil ou um perfil deglicosilação muito similar àquele de populações compreendendo CTLA4-lgdo tipo silvestre. Ainda, em virtude do fato de que a proteína recombinanteL130EA55Y-lg é diferente por apenas 2 aminoácidos (Tyr na posição de a-minoácido 55 e Glu na posição de aminoácido 130) comparado com monô-meros de CTLA4-lg tendo uma Ala na posição de aminoácido 55 e Leu naposição de aminoácido 130 de SEQ ID NO: 2, os presentes métodos da pre-sente invenção deverão ser capazes de produzir L130EA55Y-lg com atribu-tos característicos similares conforme descrito na Tabela 6.

Os métodos da invenção podem também ser usados para pro-duzir moléculas de CTLA4A29YL104E-lg as quais são variantes de SEQ IDNOS: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma modalidade, a CTI_A4A29YL104E-lgpode compreender um monômero tendo uma ou mais alterações em SEQ IDNO: 3. Por exemplo, descrições de outras moléculas de CTUMa29yl104e-Iqsão descritas nas Publicações de Pedido de Patente U.S. N0S U.S.2002/0039577, U.S. 2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S. 2005/0019859e U.S. 2005/0084933 e Patente U.S. No. 7.094.8874, as quais são aqui in-corporadas por referência em sua totalidade.

Em uma modalidade, CTLA4A29YL104E-lg compreende uma oumais mutações dentro da região de CTLA-4 (SEQ ID NO: 18) ou uma muta-ção na região de Ig ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras moda-lidades, a molécula de CTLA4A29YL104E-lg compreende a CTI_A4A29YL104E-lgtendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cerca de 70%, cercade 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cercade 99% idêntica à SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma outra mo-dalidade, a molécula de CTI_A4A29YL104E-lg conforme descrito acima é capazde ligação ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, a CTLA4A29YL104E-lg écapaz de formar um dímero. Em uma outra modalidade, a CTLA4A29YL104E-lgexibe um perfil de carboidrato similar àquele exibido por uma população demoléculas de CTLA4A29YL104E-lg sem mutação. Em ainda outras modalida-des, as moléculas de CTLA4A29YL104E-lg têm os mesmos sítios potenciais deglicosilação N-Iigada e O-Iigada presentes em SEQ ID NO: 4. Em outra mo-dalidade, a CTLA4A29YL104E-lg tem os mesmos sítios de glicosilação N-Iigadae O-Iigada presentes em SEQ ID NO: 4 e tem sítios de glicosilação adicio-nais. A mutações podem incluir, mas não estão limitadas a, deleções, inser-ções, adições de nucleotídeo; deleções, substituições, adições de aminoáci-do; desvios de rede de ácido nucleico; as substituições podendo ser nãoconservativas (por exemplo, a glicina substituída por um triptofano) ou subs-tituições conservativas (por exemplo, uma Ieucina substituída por uma iso-leucina).

Em uma modalidade da invenção, uma população de moléculasvariantes de CTLA4-lg pode ser produzida por células de mamífero (por e-xemplo, células de CHO dhfr negativas), as quais expressam um gene quecodifica a proteína desejada (por exemplo, uma proteína L130EA55Y-lg ousemelhante), desenvolvida em suspensão de acordo com o método de pro-dução em massa da presente invenção. De acordo com presente invenção,uma proteína variante de CTLA4-lg recombinante produzida por células demamífero pode ser recuperada de acordo com os parâmetros de coleta des-critos aqui. Em outras modalidades, uma proteína variante de CTLA4-lg re-combinante produzida por células de mamífero pode ser purificada de acor-do com o esquema de purificação descrito na presente invenção (Exemplo 15).

Em uma modalidade da invenção, uma população de moléculasde CTUMa29yl104e-Iq pode ser produzida por células de mamífero (por e-xemplo, células de CHO dhfr negativas), as quais expressam um gene quecodifica a proteína desejada (por exemplo, a CTUM^9^104^), desenvolvi-das em suspensão de acordo com o método de produção em massa da pre-sente invenção. De acordo com presente invenção, uma CTUMa29yuo4e-Iqrecombinante produzida por células de mamífero pode ser recuperada deacordo com os parâmetros de coleta descritos aqui. Em outras modalidades,uma CTUMa29yl1'°4E-lg recombinante produzida por células de mamífero po-de ser purificada de acordo com o esquema de purificação descrito na pre-sente invenção (EXEMPLOS 19-20).

Tipos de processos de cultura de células e cultura geral

Uma proteína de interesse, por exemplo, uma glicoproteína, umaproteína de fusão e semelhantes, pode ser produzida através de desenvol-vimento de células expressando o produto de proteína desejado sob umavariedade de condições de cultura de células. Versados na técnica compre-enderão que a cultura de células e operações de cultura para produção deproteína podem incluir, mas não estão limitados a, três tipos gerais: culturacontínua, cultura em batelada e cultura com alimentação em batelada. Emum processo de cultura contínuo, um meio de suplemento de cultura fresco(por exemplo, meio de alimentação) é fornecido às células durante um perí-odo de cultura enquanto o meio de cultura velho é removido. O produto pro-duzido durante a cultura contínua pode também ser coletado, por exemplo,em uma base diária ou continuamente. Na medida em que as células per-maneçam vivas e as condições ambientais e de cultura sejam mantidas, ascélulas podem permanecer em cultura durante tanto tempo quanto desejadoem um processo de cultura contínuo.

Em um processo de cultura em batelada, as células são inicial-mente cultivadas em meio e esse meio de cultura não é substituído, nemremovido, nem suplementado. As células não são "alimentadas" com novomeio durante ou antes do final da operação de cultura, assim, a cultura con-tinua até que os nutrientes tenham se esgotado. Um produto de proteína écoletado ao final de uma operação de cultura.

Para processos de cultura com alimentação em batelada, umtempo de operação de cultura pode ser aumentado suplementando o meiode cultura uma ou mais vezes ao dia (ou continuamente) com meio frescodurante a operação. Nesse processo, as células são fornecidas com meiofresco, um "meio de alimentação", durante um período de cultura. Culturascom alimentação em batelada podem incluir os vários esquemas de alimen-tação descritos previamente, por exemplo, diariamente, a cada dois dias, diasim dia não, etc.; mais de uma vez por dia ou menos de uma vez por dia eassim por diante. Culturas com alimentação em batelada podem também seralimentadas continuamente com meio de alimentação. Ao final de uma ope-ração de cultura/produção, um produto de proteína de interesse é, então,coletado.

Sistemas de cultura de células para a produção em pequena oularga escala de proteínas, incluindo glicoproteínas, produzidas por célulashospedeiras de mamífero são úteis dentro do contexto da presente inven-ção. Versados na técnica compreenderão que discos de cultura tecidual,frascos para centrífuga e T-frascos são, tipicamente, usados para métodosde cultura em uma escala de laboratório. Os processos que podem ser usa-dos para cultura em uma escala maior (por exemplo, 500 L, 5000 L, 10.000L, 20.000 L e semelhantes) incluem, mas não estão limitados a, biorreatorcom fibra oca, um biorreator com leito fluidizado, um sistema de biorreatorcom tanque agitado ou uma garrafa de cultura giratória. Os dois últimos pro-cessos podem ser utilizados com ou sem microveículos.Os sistemas podem ser operados em um modo em batelada,com alimentação em batelada ou contínuo. Para cultura em larga escala, obiorreator com tanque agitado é o sistema de escolha em virtude de sua fle-xibilidade. Esses reatores podem manter as células em suspensão por meiode agitação através de agitação mecânica com purgação de bolhas de gásou um propulsor. Os biorreatores com tanque agitado podem ser escalona-dos para volumes de produção em larga escala (por exemplo, 20.000 litros)e podem ser operados em diferentes modos de alimentação. Esses sistemasproporcionam uma área de superfície grande para crescimento celular e atransferência eficiente de resíduos metabólicos, oxigênio e nutrientes, bemcomo manter um ambiente homogêneo por todo o reator impedindo as célu-las de assentar no fundo via agitação ou mistura contínua dos componentesdentro dos reatores. Para a produção da glicoproteína desejada, a presenteinvenção concretiza cultura de células em larga escala com alimentação embatelada mantida em um biorreator com tanque agitado, alimentando diaria-mente com meio de alimentação contendo D-galactose. Em outra modalida-de, cultura de células com alimentação em batelada pode também ser man-tida em um biorreator com tanque agitado, alimentado diariamente com meiode cultura que contém concentrações adequadas dos nutrientes Iimitativospara a cultura de células importantes para glicosilação de proteína, tais co-mo glicose e glutamina (Chee e outros, 2005, Biotechnol. Bioenq. 89: 164-177).

As células em cultura que produzem uma proteína de interessepodem ser propagadas de acordo com qualquer esquema ou rotina que semostra adequada para a célula hospedeira de mamífero em particular e oplano de produção considerado em particular. Condições de cultura de célu-las podem ser desenvolvidas para intensificar a expansão ou crescimento deuma população de células hospedeiras de mamífero na fase de crescimentoda cultura de célula durante um período de tempo que é maximizado para talexpansão e crescimento. A fase de crescimento da cultura de célula com-preende o período de crescimento exponencial de células (por exemplo, afase log) onde as células estão primariamente se dividindo rapidamente. Du-rante essa fase, a taxa de aumento na densidade de células viáveis é maiordo que em qualquer outro ponto de tempo.

Também, condições de cultura de células podem ser desenvol-vidas para intensificar a produção de proteína durante a fase de produção dacultura de células durante um período de tempo. A fase de produção da cul-tura de células compreende o período de tempo durante o qual crescimentocelular é estacionário ou é mantido em um nível quase constante. A densi-dade de células viáveis permanece aproximadamente constante durante umdeterminado período de tempo. Crescimento celular logarítmico terminou e a produção de proteína é a atividade primária durante a fase de produção. Omeio, nesse momento, geralmente é suplementado para sustentar produçãocontínua de proteína e obter o produto de glicoproteína desejado.

Condições de cultura, tais como temperatura, pH, oxigênio dis-solvido (DO2) e semelhantes, são aquelas usadas em cultura de células hospedeiras de mamífero que são compreendidas por versados na técnica.Uma faixa de temperatura apropriada para cultura de células hospedeiras demamífero, tais como células de CHO, está entre 30 a 40°C e, em uma moda-lidade, cerca de 37°C. O pH geralmente é ajustado para um nível entre cercade 6,5 e 7,5 usando um ácido ou base. Um DO2 adequado está entre 5-90%de saturação de ar. Essas condições de cultura podem ser usadas para faci-litar a cultura de células de mamífero que produzem um produto de proteínaou glicoproteína desejado.

A população de células hospedeiras de mamífero pode ser ex-pandida e desenvolvida na fase de crescimento da cultura, em que as célu- las, possivelmente removidas de armazenamento, são inoculadas em ummeio de cultura aceitável para promover crescimento e alta viabilidade. Ascélulas podem, então, ser mantidas em uma fase de produção durante umperíodo de tempo adequado através da adição de meio de cultura fresco àcultura de células hospedeiras. Durante a fase de produção, as células po-dem ser submetidas a vários desvios na temperatura para intensificar a pro-dução de proteína. Processos de cultura com múltiplos desvios de tempera-tura são descritos nos pedidos de patente U.S. N0 de Série 10/742.564, de-positado em 18 de Dezembro de 2003 e U.S. N0 de Série 10/740.645, depo-sitado em 18 de Dezembro de 2003. Os conteúdos desses pedidos são in-corporados por referência aqui em sua totalidade. Na presente invenção, oprocesso de cultura de células compreendendo os dois ou mais desvios detemperatura pode resultar em um número aumentado de células viáveis quesobrevivem na cultura até o final do processo ou operação de produção. Du-rante a fase de produção da cultura, o maior número de células que sobrevi-vem pode resultar em uma maior quantidade de produto de proteína ou gli-coproteína produzido, aumentando a quantidade de produto de proteína nofinal do processo.

Um aspecto particular da presente invenção concretiza culturade células de mamíferos em larga escala de alimentação em batelada (porexemplo, 500 L, 5000 L, 10000 L e semelhantes), que é alimentada diaria-mente ou com alimentação de meio descrita nas Tabelas 14, 15, compreen-dendo D-galactose de forma que células produzam uma glicoproteína deinteresse. Para aumentar a qualidade da proteína produzida nessa modali-dade, dois ou mais desvios de temperatura podem ser empregados duranteo período de cultura para prolongar a fase de produção de proteína para a-lém daquela que ocorre quando nenhum desvio de temperatura é usado ouquando apenas um desvio de temperatura é usado. Em outra modalidade, ainvenção requer cultura de células de mamífero em larga escala de alimen-tação em batelada (por exemplo, 500 L, 5000 L, 10000 L e semelhantes),que é alimentada 1 ou mais vezes ao dia com meio de alimentação descritona Tabela 22 o qual compreende D-galactose, de modo que as células pro-duzam uma glicoproteína de interesse (por exemplo, CTI_A4A29YL104E-lg). Umou mais desvios de temperatura também podem ser empregados durante operíodo de cultura para prolongar a fase de produção de proteína para alémdaquela que ocorre quando nenhum desvio de temperatura é usado de for-ma a aumentar a qualidade da glicoproteína. Alternativamente, sulfato dedextrana pode ser adicionado à cultura com um concomitante desvio detemperatura.

Produção em massa de proteína recombinante em biorreatoresA presente invenção proporciona métodos para cultura conven-cional em um biorreator com tanque agitado de células eucariotas (por e-xemplo, um volume de cultura de células de 20000 L), particularmente paraproduzir quantidades em larga escala ou industriais de produtos de proteínadesejados que são expressos por tais células. O processo de cultura é umprocesso de cultura de alimentação em batelada de células desenvolvidasem suspensão, com coleta do sobrenadante de cultura, em que células eu-cariotas, por exemplo, células de mamífero, expressando uma proteína deinteresse, secretam um produto de proteína desejado no meio de cultura.

Métodos para cultura em larga escala de células de mamífero,particularmente para produzir grandes quantidades de produtos de proteínadesejados que são expressos por tais células, são concretizados na presen-te invenção. Os métodos podem ser realizados através de etapas compre-endendo:

(i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura(por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro epropagação da cultura de semeadura (por exemplo, uma cultura inicial que éusada para inocular um volume maior) pelo menos até as células atingiremuma densidade de cultura cruzada mínima, pelo que a densidade é um valorpredeterminado necessário para propagação suficiente de células no volumede cultura subsequente;

(ii) transferência da cultura de semeadura propagada para um va-so de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ou sacosde células) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivadosde animal de forma a expandir a cultura;

(iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um va-so de cultura de semeadura de larga escala contendo meio de cultura isentode soro para propágar adicionalmente a cultura de célula; e

(iv) manutenção da cultura em larga escala em meio carecendo decomponentes derivados de animal, pelo menos até que as referidas célulasatinjam uma densidade-alvo ou mostrem uma característica bioquímica es-pecífica.Em algumas modalidades, o método pode compreender a etapade (iv) coleta do meio de cultura e substituição desse meio por meio fresco.

Em outras modalidades, métodos para a cultura em larga escalade células de mamífero podem ser realizados através de etapas compreen-dendo:

(i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura(por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro (porexemplo, meio de inóculo) e propagação da cultura de semeadura (por e-xemplo, uma cultura inicial que é usada para inocular um volume maior), pe-

lo menos até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada mínimaque é um valor predeterminado necessário para propagação suficiente decélulas no volume de cultura subsequente;

(ii) transferência da cultura de semeadura propagada para umvaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ousacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes de-rivados de animal (por exemplo, meio de inóculo) de forma a expandir a cul-tura;

(iii) transferência da cultura de semeadura expandida para umvaso de cultura de semeadura de larga escala (tal como biorreatores de1000-L) contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio basal)para propágar adicionalmente a cultura de células; e

(iv) manutenção da cultura em larga escala em meio carecendode componentes derivados de animal (por exemplo, meio de alimentação),pelo menos até que as referidas células atinjam uma densidade-alvo oumostrem uma característica bioquímica específica.

Em algumas modalidades da invenção, o método pode compre-ender a etapa de:

(v) coleta do meio de cultura e substituição do meio consumido pormeio fresco.

A presente invenção é aplicável a qualquer tipo de célula emqualquer formulação de meio carecendo de componentes derivados de ani-mal de forma a produzir quantidades em larga escala de produtos de proteí-na desejados e pode utilizar um dos dois processos a seguir ou variaçõesdos mesmos: a) processos com microveículo ou b) processos de células emsuspensão. Cultura de células, por exemplo, células de mamífero, pode utili-zar um processo operado em duas fases distintas, uma fase de crescimentoe uma fase de produção. Em outra modalidade da invenção, qualquer formu-lação de meio a qual contém componentes derivados de animal (alguns e-xemplos não-limitativos sendo Albumina de Soro Bovino (BSA) ou FBS) po-de ser empregada também para a produção de quantidades de proteína emlarga escala, conforme descrito acima.

Aqueles versados na técnica compreenderão que um processocom microveículo, não limitado a um processo com microveículo padrão ouum processo de perfusão de microveículo, pode ser usado para a cultura decélulas em que as células são presas a e/ou imobilizadas em um veículomacroporoso. Em um processo com microveículo padrão, as células sãoinoculadas em um vaso de cultura de semeadura contendo meio de culturaisento de soro e propagadas até as células atingirem uma densidade de cul-tura mínima. Subseqüentemente, a cultura de semeadura propagada étransferida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala contendomeio de cultura isento de soro e microveículos. Nessa fase de crescimento,as células são desenvolvidas sobre microveículos até que os veículos este-jam totalmente colonizados, por exemplo, através de migração das célulaspara os veículos no caso de um processo usando veículos macroporosos.

Troca de meio pode ocorrer quando microveículos assentam nofundo do vaso de cultura de semeadura, após o que um percentual prede-terminado de volume do tanque é removido e um percentual correspondentedo volume do tanque de meio fresco é adicionado ao vaso. Microveículossão, então, ressuspensos no meio de cultura. Versados na técnica entendemque o processo de remoção e substituição de meio pode ser repetido em umintervalo predeterminado, por exemplo, a cada 24 horas, pelo que a quanti-dade de meio substituído é dependente da densidade celular e pode, tipica-mente, ser de 25% a 80% do volume do tanque. 60-95% do meio no tanquepodem ser trocados a cada 24 horas, quando a densidade celular atinge umvalor predeterminado adequado para expressão de proteína. Versados natécnica freqüentemente usam o valor % de troca de meio antes mencionadopor toda a fase de produção também.

Durante a fase de produção, meio de cultura pode ser trocadopara permitir que os microveículos assentem no fundo do tanque, após oque o volume % selecionado do tanque é removido e um volume % do tan-que correspondente, por exemplo, 60-95% conforme descrito anteriormente,de meio de cultura fresco é adicionado ao vaso. Microveículos são, então,ressuspensos no meio de cultura e o processo de substituição e remoção domeio pode ser repetido diariamente.

O processo de perfusão de microveículo se assemelha ao pro-cesso com microveículo padrão e também é operado nas fases de cresci-mento/expansão e produção. A principal diferença entre os dois processos éo método empregado para trocar o meio de cultura. Uma quantidade definidade volume do tanque, por exemplo, 60-95% do volume total do tanque, étrocada toda de uma vez no processo com microveículo padrão enquantoque, no processo de perfusão, o meio é adicionado continuamente. Essenci-almente, um volume % do tanque de meio é trocado gradualmente duranteum período de tempo predeterminado, enquanto os microveículos são man-tidos no vaso através de uso de um dispositivo de separação (ou dispositivode perfusão) que permite que o meio saia do vaso, mas retém os microveí-culos dentro do tanque. A fase de crescimento nesse processo é conformedescrito para um processo com microveículo padrão, exceto quanto à trocagradual de meio.

Duas opções não Iimitativas para um processo de células emsuspensão incluem um processo de perfusão de células em suspensão e umprocesso em batelada de células em suspensão. No processo de perfusão,células em um meio de cultura são livremente suspensas sem serem imobili-zadas em veículos e, tais processos com microveículo, podem ser operadosem duas fases distintas (por exemplo, uma fase de crescimento e uma fasede produção). Durante a fase de crescimento de um processo de perfusãode células em suspensão, as células são inoculadas em um vaso de culturade semeadura contendo meio de cultura isento de soro e propagadas até ascélulas atingirem uma densidade de semeadura cruzada alvo. A cultura desemeadura propagada pode, então, ser transferida para um vaso de culturade semeadura de larga escala, o qual contém meio de cultura carecendo decomponentes derivados de animal e propagadas até um valor de densidadecelular predeterminado adequado para expressão da proteína ser obtida. Aperfusão contínua do vaso de cultura de semeadura com meio de culturafresco é realizada para executar o processo de troca de meio.

No processo de suspensão de célula em batelada, cultura decélulas pode ser realizada via os seguintes formatos não-limitativos: a) pro-cesso em batelada simples ou b) processo de alimentação em batelada. Cé-lulas são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura contendo meiode cultura carecendo de componentes derivados de animal em um processoem batelada simples e propagadas até as células atingirem uma densidadede cultura cruzada predeterminada. Subseqüentemente, a cultura de seme-adura propagada é transferida para um vaso de cultura de semeadura delarga escala contendo meio de cultura isento de soro e o vaso de cultura desemeadura é operado até que os nutrientes no meio de cultura tenham sidoesgotados. Em um processo de alimentação em batelada, alimentação deuma solução concentrada de nutrientes (por exemplo, um meio de alimenta-ção) ao tanque pode estender o suprimento de nutrientes no meio desseprocesso de cultura, assim, aumentando o tempo de processo e, por fim,levando a um aumento na produção da proteína desejada dentro do vaso decultura de semeadura. O método de adição do meio de alimentação podevariar. Ele pode ser adicionado como um único bolo pulsado (uma vez, duasvezes, três vezes etc., um dia) ou pode ser alimentado gradualmente no de-correr de um período de 24 horas. Essa alimentação permite que as célulassejam propagadas em um vaso de cultura de semeadura de larga escala e omeio, o qual pode conter o produto de proteína secretado de interesse, a sercoletado ao final da operação antes que qualquer um dos nutrientes sejamesgotados. Ao invés de remoção de todos os conteúdos do vaso, aquelesversados na técnica removerão apenas uma porção do volume do tanque(pode ser cerca de 80%).

Um aspecto opcional do processo de alimentação em batelada éo uso de desvios de temperatura. Nesse processo, as temperaturas empre-gadas como as temperaturas de operação durante a fase de produção sãomenores do que a temperatura usada durante a fase de crescimento. As re-feridas faixas de temperatura para um processo de alimentação em batela-da, por exemplo, o processo usado na presente invenção, poderia consistirde uma fase de crescimento inicial em uma temperatura adequada paracrescimento da linhagem de célula em particular em uso, seguido por umadiminuição na temperatura de operação em uma densidade celular prede-terminada.

Em uma modalidade, um processo para um processo de culturacom alimentação em batelada em larga escala compreende o seguinte: (i)inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo,um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro e propagação dacultura de semeadura pelo menos até as células atingirem uma densidadede cultura cruzada predeterminada em uma temperatura adequada paracrescimento; (ii) transferência da cultura de semeadura propagada para umvaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ousacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes de-rivados de animal de forma a expandir a cultura em uma temperatura ade-quada; (iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um vasode cultura de semeadura de larga escala contendo meio de cultura isento desoro para propágar adicionalmente para a cultura de célula em uma tempe-ratura adequada; e (iv) manutenção da cultura em larga escala em umatemperatura diminuída adequada para expressão de proteína, em meio ca-recendo de componentes derivados de animal, com reposições diárias atra-vés de meio de alimentação fresco, pelo menos até que as referidas célulasatinjam uma densidade-alvo ou extensão de tempo crítica.

A etapa de reposição de meio de alimentação fresco em (iv) po-de requerer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80%, dovolume do tanque e reposição do mesmo pelo mesmo volume de meio dealimentação fresco.

Em uma outra modalidade, um processo para um processo de cul-tura com alimentação em batelada em larga escala compreende o seguinte:(i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo,um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro e propagação dacultura de semeadura pelo menos até as células atingirem uma densidadede cultura cruzada predeterminada em uma temperatura adequada paracrescimento; (ii) transferência da cultura de semeadura propagada para umvaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ousacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes de-rivados de animal de forma a expandir a cultura em uma temperatura ade-quada; (iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um vasode cultura de semeadura de larga escala (por exemplo, um biorreator de1000-L) contendo meio de cultura isento de soro para propágar adicional-mente para a cultura de célula em uma temperatura adequada; e (iv) manu-tenção da cultura em larga escala em uma temperatura diminuída adequadapara expressão de proteína, em meio carecendo de componentes derivadosde animal, com reposições diárias através de meio de alimentação fresco,pelo menos até que as referidas células atinjam uma densidade-alvo ou ex-tensão de tempo crítica.

A etapa de reposição de meio de alimentação fresco em (iv) po-de requerer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, cerca de80% do volume do tanque e reposição do mesmo pelo mesmo volume demeio de alimentação fresco.

Em uma modalidade da presente invenção, as células cultivadasem um processo de alimentação em batelada são células de mamífero, porexemplo, células de CHO, as quais expressam um produto de proteína dese-jado. Células de mamífero são inoculadas em um vaso de cultura de semea-dura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de so-ro, por exemplo, meio CD-CHO (Exemplo 13) e propagadas em uma tempe-ratura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de 35-39°C, du-rante 3-4 dias até as células atingirem uma densidade de cultura cruzadapredeterminada (por exemplo, tendo £ 6,0x10® células viáveis ou em que aviabilidade de cultura final > 80%). A cultura de semeadura propagada é,então, transferida para um grande vaso de cultura de semeadura (por exem-plo, garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecendo de componen-tes derivados de animal para expansão em uma temperatura adequada (porexemplo, em cerca de 35-39°C) durante aproximadamente 3-4 dias. A cultu-ra de célula é ainda expandida em um vaso de cultura de semeadura maior(por exemplo, um saco de células de 20 L, um saco de células de 100 L esemelhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO, em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de35-39°C, durante 3-4 dias até as células atingirem uma densidade de seme-adura alvo (por exemplo, tendo >1-2 x106 células viáveis/ml ou em que aviabilidade de cultura final > 80%). Em uma modalidade, a expansão de inó-culo envolve um mínimo de 4 passagens. Em outra modalidade da invenção, expansão de inóculo requer não mais do que 20 passagens.

A cultura de semeadura expandida pode, então, ser usada parainocular um tanque de cultura em larga escala (por exemplo, a 1000L, umbiorreator de 4000L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro(por exemplo, meio CD-CHO) para propágar adicionalmente a cultura decélula em uma temperatura adequada, por exemplo, em cerca de 35-39°C,durante 3-6 dias, até as células atingirem uma densidade de cultura-alvo(por exemplo, tendo > 1-2 χ 106 células viáveis/ml ou em que a viabilidadefinal da cultura de células > 80%). Uma cultura em larga escala (por exem-plo, uma cultura de 10.000L, 15.000L, 20.000L em um biorreator e seme-lhantes) é subseqüentemente mantida em meio de cultura isento de soro,em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF, Exem-plo 14), em uma temperatura menor do que a temperatura de crescimento(por exemplo, em ou cerca de 33-35°C durante 3-4 dias e em ou cerca de31-33°C durante 6-8 dias), adequada para expressão de proteína e produçãodo produto de proteína secretado. O meio de alimentação é substituído dia-riamente por meio de alimentação fresco, pelo que a reposição do tanquecom meio de alimentação fresco requer remoção de um volume predetermi-nado, por exemplo, 80% do volume do tanque e reposição do tanque com omesmo volume de meio de alimentação fresco. A escala comercial de cultu-ra é mantida até que as referidas células atinjam um valor-alvo de parâme-tros de produção que podem ser, mas não estão limitados a, uma extensãode tempo, uma densidade celular alvo ou característica bioquímica de prote-ína (tal como uma proporção molar de NANA conforme previamente descri-to) em que a densidade celular viável pode ser 3,0-8,0 χ 10^6 células/ml; aproporção molar de NANA pode ser > 6,0; a viabilidade final de cultura decélulas pode ser > 30%; e a titulação final de produto de proteína pode ser 2:0,5 g/L).

Em uma modalidade particular da presente invenção, as célulascultivadas em um processo de alimentação em batelada são células de ma-mífero, por exemplo, células de CHO, as quais expressam um produto deproteína desejado (por exemplo, a molécula de CTLA4-lg). células de CHOsão inoculadas em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um fras-co T-175) contendo meio de cultura isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO e propagadas em uma temperatura adequada para crescimento, porexemplo, em cerca de 37°C, durante 3-4 dias até as células atingirem umadensidade de cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo £10,0x10^6 células viáveis ou em que a viabilidade de cultura final £ 84%). Acultura de semeadura propagada é, então, transferida para um grande vasode cultura de semeadura (por exemplo, garrafas giratórias) contendo meiode cultura carecendo de componentes derivados de animal para expansãoem uma temperatura adequada (aproximadamente 37°C) durante cerca de 4dias. A cultura de célula é ainda expandida em um vaso de cultura de seme-adura maior (por exemplo, um saco de células de 20 L, um saco de célulasde 100 L e semelhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meioCD-CHO, durante 4 dias em uma temperatura adequada para crescimento(por exemplo, em cerca de 37°C) até as células atingirem uma densidade decultura-alvo (por exemplo, tendo >1-2x10® células viáveis/ml ou em que aviabilidade de cultura final > 91%). A expansão de inóculo pode envolver ummínimo de 7 passagens.A cultura de semeadura expandida é, então, usada para inocularum tanque de cultura em larga escala (por exemplo, um biorreator de 4000Le semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meioCD-CHO) para propágar adicionalmente a cultura de célula em uma tempe-ratura adequada, por exemplo, em cerca de 37°C, durante 5-6 dias, até ascélulas atingirem uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo > 1-2 χ106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade final da cultura de células >86%). Uma cultura em escala comercial (por exemplo, uma cultura de20.000 L em um biorreator) é subseqüentemente mantida em meio de cultu-ra isento de soro, em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo,meio eRDF), em uma temperatura menor do que a temperatura de cresci-mento, a qual é adequada para expressão de proteína e produção do produ-to de proteína secretado (por exemplo, CTLA4-lg). A cultura em escala co-mercial é primeiro diminuída de cerca de 37°C para cerca de 34°C durante 4dias e, então, submetida a um segundo desvio de temperatura através dediminuição da temperatura de cerca de 34°C para cerca de 32°C durante 8dias. O meio de alimentação é substituído diariamente por meio de alimenta-ção fresco, pelo que reposição do meio de alimentação no tanque do biorre-ator requer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80% dovolume do tanque e reposição do mesmo pelo mesmo volume de meio dealimentação fresco. A escala comercial é mantida até que as referidas célu-las de CHO e/ou produto de proteína secretado atinja um valor-alvo dos se-guintes parâmetros de produção não-limitativos: uma densidade celular viá-vel de 4,0-7,0 χ 106 células/ml; uma proporção molar de NANA £8,0; umaviabilidade final de cultura de células £ 38%; e uma titulação final de produtode proteína de > 0,6 g/L.

Em outra modalidade da presente invenção, as células cultivadasem um processo de alimentação em batelada são células de mamífero, porexemplo, células de CHO, as quais expressam um produto de proteína dese-jado. Células de mamífero são inoculadas em um vaso de cultura de semea-dura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de so-ro, por exemplo, meio CD-CHO (EXEMPLO 19) e propagadas em uma tem-peratura adequada para crescimento, por exemplo, de cerca de 35°C a cercade 39°C, durante cerca de 3-4 dias; ou de cerca de 36°C a cerca de 38°C,durante cerca de até cerca de 4 dias até as células atingirem uma densidadede cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo uma densidade celu-lar de mais de ou igual a 1,5 χ 106 ou em que a viabilidade de cultura final émais de ou igual a cerca de 80%). A cultura de semeadura propagada é, en-tão, transferida para um grande vaso de cultura de semeadura (por exemplo,garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecendo de componentesderivados de animal para expansão em uma temperatura adequada (por e-xemplo, de cerca de 35°C a cerca de 39°C ou de cerca de 36°C a cerca de38°C) durante cerca de 3-4 dias ou até cerca de 4 dias. A cultura de célula éainda expandida em um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo,um saco de células de 20 L1 um saco de células de 100 L e semelhantes)contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO, em uma tempe- ratura adequada para crescimento, por exemplo, de cerca de 35°C a cercade 39°C ou de cerca de 36°C a cerca de 38°C, durante cerca de 3-4 dias ouaté cerca de 4 dias até as células atingirem uma densidade de cultura-alvo(por exemplo, tendo pelo menos cerca de 1,5 χ 106 células viáveis/ml ou emque a viabilidade de cultura final é mais de ou igual a 80%). Em uma modali- dade, a expansão de inóculo envolve um mínimo de 4 passagens. Em outramodalidade da invenção, expansão de inóculo requer não mais do que 20passagens. Em algumas modalidades, o meio CD-CHO é o meio de inóculoCD-CHO.

A cultura de semeadura estendida pode, então, ser usada para inocular um tanque de cultura em larga escala (por exemplo, um biorreatorde 1000L, 4000L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro(por exemplo, meio CD-CHO, tais como meio de inóculo CD-CHO e/ou meiobasal CD-CHO) para propágar adicionalmente a cultura de células em umatemperatura adequada, por exemplo, de cerca de 35°C a cerca de 39°C oude cerca de 36°C a cerca de 38°C durante de cerca de 3 a cerca de 6 diasou durante de cerca de 4 a cerca de 5 dias ou durante cerca de 4,7 dias oudurante menos de ou igual a cerca de 113 horas, até que as células atinjamuma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo cerca de 2,3 χ 106 célu-las viáveis/ml ou em que a viabilidade final da cultura de células seja de pelomenos cerca de 88%).

Uma cultura em escala comercial (por exemplo uma cultura de10.000L, 15.000L, 20.000L, 30.000L em um biorreator e semelhantes) ésubseqüentemente mantida em meio de cultura isento de soro, em que omeio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF, EXEMPLO 19),em uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 39°C durante de cerca de3 a cerca de 6 dias ou de cerca de 4 a cerca de 5 dias, adequado para ex-pressão de proteína e produção do produto de proteína secretado. Alternati-vamente, um composto polianiônico (por exemplo, tal como sulfato de dex-trana) pode ser adicionado à cultura mantida em meio de cultura isento desoro, em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF,EXEMPLO 19) conforme descrito abaixo e na Publicação de Pedido de Pa-tente U.S. N0 2005/0019859, a qual é incorporada aqui por referência emsua totalidade. A cultura pode ser concomitantemente submetida a uma úni-ca etapa de diminuição de temperatura (por exemplo, em ou cerca de 32°C aem ou cerca de 36°C durante de cerca de 3 a cerca de 14 dias ou durante decerca de 10 a cerca de 13 dias ou durante de cerca de 234 a cerca de 304 horas).

Em uma modalidade da invenção, a cultura pode também ser con-comitantemente submetida a uma diminuição de temperatura em múltiplasetapas (por exemplo, em ou cerca de 33°C a em ou cerca de 35°C durantecerca de 3-6 dias e em ou cerca de 31 °C a em ou cerca de 33°C durantecerca de 6-8 dias). O processo acima descrito é adequado para expressão eprodução de proteína do produto de proteína secretado.

O meio de alimentação nos casos descritos acima pode ser substi-tuído diariamente (1, 2, 3, etc. vezes ao dia) ou a cada uns poucos dias pormeio de alimentação fresco. A reposição do tanque com meio de alimenta-ção fresco requer a remoção de um volume predeterminado, por exemplo,80% do volume do tanque e reposição do tanque com o mesmo volume demeio de alimentação fresco. A cultura em escala comercial é mantida atéque as células atinjam um valor-alvo de parâmetros de produção que podemser, mas não estão limitados a, a extensão de tempo, uma densidade celularalvo ou característica bioquímica de proteína (tal como uma proporção molarde NANA conforme previamente descrito), em que a densidade celular viávelpode ser de 3,0-8,0 χ 106 células/ml; a proporção molar de NANA pode ser> 5,0 ou cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6; a viabilidade celularfinal de cultura pode ser maior do que ou igual a cerca de 30% ou maior doque ou igual a cerca de 37%; e uma titulação final de produto de proteínaque pode ser de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 g/L, mais de ou igual a 0,5g/L ou mais de ou igual a 20 g/L.

De acordo com a presente invenção, um processo de cultura decélula envolvendo a adição retardada de composto polianiônico é proporcio-nado. O processo compreende adição de composto polianiônico a uma cul-tura de célula em um momento após inoculação (por exemplo, durante a fa-se de crescimento ou durante a fase de produção de um processo de cultu-ra). A adição retardada de composto polianiônico obtém viabilidade celularaumentada. Em uma modalidade, a invenção é dirigida a um processo decultura de célula que compreende cultura de células hospedeiras as quaisexpressam uma proteína de interesse e adição de composto polianiônico àcultura de célula em um momento após inoculação.

Composto polianiônicos incluem, mas não estão limitados a, sulfa-to de dextrana (disponível da Sigma-Aldrich1 St. Louis, Mo.), heparina (dis-ponível da Sigma-AIdrich), sulfato de heparana (disponível da Sigma-Aldrich), sulfato de manana, sulfato de condroitina (disponível da Sigma-Aldrich), sulfato de dermatana (disponível da Sigma-AIdrich), sulfato de que-ratana (disponível da Sigma-AIdrich), hialuronato (disponível da Sigma-AIdrich), sulfato de (poli)vinila (disponível da Sigma-AIdrich), kappa-carragena (disponível da Sigma-AIdrich) e suramina (disponível da Sigma-AIdrich). Os compostos estão prontamente disponíveis das fontes listadas ouprontamente obteníveis através de meios conhecidos por versados na técni-ca. Esses compostos estão freqüentemente disponíveis na forma de um salincluindo, mas não limitado a, um sal de sódio, mas também podem ser usa-dos nas formas de não-sal. um composto polianiônico inclui todas as formasdo mesmo incluindo, mas não limitado a, formas de sal, tais como sais desódio.

Exemplos particularmente úteis não-limitativos de compostos poli-aniônicos da invenção incluem compostos polissulfatados: sulfato de dextra-na, heparina, sulfato de heparana, sulfato de manana, sulfato de condroitina,sulfato de dermatana, sulfato de queratana, sulfato de (poli)vinila, capa-carragena e suramina. Em uma modalidade, o composto polianiônico é sul-fato de dextrana. Sulfato de dextrana pode ter um peso molecular médio cal-culado de 5.000 a 500.000 Da. Em outra modalidade da invenção, sulfato dedextrana tendo um peso molecular de 5.000 Da é usado.

De acordo com os métodos da invenção, o composto polianiôni-co pode ser adicionado à cultura de células uma vez, duas vezes, três vezesou qualquer número de vezes durante o período de cultura de células espe-cificado (por exemplo, em um momento após inoculação, tal como durante afase de crescimento ou a fase de produção). Um ou mais compostos poliani-ônicos podem ser usados em conjunto. Por exemplo, qualquer dada únicaadição de um composto polianiônico pode incluir a adição de um ou mais deoutros compostos polianiônicos. Similarmente, se há mais de uma adição deum composto polianiônico, diferentes compostos polianiônicos podem seradicionados em diferentes adições. Compostos e substâncias adicionais,incluindo compostos polianiônicos, podem ser adicionados à cultura antes,com ou após a adição de composto polianiônico, durante ou não durante operíodo de tempo especificado. Em a particular modalidade, há uma única,por exemplo, uma vez, adição de composto polianiônico. Em outra modali-dade, um composto polianiônico é adicionado.

O composto polianiônico pode ser adicionado à cultura de célulaatravés de qualquer meio. Meios para a adição de composto polianiônicoincluem, mas não estão limitados a, dissolução em água, dissolução emmeio de cultura, dissolução em meio de alimentação, dissolução em ummeio adequado e em uma forma na qual ele é obtido. Em particular, o com-posto polianiônico é adicionado dissolvido em água. De acordo com a inven-ção, o composto polianiônico é adicionado para levar a concentração na cul-tura para um nível apropriado. Como exemplos não-limitativos, o compostopolianiônico é adicionado a uma concentração de 1-1000 mg/L, 1-200 mg/L,1-100 mg/L ou 25-75 mg/L. Concentrações particularmente úteis de compostopolianiônico adicionado à cultura de célula incluem, mas não estão limitadas a,cerca de 25-200 mg/L; cerca de 25-100 mg/L; e cerca de 50-100 mg/L. Emuma modalidade da invenção, a concentração de composto polianiônico adi-cionado à cultura é cerca de 50 mg/L. Em outra modalidade, a concentraçãode composto polianiônico adicionado à cultura é cerca de 100 mg/L.

Métodos da invenção proporcionam que a cultura pode ser ope-rada durante qualquer extensão de tempo após a adição de composto polia-niônico. O tempo de operação de cultura pode ser determinado por versadosna técnica, baseado em fatores relevantes, tais como a quantidade e quali-dade de proteína recuperável e o nível de espécies celulares contaminantes(por exemplo, proteínas e DNA) no sobrenadante resultante de Iise celular, oque complicará a recuperação da proteína de interesse. Em algumas moda-lidades do processo de cultura de célula, o composto polianiônico é adicio-nado em um momento após inoculação (por exemplo, durante a fase decrescimento do processo de cultura de célula ou durante a fase de produçãodo processo de cultura de célula). Composto polianiônico é adicionado emum momento após inoculação que é durante ou em torno do final da fase decrescimento. Em particular, o composto polianiônico é adicionado em ummomento após inoculação que é durante a fase de produção, por exemplo,no início da fase de produção.

Em uma modalidade particular da presente invenção, as célulascultivadas em um processo de alimentação em batelada são células de ma-mífero, por exemplo, células de CHO, as quais expressam um produto deproteína desejado (por exemplo, uma molécula de CTLA4A29YL104E-lg). Célu-las de CHO são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura de (porexemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro, por e-xemplo, meio CD-CHO (tal como meio de inóculo CD-CHO) e propagadasem uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de37°C, durante cerca de 3-4 dias, até que as células atinjam uma densidadede cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo > 1,5 χ 106 célulasviáveis ou em que a viabilidade final de cultura > 80%). A cultura de semea-dura propagada é, então, transferida para um vaso de cultura de semeaduragrande (por exemplo, garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecen-do de componentes derivados de animal para expansão em uma temperatu-ra adequada (em torno de 37°C) durante cerca de 4 dias. A cultura de célu-las é ainda expandida em um vaso de cultura de semeadura grande (porexemplo, um saco de células de 20 L, um saco de células de 100 L e seme-lhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO (tal co-mo meio de inóculo CD-CHO), durante cerca de 4 dias em uma temperaturaadequada para crescimento (por exemplo, em cerca de 37°C) até que ascélulas atinjam uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo > 1,5 χ106 células viáveis ou em que a viabilidade final de cultura £ 80%). A expan-são de inóculo pode envolver um mínimo de 7 passagens.

A cultura de semeadura expandida é, então, usada para inocularum tanque de cultura em larga escala (por exemplo, um biorreator de 1000-L, 4000-L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro (por e-xemplo, meio CD-CHO, tal como meio basal CD-CHO) para propágar adi-cionalmente a cultura de célula em uma temperatura adequada, por exem-plo, em cerca de 37°C, durante cerca de 5-6 dias, até que as células atinjamuma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo cerca de 2,3 χ 106 célu-las viáveis/ml ou em que a viabilidade final das culturas de célula £ 88%). Acultura em escala comercial (por exemplo, uma cultura de 10.000L,15.0000L ou 20.000 L e semelhantes em um biorreator) é subseqüentemen-te mantida em um meio de cultura isento de soro, em que o meio é um meiode alimentação (por exemplo, meio eRDF), em uma temperatura menor doque a temperatura de crescimento, a qual é adequada para expressão deproteína e produção do produto de proteína secretado (por exemplo, a C-T^a29yu04e-I9).

A cultura em escala comercial é diminuída, por exemplo, de cer-ca de 37°C para cerca de 34°C durante cerca de 4 dias. O composto polia-niônico pode ser adicionado concomitantemente à cultura quando a tempe-ratura é diminuída. Alternativamente, a cultura em escala comercial é dimi-nuída de cerca de 35°C-37°C para cerca de 32°C-36°C durante cerca de 12dias e o composto polianiônico é concomitantemente adicionado à medidaque a temperatura é diminuída.

O meio de alimentação nos casos descritos acima pode sersubstituído diariamente (1, 2, 3, etc. vezes ao dia) ou a cada alguns dias pormeio de alimentação fresco. A reposição do tanque com meio de alimenta-ção fresco requer a remoção de um volume predeterminado, por exemplo,80% do volume do tanque e reposição do tanque com o mesmo volume demeio de alimentação fresco. Em uma modalidade, o meio de alimentação éadicionado diariamente cerca de 2 a 3 dias até, por exemplo, a concentraçãode glicose cair para 1 g/L. Em outra modalidade, o meio de alimentação éadicionado a cada 8 horas, por exemplo, uma vez que a concentração deglicose tenha atingido 1 g/L. A escala comercial é mantida até que as referi-das células de CHO e/ou produto de proteína secretado atinja um valor-alvodos seguintes parâmetros de produção não-limitativos: uma proporção molarde NANA de cerca de 6,0 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6; uma viabilidadefinal de cultura de células £ 37%; e uma titulação final de produto de proteínade cerca de 0,46 a cerca de 0,71 g/L.

Em uma modalidade da presente invenção, as células que estãosendo cultivadas podem ser células de mamífero ou uma linhagem de célu-las de mamífero estabelecida incluindo, sem limitação, CHO (por exemplo,ATCC CCL 61), HEK293 (por exemplo, ATCC CRL 1573; Graham e outros,J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977), COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650),DG44 (linhagem de célula de CHO) (Cell. 33: 405, 1983 e Somatic Cell andMolecular Genetics 12: 555, 1986) e linhagens de células de rim de hamsterbebê (BHK). Outros exemplos não-limitativos úteis são mielomas, células3T3, células Namala e fusões de mielomas com outras células. Em algumasmodalidades, as células podem ser células mutantes ou recombinantes taiscomo, por exemplo, células que expressam um espectro diferente de enzi-mas que catalisam a modificação pós-traducional de proteínas (por exemplo,enzimas de processamento, tais como pró-peptídeos ou enzimas de glicosi-lação, tais como glicosil transferases e/ou glicosidases) do que um tipo decélula do qual elas foram derivadas. Em um aspecto particular da presenteinvenção, células de CHOIdhfr- são particularmente utilizadas.

Os vasos de cultura de semeadura usados para expansão dacultura de célula pode ser, mas não estão limitado a, frascos de Erlenmyer,frascos T-175, garrafas giratórias e sacos de células. Os vasos de culturaem grande escala podem ser, por exemplo, reatores aéreos onde agitação éobtida por meio de introdução de ar do fundo do vaso ou reatores com tan-que agitado convencionais (CSTR), onde agitação é obtida por meio de pro-pulsores do tipo convencional. Dentre os parâmetros controlados dentro delimites especificados estão temperatura, pH e tensão de oxigênio dissolvido(DOT). O meio de controle de temperatura nesse sistema é água e pode seraquecido ou resfriado, conforme necessário. A água pode ser passada atra-vés de uma tubulação em espiral imersa em um meio de cultura de célulasou através de uma camisa circundando o vaso. O pH, por exemplo, pode serregulado através da adição de base a um meio de cultura de células quandorequerido ou variando a concentração de CO2 do gás no headspace. DOTpode ser mantido através de purgação com oxigênio puro ou ar ou misturasdos mesmos.

A invenção, portanto, proporciona um método para produção deuma proteína recombinante, o método compreendendo pelo menos duasetapas: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteínarecombinante (isto é, uma proteína que as células de mamífero normalmentenão expressam ou superexpressam, onde a proteína recombinante é ex-pressa nas células via um vetor ou estrutura de expressão que tenha sidotransfectada nas células ou os precursores das células) de uma cultura ori-ginária para uma cultura líquida de pelo menos 10.OOOL e (b) isolamento daproteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L. Emuma modalidade, esse método pode ser usado de modo que a proteína re-combinante seja produzida em uma concentração de pelo menos 0,5 gramapor litro de cultura líquida antes de purificação da proteína da cultura líquida.Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção pode ser usadopara produzir uma proteína recombinante em uma concentração de pelomenos de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 grama por litro de cultura líquidaantes de purificação da proteína da cultura líquida.

Em uma modalidade, a etapa de expansão pode envolver (i) cul-tura das células em um meio isento de soro com pelo menos quatro passa-gens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 χ105 células viáveis por ml_ e (ii) manutenção das células em cultura duranteum tempo suficiente para produzir pelo menos cerca de 0,5 da proteína re-combinante. Em uma modalidade, o número de passagens não excede a 36passagens. Em outra modalidade, o número de passagens pode exceder a36 passagens, onde as células são estáveis durante gerações com relaçãoao número de cópia do ácido nucleico que codifica uma proteína recombi-nante, viabilidade celular e tempo de duplicação.

O tempo suficiente para produzir pelo menos cerca de 0,5 a cer-ca de 1,3 g/L da proteína recombinante pode ser qualquer quantidade detempo, na medida em que a viabilidade celular não cai abaixo de 5%, 10%,25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% e/ou na medida em que onúmero de gerações de célula não excede a 50, 75, 100, 105 ou 125 gera-ções. A etapa de manutenção pode também compreender etapas de desviode temperatura, tais como diminuição da temperatura da cultura primeiro de37 ± 2°C para 34 ± 2°C e, em um momento posterior, de 34 ± 2°C para 32 ±2°C. A temperatura de 32 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 ou 100 dias. A tempera-tura de 32 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 20, 50, 75 ou 100gerações de células. A temperatura de 32 ± 2°C pode ser mantida até que adensidade celular da cultura seja de cerca de 30 a cerca de 100 χ 105 célu-las por mL de cultura líquida.

Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos paraprodução de uma proteína recombinante, o método compreendendo pelomenos as etapas de: (a) expansão de células de mamífero que secretamuma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líqui-da de pelo menos 10.000L, de modo que a concentração de proteína re-combinante é pelo menos 0,5 grama/L de cultura líquida; e (b) isolamento daproteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L quan-do a cultura líquida: (i) contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mois de NA-NA por mol de proteína (glicoproteína nesse caso); (ii) tem uma densidadecelular de cerca de 33 a cerca de 79 χ 105 células por mL; (iii) a viabilidadecelular na cultura líquida não é menos de cerca de 38% ou é mais de ou i-gual a cerca de 38%; (iv) a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 76,8EU por mL de cultura líquida; e/ou (v) a bioburden é menos de 1 unidadeformação de colônia por mL de cultura líquida.

Em uma outra modalidade, a etapa de expansão pode envolver(i) cultura das células em um meio isento de soro com pelo menos quatropassagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de1,0 χ 106 células viáveis por mL e (ii) manutenção das células em culturadurante um tempo suficiente para produzir pelo menos de cerca de 0,46 acerca de 0,71 grama da proteína recombinante por litro de cultura líquida.

Em uma modalidade, o número de passagens não excede a 36 passagens.

Em outra modalidade, o número de passagens pode exceder 36 passagens,onde as células são estáveis durante gerações com relação ao número decópias obtido do ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, viabili-dade celular e tempo de duplicação.

O tempo suficiente para produzir de cerca de 0,46 a cerca de 0,71g/L da proteína recombinante pode ser qualquer quantidade de tempo, namedida em que a viabilidade celular não caia abaixo de 5%, 10%, 25%,30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% e/ou na medida em que o nú-mero de gerações de células não exceda a 27, 50, 75, 100, 105 ou 125 ge-rações. A etapa de manutenção pode também compreender etapas de des-vio de temperatura, tal como diminuição da temperatura da cultura primeirode 37 ± 2°C para 34 ± 2°C. A temperatura de 34 ± 2°C pode ser mantida du-rante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50ou 100 dias. Alternativamente, a etapa de manutenção pode ser uma etapade desvio de temperatura, tal como diminuição da temperatura da cultura de37 ± 2°C para 34 ± 2°C.

Composto polianiônico pode ser adicionado às culturas à medidaque a diminuição de temperatura começa. A concentração de compostospolianiônico adicionado à cultura pode ser cerca de 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L,12,5 mg/L, 15 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 250mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L ou 1000 mg/L. A temperatura de 32 ± 2°C podeser mantida durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 20, 30, 50 ou 100 dias. A temperatura de 34 ± 2°C pode ser mantida du-rante pelo menos 20, 27, 50, 75 ou 100 gerações de célula.

Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos para aprodução de uma proteína recombinante, o método compreendendo pelomenos as etapas de: (a) expansão de células de mamífero que secretamuma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líqui-da de pelo menos 10.000L, de modo que a concentração de proteína re-combinante é pelo menos de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 grama por litrode cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura depelo menos 10.000 L de cultura líquida quando a cultura líquida: (i) contémcerca de 6 mois de NANA por mol de proteína (glicoproteína nesse caso); (ii)a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 37%; (iii) aendotoxina é menos de ou igual a cerca de 4,8 EU por mL de cultura líquida;e/ou (iv) a bioburden é menos de 1 unidade em formação de colônia por mLde cultura líquida.

A proteína recombinante produzida através desses métodos dainvenção pode ser uma proteína secretada, uma glicoproteína, uma citocina,um hormônio, uma proteína de CTLA4-lg ou uma proteína de C-TLA4A29YL104E-lg. Em uma modalidade, as células de mamífero são uma pro-le ou subclones de células proporcionadas pela invenção. Em outra modali-dade, as células de mamífero são a prole ou subclones de células derivadasda linhagem de células da invenção. Em uma outra modalidade, as célulasde mamífero são uma população clonal de células transfectadas com umcassete de expressão compreendendo SEQ ID NO: 1. Em uma modalidadeparticular, as células de mamífero são uma população clonal de célulastransfectadas com um cassete de expressão compreendendo SEQ ID NO: 3.Técnicas gerais para a purificação de Proteína recombinante de Cultura

Após uma fase de produção de proteína em um processo de cul-tura de célula, a proteína de interesse, por exemplo uma glicoproteína, é re-cuperada do meio de cultura de célula usando técnicas compreendidas porversados na técnica. Em particular, a proteína de interesse é recuperada domeio de cultura como um polipeptídeo secretado, embora ela também possaser recuperada dos Iisatos de célula hospedeira. O meio de cultura ou Iisatoé inicialmente centrifugado para remover resíduos e partículas de células. Aproteína desejada é subseqüentemente purificada do DNA contaminante,proteínas e polipeptídeos solúveis, com os seguintes procedimentos de puri-ficação bem estabelecidos na técnica: SDS-PAGE; precipitação com sulfatode amônio; precipitação com etanol; fracionamento sobre colunas de imuno-afinidade ou troca de íons; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílicaou uma resina de troca de ânions, tal como QAE ou DEAE; cromatofocaliza-ção; filtração em gel usando, por exemplo, uma coluna Sephadex G-75®; ecolunas de proteína A Sefarose® para remover contaminantes, tal comoIgG. A adição de um inibidor de protease, tal como fluoreto de fenil metil sul-fonila (PMSF) ou uma mistura de coquetel de inibidor de protease também pode ser útil para inibir a degradação proteolítica durante purificação. Versa-dos na técnica reconhecerão que métodos de purificação adequados parauma proteína de interesse, por exemplo, uma glicoproteína, podem requereralterações para levar em conta mudanças no caráter da proteína quando deexpressão em uma cultura de células recombinante.

Técnicas de purificação e métodos que selecionam os gruposcarboidrato da glicoproteína são também de utilidade dentro do contexto dapresente invenção. Por exemplo, tais técnicas incluem HPLC ou cromatogra-fia de troca de íons usando resinas de troca de cátions ou de troca de â-nions, em que a fração mais básica ou mais ácida é coletada, dependendode qual carboidrato está sendo selecionado. O uso de tais técnicas tambémpode resultar na remoção concomitante de contaminantes.

Na presente invenção, células de CHO capazes de produzir pro-teínas de fusão de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg são desenvolvidas comouma suspensão em um meio CHO-específico até uma densidade celularpredeterminada. Células de CHO desenvolvidas em suspensão no meio deexpressão sem soro subseqüentemente produzem moléculas de CTLA4-lgou CTLMa29yu04^lg, as quais são secretadas pelas células de CHO nomeio de cultura. A suspensão de células pode ser clivada via centrifugação emoléculas de CTLA4-lg podem, então, ser separadas do sobrenadante decultura clarificado de técnicas-padrão de purificação. Exemplos não-Iimitativos de procedimentos de purificação adequados para obtenção demaior pureza e homogeneidade de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg, individu-almente ou em combinação, são: cromatografia por afinidade sobre sefaro-se; fracionamento sobre colunas de troca de ânions (AEC); e cromatografiade interação hidrofóbica (HIC).

Em algumas modalidades, isolamento de moléculas de CTLA4-Ig ou outras proteínas (incluindo glicoproteínas) dos métodos de produçãodescritos aqui podem pelo menos incluir as etapas seguintes: (i) obtenção deuma cultura de célula sobrenadante; (ii) sujeição do sobrenadante à croma-tografia de troca de ânions para obter um produto de proteína eluído; (iii)sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatografia de inte-ração hidrofóbica, de modo a obter um produto de proteína enriquecido; (iv)sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia por afinidadepara obter um produto de proteína enriquecido eluído; e (v) sujeição do pro-duto de proteína enriquecido eluído de (iv) à cromatografia de troca de â-nions. O produto de proteína enriquecido obtido na etapa (iii) pode ser carac-terizado, por exemplo, em que seu percentual de qualquer proteína de HMWou contaminante é menos de 5, 10, 15 ou 25%. A cromatografia de troca deânions da etapa (ii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de umtampão de lavagem compreendendo HEPES cerca de 25-100 mM e a NaCIcerca de 300-900 mM e tendo um pH de cerca de 7,0-8,0. A cromatografiade interação hidrofóbica da etapa (iii) pode ser realizada, por exemplo, atra-vés de uso de um único tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 7,0 ecompreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 850 mM; ouum tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 8,0 e compreendendo Trisa cerca de 25 mM e NaCI e cerca de 250 mM. A cromatografia por afinidadeda etapa (iv) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampãode eluição tendo um pH de cerca de 3,5 e compreendendo Glicina a cercade 100 mM. A cromatografia por afinidade da etapa (v) pode ser realizada,por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem tendo um pH decerca de 8,0 e compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI da cercade 120 mM a NaCI a cerca de 130 mM ou um tampão de lavagem tendo umpH de cerca de 8,0 e compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI acerca de 200 mM. A cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) pode serrealizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo umgrupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. A coluna de inte-ração hidrofóbica da etapa (iii) pode ser realizada usando uma resina de in-teração hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi,butila ou isoamila.

Em outras modalidades, isolamento de moléculas de C-TUMa29yl1'°4E-lg ou outras proteínas (incluindo glicoproteínas) dos métodosde produção descritos aqui pode pelo menos incluir as etapas seguintes: (i)obtenção de uma cultura de célula sobrenadante; (ii) sujeição do sobrena-dante à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína eluí-do; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatografiade troca de ânions de modo a obter um produto de proteína enriquecido; e(iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia de interaçãohidrofóbica para obter um produto de proteína enriquecido eluído com com-plexos de espécies de elevado peso molecular (HMW)/proteína reduzidos. Oproduto de proteína enriquecido obtido na etapa (iv) pode ser caracterizado,por exemplo, em que seu percentual de qualquer proteína de HMW ou con-taminante é menos de 5, 10, 15 ou 25%. A cromatografia por afinidade daetapa (ii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão deeluição tendo um pH de cerca de 3,0 e compreendendo Glicina a cerca de250 mM. A cromatografia por afinidade da etapa (ii) pode ser realizada, porexemplo, através de uso de um tampão de lavagem tendo um pH de cercade 7,5 e compreendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 150mM. A cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) pode ser realizada, porexemplo, através de uso de um tampão de lavagem compreendendo HEPESa cerca de 50 mM e NaCI a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de7,0. A cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) pode ser realizada, porexemplo, através de uso de um tampão de eluição compreendendo HEPESa cerca de 50 mM e NaCI a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de7,0, A cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iv) pode ser realiza-da, por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem tendo um pH decerca de 7,0 e compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e (NH4)2SO4 acerca de 1,2 M A cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) pode serrealizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo umgrupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. A coluna de inte-ração hidrofóbica da etapa (iv) pode ser realizada usando uma resina de in-teração hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi,butila ou isoamila.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um método parapurificação de moléculas de CTLA4-lg de uma cultura de célula líquida, demodo que uma CTLA4-lg purificada é substancialmente isenta de Proteína-1quimiotática de monócitos (MCP-1). Em uma modalidade, a invenção pro-porciona uma composição farmaceuticamente aceitável de moléculas deCTLA4-lg, em que a composição compreende não mais do que 0,5 ppm deMCP-1, 1 ppm de MCP-1, 2 ppm de MCP-1, 3 ppm de MCP-1, 4 ppm deMCP-1, 5 ppm de MCP-1, 6 ppm de MCP-1, 7 ppm de MCP-1, 8 ppm deMCP-1, 9 ppm de MCP-1 ou 10 ppm de MCP-1 Em outra modalidade, nacomposição, a quantidade MCP-1 não pode exceder a 1%, 0,5% ou 0,1% dopeso de CTLA4-lg purificada. Em outra modalidade, a composição de molé-culas de CTLA4-lg é substancialmente isenta de MCP-1 onde há menos de50, 45, 40, 38, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 ng/mL deMCP-1 no eluato líquido de QFF. Em outra modalidade, a invenção propor-ciona um método para purificação de moléculas de CTLA4-lg de uma culturade célula líquida, de modo que uma CTLA4-lg purificada é substancialmenteisenta de MCP-1 e compreende menos do que 2,5% de tetrâmero de C-TLA4-lg.

A quantidade de proteína 1 quimiotática de monócito (MCP-1) nacomposição pode ser quantificada usando um método ELISA. O anticorpo derevestimento é um anticorpo de IgG anti-MCP-1 de camundongo de bezerro.

0 anticorpo secundário é um anticorpo de IgG anti-MCP-1 de rato de coelho.Detecção é realizada usando anticorpo anti-coelho de cabra conjugado àmorseradish peroxidase e o substrato TMB. O reagente peroxidase de rába-no-silvestre produz uma reação colorimétrica que se desenvolve em propor-ção à quantidade de proteína capturada. O ELISA quantifica o nível de MCP-1 com relação à Curva-padrão de Material. Em uma modalidade, MCP-1 foiquantificada na composição e os níveis de MCP-1 estavam em faixas de 0-0,097 ng/mg e 0,014-0,154 ng/mg.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para apurificação de moléculas de CTLA4A29YL104E-lg de uma cultura de célula lí-quida, de modo que a CTLA4A29YL104E-lg purificada é substancialmente isentade Proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1). Em uma modalidade, aquantidade MCP-1 não pode exceder a 1%, 0,5% ou 0,1% do peso da C-TLA4A29YLi04E_,g purjfjcada Em outra modalidade, CTI_A4A29YL104E-lg é subs-tancialmente isenta de MCP-1, onde há menos de 50, 45, 40, 38, 35 ou 30ng/mL de MCP-1 no eluato líquido de HIC. Em uma outra modalidade, a in-venção proporciona um método para purificação de moléculas de C-TLA4A29YL104E-lg de uma cultura de célula líquida, de modo que a C-TLA4A29YL104E-lg purificada seja substancialmente isenta de MCP-1 e com-preende menos do que 2,5% de CTI_A4A29YL104E-lg.

Recuperação de Glicoproteína de uma cultura de célula ePurificação

A presente invenção descreve uma série da etapas para a sepa-ração de uma glicoproteína (por exemplo, CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg)de um sobrenadante de cultura de células impuro, empoçamento da proteínacontém a glicoproteína de interesse (tal como CTLA4-lg ou CTLjMa29yu04e-Ig) e contaminantes indesejados. O sobrenadante de cultura de células im-puro pode ser usado como o material de iniciação para a purificação da gli-coproteína de CTLA4-lg ou CTUMa29yl1 04E-lg.

Em uma modalidade da presente invenção, o sobrenadante decultura de célula que contém glicoproteína de CTLA4-lg e contaminantesindesejáveis é aplicado a um meio de troca de ânions. A glicoproteína deCTLA4-lg presente no sobrenadante de cultura de célula se liga ao meio detroca de ânions. O meio de troca de ânions é, então, lavado para removerqualquer material não ligado do meio de troca de ânions. A glicoproteína deCTLA4-lg é eluída após o material não ligado ser removido e o eluato é coletado.

Em uma modalidade da presente invenção, o sobrenadante decultura de célula impuro que contém glicoproteína de CTLA4A29YL104E-lg econtaminantes indesejáveis é aplicado a um meio de cromatografia por afini-dade. A glicoproteína de CTI_A4A29YL104E-lg presente no sobrenadante decultura de célula impuro se liga a um meio de cromatografia por afinidade. Omeio de cromatografia por afinidade é, então, lavado para remover qualquermaterial não ligado do meio de troca de ânions. A glicoproteína de C-TLA4A29YL104E_,g

é eluída após o material não ligado ser removido e o eluatoé coletado.

Em uma modalidade particular da presente invenção, uma cro-matografia de troca de íons em Q-Sefarose (AEC), por exemplo, usandouma coluna Q-Sefarose XL (GE Healthcare), é empregada para separar gli-coproteína de CTLA4-lg do material coletado, bem como para diminuir con-taminantes. Essa coluna pode ser usada como uma etapa inicial na purifica-ção de glicoproteína de CTLA4-lg de uma cultura de células de mamífero,para fracionamento do meio de cultura de células coletado. Em outra moda-lidade, uma cromatografia de troca de íons Q-Sefarose, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), pode ser usada após uma etapa depurificação através de cromatografia por afinidade. A propriedade de fluxomuito alta das colunas de troca de ânions permite que o grande volume deglicoproteína de CTLA4-lg ou meio de cultura de células coletado seja pron-tamente concentrado antes de subsequentes etapas de cromatografia, taiscomo SP-Sefarose ou HIC1 através de ajuste das condições de modo que aglicoproteína de CTLA4-lg se liga à coluna. Para um tampão de lavagemcom pH de cerca de 5 a 9, em particular cerca de 8, concentrações de HE-PES a 75 mM e NaCI a 360 mM são úteis. Tipicamente, para um tampão de eluição com pH de cerca de 5 a 8, em particular cerca de 7, concentraçõesde HEPES a 25 mM e NaCI a 325 mM são úteis.

Resinas adequadas para separação de glicoproteína de CTLA4-lg do meio de cultura coletado foram aquelas tendo grupos funcionais aminaimobilizados. Mais úteis são as resinas com um grupo funcional de amina quaternária, por exemplo, aquelas sobre as resinas Q-Sepharose Fast Flowda GE Healthcare, onde um Iigante de amônio quaternário é ligado a umaágarose de alta porosidade reticulada. Também úteis são as resinas com umgrupo funcional amina primária, secundária e terciária, por exemplo, aquelasnas resinas DEAE Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um Iigante de dietilaminoetila terciária é ligado a uma ágarose de alta porosidade reticu-lada.

Em outra modalidade da presente invenção, o eluato contendoglicoproteína de CTLA4-lg do meio de troca de ânions é coletado e, então,contatado com uma resina de interação hidrofóbica. Conforme descrito abai- xo, o volume contendo glicoproteína de CTLA4-lg passa através da colunade HIC e o reservatório coletado, o qual pode ser ainda purificado é, então,ligado a uma resina de troca de ânions.

HIC é útil para a separação de dímeros de glicoproteína de C-TLA4-lg desejados de material de espécies de elevado peso molecular e outras impurezas de proteína da cultura de células de mamífero. Por exem-plo, cultura de células de CHO expressando CTLA4-lg contém agregados deespécies de elevado peso molecular de glicoproteína de CTLA4-lg. Tambémencontradas no meio de cultura de células de mamífero são impurezas deproteína de células de CHO. Esses produtos indesejáveis poderiam geraruma resposta antigênica indesejada em um paciente e contribuir para a po-bre qualidade de produto ou atividade. HIC separa eficazmente varianteshidrofóbicas, dímeros de glicoproteína de CTLA4-lg de complexos de HWMde glicoproteína de CTLA4-lg e impurezas de proteína de CHO via ligaçãodos últimos produtos à resina de HIC e passagem dos dímeros de glicopro-teína de CTLA4-lg através da coluna. Assim, uma glicoproteína de CTLA4-lgempoçada poderia ser obtida que é substancialmente isenta dessas espé-cies e que é particularmente adequada para outra etapa cromatográfica, talcomo uma cromatografia de troca de íons. Uma fonte de misturas de glico-proteína de CTLA4-lg para uso com HIC é cultura de células de mamífero,por exemplo, uma cultura de células de CHO. Em particular, a cultura podeser submetida a pelo menos uma etapa de purificação anterior, conformediscutido previamente.

Em outra modalidade da presente invenção, o método de HICpode ser modificado para coletar e empoçar de outras glicoproteínas (porexemplo, complexos de HMW de CTLA4-lg). Agregados de HMW podem seligar à resina de HIC (por exemplo, compreendendo tetrâmero de CTLA4-lge semelhantes). Esses complexos de HMW têm uma maior avidez e se li-gam mais eficazmente in vivo do que o dímero de CTLA4-lg apenas. Assim,versados na técnica podem obter e empoçar agregados de HMW de CTLA4-Ig através de eluição da CTLA4-lg empoçada da HIC.

As resinas de HIC mais úteis para separação de formas de gli-coproteína de CTLA4-lg são aquelas tendo grupos funcionais fenila imobili-zados. Das resinas de fenill-HIC, fenill Sepharose Fast Flow High Sub (altasubstituição) pela GE Healthcare é mais útil. Meio Fenil Toyopearl pela To-soHaas e TSK Phenyl 5PW são exemplos não-limitativos de outras resinasde fenill-HIC que podem ser usadas. Outros grupos funcionais em HIC inclu-em, mas não são limitados a, as porções propila, octila, alcoxila, butila e iso-amila.

Por exemplo, um processo de cromatografia em coluna dePhenyl Sepharose Fast Flow, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC),pode ser usado para reduzir a quantidade de espécies de elevado peso mo-lecular de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg eluídas em uma etapa de purifica-ção por HIC (veja Exemplo 15 e Exemplo 20). Portanto, o pico de eliminaçãoda coluna de HIC é enriquecido em espécies de HMW de CTLA4-lg ou C-TLA4A29YL104E-|g

A fração não ligada contendo glicoproteína de CTLA4-lg da eta-pa de purificação de HIC pode ser submetida a um método de purificaçãoadicional, tal como cromatografia por afinidade e o eluato resultante pode,então, ser aplicado a um meio de troca de ânions. A glicoproteína de CTLA4-Ig se liga à resina de troca de ânions, a qual pode ser subseqüentementelavada para remover proteínas não ligadas. Após as proteínas não ligadasserem removidas, glicoproteína de CTLA4-lg é eluída em uma resina de tro-ca de ânions. O eluato é coletado e pode ser ainda concentrado.

Em outra modalidade da presente invenção, cromatografia porafinidade, por exemplo rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), éempregada para enriquecer adicionalmente glicoproteína de CTLA4-lg, aqual pode ser ainda seguido por uma etapa de cromatografia de troca deíons, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). A etapa decromatografia por afinidade pode também reduzir os níveis de impurezas deproteína de CHO e Proteína Quimiotática de Monócito (MCP-1, uma quimio-cina). Cromatografia por afinidade envolve separação por adsorção, onde amolécula de interesse a ser purificada, por exemplo, glicoproteína C-TI_A4A29YL104E-lg, se liga específica e reversivelmente a um Iigante imobiliza-do sobre alguma matriz ou resina. Alguns exemplos não-limitativos de colu-nas de purificação por afinidade incluem lectina; expressão de afinidade (porexemplo, uma coluna GST ou coluna 6X-His); Estreptavidina; heparina; ouanticorpo (por exemplo, uma coluna de proteína A ou uma coluna de proteí-na G). Em particular, a presente invenção utiliza uma resina de proteína Apara ligação da glicoproteína CTLA4A29YL104E-lg. Para um tampão de lava-gem com pH de cerca de 5 a 9, mais preferivelmente de cerca de 7,5, con-centrações de Tris a 25 mM, NaH2PC^ a 25 mM e NaCI a 250 mM são úteis.

Para um tampão de eluição com pH de cerca de 2 a 5, mais preferivelmentede cerca de 3,5, uma concentração de glicina de 100-300 mM é útil. O eluatoda cromatografia por afinidade pode, então, ser neutralizado e carregadosobre uma coluna de cromatografia de troca de ânions, Q-Sepharose FastFlow sendo mais útil.Para reduzir adicionalmente os níveis de proteína A, DNA e es-pécies de glicoproteína de CTLA4-lg indesejados no produto após as etapasde recuperação/purificação inicial precedentes, outra etapa de troca de íonspode ser incorporada no procedimento de purificação. A presente invençãopode empregar colunas de troca de íons comercialmente disponíveis, taiscomo uma coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare ou uma colunaDEAE Sepharose Fast Flow, também da GE Healthcare. Conforme determi-nado aqui, as resinas mais adequadas para separação de glicoproteína deCTLA4-lg do meio de cultura coletada foram aquelas tendo grupos όποιο-nais amina imobilizados. Outros grupos úteis são as resinas com grupo fun-cional de amina quaternária, por exemplo, aquelas em uma coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um Iigante de amônio quater-nário é ligado a uma ágarose de alta porosidade reticulada. Também úteissão as resinas com grupo funcional de amina primária, secundária e terciá-ria, por exemplo, aquelas em uma coluna DEAE Sepharose Fast Flow da GEHealthcare, onde um Iigante de dietilaminoetila terciária é ligado a uma ága-rose de alta pureza reticulada. Em uma modalidade particular da invenção,uma coluna que utiliza um permutador de íons forte, tal como uma coluna Q-Sepharose Fast Flow, é utilizado.

Em uma modalidade da invenção, um eluato de glicoproteína deCTLA4-lg é carregado sobre uma coluna de troca de ânions, por exemplo,Q-Sepharose Fast Flow. A coluna é lavada e glicoproteína de CTLA4-lg ésubseqüentemente eluída da coluna de troca de ânions. Para um tampão delavagem com pH de cerca de 5 a 9, em uma modalidade um pH de 8, con-centrações de HEPES a 25 mM e NaCI a 100-140 mM são úteis. Para umtampão de eluição com pH de cerca de 5 a 9 ou, em outra modalidade, umpH de 8, concentrações de HEPES a 25 mM e NaCI a 200 mM são úteis. Aglicoproteína de CTLA4-lg eluída do meio de troca de íons é recuperada,concentrada e lavada, através de diafiltração ou outro método adequado co-nhecido por versados na técnica, para proporcionar um produto final de gli-coproteína de CTLA4-lg purificado. O produto de glicoproteína de CTLA4-lgpreparado de acordo com o processo da presente invenção é de alta pureza,por exemplo, contendo ^ 95% do dímero de CTLA4-lg, contendo < 5% doproduto de HMW de CTLA4-lg e contendo £ 1% de monômero de CTLA4-lg.

O método de purificação pode ainda compreender etapas adi-cionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estar potencialmente presentes em um meio de cultura de células de linhagens decélulas de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viralestão disponíveis incluindo, mas não limitado a, tratamento com caotropos,tais como uréia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais de diafiltra-ção/ultrafiItração, separação convencional, tais como cromatografia de trocade íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases, sol-ventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos

Em outra modalidade da presente invenção, cromatografia porafinidade, por exemplo resina MabSeIect Protein A Sepharose (GE Healthca-re), é empregada para capturar glicoproteína CTLA4A29YL104E-lg, a qual podeser ainda seguido por uma etapa de cromatografia de troca de íons, por e-xemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). A etapa de cromatografiapor afinidade pode também reduzir os níveis de impurezas de proteínasCHO e Proteína Quimiotática de Monócito (MCP-1, uma quimiocina). Croma-tografia por afinidade envolve separação por adsorção, onde a molécula deinteresse a ser purificada, por exemplo, glicoproteína CTI_A4A29YL104E-lg, seliga específica e reversivelmente a um Iigante imobilizado sobre alguma ma-triz ou resina. Alguns exemplos não-limitativos de colunas de purificação porafinidade incluem lectina; tag de afinidade (por exemplo, uma coluna GST oucoluna 6X-His); Estreptavidina; heparina; ou anticorpo (por exemplo, uma coluna de proteína A ou uma coluna de proteína G). Em particular, a presen-te invenção utiliza uma resina de proteína A para ligação da glicoproteínaCTI_A4A29YL104E-lg. Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9,mais preferivelmente de cerca de 7,5, concentrações de Tris a 25 mM,NaH2P04 a 25 mM e NaCI a 250 mM são úteis. Para um tampão de eluiçãocom pH de cerca de 2 a 5, mais preferivelmente de cerca de 3,5, uma con-centração de glicina de 100-300 mM é útil. O eluato da cromatografia porafinidade pode, então, ser neutralizado e carregado sobre uma coluna decromatografia de troca de ânions, Q-Sepharose Fast Flow sendo mais útil.

Para reduzir adicionalmente os níveis de proteína A, DNA e es-pécies de glicoproteína de CTLMa29yl1 04E-lg não desejadas no produto apósas etapas precedentes de recuperação/purificação inicial, uma etapa de tro-ca de íons pode ser incorporada no procedimento de purificação. A presenteinvenção pode empregar colunas de troca de íons comercialmente disponí-veis, tais como a coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, colunaQ-Sefarose XL (GE Healthcare) ou a coluna DEAE Sepharose Fast Flow,também da GE Healthcare. As resinas mais adequadas para separação deglicoproteína de CTLMa29yl1'°4E-lg são aquelas tendo grupos amina funcio-nais imobilizados. Outros grupos úteis são as resinas com grupo funcionalamina quaternária, por exemplo, aquelas na coluna Q-Sepharose Fast Flowda GE Healthcare, onde um Iigante de amônio quaternário é ligado a umaágarose de alta porosidade reticulada. Também úteis são as resinas comgrupo funcional amina primária, secundária e terciária, por exemplo, aquelasna coluna DEAE Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde uma dietila-minoetila terciária está ligada a uma ágarose de alta porosidade reticular.

Em uma modalidade particular da invenção, uma coluna que utiliza um per-mutador de íons forte, tal como uma coluna Q-Sepharose Fast Flow, é utilizada.

Em uma modalidade da invenção, uma glicoproteína de C-TLA4A29YL104E-lg eluída e carregada sobre uma coluna de troca de ânions,por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow. A coluna é lavada e glicoproteína deCTLMa29yl1°4E-lg é subseqüentemente eluída da coluna de troca de ânions.

Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9, em uma modalida-de, pH de 7, concentrações de HEPES a 25-55 mM e NaCI a 100-140 mMsão úteis. Para um tampão de eluição com pH de cerca de 5 a 9 ou, em ou-tra modalidade, pH de 7, concentrações de HEPES a 25-50 mM e NaCI a200 mM são úteis.

Em outra modalidade da presente invenção, o eluato contendoglicoproteína de CTLMa29yu04E-lg do meio de troca de ânions é coletado e,então, contatado com uma resina de interação hidrofóbica. HIC é útil para aseparação de dímeros de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-lg desejados dematerial de espécie de elevado peso molecular e outras impurezas de prote-ína da cultura de células de mamífero. Por exemplo, cultura de células deCHO expressando CTUMa29yu04E-lg contêm agregados moleculares de es-pécies de elevado peso molecular de glicoproteína de CTUMa29yl104e-Iq.

Também encontradas no meio de cultura de células de mamífero são impu-rezas de proteína de CHO. Esses produtos indesejáveis poderiam gerar umaresposta antigênica indesejada em um paciente e contribuir para pobre qua-lidade de produto ou atividade.

HIC separa eficazmente variantes hidrofóbicas, dímeros de gli-coproteína de CTUMa29yl1'°4E-lg de complexos de HMW de glicoproteína deCTUMa29yl1 04E-lg e impurezas de proteína de CHO via ligação dos últimosprodutos à resina de HIC e passagem dos dímeros de glicoproteína de C-TUMa29yl104e-Iq através da coluna. Assim, uma glicoproteína de C-TUMa29yl104e-Iq empoçada é obtida que é substancialmente isenta dessasespécies. Uma fonte de misturas de glicoproteína de CTUMa29yl1 04E-lg parauso com HIC é cultura de células de mamífero, por exemplo, uma cultura decélulas de CHO. Em particular, a cultura pode ser submetida a pelo menosuma etapa de purificação, conforme discutido previamente.

Em outra modalidade da presente invenção, o método de HICpode ser modificado para coletar e empoçar outras glicoproteínas (por e-xemplo, complexos de HMW de CTUMa29yl104e-Iq). Agregados de HMW po-dem se ligar à resina de HIC (por exemplo, compreendendo tetrâmero deCTUMa29yu04E-lg e semelhantes). Esses complexos de HMW têm uma mai-or avidez e se ligam mais eficazmente in vivo do que o dímero de C-TUMa29yl1'°4E-lg apenas. Assim, versados na técnica podem obter e empo-çar agregados de HMW de CTUMa29yl1'D4E-lg através de eluição da C-TLA4A29YL104E_|g empoçac|a da H|C.

Glicoproteína de CTUMa29yl104e-Iq eluída do meio de HIC é re-cuperada, concentrada e lavada através de diafiltração ou outro método a-dequado conhecido por versados na técnica, para proporcionar um produtofinal de glicoproteína de CTLMa29yl1'°4E-lg purificada. O produto de glicopro-teína de CTLA4A29YL104E-lg preparado de acordo com o processo da presenteinvenção é de alta pureza, por exemplo, contendo £ 95% do dímero de C-TLA4A29YLi04E_|g contendo < 5% do produto de HMW de CTUMa29yl1 04E-lg econtendo < 1% de monômero de CTLA^9yli04e-Iq.

As resinas de HIC mais úteis para separação de formas de gli-coproteína de CTUMa29yl1 04E-lg são aquelas tendo grupos fenila funcionaisimobilizados. Das resinas de phenyl-HIC, Phenyl Sepharose Fast Flow HighSub (alta substituição) pela GE Healthcare é mais útil. Meio Phenyl Toyope-arl pela TosoHaas e TSK Phenyl 5PW são exemplos não-limitativos de ou-tras resinas de phenyl-HIC que podem ser usadas. Outros grupos funcionaisem HIC incluem, mas não estão limitados a, as porções propila, octila, alco-xila, butila e isoamila.

O método de purificação pode ainda compreender etapas adi-cionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estarpotencialmente presentes em um meio de cultura de células de linhagens decélulas de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viralestão disponíveis incluindo, mas não limitado a, tratamento com caotropos,tais como uréia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais de diafiltra-ção/ultrafiltração, separação convencional, tais como cromatografia de trocade íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases, sol-ventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.

Em um aspecto, moléculas purificadas de CTLA4-lg as quaisforam concentradas e submetidas a uma etapa de diafiltração podem serenchidas em garrafas Biotainer® de 2 L, saco de bioprocesso de 50 L ouqualquer outro vaso adequado. Moléculas de CTLA4-lg em tais vasos po-dem ser armazenadas durante cerca de 60 dias a 2°C a 8°C antes de con-gelamento. Armazenamento prolongado de CTLA4-lg purificada a 2°C a 8°Cpode levar a um aumento na proporção de CTLA4-lg tetramérico. Portanto,para armazenamento a longo prazo, moléculas de CTLA4-lg podem sercongeladas a cerca de -70°C antes de armazenamento e armazenadas emuma temperatura de cerca de -40°C. A temperatura de congelamento podevariar de cerca de -50°C a cerca de -90°C. O tempo de congelamento podevariar e depende grandemente do volume do vaso que contém moléculas deCTLA4-lg e do número de vasos que são carregados no congelador. Porexemplo, em uma modalidade, moléculas de CTLA4-lg estão em garrafasBiotainer® de 2 L. Carregamento de menos do que quatro garrafas Biotai-ner® de 2 L no congelador podem requerer um tempo de congelamento decerca de 14 a pelo menos cerca de 18 horas. Vasos com moléculas de C-TLA4-lg congeladas são armazenados em uma temperatura de cerca de -35°C a cerca de -55°C.

O tempo de armazenamento em uma temperatura de cerca de -35°C a cerca de -55°C pode variar e pode ser tão curto quanto 18 horas. Asmoléculas de CTLA4-lg congeladas podem ser descongeladas de uma ma-neira controlada. Descongelamento das moléculas de CTLA4-lg congeladasé controlado e pode ser feito em uma incubadora em uma temperatura decerca de 20°C a cerca de 24°C. A duração das etapas de descongelamentodepende da carga da incubadora, em que carregamento de menos do quequatro garrafas Biotainer® de 2L pode requerer um tempo de congelamentode menos do que cerca de 24 horas. Carregamento de quatro garrafas Bio-tainer® de 2 L pode requerer cerca de 18 horas. Solução descongeladacompreendendo moléculas de CTLA4-lg pode ser misturada para evitar gra-dientes potenciais de concentração. Portanto, descongelamento pode serfeito em uma incubadora com temperatura controlada, a qual também permi-te a agitação dos vasos os quais contêm CTLA4-lg. a velocidade de agitaçãopode ser cerca de 40 a cerca de 80 rpm. Moléculas descongeladas de C-TLA4-lg podem ser ainda misturadas durante mais 5-10 min em uma taxarotacional de cerca de 3 rpm. Moléculas descongeladas de CTLA4-lg podemser armazenadas a 2°C a 8°C, transformadas em alíquotas e Iiofilizadas du-rante a produção de composições farmacêuticas compreendendo CTLA4-lg.

A presente invenção pode ser ainda aplicada à purificação deoutros Exemplos não-limitativos de glicoproteínas terapêuticas produzidasem larga escala. O processo da presente invenção pode ser aplicável à pro-dução de outras glicoproteínas tendo mais de uma variante glicosilada emcultura de células de mamífero. Versados na técnica compreenderão umamodificação que poderia se tornar necessária no curso da adaptação do mé-todo de produção exemplificado de diferentes glicoproteínas.

Formulações & Kits

A invenção também proporciona qualquer uma das moléculas deCTI_A4-lg descritas como uma mistura liofilizada. Formulações compreen-dendo CTLA4-lg a ser liofilizada podem ainda compreender três componen-tes básicos: (1) um ingrediente ativo adicional incluindo outras proteínas re-combinantes ou pequenas moléculas (tais como imunossupressores), (2) umexcipiente(s) e (3) um solvente(s). Excipientes incluem reagentes farmaceu-ticamente aceitáveis que proporcionam boas propriedades de liofilização aobolo (agentes de composição de volume), bem como proporcionam Iioprote-ção e/ou crioproteção de proteínas ("estabilizante"), manutenção de pH (a-gentes de tamponamento) e conformação apropriada da proteína durantearmazenamento, de modo que retenção substancial de atividade biológica(incluindo estabilidade do ingrediente ativo, tal como estabilidade de proteí-na) seja mantida. Com relação a excipientes, um exemplo de formulaçãopode incluir um ou mais de um agente(s) de tamponamento, um agente decomposição de volume, um estabilizante de proteína e um antimicrobiano.

Açúcares ou polióis podem ser usados como estabilizantes de proteína nãoespecíficos em solução e durante liofilização e secagem-pulverização. Polí-meros podem ser usados para estabilizar proteínas em solução e duranteliofilização e secagem-pulverização. Um polímero popular é albumina de so-ro, a qual foi usada como um crioprotetor e lioprotetor. Em uma modalidade,a invenção proporciona formulações que são isentas de albumina. Váriossais podem ser usados como agentes de composição de volume. Agentesde composição de volume salinos ilustrativos incluem, por exemplo, NaCI1MgCI2 e CaCI2. Determinados aminoácidos podem ser usados como criopro-tetores e/ou Iioprotetores e/ou agentes de volume. Aminoácidos que podemser usados incluem, mas não são limitados a, glicina, prolina, 4-hidroxipro-lina, L-serina, glutamato de sódio, alanina, arginina e cloridrato de lisina.

Muitos agentes de tamponamento que abrangem uma faixa ampla de pHestão disponíveis para seleção em formulações. Agentes de tamponamentoincluem, por exemplo, acetato, citrato, glicina, histidina, fosfato (sódio ou po-tássio), dietanolamina e Tris. Agentes de tamponamento abrangem aquelesagentes os quais mantêm um pH em solução em uma faixa aceitável antesde liofilização. Formulações foram previamente descritas no Pedido de Pa-tente U.S. No. 60/752.150, depositado em 20 de dezembro de 2005, o qual éincorporado aqui por referência em sua totalidade.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma mistura Iiofili-zada de CTLA4-lg compreendendo pelo menos 90%, 95%, 99% ou 99,5%de dímero de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a invenção proporciona umamistura Iiofilizada de CTLA4-lg compreendendo pelo menos 90%, 95%, 99%ou 99,5% de dímero de CTLA4-lg e não mais do que 5%, 4%, 3%, 2% ou1% de tetrâmero de CTLA4-lg. Em outra modalidade, a invenção proporcio-na uma mistura Iiofilizada de CTLA4-lg compreendendo pelo menos 90%,95%, 99% ou 99,5% de dímero de CTLA4-lg e não mais do que 5%, 4%,3%, 2% ou 1% de tetrâmero de CTLA4-lg e não mais do que 2%, 1,5%,1,0%, 0,8%, 0,5% ou 0,3% monômero de CTLA4-lg. Em uma outra modali-dade, a invenção proporciona uma mistura Iiofilizada de CTLM-Ig compre-endendo pelo menos 8,0 mois de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-lg. Em outra modalidade, a invenção propor-ciona uma mistura Iiofilizada de CTLA4-lg compreendendo: de cerca de 15 acerca de 35 mois de GIcNac por mol de CTLAIg moléculas ou dímero; decerca de 1 a cerca de 5 mois de GaINac por mol de dímero de CTLA4-lg oupara molécula de CTLA4-lg; de cerca de 5 mois a cerca de 20 mois de ga-Iactose por mol de dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg; decerca de 2 a cerca de 10 mois de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg oupara molécula de CTLA4-lg; e/ou de cerca de 5-15 mois de manose por molde dímero de CTLA4-lg ou para molécula de CTLA4-lg.

A substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-lg está disponívelcomo uma solução aquosa em uma concentração de aproximadamente 25mg/mL (22,5-27,5 mg/mL) em tampão de fosfato de sódio a 25 mM e cloretode sódio a 10 mM em um pH de ~ 7,5. A CTI_A4A29YL104E-lg tem uma tendên-cia a formar espécies de elevado peso molecular em solução aquosa. Por-tanto, um produto liofilizado foi desenvolvido de forma a minimizar os níveisde espécies de elevado peso molecular que podem se formar no produto defármaco. Vários excipientes, tais como maltose, sacarose e aminoácidos, talcomo cloridrato de L-arginina, foram selecionados como lioprotetores poten-ciais durante liofilização de CTLA^9yl104e-Iq. Descobriu-se que sacarose éo lioprotetor mais eficaz. Foi ainda observado que aumento da proporção desacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína, uma proporçãode sacarose:proteína de 2:1 (peso:peso) foi escolhida para uma solução deproteína a ser liofilizada. O produto de fármaco Iiofilizado tem estabilidadeadequada e comportamento de constituição satisfatório.

Métodos de Tratamento

De acordo com presente invenção, uma doença mediada atra-vés de interações de células T com células B7 positivas pode ser tratadarecebendo uma formulação farmaceuticamente aceitável de CTLA4-lg ouCTUMa29yl1 04E-lg. As moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg secreta-das por uma linhagem de célula de mamífero manipulada (por exemplo, umalinhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês dhfr- negativa que abrigaDNA que codifica CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg) pode ser uma populaçãode moléculas tendo um perfil de glicosilação em particular. Conforme estabe-lecido aqui, um perfil de glicosilação particular pode afetar a ligação de C-TLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg ao CD80 e/ou CD86, de modo que moléculasde CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg podem proporcionar uma maior inibiçãode ativação e/ou proliferação de células T. Conforme estabelecido aqui, umperfil de glicosilação particular pode ser afetado pela linhagem de célula e ométodo de produção. Assim, em determinadas modalidades da invenção, ainvenção proporciona moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg produzi-das por uma linhagem de célula nos métodos de produção descritos aqui deforma a tratar doenças ou distúrbios relacionados a células T que incluem,mas não estão limitados a, geralmente qualquer distúrbio ou doença Iinfopro-liferativa dependente de células T e qualquer doença ou distúrbio autoimunedependente de células T e, mais especificamente: Iinfoma de células T, leu-cemia linfoblástica aguda de células T, Iinfoma de células T angiocêntricotesticular, angiíte linfocítica benigna, doença de enxerto versus hospedeiro(GVHD)1 distúrbios imunes associados à rejeição a transplante de enxerto,psoríase, inflamação, alergia, ooforite, doença inflamatória do intestino, glo-merulonefrite, encefalomielite, tiroidite de Hashimoto, doença de Graves,doença de Addison, doença de Crohn, síndrome de Sjogren, lúpus eritema-toso, mixedema primário, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune,artrite reumatoide, diabetes mellitus dependente de insulina, síndrome deGood Pasture, miastenia gravis, pênfigo, esclerose múltipla, oftalmia simpa-tética, uveíte autoimune, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idi-opática, cirrose biliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulcerativa,escleroderma, polimiosite e doença mista do tecido conectivo.

A invenção proporciona o uso de qualquer uma das moléculasde CTLA4-lg ou CTLA^9^1046-^ descritas em métodos para a inibição deproliferação ou ativação de células T, inibição de uma resposta imune emum indivíduo ou para o tratamento in vitro de um distúrbio imune em um indi-víduo ou indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo. Tole-rância imune é um tipo de resposta imunológica na qual é desenvolvida umanão-reatividade específica dos tecidos Iinfoides a um antígeno específicoonde, na ausência de tolerância, o antígeno é capaz de induzir a uma res-posta imune. Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-lg ou C-TUMa29yl1 04E-lg e composições da invenção podem ser usadas para tratarum indivíduo que recebeu um transplante de forma a induzir a tolerância ereduzir a possibilidade de rejeição. Em outra modalidade, o transplante é umtransplante de órgão, um transplante de tecido ou um transplante de células.Em outra modalidade, o transplante de célula compreende células de medu-la óssea ou células de ilhota.

A invenção proporciona o uso de qualquer uma das moléculasde CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lg descritas na fabricação de um medica-mento para tratamento de qualquer uma das doenças ou distúrbios acimaestabelecidos. A invenção também proporciona o uso de qualquer uma dasmoléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg descritas em uma co-administração com outro agente para o tratamento das doenças ou distúr-bios acima mencionados. As moléculas de CTLA4-lg ou CTI_A4A29YL104E-lgda invenção podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, intrave-nosamente, subcutaneamente e/ou através de inalação. Formulações deCTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg aplicáveis para administração intravenosa ousubcutânea são descritas no Pedido de Patente N0 de Série U.S.60/752.150, depositado em 20 de dezembro de 2005, o qual é incorporadoaqui por referência em sua totalidade. Formulações de CTLA4-lg ou C-TI_A4A29YL104E-lg também podem incluir formulações baseadas em Iipossomaem que os Iipossomas podem distribuir moléculas de CTLA4-lg ou Ο-TI_A4A29YL104E-lg à células ou tecidos-alvo. Moléculas de CTLA4-lg ou C-TLA4A29YL104E-lg podem também ser distribuídas à células ou tecidos alvoatravés de administração de um vetor viral que compreende um cassete deexpressão de gene de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg. A administração edosagens de uma população de moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-Ig são descritas nos pedidos de Patente U.S. publicados comoUS20030083246 e US20040022787, bem como no pedido de Patente U.S.número de série 60/668.774, depositado em 6 de abril de 2005, todos osquais são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

As moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lg conforme des-crito aqui, podem estar em uma variedade de formas de dosagens as quaisincluem, mas não estão limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, com-primidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas polimé-ricas, Iipossomas e soluções injetáveis ou passíveis de infusão. A forma de-pende do modo de administração e da aplicação terapêutica. Um modo deadministração e regime de dosagem eficazes para as moléculas da presenteinvenção depende da gravidade e curso da doença, a saúde do indivíduo eresposta ao tratamento e o julgamento do médico que faz o tratamento.

Consequentemente, as dosagens das moléculas deverão ser tituladas aosindivíduos. A inter-relação de dosagens para animais de vários tamanhos eespécie e seres humanos baseada em mg/m2 de área de superfície é des-crita por Freireich, E. J. e outros (Quantitative Comparison of Toxicity of Anti-cancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. CâncerChemother. Rep.. 50, No. 4, 219-244, Maio de 1966). Ajustes no regime dedosagem podem ser feitos para otimizar a inibição da resposta de cresci-mento.

Doses podem ser divididas e administradas em uma base diáriaou a dose pode ser reduzida proporcionalmente, dependendo da situação.Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diária oumensalmente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida, conformeindicado pela situação terapêutica específica. Em uma modalidade, a admi-nistração é mensal, trimestral, diária, duas vezes ao dia, cerca de cada 10horas, cerca de cada 6 horas, cerca de cada 4 horas, cerca de cada 2 horas,cerca de uma vez a uma hora. De acordo com a prática da invenção, umaquantidade eficaz para tratamento de um indivíduo pode estar entre cerca de0,1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo, também, a quantida-de eficaz pode ser uma quantidade entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/kg depeso corporal do indivíduo. As moléculas de CTLA4-lg ou CTLA4A29YL104E-lgda invenção também têm aplicação clínica in vivo. Elas podem ser usadaspara a enumeração de células B7 positivas no diagnóstico ou prognóstico dealgumas condições de imunodeficiência, na fenotipificação de Ieucemias eIinfomas e no monitoramento de alteração imunológica após transplante deórgão.

A distribuição das composições descritas aqui pode ser obtidavia injeção, distribuição oral, inalação de uma pulverização ou outra disper-são particular, injeção subcutânea, distribuição intravenosa, distribuição tópi-ca, supositório, distribuição ocular, distribuição nasal ou oral. A composiçãopode ser distribuída via encapsulação em um Iipossoma ou outro veículo dedistribuição semelhante à membrana. A composição pode ser distribuída viao sangue ou outros fluidos que são previamente tratados com a composiçãoe, então, subseqüentemente transfundidas em um indivíduo.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: 17 é a seqüência de nucleotídeo que codifica pcS-DhuCTLA4lg:

GATCTCCCGA TCCCCTATGG TCGACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAAGCCAGTATCT GCTCCCTGCT TGTGTGTTGGAAGCTACAAC AAGGCAAGGC TTGACCGACAGTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCAGTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCATTTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTGCGTCAATAAT GACGTATGTT CCCATAGTAAGGGTGGACTA TTTACGGTAA ACTGCCCACTGTACGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTATGACCTTATG GGACTTTCCT ACTTGGCAGTTGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACATCAATGTTCCAAGTCT CCACCCCATT GACGTCAATGACTTTCCAAA ATGTCGTAAC AACTCCGCCCGGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCTCTTTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGGACTAGTAACG GCCGCCAGTG TGCTGGAATTCTCACACAGA GGACGCTGCT CAGTCTGGTCATGGCAATGC ACGTGGCCCA GCCTGCTGTGTTTGTGTGTG AGTATGCATC TCCAGGCAAACAGGCTGACA GCCAGGTGAC TGAAGTCTGTACCTTCCTAG ATGATTCCAT CTGCACGGGCATCCAAGGAC TGAGGGCCAT GGACACGGGACCACCGCCAT ACTACCTGGG CATAGGCAACCCGTGCCCAG ATTCTGATCA GGAGCCCAAATCCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGATCGGACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAGGAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTACACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGCCTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAGCCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAATACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCCAACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG

AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTTATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGCGATATACGCG TTGACATTGA TTATTGACTATAGTTCATAG CCCATATATG GAGTTCCGCGGCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGACGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAATTGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAAAATGGCCCGC CTGGCATTAT GCCCAGTACAACATCTACGT ATTAGTCATC GCTATTACCAGGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGATGGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGGCATTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTACGGCTAACTAG AGAACCCACT GCTTACTGGCAGACCCAAGC TTGGTACCGA GCTCGGATCCCTGCAGATAG CTTCACCAAT GGGTGTACTGCTTGCACTCC TGTTTCCAAG CATGGCGAGCGTACTGGCCA GCAGCCGAGG CATCGCCAGCGCCACTGAGG TCCGGGTGAC AGTGCTTCGGGCGGCAACCT ACATGATGGG GAATGAGTTGACCTCCAGTG GAAATCAAGT GAACCTCACTCTCTACATCT GCAAGGTGGA GCTCATGTACGGAACCCAGA TTTATGTAAT TGATCCAGAATCTTCTGACA AAACTCACAC ATCCCCACCGTCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAGGTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCACGTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAGACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTCTACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTCGCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTGACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAGGACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAGCATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAGGTGCGACGGC CGGCAAGCCC CCGCTCCCCGGAGGGCCCTA TTCTATAGTG TCACCTAAATCCTTCTAGTT GCCAGCCATC TGTTGTTTGCGGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTAATAAAGGTGTCATT CTATTCTGGG GGGTGGGGTGGACAATAGCA GGCATGCTGG GGATGCGGTGAGCTGGGGCT CTAGGGGGTA TCCCCACGCGGTGGTGGTTA CGCGCAGCGT GACCGCTACAGCTTTCTTCC CTTCCTTTCT CGCCACGTTCGGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGAGCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCCCTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCCCCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGCGAGGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAGGGCTTTTGCA AAAAGCTTGG ACAGCTGAGGTCCTAGCGTG AAGGCTGGTA GGATTTTATCTGCATCGTCG CCGTGTCCCA AGATATGGGGCCGCTCAGGA ACGAGTTCAA GTACTTCCAAAAACAGAATC TGGTGATTAT GGGTAGGAAACCTTTAAAGG ACAGAATTAA TATAGTTCTCGCTCATTTTC TTGCCAAAAG TTTGGATGATGCAAGTAAAG TAGACATGGT TTGGATAGTCAATCAACCAG GCCACCTCAG ACTCTTTGTGACGTTTTTCC CAGAAATTGA TTTGGGGAAACTCTCTGAGG TCCAGGAGGA AAAAGGCATCGACTAACAGG AAGATGCTTT CAAGTTCTCTAGACCATGGG ACTTTTGCTG GCTTTAGATCACATAATTGG ACAAACTACC TACAGAGATTAGTGTATAAT GTGTTAAACT ACTGATTCTAGGAACTGATG AATGGGAGCA GTGGTGGAAT

CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATGAGGCTCTCGCG GTCGCACGAG GATGCTTCTAGCTAGAGCTC GCTGATCAGC CTCGACTGTGCCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAAAATGAGGAAA TTGCATCGCA TTGTCTGAGTGGGCAGGACA GCAAGGGGGA GGATTGGGAAGGCTCTATGG CTTCTGAGGC GGAAAGAACCCCCTGTAGCG GCGCATTAAG CGCGGCGGGTCTTGCCAGCG CCCTAGCGCC CGCTCCTTTCGCCCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGTAGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCACCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCATCTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCGTGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCCAAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTAGCTGCGATTT CGCGCCAAAC TTGACGGCAACCCGCTGCCA TCATGGTTCG ACCATTGAACATTGGCAAGA ACGGAGACCT ACCCTGGCCTAGAATGACCA CAACCTCTTC AGTGGAAGGTACCTGGTTCT CCATTCCTGA GAAGAATCGAAGTAGAGAAC TCAAAGAACC ACCACGAGGAGCCTTAAGAC TTATTGAACA ACCGGAATTGGGAGGCAGTT CTGTTTACCA GGAAGCCATGACAAGGATCA TGCAGGAATT TGAAAGTGACTATAAACTTC TCCCAGAATA CCCAGGCGTCAAGTATAAGT TTGAAGTCTA CGAGAAGAAAGCTCCCCTCC TAAAGCTATG CATTTTTATATTTGTGAAGG AACCTTACTT CTGTGGTGTGTAAAGCTCTA AGGTAAATAT AAAATTTTTAATTGTTTGTG TATTTTAGAT TCCAACCTATGCCTTTAATG AGGAAAACCT GTTTTGCTCAGAAGAAATGC CATCTAGTGA TGATGAGGCTAAAAAGAAGA GAAAGGTAGA AGACCCCAAGAGTCATGCTG TGTTTAGTAA TAGAACTCTTAAAGCTGCAC TGCTATACAA GAAAATTATGCATAACAGTT ATAATCATAA CATACTGTTTGCTATTAATA ACTATGCTCA AAAATTGTGTAATAAGGAAT ATTTGATGTA TAGTGCCTTGTGTAGAGGTT TTACTTGCTT TAAAAAACCTAATGAATGCA ATTGTTGTTG TTAACTTGTTCAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGCGTCCAAACTC ATCAATGTAT CTTATCATGTGGATCTCATG CTGGAGTTCT TCGCCCACCCCAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCACTTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATCCTAGAGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCTAATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCATGAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTCGTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACGCTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCTATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT

GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGCGTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGAGTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA

GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTACAAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTGCTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCCTAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAGTGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGTGCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGTTACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG

ACTGCTGACT CTCAACATTC TACTCCTCCAGACTTTCCTT CAGAATTGCT AAGTTTTTTGGCTTGCTTTG CTATTTACAC CACAAAGGAAGAAAAATATT CTGTAACCTT TATAAGTAGGTTTCTTACTC CACACAGGCA TAGAGTGTCTACCTTTAGCT TTTTAATTTG TAfiAGGGGTTACTAGAGATC ATAATCAGCC ATACCACATTCCCACACCTC CCCCTGAACC TGAAACATAATATTGCAGCT TATAATGGTT ACAAATAAAGATTTTTTTCA CTGCATTCTA GTTGTGGTTTCTGGATCGGC TGGATGATCC TCCAGCGCGGCAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTAAAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAGTTATCATGTC TGTATACCGT CGACCTCTAGGTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCACAAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGTACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTCCGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCGGCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGTATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA

CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGCGCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAGCCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT

CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGGTAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCGCGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGGACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCACAGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTGATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGTATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGGTGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTACTTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCAGGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCACTAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAACTGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATTCGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTTGCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTTCGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATCGGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAAAGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG

GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCCGTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTTCTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTTTTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAGTCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGTACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACCATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGCCGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCGTAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTACTATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG

TCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCCCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACTCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC

AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAATACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTCTTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCACTCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAAAACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACTCATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGGATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCGAAAAGTGCCA CCTGACGTCG ACGGATCGGG A

SEQ ID NO: 18 é a seqüência de aminoácido do domínio extra-celular de Humano CTLA4:

MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDOutras modalidades não limitativas:

A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ová-rio de Hamster Chinês capaz de produzir CTLA4-lg. Em uma modalidade, apopulação de célula é capaz de produzir mais de 0,5 ou mais gramas de pro-teína de CTLA4-lg por litro de cultura líquida e em que a CTLA4-lg exibeuma proporção molar de ácido siálico para dímero de CTLA4-lg é de cercade 6 a cerca de 14 em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em umamodalidade, a população de célula foi adaptada a um meio isento de soroquimicamente definido. Em outra modalidade, CTLA4-lg produzida a partirde cultura da população de célula tem um coeficiente de extinção de 1,00 ±0,05 AU mL cm"1 mg"1 Em uma outra modalidade, a população de célula,quando desenvolvida em cultura, é capaz de produzir polipeptídeos de C-TLA4-lg, em que: (a) cerca de 90% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compre-endem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com ametionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% dos polipeptídeos de CTLA4-lgcompreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começandocom a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% dos polipeptídeos deCTLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ter-minando com a Iisina no resíduo número 383; (d) cerca de 96% dos polipep-tídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente,(e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreen-dem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metio-nina no resíduo número 25.

A invenção proporciona uma célula de prole das células descri-tas acima, em que a célula de prole produz CTLA4-lg. Em uma modalidade,a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo me-nos 5 gerações. Em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir decultura de uma célula durante pelo menos 10 gerações. Em outra modalida-de, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelomenos 20 gerações. Em outra modalidade,a célula de prole é obtida a partirde cultura de uma célula durante pelo menos 40 gerações, em outra modali-dade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pe-Io menos 50 gerações, em outra modalidade, a célula de prole é obtida apartir de cultura de uma célula durante pelo menos 75 gerações, em outramodalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula du-rante pelo menos 100 gerações.

A invenção proporciona uma linhagem de célula produzida a par-tir de qualquer das células descritas acima. Em uma modalidade, a linhagemde célula é clonal. Em outra modalidade, a linhagem de célula é capaz deproduzir: (a) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 8 (metionina na posição de aminoácido 27 e gli-cina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (b) uma proteína defusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5(metionina na posição de aminoácido 27 e Iisina na posição de aminoácido383 de SEQ ID NO: 2); (c) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo umaseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (alanina na posição de aminoá-cido 26 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (d) umaproteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQID NO: 4 (alanina na posição de aminoácido 26 e Iisina na posição de ami-noácido 383 de SEQ ID NO: 2); (e) uma proteína de fusão de CTLA4-lg ten-do uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (metionina na posiçãode aminoácido 25 e Iisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2);ou (f) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoá-cido de SEQ ID NO: 6 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicina naposição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2).

Em outra modalidade, a linhagem de célula é capaz de produzirproteínas de fusão de CTLA4-lg, em que: (a) cerca de 90% dos polipeptí-deos de CTLA4-lg compreendem uma seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% dos po-lipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácido de SEQID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4%dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 2 terminando com a Iisina no resíduo número 383; (d) cercade 96% dos polipeptídeos de CTLA4-lg compreendem a seqüência de ami-noácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382;e opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos de C-TLA4-lg compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 come-çando com a metionina no resíduo número 25,

Em uma modalidade, as proteínas de fusão de CTLA4-lg, asquais são produzidas a partir de cultura a linhagem de célula, têm um coefi-ciente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU ml_ cm-1 mg-1. Em uma modalidade, ainvenção proporciona uma população de célula derivada de uma célula dainvenção. Em uma modalidade, a população de célula consiste em pelo me-nos uma alteração genética adicional quando comparado com a célula origi-nalmente transfectada e em que a população de célula derivada é capaz deproduzir CTLA4-lg. Em outras modalidades, a população de célula consisteem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26 alterações genéticas adicionais quando comparadocom a célula originalmente transfectada e em que a população de célula de-rivada é capaz de produzir CTLA4-lg. Em uma modalidade, a alteração ge-nética compreende pelo menos uma mutação não-conservativa no genomacelular ou no cassete de expressão recombinante que codifica a CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a alteração genética compreende pelomenos um ácido nucleico recombinante adicional dentro da célula. Em umamodalidade, a alteração compreende uma mutação do genoma celular. Emuma modalidade, a alteração compreende a adição de um ácido nucleico aogenoma celular ou como um ácido transnucleico, o qual codifica um polipep-tídeo antiapoptótico. Em uma modalidade, o polipeptídeo antiapoptótico serefere à glicosilação.

Em uma modalidade, alteração genética compreende pelo me-nos uma mutação do genoma celular ou do cassete de expressão recombi-nante que codifica a CTLA4-lg. Em uma modalidade, a população de célula,quando desenvolvida em cultura, é capaz de produzir: (a) uma proteína defusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8(metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoácido382 de SEQ ID NO: 2); (b) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo umaseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (metionina na posição de ami-noácido 27 e Iisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); (c)uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 7 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição deaminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (d) uma proteína de fusão de CTLA4-lgtendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (alanina na posiçãode aminoácido 26 e Iisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2);

(e) uma proteína de fusão de CTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 4 (metionina na posição de aminoácido 25 e Iisina na posi-ção de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); ou (f) uma proteína de fusão deCTLA4-lg tendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (metioninana posição de aminoácido 25 e glicina na posição de aminoácido 382 deSEQ ID NO: 2).

A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero deCTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 18. A invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 18. A inven-ção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo uma pro-porção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg decerca de 11 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de molé-culas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siáli-co para dímero de CTLA4-lg de cerca de 12 a cerca de 18. A invenção pro-porciona uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporçãomolar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg de cerca de13 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas deCTLA4-lg tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico paradímero de CTLA4-lg de cerca de 14 a cerca de 18. A invenção proporcionauma população de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar mé-dia de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg de cerca de 15 a cercade 17. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lgtendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero deCTLA4-lg de cerca de 16.

A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que mais de 95% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em umamodalidade, mais de 98% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em umamodalidade, mais de 99% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Em umamodalidade, mais de 99,5% das moléculas são dímeros de CTLA4-lg. Emuma modalidade, de cerca de 95% a cerca de 99,5% das moléculas são dí-meros de CTLA4-lg e cerca de 0,5% a cerca de 5% das moléculas são te-trâmeros de CTLA4-lg. Em uma modalidade, cerca de 98,6% das moléculassão dímeros de CTLA4-lg e cerca de 1,2% das moléculas são tetrâmeros deCTLA4-lg e cerca de menos do que 0,7 % das moléculas são monômeros deCTLA4-lg. A invenção proporciona uma população consistindo em dímerosde CTLA4-lg. A invenção proporciona uma população de moléculas de C-TLA4-lg, em que a população é substancialmente isenta de monômero deCTLA4-lg. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de tetrâmero de CTLA4-lg. A invenção proporciona uma população de monômeros de moléculas deCTLA4-lg substancialmente isenta de dímero e tetrâmero de CTLA4-lg. Emuma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-lg tem pelomenos 3 grupos ácido siálico.

Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de C-TLA4-lg tem de pelo menos 3 grupos ácido siálico a pelo menos 8 gruposácido siálico. A invenção proporciona uma população purificada de molécu-las tetraméricas de CTLA4-lg, a população sendo substancialmente isentade dímero de CTLA4-lg e opcionalmente em que a população compreendeuma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. A invenção proporcio-na uma população purificada de moléculas tetraméricas de CTLA4-lg, a po-pulação sendo substancialmente isenta de monômero de CTLA4-lg e opcio-nalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais decerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica com-preende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-lg, em que cada polipeptídeotem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo èmSEQ ID NOS: 3-8 e em que cada membro do par de polipeptídeos é cova-Ientemente ligado ao outro membro e em que os dois pares de polipeptídeossão não-covalentemente associados um ao outro. Em uma modalidade, ca-da molécula tetramérica é capaz de ligação a um CD80 ou CD86. Em umamodalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezesmaior pelo CD80 ou CD86 quando comparado com um dímero de moléculade CTLA4-lg. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo me-nos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ou ativação de células Tquando comparado com um dímero de molécula de CTLA4-lg.

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que a composição compreende isoformas dominan-tes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétrica de CTLA4-lg o qualtem um ponto isoelétrico, pl, menos de ou igual a 5,1 conforme determinadoatravés de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, o pl aumenta apóstratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, pelo menos 40% dasmoléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétrico de menos do que ouigual a cerca de 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétri-ca. Em uma modalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-lg exi-bem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 conformedeterminado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelomenos 90% das moléculas de CTLA4-lg exibem um ponto isoelétrico de me-nos do que ou igual a cerca de 2,5 conforme determinado através de focali-zação isoelétrica. A invenção proporciona uma população de moléculas deCTLA4-lg tendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invençãoproporciona uma população de moléculas de CTLA4-!g tendo um pl de cercade 4,3 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 3,3 ± 0,2 a cerca de 4,7 ± 0,2. A invenção proporciona um método para preparo de uma composição, acomposição compreendendo a molécula de CTLA4-lg com um pl de cercade 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição deuma mistura de moléculas de CTLA4-lg à eletroforese em gel de focalizaçãoisoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma populaçãode moléculas de CTLA4-lg com um pl em particular e (b) isolamento da po-pulação de moléculas de CTLA4-lg tendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cer-ca de 5,0 ± 0,2 de modo a preparar uma composição. A invenção proporcio-na uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que asmoléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar médiade GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 17 a cerca de 25. Ainvenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de C-TLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por umaproporção molar média de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cercade 15 a cerca de 35. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são ca-racterizadas por uma proporção molar média de GaINAc por mol de dímerode CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculasde CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molar média de galacto-se por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, emque as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por uma proporção molarmédia de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de8,3. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são caracterizadas por umaproporção molar média de manose por mol de dímero de CTLA4-lg de cercadé 7,2 a cerca de 22. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA4-lg são ca-racterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dí-mero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a)uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg decerca de 15 a cerca de 35; e (b) uma proporção molar média de ácido siálicopor mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invençãoproporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg ca-racterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc por mol de díme-ro de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar mé-dia de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero deCTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma compo-sição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a) umaproporção molar média de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cercade 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc por mol dedímero de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção mo-lar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 8 a cer-ca de 17; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de díme-ro de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona umacomposição compreendendo moléculas de CTLA4-lg caracterizada por: (a)uma proporção molar média de GIcNAc por mol de dímero de CTLA4-lg decerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GaINAc pormol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma propor-ção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 8a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímerode CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; e (e) uma proporção molar mé-dia de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc pormol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma propor- ção molar média de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 1,7a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dí-mero de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molarmédia de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de C-TLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; e (f) uma proporção molar média deácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12,

A invenção proporciona uma composição compreendendo molé-culas de CTLA4-lg, em que a composição exibe um pico por cromatogramade NGNA de cerca de 9,589+/-0,3 e um pico por cromatograma de NANA decerca de 10,543+/-0,3. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas de CTLA-Ig exibem umperfil de carboidrato conforme mostrado na figura 7. A invenção proporcionauma composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg, em que as molé-culas de CTLA4-lg exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - IV, emque o Domínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeosa-sialilados, o Domínio Il compreende picos os quais representam oligossa-carídeos monossialilados, o Domínio Ill compreende picos os quais repre-sentam oligossacarídeos dissialilados e o Domínio IV compreende picos osquais representam oligossacarídeos trissialilados. Em uma modalidade, adiferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-Iigados entre umprimeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio Il é de cerca de 22a cerca de 28 minutos. A invenção proporciona uma composição compreen-dendo dímeros de moléculas de CTLA4-lg, em que pelo menos 0,5 % dosdímeros de moléculas de CTLA4-lg são cisteinilados, em outra modalidade,pelo menos 1,0% dos dímeros de moléculas de CTLA4-lg são cisteinilados.

A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-lg, em quea população exibe um perfil de espectrometria de massa conforme mostradonas figuras 8 e 10. A invenção proporciona uma população de moléculas deCTLA4-lg, em que a população exibe um perfil de eletroforese capilar con-forme mostrado nas figuras 20 e 21. A invenção proporciona uma composi-ção de moléculas de CTLA4-lg tendo uma proporção molar média de gruposácido siálico para dímero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 18, em queo dímero de CTLA4-lg é produzido a partir de células de uma linhagem decélula comercial. A invenção proporciona uma composição de CTLA4-lg ob-tida através de qualquer método da invenção. A invenção proporciona umapopulação de moléculas de CTLA4-lg, em que as moléculas são glicosiladasem um resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 2,um resíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 2, umresíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO: 2, umresíduo de aminoácido serina na posição 155 de SEQ ID NO: 2 ou um resí-duo de aminoácido serina na posição 165 de SEQ ID NO: 2. A invenção pro-porciona uma população de moléculas de CTLA4-lg, em que a população demoléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAcpor mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma pro-porção molar média de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol dedímero de CTLA4-lg de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molarmédia de fucose por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de C-TLA4-lg de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média deácido siálico por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; (g)um pl, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focali-zação isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2;(h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm;(i) menos de 2,5 % de tetrâ-mero; 0) menos de 0,5% de monômero; (k) polipeptídeos de CTLA4-lg dapopulação tendo um aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer umade SEQ ID NOS: 2-8;(l) em que moléculas de CTLA4-lg dentro da populaçãoé capaz de ligação ao CD80 e CD86. A invenção proporciona uma popula-ção de moléculas de CTLA4-lg, em que a população de moléculas é caracte-rizada por: (a) uma proporção molar média de GIcNAc por mol de dímero deCTLA4-lg de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média deGaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c)uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-lg decerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por molde dímero de CTLA4-lg de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporçãomolar média de manose por mol de dímero de CTLA4-lg de cerca de 7,2 acerca de 22; (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dí-mero de CTLA4-lg de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pl, conforme deter-minado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, emuma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menosdo que ou igual a 5 ppm; (i) menos de 2,5 % de tetrâmero; (j) menos de0,5% de monômero; (k) polipeptídeos de CTLA4-lg da população tendo umaminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 2-8;(I) em que moléculas de CTLA4-lg dentro da população é capaz de ligaçãoao CD80 e CD86; ou equivalentes farmacêuticos dos mesmos. A invençãoproporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz dasmoléculas de CTLA4-lg e um veículo farmaceuticamente aceitável. A inven-ção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficazdas moléculas de CTLA4-lg, em que a composição ainda compreende umaquantidade de mono-hidrato de maltose. Em uma modalidade, a composiçãoainda compreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamenteaceitável. Em uma modalidade, a composição ainda compreende maltose,mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido desódio e água estéril. Em uma modalidade, a composição ainda compreendesacarose, poloxâmero, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, fosfatode sódio anídrico dibásico, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água esté-ril.

A invenção proporciona uma mistura Iiofilizada de CTLA4-lgcompreendendo pelo menos 95% de dímero de CTLA4-lg e não mais do que5% de tetrâmero de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compreendepelo menos 98% de dímero de CTLA4-lg e não mais do que 2% de tetrâme-ro de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos99% de dímero de CTLA4-lg e não mais do que 1% de tetrâmero de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 8,0 mois de áci-do siálico por mol de dímero de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a misturacompreende cerca de 15,7 a cerca de 31 mois de GIcNAc por mol de dímerode CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 1,6 acerca de 3,2 mois de GaINAc por mol de dímero de CTLA4-lg. Em uma mo-dalidade, a mistura compreende cerca de 9,3 a cerca de 15,5 mois de galac-tose por mol de dímero de CTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura com-preende cerca de 3,6 a cerca de 7,9 mois de fucose por mol de dímero deCTLA4-lg. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 9,7 mois demanose por mol de dímero de CTLA4-lg. A invenção proporciona um kit far-macêutico compreendendo: (a) um recipiente contendo uma mistura Iiofiliza-da de CTLA4-lg da reivindicação 1; e (b) instruções para reconstituição damistura Iiofilizada de CTLA4-lg em solução para injeção.

A invenção proporciona um método para inibição de proliferaçãode células T (ou ativação), o método compreendendo contato de uma célulaT com uma quantidade eficaz de a composição de CTLA4-lg. A invençãoproporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indiví-duo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisado mesmo, de uma quantidade eficaz da composição. A invenção proporcio-na métodos para indução de tolerância imune a um antígeno em um indiví-duo, tratamento de inflamação em um indivíduo, tratamento de artrite reuma-toide, tratamento de psoríase em um indivíduo, tratamento de lúpus em umindivíduo, tratamento de ou prevenção de uma alergia em um indivíduo, tra-tamento de ou prevenção de doença enxerto vs hospedeiro em um indiví-duo, tratamento de ou prevenção de rejeição de um órgão transplantado emum indivíduo, tratamento de esclerose múltipla em um indivíduo, tratamentode diabetes do tipo I em um indivíduo, tratamento de doença inflamatória dointestino em um indivíduo, tratamento de ooforite em um indivíduo, tratamen-to de glomerulonefrite em um indivíduo, tratamento de encefalomielite alérgi-ca em um indivíduo ou tratamento de miastenia gravis em um indivíduo atra-vés de administração de uma composição da invenção em uma quantidadea um indivíduo para tratar a doença ou distúrbio. A composição pode sercombinada com um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção pro-porciona o uso de uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo umaproporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg decerca de 6 a cerca de 18 na fabricação de um medicamento para o trata-mento terapêutico e/ou profilático de um distúrbio imune. A invenção propor-ciona o uso de uma população de moléculas de CTLA4-lg tendo uma pro-porção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-lg decerca de 6 a cerca de 18 na fabricação de um agente antiartrite reumatoideem uma embalagem junto com instruções para seu uso no tratamento deartrite reumatoide. A invenção proporciona um método para inibição de proli-feração de células T (ou ativação), o método compreendendo contato deuma célula T com uma quantidade eficaz da composição da invenção emcombinação com metotrexato. A invenção proporciona um método para ini-bição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendoadministração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidadeeficaz da composição da invenção em combinação com metotrexato. A in-venção proporciona um método para indução de tolerância imune a um antí-geno em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indi-víduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz da composição dequalquer uma das reivindicações 1-64 em combinação com metotrexato. Ainvenção proporciona um método para produção de uma proteína recombi-nante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero quesecretam uma proteína recombinante, em que a expansão é de uma culturaoriginária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que a con-centração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de culturalíquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida depelo menos 10.000 L. Em uma modalidade, a expansão da etapa (a) com-preende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamentedefinido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densida-de celular de pelo menos cerca de 1,0 χ 105 células viáveis por ml_, em quecada estágio de semente começa em cerca de 2 χ 105 por ml_ e vai até 1-2mil células por mL; (ii) manutenção das células em cultura durante um temposuficiente para produzir, a partir da cultura, pelo menos cerca de 0,5 g / L.

Em uma modalidade, a proteína é uma glicoproteína. Em uma modalidade, aproteína é uma proteína de CTLA4-lg. Em uma modalidade, as células demamífero são a prole células. Em uma modalidade, as células de mamíferosão a prole de uma linhagem de célula clonal CHO capaz de produzir Prote-ínas de fusão de CTLA4-lg, em que as células de CHO têm, estavelmenteintegradas em seu genoma, pelo menos 30 cópias de um cassete de ex-pressão de CTLA4-lg. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempopelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 30%. Em uma modali-dade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células nãocai abaixo de 40%. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pe-lo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 50%. Em uma modalida-de, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células nãocai abaixo de 60%. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pe-lo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 70% ou 80% ou 90% ou95%. Em uma modalidade, as pelo menos quatro passagens compreendem:(i) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 50 mLaté uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 mil célulaspor mL ser atingida, (ii) crescimento das células em um volume de cultura depelo menos 10 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de2,5 milhões de células por mL ser atingida; (iii) crescimento das células emum volume de cultura de pelo menos 100 L até uma densidade celular decerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida; e (iv)crescimento das células em um volume de cultura de 200 L até uma densi-dade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mLser atingida. Em uma modalidade, galactose é adicionada ao meio isento desoro quimicamente definido. Em uma modalidade, a manutenção de com-preende (i) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°C a 34±2°C; e (ii)diminuição da temperatura da cultura de 34±2°C a 32±2°C. Em uma modali-dade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo me-nos 5 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de32±2°C durante pelo menos 6 dias. Em uma modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 7 dias. Em uma mo-dalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelomenos 8 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixade 32±2°C durante pelo menos 9 dias. Em uma modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 10 dias. Em umamodalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pe-lo menos 11 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro dafaixa de 32±2°C durante pelo menos 12 dias. Em uma modalidade, a tempe-ratura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 13 dias. Emuma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C duran-te pelo menos 14 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentroda faixa de 32±2°C durante pelo menos 15 dias. Em uma modalidade, atemperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 16dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de32±2°C durante pelo menos 17 dias. Em uma modalidade, a temperatura émantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 18 dias. Em umamodalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante até18 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de32±2°C até a densidade celular da cultura ser de cerca de 30 χ 10^5 a cercade 79 χ 10^5 células por mL de cultura líquida. A invenção proporciona ummétodo para produção de uma proteína recombinante, o método compreen-dendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteínarecombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo me-nos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelomenos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recom-binante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamentoocorre apenas quando a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de6,0 mois de NANA por mol de proteína. A invenção proporciona um métodopara produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo:(a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombi-nante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelomenos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recom-binante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L1 em que o isolamentoocorre apenas quando a cultura líquida tem uma densidade celular de cercade 33 χ 105 a cerca de 79 χ 105 células por mL.

A invenção proporciona um método para produção de uma pro-teína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células demamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originá-ria para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concen-tração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líqui-da; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelomenos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a viabilidade celular nacultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de 30% oucerca de 38%. A invenção proporciona um método para produção de umaproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de célulasde mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura origi-nária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L1 de modo que a con-centração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de culturalíquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida depelo menos 10.000 L1 em que o isolamento ocorre apenas quando a endoto-xina é menos de ou igual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida. Ainvenção proporciona um método para produção de uma proteína recombi-nante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero quesecretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para umacultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de pro- teína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) iso-lamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos10.000 L1 em que o isolamento ocorre apenas quando a bioburden é menosde 1 unidade formação de colônia por mL de cultura líquida. A invenção pro-porciona um método para produção de uma proteína recombinante, o méto-do compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam umaproteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida depelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinan-te é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteínarecombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o iso-lamento ocorre apenas se pelo menos duas das seguintes condições sãoreunidas: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mois deNANA por mol de proteína, (ii) a cultura líquida tem uma densidade celularde cerca de 33 χ 105 a cerca de 79 χ 105 células por mL, (iii) a viabilidadecelular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de38% ou (iv) a quantidade CTLA4-lg na cultura é mais de 0,5 g / L. Em umamodalidade, o isolamento compreende: (i) obtenção de um sobrenadante decultura de célula; (ii) sujeição do sobrenadante à cromatografia de troca deânions para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto deproteína eluído da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbica, demodo a obter um produto de proteína enriquecido; (iv) sujeição do produtode proteína enriquecido à cromatografia por afinidade para obter um produtode proteína enriquecido eluído; e (v) sujeição do produto de proteína enri-quecido eluído de (iv) à cromatografia de troca de ânions.

Em uma modalidade, o produto de proteína enriquecido obtidona etapa (iii) é caracterizado pelo fato de que o percentual de qualquer mul-tímero de elevado peso molecular é menos de 25% em peso. Em uma mo-dalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usandoum tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 75 mM e NaCI acerca de 360 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em uma modalidade, acromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando um tampãode eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 325mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma modalidade, a cromatografiade interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando um único tampãode lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma modalidade, a cromatogra-fia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando um tampão de lavagemcompreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 250 mM e tendoum pH de cerca de 8,0. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidadeda etapa (iv) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo Gli-cina a cerca de 100 mM e tendo um pH de cerca de 3,5. Em uma modalida-de, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando umtampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI acerca de 120 mM a NaCI a cerca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0.

Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) é rea-lizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 25mM e NaCI a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em umamodalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada u-sando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo a-mina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em uma modalidade, aresina tem um grupo funcional amina quaternária. Em uma modalidade, acromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando umaresina de interação hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propi-la, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma modalidade, o grupo funcional é umgrupo funcional fenila. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade daetapa (iv) é realizada usando uma coluna contendo Proteína A. Em uma mo-dalidade, método para o preparo de CTLA4-lg, o método compreendendopurificação de CTLA4-lg de uma cultura de célula líquida, de modo que umaCTLA4-lg purificada (a) tem cerca de 38 ng de MCP-1 por mg de dímero deCTLA4-lg e (b) compreende menos do que 2,5% de tetrâmero de CTLA4-lgem peso.

Em uma modalidade, a cultura líquida de células compreendeuma célula ou uma célula de prole da invenção. A invenção proporciona ummétodo para produção de CTLA4-lg, o método compreendendo: (a) expan-são de células de prole de qualquer de linhagem de células de CHO comer-cial que são capazes de produzir CTLA4-lg, em que a expansão é de umacultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que aconcentração de CTLA4-lg é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e(b) isolamento de CTLA4-lg de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L,em que a cromatografia é sobre uma coluna com resina de interação hidro-fóbica com pelo menos um grupo funcional fenila, em que o isolamentocompreende uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica realizadausando um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25mM e NaCI a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0.

EXEMPLOS DA INVENÇÃO

Uma série de Exemplos são proporcionados abaixo para facilitaruma compreensão mais completa da presente invenção. Os exemplos a se-guir ilustram os modos exemplificativos e prática da presente invenção. Con-tudo, o escopo da invenção não está limitado às modalidades específicasdescritas nesses Exemplos, as quais são para fins de ilustração apenas,uma vez que métodos alternativos podem ser utilizados para obter resulta-dos similares.

Os Exemplos a seguir se referem a moléculas de CTLA4-lg quecompreendem seqüências de uma ou mais de SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Esses Exemplos não se destinam a ser Iimi-tativos e versados na técnica compreenderão que os exemplos podem serexpandidos e adaptados, por exemplo, à outras moléculas de CTLA4-lg, ou-tras glicoproteínas e outras proteínas relacionadas a ou compreendendoporções de uma proteína da superfamília Ig.

A tabela a seguir apresenta exemplos que se relacionam à C-TLA4-lg e à CTLA^9yl104e-I9.

<table>table see original document page 299</column></row><table>continuação

<table>table see original document page 300</column></row><table>

Abreviações:

15N 15Nanômetro

A280 Absorbância a 280 nm

CTLA4-lg Antígeno 4 de Linfócito T Citotóxico/lmunoglobulina; CTLA-4 Ig

API Ingrediente farmacêutico ativo

AU Unidades de absorbância

B7 Ligante do receptor de CTLA-4

cfu Unidade de formação de colônia

CHO Ovário de Hamster Chinês

CHOP Proteína de Ovário de Hamster Chinês em células hospedeiras

CV Volume de ColunaEnchimento de Subs- Concentração de Substância de Fármaco/Etapa de Diafiltra-tância de Fármaco ção e EnchimentoELISA Ensaio Imunoabsorvente enzima-ligadoEU Unidades de endotoxinaFc A região constante de anticorposGaINAc N-Acetil-galactosaminaGIcNAc N-Acetil-glicosaminaHEPES Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1 -etano-sulfônicoHIC Cromatografia de interação hidrofóbica; Phenyl Sepharose® Fast FlowHMW Espécies de elevado peso molecularHPLC Cromatografia de líquido de elevado desempenhoIgGl Imunoglobulina da Classe G1IPC Controle em-processoLAL Lisato de amebócito LimulusMBR(s) Registro(s) de lote mestreMCP-1 Proteína 1 quimiotática de monócitoMTX MetotrexatoMW Peso molecularN/A Não aplicávelNANA ácido N-acetilneuramínico; ácido siálico; SANMWC Corte Nominal de Peso molecularOD Densidade ópticaPAR Faixa aceitável provadaPlanova Filtros de remoção viral, tamanho de poro de 15 nmPP(S) Parâmetro(s) de processoPQ Qualificação de desempenhopsi Libras por polegada quadradapsid Libras por Polegada quadrada, diferencialpsig Libras por Polegada quadrada; CalibreQFF Q Sepharose® Fast FlowQXL Carga extrema de Q SefaroserPA Proteína recombinante A Sepharose Fast FlowSA Ácido siálico; ácido N-acetilneuramínico; NANASDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida/dodecil sulfato de sódioSOP Procedimento de operação padrãoTris Tris (HidroximetiI) ÁminometanoTriton X-1OO t-Octilfenoxipolietóxietanol; terc-octilfenil éter de polietileno glicolUF UltrafiltraçãoUV Ultravioletav/v Volume por VolumeVF Filtração viral; filtração em nanômetroVl Inativação viral

Exemplo 1: Confirmação da seqüência de codificação de CTLA4-lg noplasmídeo pcSDhuCTLA4-lg

A seqüência de ácido nucleico anotada do gene de CTLA4-lgpresente em pcSDhuCTLA4-lg e a seqüência de aminoácido deduzida cor-respondente de CTLA4-lg são mostradas na figura 1. O ácido nucleico depcSDhuCTLA4-lg foi transfectado em células de CHO de forma a gerartransfectantes estáveis que pudessem expressar moléculas de CTLA4-lg(veja Exemplo 12). Os transfectantes foram selecionados e determinadostransfectantes foram subclonados ou expandidos para gerar linhagens decélulas clonais.

Análise dos dados de seqüência de DNA confirmaram que asjunções criadas durante a construção do plasmídeo eram conforme projeta-do e que os iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos usados na reação emcadeia de polimerase geraram a seqüência sinalizadora de oncostatina Mcorreta a montante da seqüência de CTLA4-lg. As alterações desejadas decisteína para serina (nas posições 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 2) na re-gião de dobradiça da proteína de fusão foram confirmadas. Esses resíduosde aminoácido são designados em negrito com um asterisco na figura 1.

Uma alteração de aminoácido adicional de prolina para serina na posição174 de SEQ ID NO: 2 foi também detectada. Essa alteração foi introduzidadurante a síntese de cDNA de IgGi através da reação em cadeia de polime-rase. Esse resíduo de aminoácido é também designado em negrito com umasterisco na figura 1.

A análise dos dados de seqüência de DNA identificou uma dife-rença adicional quando comparado com as seqüências de nucleotídeo publi-cadas da região constante de IgGi humana e Humano CTLA4. O códon noaminoácido 110 da região de codificação de CTLA4 foi identificado comoACC (treonina) ao invés de GCC (alanina).

Exemplo 2: Formulação de CTLA4-lg

A composição de CTLA4-lg para injeção, 250 mg/frasco, é umIiofilizado estéril, não-pirogênico para administração intravenosa (IV). Umapopulação de moléculas de CTLA4-lg é embalada em frascos de vidro comtubulação de sílex do Tipo I de 15 cc. Cada frasco é tampado com uma rolharevestida com fluoro-resina de butila cinza Daikyo D-21-7-S/B2-TR de 20mm e vedado com uma vedação flip-off branca de alumínio de 20 mm.Cada frasco de uso único contém 250 mg de composição deCTLA4-lg a qual é constituída com Água estéril para injeção, USP e aindadiluída com Cloreto de sódio para Injeção a 0,9%, USP, no momento de uso.

A composição de CTLA4-lg para injeção, 250 mg/frasco e a função de cadacomponente é listada na tabela abaixo.

Tabela 8: Composição de CTLA4-lg_

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b Esses componentes estão presentes na composição de solução de C-TLA4-lg

A composição de CTLA4-lg contém aproximadamente 50 mg/mLde CTLA4-lg em tampão de fosfato de sódio a 25 mM e cloreto de sódio a 50mM em um pH de 7,5. Durante desenvolvimento anterior, esse sistema tam-pão foi selecionado baseado na avaliação da estabilidade física e química deCTLA4-lg como uma função do pH, tipo de tampão, concentração de tampãoe concentração de cloreto de sódio. A estabilidade de soluções de CTLA4-lgfoi investigada na faixa de pH de 5 a 9. Os resultados indicaram que a for- mação de espécies de elevado peso molecular era pH-dependente e a faixade pH de estabilidade máxima estava entre 7 e 8. Em uma determinaçãodistinta, o efeito do tipo e concentração de tampão foi avaliado, onde desco-briu-se que a composição de CTLA4-lg era igualmente estável no tampão defosfato de sódio ou tampão de tris em um pH de 8. Adicionalmente, as con-centrações de tampão entre 10 a 100 mM não têm qualquer impacto sobre aestabilidade da composição de CTLA4-lg a 2°-8°C. Similarmente, a presen-ça de cloreto de sódio em uma concentração entre 30 a 500 mM não teveefeito sobre a estabilidade do estado em solução da composição de CTLA4-lg armazenada a 2°-8°C.

Baseado nesses resultados, a composição de CTLA4-lg a 10mg/mL em tampão de fosfato de sódio a 25 mM e cloreto de sódio a 50 mMem um pH de 7,5 foi selecionada para formulação com uma resistência de50 mg/frasco. A concentração de CTLA4-lg foi depois alterada para 50mg/mL na mesma composição de tampão para permitir o desenvolvimentodas composições de CTLA4-lg com resistências de 200 e 250 mg/frasco.

CTLA4-lg para injeção é formulada com maltose além de tam-pão de fosfato de sódio e cloreto de sódio. A função dos excipientes usadosnesse produto é listada na tabela acima.

A presença de sais inorgânicos, tais como os componentes detampão cloreto de sódio e fosfato de sódio, reduz a temperatura de transiçãodo vidro (Tg') do sistema congelado. Além disso, fosfato de sódio dibásico, oqual é formado in situ em um pH de 7,5, sofre cristalização preferencial du-rante congelamento, o que reduz o pH do micro-ambiente da solução conge-lada. Baseado nessas razões, as quantidades mínimas de tampão de cloretode sódio e fosfato de sódio foram selecionadas para minimizar seu impactosobre o processo de liofilização. Maltose é adicionada como um estabilizanteo qual atua como um crio- e lio-protetor durante liofilização e quando de sub-sequente armazenamento do produto de fármaco, respectivamente. A com-posição de CTLA4-lg para injeção, 250 mg/frasco, é um frasco estéril paraúnico uso sem conservantes antimicrobianos.Exemplo 3: Análise do teor de carboidrato de uma composição de C-TLA4-lg

A finalidade do método é proporcionar perfis cromatográficos deoligossacarídeos de CTLA4-lg N-ligados. Esse procedimento pode ser usadopara obter a proporção molar de ácido N-acetil neuramínico (NANA) e ácidoN-glicolil neuramínico (NGNA) para proteína em amostras de CTLA4-lg (li-gação total mais livre). NANA e NGNA são duas formas de ácido siálico. Aglicosilação sobre a proteína de CTLA4-lg contém oligossacarídeos N-ligados. Por exemplo, esses oligossacarídeos podem ser liberados atravésde hidrólise enzimática com PNGase F durante o curso de 22 horas. O perfilde oligossacarídeos livres é obtido usando cromatografia de troca de ânionsem pH elevado empregando detecção eletroquímica. Perfis de carboidratopara os oligossacarídeos N-Iigados foram avaliados usando Cromatografiade troca de ânions em pH elevado com Detecção amperométrica pulsada(HPAEC-PAD). Esses perfis foram confirmados e informação estrutural foiobtida usando cromatografia em carbono grafitado poroso (PGC) acopladacom MS. Ambas as técnicas e os resultados são descritos nessa seção. Es-se procedimento é exemplificativo para CTLA4-lg de SEQ ID NO:

Isolamento de oligossacarídeo N-ligado: Clivagem de oligos-sacarídeos asparagina-ligados (N-Iigados) de CTLA4-lg foi realizado atravésde hidrólise enzimática usando PNGase F. Para realizar a desglicosilação,CTLA4-lg foi primeiro reduzida e desnaturada: 1-2 mg de CTLA4-lg em 176μL de tampão de fosfato de sódio a 5 mM contendo SDS a 0,5% e 1% debeta-mercaptoetanol foram aquecidos a 100°C durante 2 minutos, então,deixados resfriar para a temperatura ambiente. À mistura esfriada, 16 μί deNP-40 a 10% foram adicionados. A amostra foi bem misturada e 40 μΙ_ dePNGase F (50.000 U/mL, em tampão de fosfato de sódio a 50 mM) foramadicionados. A amostra foi bem misturada e incubada a 38° C durante 24horas. Os oligossacarídeos enzimaticamente liberados (glicanas) foram puri-ficados através de cromatografia de líquido de alto desempenho em fasereversa (HPLC) usando uma coluna Phenomenex Luna C18 (4,6 χ 150 mm;5 μL) acoplada a uma coluna Thermo HyperCarb (4,6 χ 100 mm; 5 μί,) emuma taxa de fluxo de 1,0 mL/minuto; o cromatágrafo usado para o isolamen-to foi um Waters Alliance 2695 equipado com um detector Waters 2996. Ascolunas foram primeiro equilibradas com ácido trifluoroacético a 0,05%(TFA). Após injeção da amostra, um gradiente de acetonitrila foi iniciado,terminando a 15 minutos com uma composição de solvente de TFA a 0,05%em acetonitrila a 12%. As glicanas foram, então, eluídas da coluna Hyper-Carb com um gradiente de etapa para TFA a 0,05% em acetonitrila a 60%.

As glicanas foram coletadas enquanto se monitorava através de absorbânciade UV a 206 nm e foram concentradas até secagem sob vácuo. Antes desubsequentes injeções, a coluna Luna C18 foi limpa com TFA a 0,05% emacetonitrila a 40%, isopropanol a 40%, 20% de água.

Preparo de Solução de estoque de NANA (ácido N-acetilneuramínico) (1 mg/mL). Importante: Antes de pesagem, deixar que o pa-drão de NANA aqueça para a temperatura ambiente. Falha em assim fazerresultará em condensação de água no padrão. Abrir apenas o suficiente pa-ra obter a quantidade desejada, então, revedar a garrafa hermeticamente eretornar para o congelador, armazenando com dessecante. Pesar precisa-mente entre 3 e 10 mg do ácido N-acetil neuramínico. Registrar para apro-ximadamente 0,1 mg. Transferir para um recipiente de tamanho apropriadose pesagem é feita usando papel/bote de pesagem. Adicionar uma quanti-dade suficiente de água com grau para HPLC para proporcionar uma con-centração de 1 mg/mL de solução. Misturar com uma barra de agitação ouatravés de turbilhonamento até dissolvida. Armazenar entre 2 e 8°C duranteaté 3 meses em um tubo de polipropileno.

Preparo de Solução de estoque de NGNA (ácido N-glicolilneuramínico) (1 mg/mL) Importante: Antes de pesagem, deixar o padrão deNGNA aquecer para a temperatura ambiente. Falha em assim fazer resultaráem condensação de água no estoque. Abrir apenas o suficiente para obter aquantidade desejada, então, revedar a garrafa hermeticamente e retornarpara o congelador, armazenando com dessecante. Pesar precisamente en-tre 3 e 10 mg (registrar para aproximadamente 0,1 mg de ácido N-glicolilneuramínico. Registrar para aproximadamente 0,1 mg. Transferir para umrecipiente de tamanho apropriado se pesagem é feita usando papel/bote depesagem. Adicionar um volume apropriado de água com grau para HPLCpara proporcionar uma concentração-alvo de 1 mg/mL de solução. Misturarcom uma barra de agitação ou através de turbilhonamento até dissolvida.Armazenar entre 2 e 8°C durante até 3 meses em um tubo de polipropileno.

Solução de adequabilidade de sistema. Adicionar 0,050 mL decada de soluções de estoque de NANA e NGNA a 1 mg/mL a 0,900 mL deágua com grau para HPLC em um recipiente apropriado. Misturar através deturbilhonamento. Armazenar entre 2 e 8°C durante até 3 meses.

Solução de trabalho de ácido N-acetil neuramínico (0,050mg/mL). Medir precisamente 0,050 mL de solução de estoque de NANA a 1mg/mL e adicionar a 0,950 mL de água com grau para HPLC. Misturar atra-vés de turbilhonamento. Preparar em duplicata no momento de uso.Solução de trabalho de ácido N-glicolil neuramínico (0,050mg/mL). Medir precisamente 0,050 mL de solução de estoque de NGNA a 1mg/mL e adicionar a 0,950 mL de água com grau para HPLC. Misturar atra-vés de turbilhonamento. Preparar em duplicata no momento de uso.

Preparo de Amostras e branco de hidrólise. Obter a concen-tração de proteína para material de CTLA4-lg do Certificado de Análise(COA). Preparar uma única amostra de branco de hidrólise através da adi-ção de 0,190 mL de água com grau para HPLC a um tubo para microcentrí-fuga de 1,5 mL. Preparar duas soluções de amostra a 1 mg/mL e material dereferência de CTLA4-lg usando água com grau para HPLC. Misturar atravésde turbilhonamento.

Hidrólise de Amostras, material de referência de CTLA4-lg ebranco de hidrólise. Realizar a hidrólise sobre preparados em duplicada dematerial de referência e amostras em tubos para microcentrífuga de 1,5 mL.

Nota: É importante usar tubos para microcentrífuga os quais se encaixarãocompletamente no bloco de aquecimento. Adicionar 0,010 mL de H2SO4 a 1M a 0,190 mL de diluições de amostra a 1 mg/mL e material de referência deCTLA4-lg e branco de hidrólise. Misturar através de turbilhonamento e pren-der a tampa com uma trava para tampa ou fita. Colocar os tubos para micro-centrífuga em um bloco de aquecimento a 80°C ± 2°C durante 1 hora ± 2min. Após incubação, remover os tubos do bloco de aquecimento, colocar ostubos na microcentrífuga e centrifugar para forçar a amostra para o fundo dotubo. Transformar em alíquotas soluções hidrolisadas em frascos para a-mostrador automático e colocar em um amostrador automático para injeção.

Condições do instrumento. Preparar o sistema de cromatogra-fia de líquido de elevado desempenho (HPLC). Ajustar as condições a se-guir. Equilibrar a coluna durante pelo menos uma hora em uma taxa de fluxode 0,6 mL/min e uma temperatura de 40°C.<table>table see original document page 308</column></row><table>

Adequabilidade de sistema. Começar análise com uma injeçãode fase móvel como o Placebo do Instrumento para avaliar a linha de basedo sistema, a qual deverá ser uniforme e estável. Se a linha de base não éuniforme e estável, injeções de placebo adicionais deverão ser feitas. Nota:

Um desvio da linha de base não deverá exceder a 0,25 AU. Realizar seisinjeções repetidas de Solução de adequabilidade de sistema. Calcular a Re-solução (R) e placas teóricas (N).

Usando a primeira injeção de adequabilidade de sistema, calcu-lar o número de placas teóricas (N) usando a seguinte equação:

Número de placas teóricas ^^^

onde:

N = contagem de placa teórica

T = tempo de retenção de pico de NANA, em minutos

W = largura de pico de NANA na linha de base, em minutos

Calcular os mois de NANA e NGNA no material de referência deCTLA4-lg e amostras. Padrões de NANA e NGNA são injetados no início eno final de cada operação. Calcular a média das contagens de área para asinjeções repetidas de NANA e NGNA. Usar essa área na seguinte equação:mols de NANA ou NGNA no material de referência Abatacept ouamostra = (X) (Y)(Z)

X = mols de NANA ou NGNA em soluções de trabalho calcula-dos na Seção 7.3.1

Y = contagens de área de NANA ou NGNA no material de refe-rência abatacept para amostra para cada preparado (Nota: veja Seção 7.2 efigura 3 para picos para integrar NANA)

Z = área média de NANA ou NGNA repetidos em soluções detrabalho

Em uma modalidade, a resolução entre os picos de NGNA eNANA deve ser >1,3. A contagem de placa teórica deve ser > ou = a 4000. Areprodutibilidade de injeção de adequabilidade de sistema avaliada como %de RSD das contagens de área de pico de NANA deve ser <3%. A contagemde placa teórica deve ser >4000. A reprodutibilidade de injeção de adequabi-lidade de sistema avaliada como % de RSD das contagens de área de picode NANA deve ser <3%.

Definição de perfil de oligossacarideo N-Iiqado através deCromatografia de troca de ânions em pH elevado com Detecção ampe-rométrica pulsada (HPAEC-PAD): HPAEC de oligossacarídeos isolados foirealizada sobre um sistema de cromatografia consistindo em um Waters Alli-ance equipado com um Detector eletroquímico Waters 464 utilizando umacoluna de troca de ânions Dionex CarboPack PA1 (4 χ 250 mm) e uma colu-na de proteção Dionex CarboPack. As amostras de oligossacarideo forameluídas usando um gradiente de acetato de sódio em hidróxido de sódio a200 mM (aumentando a concentração de acetato de sódio de 0 mM no mo-mento de injeção para 225 mM a 60 minutos). O detector eletroquímico foioperado sob o modo de pulso com potenciais de pulso E1 = 0,05V (t1 = 0,4 s),S = 0,75V (t2 = 0,2 s), E3 = -0,15V (t3 = 0,4 s). A célula de detecção eracomposta de um eletrodo de trabalho de ouro, um contra eletrodo de açoinoxidável e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata.

Esse método descreve o procedimento para determinar o perfilpor HPAEC (Cromatografia de troca de ânions em pH elevado) de oligossa-carídeos N-Iigados liberados de proteína em amostras de CTLA4-lg. A finali-dade do método é proporcionar perfis cromatográficos de CTLA4-lg, taiscomo oligossacarídeos N-Iigados em Substância de Fármaco de CTLA4-lg aqual pode ser usada para análise comparativa entre diferentes composiçõesde moléculas de CTLA4-lg. A glicosilação sobre a proteína de CTLA4-lg con-tém oligossacarídeos N-ligados. Esses oligossacarídeos são liberados atra-vés de hidrólise enzimática com PNGase F (Peptídeo: N-Glicosidase F) du-rante o curso de 22 horas. O perfil de oligossacarídeos livres é obtido usan-do cromatografia de troca de ânions em pH elevado empregando detecçãoeletroquímica.

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Perfis de oligossacarídeo de Substância de Fármaco são avalia-dos contra amostras de material de referência concorrentemente operadas.Os resultados são reportados como desvio percentual de domínios e picosselecionados dos mesmos picos nos padrões de referência.Condições de cromatografia para perfil de oligossacarídeo atra-vés de Uma cromatografia de troca de íons

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NOTA: Equilibrar a coluna e detector com a fase móvel inicial na taxa defluxo de análise durante aproximadamente 2 horas ou até a linha de baseestar estável antes de fazer as injeções.Temperatura do amostrador automático ajustadapara: 4°C

Volume de injeção 60 μΐ.

Tempo de operação 100 minutos

Tempos de retenção aproximados (RT; minutos)de picos dominantes em cada Domínio (veja figura1); valores podem variar, dependendo do RT doPadrão de Adequabilidade de sistema (SS)

RTs aproximados (min)

SS: 18,5Pico 1A: 20,0Pico 1B: 20,8Pico 1C: 21,4Pico 1D: 22,4Pico 1E: 23,1Pico 2 31,5Pico 3: 44,8Pico 4: 58,5

Preparo de Fases móveis para definição de perfil de carboi-drato de oligossacarídeo por HPAEC

Eluente 1 de HPAEC: acetato de sódio a 500 mM (NaOAc).

Pesar 20,51 ± 0,05 g de Acetato de sódio (anídrico) em um cilindro graduadode 500 mL contendo 400 ml_ de água com grau para HPLC. Levar o volumepara 500 mL com água com grau para HPLC e agitar durante 5 minutos u-sando uma pipeta sorológica de plástico até completamente misturado. Fil-trar a solução através de um filtro de náilon de 0,2 μιτι. Transferir para umagarrafa de eluente de 1 L. Tampar a garrafa frouxamente e purgar com héliodurante 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Ar-mazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três se-manas.

Eluente 2 de HPAEC: hidróxido de sódio a 400 mM (NaOH).

Usando um cilindro graduado de 1 L, medir 960 mL de água com grau paraHPLC e transferir para uma garrafa de eluente de 1 L limpa. Usando umapipeta sorológica de plástico, adicionar 40,0 mL de NaOH a 10 N diretamen-te na garrafa de eluente e misturar o eluente através de turbilhonamento.Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20 minutos. Aper-tar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em tem-peratura ambiente sob hélio durante até três semanas.

Eluente 3 de HPAEC: água com grau para HPLC. Encher umagarrafa de eluente de 1 L com aproximadamente 1 L de água com grau paraHPLC. Colocar a garrafa de eluente sobre o sistema, tampar frouxamente epurgar durante aproximadamente 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizara garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hé-lio durante até três semanas.

Tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%,

PH = 7,5,

NaH2PO4^H2O 6,9 g

NaN3 0,2 g

H2O volume final de 1,0 litro

Pesar 6,9 g ± 0,1 g de NaH2PO4 · H2O e 0,2 g NaN3 e dissolverem 800 mL de H2O com grau para HPLC em uma garrafa de reagente usan-do mistura contínua com uma barra de agitação. Usando um medidor de pH,ajustar o pH da solução para 7,5 usando NaOH a 10 M. Levar o volume finalpara 1,0 litro usando um cilindro graduado de 1 L. Armazenar a solução emtemperatura ambiente durante até seis meses.

Solução de trabalho de enzima PNGase F em tampão de fosfatode sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5.

Tampão de fosfato de sódio a 50 mMazida de sódio a 0,02%, pH = 7,5 1,8 mL

PNGase F do Kit, Catálogo No. P0704L 0,2 mLPipetear 1,8 mL de tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azidade sódio a 0,02%, pH de 7,5 em um frasco criogênico de 1,8 mL. Adicionar0,2 mL de PNGase F do kit e misturar totalmente. Armazenar a solução a-20°C ou pelo menos durante até seis meses. A solução pode ser transfor-mada em alíquotas antes de congelamento.Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo. Solução deestoque de estaquiose (1,25 mg/mL). Pesar 0,125 g de Estaquiose sobre umpapel de pesagem. Usar uma balança analítica e transferir para um frascovolumétrico de 100 ml_. Encher até a marca com água com grau para HPLCe misturar totalmente. Transformar em alíquotas em porções de 2 mL emcriofrascos Nalgene. Armazenar a solução a -20°C ou pelo menos duranteaté seis meses.

Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose (12,5μg/mL). Pipetear 1 mL do estoque a 1,25 mg/mL em um frasco volumétricode 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLC e misturartotalmente. Transformar em alíquotas em porções de 200 μί em tubos paramicrocentrífuga de 0,65 mL. Colocar os tubos em uma caixa de armazena-mento apropriadamente rotulada. Armazenar a Solução de Adequabilidadede Sistema a -20°C ou pelo menos durante até seis meses.

PREPARO DE PADRÃO E AMOSTRA

Preparo de Material de Referência. A um frasco contendo 1 mgde RapiGest SF liofilizado, adicionar 625 μί de tampão de fosfato de Na a50 mM contendo azida de Na a 0,02%, pH de 7,5. A um tubo de Eppendorfde 0,65 mL, adicionar 120 μί do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar40 μL de Material de Referência (~ 50 mg/mL). A concentração final de Ra-piGest SF deverá ser 0,12% em peso/v. Adicionar 40 μί da solução de tra-balho de PNGase F, misturar totalmente, centrifugar a amostra e colocar a38 ± 2°C durante 22 ± 2 horas (banho de água ou o compartimento do amos-trador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro para centrífugaMicrocon YM-100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Colocar 200μL de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através de centrifuga-ção durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado combinado aturbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra durante 10segundos. Usando a pipetear transferir a solução resultante 380 μί) paraum frasco para amostrador automático de HPLC de recuperação total (item1.15).

Preparo de amostra. A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adi-cionar 120 μΙ_ do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 μΙ_ de amos-tra de proteína ( esse volume deverá ser igual a entre 1 e 2 mg de CTLA4-lg). A concentração final de RapiGest SF deverá ser 0,12% em peso/v. Adi-cionar 40 μΙ_ da solução de trabalho de PNGase F e misturar totalmente a-través de turbilhonamento durante 10 segundos. Centrifugar a amostra ecolocar a 38 ± 2°C durante 22 + 2 horas (banho de água ou o compartimentodo amostrador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro paracentrífuga Microcon YM-100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos.Colocar 200 μΙ_ de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através decentrifugação durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado com-binado a turbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra du-rante 10 segundos. Transferir a solução resultante 380 uL) para um frascopara amostrador automático de HPLC de recuperação total (item 1.15).

ADEQUABILIDADE DE SISTEMA

Estabilização da célula do detector eletroquímico. Injetar 30μl do Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo de Estaquiose (12,5pg/mL). Assegurar que a altura de pico para estaquiose é > 800 nA. Assegu-rar que não há interferência elétrica excessiva da célula e que a linha de ba-se é uniforme. Um cromatograma de adequabilidade de sistema representa-tivo é mostrado na figura 2. Se a sensibilidade à estaquiose ou a linha debase é inaceitável, verificar a composição de tampão, limpar o eletrodo ousubstituir o eletrodo. Se interferência excessiva está presente, verificar a cé-lula para assegurar remoção de todas as bolhas de ar. Re-estabilizar a célu-la e reinjetar padrão de estaquiose.

Placas teóricas (N). Determinar o número de placas teóricas(N) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito a-través do sistema de análise de dados Empower ou pode também ser feitomanualmente.

<formula>formula see original document page 315</formula>

onde:

t: tempo de retenção medido a partir do momento de injeçãoaté o momento de eluição de pico na altura máximaW: largura de pico aravés de extrapolação dos lados para alinha de base.

N deve ser > 6000. Se a contagem de placa é menos de 6000,ajustar o gradiente de operação ou substituir a coluna.

Fator de configuração (T). Determinar o fator de configuraçãode coluna (T) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Issoé feito através do sistema de análise de dados Empower ou pode tambémser feito manualmente.

T = (W0l05/2f)

onde:

W0, os', largura de pico a 5% de altura (0,05h).

f: a medida (largura) a borda frontal de pico a W0,05 para oápice do pico.

T deve ser < 1,2. Se o fator de configuração é mais de 1,2, veri-ficar a composição de tampão, substituir a coluna ou limpar a coluna con-forme indicado e reinjetar Padrão de Adequabilidade de Sistema.

Verificação do Tempo de Retenção do Padrão de Adequabi-Iidade de Sistema de Estaquiose. O tempo de retenção é dependente dosistema. O Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose deverá exi-bir um tempo de retenção de 18,5 ± 2,0 minutos. Material Padrão de CTLA4-Ig. Observar o perfil de carboidrato do Material de Referência entre as pri-meiras faixas injetado antes de injeção de amostras. O perfil de carboidratodeverá ser similar àquele mostrado na figura 1. Os tempos de retenção ab-solutos são dependentes do sistema. Assegurar que a diferença nos temposde retenção entre os primeiros picos no Domínio I (Pico 1A) e o principal pi-co no Domínio Ill (Pico 3) está entre 22 minutos e 28 minutos. Se delinea-mento dos picos não se assemelha àquele obtido na figura 1, tomar as a-ções apropriadas (por exemplo, verificar a função do instrumento, limpar acoluna, verificar/substituir tampões, substituir a coluna) e reavaliar. O proce-dimento a seguir pode ser usado para limpar a coluna: desligar a célula célu-la e limpar a coluna com Eluente 1 a 80%, Eluente 2 a 20% durante 5 minu-tos, seguido por Eluente 1 a 50%, Eluente 2 a 50% durante 10 minutos. Re-equilibrar a coluna e célula (com a célula ligada) em condições iniciais e re-avaliar.

SEQÜÊNCIA DE INJEÇÃO

Ajustar a seqüência de injeção de oligossacarídeos isolados co-mo segue :

Padrão de estaquiose (30 μL)

Material de Referência (60 μL)

Amostra(s) (60 μL)

Material de Referência (60 μL)

É recomendado que < cinco amostras sejam operadas entre in-jeções de Material de Referência entre as faixas.

ANÁLISE DE DADOS

Processamento de cromatogramas. Processar os cromato-gramas para o Material de Referência e amostras no Empower. Ajustar pa-râmetros de integração de modo que o delineamento de pico e a linha debase sejam similares àqueles mostrados na figura 76. Pode ser preciso co-locar as linhas de integração manualmente. Realizar cálculos para áreas deDomínio relativas e áreas de pico relativas, conforme mostrado. Determinaros valores médios para esses parâmetros para o material de CTLA4-lg epara cada amostra se injeções repetidas foram feitas. Para o Material deReferência, determinar o desvio relativo para os Domínios I, II, III, Picos 1A e1B para cada réplica com relação à média de todas as réplicas.Comparação de Perfis de Amostra com perfis de Material de ReferênciaComparação Visual. Determinar se as amostras e Material deReferência têm o mesmo número de Domínios e picos primários. Picos pri-mários são aqueles picos rotulados na figura 76 (Picos 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3e 4).

Comparação de Quantificação Relativa. Comparar as áreasrelativas de amostras (Domínios I, II e III e Picos 1A e 1B; se injeções repeti-das de amostras foram feitas, usar seus valores médios) com as áreas rela-tivas médias das injeções de CTLA4-lg entre as faixas. Determinar a dife-rença relativa dessas áreas a partir dos valores médios de Material de C-TLA4-lg.

Cálculos:

Área de Domínio % (Área de Domínio relativa). Calcular a á-rea de Domínio % para os Domínios dos perfis para o Material de Referênciae amostras. Refira-se à figura 76 para padrão de áreas de Domínio. Seguin-do o exemplo na figura 76, calcular as proporções percentuais de domíniousando a informação e fórmula a seguir (tempos de retenção são dependen-tes do sistema e refletem os resultados na figura 76):

Domínio I: Soma das áreas de pico em tempos de retenção a-proximados de 18-24 minutos (Picos 1A-1E)

Domínio II: Soma dos picos de 26-38 minutos

Domínio III: Soma dos picos de 39-50 minutos

Domínio IV: Soma dos picos de 51-64 minutos

Domínio V: Soma dos picos de 65-75 minutos

NOTA: Janelas de tempo de retenção para os domínios desviar-se-ão deacordo com variações no desempenho cromatográfico diário. Ajustar os tem-pos consequentemente.

Área de domínio individual

Área de domínio % = - χ 100%

Soma de todas as áreas de domínio

Para os Domínios l-lll, calcular também os valores médios nasinjeções de Material de Referência entre as faixas, bem como nas amostras,se injeções repetidas foram feitas.

Área de pico % (Área de pico relativa). Calcular a Área de pico% para os Picos 1A, 1B, 1C e 3 dos perfis para o Material de Referência eamostras. Refira-se à figura 1 para padrão de áreas de pico; tempos de re-tenção são dependentes do sistema. Calcular as proporções percentuais depico usando a informação e fórmula a seguir:

Área de pico individual

Área de pico individual % =- χ 100%

Soma de todas as áreas de domínio

Para cada um dos Picos 1A e 1B, calcular também os valoresmédios nas injeções de Material de Referência entre as faixas, bem comonas amostras, se injeções repetidas foram feitas.

Cálculo da diferença percentual dos valores médios de Ma-terial de Referência. Usar a seguinte fórmula para calcular diferenças per-centuais nas áreas relativas médias dos Domínios I—III, Picos 1A e 1B deamostras comparado com Material de Referência:

Dif % = |RM - S| / RM χ 100

onde:

RM = valor de área relativa média de interesse para Material deReferência

S = valor de área relativa média de interesse para a amostra

| | = valor absoluto

Valores exemplificativos. Para que uma operação seja aceitá-vel, os valores exemplificativos devem ser reunidos e todas as injeções rele-vantes para a amostra devem ter ocorrido com sucesso. Adicionalmente,para cada uma das injeções de Material de Referência entre as faixas, asáreas de Domínio % para os Domínios I, Il e Ill e áreas de pico % para osPicos 1A e 1B devem estar dentro de 15% de seus valores médios.

Análise através de HPAEC-PAD: Oligossacarídeos N-Iigadosforam clivados de moléculas de CTLA4-lg e analisados através de HPAEC-PAD. Oligossacarídeos eluem em quatro domínios baseado na quantidadede ácido siálico presente. Domínios foram estabelecidos baseado na migra-ção de padrões de oligossacarídeo e foram confirmados através de MS. ODomínio I representa espécies asialiladas. Os Domínios II, Ill e IV represen-tam espécies mono-, di- e trissialiladas, respectivamente. De forma a carac-terizar a estrutura dos oligossacarídeos nos três sítios N-ligados, peptídeosT5, T7 e T14 foram individualmente isolados (refira-se à Tabela 59 para i-dentidade desses peptídeos). Isso foi realizado usando digestão tríptica deCTLA4-lg e coleta manual de picos correspondendo a esses três peptídeos.

Os peptídeos isolados foram tratados com PNGase F para libe-rar os oligossacarídeos, os quais foram subseqüentemente purificados e a-nalisados através de HPAEC-PAD. Peptídeo T5 não produz um bom perfil,uma vez que ele é difícil de purificar em virtude sua extrema hidrofobicidade.As quantidades de oligossacarídeos clivados são baixas em virtude da baixarecuperação desse peptídeo por meio de uma etapa de cromatografia defase reversa após digestão tríptica.

Tabela 3.2.S.3.1.1.3.T01

<table>table see original document page 320</column></row><table>

ND1 Não detectadoNE, não esperado a partir de digestão tríptica (essas massasnão foram esperadas a partir da digestão, clivagem não-específica)

a Peptideos trípticos T5, T7 e T14 têm glicosilação N-ligada. Amassa listada é aquela do peptídeo sem glicosilação.

b Peptideos trípticos T8 e T9 têm glicosilação O-ligada. A massalistada é aquela do peptídeo sem glicosilação.

Párias massas diferentes correspondendo à diferentes glicoformas de pep-tídeos glicosilados foram observadas.

Os perfis por HPAEC-PAD para todos os carboidratos N-Iigadosde CTLA4-lg e os três peptídeos são mostrados na figuras 55A-D. O painelA mostra o perfil de oligossacarídeo N-Iigado da molécula de CTLA4-lg, en-quanto que os painéis B, C e D mostram os perfis para T5, T7 e T14, respec-tivamente. A quantidados oligossacarídeos injetados para cada um dos pep-tídeos é diferente em virtude dos processos de preparo. A maioria dos oli-gossacarídeos detectados sobre o peptídeo T5 consistem dos oligossacarí-deos mono- e dissialilados. O perfil de T7 contém primariamente espécies deglicanas mono-, di- e algumas trissialiladas. Apenas uma pequena quantida-de das estruturas trissialiladas pode ser detectada sobre T5. O Peptídeo T14consiste predominantemente de oligossacarídeos asialilados e uma pequenaquantidade de oligossacarídeos mono- e dissialilados.

Os resultados obtidos através de HPAEC-PAD proporcionaminformação sobre glicosilação N-Iigada sítio-específica. Oligossacarídeos N-Iigados da região de CTLA4 de CTLA4-lg contêm uma maior proporção deespécies sialiladas do que aqueles da região Fc de CTLA4-lg.

Mapeamento peptídico com tripsina, Asp-N e tripsina/qui-miotripsina de CTLA4-lg: CTLA4-lg foi desnaturada e reduzida em tampãode Tris a 50 mM (pH de 8,0) contendo guanidina a 6 M e ditiotreitol a 5 mM(DTT). Após uma incubação de 20 minutos a 50°C, iodoacetamida (IAA) foiadicionada para uma concentração final de 10 mM para alquilar tióis livres ea incubação foi continuada durante mais 20 minutos a 50°C no escuro. Amistura alquilada e reduzida foi carregada sobre uma coluna de dessaliniza-ção (Amersham NAP-5), então, eluída no volume de vazio com Tris a 50mM, CaCb a 10 mM, pH de 8,0 ou tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pHde 7,5. Após dessalinização, CTLA4-lg reduzida/alquilada foi digerida usan-do duas diferentes proteases: tripsina ou Asp-N. Para digestão com tripsinamais cquimiotripsina, CTLA4-lg é não é reduzida nem alquilada.

Para digestão com tripsina, tripsina com grau para sequencia-mento (Roche, 2%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e incubadadurante 4 horas a 37°C. Para digestão com Asp-N1 Asp-N com grau parasequenciamento (Roche, 4%, peso/peso, enzima/ proteína) foi adicionada eincubada durante 16 horas a 37°C. Para a digestão com tripsina/quimio-tripsina, tripsina com grau para sequenciamento (Promega, 4%, peso/peso,enzima/proteína) foi adicionada e incubada durante 4 horas a 37°C, então,a-quimiotripsina foi adicionada (Sigma, 4%, peso/peso, enzima/proteína) eincubada durante 16 horas a 37° C. Todas as amostras foram colocadas emum congelador após a digestão.

As misturas peptídicas resultantes foram separadas através deeluição em gradiente a partir de uma coluna Waters Atlantis® dC18 (2,1 χ250 mm) sobre uma Workstation de HPLC Waters Alliance a 0,120mL/minuto. A coluna foi diretamente conectada ao Espectrômetro de massaWaters Micromass Q-Tof Micro® equipado com uma fonte de pulverizaçãode íons para coleta dos espectros de massa. Misturas peptídicas foram tam-bém separadas sobre uma coluna Varian Polaris C18 (4,6 χ 250 mm) a 0,7mL/minuto usando a mesma Workstation de HPLC. As colunas foram equili-bradas com solvente A (TFA a 0,02% em água) e os peptídeos foram eluí-dos aumentando a concentração de solvente B (acetonitrila a 95%/TFA a0,02% em água). Uma válvula de derivação pós-coluna foi usada para dirigir15% do fluxo para a workstation Q-Tof, a qual foi operada no modo de TOFpositivo (m/z 100-2000). A tensão de pulverização de íons típica usada foi de3000 V.

Análise de CTLA4-lg através de MS: CTLA4-lg foi diluída comTRIS a 100 mM, NaCI a 25 mM, pH de 8 para uma concentração final de 0,7mg/mL. PNGase F (New England Biolabs) foi diluída 30 vezes com TRIS a100 mM, NaCI a 25 mM, pH de 8 para uma concentração final de 17 υ/μί.Volumes iguais (60 μΐ. cada) de amostra de fermentação purificada diluída esolução de glicosidase diluída foram misturados e incubados a 37° C durante4 horas.

A CTLA4-lg desglicosilada resultante (2 μg) foi carregada sobreuma coluna de extração com cartucho em fase reversa baseada em políme-ro (copolímero de poliestireno e poli N-vinil-2-pirrolidinona) Waters Oásis®(2,1 χ 20 mm). A coluna carregada foi lavada com 5% de solvente B (solven-te A: ácido fórmico a 1% em água, solvente B: ácido fórmico a 1% em aceto-nitrila) em uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto durante cinco minutos paradessalinizar, com o eluente desviado para descarte. Ao final de 5 minutos,um gradiente rápido (5% de solvente B a 95% de solvente B em 10 minutos)começou a eluição de CTLA4-lg da coluna; aqui, o eluente foi dirigido para oespectrômetro de massa (Waters Micromass Q-Tof micro®) a 45 μί/ηιίη a-pós divisão de fluxo (sistema de cromatografia usado foi um Waters Alliance2695 equipado com um detector Waters 2996).

A tensão de capilar para o Q-Tof micro® foi ajustada a 3kV e atensão de cone de amostra a 40 V. A média para explorações a cada 0,9segundos foi calculada em uma exploração; o tempo interexploração foi de0,1 segundo. O Analisador Q-Tof explora de m/z 800 a 2500. Espectros cor-respondendo à porção maior do que metade da altura de pico máxima (nocromatograma por TIC) são combinadas usando O software Waters Mass-Lynx®. Os espectros combinados foram submetidos à deconvolução no Wa-ters MaxEntI. A resolução foi ajustada a 1 Da/Canal e o modelo de danoGaussiano uniforme foi selecionado com largura no ajuste de metade da al-tura entre 0,5-1 Da. Proporções de intensidade mínima para o pico à es-querda e o pico à direita foram ambas ajustadas a 50%.

Análise de Oligossacarídeo N-Iiqado através de Cromatogra-fia de líquido/Espectrometria de massa ÍLC/MS ) Usando um carbonografitado poroso (PGC): Oligossacarídeos isolados foram separados sobreuma coluna grafitada porosa (Thermo Hypercarb; 4,6 χ 100 mm) usando umSistema Waters Alliance 2695 HPLC equipado com um detector com conjun-to de fotodiodo Waters 2996. Separação de oligossacarídeo foi obtida usan-do um gradiente em dois estágios de proporções crescentes de acetonitrilaem TFA a 0,05%. Nos primeiros estágios do gradiente, o percentual de ace-tonitrila oscilava de 9,6% no momento de injeção para 24% a 80 minutos, nosegundo estágio do gradiente, o percentual de acetonitrila oscilava de 24% a80 minutos a 60% a 110 minutos. Uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto foiusada sempre. A corrente de eluição foi monitorada através de detecção porUV a 206 nm e analisada através de espectrometria de massa usando umWaters MicroMass Q-Tof micro® para identificação de massa.

Análise de carboidrato através do método de LC/MS PGC:Isolamento de oligossacarídeo através de desglicosilação da proteína foirealizado através de hidrólise enzimática usando PNGase F (New EnglandBiolabs, Beverly, MA). Para a desglicosilação, entre 1 e 2 mg de glicoproteí-na em 160 μl de tampão de fosfato de sódio a 50 mM contendo 0,15% (pe-so/v) de Rapigest SF (Waters Corporation) foram desnaturados aquecendo a100°C durante 2 minutos. A solução resfriada foi misturada e 40 μΐ de PN-Gase F (50.000 U/mL, em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5)foram adicionados. A amostra foi submetida a turbilhonamento, seguido porincubação a 38° C durante 24 horas. Os oligossacarídeos enzimaticamenteliberados foram purificados através de cromatografia líquida de alto desem-penho. Cromatografia de líquido em fase reversa foi realizada sobre umacoluna Phenomenex Luna 5 μL C18 (4,6 χ 150 mm, Phenomenex, Torrance1CA) acoplada a um Thermo HyperCarb 5 μι. (4,6 χ 100 mm, Phenomenex,Torrance, CA) em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. As colunas foram equili-bradas com ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA) antes de injeção. Após inje-ção de amostra (150 μL da mistura digerida), um gradiente de acetonitrila foiiniciado terminando a 15 minutos e uma composição de solvente de TFA a0,05% em acetonitrila a 12%. As glicanas foram, então, eluídas da colunaHyperCarb através de lavagem com TFA a 0,05% em acetonitrila a 60%. Asglicanas foram detectadas através de absorbância de UV a 206 nm. Picoseluídos de lavagem da coluna Hypercarb foram coletados e concentradosaté secagem sob vácuo. Antes de subsequentes injeções, a coluna LunaC18 foi limpa com TFA a 0,05% em acetonitrila a 40%, isopropanol a 40%,20% de água.

Definição de perfil dos oligossacarídeos isolados com PGC

O sistema usado para cromatografia PGC dos oligossacarídeosisolados consistia de um Waters Alliance equipado com um detector comconjunto de fotodiodo Waters 2996 utilizando uma coluna Hypercarb (2,1 χ100 mm). As amostras de oligossacarídeo foram eluídas usando um gradien-te de acetonitrila.

Eluição em fase móvel ácida: Gradiente de acetonitrila emácido trifluoroacético a 0,05% (TFA). Um gradiente em dois estágios deacetonitrila crescente foi usado para a separação cromatográfica dos oligos-sacarídeos. O gradiente linear inicial de volume percentual crescente de ace-tonitrila de 9,6% no momento de injeção para 24% a 80 minutos é seguidopor um segundo gradiente de volume percentual crescente de acetonitrila de24% a 80 minutos para acetonitrila a 60% a 110 minutos. Uma taxa de fluxode 0,15 ml/min foi usada por todo o gradiente. A corrente de eluição foi moni-torada a 206 nm com um detector de UV Waters, seguido por um MicromassQ-Tof Micro para identificação de massa. Os parâmetros de ionização para asonda de ESI foram ajustados como segue : Tensão de capilar = 3 kV, Ten-são de cone = 45 V, Temperatura da fonte de 80° C e Temperatura de des-solvatação de 175° C.

Eluição em fase móvel básica: Um gradiente de acetonitrila emhidróxido de amônio a 0,4% (NH4OH) foi usado para a separação cromato-gráfica dos oligossacarídeos. Um gradiente linear de volume percentualcrescente de acetonitrila de 10,4% no momento de injeção para 28% a 150minutos em uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min foi usado para produzir o per-fil. A corrente de eluição foi monitorada a 206 nm com um detector de UVWaters, seguido por um Micromass Q-Tof Micro para identificação de mas-sa. Os parâmetros de ionização para a sonda de ESI foram ajustados comosegue : Tensão de capilar = 3 kV, Tensão de cone = 45 V, Temperatura dafonte de 80° C e Temperatura de dessolvatação de 175° C.

Obtenção direta de perfil de misturas de oligossacarídeodigeridas com PGC: O sistema usado para cromatografia PGC de misturasde oligossacarídeo digeridas consistia de um Waters Alliance adaptado comuma coluna grafitada porosa Luna C18 e Hypercarb (4,6 χ 100 mm, Ther-mo). O sistema tinha uma interface com um detector com conjunto de fotodi-odo Waters 2996 e um Q-ToF Micro (Micromass). Desglicosilação de proteí-na foi realizada através de hidrólise enzimática usando PNGase F. Para adesglicosilação, entre 1 e 2 mg de glicoproteína em 160 μΙ_ de tampão defosfato de sódio a 50 mM contendo 0,15% em peso de Rapigest SF (WatersCorporation), foram desnaturados aquecendo a 100° C durante 2 minutos. Asolução resfriada foi bem misturada e 40 μΙ_ de PNGase F (50.000 U/mL, emtampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5) foram adicionados. A amos-tra foi misturada e, então, incubada a 38° C durante 24 horas. O perfil deoligossacarídeos enzimaticamente liberados foi obtido através de cromato-grafia de líquido de elevado desempenho. Cromatografia de líquido em fasereversa foi realizada sobre uma coluna Phenomenex Luna 5 μΙ C18 (4,6 χ150 mm) acoplada a uma coluna Thermo HyperCarb 5 μί (4,6 χ 100 mm)em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. As colunas foram equilibradas comácido trifluoroacético a 0,05% (TFA). Após injeção de amostra (150 μί demistura digerida) um gradiente de acetonitrila foi iniciado, terminando a 11minutos e uma composição de solvente de TFA a 0,05% em 9% acetonitrila.

Uma troca de coluna foi usada para isolar a coluna Hypercarb e as glicanassão, então, eluídas da coluna HyperCarb com um gradiente linear de percen-tual crescente de acetonitrila. Um gradiente inicial de percentual crescentede acetonitrila de 9% no momento de injeção para 36% a 160 minutos foiusado. O segundo gradiente envolveu um volume percentual crescente deacetonitrila de 36% a 160 minutos para acetonitrila a 60% a 170 minutos.

Uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min foi usada por todos os gradientes de elui-ção. As glicanas foram detectadas através de absorbância de UV a 206 nme através de Exploração por MS da faixa de massa de 400 - 3000 m/z. Osparâmetros de MS foram ajustados para os seguintes valores: Capilar 3 kV,Cone 45 V. Antes de subsequentes injeções, a coluna Luna C18 foi limpacom TFA a 0,05% em acetonitrila a 40%, isopropanol a 40%, 20% de água.

Análise através de Cromatografia em carbono grafitado po-roso: A estruturas dos oligossacarídeos dos Domínios I-IV foram investiga-das usando Cromatografia em carbono grafitado poroso (PGC) acoplada aMS. Oligossacarídeos N-Iigados foram isolados de CTLA4-lg e purificadosconforme descrito na seção HPAEC-PAD anterior. Os oligossacarídeos fo-ram analisados usando uma Hypercarb (PGC) com um detector de UV1 se-guido por Q-TOF ESI/MS. O perfil por PGC para os oligossacarídeos N-Iigados liberados de CTLA4-lg através de digestão com PNGase F é mos-trado na figura 56, com os domínios anotados. A ordem de eluição é a mes-ma conforme aquela observada em HPAEC-PAD. A estruturas obtidas sãomostradas na Tabela 60.

A nomenclatura para denominação dos oligossacarídeos mos-trados na Tabela 60 é mostrado abaixo:

<image>image see original document page 327</image>

A área sombreada de cinza mostra a estrutura central do oligos-sacarídeo N-ligado, onde P significa digestão com PNGase F e os dígitossubsequentes descrevem o número de resíduos de Manose (círculo), Fuco-se (triângulos apontando para cima), Galactose (triângulo apontando para adireita) e resíduos de ácido siálico (estrela), respectivamente. N-acetil glico-samina (GIcNAc) é representada por um quadrado.Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T02: Estruturas e massas de Oligossacarídeos N-ligados detectados em Abatecept

<table>table see original document page 328</column></row><table>Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T02: Estruturas e massas de Oligossacarídeos N-Iigados detectados em Abatecept

<table>table see original document page 329</column></row><table>

No Domínio I1 seis picos foram identificados, correspondendoaos três oligossacarídeos asialilados (estruturas P2100, P2110, P2120). Adiferença de massa de 113 Dáltons entre a estrutura prevista e a massa ob-servada é em virtude de detecção de um aduto de trifluoroácido acético(TFA). Diferentes picos com a mesma massa de 1,463 correspondendoaP2100, indica que, provavelmente, eles são diferentes anômeros.

No Domínio II, seis picos foram identificados, correspondendoaos três oligossacarídeos biantenários e triantenários (estruturas P2111,P2121 e P3131, respectivamente), cada um contendo um resíduo de ácidosiálico (ácido N-acetil neuramínico, NANA).

No Domínio III, seis picos foram identificados, correspondendoaos três oligossacarídeos biantenários, triantenários e tetra-antenários (es-truturas P2122, P3132 e P4142, respectivamente), cada um contendo doisresíduos de ácido siálico (NANA).

No Domínio IV, dois picos foram identificados, correspondendo adois oligossacarídeos triantenários e tetra-antenários (estruturas P3133 eP4133), cada um contendo três resíduos de ácido siálico (NANA).

Medição de proporção molar de mols de ácido siálico paramois de moléculas ou dímeros de CTLA4-lg através de tratamento porhidrólise ácida de moléculas de CTLA4-lg (veja figuras 25 e 26): Nessemétodo, NANA e NGNA são clivados da proteína através de hidrólise ácida.Os NANA e NGNA liberados são separados através de HPLC sobre umacoluna Rezex Monosaccharide RHM e detectados através de absorbânciade UV (206 nm). NANA e NGNA são quantificados baseado nos fatores deresposta de padões de NANA e NGNA concorrentemente operados. Os re-sultados do teste são reportados como proporções molares (MR) de NANA eNGNA, respectivamente, para proteína. Esse ensaio determina o númerototal de mols, ligados e não-ligados, de ácido siálico.

Reagente, instrumentação e condições cromatográficas u-sadas no ensaio: Tampão de operação de fase móvel de ácido sulfúrico aH2SO4 a 1M (estoque) e H2SO4 a 5 mM; solução-padrão de NANA a 1mg/ml; padrão solução de NGNA a 1 mg/ml. Módulo Alliance Chromatogra-phic System -Waters Corporation 2695 Separations com amostrador auto-mático integrado; coluna Rezex Monosaccharide RHM-8 micrômetros, 7,8 χ300 mm, Phenomenex, equipada com coluna de proteção de 7,8 χ 50 mm,Phenomenex; Detector- Detector com conjunto de fotodiodo Waters Corpo-ration 996 ou detector de absorbância com comprimento de onda duplo Wa-ters Corporation 2487.

Parâmetro cromatográficos: Fluxo - 0,600mL/min; Fase móvel- H2SO4 a 5 mM; Volume de injeção - 5 microL; Concentração-alvo - 1mg/ml; Tempo de operação -- 25min; Temperatura da coluna - 40°C; Tem-peratura do amostrador automático - 4°C; Comprimento de onda - 206 nm;Tempo de retenção de NANA (dependente do sistema) - 10,8 min (+ ou - 1min), Tempo de retenção de NGNA (dependente do sistema) - 9,8 min (+ ou-1 min.).

Padrão de Adequabilidade de Sistema: Adicionar 50 µl_ decada de NANA e NGNA a 1 mg/mL a 900 µl_ de H2O em um recipiente apro-priado. Armazenar a 4°C durante até 3 meses; solução de trabalho de ácidoN-acetil neuramínico (0,05 mg/mL); solução de trabalho de ácido N-glicolilneuramínico (0,05 mg/mL).

Hidrólise de Amostras e padrão de material de CTLA4-lg:Amostras e padrão de material de CTLA4-lg são diluídos para 1 mg/mL emH2O para hidrólise. Amostras de CTLA4-lg e padrão de material de CTLA4-lg são hidrolisados através da adição de 10 µl de H2SO4 a 1 M a 190 µl deamostras diluídas e CTLA4-lg a 1 mg/mL. Hidrólise é realizada em duplicataem tubos para microcentrífuga de 1,5 mL. As tampas são presas com umatrava para tampa ou fita. Os tubos são misturados através de turbilhonamen-to e colocados em um bloco de aquecimento a 80°C durante 1 h. Após incu-bação, os tubos são removidos do bloco de aquecimento, esfriados para atemperatura ambiente durante 3 min e colocados na centrífuga para umarápida centrifugação para coletar a amostra do fundo do tubo. Dos tubos, 50µl são transformados em alíquota da solução hidrolisada em frasco de a-mostra, a qual é colocada em um amostrador automático resfriado para inje-ção. O branco de hidrólise é feito como um preparado único através da adi-ção de 10 µl de H2SO4 a 1 M a 190 µl água em tubos para microcentrífugade 1,5 mL. O placebo é processado conforme as amostras.

Adequabilidade de sistema: Para verificar a Adequabilidade desistema, seis injeções repetidas do Padrão de Adequabilidade de Sistema (5µl cada) foram injetadas, seguido por uma injeção do branco de hidrólise (5µl). Usando a última injeção de Padrão de Adequabilidade de Sistema, aResolução (R), valores aceitáveis são maiores do que 1,3 e placas teóricas(N), a contagem de placa teórica aceitável deve ser pelo menos 4000, foramcalculadas, respectivamente. Usando as últimas cinco réplicas de adequabi-lidade de sistema, a reprodutibilidade de contagens de NANA foi calculada eo branco de hidrólise foi avaliado.

Resolução: Usando a última injeção de Padrão de Adequabili-dade de Sistema, a resolução de pico foi calculada usando a seguinte equa-ção: R = 2(T2-T1 )/(W2+W1), onde R é a resolução, T2 é o tempo de reten-ção do pico de NANA (pico 2), T1 é o tempo de retenção do pico de NGNA(pico 1), W2 é a largura na linha de base de linhas traçadas da tangente pa-ra os lados de pico 2, W1 é a largura na linha de base de linhas traçadas datangente para os lados de pico 1. A figura 25 representa uma injeção de A-dequabilidade de sistema típica.

Placas teóricas (N): Usando a última injeção de Padrão de A-dequabilidade de Sistema, a contagem de placa teórica (N) foi calculada u-sando a seguinte equação: N = 16(RT2/W), onde N é a contagem de placateórica, RT é o tempo de retenção do pico de NANA em minutos, W é a lar-gura na linha de base de linhas traçadas da tangente para os lados do picode NANA. As últimas cinco injeções do Padrão de Adequabilidade de Siste-ma foram usadas para calcular as contagens de área média e seu desvio-padrão para NANA. O desvio-padrão relativo era igual ou menos de 3%. Obranco de hidrólise estava isento de quaisquer picos significativos com otempo de retenção de NANA e NGNA.

Seqüência de injeção: Uma injeção de cada um dos padrõesde trabalho de NANA e NGNA foi injetada, seguido pelo material de amostrade CTLA4-lg hidrolisado (amostras em duplicata), seguido pelo material deCTLA4-lg hidrolisado. Após as operações com CTLA4-lg terem terminado,uma injeção de cada um dos padrões de trabalho de NANA e NGNA foi inje-tada.

Para determinar os mois de NANA ou NGNA injetados no pa-drão de trabalho, a seguinte equação é usada: mol de NANA ou NGNA =(C)(P)(I)/MW, onde C é a concentração de NANA e NGNA no padrão de tra-balho, P é a pureza do padrão, I é o volume de injeção, MW é o peso mole-cular (309,2 g/mol para NANA e 325,3 g/mol para NGNA).

Para determinar os mois de NANA e NGNA nas amostras deCTLA4-lg, a seguinte equação é usada: mois de NANA ou NGNA na amos-tra = (X)(Y)/Z, onde X é o número de mois no padrão de trabalho de NANA eNGNA, Y é as contagens médias de NANA e NGNA na amostra de CTLA4-Ig1 Z é a área média de NANA e NGNA em duplicata nos Padrões de Traba-lho. A partir das injeções em duplicata dos padrões, as contagens de área dopadrão de NANA e NGNA devem ter um RSD de menos do que 10%.

Para determinar a quantidade injetada em cada amostra, a se-guinte equação é usada: mois de proteína = (C)(D)(I)/MW, onde C é a con-centração de dímero de CTLA4-lg em g/ml (obtida a partir de análise porUV), D é a diluição para hidrólise (0,95), I é o volume de injeção (0,005 ml) eMW é o peso molecular de dímero de CTLA4-lg, conforme determinado apartir de espectrometria de massa (92,439g/mol).

A proporção molar (MR) de NANA ou NGNA para proteína deCTLA4-lg é calculada através da seguinte equação: MR = A/B, onde A é onúmero de mois de NANA ou NGNA e B é o número de mois de moléculasou dímeros de CTLA4-lg.

A proporção molar (MR) de ácido siálico, NANA e NGNA paraproteína de CTLA4-lg é calculada através da seguinte equação: MR =(A+B)/C, onde A é o número de mois de NANA, B é o número de mois deNGNA e C é o número de mois de moléculas ou dímeros de CTLA4-lg. Du-plicatas de amostras de CTLA4-lg e padrão de material de CTLA4-lg devemter um RSD de menos do que 10% em proporções molares para NANA.

Linearidade de respostas determinada através de método dehidrólise de medição do teor de ácido siálico: Respostas de NANA foramdemonstradas como sendo lineares com relação às concentrações de pa-drão de NANA na faixa de 0,5 μg/mL (padrão nominal de NANA de ~0,1% =NANA-QL) a 98,7 μg /mL (padrão nominal de NANA de -200%). Respostasde NGNA foram demonstradas como sendo lineares a concentrações depadrão de NGNA na faixa de 5,0 μg/mL (padrão nominal de NGNA de -10%)a 82,0 μg /mL (-160% padrão nominal de NGNA).Respostas de NANA de material de CTLA4-lg hidrolisado sãolineares com relação a concentrações de proteína na faixa de 0,25 mg/mL(carga nominal de CTLA4-lg de 25%) a 2,0 mg/mL de CTLA4-lg (carga no-minal de CTLA4-lg de 200%). Respostas de NGNA de material de CTLA4-lghidrolisado são lineares à concentrações de proteína na faixa de 0,25 mg/mL(carga nominal de CTLA4-lg de 25%) a 2,0 mg/mL de CTLA4-lg (carga no-minal de CTLA4-lg de 200%).

Precisão do método de hidrólise de medição do teor de áci-do siálico: Precisão foi demonstrada para material de CTLA4-lg (1 mg/mL)reforçado com padrões de NANA ou NGNA.

Precisão do método de hidrólise de medição do teor de áci-do siálico: Experimentos de validação demonstraram a precisão do instru-mento (RSD % < 3%), capacidade de repetição para o preparo de amostras(RSD % < 4%) e reprodutibilidade através de diferentes preparados de a-mostra, diferentes dias, diferentes instrumentos e diferentes análises (RSD% < 6% para NANA, % RSD < 12% para NGNA). Proporções molares deNANA e NGNA foram consideradas como sendo precisas dentro de umafaixa de 10% e 20%, respectivamente, dos resultados reportados.

Faixa do método de hidrólise de medição do teor de ácidosiálico: A faixa de trabalho para esse ensaio foi mostrada como sendo de0,49 mg/mL a 3,87 mg/mL de material de CTLA4-lg.

Limite de detecção (DL) do método de hidrólise de mediçãodo teor de ácido siálico: Os valores de DL individuais para Padrões deNANA e NGNA usando um detector com conjunto de fotodiodo (PDA; Siste-ma de HPLC 1) foram de 0,464 μg/mL e 0,402 μg/mL, respectivamente; osvalores de DL individuais para NANA e NGNA usando detector com compri-mento de onda duplo (Sistema de HPLC 2) foram de 0,131 μg/mL e 0,111μg/mL, respectivamente. O DL do método, para ambas as espécies de ácidosiálico e baseado no uso do detector mais sensível, foi de 0,5 μg/mL paraNANA e NGNA.

Limite de Quantificação (QL) do método de hidrólise de me-dição do teor de ácido siálico: Os valores de QL individuais para Padrõesde NANA e NGNA usando um detector com conjunto de fotodiodo (PDA;Sistema de HPLC 1) foram de 1,68 μ9/ηηΙ_ e 1,52 μ9 /mL, respectivamente;os valores de QL para NANA e NGNA usando um detector com comprimentode onda duplo (Sistema de HPLC 2) foram de 0,48 μ9/ιτ± e 0,41 μο/ιηί, res-pectivamente. O QL do método, para ambas as espécies de ácido siálico ebaseado no uso do detector mais sensível, foi de 1,7 μ9/ηιί para NANA eNGNA.

Resistência/Robustez: O método foi demonstrado como sendorobusto com relação à estabilidade de solução de amostra refrigerada 48horas, o uso de diferentes colunas, o uso de diferentes lotes de NANA eNGNA e o uso de fases móveis com alteração da concentração de ± 5 %.

Eletroforese em gel de IEF: O pl da glicoproteína pode tambémser medido, antes e após tratamento com neuraminidase, para remover áci-dos siálicos. Um aumento no pl após tratamento com neuraminidase indica apresença de ácidos siálicos sobre a glicoproteína. Um gel de IEF pode serusado para determinar o ponto isoelétrico, o número de isoformas de C-TLA4-lg. Um sistema adequado para operação do gel de IEF é o MultiphoreIl Electrophoresis System e um gel de IEF com pH de 4,0 a 6,5 (AmershamBiosciences). O tampão de anodo tem a seguinte composição: Ácido glutâ-mico a 0,1 M em ácido fosfórico a 0,5 Μ. O tampão de catodo tem a seguintecomposição: beta-alanina a 0,1 Μ. O gel de IEF foi pré-focalizado sob ener-gia (25 watts) e corrente (25 mAmps) constantes até a tensão atingir > 300V.

Padrões de calibração de IEF e amostras da concentração apropriada foramcarregados e o gel foi operado sob energia (25 watts) e corrente (25 mAmps)constantes com um máximo de 2000V durante 2,5 horas. Após fixação ecoloração com azul Coomassie do gel de IEF, bandas de proteína são visua-lizadas através de um densitômetro. Um gel de IEF típico de preparado dedímero de CTLA4-lg é mostrado na figura 11.

Exemplo 4: Isolamento e Caracterização de Cadeia simples (Monômero)de CTLA4-lq

Preparo de CTLA4-lg de cadeia simples nativa: Amostras deproteína recombinante de CTLA4-lg preparadas através dos métodos dainvenção foram separadas através de SEC de não-desnaturação usando um2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) sobre duas colunas preparativas21,5 χ 300 mm TSK Gel® G3000SWXL (Tosoh Bioscience, Montgomery1 PA)aleatoriamente. Trinta injeções (1,0 mL de cada) da amostra a -50 mg/mLforam separadas sob condições isocráticas usando uma fase móvel consis-tindo em NaH2PO4 a 0,2 M, NaCI a 0,9%, pH de 7,0, em uma taxa de fluxode 1,0 mL/min. Amostras foram monitoradas em uma absorbância de 280nm usando um detector Waters 2996 PDA. Análise foi realizada usando ossoftwares Waters Millennium 4,0® e Empower Pro©. Frações foram coleta-das (1,0 mL de cada) sobre um coletor de frações automático Foxy 200 de90 a 150 minutos. Frações 16 a 39 (começando a 105 mL e terminando a129 mL) foram empoçadas e concentradas usando concentradores Centri-con com um corte de 3500 MW.

A amostra (2,0 mL a ~4 mg/mL) foi ainda cromatografada sobcondições de desnaturação usando uma coluna de grau prep HiLoad 26/60Superdex 200 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) em uma taxa defluxo isocrática de 2,0 mL/min usando NaH2PO4 a 200 mM, cloridrato deguanidina a 6,0 M em um pH de 6,0 como a fase móvel sobre umÀKTAexplorer® (Amersham Biosciences). Frações 12-16 foram coletadas,empoçadas, o tampao trocado para NaH2PO4 a 200 mM, pH de 6,0 usandouma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Amersham Biosciences) e, fi-nalmente, concentradas.

Preparo de CTLA4-lg de cadeia simples induzida: CTLA4-lgde cadeia simples induzida foi preparadas através de desnaturação, reduçãoe alquilação de proteína recombinante de CTLA4-lg preparada através dosmétodos da invenção. Cloridrato de guanidina (0,684 g) foi pesado em umtubo de Eppendorf para centrífuga de 1,5 mL e 512 μL de NaH2PO4 a 200mM, pH de 6,0 foram adicionados e submetidos a turbilhonamento até que ocloridrato de guanidina estivesse completamente dissolvido. Proteína re-combinante de CTLA4-lg foi desnaturada através da adição de 238 μL dematerial de CTLA4-lg (concentração: 50 mg/mL) nos tubos acima e submeti-do a turbilhonamento, resultando em uma concentração final de CTLA4-lg de—10,0 mg/mL em cloridrato de guanidina a 6,0 Μ. A proteína desnaturada foireduzida através da adição de 2,6 μΙ_ de DTT a 1,0 M e incubação a 37°Cdurante 90 minutos. A proteína reduzida foi, então, alquilada através da adi-ção de 0,047 g de iodoacetamida sólida na mistura de amostra, seguido porturbilhonamento e incubação a 37°C durante 60 minutos no escuro. A amos-tra (2,0 mL a ~4,0 mg/mL para cada injeção) foi cromatografada sob condi-ções de desnaturação usando uma coluna de grau prep HiLoad 26/60 Su-perdex 200 em uma taxa de fluxo isocrática de 2,0 mL/min usando NaH2P04a 200 mM, cloridrato de guanidina a 6,0 M em um pH de 6,0 sobre um AK-TAexplorer®. As frações de cadeia simples resultantes (9-12) foram coleta-das, empoçadas, o tampão trocado para NaH2P04 a 200 mM, pH de 6,0 so-bre uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 e concentradas.

Análise por espectrometria de massa MALD1-TOF de CTLA4-Ig nativa e de cadeia simples induzida: As amostras de cadeia simples (20 μl foram dessalinizadas e concentradas com C4 ZipTips (Millipore, Billerica,MA), então, eluídas com 20 μί de acetonitrila a 80% com TFA a 0,1% satu-rado com ácido sinapínico. A mistura (1,0 μι) foi colocada sobre a cavidadeda lâmina de amostra para MALDI e deixada secar ao ar antes de ser colo-cada no espectrômetro de massa. Os espectros de MALDI-MS foram adqui-ridos sobre um espectrômetro de massa OmniFIex (Bruker Daltonics1 MA)usando um laser de nitrogênio (337 nm). As amostras foram analisadas nomodo de íons positivo reflexivo através de extração retardada usando umatensão de aceleração de 20 kV e um tempo de retardo de 200 ns. Um totalde 250 espectros em um único ponto foi somado para cada amostra. Cali-bração externa foi obtida usando uma mistura de Tripsinogênio (23982 m/z),Proteína A (44613 m/z) e Albumina Bovina (66431 m/z).

Análise de cadeia simples usando cromatografia por exclu-são de tamanho desnaturativa (Guanidina HCO: Sobrenadante de CTLA4-Ig de culturas de célula desenvolvidas coletada em diferentes pontos duranteo curso de tempo são preparadas para análise por HPLC. As amostras sãopreparadas através de pesagem de 0,114 g de cloridrato de guanidina (Mal-Iinckrodt Baker Inc.) em um tubo de Eppendorf para centrífuga de 0,65 mL;adição de 125 uL de amostra de CTLA4-lg no curso de tempo e turbilhona-mento para dissolver completamente o HCI de guanidina. Então, imediata-mente, adicionar 1,8 uL de iodoacetamida a 250 mM e misturar e incubar a37°C durante 30 minutos.

Uma coluna de exclusão por tamanho TSK-GEL®G3000SWxlaleatória (Dl de 7,8 mm χ 30 cm) com uma coluna de proteção TSK (SWxl,Dl de 6,0 mm χ 4,0 cm) é usada para a análise por SEC de cadeia simplesrealizada sobre o módulo de separação Waters 2695 com um detector 2996com conjunto de fotodiodo. 25 μΙ_ de cada amostra são injetados sobre acoluna equilibrada com fosfato de sódio a 200 mM, cloridrato de guanidina a6,0 M, pH de 6,0 como a fase móvel. As proteínas são separadas sobre acoluna com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e o cromatograma resultante écoletado durante uma janela de 60 minutos. A integração e quantificação depicos individuais (monômero, cadeia simples, etc.) são realizadas usando osoftware Empower Pro. Para assegurar que o sistema de HPLC está funcio-nando apropriadamente, injeções são também feitas sobre a fase móvel, otampão de amostra de proteína, o Padrão de Adequabilidade de Sistema e omaterial de CTLA4-lg presente antes e após injeções de amostra. A resolu-ção de pico e contagem de placa sobre o cromatograma de Padrão de Ade-quabilidade de Sistema são calculadas.

Análise de cisteinilacão de CTLA4-lg de cadeia simples a-través de análise por LC/MS de peptídeo: CTLA4-lg foi desnaturada e re-duzida em tampão de Tris a 50 mM (pH de 8,0) contendo guanidina a 6 M editiotreitol a 5 mM (DTT). Após uma incubação de 20 minutos a 50 °C, iodo-acetamida (IAM) foi adicionada para uma concentração final de 10 mM paraalquilar os tióis livres e a incubação foi continuada durante mais 20 minutosa 50 0C no escuro. A mistura alquilada e reduzida foi carregada sobre umacoluna de dessalinização (Amersham, NAP-5), então, eluída no volume devazio com Tris a 50 mM, CaCI2 a 10 mM, pH de 8,0 ou tampão de fosfato desódio a 50 mM, pH de 7,5. Após dessalinização, CTLA4-lg reduzida/al-quilada foi digerida usando duas diferentes proteases: tripsina ou Asp-N.

Material de CTLA4-lg foi também submetido à digestão com tripsina/qui-miotripsina sem redução e alquilação.

Para digestão com tripsina, tripsina com grau para sequencia-mento (Promega, 2%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e a mistu-ra foi incubada durante 4 horas a 37°C. Para digestão com Asp-N1 Asp-Ncom grau para sequenciamento (Roche, 2%, peso/peso, enzima/proteína) foiadicionada e a mistura foi incubadas durante 16 horas a 37 °C. Para a diges-tão com tripsina/quimiotripsina, tripsina com grau para sequenciamento(Promega, 4%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e a mistura foiincubada durante 4 horas a 37 °C, então, a-cquimiotripsina foi adicionada(Sigma, 4%, peso/peso, enzima/proteína) e a mistura foi incubadas durante16 horas a 37 °C. Todas as amostras foram congeladas (-20 °C) após a di-gestão.

As misturas peptídicas resultantes foram separadas através deeluição em gradiente a partir de uma coluna Waters Atlantis® dC18 (2,1 χ250 mm) sobre uma Workstation de HPLC Waters Alliance a 0,12mL/minuto. A coluna foi diretamente conectada ao Espectrômetro de massaWaters Micromass Q-Tof Micro® equipado com uma fonte de pulverizaçãode íons para coleta dos espectros de massa. Misturas peptídicas foram tam-bém separadas sobre uma coluna Varian Polaris C18 (4,6 χ 250 mm) a 0,70mL/minuto usando a mesma Workstation de HPLC. As colunas foram equili-bradas com solvente A (TFA a 0,02% em água) e os peptídeos foram eluí-dos aumentando a concentração de solvente B (acetonitrila a 95%/TFA a0,02% em água). Uma válvula de derivação pós-coluna foi usada para dirigir15% do fluxo para a workstation Q-Tof1 a qual foi operada no modo de TOFpositivo tempo de passagem (time offlight) (m/z 100-2000). A tensão de pul-verização de íons típica usada foi de 3000 V.

A perda de 113 ± 4 u quando de redução sugeriu que há umamodificação de dissulfeto covalente na proteína. O desvio previsto para cis-teinilação é de 119,14 u. Contudo, uma perda de massa real de111,14uéesperada quando de redução das espécies com cadeia simples. Perda de119,14 u resultou da remoção da cisteína e um ganho de 8 u resultou daadição de 8 prótons quando de redução das oito cisteínas intra-cadeia (Cys47, 74, 92, 118, 197, 157, 303,361 de g^Q |D N0: 2). Assim, mais 113 ± 4 u sobre amassa intacta correspondem à cisteinilação com um aminoácido cisteína. Acisteína mais provável de ser modificada é Cys146, uma vez que a ligação dedissulfeto intercadeia está ausente nas espécies com cadeia simples basea-do nos dados de MALDI. Usando análise de peptídeo por LC/MS para exa-minar os peptídeos os quais contêm Cys146l descobriu-se que material redu-zido e não-reduzido mostram tempos de retenção e massas diferentes domaterial com cadeia simples. Para confirmar a cisteinilação, o peptídeo comcadeia simples contendo Cys146 foi coletado e analisado usando MALDI.

O pico coletado contendo Cys146 tem uma massa de 1787,48 u,em concordância com a massa prevista de 1787,51 u para o peptídeo com acisteinilação de Cys146 (FIG. 27, painel A). Esse peptídeo, após ser submeti-do à redução, perde 119,11 u, em concordância com uma perda prevista de119,14 u; a perda de cisteína (FIG. 27, painel Β). O material é, então, aindamanipulado com iodoacetamida produzindo um desvio de 56,99 u, em con-cordância com um ganho de massa previsto de 57,03 u (FIG. 27, painel C).Exemplo 5: Manipulação de formação de Monômero ou Multímero deCTLA4-lg

Efeitos agonísticos do meio e componentes do meio sobre aformação de cadeia simples: Os efeitos agonísticos de diferentes meios ecomponentes de meio são determinados para a formação de cadeia simples.Moléculas de CTLA4-lg podem ser incubadas a 37°C com vários meios econstituintes de meio individuais durante um período de 60 horas e analisa-dos com relação à formação de cadeia simples através de desnaturação emcoluna aleatória. Uma resposta agonista devastadora para formação de ca-deia simples é encontrada quando da adição de cisteína a 10 mM ao tampãode formulação. Há uma rápida elevação na formação de cadeia simples aqual tem um pico em torno de seis horas após a adição de cisteína. Essaresposta diminui gradualmente durante as 56 horas restantes.Além disso, aalimentação de +30% gal realizou um aumento mais gradual, mas ainda re-lativamente rápido na formação de cadeia simples. A alimentação de +30%gal é uma composição de galactose e 117E. Essa mistura é adicionada tododia para alimentar as células. Embora, nesse experimento, cisteína tivessesido introduzida em quantidades artificialmente grandes independentes de117E, há a necessidade de determinar qual dos componentes de 117E podeestar envolvido na formação de cadeia simples.

Componentes específicos de 117E e outros meios são incuba-dos com CTLA4 Ig durante um período de 60 horas e analisados com rela-ção à formação de cadeia simples através de seg. desnaturação em colunaaleatória. Investigação nesse meio se concentra em torno de possíveis com-ponentes de redução e/ou inibidores de dissulfeto, os quais afetarão a for-mação de cadeia simples baseado em experimentos anteriores, mostrandoque o dissulfeto intercadeia não está presente. Constituintes de 117E osquais são conhecidos por terem algum efeito de redução sobre dissulfetosforam testados; ácido lipóico, cisteína, metionina e glutationa. Novamente,uma resposta agonista devastadora para formação de cadeia simples é en-contrada quando de adição de cisteína ao tampão de formulação. Há umarápida resposta na formação de cadeia simples, a qual tem um pico em tornode seis horas, após a adição de cisteína. Essa resposta diminui gradualmen-te ao longo das 56 horas restantes. A principal formação de cadeia simplesocorre com meio contendo cisteína: cisteína, isolados de Ievedo e meio defermentação. Os outros componentes contendo enxofre, tais como metioninae glutationa, não têm um efeito ou um efeito muito pequeno sobre a forma-ção de cadeia simples. Não há efeitos observados pelo cloreto de amônio.

A presente invenção, portanto, abrange um método para forne-cimento de uma proporção de formas de cadeia simples:dímero de uma pro-teína, tal proteína capaz de existir na forma de dímero, bem como de cadeiasimples, compreendendo as etapas de (1) fornecimento e/ou manutenção de(tal como durante a etapa (2)) um meio de cultura de célula líquido para acultura de células expressando a referida proteína, no qual a concentraçãode um agente capaz de reduzir ou inibir a formação de dímero (tal como cis-teína) é selecionada para proporcionar a referida proporção e (2) cultura dasreferidas células para expressar a referida proteína. Adição de e/ou aumentoda concentração de tal agente (por exemplo, cisteína) em um meio de cultu-ra de célula líquido proporciona uma maior proporção de formas de cadeiasimples:dímero de tal proteína, enquanto que remoção, diminuição ou elimi-nação da concentração de tal agente (por exemplo, cisteína) em um meio decultura de célula líquido diminui a proporção de formas de cadeia simples:dímero da referida proteína.

Uma modalidade particular desse método é onde a referida pro-teína é uma glicoproteína capaz de formação de dímero através da formaçãoda ligação de dissulfeto intercadeia, tais como as moléculas de CTLA4-lg dapresente invenção.

Efeitos agonísticos de elevado teor de sal sobre a formação

de espécies de elevado peso molecular. Durante o processo de purifica-ção, CTLA4-lg é exposta a altas concentrações de sal durante períodos va-riados de tempo. Os efeitos de altas concentrações de sal são determinadossobre a formação de espécies de elevado peso molecular. CTLA4-lg (a ~ 50mg/ml_) é incubada na presença de fosfato de sódio a 500 mM, pH = 6,0,37°C. Há um efeito agonístico em altas concentrações de fosfato de sódio;um aumento rápido, sustentado nas formas de espécies de elevado pesomolecular, principalmente tetrâmero, é observada durante um período de100 horas.

A presente invenção, portanto, abrange um método para redu-ção da proporção de forma dimérica:agregado de uma proteína, tal proteínacapaz de existir nas formas de dímero, bem como agregada, durante pro-cessamento (tal como durante purificação) de tal proteína, compreendendo ouso de um ou mais líquidos os quais são soluções salinas de não-agregação. Uma "solução salina de não-agregação" se refere a um líquidocontendo uma concentração de sal dissolvido no mesmo o qual é, com rela-ção ao mesmo líquido contendo uma concentração maior de tal sal, menosagonística quanto à formação de agregado.

Uma modalidade particular desse método é onde a referida pro-teína é uma glicoproteína capaz de formação de dímero através da formaçãode uma ligação de dissulfeto intercadeia, tais como as moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção.Efeitos antagonísticos sobre a formação de cadeia simples:Os experimentos de modelamento anteriores demonstraram um efeito gran-de e rápido sobre a formação de cadeia simples através da adição de com-ponentes contendo cisteína. Cisteína é um aminoácido o qual contém umasulfidrila livre. Se a sulfidrila está envolvida na formação de cadeia simples,ela deverá ser bloqueada através do uso de compostos antagonísticos. Umde tais compostos é iodoacetamida. Iodoacetamida é um composto solúvelem água que reage de modo rápido com qualquer sulfidrila livre para formaruma ligação de tioéter irreversível. CTLA4-lg é incubada a 37°C com váriosmeios, cisteína e iodoacetamida durante um período de 60 horas e analisadacom relação à formação de cadeia simples através de SEC desnaturante emcoluna aleatória e HMW através de seg. não desnaturante em coluna aleató-ria. Iodoacetamida não apenas bloqueia a formação de cadeia simples, mastambém bloqueia a formação de agregado em uma composição de CTLA4-Ig e alto teor de sal. Iodoacetamida não bloqueia a formação de agregadoem baixo teor de monômero de ácido siálico. Contudo, a quantidade de a-gregado formado no material com baixo teor de ácido siálico é comparávelcom a quantidade formada na composição de CTLA4-lg.

O modelo proporciona um "insight" sobre um mecanismo quenão era anteriormente bem compreendido. Parece que existem pelo menosduas vias principais de formação de agregado no processo com CTLA4-lgque foram identificadas. A primeira via, a qual produz a grande quantidadede agregado, sulfidril cisteína livre, atua como um agonista para a formaçãode espécies de cadeia simples. O efeito agonístico da cisteína pode ser blo-queado através da adição de iodoacetamida. Surpreendentemente, a iodoa-cetamida não é apenas um antagonista para a formação de cadeia simples,mas também para a formação de espécies de elevado peso. Deverá ser no-tado que o processo é projetado para produzir uma composição que contémuma quantidade aumentada de ácido siálico quando comparado com a fer-mentação durante a purificação a jusante. Na segunda via, a qual produzmuito menos agregado, uma subespécie a qual contém baixas quantidadesde ácido siálico, não é afetada pela iodoacetamida para a formação de ca-deia simples ou agregado.

A presente invenção, portanto, abrange um método para diminuira proporção de formas de cadeia simples:dímero de uma proteína, tal prote-ína capaz de existir na forma de dímero, bem como de cadeia simples, com-preendendo as etapas de (1) fornecimento e/ou manutenção de (tal comodurante a etapa (2)) um meio de cultura de célula líquido para a cultura decélulas expressando a referida proteína, tal meio contendo um agente anta-gonístico à formação de cadeia simples (tal como iodoacetamida) e (2) cultu-ra das referidas células para expressar a referida proteína.

A presente invenção também abrange um método para diminui-ção da proporção de formas de agregado:dímero de uma proteína, tal prote-ína capaz de existir na forma de agregado, bem como de dímero, compre-endendo as etapas de (1) fornecimento e/ou manutenção de (tal como du-rante a etapa (2)) de um meio de cultura de célula líquido para a cultura decélulas expressando a referida proteína, tal meio contendo um agente anta-gonístico à formação de agregado e/ou antagonístico à formação de cadeiasimples (tal como iodoacetamida) e (2) cultura das referidas células paraexpressar a referida proteína.

Uma modalidade particular desse método é onde a referida pro-teína é uma glicoproteína capaz de formação de dímero através da formaçãode uma ligação de dissulfeto intercadeia, tais como as moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção.

Baseado nesses dados, não é difícil imaginar que pelo menosduas vias para a formação de agregado são induzidas em CTLA4-lg, naprincipal via, cadeia simples está envolvida na formação de agregado, embo-ra esse ainda não seja um mecanismo completamente claro. A segunda viamenor, a qual é independente da formação de cadeia simples, está envolvi-da na formação de agregado. Essas vias podem ajudar a explicar porqueexistem pelo menos três formas de espécies de elevado peso molecular quepodem ser cromatograficamente separadas. Esses são modelos e devemser testados durante o processo de fermentação real de forma a determinaros efeitos reais, se houver, e a magnitude dos efeitos. Baseado nesses da-dos, consideração deverá ser dada à testagem não apenas do processo defermentação atual, mas também à fermentação desprovida de cisteína.Exemplo 6: CTLA4-lg Dímero e TetrâmeroLigação de dímero e tetràmero de CTLA4-lg a B7-1 Ig

A invenção proporciona métodos para avaliação de ligação dedímero e tetrâmero de CTLA4-lg a B7-1 Ig. Características físicas (por exem-plo, coeficiente de difusão, peso molecular, valência de ligação) e parâme-tros operacionais do instrumento (por exemplo, taxa de fluxo, densidade dechip) podem influenciar os resultados do ensaio Biacore. Sob limitação detransferência de massa; a taxa de ligação de tetrâmero é aproximadamente20% menor do que o dímero para a mesma concentração molar. Em umataxa de fluxo especificada, é possível que moléculas tetraméricas penetremna matriz menos eficientemente comparado com o dímero. Sob um chip i-mobilizado de B7-1 Ig de alta densidade, ligação competitiva de tetrâmero edímero exibe curvas de inibição comparável. Isso indica que a valência teóri-ca de tetrâmero (quatro) versus dímero (dois) não tem influência sobre a li-gação a B7-1 Ig. Concentrações molares de tetrâmero podem ser calculadasbaseado em uma Curva-padrão de dímero. Usando essa abordagem, des-cobriu-se que a ligação de tetrâmero a B7-1 Ig tem resposta dose-depen- dente comparado com dímero.

Comparação da potência de ligação de um tetrâmero e um dí-mero é influenciada pela unidade de medição usada para o preparo de pa-drões e amostras. Amostras de tetrâmero e dímero podem ser comparadascom uma concentração de 2000 ng/mL. Em uma base em massa (ng/mL),cada espécie mostra uma potência de ligação de aproximadamente 100%usando uma curva-padrão da mesma espécie. Contudo, a potência de liga-ção de tetrâmero era a metade quando determinada sobre uma Curva-pa-drão de dímero e a potência de ligação de um dímero foi mais do que dupli-cada quando determinada sobre uma Curva-padrão de tetrâmero. Uma vezque o instrumento Biacore detecta interações moleculares baseado na mas-sa, as unidades de ressonância de sinal (RU) a partir de concentrações idên-ticas (ng/mL) de tetrâmero e dímero deverão ser as mesmas. Embora o sis-tema de detecção seja uma função da massa, a interação entre moléculasocorre em uma base molar. Portanto, as concentrações molares de dímerode CTLA4-lg e tetrâmero de CTLA4-lg são de 21,6 nM e 10,8 nM, respecti-vamente, a 2000 ng/mL. Usando a concentração molar, as amostras de dí-mero de CTLA4-lg e tetrâmero de CTLA4-lg mostram potência de ligaçãocomparável sobre uma Curva-padrão de dímero. Usando a mesma aborda-gem de concentração molar sobre uma curva de padrão de tetrâmero deCTLA4-lg, a amostra de dímero de CTLA4-lg mostra um aumento extra de30% na potência de ligação comparado com a amostra de tetrâmero. Essaobservação é em virtude de uma diminuição no declínio da Curva-padrão detetrâmero em altas concentrações, resultando em uma maior concentraçãocalculada para uma determinada taxa de ligação inicial. Uma explicação pa-ra essa observação é o efeito da transferência de massa.

Experimento com limitação de transferência de massa indica quea taxa de ligação inicial do tetrâmero de CTLA4-lg é aproximadamente 20%menor do que aquela do dímero de CTLA4-lg para o mesmo número de mo-léculas (isto é, a taxa de ligação do tetrâmero difere do dímero por um fatorde 0,8). Essa diferença observada é em virtude do peso molecular das duasespécies e seu efeito sobre a difusão das moléculas para a superfície dochip. O coeficiente de difusão da molécula é inversamente proporcional àraiz cúbica do peso molecular. Um menor coeficiente de difusão indicariamenor movimento das moléculas. Baseado nos respectivos pesos molecula-res, o coeficiente de difusão calculado de tetrâmero de CTLA4-lg é 0,8 vezesaquele do dímero de CTLA4-lg ou, inversamente, aquele do dímero é 1,25vezes aquele do tetrâmero. Dados experimental são consistentes com essaobservação, onde o dímero de CTLA4-lg mostra uma potência de 133%,conforme calculado a partir de uma curva-padrão de tetrâmero de CTLA4-lgusando concentrações molares. Limitações de transferência de massa sobrechips de alta densidade são mais pronunciadas em menores taxas de fluxo emenores concentrações de analito. À medida que a taxa de fluxo aumenta, odímero mostra taxas de ligação iniciais mais rápidas comparado com o te-trâmero. Portanto, o peso molecular aumentado e menor coeficiente de difu-são do tetrâmero contribuem para as diferenças na taxa de ligação inicialcomparado com o dímero.

Ligação competitiva de dímero e tetrâmero de CTLA4-lg a B71lgindica que o tetrâmero e dímero mostram Valencia de ligação similar sobcondições limitadas de transferência de massa. Os efeitos de tetrâmero adi-cional sobre um chip de B7-1 Ig inicialmente ligado com dímero ou tetrâmeroindicam baixo potencial de ligação. Essa observação não é em virtude dedisponibilidade limitada do sítio de ligação, porque o dímero adicional pode-ria se ligar a chips de B7-1 Ig inicialmente ligado com dímero de CTLA4-lg ouCTLA4-lg tetrâmero. Penetração limitada na matriz pode explicar a diminui-ção observada na ligação de tetrâmero.

A natureza pela qual moléculas se ligam sobre o Biacore afeta ainterpretação dos resultados. As moléculas de tetrâmero e dímero se difun-dem em diferentes taxas em virtude de suas diferenças no tamanho molecu-lar sob a condição de limitação de transferência de massa. Além disso, im-pedimento estérico sobre a superfície de um chip de alta densidade afeta apenetração de subsequentes moléculas na matriz.

Características físicas, tais como o peso molecular, coeficientede difusão e ligação de cada espécie precisa ser considerada quando derealização de análises de concentração sobre o Biacore. Padrões usadospara comparação do analito de interesse deverão ser do mesmo material.Contudo, tetrâmero ainda pode ser analisado contra padrões de dímero seos padrões e amostras são expressos em uma base molar onde o tamanhomolecular é levado em consideração. Os dados apresentados indicam que aligação de dímero de CTLA4-lg e tetrâmero de CTLA4-lg a B7-1 Ig é comparável.

Dímero e tetrâmero de CTI_A4-lg mostram taxas de associação(l<on) similares. Contudo, o tetrâmero mostra uma menor taxa de dissociação(k0ff), a qual é atribuída à avidez em virtude de aumento no número de sítiosde ligação.

Análise de cinética de ligação entre duas proteínas, tais comoum Iigante e um receptor, pode ser realizada sobre o Biacore usando umchip imobilizado com uma baixa densidade de Iigante de aproximadamente600-800 RUs1 de modo que a capacidade de ligação máxima (RmaX) está nafaixa de 50-150 RU. A finalidade de um chip de baixa densidade é minimizaros efeitos da avidez e transporte de massa. A avidez é observada quandoanalitos multivalentes permanecem ligados à superfície do chip em virtudeproximidade íntima de Iigantes disponível à medida que dissociação de sítiosde ligação individuais ocorre. Transporte de massa é observado quando háuma diferença significativa na concentrações de analito entre a superfície dochip e a solução bruta.

Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-lg é um dímero con-sistindo em duas moléculas com cadeia simples ligadas através de uma úni-ca ligação de dissulfeto intercadeia e contém dois sítios de ligação para mo-léculas de B7. Em outra modalidade, formação de tetrâmero de CTLA4-lg,conforme confirmado através de dispersão de luz, SEC e SDS-PAGE, resul-ta em uma molécula com potencialmente quatro sítios de ligação. A cinéticade ligação de monômeros e dímeros purificados é estaticamente comparadacom material de dímero de CTLA4-lg. Não existem diferenças significativasnas taxas Zcon (p valores > 0,05). A taxa Mf de tetrâmero é significativamentediferente da taxa Zc0Zfdo dímero. A taxa Zf0Zf do dímero purificado do pico declarificação por HIC não é significativamente diferente da taxa Zc0Zf do materi-al de dímero de CTLA4-lg. Portanto, o tetrâmero dissocia mais lentamentedo que o dímero, indicando um efeito de avidez em virtude do número au-mentado de sítios de ligação pela molécula.

Tetrâmero pode ser separado e dissociado do dímero através detratamento com guanidina. Esse dímero de CTLA4-lg tratado com guanidinafoi analisado e os resultado indicam que suas características de ligação ciné-tica eram similares àquelas do dímero de CTLA4-lg formado sob condiçõesfisiológicas. Essa observação sustenta a hipótese de que a diferença obser-vada na taxa Zc0Zf entre dímero e tetrâmero está relacionada à valência deligação das moléculas e à natureza inerente do método Biacore, onde a avi-dez exerce um papel na cinética de ligação.

Purificação por afinidade de material de CTLA4-lg do pico de clarifica-cão por HIC:

Cromatografia por afinidade em Proteína A-Sefarose: 500 mLde pico de clarificação por HIC foram filtrados através de um sistema comfiltro de 0,22 mícron de 1 L (Corning, Corning, NY1 Parte no. 430517) e car-regada sobre a coluna de rProteína A-Sefarose (5 cm χ 15 cm), a qual foipré-equilibrada com solução salina tamponada com fosfato (Sigma, St.Louis, MO1 P-4417) em um pH de 7,4. A coluna foi lavada com 700 mL dePBS, pH de 7,4 e eluída com glicina a 100 mM, pH de 3,5. Frações de 50 mLde cada foram neutralizadas para coleta através da adição de 0,5 mL de Trisa 2,0 M, pH de 10 em tubos de coleta. Frações foram ensaiadas em umaabsorbância de 280 nm, empoçadas e concentradas usando um cartuchoCentriprep YM-3 (Millipore Corporation, Bedford, MA, Parte no. 4203). A so-lução de proteína purificada foi armazenada a -70° C.

Cromatografia por afinidade PROSEP- rA (proteína recombi-nante A): 500 mL de pico de clarificação por HIC foram filtrados através deum sistema com filtro de 0,22 mícron de 1 L (Corning, Corning, NY1 Parte no.430517) e carregados em uma taxa de fluxo de 25 mL/minuto sobre umacoluna PROSEP-rA High Capacity (Millipore Corporation, Bedford, MA) (25mm χ 28 cm), a qual foi pré-equilibrada com Tris a 25 mM, pH de 8,0 con-tendo cloreto de sódio 250 mM. O sistema Waters PrepLC equipado comWaters 2767 Sample Manager e um detector com conjunto de fotodiodo Wa-ters 2996 foi usado para essa cromatografia. A coluna foi lavada com tam-pão de equilíbrio a 25 mM durante 30 minutos em uma taxa de fluxo de 25mL/minuto e eluída com acetato a 100 mM, pH de 3,0 em uma taxa de fluxode 25 mL/minuto durante 30 minutos. Frações de 10 mL de cada foram neu-tralizadas para eluição através de coleta sobre 50 ul de Tris a 2,0 M, pH de10, o foi previamente adicionado aos tubos. Frações tendo alta absorbânciaa 280 nm foram empoçadas e concentradas usando um cartucho CentriprepYM-3 (Millopore Corporation, Bedford, MA, Parte No. 4203). A solução deproteína purificada foi armazenada a -70°C.

Cromatografia por exclusão de tamanho: cromatografia foiexclusão de tamanho foi realizada sobre um módulo de separação WatersAlliance 2695 equipado com um detector com conjunto de fotodiodo Waters2996 (Milford, MA) e um coletor de frações Foxy 200 controlado por umsoftware Millennium32 versão 3.20 ou Empower. Colunas TOSOH BIOSCI-ENCE aleatória (Montgomery, PA) TSK G3000 SW (21,5 mm χ 300 mm) eTSK G3000 SWxL aleatória (7,8 mm χ 300 mm) foram usadas para SECpreparativa a analítica, respectivamente. As proteínas eluídas foram monito-radas através de absorbância de UV a 280 nm.

Isolamento preparativo de dímero, tetrâmero e multímero foi ob-tido através de SEC do material de pico de clarificação por HIC em ProteínaA purificada. Trinta amostras (~10 mg cada) de eluato de Proteína A foraminjetados sobre uma coluna de SEC preparativa aleatória usando uma fasemóvel de tampão de fosfato de sódio monobásico a 100 mM, pH de 7,0 con-tendo cloreto de sódio a 0,9% em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Fraçõesforam coletadas a cada minuto de 90-160 minutos para cada uma das trintainjeções. O tempo de operação para uma única injeção foi de 180 minutos.

Cada fração foi examinada através de HPLC por exclusão detamanho analítica em coluna aleatória. Frações 13-15 (contendo multímero),frações 22 e 23 (contendo tetrâmero) e frações 43-49 (contendo dímero) fo-ram empoçadas. Frações purificadas multímero, tetrâmero e dímero foramexaminadas sobre duas colunas de SEC analíticas com detecção por dis-persão de luz dinâmica (DSL).

Análise de ligação bioespecífica de componente de CTLA4-Ig do pico de clarificação por HIC e componentes purificados a B7-1 Iqimobilizada: A ligação bioespecífica de CTLA4-lg a B7-1 Ig imobilizada (so-bre um chip CM5) foi medida usando um biosensor BIAcore C SPR-baseado(BIAcore, AB1 Piscataway NJ). Material de CTLA4-lg foi usado para gerar aCurva-padrão. B7-1 Ig foi imobilizado em uma densidade de 5000 a 10.000unidades de ressonância (RU's) sobre um chio sensor CM5 ativado. Padrõesde referência de CTLA4-lg, controles de qualidade e amostras foram injeta-dos em uma taxa de fluxo de 20 μΙ_/ηιίη. sobre a superfície do chip sensorB7-1 Ig para gerar sensorgramas. A taxa de ligação inicial (RU/s) de CTLA4-Ig sobre B7-1 Ig imobilizada foi medida sob condições de difusão limitadasobre uma superfície de B7-1 Ig de alta densidade e isso se correlaciona di-retamente com a concentração ativa de CTLA4-lg nas amostras. Amostras-padrão, controle de qualidade e concentrações de amostra desconhecidasforam interpoladas a partir da Curva-padrão gerada através de plotagem dasRU's versus concentrações de CTLA4-lg na faixa nominal de 125-8000ng/mL. Os resultados finais foram expressos como ligação percentuais(Concentração Média Desconhecida / amostra / 2000) χ 100.

Determinação de massa molar e raio hidrodinâmico: A sepa-ração por SEC foi realizada com uma coluna TSK3000 SWXL e uma colunade proteção correspondente. A fase móvel consistia em HEPES a 25 mM,NaCI a 850 mM, pH de 7,0, usando condições isocráticas para eluição a 0,8mL/min. Análises por HPLC foram realizadas em temperatura ambiente e asamostras mantidas a 4°C durante análise. A determinação de massa molarincorporou o Wyatt Dawn EOS utilizando 15 ângulos de dispersão distintospara medir a variação angular dispersão de luz para cada espécie. Um for-malismo de plotagem Zimm foi usado para determinação de massa molar,onde a média de seções para cada espécie foi calculada para a massa mo-lar. O valor de incremento de índice refrativo específico (dn/dc) usado paracalcular a massa molar absoluta foi de 0,189 obtido usando a) e um Interfe-rômetro Optilab DSP (RI. Determinação de raio hidrodinâmico (Rh) foi reali-zada in-Line com um detector Photon Correlatar QELS posicionado em umângulo de aproximadamente 90° para a célula de fluxo. A constante de difu-são translacional é medida a partir desse sinal e o Rh é calculado usando arelação de Einstein-Stokes. Análise de dados foi realizada usando o softwareAstra versão 4.90 da Wyatt Technology.

Descobriu-se que os valores de peso molecular e raio hidrodi-nâmico para espécies diméricas e tetraméricas eram de 86 - 91 kDa e 172 -199 kDa, respectivamente. Foi observado que as amostra de pico de clarifi-cação continham espécies de HMW adicionais, correspondendo a hexâmeroe decâmero através do peso molecular. A faixa dos raios hidrodinâmicospara as espécies diméricas é de 3,8 - 4,7 nm. As faixas dos raios hidrodinâ-micos das espécies tetraméricas heterogêneas foram de 5,7 nm a 6,2 - 6,3nm.

Ligação de dímero e tetràmero de CTLA4-lq a B7-1lq usandoressonância de plasmônio em superfície:

Análises de concentração: Análises de concentração das váriasespécies de CTLA4-lg a B7-1 Ig foram realizadas sobre um instrumento Bia-core 3000 (Biacore, Piscataway, NJ) de acordo com Método 7441-A2 commodificações mínimas. Modificações incluem o seguinte: Biacore 3000 foiusado ao invés do Biacore C. A taxa de fluxo foi de 10 μL/min ao invés de 20μL/min A amostra foi injetada durante 60 segundos em oposição a 15 se-gundos. A superfície do chip sensor foi re-gerada a 30 μί/ητιίη através detrês pulsos curtos de 30 segundos (15 μΙ_^β citrato de sódio a 10 mM, pHde 4,0, contendo NaCI a 100 mM (tampão de regeneração), seguido por umpulso de 30 segundos de água.

Um chip sensor CM5 foi imobilizado com B7-1 Ig em uma con-centração de 20 μg/mL em tampão de acetato, pH de 5,0, objetivando umadensidade-alvo de 6000-12000 unidades de ressonância (RU). Padrões fo-ram preparados através de diluição serial de material de CTLA4-lg para con-centrações de 62,5-8000 ng/ml_ (0,675-86,3 nM) e dímero para concentra-ções de 125-16000 ng/mL (0,675-86,3 nM) em tampão de HBS-EP. Amos-tras de teste, consistindo em monômero ou dímero, foram diluídas para umaconcentração-alvo de ~2000 ng/mL e analisadas sobre o Biacore. Concen-trações foram determinadas através do software BIAavaIiation (versão 4.0.1)usando Curvas Padrões de material de CTLA4-lg (> 98% de monômero) oudímero purificado. A potência de ligação é calculada como a concentraçãopercentual determinada sobre o Biacore dividido pela concentração determi-nada a A280 nm.

A taxa de ligação da molécula à superfície fornecida é uma fun-ção da concentração, o que permite a determinação de concentrações des-conhecidas. Dímero de CTLA4-lg exibe uma maior taxa de ligação comouma função da concentração (ng/mL) quando comparado com tetràmero deCTLA4-lg.

As potências de ligação de dímero e tetràmero de CTLA4-lg sãoresumidas na Tabela 7. Baseado em ng/mL, a potência de ligação de umaamostra de dímero é calculada a partir da Curva-padrão de dímero e desco-briu-se que era de 99,5%; enquanto que uma concentração equivalente deuma amostra de tetrâmero é 47,2%. Inversamente, a potência de ligação daamostra de dímero é calculada a partir de uma Curva-padrão de tetrâmero edescobriu-se que era de 266%; enquanto uma concentração equivalente deuma amostra de tetrâmero é de 103%. Contudo, quando dímero e tetrâmerosão expressos como concentrações molares (nM), as potências de ligaçãode ambas as espécies são comparáveis. A potência de ligação de amostrasde dímero e tetrâmero calculada a partir de uma Curva-padrão de dímerosão de 99,4% e 94,3%, respectivamente. Sobre uma Curva-padrão de te-trâmero, ela é de 133% e 103%, respectivamente. Curvas Padrões de díme-ro e tetrâmero são comparáveis baseado nas concentrações molares.

Tabela 9: Potência de ligação de dímero e tetrâmero de CTLA4-lq

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Valência de ligação: Dímero de CTLA4-lg (25-1600 nM) ou te-trâmero (25-400 nM) foi pré-misturado em várias proporções molares comB7-1 Ig durante três minutos antes de 30 μΙ_ da mistura serem injetados emuma taxa de fluxo de 10 μL/ um sobre um chip B7-1 Ig imobilizado com umadensidade de 9392 RU. O chip foi re-gerado após cada injeção através detrês pulsos de 30 segundos de tampão de regeneração, seguido por um pul-so de 30 segundo de água. As RU's obtidas ao final de cada injeção foramcomparadas.

Teoricamente, a valência de ligação da molécula de dímero é dedois; cada cadeia simples consiste em um sítio de ligação. A molécula te-tramérica consiste em duas moléculas de dímero e, assim, tem uma valênciade ligação de quatro. Para determinar a valência de ligação aparente de dí-mero e tetrâmero, um ensaio competitivo foi projetado e conduzido sobre oBiacore 3000. No experimento, analitos foram pré-misturados com B7-1 Igem várias proporções molares durante três minutos antes da mistura ser in-jetada sobre um chip B7-1 Ig (9392 RU) em uma taxa de fluxo de 10 μΙ_/ιτιΐηdurante um minuto. A Tabela 10 mostra o percentual de dímero ou tetrâmeroque foi competitivamente inibido com quantidades molares crescentes deB7-1lg. Em uma proporção molar de 1,25 (B7-1 Ig) para 1 (dímero ou tetrâ-mero), uma diferença significativa foi observada na inibição competitiva commonômero a 96,1% e dímero a 84,9%. Contudo, dímero e tetrâmero exibemcurvas de inibição similares; isso sugere que as valências são aproximada-mente iguais. Além disso, dímero e tetrâmero também mostraram perfis deinibição similares usando chips de menor densidade.

Tabela 10: Inibição de Dímero e Tetrâmero com B7-1lq.

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Saturação de Chip de B7-1lg: Dímero ou tetrâmero de CTLA4-Ig (200, 1000 ou 8000 ng/mL) foi inicialmente injetado a 10 μl,/min duranteum minuto sobre um chip B7-1 Ig de alta densidade (6738 RU) seguido poruma série de sete injeções de 1 minuto com monômero ou dímero (200,1000 ou 8000 ng/mL). O chip foi re-gerado após cada condição através dequatro injeções de 25 μι. de tampão de regeneração, seguido por uma inje-ção de 25 μΙ_ de água. As RU's obtidas ao final de cada injeção foram com- paradas.Dímero ou tetrâmero foi repetidamente injetado sobre uma su-perfície B7-1 Ig pré-revestida com dímero ou tetrâmero sem regeneração desuperfície. Ligação inicial com tetrâmero não impede subsequentes injeçõesde dímero de se ligar, contudo, injeções adicionais de tetrâmero resultam emuma taxa de ligação significativamente diminuída quando comparado cominjeção dímero. Ligação inicial com dímero seguido por subsequentes inje-ções de dímero resulta em uma ligação aumentada tendendo à saturação.

Subsequente injeção de tetrâmero ao chip pré-revestido com dímero mostrauma diminuição gradual na ligação, indicando uma dissociação de moléculasdo chip e uma falta de penetração de tetrâmero na matriz. Resultados similarsão observados com injeção inicial de 200 ng/mL ou 8000 ng/mL de molécu-las de CTLA4-lg.

Tetrâmero de CTLA4-lq tem maior avidez ao receptor de B7-11g: Espécies de CTLA4-lg, incluindo as porções descartadas de colunas depurificação, tal como os picos de clarificação de colunas de HIC e QFF forampurificados e sua cinética de ligação foi analisada sobre o Biacore.

Espécies de CTLA4-lg do pico de clarificação por HIC: A colunade HIC é usada no processo com CTLA4-lg para remover espécies de ele-vado peso molecular, tal como DNA. Espécies de CTLA4-lg do pico de clari-ficação da coluna de HIC podem ser usadas para subsequente purificação eanálise cinética. O pico de clarificação por HIC foi passado através de umacoluna de Proteína A para capturar todas as espécies CTLA4-lg e removeroutras impurezas que possam estar presentes. O eluato da coluna de prote-ína A, o qual consistia em uma mistura de todas as espécies de CTLA4-lg(isto é, dímero, tetrâmero, hexâmero multímero), mostrou taxas de kon e k0ffaparentes as quais eram comparáveis com o padrão de dímero de CTLA4-Ig. Separação do eluato de Proteína A através de 2 coluna de SEC resultouem três espécies de CTLA4-lg: dímero, tetrâmero e hexâmero /multímero,com taxas de kon e k0ff conforme resumido na Tabela 11. O teor de ácidosiálico do dímero purificado do pico de clarificação por HIC era baixo compa-rado com dímero de CTLA4-lg.

Na Tabela 11, concentrações de amostra de 75-200 nM foramtestadas sobre o chip B7-1 Ig (694 RU). Espécies de CTLA4-lg purificadas dopico de clarificação por HIC mostraram menor ligação comparado com a re-ferência de CTLA4-lg. Tetrâmero, o qual foi desagregado, proporcionou ta-xas de kon e k0f comparáveis com a referência de CTLA4-lg.

Tabela 11: Análise cinética de espécies de CTLA4-lg a partir do pico de clari-ficação por HIC

<table>table see original document page 356</column></row><table>

Análise estatística dos dados foi realizada usando o T-teste deStudent baseado em 7 observações do padrão de dímero de CTLA4-lg e 14observações de dímero e tetrâmero purificados. Não houve diferença nacomparação das taxas de kon do padrão de dímero de CTLA4-lg com dímeroou tetrâmero purificado. Contudo, a taxa de k0ffe a Kd foram estatisticamen-te significativa quando a referência foi comparado com tetrâmero purificado(Tabela 12). Comparando o tetrâmero purificado com dímero purificado, astaxas de kon e k0ff, bem como a Kd foram estatisticamente diferente. Deveráser destacado que, embora os dados tenham sido agrupados em dímero etetrâmero, classificações individuais de amostras (isto é, frontal, lateral, etc.)pode ter características ligeiramente diferentes que podem afetar sua cinéti-ca de ligação. Para o dímero, a média das taxas de kon e koffera de 3,3 ± 1,0χ IO5M-Is-1 e 8,8 ± 3,5 χ 10"3s-\ respectivamente. As taxas de kon e koff dotetrâmero foram de 2,6 ± 0,8 χ IO5M-Is-1 e 3,1 ± 1,4 χ 10"3s-1, respectiva-mente.

Na Tabela 12, Dímero (n = 14) e tetrâmero (n = 14) e padrão dedímero de CTLA4-lg (n = 7) foram analisados.Tabela 12: Análise estatística de espécies de CLTA4-lq

<table>table see original document page 357</column></row><table>

Espécies de CTLA4-lg do pico de clarificacão de QFF: A co-luna de QFF é a última coluna de purificação usada para limpar impurezasresiduais do produto. Espécies de CTLA4-lg foram isoladas do pico de clari-ficação da coluna de QFF usando o método com 2 colunas SEC e analisa-das sobre o Biacore 3000. Os dados mostraram que a cinética de ligaçãodessa amostra de "pico de clarificação de QFF" foi similar ao padrão de dí-mero CTLA4-lg. Além disso, dímero e tetrâmero purificados do pico de clari-ficação de QFF proporcionaram cinética de ligação similar comparado comaqueles purificados da composição. Além disso, o teor de ácido siálico dasfrações de monômero purificadas era maior do que aquele do padrão de dí-mero de CTLA4-lg.

Tratamento com guanidina fdimerizacão do tetrâmero): Otetrâmero pode ser convertido ao dímero através de tratamento com guani-dina, seguido por diálise em tampão de fosfato e confirmou que existia comoum dímero através de seg. analítico. Análise cinética do tetrâmero "dimeri-zado" do pico de clarificação de HIC mostrou que suas taxas de kon e k0fferam similares àquelas do dímero de CTLA4-lg.

Exemplo 7: Análise intacta através de ionizacão por eletropulverizacão(ESn-MS

CTLA4-lg foi diluída com TRIS a 100 mM, NaCI a 25 mM, pH de8 para uma concentração final de 0,7 mg/mL. PNGase F (New England Bio-labs) foi diluída 30 vezes com TRIS a 100 mM, NaCI a 25 mM, pH de 8 parauma concentração final de 17 unidades/μΙ.. Volumes iguais (60 μΙ_ cada) deamostra diluída e solução de glicosidase diluída foram misturados e incuba-dos a 37°C durante 4 horas.

A CTLA4-lg desglicosilada resultante (2 μΙ_) foi carregada sobreuma coluna com cartucho de extração em fase reversa Waters Oásis® (2,1 χ20 mm). A coluna carregada foi lavada com 5% de solvente B (solvente A:ácido fórmico a 1% em água, solvente B: ácido fórmico a 1% em acetonitrila)em uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto durante cinco minutos para dessali-nizar, com o eluente desviado para descarte. Ao final de 5 minutos, um gra-diente rápido (5% de solvente B a 95% de solvente B em 10 minutos) come-çou a eluição de CTLA4-lg da coluna; aqui, o eluente foi dirigido para o es-pectrômetro de massa (Waters Micromass Q-Tof micro®) a 45 μΙ_/Γηίη apósdivisão de fluxo (sistema de cromatografia usado foi um Waters Alliance2695 equipado com um detectar Waters 2996).

A tensão de capilar para o Q-Tof microTM foi ajustada a 3kV e atensão de cone de amostra a 40 V. A média das explorações (cada 0,9 se-gundo) foi calculada em uma exploração; o tempo inter-exploração foi de 0,1segundo. O Analisador Q-Tof explora de m/z 800 a 2500. Espectros corres-pondendo à porção maior do que metade da altura de pico máxima (no cro-matograma por TIC) foram combinados usando o software Waters Mass-Lynx®. Os espectros combinados foram submetidos a uma deconvoluçãoWaters MaxEntI. A resolução foi ajustada a 1 Da/Canal e o modelo de danoGaussiano uniforme foi selecionado com largura no ajuste de metade da al-tura entre 0,5-1 Da. Proporções de intensidade mínima para o pico à es-querda e o pico à direita foram ambas ajustadas a 50%.

Exemplo 8: lonização por desabsorcão a laser matriz-assistida - Time ofFliaht (MALDI-TOF)

Os espectros de MALDI-MS foram adquiridos sobre um Omni-Flex® (Bruker Daltonics1 MA) usando um laser de nitrogênio (337 nm). Amos-tras de proteínas foram usadas sem dessalinização ou dessalinizadas usan-do extração em fase sólida na forma de ponteiras de pipeta C4 ZipTip® (Mil-lipore, Bedford MA). As ponteiras de pipeta foram umedecidas com acetoni-trila-água (1: 1 v/v) e equilibradas com ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA)antes de uso. As ponteiras de pipeta foram, então, carregas através de ex-tração e expelindo 10 μί de amostra da pipeta três vezes. A amostra carre-gada foi lavada três vezes com 10 μί de TFA a 0,1%. Amostras de proteínadessalinizadas foram eluídas da pipeta com 10 μΙ_ de acetonitrila para água(1: 1 v/v). As amostras foram colocadas através de mistura de 1 μΙ_ de amos-tra ( dessalinizada ou contendo tampão) com 1 μL de solução de matriz ecolocando 1 μΙ_ da mistura sobre o alvo de aço inoxidável. A solução de ma-triz era uma solução saturada de ácido sinápico água para acetonitrila a 1:1(v/v) contendo TFA a 0,1%. A mistura foi colocada sobre a lâmina de amos-tra para MALDI e deixada secar ao ar antes de ser colocada no espectrôme-tro de massa. Todas as amostra de proteínas foram analisadas no modo deíons linear positivo através de extração retardada usando uma tensão deaceleração de 20 kV e um tempo de retardo de 200 nano-segundos. Um to-tal de 400 espectros pulso único ("single-shot") foi acumulado de cada amos-tra. Calibração externa foi obtida usando uma mistura de proteínas padrõescontendo tripsinogênio (23982 m/z), Proteína A (44613 m/z) e albumina bo-vina (66431 m/z).

MALDI-TOF MS Análise de Peptídeos por MALDI-TOF/MS

A mistura de peptídeo foi separada através de cromatografia defase reversa e frações dos picos cromatográficos foram coletadas e evapo-radas até secagem. A amostra foi reconstituída em 50 μί de tampão de fos-fato a 25 mM, pH de 7,5. DTT foi adicionado para uma concentração final de5 mM e as frações foram incubadas a 50°C durante 20 minutos. Após redu-ção, IAM foi adicionada para uma concentração final de 10 mM e incubadano escuro a 50°C durante mais 20 minutos.

Os espectros de MALDI-MS foram adquiridos sobre um Omni-Flex (Bruker Daltonics, MA) usando um laser de nitrogênio (337 nm). As a-mostras foram preparadas através de mistura de 1 μί de amostra com 1 μίde solução de matriz. A solução de matriz era uma solução saturada de áci-do a-ciano-4-hidróxicinâmico em água: acetonitrila a 1:1 com TFA a 0,1%. Amistura foi colocada sobre a cavidade da lâmina para amostra de MALDI edeixada secar ao ar antes de ser colocada no espectrômetro de massa. To-dos os peptídeos foram analisados no modo de íons positivo refletivo atravésde extração retardada usando uma tensão de aceleração de 20 kV e umtempo de retardo de 200 nano-segundos. Um total de 100 espectros pulsoúnico foi acumulado de cada amostra. Calibração externa foi obtida usandouma mistura de peptídeos padrões contendo angiotensina Il (1046,54 m/z),angiotensina I (1296,68 m/z), substância P (1347,74 m/z), bombesina (1619,82m/z), ACTH clip 1-17 (2093,09 m/z), ACTH clip 18-39 (2465,20 m/z) e soma-tostatina (3147,47 m/z).

Exemplo 9: Análise dos efeitos de meios e constituintes de meio sobreespécies de CTLA4-lg com cadeia simples e multiméricas

Dímero de CTLA4-lg, uma subfração com baixo teor de ácidosiálico, uma subfração com alto teor de ácido siálico, espécies de monômerofrontal e monômero de CTLA4-lg são preparadas e purificadas. Essas amos-tras são usadas em uma série de experimentos de modelamento projetadospara determinar os efeitos dos meios e constituintes de meio sobre a forma-ção de espécies com cadeia simples e espécies de elevado peso moleculardurante tempos entre zero a pelo menos 60 horas. Os efeitos do tampão deformulação, iodoacetamida, fosfato de sódio, cloreto de amônio, meio basal,caldo de fermentação, meio 177e, meio com solução I ácida concentrada,meio com solução Il ácida concentrada, insulina, EDTA, cisteína, ácido lipói-co, glutationa, metionina e isolados de Ievedo sozinhos e em combinaçõessão testados.

Exemplo 10: Análise de moléculas de CTLA4-lg através do tamanho

Um método de cromatografia por exclusão de tamanho (SEG) oqual usa condições de desnaturação pode ser empregado para a quantifica-ção de espécies de proteína de diferentes tamanhos. Em uma modalidade, ométodo de SEC aleatória usando condições de desnaturação pode ser em-pregado para a quantificação de espécies de CTLA4-lg com cadeia simples.CTLA4-lg com cadeia simples podem ser uma espécie carecendo da ligaçãoem ponte de dissulfeto intercadeia. Espécies de CTLA4-lg com cadeia sim-ples isoladas durante o processo de purificação são referidas cornos CTLA4-Ig de cadeia simples nativa. A cadeia simples purificada produzida atravésde redução e alquilação de dímero de CTLA4-lg é referida como cadeia sim-ples induzida. CTLA4-lg de cadeia simples nativa e induzida têm as mesmascaracterísticas.Materiais:

Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), grau ACS

Solução de hidróxido de potássio (KOH) a 45% peso/peso, grau

ACS

Cloreto de sódio (NaCI)1 grau ACS

Pipeteador simples ajustável calibrado, 100 LRainina, (Catálogo No. P-100)

Água (H2O), grau para HPLC

Frascos criogênicos de 2,0 mL Nalgene, (Catálogo No. 5000-0020)

Ácido clorídrico concentrado (HCI) Fisher (Catálogo No. A144-212)

Solução de hidróxido de sódio a 10N, (NaOH) J.T.Baker, (Catá-logo No. 5674-02)

1000 mL de Unidade de filtro de 0,22 mm Corning, (CatálogoNo.430517)

Tubos de ensaio de polipropileno de 15 mL Falcon, (CatálogoNo. 352097)

Azida de sódio (NaN3), grau ACS

Monoidrato de fosfato de sódio, monobásico (NaH2PO4 H2O)

Péletes de hidróxido de potássio (KOH)

Instrumentação e Condições

Módulo de separação HPLC System Waters 2695

Coluna Toso Haas 5 μΤ8Κ 3000 SWXL1 D.l. de 300 mm χ 7,8mm (Parte No. 08541)

Coluna de proteção Toso Haas 5 μΤ8Κ 3000 SWXL, D.l. 40 mmχ 6,0 mm I.D. (Parte No. 08543)

Detector Waters 2487

Detector com comprimento de onda duplo

Comprimento de onda 280 nm

Taxa de fluxo 1 mL/min

Sistema de integração EmpowerVolume de injeção 20 μΙ_Cone. de ensaio Alvo. 10 mg/mL

Fase móvel de KH2PO4 a 0,2M, NaCI a 0,9%, pH de 6,8 comKOH

Tempo de operação do ensaio de 20 min

Coluna em temperatura ambiente

Temperatura da amostra 4°C

Tempo de retenção de monômero 8,7 min ± 1,0 min, espéciesde HMW a 7,5 min ±1,0 min. Se presente, espécies de MW eluirão após opico monomérico.Reagentes

Hidróxido de potássio a 4N (KOH a 4N) (100 mL)

Usar um dos seguintes preparados conforme descrito:

Adicionar 40 mL de água com grau para HPLC e 11,6 mL de so-lução a 45% peso/peso de KOH a um frasco volumétrico de 100 mL. Levar ovolume para 100 mL com água com grau para HPLC.

Em um frasco volumétrico de 100 mL, adicionar 80 mL de águacom grau para HPLC, pesar 22,4 gramas de péletes de KOH e agitar mag-neticamente até completamente dissolvida. Compor o volume de 100 mLcom água com grau para HPLC.

Transferir a solução para uma garrafa de reagente de vidro de250 mL. Misturar bem através de inversão. Armazenar em temperatura am-biente durante até 1 ano.

Fase móvel (KH2PO4 a 0,2 M, NaCI a 0,9%, pH 6,8)Pesar 27,2 gramas de KH2PO4 e 9,0 gramas de NaCI em um béquer de1000 mL. Dissolver os sólidos em 800 mL de água com grau para HPLC u-sando mistura contínua com uma barra de agitação.

Usando um medidor de pH, ajustar o pH da solução para 6,8usando solução de KOH a 4N. Se o pH excede 6,8, ajustar com HCI concen-trado.

Levar o volume final para 1 litro usando um cilindro graduado de1000 mL. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,22 μm.Transferir para uma garrafa de reagente de vidro de 1000 ml_ esubmeter a ultra-som enquanto desfasseifica a vácuo durante 5 +/-1 minuto.Desgasseificar antes de cada uso.

Armazenar em temperatura ambiente durante até 1 mês.

Hidróxido de sódio a 2N (NaOH a 2N)

Transferir 20 ml_ de NaOH a 10N para um cilindro de vidro gra-duado de 100 mL.

Levar o volume para 100 ml_ com água para HPLC.

Pesar 3,45 gramas de NaH2PO4 H2O e 2,92 gramas de NaCI edissolver com mistura com uma barra de agitação em 900 mL de água comgrau para HPLC. Usando um medidor de pH, ajustar o pH da solução para7,4 com NaOH a 2N. Se o pH excede a 7,4, ajustar com HCI concentrado.

Levar o volume final para 1 litro usando um cilindro graduado de1000 mL. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,22 μηπ.

Armazenar a 2°C - 8°C durante até 6 meses.

Tampão de armazenamento de coluna (NaN3 a 0,05% peso/vem Água)

Pesar 50 ± 5 mg de azida de sódio e adicionar a mesma a umbéquer de 1000 mL com uma barra de agitação magnética.

Adicionar 500 mL de água com grau para HPLC ao béquer eagitar até completamente dissolvida.

Levar o volume para 1 L com água. Filtrar a solução através deuma unidade com filtro de 0,22 μιη e entornar em uma garrafa de reagentede HPLC de 1000 mL.

Armazenar em temperatura ambiente durante até 6 meses.Preparo de Espécies de elevado peso molecular e Padrão de Adequabi-lidade de Sistema

Isso proporcionará uma diluição a três de Material de Referênciade CTLA4-lg aquecido a não aquecido e uma quantidade de espécies deelevado peso molecular com uma área percentual de 15% - 30%. Em umtubo de ensaio Falcon de 15 mL, preparar aproximadamente 3 mL de Mate-rial de Referência a 10,0 ± 1,0 mg/mL usando tampão de diluição de CTLA4-lg. A concentração inicial de CTLA4-lg é do COA. Fazer a diluição a 10,0 ±1,0 mg/mL a partir desse valor. Transferir 1,0 mL do Material de Referênciadiluído, feito em um frasco criogênico, para um criofrasco de 2,0 mL usandouma pipeta de 1 mL e aquecer em um banho de água a 67°C ± 2°C durante45 ± 2 minutos. Transferir o Material de Referência aquecido feito antes parao tubo de ensaio de 15 mL usando uma pipeta de 1 mL. Gentilmente pipete-ar para cima e para baixo um volume de 1 mL dos conteúdos do tubo de en-saio para um total de 10 vezes. Esse é o Padrão de Adequabilidade de Sis-tema.

Condições de armazenamento: Preparar alíquotas de 150 μίdo Padrão de Adequabilidade de Sistema em criofrascos de 2,0 mL paraarmazenamento a -80 ± 5°C durante até 1 ano. Obter a concentração inicialde Material de Referência e fazer a diluição a 10,0 ± 1,0 mg/mL a partir des-se valor. Usar um mínimo de 100 μΙ de Material de Referência e uma quanti-dade apropriada do tampão de diluição para obter a concentração final de10,0 ± 1,0 mg/mL. Referi-se à seguinte equação para diluições:

<formula>formula see original document page 364</formula>

Para Substância de Fármaco de CTLA4-lg, fazer a diluição a10,0 ±1,0 mg/mL a partir da concentração de proteína usando um mínimode 100 μL. Transformar em alíquotas de amostra e uma quantidade apropri-ada do tampão de diluição para obter uma concentração final de 10,0 ±1,0mg/mL. Refira-se à seguinte equação para diluições:

<formula>formula see original document page 364</formula>

Uma vez diluída para 10,0 ± 1,0 mg/mL, as amostras podem serarmazenadas a 2°C - 8°C durante até 24 horas. Para Produto de fármaco deCTLA4-lg, fazer a diluição a 10,0 ± 1,0 mg/mL a partir da concentração deproteína usando um mínimo de 200 μL. Transformar em alíquotas de amos-tra e uma quantidade apropriada do tampão de diluição para obter a concen-tração final de 10,0 ±1,0 mg/mL. Refira-se à seguinte equação para dilui-ções:

<formula>formula see original document page 365</formula>

Colocar a fase móvel em um reservatório de solvente e águacom grau para HPLC em outro. Submeter a ultra-som e desgasseificar a vá-cuo antes de operação. Ligar o detector e permitir 15 minutos para aquecerantes da operação. Antes que uma nova coluna ou a atual seja usada paraanálise, submeter a coluna a fluxo com água com grau para HPLC durantepelo menos 20 minutos, seguido por equilíbrio com tampão de fase móveldurante pelo menos 20 minutos. Usar uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min.

Descongelar a 150 pL. Transformar em alíquotas de Padrão de Adequabili-dade de Sistema, adicionar ao frasco para o amostrador automático e colo-car o frasco no amostrador automático. Injetar 20 pL do padrão sob as con-dições.

Determinar o percentual de Espécies de elevado peso molecularque elui a aproximadamente 7,5 minutos de acordo com a seguinte fórmula:(na fórmula abaixo, Monômero, na verdade, se refere a dímero.)

<formula>formula see original document page 365</formula>

onde:

A = área de pico de espécies de elevado peso molecular

B = área de pico de monômero

A área percentual de Espécies de elevado peso molecular nãodeverá ser de menos do que 15%. Se ela é menor do que 15%, adicionarespécies de elevado peso molecular concentradas extra ao Padrão de Ade-quabilidade de Sistema acima.

Resolução (R). Determinação e avaliação de tempo de re-tenção. Injetar 20 μί de Padrão de Adequabilidade de Sistema. Calcular aresolução entre as espécies de elevado peso molecular (tempo de retençãode aproximadamente 7,5 minutos) e o pico de monômero (tempo de reten-ção de aproximadamente 8,7 minutos) usando a seguinte equação: (na fór-mula abaixo, "monômero", na verdade, se refere a dímero).

<formula>formula see original document page 366</formula>

onde:

t1 = tempo de retenção das espécies de elevado peso molecularX2 = tempo de retenção de monômeroW1 = largura de pico de espécies de elevado peso molecularW2 = largura de pico de monômero

A largura de pico é medida em minutos na base do pico apósextrapolação dos lados relativamente retos do pico para a linha de base. Otempo de retenção e largura de pico são medidos nas mesmas unidades.

Em uma modalidade, (R) deve ser > 1,2 e o tempo de retenção para o picodeverá ser 8,7 ±1,0 minutos.

Determinação do número de placas teóricas (N)

A partir do cromatograma de Padrão de Adequabilidade de Sis-tema, determinar a eficiência da coluna calculando o número de placas teó-ricas (N) de acordo com a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 366</formula>

onde:

f = éo tempo de retenção de monômero (em minutos)

w = é a largura (em minutos) na linha de base do monômero ob-tido através de extrapolação dos lados do pico para a linha de base

Um total de seis (6) injeções de material de CTLA4-lg será feito.Transformar em alíquotas de 200 μL de de material de Referência a 10mg/mL em um frasco para amostrador automático e colocar o frasco no a-mostrador automático e injetar seis vezes. Processar os cromatogramas ecalcular a área de pico de dímero para cada cromatógrafo. Somar as áreasde pico de dímero dos seis cromatógrafos e calcular a média, desvio-padrãoe RSD % de acordo com as seguintes equações:

<formula>formula see original document page 367</formula>

onde:

X12,3.....= um valor específico em um conjunto de dados

nx = um conjunto de valores (x)

5.4.4.2 Calcular o desvio-padrão como segue:

<formula>formula see original document page 367</formula>

onde:

η = número de valores (x) em um conjunto de dadosχ = um valor em um conjunto de dados5.4.4.3 Calcular o desvio-padrão relativo % (RSD) como segue:RSD % = Desvio-padrão X 100

Média

Exemplo de uma seqüência de injeção:

<table>table see original document page 367</column></row><table>

Integração de Picos

Integrar todas as áreas de pico no cromatograma de 5,5 a 11,8minutos. Ampliar a linha de base do cromatograma para assegurar que aárea total de todas as espécies LMW e HMW são incluídas na integração.Desconsiderar picos na amostra que correspondem aos picos no controle. Opico de volume de inclusão (11,8-13,5 minutos) e picos posteriores não sãoconsiderados nesse cálculo. Contudo, se a área no volume de inclusão é0,1% ou maior do que a área total, ela deverá ser anotada. O pico de dímeroelui a 8,7 ± 1,0 minutos, o pico de espécies de elevado peso molecular elui a7,5 ±1,0 minutos e as espécies de baixo peso molecular (por exemplo, mo-nômero, se presentes) eluirão após o pico de dímero. Qualquer outro picoque não as espécies de elevado peso molecular, dímero ou espécies de bai-xo peso molecular que tem absorbância a 280 nm acima de 0,1% de área daárea total de pico deverá ser anotado. Calcular a área percentual como se-gue:

(A referência ao "monômero de Abatacept" nesse Exemplo serefere a dímero de CTLA4-lg).

(B)

7.2.1 Area % de espécies de HMW =-χ 100

(A) + (B) + (C)

(C)

7.2.2 Area % de espécies de LMW =-χ 100(A) + (B) + (C)

Área % de monômero = 100 - (área % de HMW + área % de

LMW)onde:

A = área de pico de monômero de abatacept

B = área total de todos os picos com tempos de retenção meno-res do que o monômero de abatacept

C = área total de todos os picos com tempos de retenção maio-res do que o pico de monômero de abatacept (excluindo volume de inclusão)

Amostras foram separadas através de cromatografia por exclu-são de tamanho usando um Water1S Alliance® 2695 (Milford, MA) sobre du-as colunas 7,8 χ 300 mm TSK Gel G3000SWXL® (Tosoh Biosep, Montgo-mery, PA) colocadas em série empregando uma coluna de proteção de 6,0 χ40 mm. 25 microlitros de cada amostra purificada foi injetados e separadossob condições isocráticas usando Na2HPO4 0,1 M , Na2SO4 a 0,1 M, pH de6,8 a 1,0 mL/min. Amostras foram detectadas a 280 nm usando um detector996 PDA (conjunto de fotodiodo) (Waters, Milford, MA) e analisadas usandoum software de cromatografia Millennium 4.0® (Waters, Milford1 MA).

Os cromatogramas sobrepostos de material com cadeia simplesnativo e induzido da cromatografia por exclusão de tamanho aleatória analí-tica desnaturante mostram um tempo de retenção médio (6 réplicas) de27,96 ± 0,02 e 27,99 + 0,02, respectivamente. Descobriu-se que a área mé-dia de pico para cadeia simples nativa era de 495525,0 ± 9589,6 e, para ca-deia simples induzida, era de 463311,8 ± 7997,2 (Tabela 13). Os espectrossobrepostos de MALDI-TOF de material de cadeia simples nativo e induzidotêm picos que são muito amplos, com uma largura na linha de base cerca de15000 unidades de massa. Isso é esperado em virtude da heterogeneidadeda glicosilação em ambas as amostras. O ponto de ápice do pico de cadeiasimples em cada espectro de massa foi usado para calcular a massa média.As massas médias para CTLA4-lg com cadeia simples nativa e induzida sãode 45694,426 + 297,735 e 45333,086 ± 264,778 unidades de massa, respec-tivamente, baseado na análise de seis réplicas (Tabela 14). Espera-se que amassa da cadeia simples nativa seja maior do que aquela da cadeia simplesinduzida, porque sobre a cadeia simples nativa há uma cisteína extra (massado resíduo de 103 Dáltons) sobre Cys146 de SEQ ID NO: 2, enquanto que acadeia simples induzida é um resultado de redução seletiva de uma únicaligação em ponte de dissulfeto intercadeia, seguido por alquilação, que adi-ciona um grupo acetila (massa de 58 Dáltons).

Esses dados mostram que os materiais nativos e induzidos pro-duzem resultados equivalentes através de cromatografia SEC desnaturantealeatória e análise por MALDI-TOF. Esses resultados demonstram a compa-rabilidade entre os materiais de CTLA4-lg com cadeia simples nativos e in-duzidos.Tabela 13: Dados de HPLC SEC de cadeia simples nativa e induzida

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Tabela 14: Dados de Espectrometria de massa MALDl-TOF de cadeia sim-

<table>table see original document page 370</column></row><table>

A presença de cisteínas dentro de uma cadeia polipeptídicapermite a formação de ligações de dissulfeto, as quais podem ser intramole-culares ou intermoleculares, levando à formação de complexos de proteínasdiméricas ou multiméricas. A CTLA4-lg existe como um dímero (em que odímero é composto de dois monômeros tendo qualquer uma das seguintesseqüências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii)27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 2), (v) 25-382 de SEQID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2) mantidas juntas através de umaligação de dissulfeto entre C146 sobre cada cadeia. A redução dessa ligaçãode dissulfeto pode resultar na formação de duas cadeias de proteína equiva-lentes mantidas juntas através de forças eletrostáticas não covalentes.Quando submetida a condições de desnaturação que sobrepujam ou supe-ram as forças eletrostáticas de atração, tal CTLA4-lg pode dissociar comple-tamente, resultando em duas estruturas de proteína idênticas de aproxima-damente 46 kDa. A estrutura resultante é referida como cadeia simples oumonômero. A presença da cadeia simples pode ser monitorada através decromatografia por exclusão de tamanho em coluna aleatória operando sobcondições de desnaturação.

Uma subpopulação de moléculas de CTLA4-lg contém uma mo-dificação sobre Cys146: a ligação de dissulfeto presente na maioria da popu-lação é trocada para um aminoácido de cisteína livre (referido como cisteini-lação). O dímero de CTLA4-lg é predominantemente uma proteína com umpeso molecular de aproximadamente 92.000. Ele é compreendido de duascadeias polipeptídicas glicosiladas as quais são mantidas juntas através deuma ligação de dissulfeto intercadeia em Cys146 e interações não covalentes(também referida como "dímero" de CTLA4-lg). A proteína purificada existecomo uma população heterogênea e contém modificações, tais como glicosi-lações e variações nos N- e C-términos.

Uma população distinta de moléculas de CTLA4-lg existe, a qualcarece da ligação de dissulfeto intercadeia. Essa população não-covalentemente ligada existe dentro do pico de dímero frontal gerado atra-vés de cromatografia por exclusão de tamanho. Descobriu-se que o dímerofrontal carece da ligação de dissulfeto intercadeia. As espécies de CTLA4-lgas quais carecem da ligação de dissulfeto intercadeia são modificadas atra-vés de cisteinilação em Cys146, modificação a qual ocorre sobre >99% dasespécies com cadeia simples, baseado em dados por ESI-MS intacta. Ciste-inilação em Cys146 e o enriquecimento de carboidratos O-Iigados são as du-as principais modificações sobre as espécies de CTLA4-lg com cadeia sim-ples. O dímero frontal é submetido a uma cromatografia por exclusão de ta-manho desnaturante, resultando em isolamento do pico de CTLA4-lg comcadeia simples. O material monomérico frontal purificado foi comparado comCTLA4-lg com e sem extração em fase sólida (SPE) e analisado sobre MAL-Dl. O monômero frontal purificado contém duas espécies dominantes: umauma espécie principal a 47005 u para SPE-tratado ou 46897 u para não-tratado; uma espécie menor a 95070 u para SPE-tratado ou 96172 u paranão-tratado. O material de CTLA4-lg também contém duas espécies domi-nantes: uma espécie principal a 91518 u para SPE-tratado ou 91143 u paranão-tratado; uma espécie menor a 45660 u para SPE-tratado ou 46014 upara não-tratado.

<table>table see original document page 372</column></row><table>

A composição de CTLA4-lg, em uma modalidade, tem as se-guintes características quando de análise por Homogeneidade de Tamanho(HPLC) de dímero, espécies de elevado MW e espécies de baixo MW (mo-nômero, cadeia simples):

• >97,0% de Dímero

• <2,0% de espécies de HMW

• < 0,5% de espécies de LMW (por exemplo, monômero, cadeiasimples)

Em outra modalidade, a composição de CTLA4-lg tem as se-guintes quantidades características de cada espécie:

• >95,5% de dímero

• <3,0% de espécies de HMW

• < 0,5% de espécies de LMW (por exemplo, monômero, cadeiasimples)

Sumário de análise por SE-HPLC de Processo com lotes deCD-CH01

<table>table see original document page 372</column></row><table>O percentual de monômero oscilava de 98,4 a 99,8%, com umvalor médio de 99,4% para Substância de Fármaco fabricada usando o Pro-cesso com CD-CH01. O percentual de espécies de HMW variava de 0,2 a1,6%. O valor médio foi de 0,6%, com um CV de 45,7%. O intervalo de tole-rância de 95% foi >98,7% para o dímero e <1,3% para as espécies de HMW.

O percentual de espécies de HMW dos lotes variava de um valor mínimo de0,4% para um valor máximo de 2,1%. O percentual médio de espécies deHMW foi de 0,8%, com um CV % de 40%. Em todos os casos, as espéciesou monômeros de LMW estavam abaixo do limite de detecção (DL = 0,1%).

O intervalo de tolerância de 95% (proporciona cobertura para 99% da áreada população) para CTLA4-lg fabricada do processo com CD-CH01 foi <1,3e <1,8%, respectivamente, para as espécies de HMW. Os intervalos de tole-rância de 95% para o dímero na Substância de Fármaco do Processo comCD-CH01 foram de 98,7% e 96,5%, respectivamente.

Sumário de dados combinados para CTLA4-lg

<table>table see original document page 373</column></row><table>

A Tabela acima mostra que o percentual de espécies de HMWoscilava de 0,2 a 2,1%, com uma média de 0,6%. O dímero oscilava de94,8% a 99,8%, com um valor médio de 99,3% e uma precisão de 0,3%. Avariação entre-sítio, dentro do-sítio e variação de sítio total para o dímeroestava dentro de 0,3 a 0,5%. A variação entre sítio para a HMW foi de26,4%. A variação dentro do-sítio e sítio-total para as espécies de HMW fo-ram de 44,2 e 51,4%, respectivamente. O intervalo de tolerância de 95%para o dímero (97,3%) e as espécies de HMW (1,8%) estavam dentro daespecificação.EXEMPLO 11: Construção de Vetor

Construção do vetor de expressão pcSD: 0 vetor de expres-são, pcSD, foi construído a partir do vetor pcDNA3 comercialmente disponí-vel (Invitrogen, Carlsbad, CA) conforme mostrado na figura 28. O cassete dogene de resistência à neomicina foi removido do plasmídeo pcDNA3 atravésde digestão com a endonuclease de restrição Nae I. A endonuclease de res-trição Nae I cria extremidades cegas. Os fragmentos de DNA foram separa-dos através de eletroforese em gel de ágarose e a parte principal do vetorpcDNA3 de 3,821 kb foi purificada do gel. O fragmento de DNA contendo ogene que codifica reductase de di-hidrofolato de camundongo (dhfy e umpromotor de SV40 foram isolados do plasmídeo pSV2-dhfr através de diges-tão do plasmídeo com as endonucleases de restrição Pvu Il e BamH I. Ofragmento de 1,93 kb correspondendo ao cassete do gene dhfr foi separadoe purificado através de eletroforese em gel de ágarose. As extremidadescortadas 3' geradas através de digestão com BamH I foram enchidas usandoo fragmento Klenow de DNA polimerase I para gerar extremidades cegas.Esse fragmento isolado foi ligado na parte principal do vetor pcDNA3 de 3,8kb com extremidade cega para criar o vetor de expressão pcSD. Esse vetorde expressão tem as seguintes características: um promotor de citomegalo-vírus (CMV), seguido por um sítio de clonagem múltipla, um sinal de polia-denilação de hormônio de crescimento bovino (BGH) e uma seqüência detérmino de transcrição, uma seqüência de cDNA de dhfr de camundongopara seleção e amplificação e um gene de resistência à ampicilina e a ori-gem de replicação pUC para seleção e manutenção em Escherichia coli.

Construção do vetor de expressão pcSDhuCTLA4-lg: Umfragmento de DNA de 1,2 quilobase (kb) contendo uma seqüência que codi-fica uma proteína de CTLA4-lg foi isolado do plasmídeo pCDM8-CTLA4-lgatravés de digestão com as enzimas de restrição Hind Ill e Xba I. O fragmen-to de 1,2 kb Hind IllIXba I foi ligado no vetor piLN previamente digerido comas enzimas de restrição Hind Ill e Xba I. A estrutura de plasmídeo resultante,designada piLN-huCTLA4-lg, é mostrada na figura 21. O plasmídeo piLN-huCTLA4-lg foi usado como a fonte da seqüência de codificação de CTLA4-Ig usada na construção do vetor de expressão final pcSDhuCTLA4-lg.

O vetor final para expressão do gene de CTLA4-lg foi construídoconforme mostrado na figura 29. Um fragmento de DNA de 1,2 kb contendoo gene de CTLA4-lg foi isolado do plasmídeo piLN-huCTLA4-lg através deum procedimento de digestão por restrição com duas etapas. O plasmídeopiLN-huCTLA4-lg foi primeiro digerido com a enzima de restrição Hind III. Asextremidades cortadas 3-prime resultantes foram enchidas através de trata-mento com o fragmento Klenow de DNA polimerase I. O plasmídeo foi, en-tão, digerido com a enzima de restrição Xba I para liberar o fragmento de 1,2kb contendo o gene de CTLA4-lg. Esse fragmento foi purificado e ligado aosfragmentos EcoR V e Xba I isolados da digestão por restrição de pcSD. Ossítios de restrição EcoR V e Xba I estão localizados no sítio de clonagemmúltipla do pcSD entre o promotor de CMV e um cassete contendo o sinalde poliadenilação de hormônio de crescimento bovino e seqüência de térmi-no de transcrição. Isso colocou o fragmento do gene de CTLA4-lg sob o con-trole do promotor de CMV. Esse plasmídeo é designado pcSDhuCTLA4-lg ecompreende SEQ ID NO: 1.

Exemplo 12: Transfecção de vetor de expressão de CTLA4-lg para obterLinhagens de células estáveis

Esse Exemplo e o Exemplo 13 descrevem uma população re-centemente transfectada de células da qual clones individuais foram selecio-nados e expandidos e, assim, os clones expandidos são diferentes das célu-las depositadas na ATCC como N0. de Acesso CRL-10762. A linhagem decélulas de CHO anterior trazendo um vetor de expressão contendo DNA quecodifica a seqüência de aminoácido correspondendo à CTLA4-lg (DNA tendoNúmero de Acesso à ATCC 68629) é descrita na Patente U.S. N0 5.434.131.Resumidamente, um plasmídeo de expressão (por exemplo, pCDM8) con-tendo cDNA que foi depositado sob No. de Acesso ATCC 68629, foi trans-fectado através de lipofecção usando procedimentos-padrão em células deCHO dhfr negativas para obter linhagens de células que expressam esta-velmente CTLA4-lg. Seleção de linhagens de células de CHO B7 positivascom relação à atividade de ligação a B7 no meio usando imunocoloraçãoresultou em um transfectante estável que expressa CTLA4-lg. Essa popula-ção heterogênea de células transfectadas foi designada a linhagem de célu-las de Ovário, CTLA4-lg-24, e foi deposita na ATCC sob o Tratado de Buda-peste em 31 de Maio de 1991 tendo Número de Acesso à ATCC CRL-10762.

A linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês, DG44, con-tém uma deleção do gene que codifica a enzima reductase de di-hidrofolato.O plasmídeo de expressão pcSDhuCTLA4-lg contém uma cópia do gene dereductase de di-hidrofolato (d/7fr). Inserção do plasmídeo pcSDhuCTLA4-lgno genoma de DG44 resulta em complementação funcional da deleção dodhfr. Essa complementação funcional pode ser usada para a seleção detransfectantes na presença de metotrexato (MTX) e amplificação de dhfr egenes adjacentes.

A linhagem de células 1D5 que secreta CTLA4-lg humana foiconstruída através de transfecção da linhagem de células DG44 com oplasmídeo de expressão pcSDhuCTLA4-lg, conforme mostrado na figura 29.O DNA de plasmídeo foi introduzido em células DG44 através de eletropora-ção usando procedimentos-padrão conhecidos na técnica. Transfectantesforam selecionados usando um meio mínimo essencial (MEM; JRH Biosci-ences, Inc., Kansas) suplementado com Soro Bovino Fetal a 5% (v/v) sub-metido à diálise. Sobrenadantes de cultura dos transfectantes foram selecio-nados com relação à produção de IgG humana usando um método ELISAem sanduíche. Um anticorpo anti-lgG humana de bezerro Fc-específico foiusado como o anticorpo de captura. Anticorpo anti-lgG humana de bezerroconjugado à peroxidase de rábano-silvestre foi usado para detectar a IgGhumana. Transfectantes expressando altos níveis do gene de CTLA4-lg hu-mana foram selecionados para amplificação adicional.

Amplificação de gene dos transfectantes selecionados foi reali-zada através da adição de MTX ao meio de cultura em uma concentraçãofinal de 100 nM. MTX é um análogo de ácido fólico que atua vez um inibidorcompetitivo de reductase de di-hidrofolato. Adição de MTX ao meio permitiuseleção de transfectantes contendo múltiplas cópias do gene dhfr e níveiselevados de reductase de di-hidrofolato. Transfectantes também contendomúltiplas cópias de do gene de CTLA4-lg adjacente foram identificados u-sando o método ELISA específico para IgG humana. Um clone que produzCTLA4-lg, designado 1D5, foi selecionado para desenvolvimento adicional,em parte descrito no Exemplo 13.

Exemplo 13: Subclonaqem de Células Transfectadas estáveis

A linhagem de células 1D5 foi submetida à clonagem em ágarmacio. Subclones derivados da clonagem em ágar macio foram analisadoscom relação à produção de IgG humana usando o método ELISA. Subclonesselecionados foram avaliados quanto à produção de CTLA4-lg e proprieda-des de crescimento. O subclone protótipo, designado 1D5-100A1, foi sele-cionado.

A linhagem de célula 1D5-100A1 foi adaptada a partir de meioDE (JRH Biosciences, Inc., Kansas, o qual contém matérias primas originá-rias de animal, para um meio quimicamente definido designado CD-CHO(Tabela 15). Meio CD-CHO é um meio isento de componente animal paten-teado fabricado pela Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.

Tabela 15:Composição de Meio Y de Processo

<table>table see original document page 377</column></row><table>

A linhagem de célula 1D5-100A1 foi cultivada e passada emmeio DE de acordo com um protocolo padrão de cultura tecidual. As célulasforam, então, transferidas para um meio composto de 50% de meio DE e50% de meio CD-CHO. Após várias passagens nesse meio, as células foramtransferidas para T-frascos contendo 100% de meio CD-CHO. As célulasforam desenvolvidas em 100% de meio CD-CHO durante várias passagens.As células adaptadas foram, então, submetidas à clonagem através de dilui-ção limitativa.

Células da linhagem de célula 1D5-100A1 CD-CHO-adaptadaforam clonadas através de diluição limitativa usando meio isento de soro. Ascélulas 1D5-100A1 foram cultivadas em um alvo de 1 célula/cavidade emlâminas de microtitulação com 96 cavidades contendo meio MCDB suple-mentado. MCDB é uma formulação de meio quimicamente definida distribuí-da pela Sigma-Aldrich, St. Louis1 MO. O meio MCDB foi suplementado comglutamina a 4 mM, 500 μg/mL de insulina humana recombinante, MTX a 100nM e meio condicionado a 10%. O meio condicionado era um sobrenadanteesterilizado em filtro de uma cultura da linhagem de célula 1D5-100A1 CD-CHO adaptada desenvolvida em meio MCDB.

Cavidades contendo uma única colônia foram identificadas e osclones avaliados quanto à produção de CTLA4-lg usando o método ELISA.Clones selecionados foram expandidos de lâminas de microtitulação com 96cavidades para lâminas de cultura de células com 6 cavidades. As culturasforam ainda expandidas em T-frascos de 25 cm2 e, então, em garrafas gira-tórias.

As culturas na garrafa giratória foram avaliadas quanto à titula-ção de CTLA4-lg, teor de ácido siálico em CTLA4-lg e crescimento. Trêsclones foram selecionados para avaliação adicional em Biorreatores e carac-terização adicional. Estoque de pesquisa do frasco congelado da linhagemde célula clonal 1D5-100A1.17 armazenado a -80°C foi usado para gerar umbanco de célula.

Exemplo 14: Produção de CTLA4-lg em Biorreatores via um processocom alimentação em batelada

Cultura em escala comercial de Células de mamífero em sus-pensão Expressando CTLA4-lg: Esse Exemplo descreve a produção demoléculas de CTLA4-lg compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2, apartir de células de CHO cf/7/r-negativas cultivadas em suspensão. Os méto-dos descritos nesse Exemplo podem ser adaptados e estendidos para aprodução de outras proteínas recombinantes incluindo, mas não limitado a,proteínas secretadas tais como citocinas e outros hormônios, proteínas se-cretadas que são membros da superfamília Ig ou compreendem uma porçãode uma proteína da superfamília Ig e geralmente qualquer proteína expressaem células de CHO. Um fluxograma de processo para as etapas de culturade CTLA4-lg é mostrado na figura 10.

Os frascos de cultura (por exemplo, T-175 e Frascos de Erlenm-yer), garrafas giratórias e sacos para célula foram usados para as etapas deexpansão de inóculo do processo de cultura de CTLA4-lg para propágar se-rialmente células de um frasco congelado para proporcionar um número su-ficiente de células viáveis para inocular um biorreator de 20.000 L.

Um único frasco de células é removido da fase vapor de umcongelador de armazenamento de nitrogênio líquido e descongelado em umbanho de água a 37°C. Os conteúdos todos do frasco são assepticamentetransferidos para um tubo para centrífuga cônico de 15 mL estéril. Meio CD-CHO é adicionado para levar o volume final para 10 mL. A célula suspensa écentrifugada, o sobrenadante descartado e o pélete de célula ressuspensoem 10 mL de Meio de cultura de células CD-CHO. As células ressuspensassão transferidas para um frasco T-175 contendo 10 mL de Meio CD-CHO. Adensidade de células viáveis e a viabilidade percentual da cultura no frascoT-175 são determinadas. Um critério para a viabilidade percentual nessaetapa de > 84% foi estabelecido. Meio CD-CHO é adicionado ao frasco T-175 para obter uma densidade-alvo de células viáveis de 1,7-2,6 χ 105 célu-las/m L.

O frasco T-175 é incubado a 37°C em uma atmosfera de dióxidode carbono a 6% durante um máximo de quatro dias para obter um númerode células final alvo de > 6 χ 106 células viáveis. Após a etapa com frasco T-175, a cultura é expandida usando uma série de fracos para agitador, garra-fas giratórias de 1 L e 2 L, conforme mostrado na figura 10. Em cada passa-gem, as células são cultivadas em uma densidade-alvo de 2,0 χ 105 célulasviáveis/mL, em que as culturas são direcionadas para ter uma viabilidadecelular de cultura final >80%. As culturas são incubadas em Meio CD-CHO a37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo dequatro dias.

Expansão da cultura ocorre em uma série de sacos para célula(20 L1 100 L e 200 L) de forma a inocular adicionalmente um biorreator de1000 L. Material de cultura de célula da etapa de expansão de inóculo emgarrafas giratórios de 2 L é empoçado para inocular um saco de célula de 20L em uma densidade de cultura-alvo de 2,0 χ 105 células viáveis/mL. Umacondição para a densidade final de células viáveis na etapa de expansão deinóculo em garrafa giratória de 2 L de 1,0 a 2,0 χ 106 células/mL e uma viabi-lidade celular percentual mínima de > 80% foi estabelecida. Quando de ino-culação, a cultura em saco de célula de 20 L é incubada em Meio CD-CHO a37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo dequatro dias. Para cada subsequente passagem (sacos para célula de 100 Le 200 L), as células são cultivadas em uma densidade-alvo de 2,0 χ 105 cé-lulas viáveis/mL, em que as culturas são direcionadas para ter uma viabili-dade celular de cultura final £80%. As culturas são incubadas em Meio CD-CHO a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante ummáximo de quatro dias. Valores exemplificativos para a densidade final decélulas viáveis expansão etapa de inóculo em saco de célula de 20 L, 100 Le 200 L de 1,0 a 2,0 χ 106 células/mL e uma viabilidade celular percentualmínima de > 80% foram estabelecidos. Esses valores exemplificativos asse-guram que um número suficiente de células viáveis é usado para inocular 0biorreator de 1000 L.

O objetivo das etapas de expansão de inóculo em biorreator decultura de 1000 L e 4000 L do processo com CTLA4-lg é proporcionar umnúmero suficiente de células viáveis para inocular o biorreator de produçãode 20.000 L.

Os biorreatores de cultura são operados no modo em bateladausando Meio de cultura de células CD-CHO. A temperatura, pH, oxigêniodissolvido, pressão, agitação e taxas de fluxo de gás para ar, oxigênio e dió-xido de carbono são controladas através de um sistema de controle distribu-ído (DCS) e proporcionam condições para crescimento ótimo da cultura nosbiorreatores de cultura. Os biorreatores de cultura são operados a 37°C.Amostras de cultura são removidas dos biorreatores de cultura para a de-terminação de densidade de células viáveis, viabilidade percentual e concen-trações de metabólito.

O biorreator de cultura de 1000 L é inoculado com inóculo daetapa de expansão em saco de célula de 200 L para uma densidade-alvoinicial de células viáveis de 1,0 a 3,0x105 células viáveis/mL. a cultura é in-cubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 5 dias. Valoresexemplificativos para a densidade final de células viáveis etapa de expansãode inóculo no biorreator de cultura de 1000 L é de 1,0 a 2,0 χ 106 células/mLe a viabilidade celular percentual mínima é > 80%.

O biorreator de cultura de 4000 L é inoculado com inóculo daetapa de expansão no biorreator de cultura de 1000 L para uma densidade-alvo inicial de células viáveis de 1,0 a 3,0x105 células viáveis/mL. A cultura éincubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 6 dias. Valoresexemplificativos para a densidade final de células viáveis na etapa de ex-pansão de inóculo no biorreator de cultura de 4000 L é de 1,0 a 2,0 χ 106células/mL e a viabilidade celular percentual mínima é > 80%. Esses valoresexemplificativos asseguram que um número suficiente de células viáveis éusado para inocular o biorreator de produção de 20.000 L.

O biorreator de cultura de 20.000 L é inoculado com inóculo daetapa de expansão no biorreator de cultura de 4000 L para uma densidade-alvo inicial de células viáveis de 1,0 a 1,8 x105 células viáveis/mL. A culturaé incubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 6 dias. Valoresexemplificativos para a densidade final de células viáveis na etapa de ex-pansão no biorreator de cultura de 20.000 L é de 1,0 a 2,0 χ 106 células/mLe a viabilidade celular percentual mínima é > 80%. Esses valores exemplifi-cativos asseguram que um número suficiente de células viáveis é usado an-tes de iniciar a fase de produção no biorreator de produção de 20.000 L.

Produção em escala comercial de CTLA4-lg: A fase de produ-ção da presente invenção que ocorre em um biorreator de produção de20.000 L produz proteína de CTLA4-lg em alta quantidade e alta qualidade,o que envolve operações de cultura tendo um desvio de temperatura em du-as etapas. A cultura de 20.OOOL que é incubada em Meio CD-CHO a 37°Cdurante um máximo de 6 dias (conforme descrito acima) é submetida a umdesvio de temperatura (T-desvio) de 37°C para 34°C no dia 6 (o final da fasede crescimento logarítmico). Doze horas após o desvio de temperatura de37°C para 34°C, Meio CD-CHO é suplementado com um meio de alimenta-ção eRDF modificado (Invitrogen Corp., Carlsbad1 CA; Tabelas 16, 17) e es-sa alimentação é fornecida diariamente ao reator de produção como um bolo(1% peso/peso).

Tabela 16: Composição do meio de alimentação eRDF_

<table>table see original document page 382</column></row><table>

Tabela 17: ComDosicão do meio eRDF-1

<table>table see original document page 382</column></row><table>L-Hidroxiprolina 31,5

L-Serina 85,10

L-Treonina 110,8

L-Triptofano 18,40

L-Tirosina 2 Na 2Η20 108,10

L-Valina 108,9

Ácido Para Amino Benzóico 0,51

Vitamina B12 0,339

Biotina 1,00

Pantotenato de D-Ca 1,29

Cloretodecolina 12,29

Ácido fólico 1,96

i-lnositol 46,84

Niacinamida 1,47

PiridoxaIHCI 1,00

Piridoxina HCI 0,420

Riboflavina 0,21

TiaminaHCI 1,59

Putrescina 2HCI_0,020

A cultura de 20.000L é incubada em Meio CD-CHO suplementa-

do diariamente com meio de alimentação eRDF a 34°C durante um máximode 4 dias. No dia 10, a cultura de 20.000 L é submetida a um segundo des-

vio-T de 34°C para 32°C. A cultura de produção de 20.000 L no biorreator de

produção foi mantida a 32°C durante um máximo de 8 dias. No dia 18, a

amostra de cultura foi analisada com relação aos seguintes valores exempli-

ficativos: densidade de células viáveis na etapa de produção no biorreator de

cultura de 20.000 L é de 3,0 a 8,0 χ 106 células/mL; viabilidade celular per-

centual mínima é > 38%; proporção molar final de ácido siálico (descrita em

alguma parte aqui) é > 6; e titulação final de produto de proteína de CTLA4-

Ig é de 0,5 a 1,3 g/L. Esses valores exemplificativos asseguram que um pro-

duto de proteína de qualidade e quantidade suficientes está sendo produzido

pela linhagem de células de CHO recombinante e que a cultura de células

de mamífero de 20.000 L está pronta para ser coletada. À cultura no biorrea-

tor durante a fase de produção, é fornecida uma alimentação em bolo diáriausando meio eRDF modificado (Tabela 16, 17), como segue : começando 12horas após o desvio de temperatura inicial (37°C para 34°C), um mínimo de1% de volume de cultura foi adicionado como meio de alimentação; se o ní-vel de glicose cai para abaixo de 3 g/L, um volume calculado é adicionadopara levar o nível de glicose de volta para 3 g/L.

A fase de produção teve uma duração de 18 dias na escala de20.000 L. Amostras foram tomadas em uma base diária do biorreator deprodução para análise. Por exemplo, a amostra usada para contagem decélulas foi corada com azul de tripano (Sigma, St. Louis, Mo.). A contagemde células e determinação de viabilidade celular foram realizadas usando umhemocitômetro para conter células viáveis coradas sob o microscópio. Paraanálise de metabólitos, uma amostra adicional transformada em alíquotas foicentrifugada durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para peletizar as células.O sobrenadante foi analisado com relação à titulação de proteína, ácido siá-lico, glicose, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amônia e LDH,usando técnicas e protocolos convencionalmente praticados na técnica.Exemplo 15: Purificação de CTLA4-lg recombinante

Cromatografia de troca de ânions QXL para purificação deCTLA4-lg: A etapa de cromatografia de troca de ânions no processo comCTLA4-lg usa uma resina de troca de ânions Q Sefarose Extreme Load (Q-XL). Essa resina é fornecida pela GE Healthcare, Waukesha, Wl (formal-mente Amersham Biosciences). A etapa de cromatografia QXL é para captu-rar e concentrar o dímero de CTLA4-lg do material em-processo das etapasde operação de coleta para processamento adicional a jusante.

Uma coluna com diâmetro interno de 1,0-2,0 m é empacotadacom resina QXL em uma altura de 17 a 30 cm, representando um volume decerca de 643 L a 1018 L. A coluna é qualificada para uso determinando aaltura equivalente a uma lâmina teórica (HETP) e assimetria (As) da colunaempacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são em-pregadas para qualificação da coluna QXL.

A operação da coluna QXL é realizada em temperatura ambien-te. O caldo de cultura de células clarificado é carregado sobre uma colunaQXL equilibrada. A etapa de cromatografia QXL é realizada usando uma ta-xa de fluxo máxima de 99,4 L/min. A pressão de entrada da coluna é manti-da abaixo de 35 psig. A carga máxima de proteína de CTLA4-lg para a colu-na QXL é de 28 gramas de CTLA4-lg por litro de resina.

A coluna de cromatografia QXL é primeiro sanitarizada com umasolução de hidróxido de sódio a 1N. A sanitarização é realizada usando 2 a 4volumes de coluna (CV) da solução de hidróxido de sódio a 1N. A sanitariza-ção está completa quando a condutividade do efluente da coluna é igual a169 + 33 mS/cm e a coluna é mantida durante 60 a 120 minutos.

Após etapa de sanitarização, a coluna é equilibrada com umtampão de HEPES a 75 mM, cloreto de sódio a 360 mM, pH de 8,0. O equi-líbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio foipassado através da coluna e o pH do efluente é de 8,0 ± 0,2 e a condutivi-dade do efluente é de 13,4 ± 1,0 mS/cm.

O material em-processo da etapa de operação de coleta é car-regado sobre a coluna de QXL. A coluna é lavada com um mínimo de 10 CVde tampão de Lavagem (HEPES a 75 mM, NaCI a 360 mM, pH de 8,0) e aabsorbância a 280 nm (A2so) do efluente da coluna é medida ao final da eta-pa de lavagem. CTLA4-lg é, então, eluída da coluna com um tampão deHEPES a 25 mM, NaCI a 325 mM ou NaCI a 850 mM, pH de 7,0. O eluato édesviado para um vaso de coleta quando a A2eo aumenta para > 0,02 unida-des de absorbância (AU) acima do valor de AU ao final da etapa de Iava-gem. O eluato é coletado até que a A2so da borda guia do pico de eluiçãodiminua para um valor de < 1,0 AU.

Um dímero de produto de CTLA4-lg com uma proporção molarde mois de ácido siálico para mois proteína de CTLA4-lg que é ^ 8 é coleta-do e um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg está presente a £ 25,7%. O material de espécies de elevado pesomolecular de CTLA4-lg, o qual inclui tetrâmeros, pode, então, ser ainda puri-ficado para uso como uma substância distinta para os métodos de tratamen-to descritos aqui.

HIC em Phenyl Sefarose FF para purificação de CTLA4-lg: Aetapa de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usa resina Phenyl Se-pharose Fast Flow (GE Healthcare, Waukesha, Wl (formalmente AmershamBiosciences)). A etapa de HIC reduz o nível de material de espécies de ele-vado peso molecular de CTLA4-lg presente no reservatório de produto deQXL. O dímero de CTLA4-lg não se liga à resina de HIC sob as condiçõesde carregamento usadas para a etapa de HIC.

Uma coluna com diâmetro interno de 1,0 a 2,0 m é empacotadacom resina Phenyl Sepharose Fast Flow para uma altura de 18 a 22 cm, re-presentando um volume de cerca de 680 a 852 L. A coluna é qualificada pa-ra uso determinando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação dacoluna de HIC.

A operação da coluna de HIC é realizada em temperatura ambi-ente. O reservatório de eluato da etapa na coluna QXL é carregada sem ou-tro tratamento à coluna de HIC equilibrada. A etapa de HIC é operada emuma taxa de fluxo máxima de 65,4 L/min e em uma pressão de operação de<13 psig. A carga máxima de proteína de CTLA4-lg aplicada à coluna deHIC é de 10,0 g de proteína de CTLA4-lg por litro de resina. Múltiplos ciclosda etapa de HIC podem ser empregados baseado na quantidade proteína deCTLA4-lg presente no reservatório de eluato de QXL.

A coluna de HIC é primeiro sanitarizada com uma solução dehidróxido de sódio a 1 Ν. A sanitarização está completa quando 2 a 4 CV dasolução de hidróxido de sódio a 1N passaram através da coluna. A coluna é,então, mantida durante 60 a 120 minutos para assegurar essa sanitarização.

Após a etapa de sanitarização, a coluna é equilibradas com umtampão de HEPES a 75 mM, cloreto de sódio a 2,55 M, pH de 7,0. O equilí-brio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio pas-sou através da coluna e o pH do efluente é de 7,0 ± 0,3 e a condutividade éde 71,5 a 75,5 mS/cm.

O eluato da etapa QXL é aplicado à coluna de HIC equilibrada. Acoluna é, então, lavada com o tampão de equilíbrio até que a A280 do efluen-te diminua para entre 0,8 e 1,0 AU. O efluente contendo proteína de CTLA4-Ig de cada ciclo da etapa de HIC é filtrado através de um filtro de acetato decelulose de 0,2 μιτι em um vaso de coleta de aço inoxidável comum. Essereservatório de produto de HIC é mantido no vaso de coleta a 2o a 8°C. Otempo máximo de contenção no vaso de coleta é de 3 dias.

Um dímero de produto de CTLA4-lg com uma proporção molarde mois de ácido siálico para mois proteína de CTLA4-lg que é >8 é coletadoe um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg está presente a < 2,5%.

Cromatografia por afinidade em proteína A recombinantepara purificação de CTLA4-lg: A resina de afinidade por proteína A recom-binante Sepharose Fast Flow (rPA) usada no processo de produção de C-TLA4-lg a jusante é obtida da GE Healthcare (Waukesha, Wl (formalmenteAmersham Biosciences)). A coluna da etapa de cromatografia rPA ainda pu-rifica a proteína de CTLA4-lg. Essa etapa remove DNA e proteína de célulashospedeiras, incluindo proteína 1 quimiotática de monócito (MCP-1).

Uma coluna com diâmetro interno de 80 a 140 cm é empacotadacom resina rPA para uma altura de 18 a 25 cm, representando um volumede cerca de 339 a 372 L. A coluna é qualificada para uso determinando aHETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma Asde 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna. O número máximode uso para a resina rPA estabelecido em um estudo de vida útil da resina é60.

A operação na coluna de rPA é realizada em temperatura ambi-ente. O reservatório de produto da inativação viral é carregado sobre a colu-na de rPA equilibrada. A etapa de rPA é operada em uma taxa de fluxo má-xima de 26,7 L/min e uma pressão de operação de < 13 psig. A carga máxi-ma de proteína de CTLA4-lg aplicada à coluna de rPA é de 25 g de proteínade CTLA4-lg por litro de resina.

A coluna de rPA é equilibrada com um tampão de Tris a 25 mM,NaCI a 250 mM, pH de 8,0. Equilíbrio está completo quando um mínimo de 3CV de tampão de equilíbrio passou através da coluna e os valores de pH econdutividade dos efluentes estão entre 7,8 a 8,2 e 23,0 a 27,0 mS/cm, res-pectivamente.

O reservatório de produto da etapa de inativação viral é aplicadoà coluna de rPA equilibrada. A etapa de cromatografia rPA inclui duas eta-pas de lavagem. A primeira etapa de lavagem é realizada usando um míni-mo de 5 CV de um tampão de Tris a 25 mM, NaCI a 250 mM, Triton X-100 a0,5%, pH de 8,0 para remover material fracamente ligado da coluna de rPA.A segunda etapa de lavagem é realizada usando um tampão de Tris a 25mM, NaCI a 250 mM, pH de 8,0. A segunda etapa de lavagem usa um míni-mo de 5 CV para remover o Triton X-100 residual da coluna de rPA.

A proteína de CTLA4-lg é eluída da coluna de cromatografia rPAcom um tampão de glicina a 100 mM, pH de 3,5. O eluato é desviado paraum vaso de coleta quando a A2so aumenta para >0,2 AU acima da linha debase. O efluente da coluna é filtrado através de um filtro de acetato de celu-lose de 0,2 μίτι em um vaso de coleta equipado com um agitador. O eluato écoletado até que a A2so da borda guia do pico de eluição diminua para umvalor de □ 0,2 AU. O pH do eluato empoçado é ajustado para um pH de 7,5± 0,2 com um tampão de HEPES a 2 M, pH de 8,0. O reservatório de produ-to da etapa de cromatografia rPA é mantido a 2 a 8°C durante um máximode 3 dias.

Um dímero de produto de CTLA4-lg com uma proporção molarde mois de ácido siálico para mois proteína de CTLA4-lg que é £8 é coleta-do; um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg está presente a <2,5%; e um reservatório de MCP-1 < 38 ng/mLestá presente.

Cromatografia de troca de ânions QFF para purificação deCTLA4-lg: A etapa de cromatografia de troca de ânions no processo de pro-dução de CTLA4-lg produção a jusante usa uma resina de cromatografia detroca de ânions Q Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare (Waukesha,Wl (formalmente Amersham Biosciences). O objetivo da etapa de cromato-grafia QFF é reduzir os níveis residuais de proteína A e proporcionar redu-ção adicional de DNA de célula hospedeira do reservatório de produto daetapa de filtração viral. A etapa em coluna QFF é também usada para con-trolar a proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-lg do re-servatório de produto da etapa de cromatografia QFF e proporcionar controleadicional de níveis de materiais de HMW de CTLA4-lg em-processo. O pontode controle primário em-processo para a redução de Material de HMW deCTLA4-lg é a etapa de HIC.

Uma coluna com diâmetro interno de 60 a 140 cm é empacotadacom resina QFF para uma altura de 28 a 35 cm, representando um volumede cerca de 536 a 667 L. A coluna é qualificada para uso determinando aHETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e umaAs de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna.

A operação na coluna QFF é realizada em temperatura ambien-te. O reservatório de produto da etapa de filtração viral é carregado sobre acoluna QFF equilibrada. A etapa QFF é operada em uma taxa de fluxo má-xima de 38,7 L/min e uma pressão de operação de < 0,2413 MPa manomé-trico (35 psig). A carga máxima de proteína de CTLA4-lg aplicada à colunaQFF é de 25 g de proteína de CTLA4-lg por litro de resina.

A coluna de cromatografia QFF é primeiro sanitarizada com umasolução de hidróxido de sódio a 1 Ν. A sanitarização é realizada usando 2 a4 CV da solução de hidróxido de sódio a 1N. A sanitarização está completaquando a condutividade do efluente da coluna é igual a 136 a 202 mS/cm ea coluna é mantida durante 60 a 120 minutos.

Após a etapa de sanitarização, a coluna é equilibrada com umtampão de HEPES a 25 mM, cloreto de sódio a 100 mM, pH de 8,0. O equi-líbrio está completo quando um mínimo de 4 CV de tampão de equilíbriopassou através da coluna e o pH do efluente é de 7,7 a 8,3 e a condutivida-de é de 10,5 a 12,9 mS/cm.

O reservatório de produto da etapa de filtração viral contido emsacos de bioprocesso é transferido para um vaso de coleta de aço inoxidávelestéril.

O reservatório de produto da etapa de filtração viral é aplicado àcoluna QFF equilibrada. A etapa de cromatografia QFF inclui duas etapas delavagem. A primeira etapa de lavagem é realizada usando um mínimo de 5,0CV de um tampão de HEPES a 25 mM, NaCI a 120 mM, pH de 8,0. A se-gunda etapa de lavagem é realizada usando um mínimo 5,0 CV de um tam-pão de HEPES a 25 mM, NaCI a 130 mM, pH de 8,0.O dímero de CTLA4-lg é eluído da coluna de cromatografia QFFusando um tampão de HEPES a 25 mM, NaCI a 200 mM, pH de 8,0. A cole-ta de eluato é iniciada quando a A2eo do efluente começa a aumentar. Duran-te eluição, o efluente da coluna é filtrado através de um filtro de acetato decelulose de 0,2 µl? no vaso de coleta de aço inoxidável. O eluato é coletadoaté que a absorbância da borda guia do pico de eluição diminua para <0,2AU acima da linha de base. O vaso de coleta é, então, esfriado para 2 a 8°C.O tempo de contenção máximo para que o produto da etapa de cromatogra-fia QFF empoce a 2 a 8°C é 3 dias.

Um dímero de produto de CTLA4-lg com uma proporção molarde mois de ácido siálico para mois proteína de CTLA4-lg que é £8 é coleta-do; um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg está presente a £2,5%; um reservatório de material de baixo pesomolecular de CTLA4-lg (por exemplo, monômero de CTLA4-lg) está presen-te a <0,5%; e um reservatório de MCP-1 ^ 9,5 ng/mL está presente.

O sistema Pall Filtron TFF é usado na etapa de concentração ediafiltração do processo de produção de CTLA4-lg a jusante. O objetivo des-sa etapa é concentrar o produto da etapa de cromatografia QFF. Empoçarpara 45 a 55 g/L e trocar o tampão de eluição usado na etapa de cromato-grafia QFF pelo tampão final usado para Composições de CTLA4-lg. O pro-duto de proteína de CTLA4-lg concentrado empoçado é transferido atravésde um filtro de fluoreto de polivinilideno de 0,2 µlt? e para um saco de biopro-cesso de 50 L.

Exemplo 16: CTLA4-lg-Proporcão molar Determinação de Amino mo-nossacarídeos

Esse Exemplo proporciona métodos para obter proporções mo-lares de amino monossacarídeos (N-acetil galactosamina, N-acetil glicosa-mina) para proteína em amostras de CTLA4-lg.

Instrumentação: Sistema de eletroforese em capilar BeckmanP/ACE MDQ CE System; sistema de detecção com Detector Beckman La-ser-Induced-Fluorescence (LIF) (acoplado com P/ACE MDQ); Capilarnão revestido (d.i. de 25 µlt?; d.e. de 360 µm), comprimento total de 27-31cm para acomodar P/ACE MDQ ou 5510 PoIyMicro Technologies, Cat. No.TSP025375; Misturador Maxi-Mix Thermolyne, (VWR Catálogo No. 5881 Ο-185)

Reagentes:

Solução de hidrólise (solução aquosa de HCI a 4 N)

Adicionar 160 ml_ de HCI a 6 N e 80 mL de água com grau paraHPLC a uma garrafa de vidro de 250 mL.Agitar para misturar bem.Armazenar a 2-8°C durante até 6 meses. Solução de Derivatização I (solução aquosa de APTS a 0.1 M)

Adicionar 192 μL de água com grau para HPLC a 10 mg de póde APTS em um frasco de vidro.

Submeter o frasco a turbilhonamento 5-10 segundos para dis-solver completamente o APTS.

Armazenar a -20°C durante até um ano.

Solução de Derivatização Il (ácido acético a 1 M e NaBHaCN a 0.25 M)

Diluir 20 μL ácido acético com 320 μί água com grau para HPLC(diluição de 17 vezes) em um tubo para centrífuga a 0,4 mL para fazer umasolução de ácido acético a 1 M.

Pesar 2,0 ± 0,5 mg de NaBHsCN em um frasco criogênico.Usando a seguinte fórmula, adicionar um volume apropriado dasolução de ácido acético a 1 M para fazer 0,25 M NaBHaCN a 0,25 M.Volume (pL) = 103 χ (peso de NaBH3CN em mg)/(62,84 g/mol χ 0,25 mol/L)

• Cianoborohidreto de sódio (NaBHaCN) deverá ser armazenadono escuro em um secador.

• Sub-divisão do reagente em uma série de criofrascos de 2,0mL para armazenamento é recomendada para evitar abertura repetida dagarrafa de reagente original como segue:

• Pesar 1,0 g ± 0,2 mg de cianoborohidreto de sódio em um crio-frasco de 2,0 mL. Transformar em alíquota os conteúdos todos de cianobo-rohidreto de sódio da garrafa original dessa maneira.

• Tampar hermeticamente e rotular os criofrascos seqüencial-mente (1,2,3, etc.) junto com o nome do reagente, número de lote e umadata de expiração de 6 meses.

• Os frascos deverão ser vedados com parafilme para evitar u-midade.

· Pesar cianoborohidreto de sódio para a Solução de Derivatiza-ção II não mais do que três vezes a partir do mesmo criofrasco. Anotar issoe do número de seqüência do criofrasco na folha de dados do laboratório.

• Um pico de reagente observado no perfil de CE ou pobre rotu-lação pode ocorrer após abertura repetida do criofrasco ou com esse lote decianoborohidreto de sódio em particular. Se isso afeta os resultados, descar-tar o criofrasco que está sendo usado e pesar reagente de um criofrascocom o próximo número de seqüência ou de um novo lote de cianoborohidre-to de sódio.

Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM. pH de 9.5)

Pesar 0,210 ± 0,02 g de bicarbonato de sódio em um béquer devidro limpo de 100 mL.

Adicionar 90 ml_ de água com grau para HPLC e misturar sobreuma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos.Ajustar o pH para 9,5 ± 0,1 com NaOH a 10 N.

Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume finalpara 100 mL. Filtrar (etapa1.26) a solução e armazenar em temperatura am-biente durante até 3 meses.

Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 í 5 mM. pH de 9.25)

Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sódio em um béquer devidro limpo de 100 mL.

Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturar sobreuma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos.

Ajustar o pH para 9,25 ±0,10 com NaOH a 10 N.

Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume finalpara 100 mL para uma concentração final de 60 ± 5 mM.

Para uma solução a 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetraboratode sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação.Para uma solução a 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02) de tetraboratode sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação.

Armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses. Pre-parar tampão fresco se a resolução de pico é obtida (valor R <1,0).

Opcional: Diluir solução de tampão de tetraborato (MicroSoIv)através da adição de 120 ml_ de água ultra pura a 80 mL de tampão de te-traborato de sódio a 150 mM para uma concentração final de 60 mM (± 5mM). Titular com NaOH a 10N para levar o pH da solução para 9,25 (± 0,1).

Para uma solução de tetraborato a 55 mM, diluir 66 mL de tam-pão de tetraborato de sódio a 150 mM em 114 mL de água ultra pura. Titularconforme acima.

Para uma solução de tetraborato a 65 mM, diluir 78 mL de tam-pão de tetraborato de sódio a 150 mM em 102 mL de água ultra pura. Titularconforme acima.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante um má-ximo de 3 meses.

Preparar tampão fresco se a resolução de pico é obtida (valor R < 1,0).

Soluções de enxáque capilar

Solução de NaOH a 10 N

Adicionar 1 mL de solução de NaOH a 10 N em um tubo de plás-tico graduado de 15 mL contendo 9 mL de água com grau para HPLC. Mistu-rar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6meses.

Solução de HCI a 6N:

Adicionar 1 mL de solução de HCI a 6 N em um tubo de plástico

graduado de 15 mL

contendo 5 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem a-través de turbilhonamento 5-10 seg.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6meses.

3.6.3 Solução de metanol a 80%:Adicionar 8 mL de metanol com grau para HPLC em um tubo deplástico graduado de 15 mL contendo 2 mL de água com grau para HPLC.Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6meses.

Soluções de estoque de Padrão de MonossacarídeoN-Acetil Glicosamina (GaINAc)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de GaINAc em um frasco criogêni-co de 2,0 mL.

Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bematravés de turbilhonamento até dissolvida.

Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).N-Aeetil Galaetosamina (GIcNAc)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de GIcNAc em um frasco criogêni-co de 2,0 mL.

Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).N-Aeetil Manosamina (ManNAe)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de ManNAc em um frasco criogê-nico de 2,0 mL.

Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).

Armazenar Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeoa -20°C durante até 1 ano.

Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de pa-drão interno

Diluir a solução de estoque de ManNAc 100 vezes com águacom grau para HPLC através da adição de 20 pL de solução de estoque deManNAc em um frasco criogênico de 2 mL o qual já contém 1980 pL de á-gua com grau para HPLC. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5a 10 segundos.

Armazenar a solução de trabalho de padrão interno a 2-8 0C du-rante até 6 meses.

Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de Trabalho

Padrão de Mistura Amino

Em um frasco criogênico de 2,0 ml_ contendo 1960 μΙ_ de águacom grau para HPLC, adicionar 20 μΙ_ de soluções de estoque de GaINAc eGIcNAc1 respectivamente. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5a 10 segundos.

Armazenar a solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino a 2-8°C durante até 6 meses.

Soluções de amostra e Material de Referência.

Descongelar as amostras de proteína a 2-8°C e misturar ligeira-mente através de inversão.

Diluir as amostras e Material de Referência com água com graupara HPLC para cerca de 1,0 mg/mL. Anotar a concentração para três situa-ções representativas.

Condições de operação CE

Tampão de Operação (etapa 2.5) tetraborato de sódio a 60 mM,pH de 9,25

Temperatura de cartucho do capilar 25°CTensão de 25-30 kV, modo positivo

Condição do detector: Detector LIF, Excitação: 488 nm, Emis-são: 520 nm.

Injeção de amostra Modo de injeção sob pressão, 20 s a 0,5 PSI

Tempo de operação 10 minutos

Armazenamento de amostra 10°C

Procedimento

Nota: Usar uma pipeta de 10 μl e microponteiras para transferirvolumes de amostra de 10 μl e pipetas de tamanho apropriado para transfe-rir outros reagentes (veja faixas na etapas 2.10 a 2.14).HidróliseEm um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 pL de so-lução de trabalho de ManNAc e 200 μL de Solução de Hidrólise a 4 N (etapa3,1). Isso serve como uma corrente de sistema.

Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μl de so-lução de trabalho de ManNAc e 10 μL de Solução Padrão de Mistura Amino(etapa 3,9). Adicionar ainda 200 μL de Solução de Hidrólise a 4N. Isso servecomo padrão de monossacarídeo para quantificação e Adequabilidade desistema. Preparar em duplicata.

Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μl de so-lução de trabalho de ManNAc e 10 pL de solução de Material de Referênciade CTLA4-lg (aproximadamente 1 mg/mL).

Adicionar ainda 200 μί de solução de HCI a 4N. Preparar emduplicata.

Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μl de so-lução de trabalho de ManNAc e 10 μl de solução de amostra (aproximada-mente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 μl de solução de HCI a 4N. Prepararem duplicata.

Submeter a turbilhonamento as amostras durante aproximada-mente 10 segundos e centrifugar durante aproximadamente 5-10 segundos.Colocar as amostras em uma prateleira para frasco com 96 posições e incü-bar em um forno a 95°C durante 6 horas.

Após hidrólise, colocar as amostras hidrolisadas a -20°C durante10 minutos para esfriar.

Centrifugar rapidamente as amostras hidrolisadas até que qual-quer condensado seja forçado para o fundo do tubo (5-10 segundos em altavelocidade). Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac.

Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evapo-ração em "Baixa".

Reconstituir cada amostra com 100 pL de água com grau paraHPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras atésecagem em um SpeedVac.

Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evapo-ração em "Baixa".Reaceti lacão

Reconstituir cada amostra com 10 μL de tampão de reacetilaçãoM6 e submeter a turbilhonamento 5-10 seg. para misturar bem. Adicionar 4μL de reagente de reacetilação M3 a cada tubo. Submeter a turbilhonamentodurante aproximadamente 5-10 segundos. Incubar sobre gelo durante 30minutos.

Nota: O tampão de reacetilação (M6) e reagente (M3) podemser substituídos, respectivamente, por NaHCO3 a 25 mM (adicionar 20 μL)preparado no local e anidrido acético (adicionar 4 pL).

Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac.

Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau paraHPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras atésecagem em um SpeedVac.

Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evapo-ração em "Baixa".Derivatização

Colocar a micro centrífuga no forno para equilibrar para a tempe-ratura do forno de 55°C.

Reconstituir cada amostra com 10 μL de Solução de Derivatiza-ção I (solução de APTS a 0,1 M1 etapa 3,2). Submeter a turbilhonamentoaproximadamente 5-10 segundos.

Adicionar 5 μL da Solução de Derivatização Il (HAc a 1M e Na-

BH3CN a 0,25 M, etapa 3.3). Submeter a turbilhonamento aproximadamente5-10 segundos e centrifugar.

Carregar rapidamente os frascos de amostra na centrífuga pré-aquecida e colocar a centrífuga de volta no forno a 55 °C. Incubar durante 3horas enquanto centrifuga a 2000 rpm. Isso impede a condensação de sol-vente sobre a superfície do frasco.Preparo de instrumentaçãoInstalar um novo capilar, enxaguar no modo de alta pressão (80PSI) usando as seguintes etapas:

NaOH a 1 N durante 20 minutos.

água com grau para HPLC durante 10 minutos.

tampão de tetraborato de sódio a 60 mM durante 10 minutos.

Operação

Antes cada operação, operar as seqüências de lavagem/enxá-gue para enxaguar o capilar.

Então, operar o Padrão de Adequabilidade de Sistema (padrãode monossacarídeo) para assegurar que o sistema é adequado.

Uso de NaOH a 1N pode causticar o interior de capilares de dife-rentes vendedores e causa um desvio nos tempos de migração por toda aoperação. Se isso faz com que o tempo de migração do último pico (GIcNAc)seja maior do que 10,0 minutos, pode ser necessário substituir NaOH a 1Npor NaOH a 0,1 N ou água com grau para HPLC para o enxágue da etapa 2.

Quando uso de um capilar equivalente e do procedimento delavagem acima não é adequado, uso de metanol a 80% e/ou HCI a 1N podeser necessário para que o último pico (GIcNAc) esteja dentro dos valoresexemplificativos de 10,0 minutos.

Preparo de injeção

Após derivatização, deixar as amostras esfriar para a temperatu-ra ambiente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos em temperaturaambiente, até o condensado ser forçado para o fundo do tubo.

Adicionar 85 μί de água com grau para HPLC a cada tubo paralevar o volume final de cada amostra para 100 μί. Submeter a turbilhona-mento durante 5-10 segundos.

Transferir 10 μl de amostra de cada tubo para um microfrascopara CE e adicionar 190 μί de água com grau para HPLC a cada tubo.Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos.

Etapas de enxágue e seqüência de injeção:

Nota: Para cada quatro injeções, trocar o Tampão de Operaçãode CE por Tampão de Operação de CE recentemente preparado (em virtudedo efeito de depleção tônica). Realizar enxágue do capitara 0,2757 MPa(40 psi).

<table>table see original document page 399</column></row><table><table>table see original document page 400</column></row><table>

Adequabilidade de sistema

Nota: Valores de Adequabilidade de sistema são determinadosusando as primeiras injeções de padrão de adequabilidade de sistema, amenos que de outro modo especificado.

O eletroferograma do primeiro padrão de adequabilidade de sis-tema deverá ser similar àquele mostrado na figura 81, onde o pico 1 é Gal-NAc; o pico 2 é ManNAc; o pico 3 é GIcNAc.

Nota: Quando outros instrumentos de CE que não BeckmanPACE MDO têm de ser usados, o comprimento do capilar poderia ser dife-rente daquele especificado nesse método em virtude de várias configura-ções de cartuchos contendo o capilar de separação. Isso causaria variaçõesno tempo de migração de analito, bem como intensidade de pico.

A resolução entre dois picos vizinhos é calculada para os primei-ros padrões de Adequabilidade de Sistema pelo instrumento de acordo coma seguinte equação:

<formula>formula see original document page 400</formula>

onde:

R = resolução

Í2, ti = tempos de migração dos dois picos vizinhos, respectiva-mente

Wi, W2 = larguras de pico na linha de base dos dois picos vizi-nhos, respectivamente

O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar com asseqüências de lavagem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tam-pão antigo por Tampão de Operação recentemente preparado ou substituir ocapilar. Para a última injeção de Adequabilidade de sistema, o último pico(GIcNAc) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguinte fórmula:

T = W0,85/2f

onde:

T = fator de configuração

W0, es - largura de pico a 5% da altura

f = largura do pico frontal no pico máximo

Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as seqüências de lava-gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampãode operação recentemente preparado ou substituir o capilar.

As injeções repetidas mostram aos seguintes valores exemplifi-cativos:

· Proporção de área de pico de GIcNAc vs. MaNAc: RSD □ 10%(calculada na etapa 7,1)

• Tempo de migração de GIcNAc deverá ser < 10,0 minutos

• Perfil deverá ser equivalente à figura 81, onde os três picossão observados e o padrão interno (ManNAc) é o pico de número 2.

Se qualquer um dos valores exemplificativos acima não é atingi-do antes de testagem das amostras, primeiro aumentar a tensão se o tempode migração de GIcNAc é maior do que 10,0 minutos. Em seguida, se a pro-porção de área de pico é > 10%, preparar tampão de CE fresco tendo certe-za de seu pH ou substituir o capilar. Após ajuste do instrumento, repetir inje-ções de Adequabilidade de Sistema. Quando de análise do perfil de pico, seuma diminuição significativa na altura de pico de ManNac ocorre, verificar sedeterminados cabos de fibra óptica no módulo de LIF não estão mal alinhados.

Determinar o RSD percentual para o padrão monossacarídicoatravés de comparação da proporção de áreas de pico dos componentes dopadrão interno e padrão de monossacarídeo. Dividir a área de pico para ca-da componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno paracada injeção de padrão de monossacarídeo. Calcular o RSD percentual paraGaINAc e GIcNAc para os dois padrões entre as faixas. O RSD deverá ser <10%. Se esse valor médio exemplificativo não é obtido, então, o capilar de-verá ser enxaguado ou substituído conforme acima.

Cálculos

Calcular a Proporção de área de pico de GaINAc e GIcNAc comrelação ao padrão interno (ManNAc). Usado sobre injeções repetidas dosprimeiros quatro Padrões de Adequabilidade de sistema de modo a ir ao en-contro dos valores exemplificativos acima e realizar os mesmos cálculos so-bre todos os Padrões de Adequabilidade de sistema injetados antes e apósamostra(s) entre faixas.

Proporção de área de pico = Dividir a área de pico para cadacomponente de monossacarídeo (GlcNAc, GaINAc) pela área de pico dopadrão interno (ManNAc) para cada injeção de Padrão de Adequabilidade deSistema.

<table>table see original document page 402</column></row><table>

Calcular uma média das proporções de área de pico paraGIcNAce GaINAc nos Padrões de Adequabilidade de sistema. Calcular também umdesvio-padrão (S.D.) e desvio-padrão relativo percentual (RSD %)

Valores exemplificativos: RSD para a área de pico

Proporção de GIcNAc < 10%.

Dois Padrões de Adequabilidade de sistema entre as faixas inje-tados antes e após

amostra(s): RSD percentual para a proporção de área de pico deGIcNAc e GaINAc < 10%.

Se esse valor exemplificativo médio não é obtido (RSD > 10%),então, o capilar precisa ser re-enxaguado com os procedimentos de enxá-gue e aquelas amostras e padrões de monossacarídeo entre as faixas preci-sam ser operadas novamente. Se o valor exemplificativo médio ainda não éobtido, substituir o capilar e enxágue. Operar as amostras e padrões de mo-nossacarídeo entre as faixas novamente.<formula>formula see original document page 403</formula>

onde:

η = número de medições na amostra

χ = medições individuais

<formula>formula see original document page 403</formula>

Cálculo da proporção molar de GaINAc/Proteína:

<formula>formula see original document page 403</formula>

onde:

RGaINAc = proporção molar de GaINAc vs. proteína

AGaINAe = área de pico (μΝ/.seg) de GaINAc na amostra

AManNAc = área de pico ^V.seg) de ManNAc na amostra

AManNAcO = área de pico (μΝ/.seg) média de ManNAc em padrãode monossacarídeo

AcaiNAco = área de pico (μΝ/.seg) média de GaINAc em padrão demonossacarídeo

VcaiNAco = volume de GaINAc contido em solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em μL)

Vp = volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWabatacept = Peso molecular de Material de Referência Aba-tacept conforme o Certificado de Análise (COA)

MWqicnac = Peso molecular de GaINAc (221,2 dáltons)

Padrões entre faixas

Quando de cálculo das proporções molares de material de C-TLA4-lg e amostras, usar todos os oito Padrões de Adequabilidade de sis-tema entre as faixas. Calcular as médias das áreas de pico para inclusãonessa equação. Essa deve ser usada para as primeiras três amostras. Paratodas as outras amostras, sempre usar a área média de pico dos próximosquatro padrões de monossacarídeo entre as faixas e os quatro padrões an-teriores de monossacarídeo entre as faixas para cálculos da proporção mo-lar.

Cálculo da proporção molar de GlcNAc/Proteína

<formula>formula see original document page 404</formula>

onde:

Rgicnac = proporção molar de GIcNAc vs. proteínaAgicnac = área de pico (μΝ/.seg) de GIcNAc na amostraAManNAc = área de pico (μΝ/.seg) de ManNAc na amostraAManNAco = área de pico (μΝ/.seg) média de ManNAc em padrãode monossacarídeo

Aqicnaco = área de pico (μΝ/.seg) média de GIcNAc em padrão demonossacarídeo

Vgicnaco = volume de GIcNAc contido em solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em μΙ_)

CGinNAco = concentração de GIcNAc contido em em solução detrabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)

N/p = volume de amostra de proteína usada para hidrólise (emμL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWcTLA4-ig = Peso molecular de Material de Referência de C-TLA4-lg

MWgicnac = Peso molecular de GIcNAc (221,2 dáltons)Valores exemplificativos. O RSD percentual para as duas pro-porções de área de pico para Padrão de Adequabilidade de Sistema aminoentre as faixas não deverá exceder a 10%. A proporção molar média paraamino monossacarídeos no Material de Referência deverá ser dentro da fai-xas especificadas na tabela diretamente abaixo. Para cada componente, oRSD % para os quatro resultados (injeção em duplicata de preparados emduplicada) deve ser </ = 25%.

Tabela - Faixa de proporção molar de Material de Referência de CTLA4-Ig

<table>table see original document page 405</column></row><table>

Exemplo 17: Determinação de proporção molar de aminomonossacarí-deos (GaINAc e GIcNAc) através de eletroforese capilar (CE)

Em uma modalidade, a composição de CTLA4-lg tem a caracte-rística de ter de cerca de 15-35 mois de GIcNAc / mol de proteína e de cercade 1,7-3,6 mois de GaINAc / mole proteína. O exemplo a seguir descreve ummétodo de determinação dessas proporções molares.

Reagentes: Solução de hidrólise (HCI a 4N); Solução de Deriva-tização I (ácido 8-amino-1,3,6-trissulfônico a 0,1M, sal de trissódio (APTS)solução aquosa); Solução de Derivatização Il (NaBH3CN a 0,25 M em ácidoacético a 1M); Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM,pH9,5); Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a 1N; HCI a 1N; metanol a80%); Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo de GaINAc, Glc-NAc e ManNAc em uma concentração de 5 mg/ml; Solução de trabalho demonossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno é uma diluição a100 vezes de solução de estoque de ManNAc; Solução de trabalho de mo-nossacarídeo II: Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino, uma dilui-ção a 100 vezes de soluções de estoque de GaINAc e GIcNAc.

Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CESystem; Detector: sistema de detecção induzido a laser Beckman (LIF) aco-plado com P/ACE MDQ); capilar não revestido (d.i. de 25 μm, d.e. de 360μm) comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ.

Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampão deOperação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura de car-tucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição do detec-tor: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção de amos-tra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5PSI; Tempo de operação: 10min; Armazenamento de amostra: 10°C.

Hidrólise: 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 200 μL deHCI a 4N foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μL de solu-ção de trabalho de ManNAc e 10 μL de Solução-Padrão de Mistura Aminoforam misturados com 200 μL de HCI a 4N para fazer o Padrão de monos-sacarídeo. 10 μl de solução de trabalho de ManNAc e 10 μl de dímero deCTLA4-lg (aproximadamente 1 mg/ml) foram misturados com 200 μL de HCIa 4N para fazer a amostra de teste. Todos os tubos foram submetidos a tur-bilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante 10 seg, seguido porincubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hidrólise, as amostrasforam colocadas a -20°C durante 10 min para esfriar. As amostras foramcentrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.

Reacetilação: Amostras hidrolisadas e secas foram reconstituí-das com 100 μL de água com grau para HPLC. As amostras reconstituídasforam re-acetiladas através da adição de 10 μl de tampão de re-N-acetilação M6 (GIyko) e 4 μL de reagente de reacetilação M3 (Glyko), segui-do por mistura e com incubação sobre gelo (30 min). As amostras foramcentrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.

Derivatização: Amostras reconstituídas (100 μL de água comgrau para HPLC) foram equilibradas 55°C, seguido pela adição de 10 μl deSolução de Derivatização I, uma rápida mistura e adição de 5 μL de Soluçãode Derivatização II. As amostras foram carregadas em uma centrífuga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto centrifugava a 2000 rpm.

Injeção de CE: O volume final das amostras após derivatizaçãofoi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho deCE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempode operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampãode Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrõesde monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho deCE (tempo de operação de 10 min). Após a operação de injeção de cadapadrão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibradocom água com grau para HPLC e tampão de Operação. O eletroferogramada Adequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 30.

Cálculos:

Calcular a proporção de área de pico de GaINAc e GLCNAc comrelação ao padrão interno ManNAc.

Proporção de área de pico = área de pico de monossacarídeo(GaINAc ou GlcNAc)/área de pico de ManNAc

em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de áreade pico é igual ou menor do que 10%.

Calcular a proporção monossacarídeo (por exemplo, GaINAc)para proteína de CTLA4-lg:

ProporçãOGalNAc = (AGaiNAc x AManNAcO X VGaiNAeO X CcaINAcO X MWdímero de CTLA4- Ig) / (AManNAc X AGalNAcO X Vp X Cp X MWGaiNAc)

ProporçãOGalNAc = proporção molar de GaINAc versus proteína

AcalNAc = área de pico ^V.seg) de GaINAc na amostra

AManNAe = área de pico (μΝ/.seg) de ManNAc na amostra

AManNAeo = área média de pico ^V.seg) de ManNAc no padrãode monossacarídeo

AGaiNAeo = área média de pico (μΝ/.seg) de GaINAc no padrão demonossacarídeo

CGaiNAeo = concentração de GaINAc contido em solução de tra-balho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/ml)Vp = volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/ml)

MW cTLA4-ig = Peso molecular de dímero de CTLA4-lgMWeaiNAc = 221,2 dáltons.

Tabela 18: Proporção molar média de Monossacarídeo paramoléculas ou dímeros de CTLA4-lg

<table>table see original document page 408</column></row><table>

Exemplo 18: Determinação de proporção molar de monossacarídeosneutros fmanose. fucose e galactose) através de eletroforese capilar(ÇE)

Reagentes: Solução de hidrólise (ácido trifluoroacético a 2M(TFA)); Solução de Derivatização I (ácido 8-amino-1,3,6-trissulfônico a 0,1 M1sal de trissódio (APTS) solução aquosa); Solução de Derivatização Il (Na-BH3CN a 0,25M em ácido acético a 1M); Tampão de Operação (tetraboratode sódio a 60 ± 5 mM, pH9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a1N; HCI a 1N; metanol a 80%); Soluções de estoque de Padrão de Monos-sacarídeo de manose (Man), fucose (Fuc), galactose (GaI) e xilose (XyI) emuma concentração de 5 mg/ml; Solução de trabalho de monossacarídeo I:Solução de trabalho de padrão interno é 100 vezes diluição de solução deestoque de Xyl; Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de tra-balho padrão de mistura neutra, 100 vezes diluição de soluções de estoquede Man, Fuc e Gal.

Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CESystem; Detector: Sistema de detecção induzida a laser Beckman (LIF) aco-plado com P/ACE MDQ); Capilar não revestido (d.i. de 25 μm, d.e. de 360μm) comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ.

Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampãode Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura decartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição dodetector: Detector LIF1 excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção deamostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5 PSI; Tempo de operação:10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.

Hidrólise: 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 200 μL de

TFA a 2M foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μL de Solu-ção de trabalho de xilose e 10 μL de Solução-padrão de mistura neutra fo-ram misturados com 200 μL de TFA a 2M para fazer o Padrão de monossa-carídeo. 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 10 μL de dímero de Ο-TLA4-lg (aproximadamente 1 mg/ml) foram misturados com 200 μL de TFAa 2M para fazer a amostra de teste. Todos os tubos foram submetidos a tur-bilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante 10 seg, seguido porincubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hidrólise, as amostrasforam colocadas a -20°C durante 10 min para esfriar. As amostras foramcentrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.

Derivatização: Amostras foram reconstituídas com 100 μL deágua com grau para HPLC e foram equilibradas 55°C, seguido pela adiçãode 10 μL de Solução de Derivatização I, uma rápida mistura e adição de 5μL de Solução de Derivatização II. As amostras foram carregadas em umacentrífuga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto cen-trifugava a 2000 rpm.

Injeção de CE: O volume final das amostras após derivatizaçãofoi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho deCE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempode operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampãode Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrõesde monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho deCE (15 min tempo de operação). Após a operação de injeção de cada pa-drão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibrado comágua com grau para HPLC e tampão de Operação. O eletroferograma daAdequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 31.

Cálculos:

Calcular a proporção de área de pico de Man, Gal e Fuc comrelação ao padrão interno Xilose.

Proporção de área de pico = área de pico de monossacarídeo(Gal, Fuc ou Man)/Área de pico de xilose

em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de áreade pico é igual a ou menor do que 10%.

Calcular a proporção de monossacarídeo (por exemplo, Man)para proteína de CTLA4-lg:

PropOrçãOMan = (AMan X AXy|0 x VManO X CManO X MW dímero de CTLA4-lg) /(AXy| X AManO X Vp X Cp X MWMan)

PropOrçãOMan = proporção molar de Man versus proteína

AMan = área de pico (μΝ/.seg) de Man na amostra

AXyi = área de pico (μΝ/.seg) de Xyl na amostra

Axyio = área de pico (uV.seg) média de Xyl no padrãode monossacarídeo

AMano = área de pico (μΝ/.seg) média de Man no pa-drão de monossacarídeo

VMano = volume de Manose contido em solução detrabalho de monossacarídeo usada para hi-drólise (em μL)

CMano = concentração de Manose contido em soluçãode trabalho de monossacarídeo usada para

hidrólise (em mg/ml)

Vp = volume de amostra de proteína usada parahidrólise (em μL)

Cp = concentração de amostra de proteína usadapara hidrólise (em mg/ml)

MW cTLA4-ig = Peso molecular de dímero de CTLA4-lg

MWwan = 180,2 dáltons.Tabela 19: Proporção molar média de Monossacarídeo para moléculas oudímeros de CTLA4-lg

<table>table see original document page 411</column></row><table>

EXEMPLO 19: PRODUÇÃO DE CTLA4A29YL104E-lg

CTLA4A29YL104E-lg é uma proteína de fusão geneticamente modi-ficada, a qual consiste no domínio de ligação funcional da CTLA-4 humanamodificada e do domínio Fc da imunoglobulina humana da classe IgGI. Du-as substituições de aminoácido foram feitas na região de ligação a B7 dodomínio de CTLA-4 (L104E e A29Y) para gerar essa molécula. Ela é com-preendida de duas cadeias polipeptídicas glicosiladas de 357 aminoácidoscada. Ela existe como um dímero covalente ligado através de uma ligaçãode dissulfeto intercadeia. A CTLA4A29YL104E-lg tem uma massa média de a-proximadamente 91.800 Da1 conforme determinado por meio de espectro-metria de massa através de ionização por deabsorção a laser matriz-assistida time-of-flight (MALDI-TOF).

CTLA4A29YL104E-lg é uma forma modificada de CTLA4-lg. A modi-ficação consiste em mutações de ponto que resultam em duas substituiçõesde aminoácido (L104E e A29Y). Com relação à CTLA4-lg, a CTLA4A29YL104E-Ig se liga CD80 (B7-1) com avidez ~2 vezes aumentada e se liga a CD86(B7-2) com avidez ~4 vezes aumentada. A CTI_A4A29YL104E-lg é aproximada-mente 10 vezes mais eficaz do que o abatacept na inibição de proliferaçãode células T1 produção de citocina e morte CD28-dependente de células alvopor células assassinas naturais. A CTI_A4A29YL104E-lg causa inibição modestade proliferação de células T B7-1-mediada, mas é acentuadamente maispotente no bloqueio proliferação de células T B7-2-mediada. Esse Exemplodescreve a produção de moléculas de CTI_A4A29YL104E-lg compreendendoSEQ ID NO: 4. Os métodos descritos nesse Exemplo podem ser adaptadose estendidos para a produção de outras proteínas recombinantes incluindo,mas não limitado a, proteínas secretadas tais como citocinas e outros hor-mônios, proteínas secretadas que são membros da superfamília Ig ou com-preendem uma porção de uma proteína da superfamília Ig e geralmentequalquer proteína expressa em células de CHO.

Um fluxograma de processo para as etapas de cultura de C-TLA4A29YL104E-lg é mostrado na figura 24. CTLA4A29YL104E-lg é produzida embiorreatores de produção de 5000 L com um volume de trabalho aproximadode 4000 L. Uma batelada de Substância de Fármaco é produzido a partir deum único biorreator de produção derivado de um único frasco de um bancode célula. O processo de produção envolve três estágios consistindo em ex-pansão de inóculo, cultura de células de produção e purificação a jusante. Oestágio de expansão de inóculo é conduzido usando meio isento de compo-nente animal. O estágio de cultura de células de produção é também reali-zado em meio isento de componente animal, com exceção do uso de D-galactose.

Meios de cultura de célula. Todos os meios são preparadosem vasos de meio limpos do tamanho apropriado e esterilizados através defiltração. A composição do meio utilizado para expansão de inóculo é apre-sentada na tabela abaixo.

Meio basal de crescimento celular de inóculo

<table>table see original document page 412</column></row><table>Meio de alimentação no biorreator de produção

<table>table see original document page 413</column></row><table>

Expansão de inóculo

Um frasco congelado do banco de células é descongelado emuma temperatura controlada e centrifugado para remover o meio crioprote-tor. As células são ressuspensas em meio de inóculo e recuperadas em umT-frasco. Uma viabilidade celular mínima após descongelamento de 80% éum valor exemplificativo. A temperatura e dióxido de carbono são controla-dos durante a incubação etapa no T-frasco. O T-frasco é incubado até queum número de células viáveis de 1,0 χ 107 células seja obtido e os conteú-dos são transferidos para um frasco de agitação. A cultura é expandida atra-vés de uma série de frascos de agitação para obter o volume de inóculo re-querido. A faixa de densidade de cultura para as passagens no frasco deagitação é de 1,0 a 3,0 χ 105 células viáveis/mL. A temperatura, dióxido decarbono e velocidades do agitador são controlados durante a etapa de incu-bação em frasco de agitação. As culturas no frasco de agitação são empo-çadas em um vaso de transferência de inóculo estéril quando se atinge umadensidade de células viáveis faixa de 1,5 a 3,0 χ 106 células/mL. Aproxima-damente 20 litros da etapa de expansão de inóculo em frasco de agitaçãofinal são transferidos para o biorreator de cultura de 140 L para obter umafaixa inicial de densidade celular de 0,2 a 1,0 χ 106 células viáveis/mL.Operação do biorreator de cultura

um biorreator de cultura de 140 L com um volume de trabalho deaproximadamente 90 litros é operado no modo em batelada. A temperatura,

pH, pressão e concentração de oxigênio dissolvido no biorreator de culturade 140 L são monitorados e controlados usando um sistema de controle dis-tribuído (DCS). As amostras são obtidas diariamente do biorreator de culturade 140 L para monitorar o crescimento celular. A faixa de densidade de cul-tura do biorreator de cultura de 140 L é de 0,2 a 1,0 χ 106 células viáveis/mL.

O biorreator de cultura de 140 L é usado para inocular um biorreator de cul-tura de 1100 L quando uma densidade de células viáveis de >1,5 χ 106 célu-las/mL é obtida. A duração da etapa no biorreator de cultura de 140 L é deaproximadamente 3 dias. A densidade-alvo inicial de células viáveis no bior-reator de cultura de 1100 L é de 0,4 a 1,5 χ 106 células viáveis/mL.

O biorreator de produção de 1100 L contém um volume de cultu-ra inicial de 260 litros. O biorreator de produção de 1100 L é operado no mo-do em batelada. A temperatura, pH, pressão e concentração de oxigêniodissolvido no biorreator de cultura de 1100 L são monitorados e controladosusando um DCS. O volume da cultura é aumentado para 900 litros com meiobasal quando a densidade de células viáveis atingiu >1,5 χ 106 células/mL.

As amostras são obtidas diariamente do biorreator de cultura de 1100 L paramonitorar o crescimento celular. O biorreator de produção de 1100 L é usadopara inocular um biorreator de produção de 5000 L quando uma densidadede células viáveis de >2,0 χ 106 células/mL é obtida. A duração da etapa nobiorreator de cultura de 1100 L é de aproximadamente 4 dias. A densidade-alvo inicial de células viáveis no biorreator de produção de 5000 L é de 0,4 a1,5 χ 106 células viáveis/mL.

Operação do biorreator de produção

O biorreator de produção de 5000 L contém um volume de cultu-ra inicial de 3000 litros. O biorreator de produção de 5000 L é operado emum modo de alimentação em batelada com temperatura, pH, pressão e con-centração de oxigênio dissolvido monitorados e controlados usando umDCS. Um bolo de sulfato de dextrano é adicionado à cultura a aproximada-mente 72 horas. Durante a operação de um biorreator de produção, o pontode ajuste da temperatura de cultura é desviado de 37° para 34°C a 144 ± 8horas. O desvio de temperatura e a adição de sulfato de dextrana são reali-zados para prolongar a duração de alta viabilidade celular na etapa com obiorreator de produção de 5000 L. As amostras são obtidas do biorreatorpara monitorar o crescimento e biabilidade celular, concentração de glicose,Iactato e amônia. As amostras são também testadas com relação à concen-tração de CTLA4A29YL104E-lg e proporção molar de ácido siálico para proteínade CTI_A4A29YL104E-lg. o meio de alimentação é adicionado ao biorreator paramanter uma concentração de glicose desejada. O critério de coleta primáriopara um biorreator de produção é a proporção molar de ácido siálico paraproteína de CTI_A4A29YL104E-lg. um biorreator de produção é coletado emuma proporção molar alvo de ácido siálico para proteína de CTLMa29yl104e-Ig de D6. a duração da etapa com o biorreator de produção de 5000 L é deaproximadamente 14 dias. O volume de coleta do biorreator de produção de5000 L é de aproximadamente 4000 litros.

Remoção de célula e Concentração de produto

As células são removidas do caldo de cultura através de microfil-tração em fluxo tangencial usando membranas de 0,65 μm. o permeado damicrofiltração é concentrado através de ultrafiltração em fluxo tangencial u-sando membranas com um corte de peso molecular nominal de 30 kDa(NMWCO). a pressão transmembrana e taxas de fluxo são controladas du-rante as etapas de microfiltração e ultrafiltração. o concentrado é, então,passado através de uma série de filtros de membrana, com uma filtraçãofinal através de um filtro de uso único de 0,2 μm. O pH do concentrado é a-justado para 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 0,5 M. os filtrosde microfiltração e ultrafiltração são de uso múltiplo. Os filtros de microfiltra-ção são limpos com hipoclorito de sódio e Triton X-100 e armazenados emácido fosfórico. os filtros de ultrafiltração são limpos com hipoclorito de sódioe hidróxido de sódio e, então, armazenados em hidróxido de sódio.

EXEMPLO 20: PURIFICAÇÃO DE CTLA4A29YL104E-lq RECOMBINANTE

Exemplo 20-A: Um exemplo de um processo de purificação deCTI_A4A29YL104E-lg é mostrado no fluxograma a seguir e a descrição de umprocesso de purificação é proporcionada através desse Exemplo.<figure>figure see original document page 19</figure>

Inativação viral

O pH do material coletado concentrado clarificado é ajustadopara 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 0,5 M. Agentes viraisadventícios potenciais são inativados através da adição de Triton X-100 a20% para uma concentração final de 0,5% (v/v). A solução de proteína trata-da com Triton X-100 é misturada durante > 2 horas.Cromatografia por afinidade

Cromatografia por afinidade usando uma resina para colunaMabSeIect Protein A (GE Healthcare, formalmente conhecida como Amer-sham Biosciences) é usada para capturar a proteína de CTI_A4A29YL104E-lg domaterial em-processo da etapa de inativação viral e separar a proteína debelatacept da maioria das impurezas.A coluna MabSeIect Protein A é equilibradas com um tampão deNaH2PO4 a 25 mM, NaCI a 150 mM, pH de 7,5. A capacidade de ligação di-nâmica da resina de afinidade é 25 g de proteína de CTI_A4A29YL104E-lg porlitro de resina em uma velocidade linear de 350 cm/hora. O leito da colunade 157 L é capaz de ligação de aproximadamente 3,9 kg de proteína de C-TLA4A29YL104E-lg.

O material em-processo tratado com Triton X-100 é aplicado àcoluna MabSeIect Protein Aea coluna é lavada com um mínimo de 3 volu-mes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio para remover impurezas fraca-mente retidas. Essas impurezas incluem a proteína 1 quimiotática de monó-cito de citocina (MCP-1) e Triton X-100. A proteína de CTLA4A29YL104E-lg é,então, eluída da coluna com um tampão de glicina a 250 mM, pH de 3,0. Aproteína de CTLA4A29YL104E-lg elui como um pico estreito em aproximada-mente 2 a 3 CV de tampão de eluição e é coletada em um tanque contendotampão de HEPES a 2 M, pH de 7,5 de forma a aumentar o pH rapidamentee, desse modo, minimizar a formação de espécies de elevado peso molecu-lar de belatacept (HMW).

Cromatoqrafia de troca de ânions

Cromatografia de troca de ânions usando resina Q-SepharoseFast Flow (QFF) (GE Healthcare) é usada primariamente para enriquecer aquantidade de espécies mais altamente sialiladas da proteína de C-TLA4A29YL104E-lg. O reservatório do produto belatacept pH-ajustado da colunaMabSeIect Protein A é diluída aproximadamente duas vezes com água parainjeção (WFI) antes de aplicação à coluna QFF.

A coluna de QFF é equilibrada com um tampão de HEPES a 50mM, NaCI a 50 mM, pH de 7,0. O reservatório de produto da etapa em Mab-Select Protein A com condutividade ajustada é aplicado à coluna QFF e acoluna é lavada com um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio para re-mover impurezas fracamente ligadas. A coluna é, então, lavada com tampãode HEPES a 50 mM, NaCI a 140 mM, pH de 7,0, para remover espécies deproteína de CTI_A4A29YL104E-lg com baixo teor de ácido siálico. As espéciesmais altamente sialiladas da proteína de CTLA4A29YL104E-lg são subsequen-temente eluídas da coluna usando < 5 CV de tampão de HEPES a 50 mM,NaCI a 200 mM, pH de 7,0.Cromatoqrafia de interação hidrofóbica

Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando resina To-yopearl Phenyl 650M (Tosoh Biosciences) é usada primariamente para re-duzir a quantidade espécies de HMW de CTI_A4A29YL104E-lg no reservatóriode produto da etapa de cromatografia QFF. Antes de aplicação à coluna deHIC1 o reservatório de produto da etapa de cromatografia QFF é diluído u-sando tampão de HEPES a 50 mM, pH de 7,0 e tampão de HEPES a 50mM, sulfato de amônio a 3,6 M, pH de 7,0 para obter uma condutividade deaproximadamente 135 mS/cm e a concentração de CTI_A4A29YL104E-lg de < 1g/L no reservatório de produto de QFF.

A coluna de HIC é equilibrada com um tampão de HEPES a 50mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0. O reservatório de produto de C-TI_A4A29YL104E-lg com concentração e condutividade ajustadas da etapa decromatografia QFF é aplicada à coluna. A coluna é, então, lavada com umtampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0 para re-mover impurezas fracamente ligadas. A proteína de CTI_A4A29YL104E-lg é elu-ídas da coluna de HIC usando um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato deamônio a 0,55 M, pH de 7,0.Filtração viral

Concentração e diafiltração do reservatório de produto de C-TLA4A29YLi04E_|g da etapa de H|c sàQ obtidas através de ultrafiltração (UF). A

etapa de UF utiliza uma membrana com NMWCO de 30 kDa e um tampãode NaH2PO4 a 25 mM, NaCI a 10 mM, pH de 7,5. A etapa de UF é seguidapor uma etapa de filtração viral usando uma membrana Planova de 15 nm(Asahi Kasei). O reservatório de produto de proteína de CTLA4A29YL104E-lg é,então, ajustado para uma concentração de proteína de 25 g/L através de UFusando uma membrana com NMWCO de 30 kDa.

Sanitarizacão e armazenamento de coluna

A coluna de cromatografia MabSeIect Protein A é sanitarizada u-sando solução tampão de NaOH a 0,1 N, lavada com NaH2PO4 a 25 mM,NaCI a 150 mM, pH de 7,5 para diminuir o pH e, então, armazenada em eta-nol a 20% a 2 a 8°C. A coluna de cromatografia QFF é sanitarizada com So-lução de NaOH a 1 N e armazenada em solução de NaOH a 0,1 N em tem-peratura ambiente. A coluna de HIC é sanitarizada com solução de NaOH a0,1 N, lavada com etanol a 20% e armazenada em etanol a 20% em tempe-ratura ambiente.

Exemplo 20-B: Um outro exemplo de tal método de purificação segue:

Inativação viral: O pH do material coletado concentrado clarifica-do é ajustado para 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 0,5 M.Agentes virais adventícios potenciais são inativados através da adição deTriton X-100 a 20% para uma concentração final de 0,5% (v/v). A solução deproteína tratada com Triton X-100 é misturada durante > 2 horas.

Cromatografia por afinidade em proteína A para purificaçãode CTLA4A29YL104E-ig: Cromatografia por afinidade usando uma coluna comresina MabSeIect Protein A (GE Healthcare, formalmente conhecida comoAmersham Biosciences) é usada para capturar CTLA4A29YL104E-lg do materialem-processo da etapa de inativação viral e separar CTLA4A29YL104E-lg damaioria das impurezas.

Uma coluna com diâmetro interno de 140 cm é empacotada comresina MabSeIect PrA para uma altura de 18 a 25 cm, representando umvolume de cerca de 339 a 372 L. A coluna é qualificada para uso determi-nando HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm euma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna.

A operação na coluna MabSeIect PrA é realizada em temperaturaambiente. O reservatório de produto da inativação viral é carregado sobre acoluna MabSeIect PrA equilibrada. A etapa em MabSeIect PrA é operada emuma taxa de fluxo máxima de 26,7 L/min e uma pressão de operação de >0,0896 MPa manométrico (13 psig). A carga máxima de proteína de C-TLA4A29YL104E-lg aplicada à coluna MabSeIect PrA é de 25 g de proteína deCTI_A4A29YL104E-lg por litro de resina em uma velocidade linear de350 cm/hora. O leito da coluna é capaz de ligação de aproximadamente 3,9kg de proteína de CTLA4A29YL104E-lg.A coluna MabSeIect PrA é equilibrada com um tampão deNaH2PO4 a 25 mM, NaCI a 150 mM, pH de 7,5. Equilíbrio está completoquando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio passou através da co-luna e os valores de pH e condutividade dos efluentes estão entre 7,3 a 7,7e 14,5 a 17,5 mS/cm, respectivamente.

O material em processo tratado com Triton X-100 é aplicado àcoluna MabSeIect PrA equilibrada. A coluna é lavada com um mínimo de 3CV de um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCI a 150 mM, Triton X-100 a0,5%, pH de 7,5 para remover impurezas fracamente retidas da colunaMabSeIect PrA. Essas impurezas incluem a proteína 1 quimiotática de mo-nócito de citocina (MCP-1) e Triton X-100. Etapas subsequentes de lavagemsão realizadas usando um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCI a 150 mM,pH de 7,5 para remover o Triton X-100 residual da coluna MabSeIect PrA.

A CTLA4A29YL104E-lg é eluída da coluna de cromatografia MabSe-Iect PrA com um tampão de glicina a 250 mM, pH de 3,0. O eluato é desvia-do para um vaso de coleta quando a A28O aumenta para > 0,2 AU acima dalinha de base. O efluente da coluna é filtrado através de um filtro de acetatode celulose de 0,2 μηη em um vaso de coleta equipado com um agitador. Oeluato é coletado até que a A28O da borda guia do pico de eluição diminuapara um valor de < 0,2 AU. A CTI_A4A29YL104E-lg elui como um pico estreitoem aproximadamente 2 a 3 CV de tampão de eluição. O pH do eluato empo-çado é ajustado para um pH de 7,5 □ 0,2 com um tampão de HEPES a 2 M,pH de 7,5 de forma a aumentar o pH rapidamente e, desse modo, minimizara formação de espécies de elevado peso molecular de CTLA4A29YL104E-lg(HMW). O reservatório de produto da etapa de cromatografia MabSeIect PrAé mantido em temperatura ambiente durante um máximo de 5 dias. O reser-vatório de produto pode ser esfriado para armazenamento; o perfil de estabi-lidade da CTI_A4A29YL104E-lg era o mesmo a 5°C e 22°C. O produto pode serarmazenado durante até 5 dias.

O produto de dímero de CTLA4A29YL104E-lg com uma proporçãomolar de mois de ácido siálico para mois de proteína de CTI_A4A29YL104E-lgque é cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6, é coletado.Cromatografia de troca de ânions QFF para purificação deCTLA4A29YL104E-lg. Cromatografia de troca de ânions usando resina Q-Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) é usada primariamente paraenriquecer a quantidade de espécies mais altamente sialiladas de C-TLA4A29YL104E-lg, bem como reduzir os níveis residuais de proteína A. O re-servatório de produto de CTLA4A29YL104E-lg com pH ajustado da coluna Mab-Select Protein A é diluído aproximadamente duas vezes com água para inje-ção (WFI) antes de aplicação à coluna de QFF.

Uma coluna com diâmetro interno de 80 cm é empacotada comresina QFF para uma altura de 27 a 35 cm, representando um volume decerca de 136 a 176 L. A coluna é qualificada para uso determinando a HETPe As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma assimetria(As) de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna.

A operação na coluna de QFF é realizada em temperatura ambi-ente. A coluna de QFF é equilibrada com um tampão de HEPES a 50 mM,NaCI a 50 mM, pH de 7,0. O reservatório de produto da etapa em MabSeIectProtein A com pH e condutividade ajustados é aplicado à coluna de QFF. Aetapa QFF é operada em uma taxa de fluxo máxima de 16,4 L/min (196 cm/h)e uma pressão máxima de operação de 0,2413 MPa (35 psi).

A coluna é sanitarizada antes e após uso com uma solução deNaOH a 1 N. Um mínimo de 2 volumes de coluna da solução de hidróxido desódio é passado sobre a coluna. A coluna é, então, mantida estática durante60 a 120 minutos. A faixa de condutividade aceitável para a solução e o e-fluente da coluna é de 136 a 202 mS/cm.

A coluna é equilibrada com um mínimo de 5 volumes de colunade um tampão de HEPES a 50 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,0. Asfaixas de pH e condutividade para esse tampão são 6,8 a 7,2 e 5,0 a 7,0mS/cm, respectivamente. Essas faixas são também usadas para determinarse a coluna está equilibrada.

O reservatório de produto da etapa em MabSeIect Protein A pro-duto empoçar com pH e condutividade ajustados é aplicado à coluna de QFFe a coluna é lavada com um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio pararemover impurezas fracamente ligadas. A coluna é, então, lavada com tam-pão de HEPES a 50 mM, NaCI a 135 mM, pH de 7,0, para remover espéciesde CTI_A4A29YL104E-lg com baixo teor de ácido siálico.

As espécies mais altamente sialiladas da CTI_A4A29YL104E-lg sãoeluídas da coluna de cromatografia QFF usando um tampão de HEPES a 50mM, NaCI a 200 mM, pH de 7,0. A coleta de eluato é iniciada quando o tam-pão de eluição é primeiro aplicado à coluna. Durante eluição, o efluente dacoluna é filtrado através de um filtro de 0,2 μιτι no vaso de coleta. O eluato écoletado até que a absorbância da borda guia do pico de eluição diminuapara < 0,2 AU acima da linha de base. A CTLA4A29YL104E-lg elui da colunausando < 5 CV de um tampão de HEPES a 50 mM, NaCI a 200 mM, pH de7,0. O vaso de coleta é, então, esfriado para 2 a 8°C. O tempo máximo decontenção para o reservatório de produto da etapa de cromatografia QFF a 2a 8°C é 3 dias.

Um produto de dímero de CTLA4A29YL104E-lg com uma proporçãomolar de mois de ácido siálico para mois de proteína de CTI_A4A29YL104E-lgque é cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 é coletado.

HIC em Phenyl Sefarose FF para purificação de C-TLA4A29YL104E'lg: Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando resi- na Toyopearl Phenyl 650M (Tosoh Biosciences) é usada primariamente parareduzir a quantidade espécies de HMW de CTLA4A29YL104E-lg no reservatóriode produto da etapa de cromatografia QFF.

Uma coluna com diâmetro interno de 100 cm é empacotada comresina Phenyl Sefarose Phenyl 650M para uma altura de 18 a 22 cm, repre-sentando um volume de cerca de 141 a 173 L. A coluna é qualificada parauso determinando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da colu-na de HIC.

A operação da coluna de HIC é realizada em temperatura ambi-ente. Antes de aplicação à coluna de HIC, o reservatório de produto da eta-pa de cromatografia QFF é diluído usando um tampão de HEPES a 50 mM,pH de 7,0 e HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 3,6 M, pH de 7,0 paraobter uma condutividade de aproximadamente 135 mS/cm e uma concentra-ção de CTLA4A29YL104E-lg de < 1 g/L no reservatório de produto de QFF. Aetapa de HIC é operada em uma taxa de fluxo máxima de 22,7 L/min (173cm/h) e em uma pressão máxima de operação de 45 psi. Múltiplos ciclos daetapa de HIC podem ser empregados baseado na quantidade de C-TLA4A29YL104E-lg presente no reservatório de eluato de QXL.

Após a etapa de sanitarização, a coluna de HIC é equilibradacom um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0.O equilíbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilí-brio passou através da coluna e o pH do efluente é 7,0 ± 0,3 e uma conduti-vidade de aproximadamente 135 mS/cm.

O reservatório de produto de CTI_A4A29YL104E-lg com concentra-ção e condutividade ajustadas da etapa de cromatografia QFF é aplicado àcoluna. A coluna é, então, lavada com um tampão de HEPES a 50 mM, sul-fato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0 para remover impurezas fracamente Iiga-das. A CTLA4A29YL104E-1g é eluída da coluna de HIC usando um tampão deHEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 0,55 M, pH de 7,0. Esse reservatóriode produto de HIC é mantido no vaso de coleta a 2 a 8°C. O tempo máximode contenção no vaso de coleta é 3 dias.

Um produto de dímero de CTI_A4A29YL104E-lg com uma proporçãomolar de mois de ácido siálico para mois de proteína de CTI_A4A29YL104E-lgque é cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6; um reservatório de ma-terial de espécies de elevado peso molecular de CTLA4A29YL104E-lg está pre-sente a £2,5%; um reservatório de material de espécies de baixo peso mole-cular de CTLA4A29YL104E-lg (por exemplo, monômero de CTI_A4A29YL104E-lg)está presente a £0,5%; e um reservatório de MCP-1 < 9,5 ng/mL está pre-sente.

Filtração viral. Concentração e diafiltração do reservatório deproduto de CTI_A4A29YL104E-lg da etapa de HIC é obtida através de ultrafiltra-ção (UF). A etapa de UF utiliza uma membrana com NMWCO de 30 kDa eum tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCI a 10 mM, pH de 7,5. A etapa de UFé seguida por uma etapa de filtração viral usando uma membrana Planovade 15 nm (Asahi Kasei). O reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-lg é,então, ajustado para uma concentração de proteína de 25 g/L através de UFusando uma membrana com NMWCO de 30 kDa.

O sistema Pall Filtron TFF é usado em uma etapa de concentra-ção e diafiltração do processo de produção de CTI_A4A29YL104E-lg a jusante.

O objetivo dessa etapa é concentrar o reservatório de produto da etapa decromatografia HIC para 45 a 55 g/L e trocar o tampão de eluição usado naetapa de cromatografia HIC com o tampão final usado para composições deCTLA4A29YLi04E_|g q reservatório de produto de CTI_A4A29YL104E-lg concen-trado é transferido através de um filtro de fluoreto de polivinilideno de 0,2 μηιe para um saco de bioprocesso de 50 L.

EXEMPLO 21: ATIVIDADE BIOLÓGICA - DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃOΒΙΟ-ESPECÍFICA DE CTLA4A29YL104E-la AO CO-RECEPTOR B-7IG ATRA-VÉS DE RESSONÂNCIA DE PLASMÔNIO EM SUPERFÍCIE

Ressonância de plasmônio em superfície (ligação a B7)

Esse método mede a ligação de CTI_A4A29YL104E-lg a um co-receptor de B7 representativo através de ressonância de plasmônio em su-perfície. B7lg é imobilizado em alta densidade via grupos amino primário àsuperfície de um sensorchip CM5 ativado. Material de CTI_A4A29YL104E-lg,Controles de qualidade e amostras são diluídos para concentrações entre0,125 e 8 ng/mL e injetados sobre a superfície de B7lg para gerar sensor-gramas de ligação. A taxa inicial (declínio) de ligação de CTLA4A29YL104E-lgao B7lg imobilizado é medida sob condições de transferência de massa limi-tada (difusão) sobre essa superfície de B7lg. A taxa de ligação inicial emunidades de ressonância por segundo (RU/s) se correlaciona diretamentecom a concentração ativa. As taxas de ligação de amostras são convertidasem uma concentração ativa usando a curva de Padrão de Referência, ondea taxa de ligação de material de CTI_A4A29YL104E-lg é plotada contra a con-centração de teste. Os resultados finais são expressos como ligação percen-tual de amostra com relação ao material de CTLA4A29YL104E-lg.

A presença da região Fc de IgGI humana em CTI_A4A29YL104E-lgfoi detectada usando ressonância de plasmônio em superfície (SPR). SPRpermite a medição de interações bio-específicas em tempo real. Um frag-mento de anticorpo específico para a região Fc de IgG humana (anti-Fc deIgG humana de F(ab)2 de cabra) foi covalentemente imobilizado sobre a su-perfície de um sensorchip. Ligação de amostras de CTLA4A29YL104E-lg foi de-tectada através de medição da resposta obtida sobre sua superfície, compa-rado com a superfície de um sensorchip não modificado.Os resultados, emunidades de ressonância ligadas para o processo B, Processo C e a co-mistura são comparáveis, conforme mostrado na figura 6 e Tabela 23.

Tabela 23. Detecção de Fc de IgG Humana em lotes de substânciade fármaco de CTLA4A29YL104E-lg Usando SPR_

<table>table see original document page 425</column></row><table>

Ensaio de inibição de IL-2 em células humanas

O método é baseado na inibição de produção de IL-2 a partir decélulas T através de CTLA4A29YL104E-lg quando estimuladas com anti-CD3 ecélulas B. Células T Jurkat, transfectadas com o gene de Iuciferase sob ocontrole do promotor de IL-2, são coestimuladas com células Daudi B e anti-CD3 na presença de várias concentrações de CTI_A4A29YL104E-lg. A coestimu-lação ativa o promotor de IL-2 o qual, por sua vez, produz proteína de Iucife-rase. O sinal Iuminescente resultante é medido usando um sistema de en-saio de luciferase. Nesse sistema, CTI_A4A29YL104E-lg produz uma diminuiçãodose-dependente na atividade de luciferase.

Os resultados para o processo B Lote 000929-278, Processo CLote 224818-2004-007 e a co-mistura Lote 55128-162 são comparáveis,conforme mostrado na Tabela 24. Os valores de EC5o, fatores de declínio eassíntotas máximo e mínimo são similares para todas as três amostras, den-tro de um desvio-padrão. Isso indica que CTLA4A29YL104E-lg do processo C edo processo B se comportam comparavelmente no ensaio de potência invitro.

Tabela 24. Comparação de atividade de Iuciferase mediada pelo promotor de IL-2Humana no bioensaio de potência in vitro. Parâmetros de curva de dose-respostapara Processos da invenção

<table>table see original document page 426</column></row><table>

Materiais:

-Sensor Chip CM5, grau certificado Biacore (Catálogo No. BR-1000-13)

- Tampão de HBS-EP BIA Certified1 HEPES a 10 mM, pH de 7,4,NaCI a 150 mM, EDTA a 3,4 mM, 0,005% v/v

- Surfactant P20 Biacore (Catálogo No. BR-1001-88)

-Amine Coupling Kit BIA Certified, 115 mg de N-hidróxi-succi-nimida (NHS), 750 mg de cloridrato de 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC), 10,5 mL de HCI de etanolamina Biacore (Catálogo No. BR-1000-50)

- Instrumento Biacore C com um computador PC compatível Bi-açore, (Catálogo No. BR-1100-51)

-Biacore C Control Software, conforme fornecido com o instru-mento Biacore C, versão 1.0.1

Amine Coupling Kit BIA Certified: O kit contém um frasco decada: 115 mg de NHS, 750 mg de EDC e 10,5 mL de etanolamina. Prepararcada frasco de acordo com as orientações dos fabricantes. Transformar emalíquotas volumes de 200 μΙ_ de soluções de NHS e EDC em frascos deplástico/vidro individuais de tamanho apropriado e tampar. Essas soluçõessão estáveis durante 2 meses quando armazenadas a -20°C. Transformarem alíquotas 200 μΙ_ de Etanolamina em frascos de plástico/vidro individuaisde tamanho apropriado e tampar. Essa solução é armazenada a 2-8°C e éestável de acordo as orientações do fabricante.Para assegurar boa ligação à célula de fluxo, uma célula de fluxoserá usada durante uma semana ou 286 injeções, a qual sempre vai primei-ro. Uma nova célula de fluxo será imobilizada no início de cada semana,!mobilização de B7.1 Ig em Preparado para Testagem de amostra

NOTA: transformar em alíquotas 200 μL. de todas as soluçõesem tubos Biacore de 7 mm para análise.

Descongelar um frasco contendo B7.1 Ig em temperatura ambi-ente. Diluir B7.1 Ig usando tampão de acetato a 10 mM, pH de 5,0 (1.7) paraobter uma massa de superfície de entre 3000-9000 Unidades de ressonân-cia (RU). Descongelar um frasco (200 μL) cada um de EDC e NHS para atemperatura ambiente. Remover HCI de etanolamina do refrigerador e deixaraquecer para a temperatura ambiente. Do software Biacore: Abrir o projetopublicado "B7 Ig Immobilization" selecionado do "Immobilization Wizard".Abrir o arquivo publicado "B7 Immob.blw". Navegar através do wizard e con-firmar ou alterar a seleção clicando em "Next". Sob "User Information" sele-cionar célula de fluxo e fornecer informação experimental na aba "Notebo-ok". Colocar reagente e frascos de Iigante no rack de amostra conforme es-boçado. Revisar instruções. Salvar o arquivo modelo como: B7 Immob Bl-OQC # Date Iniciais Chip # Flow cell # .blw. Começar a imobilização clican-do em "Start". Salvar o arquivo resultante como: B7 Immob BIOQC # DateInicial chip # flow cell #.blr. Quando o ensaio está terminado, imprimir osresultados do Wizard e sensorgrama.

EXEMPLO 22: ANÁLISE DO TEOR CARBOIDRATO DE UMA COMPOSI-ÇÃO DE CTLA4A29YL104E-lg. MAPEAMENTO PEPTÍDICO TRÍPTICO E IEFMapeamento peptídico por digestão tríptica

Nesse método de digestão tríptica, amostras de CTI_A4A29YL104E-Ig são desnaturadas usando guanidina-HCI e reduzidas e alquiladas usandoDTTe IAA. As amostras são dessalinizadas usando uma NAP-5 coluna edigerida com tripsina. A mistura de digestão é separada através de cromato-grafia de fase reversa (C18) e os picos são detectados através de absorbân-cia de UVa 215 nm.

REAGENTES: solução de fase móvel A (ácido trifluoroacético(TFA) em Água (v/v)); solução de Fase móvel B (TFA a 0,02% em ACN a95% (AcetonitriIa) e 5 % de água (v/v)); agente de alquilação (iodoacetamidaa 200 mM (IAA)); Tampão de diluição (TRIS a 100 mM, NaCI a 25 mM, pHde 8,0); Tampão de desnaturação (guanidina a 8 M, TRIS a 50 mM, pH de8,0); Tampão de Digestão (TRIS a 50 mM, CaCI2 a 10 mM, pH de 8,0); A-gente de Redução (DTT a 100 mM).

INSTRUMENTAÇÃO: (instrumentação equivalente pode ser usa-da) colunas NAP-5 (Amersham, cat. N0 17-0853-02); aquecedor de colunapara HPLC; Sistema Waters Alliance HPLC com aquecedor de coluna e de-tector de UV.

Visão de Procedimento

CTLA4A29YU04E-lg

Desnaturada/Reduzida/Alquilação de Proteína

Proteína dessalinizada

Proteína digerida

Perfil de mapa e informação de MS

Redução e Alquilação: Amostras (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig1 etc.) foram diluídas para 10 mg/ml através da adição de água para umvolume final de 100 μL (1 mg). 560 μΙ de tampão de desnaturação e 35 μL de Agente de Redução (DTT a 100 mM) foram adicionados a 100 μΙ amos-tras, foram misturados e centrifugados em uma microcentrífuga durante 3segundos. As amostras foram, então, incubadas a 50°C durante 20 minutos± 2 minutos. 35 μL de agente de alquilação (IAA a 200 mM) foram, então,adicionados a cada amostra e novamente foram misturados e centrifugadosem uma microcentrífuga durante 3 segundos. As amostras foram, então, co-bertas com folha de alumínio e incubadas a 50°C durante 20 min. ± 2 minu-tos. Após as colunas NAP-5 terem sido equilibradas entornando 3 volumesde coluna (cerca de 7-8 mL) de Tampão de Digestão, 500 μL das misturasreduzidas e alquiladas foram entornadas sobre as colunas NAP-5, permitin-do que o líquido drene através da coluna. As amostras foram, então, coleta-das das colunas NAP-5 via eluição de amostra da coluna com 1 ml_ de Tam-pão de Digestão.

Digestão: Amostras foram digeridas com 20 µL de tripsina (0,5µg/µL) em um banho de água a 38°C durante 4 horas (± 0,5 horas). Quandode término de digestão, as amostras foram acidificada com 2,5 µL de TFA.As amostras foram, então, colocadas em frascos para amostrador automáti-co para subsequente análise.

Método do Instrumento: O método de instrumento é mostradoabaixo:

<table>table see original document page 0</column></row><table>

A coluna foi equilibrada com 100% de tampão de fase móvel Adurante 25 minutos antes das primeiras injeções. A absorbância de UV foimonitorada a 215 nm enquanto a temperatura da coluna era mantida a 37°C e a temperatura do amostrador automático a 4°C. Um placebo de tampão defase móvel A foi operado antes do primeiro Padrão de Adequabilidade deSistema, após o que, uma única injeção de 50 µL de cada amostra. A inje-ção de Material de Referência deverá abranger faixas a cada seis injeçõesde amostra.

Número de placas teóricas: Eficiência de coluna, avaliada co-mo o número de placas teóricas, pode ser medida quantitativamente usandoo tempo de retenção e a largura de pico de acordo com a equação:

<formula>formula see original document page 0</formula>

onde:"w" é a largura de pico na linha de base medida através de ex-trapolação dos lados relativamente retos para a linha de base,

Ύ é o tempo de retenção do pico medido a partir do momentode injeção até o momento de eluição do pico máximo.Se N <50000, re-equilibrar a coluna.

Resolução: Determinar a resolução (R) entre 2 picos, por exem-plo, pico T2 e pico T12 conforme indicado na figura 32; pode ser determina-da usando a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 430</formula>

onde:

ti, Ϊ2 = tempos de retenção de picos de fragmentos 12 e

T12, respectivamentewi,w2 = largura de pico tangente-definida na linha de basedos picos com tempos de retenção ti e h., respecti-vamente.

Se R < 1,5, a coluna deverá ser re-equilibrada e se o problemapersiste, a coluna deverá ser substituída.

A figura 32 e Tabela 25 mostram os fragmentos peptídicos obtidosa partir de uma digestão com tripsina de CTI_A4A29YL104E-lg. A região mos-trando os peptídeos T7 e T9 a ~50 minutos algumas vezes refletem digestãoincompleta de amostra e picos podem mostrar diferentes qualidades de diapara dia; contudo, dentro de uma operação, todas as amostras mostramcomparabilidade.

Tabela 25: Fragmentos de peptídeo tríptico de CTLA4A29YL104E-lg

<table>table see original document page 430</column></row><table>T10 159-165 834,9 834,5 DTLMISRT11 166-184 2140,3 2138,5 TPEVTCVWDVSHEDPEVKT12 185-198 1677,8 1677,8 F N WYVDG VE VH NAKT13 199-202 500,6 500,3 TKPRT14a 203-211c 1189,2 ___d EEQYNSTYRT15 212-227 1808,1 1808 WSVLTVLHQDWLNGKT16 228-230 438,5 438,2 EYKT17 231-232 307,4 ND CKT18 233-236 446,5 ND VSNKT19 237-244 838,0 837,4 ALPAPIEKT20 245-248 447,5 447,2 TISKT21 249-250 217,2 ND AKT22 251-254 456,5 456,3 GQPRT23 255-265 1286,4 1285,6 EPQVYTLPPSRT24 266-270 604,7 604,3 DELTKT25 271-280 1161,4 1160,7 NQVSLTCLVKT26 281-302 2544,7 2544 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT27 303-319 1874,1 1873,9 TTPPVLDSDGSFFLYSKT28 320-324 574,7 574,3 LTVDKT29 325-326 261,28 ND SRT30 327-349 2803,09 2802,1 WQQGNVFSCSVMH EALH NHYTQKT31 350-356 659,7 659,2 SLSLSPGT6 84-93 1171,4 1170,5 AMDTGLYICKT7b 94-128c 3983,5 d VELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEP CPDSDQEPKT8b 129-132 435,4 ND SSDKT9b 133-158° 3345,7 d THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKT10 159-165 834,9 834,5 DTLMISRT11 166-184 2140,3 2138,5 TPEVTCVWDVSHEDPEVKT12 185-198 1677,8 1677,8 FNWYVDGVEVHNAKT13 199-202 500,6 500,3 TKPRT14a 203-211c 1189,2 d EEQYNSTYRT15 212-227 1808,1 1808 WSVLTVLHQDWLNGKT16 228-230 438,5 438,2 EYKT17 231-232 307,4 ND CKT18 233-236 446,5 ND VSNKT19 237-244 838,0 837,4 ALPAPIEKT20 245-248 447,5 447,2 TISKT21 249-250 217,2 ND AKT22 251-254 456,5 456,3 GQPRT23 255-265 1286,4 1285,6 EPQVYTLPPSRT24 266-270 604,7 604,3 DELTKT25 271-280 1161,4 1160,7 NQVSLTCLVKT26 281-302 2544,7 2544 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT27 303-319 1874,1 1873,9 TTPPVLDSDGSFFLYSKT28 320-324 574,7 574,3 LTVDKT29 325-326 261,28 ND SRT30 327-349 2803,09 2802,1 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKT31 350-356 659,7 659,2 SLSLSPG

a Peptídeos com carboidrato N-Ligadob Peptídeos com carboidrato O-Ligado

c Massas para T5, T7, T9 e T14 são massas sem as porções de car-boidratod Um número de massa correspondendo aos peptídeos glicosilados foiobservado

Focalizacão isoelétrica

Focalização isoelétrica (IEF) é usada para avaliar os pontos i-soelétricos (pl) das várias isoformas de CTI_A4A29YL104E-lg em Substância deFármaco e produto de fármaco. Esse método usa Pharmacia Biotech Am-pholine® PAG Plate em um pH com gradiente de 4,0-6,5 e um sistema deeletroforese com leito plano Multiphore II. As amostras (por exemplo, C-TI_A4A29YL104E-lg, etc.) são diluídas em água Milli-Q e carregadas diretamentesobre o gel usando tiras de aplicação de amostra. O gel é focalizado durante2,5 horas sob tensão crescente usando tiras de catodo embebidas em β-alanina a 100 mM e uma tira de anodo embebida em ácido glutâmico a 100mM / ácido fosfórico a 500 mM. Após focalização, o gel é fixado usando áci-do sulfo-salicílico/ácido tricloroacético e, então, corado usando um sistemade coloração com azul Coomassie. Após coloração, o gel úmido é exploradoem um arquivo de imagem digital usando um densitômetro baseado a laserem uma resolução espacial de 50 ou 100 μητι com até 4096 níveis de resolu-ção de densidade óptica. CTLA4A29YL104E-lg focaliza em 10 a 15 bandas, os-cilando de um pl de 4,5 a 5,5.

Focalização isoelétrica de CTI_A4A29YL104E-lg nativa sobre um gel(pH de 4,0-6,5) gera um padrão de formação de banda similar na faixa de plde 4,6-5,5 para o processo C Lote 224818-2004-007, Processo B Lote000929-287 e Co-mistura Lote 55128-162, conforme mostrado na figura 12.

Esse procedimento mostra que os materiais dos Processos BeC são com-paráveis quando analisados sobre o mesmo gel de IEF.

Padrões de focalização isoelétrica deverão ser facilmente distin-guidos da base (veja figura 12)

<table>table see original document page 432</column></row><table>Conalbumina 5,90

Lactogiobulina 5,20

Inibidor de tripsina de soja 4,55

Amiloglicosidase 3,50

CTI_A4A29YL104E-lg é identificada como múltiplas bandas (>10) quetêm uma faixa de pl de cerca de 4,5 a cerca de 5,5 (FIG. 32).

CTLA4A29YL104E-lg é uma glicoproteína de fusão de CTLA4-lg desegunda geração a qual consiste do domínio de ligação a Iigante modificadodo antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e da região constante da ca-deia pesada de IgG1 humana. Essa nova molécula tem aplicação terapêuticacomo um imunossupressor. CTLA4A29YL104E-lg contém múltiplas isoformascarregadas as quais podem ser decompostas através de focalização isoelé-trica (IEF). Um método de IEF para a análise de substância de fármaco deCTI_A4A29YL104E-lg e produto de fármaco foi desenvolvido. Esse método éusado para examinar CTLA4A29YL104E-lg em um sistema de eletroforesecom leito plano Ampholine® PAG Plate, pH de 4,0-6,5, Multiphore II. Subs-tância de fármaco de CTI_A4A29YL104E-lg, produto de fármaco e Material deReferência são diluídos em água Milli-Q e carregados diretamente sobre ogel. O gel é focalizado durante 2,5 horas sob tensão crescente usando umatira de catodo embebida em β-alanina a 100 mM e uma tira de anodo embe-bida em ácido glutâmico a 100 mM / ácido fosfórico a 500 mM. Após focali-zação, o gel e fixado e corado com azul Coomassie. O gel corado é explora-do através de densitometria a laser e análise semiquantitativa de bandas degel é realizada sobre o arquivo de imagem digital.

Materiais:

Ampholine PAG Plate Gel, pH de 4,0-6,5 GE Healthcare (Cat No. 80-1124-81)Tiras de eletrodo para IEF de 6 χ 280 mm GE Healthcare (Cat No. 80-1004-40)Peças de aplicação de amostra GE Healthcare (Cat No. 80-1129-46)Equipamento:

<table>table see original document page 434</column></row><table>

Preparo de reagentes

Solução tampão de anodo (100 mL): Ácido glutâmico a 0,1 Mem ácido fosfórico a 0,5 M; 3,4 mL de ácido fosfórico a 85%; 1,47 ± 0,02 gde Ácido glutâmico; água Milli-Q. Adicionar Ácido glutâmico a 50 mL de águaMilli-Q. Adicionar ácido fosfórico a 85% e Q.S. para 100 mL, agitar para mis-turar. Atribuir uma data de expiração de 6 meses e armazenar a 4°C.

Solução tampão de catodo (100 mL): β-Alanina a 0,1 M1 0,9 ±0,02 g de β-Alanina, água Milli-Q. Q.S. reagente para 100 mL com água Milli-Q, agitar para misturar. Atribuir uma data de expiração date de 6 meses earmazenar a 4°C.

Solução de fixação (2000 mL): ácido 5-sulfo-salicílico a 3,5%em ácido tricloroacético a 12%, 240 +5,0 g de Ácido tricloroacético, 70 + 2,0g de ácido 5-sulfo-salicílico, água Milli-Q. Combinar os reagentes e Q.S. para2000 mL com água Milli-Q. Atribuir uma data de expiração de 3 meses e ar-mazenar em temperatura ambiente.

Aparelho e Preparo de gel. Conectar a plataforma de resfria-mento da unidade de eletroforese Multiphore Il ao circulador termostáticoMulti-Temp e ajustar a temperatura para 10°C. Deixar que o circulador atinja10 ± 2°C. Remover o gel do refrigerador. Usando tesouras, cortar cuidado-samente ao longo de todos os quatro lados do envelope, certificando-se denão cortar o gel/suporte de gel. Adicionar aproximadamente 1,0 mL de águaMilli-Q a uma borda da plataforma de resfriamento. Colocar uma borda dogel/suporte de gel na água, de modo que a água se mova através de toda aborda do gel. Aplicar cuidadosamente o gel através da plataforma de resfri-amento, evitando a formação de bolhas de ar. Remover o filme transparenteda superfície do gel. Embeber cada tira de eletrodo com aproximadamente3,0 mL da solução de eletrodo apropriada (Tabela diretamente abaixo). Apli-car as tiras de eletrodo aproximadamente 10 mm das bordas superior e infe-rior do gel. Colocar a tira de catodo mais próxima das marcas (-) e a tira deanodo mais próxima das marcas (+) sobre a plataforma de resfriamento. A-pós as tiras de eletrodo terem sido aplicadas, cortar as tiras para adaptar aogel, evitando contato com o suporte de gel.

Soluções de eletrodo e ajustes de parâmetro de eletroforese

Faixa de PH Solução de anodo Solução de catodo Tensão (V) Corrente (mA) Energia (W) Tempo (h)4,0-6,5 Ácido glutâmico a 0,1 M em H3PO4 a 0,5 M β-Alanina a 0,1 M 2000 25 25 2,5

Aplicar as peças de aplicação de amostra aproximadamente 10mm acima da tira de catodo. Usando os parâmetros de eletroforese definidosna tabela diretamente acima, pré-focalizar o gel até que a tensão atinja 300V.

Preparo de marcador de pl para IEF e Controle de coloração.

Reconstituir o marcador de pl para IEF com 100 μΙ_ de água Milli-Q. Recons-tituir o controle de coloração de Anidrase carbônica Il com 1000 μΙ_ de águaMilli-Q para fazer uma solução de estoque a 1,0 mg/mL. Adicionar 10 μί desolução de estoque (1,0 mg/mL) a 90 μΙ_ de água Milli-Q para uma concen-tração final de carregamento de 0,10 mg/mL.

Preparo de amostra. Diluir o Material de Referência de C-TLA4A29YL104E

Ig e amostras para uma concentração de 2 mg/mL.

Exemplo: Se a amostra de CTI_A4A29YL104E-lg tem uma concen-tração de 25 mg/mL, usar a seguinte diluição para preparar a concentraçãode carregamento final de 2 mg/mL:

10 μl (de 25 mg/mL) + 115 μί de água Milli-Q = 2 mg/mLNOTA: se a concentração de amostra é < 2,0 mg/mL, então, Io-ad a amostra without diluição.

Carregamento de gel. Carregar os géis para facilitar identifica-ção de amostra baseado no padrão de operação. Não carregar o gel simetri-camente. Carregar o marcador de pl para IEF1 controle de coloração, Mate-rial de Referência de CTI_A4A29YL104E-lg e amostras de CTLA4A29YL104E-lg,conforme esboçado na tabela diretamente abaixo. Carregar todas as amos-tras sobre uma peça de aplicação de amostra.

Padrão de carregamento de gel

<table>table see original document page 436</column></row><table>

* Carga de marcador de pl para IEF na Fileira 1 é necessária para definir a ori-entação do gel. Começar o padrão de carregamento dentro da fileira 2 e repetiro padrão de carregamento para amostras adicionais. O marcador de pl paraIEF deve ser carregado pelo menos a cada dez fileiras (Exemplo:MRSiS2S3S4S5S6RM; M - marcador; R - Material de Referência, Sx - amostra).

Processamento de gel. Colocar o contentor de eletrodo sobre aunidade Multiphor Ilt e alinhar os eletrodos com o centro das tiras de eletro-do sobre o gel. Conectar os dois eletrodos do contentor de eletrodo à unida-de de base e colocar a tampa de segurança em posição. Usando uma fitaadesiva, cobrir os orifícios na tampa de segurança para impedir que o gelseque. Conectar os eletrodos ao suprimento de energia. Operar a eletrofore-se na tensão, corrente e energia apropriadas. Quando eletroforese estácompleta, desligar o suprimento de energia e remover a tampa de segurançae contentor de eletrodo. Remover cuidadosamente as tiras de eletrodo e aspeças de aplicação de amostra do gel. Remover todos o gel e suporte de gelda placa de resfriamento e colocar em um disco Pyrex™ de 280 χ 180 χ 40mm contendo 200 mL de solução de fixação. Cobrir o disco com um envoltó-rio plástico e colocar sobre um agitador orbital em temperatura ambiente du-rante um mínimo de 20 minutos.ΝΟΤΑ: O gel deverá ser fixado durante um máximo de 1 hora.

Quando fixação está completa, lavar o gel 3 vezes durante 5 mi-nutos cada com aproximadamente 200 mL de água Milli-Q. Misturar a solu-ção de reagente de coloração GeICode Blue através de inversão da garrafavárias vezes. É importante misturar o reagente de coloração antes de distri-buição para assegurar que uma amostra homogênea do reagente é usada.Adicionar aproximadamente 200 mL do reagente de coloração ao disco. Co-brir o disco com um envoltório plástico e colocar sobre o agitador orbital emtemperatura ambiente durante 18 a 20 horas para obter desenvolvimentoótimo de banda. Quando coloração está completa, lavar o gel substituindo oreagente de coloração por aproximadamente 200 mL de água Milli-Q. Reali-zar um mínimo de 3 trocas de água durante um período de 1-2 horas pararesultados ótimos.

Exploração e análise de gel. Explorar o gel usando os parâme-tros de exploração definidos na tabela diretamente acima. Análise do gel érealizada sobre o arquivo da imagem explorada.

Exploração de gel e Parâmetros de análise

<table>table see original document page 437</column></row><table>

NOTA: A Tabela 3 esboça diretrizes gerais para a análise das imagens degel. Refira-se ao manual do ImageQuant TL (v2003.03) e instruções na telapara informação detalhada sobre o ajuste apropriado de cada parâmetro dedetecção de banda.

Abrir um arquivo de imagem de gel (dados brutos explorados) da<1D Gel Analysis> no ImageQuantTL. Ir para <Contrast> na barra de ferra-mentas e diminuir o parâmetro <lmage Histogram> até que todas as bandassejam claramente visíveis. Selecionar <Lane Creation> e escolher <Manual>para ajustar <Number of Lanes> a ser analisado. Ajustar <Lane % Width>para 100% para cobrir as fileiras de gel. Alinhar apropriadamente fileiras úni-cas se necessário. Usar o método <Rolling Ball> para subtrair a base. Issonão é crítico para análise de imagem do gel de IEF. Detectar bandas usandoos ajustes iniciais de <Minimum Slope>, <Noise Reduction> e <%MaximumPeak> listados na Tabela 3. O ajuste desses valores é necessário para iden-tificar precisamente as bandas. Corrigir manualmente quaisquer bandas quefaltam e bandas mal identicadas. Computar valor de pl através de uso domarcador de pl padrão dos marcadores rotulados listados na seção Adequa-bilidade de sistema para o gel com pH/pl de 4,0-6,5. Não realizar as etapasde calibração e normalização. Exportar os dados contidos dentro da janelade medição em uma planilha do Excel para cálculo adicional e reportar. Im-portar os dados do Excel para uma planilha validada para realizar análisequantitativa para reportagem de resultados.

ADEQUABILIDADE DE SISTEMA. Padrões de focalização isoe-létrica (marcadores de pl) devem ser prontamente distinguidos da base emostrar distorção limitada através de inspeção visual da imagem de gel ex-plorada (veja Tabela diretamente abaixo para os marcadores de pl listados).

Padrões de focalização isoelétrica

<table>table see original document page 438</column></row><table>

NOTA: Nem todos os padrões de focalização isoelétrica aparecerão sobre ogel porque o pH/faixa de pl do gel é de 4,0-6,5. Os marcadores de pl a 3,50,4,55, 5,20 e 5,85 têm de ser identificados e rotulados sobre o gel.

O padrão de formação de banda de Material de Referência deCTLA4A29YL104E-lg e artigos de teste deverá mostrar distorção limitada atra-vés de inspeção visual da imagem de gel explorada. Um controle de colora-ção de anidrase carbônica Il (pl de 5,4) em um baixo nível de carga de prote-ína (1,0 μ9) é usado para demonstrar coloração de gel consistente. A bandadeve ser facilmente distinguida da base através de inspeção visual da ima-gem de gel explorada. Material de Referência de CTI_A4A29YL104E-lg deveconter 8 a 15 bandas com intensidade de banda >1,0% dentro da faixa de plde 4,5 a 5,6. Material de Referência de CTI_A4A29YL104E-lg com bandas dentroda faixa de pl de 4,5 a 5,6 deve ter uma intensidade cumulativa percentualde >95%.

CÁLCULO DE DADOS. A seguinte equação é utilizada para ocálculo da intensidade cumulativa percentual de amostras de C-TLA4A29YL104E-lg com relação ao Material de Referência:

Intensidade de banda % da amostra (pl 4,5-5,6)

Intensidade cumulativa percentual = - x100

Intensidade de banda % da referência (pl 4,5-5,6)

Exemplo: Se a amostra tem uma intensidade de banda % (pl4,5-5,6) de 95% e o Material de Referência tem uma intensidade de banda% (pl 4,5-5,6) de 100%, a intensidade % cumulativa será 95%.

O material de CTI_A4A29YL104E-lg em uma modalidade terá bandascom uma intensidade de banda relativa > 1,0% dentro da faixa de pl de 4,5 -5,6. O material de CTLA4A29YL104E-lg tem uma intensidade cumulativa per-centual com relação àquela do material de referência de CTI_A4A29YL104E-lgdentro da faixa de pl de 4,5 - 5,6.

EXEMPLO 23: TRANSFECÇÃO E GERAÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLU-LAS

Antes de eletroporação, o vetor de expressão pD16LEA29Y foilinearizado com enzima BstBI para produzir saliências de 4 bp compatíveis.O vetor Iinearizado e DNA veículo de esperma de salmão cisalhado (comoveículo) foram co-precipitados com etanol e assepticamente ressuspensosem meio PF CHO (JRH Biosciences) para eletroporação em células DG44.

Após eletroporação, as células foram deixadas se recuperar emmeio não seletivo. As células foram, então, cultivadas em lâminas com 96cavidades em meio seletivo de PF CHO contendo 500 ng/mL de recombulina(Gibco), L-glutamina a 4 mM (Gibco) e metotrexato (ICN).

Linhagens de células de produção de CTLA4A29YL104E-lg dessa lâ-mina foram escolhidas para amplificação de expressão usando a seguinteprogressão de concentrações de metotrexato (MTX) adicionadas ao meio:

MTX a 20 nM => 50 nM => 100 nM => 250nM => 500nM => 1 μΜ MTX

Plasmídeo de expressão de CTI_A4A29YL104E-lg inteiro é integradono genoma de uma célula.

Seleção de linhagem de célula de produção

A linhagem de células de produção final GF1.1.9 foi isolada apósdois ciclos de clonagem por diluição Iimitativa das melhores linhagens decélulas na cavidade mestre amplificada. Seleção de linhagem de célulasGF1.1.9 foi baseada no padrão de crescimento, titulação e produto contendouma quantidade reduzida de componentes de espécies de elevado peso mo-lecular e um maior teor de ácido siálico com relação ao material produzidode outros clones.

EXEMPLO 24: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DA CTLA4A29YL104E-lqEstudos de estabilidade genômica

DNA e RNA isolado de células derivadas de um banco de célulaforam usados para análise de hibridização de Southern e Northern e se-quenciamento do cDNA para uma seqüência de codificação de C-TLA4A29YL104E-lg. Os resultados foram comparados com os resultados obti-dos de CTLA4A29YL104E-lg.

Os resultados para a análise de hibridização de Northern e estima-tiva de sequenciamento de cDNA são apresentados abaixo.

Análise de hibridização de Northern

A cultura inoculada com células do banco de células foi expandidae usada para isolar RNA para a análise de hibridização de Northern. A cultu-ra preparada representa células de aproximadamente 27 gerações além daidade de célula in vitro usada no processo de produção de CTI_A4a29YL104E-lg. RNA total foi extraído de células derivadas do banco de células de C-TLA4A29YLi04E_|g e de cé|u)as de cTLA4A29YL104E-lg expandida. Um controleutilizando RNA total da linhagem de células de CHO precursora foi tambémusada nesses experimentos. Aproximadamente 5 μ9 de RNA total foramsubmetidos à eletroforese em gel de ágarose sob condições de desnatura-ção. O RNA no gel foi blotted sobre uma membrana de náilon e hibridizadocom um fragmento de DNA HindUUXbal de 1,2 kb 32P-rotulado contendo ogene de CTLA4A29YL104E-lg. O fragmento de DNA H/ndlll/Xòal de 1,2 kb usa-do para a sonda foi isolado do plasmídeo pD16LEA29Y.

Uma espécie de mRNA de aproximadamente 1,7 quilobases quese hibridizava à sonda de gene CTI_A4A29YL104E-lg foi detectada na amostrade RNA total do banco de células conforme mostrado na figura 33. O painelAeO painel B mostrados na figura 33 representam o gel de ágarose coradocom brometo de etídio e o autorradiograma correspondente, respectivamen-te.

Esses resultados indicam que apenas um transcrito que codificaCTLA4A29YL104E_|gé expresso em culturas derivadas do banco de células deCTI_A4A29YL104E-lg expandidas. Além disso, nenhuma alteração detectável notranscrito de mRNA de CTLA4A29YL104E-lg foi observada nessas amostrasquando comparado com os resultados obtidos usando um banco de células.EXEMPLO 25: CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO

Um método de exclusão tamanho foi desenvolvido para analisarcomposições de CTLA4A29YL104E-lg usando uma coluna TosoHaas TSK-3000SWXL de 7,8 mm χ 300 mm equipada com uma coluna de proteção comdetecção a 280 nm. CTLA4A29YL104E-lg é avaliada com relação à homogenei-dade de produto, incluindo monômero (cadeia simples), dímero ou espéciesde elevado peso molecular (por exemplo, tetrâmero). O método mostra boa precisão (<2%) em uma concentração nominal de ~10 mg/mL e é linear de-0,5-15 mg/mL (r2 = 0,999). O DL (Limite de detecção) é -2,26 μg/mL e oQL (Limite de Quantificação) é ~7,53 μg/mL. Essas moléculas solúveis deCTLA4-lg são proteínas de fusão consistindo do domínio de ligação a Iigantedo antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e da região constante de ca-deia pesada de IgGI humana com aplicação terapêutica potencial como i-munossupressores. Esses compostos exercem seus efeitos fisiológicos atra-vés de ligação a antígenos B7 (CD80 e CD86) sobre a superfície de váriascélulas apresentando antígeno (APC), assim, bloqueando a interação fun-cional de B7.1 e B7.2 com CD28 sobre a superfície de células T. Esse blo-queio resulta na supressão de ativação de células T1 consequentemente, daresposta imune. Embora LEA29Y venha a diferir da CTLA4lg apenas em5 dois resíduos de aminoácido, Leui04 - glu e Ala29 - Try, as moléculas têmavidez significativamente diferente pelos antígenos B7.1 e B7.2. LEA29Ymostra uma avidez 5 a 10 vezes maior pela forma humana de B7.2 (CD86) eavidez similar pela B7.1 humana (CD80), comparado com a CTLA4lg pre-cursora.

Cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna TSK-3000 SWXL (7,8 mm χ 300 mm) equipada com uma coluna de proteção edetecção a 280 nm é usada para analisar substância de fármaco de C-

TLA4A29YL104E_|g

com relação à homogeneidade. Dímero, espécies de eleva-do peso molecular (HMW) e espécies de baixo peso molecular (LMW) deCTLA4A29YL104E-lg são diferenciados.

Cromatografia de exclusão de tamanho (SEG) é usada para ava-liar CTLA4A29YL104E-lg com relação à homogeneidade de produto. As figu-ras 34A-C mostram o cromatograma de SEC de CTLA4A29YU04E-lg para oProcesso B1 Processo C e um lote de co-mistura. SEC de CTI_A4A29YL104E-lgindica que o material de processo C tem uma área de dímero de 99,8 porcento, uma área de espécies de HMW de 0,2 pode cento e nenhuma espé-cie de LMW detectável. Esses resultados são comparáveis com o materialde processo B (área de dímero de 97,4 por cento, área de HMW de 2,6 porcento e LMW <DL).

Reagentes: KOH a 4N (100 mL); Padrão de Adequabilidade de

Sistema (marcadores de peso molecular dissolvidos em água com grau paraHPLC); tampão de operação de Fase móvel (KH2PO4 a 0,2 M, NaCI a 0,9%,pH de 6,8); NaOH a 4N; Tampão de diluição (NaH2PO4 a 25 mM -H2O1 NaCIa 10 mM, pH de 7,5)INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES - instrumentação equivalente pode sersubstituída:

<table>table see original document page 443</column></row><table>

Padrões e amostras (10 mg/ml) foram preparados como volumesde 50 ml em frascos para amostrador automático rotulados. As amostrasforam preparadas em duplicata.

CÁLCULOS

Determinação de Resolução (R) e avaliação de tempo de re-tenção: 20 mL de Padrões de Adequabilidade de sistema são injetados paracalcular a resolução entre 2 picos de um cromatograma gerado usando taispadrões (por exemplo, um pico, Pico 1, tendo um tempo de retenção ~ 8,5minutos e um segundo pico, Pico 2, tendo um tempo de retenção -10 minu-tos) usando a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 443</formula>

onde:

<formula>formula see original document page 443</formula>W1 = Largura de pico do Pico 1

W2 = Largura de pico do Pico 2

<formula>formula see original document page 444</formula>

= 2,12.5 1,3

A largura de pico é igual a largura (em minutos) na base do picoapós extrapolação dos lados relativamente retos do pico para a linha de ba-se. Tempo de retenção e larguras de pico são medidos nas mesmas unida-des.

R deve ser Ξ 1,3 e o tempo de retenção para o pico deverá ser ~8,5 V 0,5 minutos.

Determinação do Número de placas teóricas: A partir do cro-matograma do Padrão de Adequabilidade de Sistema, a eficiência da colunapode ser determinada calculando o número de placas teóricas de acordocom a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 444</formula>

onde:

(t) = é o Tempo de retenção do Pico 2 (em minutos)

(w) = é uma largura (em minutos) na linha de base de Pico 2 ob-tida através de extrapolação dos lados do pico para a linha de base, confor-me observado na figura 1.

N deverá ser 3 2500.

Integração de Picos: As áreas de pico no cromatograma foramintegradas (por exemplo, figuras 34A-C). O pico de dímero de CTI_A4A29YL104E-lgestá a ~ 8,5 minutos e o pico de espécies de elevado peso molecular está a~ 7,4 minutos.

As áreas percentuais podem ser calculadas de acordo com asfórmulas abaixo:

Área % de monômero = 100 - (área % de espécies de elevado pe-so molecular + área % de espécies de baixo peso molecular)<table>table see original document page 445</column></row><table>

onde:

A = área de pico de dímero de CTLA4A29YL104E-lg

B = área total de todos os picos com tempos de retenção me-nores do que o dímero de CTI_A4A29YL104E-lg

C= área total de todos os picos com tempos de retenção maio-res do que o pico de dímero de CTI_A4A29YL104E-lg (excluin-do volume de inclusão).

O RSD % das contagens de área total (excluindo o volume de in-clusão) é determinado. O RSD % das contagens de área total deve ser 2%ou menos. Se a área é < 2707 contagens de área, reportar os resultadoscomo. DL1 (Limite de detecção) (~ 2,26 pg/mL). Se as contagens de áreaestão entre 2707-9014, reportar os resultados como. QL (Limite de Quantifi-cação) (~ 7,53 pg/mL). Se as contagens de área são. 9014, reportar os re-sultados para mais próximo de um décimo de um por cento.

EXEMPLO 26: SDS-PAGE E LIGAÇÕES DE DISSULFETO

Eletroforese em gel de poíiacrilamida/dodecil sulfato de sódio

Um procedimento de eletroforese em gel de poíiacrilamida/dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) para a análise de CTI_A4A29YL104E-lg é usadacomo um teste de pureza. As amostras são preparadas em um tampão deamostra de Tris-HCI (pH de 6,8), SDS, sacarose e azul de bromofenol napresença (reduzida) ou ausência (não-reduzida) de ditiotreitol (DTT). As a-mostras são colocadas em um banho de água a 80°C durante dois minutos esubmetidas à eletroforese em géis de SDS-poliacrilamida com gradiente (4-20%) pré-fundidos usando um tampão de operação de SDS de Tris-glicina.

Após eletroforese, os géis são fixados e corados usando um sistema de co-loração com azul Coomassie ou prata. CTI_A4A29YL104E-lg não-reduzida é ob-servada como uma grande banda, com um peso molecular evidente aproxi-mado de -104 kD. CTI_A4A29YL104E-lg é observada como uma banda principalcom um peso molecular evidente aproximado de ~53 kD.

Amostras de Processo B Lote 000929-278, Processo C Lote224818-2004-007 e uma co-mistura Lote 551218-162 foram eletroforetica-mente decompostos usando géis de SDS-PAGE com gradiente de 4-20%sob condições de redução e não-redução. Géis foram separadamente cora-dos com corante Coomassie ou prata, conforme mostrado na figura 35 e fi-gura 36. SDS-PAGE de CTI_A4A29YL104E-lg não-reduzida mostrou uma bandaprincipal a aproximadamente 104 kDa, representando o monômero intacto.Três bandas menores, não facilmente observadas sobre reproduções eletrô-nicas, foram também observadas a ~200, 65 e 53 kDa. Amostras de C-TLA4A29YL104E-lg reduzida mostram uma banda principal a aproximadamente53 kDa, representando a forma com cadeia simples e uma banda menor a~150 kDa. Essa comparação mostra que os três materiais testados sãocomparáveis quando analisados sobre o mesmo gel.

Ligações de dissulfeto

Ligações de dissulfeto foram caracterizadas para a Substância deFármaco do Processo C usando Lote 224818-2004-007. Cada cadeia deCTI_A4A29YL104E-lg contém nove cisteínas. Essas são Cys21, Cys48, Cys66,Cys92, Cys120, Cys171, Cys231, Cys277 e Cys335. Mapeamento peptídicocom LC/MS/MS on Iine de CTLA4A29YL104E-lg reduzida e não-reduzida foi u-sado para identificar os sítios de ligações intra- e intermolecular em C-Uma lista dos peptídeos obtidos a partir de mapeamentopeptídico de CTLA4A29YL104E-lg não reduzida junto com o MW esperado eobservado são mostrados na Tabela 27.

O desaparecimento de determinados picos no mapeamento peptí-dico não-reduzido e o aparecimento de novos picos no mapeamento peptídi-co reduzido proporcionada evidência de três peptídeos dissulfeto-ligados:T2-T6, Τ11-T17 e T25-T30, os quais correspondem às ligações de dissulfetode Cys21-Cys92, Cys171-Cys231 e Cys277-Cys335. Os peptídeos T5 e T7têm espécies de elevado peso molecular e contêm carboidratos N-ligados, oque torna difícil localizar ligações de dissulfeto. Para gerar peptídeos maiscurtos e isentos de carboidrato, CTI_A4A29YL104E-lg foi digerida com uma mis-tura de tripsina e quimiotripsina. Como um resultado de clivagem adicionalcom quimiotripsina T7 foi encurtado de um peptídeo com 35 aminoácidospara um peptídeo com 15 aminoácidos, designado ΊΤ-ΊΤ, no qual o carboi-drato N-Iigado é removido. O peptídeo JT-IT dissulfeto-ligado aparece nomapa não-reduzido (veja figura 37). MS/MS sobre T7'-T7' confirmou sua se-qüência e ligação de dissulfeto intercadeia em Cys120-Cys120.

Tabela 27. Seqüência de peptídeo e MW de peptídeos dissulfeto-ligados a partir deDigestão com tripsina de CTLA4A29YL104E-lg sob condições de não-redução_

<table>table see original document page 447</column></row><table>a.

Peptídeos T5 e 17-11 dão origem à várias massas em virtude de heterogeneidade de glicosilação N-ligada,tornando difícil localizar ligações de dissulfeto.

Tratamento com uma mistura de tripsina e quimiotripsina tam-bém resultou na formação de fragmentos, os quais correspondem à versõesmais curtas de outros peptídeos dissulfeto-ligados que foram observadoquando de hidrólise de CTLA4A29YL104E-lg através de tripsina apenas. Essessão mostrados na Tabela 28.Tabela 28. Seguência de peptídeo e MW de Peptídeos dissulfeto-ligados de

<table>table see original document page 448</column></row><table>

A digestão de CTI_A4A29YL104E-lg com uma mistura de tripsina equimiotripsina estabeleceu o emparelhamento de dissulfeto em T7-T7 e con-firmou as ligações de dissulfeto observadas com digestão através de tripsinaapenas. Contudo, essa mistura de enzima não tem qualquer efeito sobre opeptídeo T5, o qual é também um glicopeptídeo. De forma a remover os car-boidratos N-Iigados de T5, CTI_A4A29YL104E-lg foi digerida com uma misturade tripsina e elastase conforme mostrado na figura 38. Essa mistura de en-zimas hidrolisou T5 ém quatro diferente sítios, gerando um peptídeo maiscurto designado (T5'-T5") conforme mostrado na Tabela 29. Esse peptídeogerado tinha a massa esperada de 1259 Da e continha a ligação de dissulfe-to correspondendo a Cys46-Cys66. O perfil por mapeamento peptídico obti-do a partir de hidrólise de CTLA4A29YL104E-lg não-reduzida através de umamistura de tripsina e elastase, é mostrado na figura 38 e a seqüência depeptídeo T5'-T5" está na Tabela 29.Tabela 29: Seqüência de Deptídeo e MW de Peptídeos T5'-T5" Obtidos através deDigestão de CTLA4A29YL1 -Ig com uma Mistura de Tripsina e Eiastase_

<table>table see original document page 449</column></row><table>

Os resultados indicam que CTLA4A29YL104E-lg tem quatro ligaçõesde dissulfeto intra-moleculares nas posições Cys21-Cys92 (T2-T6), Cys48-Cys66 (correspondendo a um único peptídeo T5), Cys171-Cys231 (T11-T17) e Cys277-Cys335 (T25-T30) e uma ligação de dissulfeto intercadeia nas po-sições Cys120-Cys120 (T7-T7). Os dados somaram todos os dezoito resí-duos de cisteína. Nenhum emparelhamento errôneo foi observado.EXEMPLO 27: FORMULAÇÃO DE CTLA4A29YL104E-lg

CTI_A4A29YL104E-lg para injeção, 100 mg/frasco, é um Iiofilizado es-téril não-pirogênico. A composição de produto de fármaco é fornecida naTabela 30. Ela é um bolo branco a acinzentado, íntegro ou fragmentado for-necido em frascos de vidro do Tipo I tampados com rolhas de butila cinza evedados com vedações de alumínio. Esse produto inclui um excesso de 10%para levar em conta perdas pelo frasco, agulha e seringa.

Antes de administração, CTI_A4A29YL104E-lg para injeção, 100mg/frasco, é constituída com 4,2 mL de Água estéril para injeção, USP, paraproporcionar uma concentração de 25 mg/mL. Ela pode ser ainda diluídapara uma concentração tão baixa quanto 1 mg/mL com dextrose para inje-ção a 5%, USP ou Cloreto de sódio para injeção a 0,9%, USP. Soluçõesconstituídas e diluídas são claras, incolores e essencialmente isentas de ma-téria em partículas quando de inspeção visual.<table>table see original document page 450</column></row><table>

Cada frasco contém um excesso de 10% para considerar perdas pelo frasco, agulha eseringa da solução reconstituída.

b Removido durante liofilização

A temperatura de transição do vidro da solução congelada a serliofilizada foi determinada como sendo -28,9 °C. Estudos de liofilização foramconduzidos em várias auto-temperaturas de forma para determinar a maiorauto-temperatura possível permissível durante secagem primária, sem com-prometer a qualidade do produto. Baseado nesses estudos, uma auto-temperatura de -20 °C foi selecionada para a etapa de secagem primáriadurante a liofilização de CTI_A4A29YL104E-lg. Ao final do ciclo de liofilização, osfrascos são tampados sob pressão reduzida.

O processo de produção envolve congelamento de frascos con-tendo solução bruta para liofilização (com excipientes apropriados) em umacâmara de liofilização, seguido por sublimação de água congelada sob tem-peratura e pressão controladas. As condições de temperatura e pressão nacâmara são otimizadas de forma ter sublimação eficiente sem comprometera qualidade do produto.

A compatibilidade da solução com várias superfícies de contatocom o produto e componentes de embalagem foi estudada. Descobriu-seque a solução é compatível com uma tubulação de silicone, aço inoxidável316L, Acrodisc®, HT Tuffryn (poli-sulfona), membranas de filtração de PVDFMillipore (fluoreto de polivinilideno) e o sistema de vedação de recipienteselecionado.

CTLA4A29YL104E-lg para injeção, 100 mg/frasco, é embalada emfrascos de vidro com tubulação de sílex do Tipo I de 5 cc e tampada comuma rolha revestida com fluoro-resina Daikyo de 20 mm de butila cinza D-21-7-S/B2-TR 2 e vedada com uma vedação flip-off de alumínio de 20 mm.

Seleção de frasco para CTI_A4A29YL104E-lg para injeção foi baseadano volume de enchimento de 5,5 mL para assegurar liofilização eficiente eseleção de rolha revestida com fluoro-resina Daikyo de 20 mm de butila cin-za D-21-7-S/B2-TR foi baseada nos dados de compatibilidade.

Estudos de compatibilidade com tempo de uso extensivo foramconduzidos. 100 mg/ml_ de CTLA4A29YL104E-lg para injeção, quando constitu-ída para 25 mg/mL com água estéril para injeção, pode ser armazenada emtemperaturas ambientes de 15°-25°C (59°-77°F) e luz ambiente durante 24horas. Solução constituída, quando ainda diluída para 1 mg/ml ou 10 mg/mLcom Cloreto de sódio a 0,9% para Injeção (solução salina normal/NS) oucom dextrose para injeção a 5% (D5W) e armazenada em um saco de PVCou Intra Via de não-PVC em temperaturas ambientes de 15°-25°C (59°-77°F)e luz ambiente, não mostrou perda de potência ou aumento nas espécies deelevado peso molecular durante um período de 24 horas. A solução diluídadeve ser filtrada através de um filtro de acetato/celulose misto de 0,2 pm ou1,2 pm antes de administração. A solução diluída é compatível com filtros decelulose/acetato mistos de 0,2 pm e 1,2 pm.

O produto é incompatível com silicone. Ele interage com siliconepara formar partículas visíveis. Portanto, contato com superfícies tratadascom silicone, tais como seringas siliconizadas, deverá ser evitado.

EXEMPLO 28: PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CTLA4-IG

CTLA4-lg é produzida como uma proteína secretada em culturade célula em larga escala usando uma linhagem de célula de Ovário deHamster Chinês (CHO). O processo de produção de CTLA4-lg é iniciadousando uma série de etapas de expansão de inóculo em frasco e biorreatorde cultura. Os conteúdos de um biorreator de cultura final são usados parainocular um biorreator de produção de 5000 L. A cultura de célula coletadado biorreator de produção de 5000 L é clarificada e concentrada através demicrofiltração e ultrafiltração. O material coletado isento de célula é ajustadocom relação ao pH e condutividade no preparado para processamento a ju-sante. CTLA4-lg é purificada usando uma série de etapas cromatográficas ede filtração. O processo de produção de CTLA4-lg a jusante inclui duas eta-pas de cromatografia de troca de ânions, uma etapa de cromatografia deinteração hidrofóbica e uma etapa de cromatografia por afinidade. A finalida-de dessas etapas é purificar a proteína de CTLA4-lg, remover espécies deelevado peso molecular material de CTLA4-lg e controlar o teor de ácidosiálico da Substância de Fármaco de CTLA4-lg. As etapas de processamen-to a jusante também incluem a etapa de inativação viral e uma etapa de fil-tração viral para eliminar agentes virais adventícios potenciais. Substânciade Fármaco de CTLA4-lg purificada é enchida em garrafas de policarbonatode 2 L e congelada em uma temperatura-alvo de -70°C antes de armazena-mento em uma temperatura alvo de -40°C. A Substância de Fármaco conge-lada é descongelada.

Ácido N-acetil neuramínico (NANA) é a espécie de ácido siálicoprimária presente em Substância de Fármaco de CTLA4-lg. Referências aácido siálico por toda essa seção se refere especificamente a essa especíe.Níveis mínimos de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) também estão pre-sentes em Substância de Fármaco de CTLA4-lg. Os níveis de NANA e NG-NA são determinados para a Substância de Fármaco de CTLA4-lg final. Umfluxograma de processo para o processo de produção de CTLA4-lg é mos-trado abaixo.CTLA4-lg é produzida em biorreatores de produção de 5000 Lcom um volume de trabalho aproximado de 4300 L. Uma batelada de Subs-tância de Fármaco de CTLA4-lg é feita em um único biorreator de produçãoderivado de um único frasco do banco de células. O processo de produçãode cultura de célula a montante é iniciado usando um único frasco de célulasde um banco de célula. O frasco é descongelado e os conteúdos todos usa-dos para cultivar um T-frasco contendo meio de crescimento de cultura decélula. As células são, então, expandidas em uma série de frascos para cen-trífuga. Frascos da etapa final de expansão de inóculo em frasco para centrí-fuga são usados para inocular o biorreator de cultura de 140 L. O biorreatorde cultura de 140 L tem um volume de trabalho de aproximadamente 100 L.Os conteúdos do biorreator de cultura de 140 L são usados para inocular obiorreator de cultura de 1100 L. O biorreator de produção de 1100 L tem umvolume de trabalho de aproximadamente 600 L. Os conteúdos do biorreatorde cultura de 1100 L são usados para cultivar o biorreator de produção de5000 L. As células são cultivadas no biorreator de produção de 5000 L du-rante aproximadamente 14 dias. Após a etapa no biorreator de produção, ocaldo de cultura de célula de um único biorreator é transferido para um vasode coleta para processamento adicional. A unidade de microfiltração em flu-xo tangencial (MF) é usada para separar a proteína de CTLA4-lg secretadade células hospedeiras e resíduos de célula. O permeado de MF contendoproteína de CTLA4-lg é, então, concentrado através de ultrafiltração (UF) eajustado com relação ao pH e condutividade no preparado para a primeiraetapa de cromatografia.

As etapas de purificação e processamento a jusante para Subs-tância de Fármaco de CTLA4-lg consistem em cromatografia de troca deânions, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)1 inativação viral, croma-tografia por afinidade, concentração por UF com fluxo tangencial e diafiltra-ção, filtração viral, uma segunda cromatografia de troca de ânions e concen-tração por UF e diafiltração. A etapa de HIC utiliza múltiplos ciclos por lotede CTLA4-lg, dependendo da quantidade de CTLA4-lg a ser processada.

Material em-processo de múltiplos ciclos de etapa de HIC é empoçados paraa subsequente etapa de inativação viral. Material em-processo de diferentelotes não é empoçado. Múltiplos filtros virais podem ser usados em paraleloao processo de um único lote de CTLA4-lg. Após filtração viral, os filtradossão empoçadas para processamento adicional.

Cada Lote de CTLA4-lg é filtrado através de um filtro de 0,2 μίτιem garrafas de policarbonato (PC) de 2 L e temporariamente armazenado a2°C a 8°C. As garrafas de PC de 2 L de CTLA4-lg são congeladas em umatemperatura alvo de -70°C e, então, armazenadas em uma temperatura alvode -40°C. Garrafas de Substância de Fármaco são descongeladas em umaincubadora a 22°C a 24°C e esfriadas para 2°C a 8°C antes de embarque.

Produção

CTLA4-lg é produzida em cultura de célula em larga escala u-sando uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO). O pro-cesso de produção de CTLA4-lg a montante é iniciado com o descongela-mento de um frasco congelado de um banco de célula. A cultura é propaga-da em um T-frasco, seguido por uma série de culturas em frasco para centrí-fuga. Essas culturas são transferidas para um biorreator de cultura de 140 L.

A cultura do biorreator de cultura de 140 L é transferida para um biorreatorde cultura de 1100 L. A cultura do biorreator de cultura de 1100 L é usadapara inocular um biorreator de produção de 5000 L. Um biorreator de produ-ção é coletado primariamente baseado em uma proporção molar alvo deácido siálico para proteína de CTLA4-lg. A cultura de célula coletada é clari-ficada e concentrada usando uma combinação de microfiltração (MF) e ultra-filtração (UF). Finalmente, o material coletado isento de célula concentrado éajustado para obter uma condutividade e pH específicos no preparo paraprocessamento a jusante.

Cultura de células e Preparo de meio de alimentaçãodos. Dois meios para cultura de células são usados no processo. Meio 127-G é usado nas etapas no T-frasco, frasco para centrífuga, biorreator de cul-tura e biorreator de produção. Meio 117-E é usado como um meio de alimen-tação na etapa no biorreator de produção. A composição de meio 127-G émostrada na tabela diretamente abaixo.

<table>table see original document page 455</column></row><table>

A composição de meio e-RDF-1 está abaixo:<table>table see original document page 456</column></row><table>

O meio de cultura 127-G usado no T-frasco e frascos de centri-fugação no processo é preparado em vasos para meio equipados com umagitador para mistura e um cilindro de vidro graduado para determinação devolume. O tamanho de batelada de meio 127-G usada para as etapas deexpansão de inóculo no T-frasco e frasco para centrífuga é de 75 L. Meio127-G é preparado usando Água Para injeção (WFI). Componentes sólidos elíquidos do meio são adicionados à WFI. O meio é misturado durante o perí-odo de tempo requerido após a adição de cada componente. WFI é adicio-nada para levar o meio ao volume final de batelada de 75 L. A amostra éremovida do preparado de meio final e a concentração de glicose, pH e os-molaridade da amostra são medidos para assegurar que o meio vai ao en-contro dos critérios de aceitação definidos. O meio é filtrado através de umfiltro de 0,2 μηη e distribuído em garrafas estéreis de tereftalato de polietilenoglicol (PETG). O meio 127-G preparado para a etapa de expansão de inócu-lo em T-frasco e frasco para centrífuga é armazenado a 2°C a 8°C duranteum máximo de 42 dias. Meio 127-G para as etapas no biorreator de culturade 140 L e 1100 L é preparado em vasos equipados com um agitador paramistura. G tamanho da batelada de meio 127-G usada na etapa no biorrea-tor de cultura de 140 L é de 120 L. O vaso usado para preparar o meio parao biorreator de cultura de 140 L é equipado com um vidro com visor gradua-do para determinação de volume. O tamanho de lote de meio 127-G usadona etapa no biorreator de cultura de 1100 L é de 600 kg. O vaso usado parapreparar o meio para o biorreator de cultura de 1100 L é equipado com umtransmissor de pressão diferencial para determinação de peso.

Os volumes requeridos de meio 127-G são transferidos para osbiorreatores de cultura de 140 L e 1100 L através de filtros de 0,2 μηι e 0,1μΐη consecutivos. O meio 127-G preparado para as etapas nos biorreatoresde 140 L e 1100 L pode ser mantido a 37°C durante um máximo de 48 ho-ras. O meio pode ser mantido a 4°C durante mais 84 horas.

Preparo de meios de cultura de célula 127-G e 117-E C usados em umaetapa no biorreator de produção de 5000 L

Meio 127-G para a etapa com o biorreator de produção de 5000L é preparado em um vaso de preparo de meio equipado com um agitador etransmissor de pressão diferencial para determinação de peso. O tamanhode lote de meio 127-G usado na etapa com o biorreator de produção de5000 L é de 2900 kg. O volume requerido de meio 127-G é transferido parao biorreator de produção de 5000 L através de filtros consecutivos de 0,2 ocme 0,1 μm. O meio 127-G preparado para a etapa com o biorreator de produ-ção de 5000 L pode ser mantido a 37°C durante um máximo de 48 horas. Omeio pode ser mantido a 4°C durante mais 84 horas.

Meio de alimentação 117-E é preparado em um vaso de preparode meio equipado com um agitador para mistura e um transmissor de pres-são diferencial para determinação de peso. O tamanho de batelada de meio117-E usado na etapa com o biorreator de produção de 5000 L é de 1800kg. Os componentes do meio 117-E são adicionados a um peso especificadode WFI no vaso de preparo de meio. O meio é misturado durante o períodode tempo requerido após a adição de cada componente. WFI é adicionadapara levar o meio ao peso final especificado. A amostra é removida do pre-parado de meio final e a concentração de glicose, pH e osmolaridade daamostra medidos de forma para assegurar que o meio vai ao encontro doscritérios de aceitação definidos. O volume requerido de meio 117-E é trans-ferido para um tanque de contenção de meio de alimentação através de fil-tros consecutivos de 0,2 μm e 0,1 μm. O meio 117-E preparado para a etapacom o biorreator de produção de 5000 L pode ser mantido a 37°C duranteum máximo de 2 dias. O meio pode ser mantido a 4°C durante mais 4 dias.

Etapas de expansão de inóculo em T-frasco e Frasco para centrífuga

O objetivo das etapas de expansão de inóculo em T-frasco efrasco para centrífuga do processo de produção de CTI_A4-lg é propágarserialmente células do frasco com banco de células para proporcionar umnúmero suficiente de células viáveis para inocular o biorreator de cultura de140 L. Um único frasco do banco de células é removido da fase vapor de umcongelador de armazenamento de nitrogênio líquido e descongelado em umbanho de água a 37°C. Os conteúdos todos do frasco são assepticamentetransferidos para um tubo para centrífuga cônico de 15 mL estéril. Meio 127-G é adicionado para levar o volume final para 10 mL. A suspensão de célulaé centrifugada, o sobrenadante descartado e o pélete de célula ressuspensoem 10 mL de meio de cultura de célula 127-G. As células ressuspensas sãotransferidas para um frasco T-175 contendo 10 mL de meio 127-G. A densi-dade de células viáveis e a viabilidade percentual da cultura no frasco T-175são determinadas. Uma viabilidade percentual nessa etapa de >84% foi es-tabelecida. Meio 127-G é adicionado ao frasco T-175 para obter uma densi-dade-alvo de células viáveis de 2,1 χ 105 células/mL.

O frasco T-175 é incubado a 37°C em uma atmosfera de dióxidode carbono a 6% durante um máximo de quatro dias para obter um númerode células final-alvo de 1,80 χ 107 células viáveis. Após a etapa com frascoT-175, a cultura é expandida usando uma série de etapas frascos para cen-trífuga de 0,25 L, 1 L e 3 L. Em cada passagem, as células são cultivadasem uma densidade-alvo de 2,0 χ 105 células viáveis/mL. As culturas emfrasco para centrífuga são incubadas a 37°C em uma atmosfera de dióxidode carbono a 6%.

Material de cultura de célula da etapa final de expansão de inó-culo em frasco para centrífuga de 3 L é empoçado em um vaso de transfe-rência de inóculo esterilizado de 20 L. Uma densidade final de células viá-veis na etapa de expansão de inóculo no frasco para centrífuga de 3 L de1,0 a 2,0 χ 106 células/mL e uma viabilidade celular percentual mínima de >80% foram estabelecidas. Esses valores exemplificativos asseguram que umnúmero suficiente de células viáveis é usado para inocular o biorreator decultura de 140 L. Um volume total de12La18Lda cultura de célula empo-çada da etapa de expansão de inóculo final no frasco para centrífuga de 3 Lé usado para inocular o biorreator de cultura de 140 L.

Etapas de expansão de inóculo em biorreator de cultura de 140 L e1100L

O objetivo das etapas de expansão de inóculo em biorreator decultura de 140 L e 1100 L do processo de produção de CTLA4-lg é propor-cionar um número suficiente de células viáveis para inocular o biorreator deprodução de 5000 L. Os biorreatores de cultura são operados no modo embatelada usando meio de cultura de célula 127-G. A temperatura, pH, oxigê-nio dissolvido, pressão, agitação e taxas de fluxo de gás para ar, oxigênio edióxido de carbono são controlados através de um sistema de controle dis-tribuído (DCS) e proporcionam condições para crescimento ótimo da culturanos biorreatores de cultura. Os biorreatores de cultura são operados a 37°C.As amostras de cultura são removidas dos biorreatores de cultura para adeterminação de densidade de células viáveis, viabilidade percentual e con-centrações de metabólito.

O biorreator de cultura de 140 L é inoculado com inóculo empo-çado da etapa de expansão de inóculo em frasco para centrífuga de 3 L parauma densidade-alvo inicial de células viáveis de 2,0 χ 105 células/mL. Umadensidade final de células viáveis na etapa de expansão de inóculo no bior-reator de cultura de 1100 L de 1,0 a 2,5 χ 106 células/mL e uma viabilidadecelular percentual mínima de > 80% foram estabelecidas. Esses critérios deaceitação asseguram que um número suficiente de células viáveis é usadopara inocular o biorreator de produção de 5000 L. A cultura de célula do bior-reator de cultura de 1100 L é transferida para o biorreator de produção de5000 L para obter uma densidade inicial de células viáveis-alvo de 1,5 χ 105células/mL.

Etapa no biorreator de produção

O objetivo da etapa com o biorreator de produção de 5000 L éexpandir o número de células viáveis e produzir a proteína de CTLA4-lg. Aduração em um biorreator de produção etapa é de aproximadamente 14 di-as. Inóculo do biorreator de cultura de 1100 L é cultivado em um biorreatorde produção de 5000 L contendo meio de cultura de célula 127-G. Um bior-reator de produção é operado em um modo de alimentação em batelada. Atemperatura, pH, oxigênio dissolvido, pressão, agitação e taxas de fluxo degás para ar, oxigênio e dióxido de carbono são controlados através de DCSe proporcionam condições para crescimento ótimo da cultura e produção daproteína de CTLA4-lg no biorreator de produção.

Uma estratégia de controle de temperatura em três estágios éusada durante a etapa com o biorreator de produção de 5000 L para otimizaro crescimento celular e produção de CTLA4-lg. A temperatura de incubaçãoinicial de um biorreator de produção é controlada a 37°C para obter cresci-mento celular ótimo. A temperatura é diminuída para 34°C quando uma den-sidade de células viáveis de 4,0 χ 106 células/mL é obtida no biorreator deprodução ou a 144 horas a partir do momento de inoculação, o que ocorrerprimeiro. A temperatura é diminuída para 32°C a 240 horas e mantida a 32°Caté coleta. Amostras diárias são obtidas do biorreator de produção de 5000 Lpara monitorar o crescimento celular, viabilidade celular, concentrações demetabólito, titulação de CTLA4-lg e a proporção molar de ácido siálico paraproteína de CTLA4-lg.

Alimentação de meio 117-E ao biorreator de produção é iniciadaentre 12 a 24 horas a partir do momento de inoculação. Meio 117-E é adi-cionado diariamente para obter um alvo de 1% (v/v) de meio de alimentaçãoao volume de cultura ou um volume suficiente do meio de alimentação 117-Epara levar a concentração de glicose para 3 g/L. Essa estratégia de alimen-tação proporciona níveis suficientes de glicose e outros nutrientes à culturapara sustentar a produção de proteína de CTLA4-lg durante a etapa em umbiorreator de produção.

Meio 117-E é suplementado com D-galactose para promoverglicosilação aumentada de proteína de CTLA4-lg. Suplementação com ga-Iactose resulta em um aumento no teor final de ácido siálico da proteína deCTLA4-lg. A proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-lg éum critério de coleta importante no processo de produção de CTLA4-lg.

Uma estratégia com três estágios é também usada para contro-lar o oxigênio dissolvido e taxa de agitação no biorreator de produção. A taxade agitação inicial de 30 rpm assegurar uniformidade de condições físicas eimpede assentamento das células dentro do biorreator de produção de 5000L. O ponto de ajuste de oxigênio dissolvido inicial de 40% assegurar disponi-bilidade de níveis suficientes de oxigênio dissolvido para sustentar o cresci-mento da cultura no biorreator de produção. Os pontos de ajuste para oxigê-nio dissolvido e taxa de agitação são aumentados a 96 horas a partir domomento de inoculação para 50% e 40 rpm, respectivamente. A 120 horas apartir do momento de inoculação, os pontos de ajuste para oxigênio dissolvi-do e taxa de agitação são ainda aumentados para 60% e 50 rpm, respecti-vamente. Essa estratégia assegurar níveis suficientes de oxigênio dissolvidopara manter a cultura de célula durante a etapa no biorreator de produção. Atitulação de proteína de CTLA4-lg aumenta durante o curso da etapa em umbiorreator de produçã. A viabilidade da cultura é monitorada durante o cursodessa etapa. A proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-lgé monitorada duas vezes diariamente a partir de 6 dias do momento de ino-culação até o momento de coleta. A proporção molar de ácido siálico paraproteína de CTLA4-lg tem um pico a aproximadamente 10 em torno do dia 8a partir do momento de inoculação e, então, diminui gradualmente durante orestante da etapa no biorreator de produção. O critério de coleta primáriopara um biorreator de produção é a proporção molar de ácido siálico paraproteína de CTLA4-lg. Um biorreator de produção é coletado em um propor-ção molar alvo de ácido siálico para proteína de CTLA4-lg de 8,0.

Um valor de viabilidade celular mínima de 38% foi também esta-belecido para coleta da cultura. Esses critérios de coleta asseguram a con-sistência do material coletado em-processo para processamento a jusante àSubstância de Fármaco de CTLA4-lg. O número total de gerações de célulado início da expansão de inóculo até a coleta de um biorreator de produçãono processo de produção de CTLA4-lg a montante é de aproximadamente38 gerações. Foi demonstrado que a linhagem de célula usada no processoé estável durante 105 gerações em um estudo de estabilidade de linhagemde célula.

Etapas de operação de coleta

O objetivo das etapas de operação de coleta é remover células eresíduos de célula do material coletado e concentrar a corrente em-processocontendo proteína de CTLA4-lg para processamento adicional a jusante. Ossistemas de MF e UF são sanitarizados antes de processamento do materialcoletado. Os sistemas de MF e UF são submetidos a fluxo com uma soluçãode ácido peracético. Os sistemas de MF e UF são, então, tratados com umasolução de alvejamento e uma solução de hidróxido de sódio, respectiva-mente. Finalmente, os sistemas de MF e UF são submetidos a fluxo comWFI até uma condutividade de < 3 μβ/αη no retentado e permeado é obtida.O caldo de cultura de célula do biorreator de produção de 5000 L é transferi-do para um vaso de coleta. MF em fluxo tangencial com membranas de fluo-reto de polivinilideno de 0,65 μηι é usada para a remoção de células e resí-duos de célula do material coletado em-processo contendo proteína de C-TLA4-lg. O permeado de MF isento de células é coletado em vaso de per-meado. O permeado de MF isento de células é simultaneamente concentra-do através de UF em fluxo tangencial usando membranas de poliéter-sulfonacom um corte de peso molecular nominal de 30 quilodáltons (kDa). O per-meado de UF é usado como o meio de diafiltração para a etapa de processode MF. Uma solução de ácido fosfórico a 0,1 N é usada para armazenamen-to do sistema de MF. Uma solução de hidróxido de sódio a 0,1 N é usadapara armazenamento do sistema de UF. A temperatura, taxas de fluxo depermeado e retentado e pressões transmembrana são monitoradas e contro-ladas durante a operação de MF e UF. As taxas de fluxo são medidas atra-vés de fluxômetros in line presentes sobre as rampas de filtração. Sensoressão usados para medir a pressão e temperatura. Uma taxa de fluxo de reten-tado de MF de 163 a 235 L/min e uma pressão transmembrana de MF de <0,0262 MPa manométrico (3,8 psig) foram estabelecidas. Esses valores as-seguram consistência no desempenho das etapas de operação de coleta.

A etapa final na operação de coleta é um ajuste do pH e condu-tividade do material coletado em-processo clarificado e concentrado. O pH econdutividade do material coletado em-processo concentrado são ajustadospara captura da proteína de CTLA4-lg durante a primeira etapa de proces-samento cromatográfico a jusante. O pH é ajustado para 8,0 através da adi-ção de uma solução de Tris a 2 M e a condutividade do permeado concen-trado é reduzida para 10 mS/cm através da adição de WFI. O material cole-tado em-processo concentrado e ajustado é, então, filtrado através de trêsalojamentos de filtro paralelos e um consecutivo contendo filtros descartá-veis de 0,2 μm e transferido para um tanque na área de purificação a jusante.Tabela 31: Composição de Meio CD-CHO

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Tabela 32: Composição de meio de alimentação eRDF

<table>table see original document page 464</column></row><table>

Tabela 33: Composição Modificada de Meio CD-CHO a 50%

<table>table see original document page 464</column></row><table>

EXEMPLO 29 - Processo de Durificacão de CTLA4-lq

O material ajustado com pH e condutividade final da etapa deoperação de coleta descrita no Exemplo 28 é primeiro processado usandouma etapa de cromatografia de troca de ânions. A reunião ("pool") de produ-to dessa primeira etapa de cromatografia de troca de ânions é, então, pro-cessada usando uma etapa de cromatografia por interação hidrofóbica. Omaterial contendo CTLA4-lg é, então, tratado com Triton X-100 para inativaragentes virais adventícios potenciais. O material tratado com Triton X-100 éprocessado usando uma etapa de cromatografia por afinidade por proteína Arecombinante. A reunião de produto da etapa de cromatografia em proteína

A recombinante é concentrada e diafiltrada. Uma etapa de filtração viral paraa remoção de agentes virais adventícios potenciais é, então, realizada. Ofiltrado é ainda purificado usando uma segunda etapa de cromatografia portroca de ânions. Finalmente, a proteína CTLA4-lg purificada é concentrada ediafiltrada no tampão de substância de fármaco final.

CTLA4-.lg é uma proteína de fusão geneticamente manipulada aqual consiste no domínio de ligação funcional do Antígeno 4 de Linfócito TCitotóxico humano e o domínio Fc de imunoglobulina monoclonal humana daclasse IgGI. O dímero CTLA4-lg é compreendido de duas cadeias polipeptí-dicas glicosiladas homólogas de aproximadamente 45 kDa cada, as quaissão covalentemente ligadas através de uma única ligação de dissulfeto. Umfluxograma de processo para as etapas a jusante do processo de produçãode CTLA4-lg é mostrado. CTLA4-lg é produzida em biorreatores de produ-ção de 5000 L usando uma linhagem de células de ovário de hamsterChinês (CHO). Etapas cromatográficas e de filtração no processo deprodução de CTLA4-lg a jusante são realizadas em temperatura ambiente. Omaterial em-processo é armazenado a 2 a 8°C entre as etapas de proces-samento. O processo a jusante é iniciado com o recebimento do materialcoletado em-processo das etapas de operação de coleta. Esse material éprimeiro processado através de uma coluna de cromatografia de troca deânions usando resina Q Sepharose® Extreme Load (QXL). A coluna QXLfunciona para capturar a proteína CTLA4-lg do material coletado. A etapa decaptura em coluna QXL também obtém uma redução de volume para pro-cessamento a jusante adicional.

A reunião de produto de QXL é passada através de uma colunade cromatografia por interação hidrofóbica (HIC) utilizando uma resinaPhenyl Sepharose Fast Flow. Durante essa etapa, material de CTLA4-lg dealto peso molecular (HMW) e proteínas de célula hospedeira de ovário dehamster Chinês (CHOP) são ligados à coluna. A proteína dimérica CTLA4-lgnão se liga à resina de HIC e passa através da coluna. Após a etapa de HIC1uma inativação viral (VI) usando detergente Triton® X-100 é realizada parainativar agentes virais adventícios potenciais. A próxima etapa utiliza umacoluna de afinidade por proteína A recombinante de resina Sepharose FastFlow (rPA). Nessa etapa de cromatografia, os níveis de CHOP e proteína 1quimiotática de monócito (MCP-1) são reduzidos. A etapa de rPA é definidacomo uma etapa de eliminação viral. Após a etapa de cromatografia por afi-nidade, a proteína CTLA4-lg é concentrada e submetida à diálise usandomembranas de ultrafiltração (UF) de 30 kDa e processada através de filtrosPlanova® de 15 nm para remover agentes adventícios potenciais. Quandode término da etapa de filtração viral (VF)1 a proteína CTLA4-lg é processa-da sobre uma segunda coluna de troca de ânions usando resina Q Sepharo-se Fast Flow (QFF). A etapa de cromatografia QFF reduz os níveis de DNAe proteína A recombinante residuais. A etapa de QFF é definida como umaetapa de eliminação viral. Finalmente, a proteína CTLA4-lg é concentrada ediafiltrada usando uma membrana de UF de 30 kDa contra uma solução defosfato de sódio a 25 mM, NaCI a 50 mM, pH de 7,5. A substância de fárma-co CTLA4-lg é, então, filtrada através de um filtro de 0,2 μηη antes da etapade enchimento final.

<figure>figure see original document page 466</figure>Remoção ViralFiltração em Planova de 15 nm

Cromatografia de troca de ânionsQ Sepharose Fast Flow

Concentração/DiafiltraçãoMembrana de UF de 30 kDa

Substância de fármaco

Armazenado a 2-8 °C ou congelado e armazenado a -4 °C

A impurezas relacionadas ao processo CHOP1 MCP-1, proteína

A recombinante residual, DNA e Triton X-100 são reduzidos em etapas deprocessamento a jusante específicas do processo de produção de CTLA4-lg.PPs com limites de ação são estabelecidos no ponto de controle em-processo principal para cada impureza. CHOP e MCP-1 na reunião de pro-duto são identificados como PPs para a etapa de cromatografia rPA. Liganteproteína A recombinante residual, DNA e Triton X-100 na reunião de produtosão identificados como PPs para a etapa de cromatografia QFF. Baseado naestrutura conhecida e retenção cromatográfica da insulina, as etapas deHIC, rPA e QFF proporcionariam eliminação significativa de insulina baseadoem modos ortogonais de interação. Além disso, insulina com um peso mole-cular de 5,8 kDa seria eliminada através de três etapas de concentra-ção/d iafiltração a 30 kDa no processo de coleta e a jusante. A etapa de rPAproporciona uma eliminação de > 3,0 Iogi0 de metotrexato (MTX). Além dis-so, MTX com um peso molecular de 0,455 kDa seria eliminado através dastrês etapas de concentração/diafiltração a 30 kDa no processo de coleta e ajusante. Insulina e MTX são adicionados ao meio de fermentação em quanti-dades fixas e são consumidos como uma função do metabolismo celular du-rante o processo de fermentação de 5000-L antes de processamento a ju-sante. Insulina e MTX são medidos em múltiplos pontos no processo a ju-sante. Os níveis de insulina e MTX em cada um desses pontos estavam a-baixo do nível de quantificação para operações anteriores completas.

Tampões: O objetivo de preparo do tampão é produzir tampõesde processamento a jusante que vão de encontro a valores, limites de açãoe limites de alerta exemplificativos. Qualidade consistente do tampão é es-sencial para assegurar desempenho cromatográfico reproduzível. As etapasa jusante do processo CD-CH01 de CTLA4-lg requerem 17 tampões e solu-ções. Tampões e soluções são preparados e usados para etapas de proces-samento específicas dentro de um lote. Tampões que têm contato com omaterial em-processo CTLA4-lg são considerados como sendo tampões deprocesso significativos. Os tampões de contato com produto incluem tam-pões de equilíbrio, lavagem, eluição e ajuste de reunião de produto. Os tam-pões e soluções usados em etapas de limpeza e sanitarização e testagemfuncional dos detectores de ultravioleta (UV) nas plataformas de cromatogra-fia têm amplas faixas de especificação. Em virtude das amplas faixas de es-pecificação para esses tampões e soluções e da ausência de contato comproduto, nenhum PPs é designado para esses tampões e soluções. Os PPsdefinidos para os dez tampões de contato com produto e valores exemplifi-cativos correspondentes são resumidos. O limite de tempo de manutençãomáximo para esses tampões é de três dias e é derivado de estudos de ma-nutenção em vaso de tampão9 e suportados por estudos de estabilidade detampão. Os tampões de contato com produto também têm PPs designadoscom limites de alerta correspondentes. Os PPs e limites de alerta correspon-dentes para esses tampões são apresentados. Tampões e soluções que nãoentram em contato com material CTLA4-lg em-processo têm PPs designa-dos com limites de alerta ou ação e são apresentados. Tampões e soluçõesque não contatam o produto não são testados com relação à endotoxinaporque eles são soluções de sanitarização ou tampões ou soluções de lim-peza de resina de cromatografia que são seguidas por etapas de sanitariza-ção de coluna.

Etapa de cromatografia de troca de ânions Q Sepharose Extreme Load

Cromatografia de troca de ânions é realizada usando resina QXLda GE Healthcare (formalmente Amersham Biosciences). Uma coluna de 1,0m de diâmetro interno é acondicionada com resina QXL para uma altura de17 a 24 cm, representando um volume de 133 a 188 L. A coluna é qualifica-da para uso determinando a altura equivalente a um platô teórico (HETP) e aassimetria (As) da coluna acondicionada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm euma As de 0,8 a 1,2 são requeridas para qualificação da coluna QXL. A co-luna QXL funciona para capturar a proteína CTLA4-lg do material coletadoem-processo. A etapa de captura por QXL também obtém uma redução devolume para processamento a jusante adicional. A operação na coluna QXLé realizada em temperatura ambiente. O caldo de cultura celular clarificado écarregado sobre uma coluna QXL equilibrada. A etapa de cromatografia QXLé realizada usando uma taxa de fluxo máxima de 28 L/min. A pressão deentrada da coluna é mantida abaixo de 0,2413 MPa manométrico (35 psig).

A carga máxima de proteína abatacept para a coluna QXL é de 28 gramasde abatacept por litro de resina. A coluna é preparada através de equilíbriocom tampão de HEPES a 25 μΜ, NaCI a 100 mM, pH de 8,0. Após equilíbrioda coluna, o material coletado é carregado sobre a coluna com monitora-mento contínuo da absorção de UV do efluente a 280 nm. Após aplicação dacarga, a coluna é lavada com tampão de HEPES a 25 mM, NaCI a 120 mM,pH de 8,0. A proteína CTLA4-lg é eluída da coluna com tampão de HEPES a25 mM, NaCI a 850 mM, pH de 7,0. A tabela diretamente abaixo mostra osparâmetros de processo para a etapa de cromatografia Q Sepharose Extre-me Load.

<table>table see original document page 469</column></row><table>

O tempo de manutenção de coleta assegura consistência deprocesso com limites de alerta estabelecidos. Ao parâmetro de biocarga dereunião de produto pré-filtração é atribuído um alerta ínterim e limites de a-ção de < 10 cfu/mL e < 100 cfu/mL, respectivamente. Os seis PPs de QXLdefinidos pelos limites de ação são altura da coluna, taxa de fluxo, condutivi-dade do tampão de lavagem, pico de eluição e densidade óptica (OD), ren-dimento da etapa e biocarga. A faixa de altura da coluna foi estabelecidapara proporcionar volume suficiente para que a resina capture produto domaterial coletado. Os limites de ação para esse parâmetro foram estabeleci-dos a partir dos dados. A taxa de fluxo é um fator importante para assegurarconsistência e desempenho de uma etapa cromatográfica. Ela é definidapara a etapa QXL como um PP com um limite de ação máximo. A condutivi-dade do tampão de lavagem é estabelecida para remover impurezas fraca-mente ligadas da resina QXL. Estudos de classificação por escalonamentodeterminaram que esse parâmetro é um fator importante na manutenção daconsistência da etapa QXL. O pico de eluição e a OD são definidos para mi-nimizar o nível de material CTLA4-lg de HMW na reunião de produto. O ma-terial CTLA4-lg de HMW elui ao final do pico de eluição. Limites de ação derendimento da etapa asseguram consistência de processo para a etapa deQXL. Os limites de ação para taxa de fluxo, pico de eluição e OD e PPs derendimento da etapa foram estabelecidos. À biocarga é atribuído um limitede ação de < 1 cfu/mL. Doze dos PPs de QXL são definidos pelos limites dealerta, conforme apresentado.

Os valores de pH e condutividade do tampão no processo sãomonitorados. Tampões que não vão de encontro aos valores exemplificati-vos de pH e condutividade no momento de preparo são rejeitados e o lotede tampão descartado. Para a etapa de QXL, a condutividade e pH do tam-pão de equilíbrio, pH do tampão de lavagem e condutividade e pH do tam-pão de eluição são definidos. A pressão de entrada da coluna assegura con-sistência durante a etapa de cromatografia de ligação-e-eluato. A etapa QXLé realizada em um limite máximo de pressão de 0,2413 MPa manométrico(35 psig). O limite de pressão de 0,2413 MPa manométrico (35 psig) é em-pregado para prevenir compressão da resina QXL de acordo com a especifi-cação do fabricante. A condutividade da reunião de produto é um PP comum limite de alerta. À condutividade da reunião de produto é atribuído umlimite de alerta para assegurar que o material CTLA4-lg de HMW e CHOP nareunião de produto de QXL se ligam eficazmente à subsequente coluna deHIC. Os limites de alerta de 58,5 a 69,1 mS/cm foram estabelecidos. À titula-ção de reunião de produto, proporção molar de ácido siálico (SA) para ácidoN-acetilneuramínico (NANA), material CTLA4-lg de HMW e CHOP são atri-buídos limites de alerta de forma a assegurar consistência de processo. Atitulação de reunião de produto e limites de alerta de SA foram estabeleci-dos.

O material em-processo da etapa de operação de coleta é car-regado sobre a coluna de QXL. A coluna é lavada com um mínimo de 10 CVde tampão de lavagem (HEPES a 25 mM, NaCI a 120 mM, pH de 8,0) e aabsorbância a 280 nm (A280) do efluente da coluna é medida ao final daetapa de lavagem. O abatacept é, então, eluído da coluna com um tampãode HEPES a 25 mM, NaCI a 850 mM, pH de 7,0. O eluato é desviado paraum vaso de coleta quando a A280 aumenta para > 0,02 unidades de absor-bância (AU) acima do valor de AU ao final da etapa de lavagem. O eluato écoletado até que a A280 da borda de fuga do pico de eluição diminua paraum valor de <1,0 AU. Tampão de eluição é adicionado diretamente ao vasode coleta de eluato para obter um peso alvo de 600 ± 10 kg do eluato. Umataxa de agitação de 30 ± 5 rpm no vaso de coleta de eluato é usada paraassegurar que os conteúdos sejam bem misturados. Após um período demistura de > 5 minutos, os conteúdos do vaso de coleta são filtrados atravésde um filtro de acetato de celulose de 0,2 μιη diretamente em um vaso decontenção. Mais 50 kg de tampão de eluição são adicionados ao vaso decoleta e, então, filtrados através do filtro de acetato de celulose de 0,2 μιη nomesmo vaso de contenção. Os conteúdos do vaso de contenção são arma-zenados a 2o a 8 0C durante até 72 horas.

Tabela 5. Parâmetros de Processo para a etapa de cromatografia Q Se-pharose Extreme Load

<table>table see original document page 471</column></row><table>continuação

<table>table see original document page 472</column></row><table>

Cromatografia por interação hidrofóbica Phenvl Sepharose Fast Flow

O objetivo primário da etapa de HIC é reduzir o nível de espé-cies de CTLA4-lg de alto peso molecular (por exemplo, tetrâmero) presentesna reunião de produto de QXL. O tetrâmero de CTLA4-lg não se liga à resinade HIC sob as condições de carregamento usadas para a etapa de HIC.

A etapa de HIC é realizada usando uma resina Phenyl Sepharo-se Fast Flow da GE Healthcare. A coluna de HIC se liga ao material CTLA4-Ig de HMW e CHOP1 desse modo, reduzindo suas concentrações na corren-te de proteína CTLA4-lg. A coluna de HIC é preparada através de equilíbriocom tampão de HEPES a 25 mM, NaCI a 850 mM, pH de 7,0. A reunião deproduto de CTLA4-lg da etapa de QXL é aplicada à coluna equilibrada. Apósaplicação da carga, tampão de HEPES a 25 mM, NaCI a 850 mM, pH de 7,0é aplicado à coluna. CTLA4-lg é coletada da coluna no escoamento e fra-ções de chase da coluna. A coluna de HIC é operada em múltiplos ciclospara processar um único lote de CTLA4-lg, dependendo da massa total deCTLA4-lg na reunião de produto de QXL. A coluna é limpa e sanitarizadaentre os ciclos e lotes.

O PP carga bioburden de HIC é definido por limites de alerta eação. Ao PP biocarga de HIC é atribuído um alerta de ínterim e limites deação de < 10 cfu/mL e < 100 cfu/mL, respectivamente. Os cincos valores deHIC definidos para a coluna são altura da coluna, taxa de fluxo, OD final dechase, rendimento da etapa e tempo de manutenção da carga. A altura dacoluna foi determinada para proporcionar volume de resina suficiente paraprocessar a reunião de eluição da coluna QXL em um, dois ou três ciclos porlote. Os limites de ação para esse parâmetro foram estabelecidos a partirdos dados. A taxa de fluxo é um fator importante para assegurar a consis-tência e desempenho de uma etapa cromatográfica. Ela é definida para aetapa de HIC como um parâmetro de processo com um limite de ação má-ximo. A OD final de chase é definida para minimizar o nível de materialCTLA4-lg de HMW na reunião de produto. Material CTLA4-lg de HMW eluiao final do pico de produto. O rendimento da etapa de processo asseguraconsistência de processo para a etapa de HIC. Os limites de ação para osPPs taxa de fluxo, OD final de chase e rendimento de etapa foram estabe-lecidos. Limites de ação para tempo de contenção de carga asseguramconsistência de processo. O limite de ação para o PP tempo de conten-ção de carga de < 5 dias é suportado por estudos de tempo de contençãoem vaso de produto e o estudo de estabilidade bioquímica. Nove PPs deHIC são definidos pelos limites de alerta, conforme apresentado. Os parâme-tros de pH e condutividade do tampão no processo a jusante são identifica-dos como PPs com limites de alerta. Tampões que não vão de encontro avalores exemplificativos de pH e condutividade no momento de preparo sãorejeitados e o lote de tampão descartado. Para a etapa de HIC, a condutivi-dade e pH do tampão de equilíbrio/chase são definidos como PPs com limi-tes de alerta.

A pressão de entrada da coluna assegura consistência durante aetapa de cromatografia. A etapa de HIC é realizada em um limite de pressãomáximo de 0,0896 MPa manométrico (13 psig). O limite de pressão de0,0896 MPa manométrico (13 psig) é empregado para prevenir compressãoda resina de HIC de acordo com a especificação do fabricante. A titulação dereunião de produto e limites de alerta de SA asseguram consistência de pro-cesso e foram estabelecidos nos relatos de PAR. Ao DNA, CHOP e MCP-1na reunião de produto são atribuídos limites de alerta nessa etapa de formaa facilitar a quantificação de sua remoção na subsequente etapa de rPA.Tabela 7. Parâmetros de Processo para a etapa de cromatografia porinteração hidrofóbica Phenyl Sepharose Fast Flow

<table>table see original document page 474</column></row><table>

a^ informação foi obtida da Tabela 2 no Relato Final PAR: Purificação12.

Etapa de inativacão viral: Inativação de agentes virais adventícios potenci-ais na reunião de produto de da etapa de HIC é obtida através da adição deTriton X-100 a 20% até uma concentração final de 0,5% (v/v). A solução tra-tada com detergente é misturada e mantida a 22 ± 3°C durante uma a quatrohoras antes de prosseguir para a próxima etapa. Os cinco PPs definidos pa-ra a etapa de IV são apresentados. O limite máximo do parâmetro de adiçãode Triton X-100 a 20% é de 3,8%. Veja a tabela diretamente abaixo quemostra os parâmetros de processo para a etapa de inativação viral.

<table>table see original document page 474</column></row><table>

a^ informação foi obtida a partir de estudos de eliminação viral, PQ-58-ViralClearance-BMSI 88667-00123.Tabela 9. Parâmetros de processo para a etapa de inativação viral

<table>table see original document page 475</column></row><table>

a informação foi obtida a partir da Tabela 3 no Relato Final PAR: Purificacao12.

Etapa de afinidade Sepharose Fast Flow por proteína A recombinante

A cromatografia por afinidade é realizada usando uma resinarPA da GE Healthcare. A etapa de cromatografia rPA purifica adicionalmentea proteína CTLA4-lg através de redução dos níveis de CHOP, MCP-1 e a-gentes virais adventícios potenciais. A coluna de cromatografia por afinidadeé equilibrada com tampão de Tris a 25 mM, NaCI a 250 mM, pH de 8,0. Apósequilíbrio da coluna, o material tratado com Triton X-100 da etapa de Vl éaplicado à coluna de cromatografia por afinidade. A coluna é primeiro lavadacom tampão de Tris a 25 mM, NaCI a 250 mM, Triton X-100 a 0,5%, pH de8,0, seguido por uma segunda lavagem com tampão de Tris a 25 mM, NaCIa 250 mM, pH de 8,0. A proteína CTLA4-lg é eluída da coluna com tampãode glicina a 100 mM, pH de 3,5. O pH da reunião de produto da coluna deafinidade é ajustado para 7,5 ± 0,2 com tampão de HEPES a 2 M, pH de 8,0.

Os quatro PPs definidos para a etapa de rPA são apresentados na Tabela10. A etapa de cromatografia rPA foi identificada como uma etapa de elimi-nação viral, assim, a altura do leito da coluna foi estabelecida como um novoPP com valores exemplificativos de 21 a 25 cm. CHOP na reunião de produ-to e MCP-1 na reunião de produto foram previamente identificados comoPPs para a etapa de rPA. Essas impurezas foram redefinidas como PPscom limites de ação. Veja a tabela diretamente abaixo que mostra os parâ-metros de processo para a etapa de cromatografia Sepharose Fast Flow pro-teína A.<table>table see original document page 476</column></row><table>

"Informação foi obtida da Tabela 4 no Relato Final PAR: Purificação12.

Três PPs para a etapa de rPA são definidos pelos limites de a -lerta e ação, conforme apresentado. O tempo de contenção de carga asse-gura consistência de processo com limites de alerta estabelecidos no relatoPAR. Limites de ação para tempo de contenção de carga asseguram consis-tência de processo. O limite de ação para o PP tempo de contenção de car-ga de < 48 horas é suportado por estudos de tempo de contenção em vasode produto e o estudo de estabilidade bioquímica. Estudos de classificaçãoidentificaram o pH do tampão de eluição como um fator significativo que afe-ta o nível de material CTLA4-lg de HMW na reunião de produto de rPA. Oslimites de alerta para o pH do tampão de eluição foram estabelecidos. O limi-te de ação para o pH do tampão de eluição foi estabelecido a partir do estu-do de escalonamento. Ao pp carga bioburden de rPA foi atribuído alerta deínterim e limites de ação de < 10 cfu/mL e < 100 cfu/mL, respectivamente.

Os sete PPs para rPA definidos pelos limites de ação são pres-são de entrada da coluna, taxa de fluxo, rendimento da etapa, pH inicial dareunião de produto, HMW da reunião de produto, CHOP na reunião de pro-duto e MCP-1 na reunião de produto. O limite de pressão de < 0,0896 MPamanométrico (13 psig) é empregado para prevenir compressão da resinarPA de acordo com a especificação do fabricante. A taxa de fluxo é um fatorimportante para assegurar a consistência e desempenho de uma etapa cro-matográfica. Ela é definida para a etapa de rPA como um PP com um limitede ação máximo. Os limites de ação para rendimento da etapa e pH inicialda reunião de produto asseguram consistência de processo para a etapa derPA. Limites de ação para a taxa de fluxo e pH inicial da reunião de produtoforam estabelecidos. A formação potencial de material CTLA4-lg de HMWdurante eluição de pico requer a definição de um limite de ação de < 2,5%para esse parâmetro. A faixa de limite de ação de 66 a 108% foi estabeleci-da usando os dados de média ± 3 desvios-padrão de um único lote de resinarPA. Essa faixa é consistente com os rendimentos de etapa observados noestudo de vida útil da resina. As impurezas relacionadas ao processo CHOPe MCP-1 foram previamente identificadas como PPs para a etapa de rPA.Nesse relato, essas impurezas foram redefinidas como PPs com limites deação. CHOP e MCP-1 na reunião de produto são definidos como CQAs comvalores exemplificativos para assegurar controle dessas impurezas relacio-nadas ao processo. Doze dos PPs para rPA são definidos por limites de aler-ta, conforme apresentado. Os parâmetros de pH e condutividade do tampãono processo a jusante são identificados como PPs com limites de alerta.Tampões que não vão de encontro aos valores exemplificativos de pH econdutividade no momento de preparo são rejeitados e o lote de tampãodescartado. Para a etapa de rPA, a condutividade e pH do tampão de equilí-brio/lavagem 2, pH e condutividade do tampão de lavagem 1 e condutividadedo tampão de eluição são definidos como PPs com limites de alerta.

Tabela 11. Parâmetros de processo para a etapa de cromatografia FastFlow proteína A recombinante

<table>table see original document page 477</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 478</column></row><table>

"Informação foi obtida da Tabela 4 no Relato Final PAR: Purificação12.

Etapa de concentracão/diafiltracão e filtracão viral

Quando de eluição da coluna de rPA, a reunião de produto éconcentrada para obter um volume alvo dentro de um limite de concentraçãode CTLA4-lg. O concentrado é, então, submetido à diafiltração com tampãode HEPES a 25 mM, NaCI a 100 mM, pH de 8,0 usando um sistema demembranas de UF com um corte de peso molecular nominal de 30 kDa(NMWC). Após diafiltração, um conjunto de filtro é usado para remover partí-cuias virais adventícias potenciais. O conjunto de filtro consiste em um filtrode 0,2 μm, um filtro de 0,1 μηι e filtros de membrana de 15 nm (filtro Planova15N). Filtros usados na etapa de VF (0,2 μιτι, 0,1 μηη e 15 nm) são filtros deuso único. O limite máximo da faixa para concentração de CTLA4-lg pós-UFe pressão diferencial Planova foi aumentado baseado na eliminação viraldemonstrada usando essas condições. Veja tabela abaixo que mostra osparâmetros de processo para a etapa de filtração viral.

<table>table see original document page 478</column></row><table>

a informação foi obtida a partir de estudos de eliminação viral, PQ-58-ViralCIearance-BMSI 88667-00123, BD-2004-001.023 e BD-2005-832.026.Tabela 13. Parâmetros de processo para a etapa de filtração viral

<table>table see original document page 479</column></row><table>

a^ informação foi obtida da Tabela 5 no Relato Final PAR: Purificação12,b^ informação foi obtida do BD-2005-706.015

Etapa de cromatoqrafia por troca de ânions Q Sepharose Fast Flow

O objetivo da etapa de cromatografia QFF é reduzir os níveis deproteína A residual e proporcionar redução adicional do DNA de célula hos-pedeira da reunião de produto da etapa de filtração viral. A etapa na colunaQFF é também usada para controlar o ácido siálico nas moléculas de C-TLA4-lg ou a proporção molar de proteína da reunião de produto da etapade cromatografia QFF e proporcionar controle adicional dos níveis de mate-rial de HMW. A etapa de cromatografia de troca de ânions QFF também po-de remover a proteína A recombinante residual, DNA de célula hospedeira,Triton X-100 e agentes virais adventícios potenciais.

A cromatografia por troca de ânions é realizada usando resinaQFF da GE Healthcare. A coluna QFF é equilibrada com tampão de HEPESa 25 mM, NaCl a 100 mM, pH de 8,0. Após equilíbrio da coluna, o filtrado dePlanova é aplicado à coluna QFF. A coluna é primeiro lavada com tampãode HEPES a 25 mM, NaCI a 120 mM, pH de 8,0, seguido por uma segundalavagem com tampão de HEPES a 25 mM, NaCI a 130 mM, pH de 8,0. Aproteína CTLA4-lg é eluída da coluna com tampão de HEPES a 25 mM, Na-Cl a 200 mM, pH de 8,0.

<table>table see original document page 479</column></row><table>

"Informação foi obtida da Tabela 6 no Relato Final PAR: Purificação12.O valor de carga bioburden QFF é < 10 cfu/mL ou < 100 cfu/mL,respectivamente. Os doze PPs de QFF definidos pelos limites de ação sãotaxa de fluxo, condutividade do tampão de lavagem 2, condutividade dotampão de eluição, tempo de contenção de carga, rendimento da etapa e osníveis de proteína A, DNA, Triton X-100, SA, HMW, CHOP e MCP-1 residu-ais na reunião de produto QFF. A taxa de fluxo é um fator a considerar paraassegurar consistência e desempenho de uma etapa cromatográfica. Ela édefinida para a etapa de QFF como um parâmetro de processo com um limi-te de ação máximo estabelecido no relato PAR. Os valores de condutividadedos tampões de lavagem 2 e eluição são PPs com limites de ação porqueeles são significativos na determinação de rendimento da etapa e qualidadedo produto. Os limites de ação para esses parâmetros foram determinadosdurante estudos de escalonamento de QFF. Os limites de ação para tempode contenção de carga asseguram consistência de processo. O limite deação para o PP tempo de contenção de carga de < 5 dias é suportado porestudos de tempo de contenção em vaso de produto e um estudo de estabi-lidade bioquímica. O rendimento da etapa assegura consistência de proces-so para a etapa de QFF. Os parâmetros de qualidade, SA, HMW, CHOP eMCP-1 na reunião de produto devem ser rigorosamente controlados na eta-pa cromatográfica final. Os limites de ação para o rendimento da etapa enível de SA, CHOP e MCP-1 na reunião de produto QFF foram estabeleci-dos. As impurezas relacionadas ao processo proteína A, DNA e Triton X-100residuais foram previamente identificados como CQAs com valores exempli-ficativos para assegurar controle dessas impurezas relacionadas ao proces-so. Nesse exemplo, o limite de ação para HMW na reunião de produto foirevisto de < 2,5 para < 2,0%.

Os parâmetros de pH e condutividade do tampão no processo ajusante são identificados como PPs com limites de alerta. Tampões que nãovão de encontro aos valores exemplificativos de pH e condutividade no mo-mento de preparo são rejeitados e o lote de tampão descartado. Para a eta-pa de QFF, a condutividade e pH do tampão de equilíbrio, condutividade epH do tampão de lavagem 1, pH do tampão de lavagem 2 e pH do tampãode eluição são definidos como PPs com limites de alerta. Esses limites foramestabelecidos. A pressão de entrada da coluna assegura consistência duran-te a etapa de cromatografia de ligação-e-eluato. A etapa de QFF é realizadaem um limite máximo de pressão de 0,2413 MPa manométrico (35 psig) deacordo com a especificação do fabricante. Aos parâmetros de volume detampão de lavagem 1, volume de tampão de lavagem 2, titulação de reuniãode produto e volume de reunião de produto são atribuídos limites de alerta12 para assegurar consistência de processo.

Tabela 15. Parâmetros de processo para a etapa de cromatografia QSepharose Fast Flow

<table>table see original document page 481</column></row><table>

"Informação foi obtida da Tabela 6 do Relato Final PAR: Purificação12.

Etapas de concentração/diafiltração e enchimento

A reunião de produto da etapa de cromatografia de troca de â-nions QFF é concentrada e submetida à diafiltração com tampão de fosfato desódio a 25 mM, NaCI a 50 mM, pH de 7,5 usando um sistema de UF commembranas de NMWC de 30 kDa. O concentrado diafiltrado é filtrado atravésde um filtro de 0,2 μιτι em recipientes estéreis e armazenado a 2 a 8°C. Asubstância de fármaco pode ser congelada a -70°C e armazenada a -40°C, serequerido. O único PP definido para a etapa de concentração/diafiltração eenchimento é apresentado. Veja tabela diretamente abaixo que mostra osparâmetros de processo para as etapas de concentração/diafiltração e en-chimento de substância de fármaco.

Parâmetros Ponto de ajuste/ valor alvo Limite de ação Critérios de aceitaçãoConcentração finaln,D 50 g/L 48 - 52 g/L 45-55 g/L

Ao PP biocarga de reunião de produto da UF Il é atribuído alertade ínterim e limites de ação de < 10 cfu/mL e < 50 cfu/mL, respectivamente.Os seis PPs definidos pelos limites de ação para a etapa de concentra-ção/diafiltração e enchimento são volumes de diafiltração, condutividade epH do filtrado, rendimento de etapa, tempo de contenção de carga e rendi-mento de processo, conforme apresentado. O limite mínimo de volumes dediafiltração foi estabelecido para assegurar troca completa de tampão daproteína CTLA4-lg pelo tampão de substância de fármaco final antes da eta-pa de enchimento. A condutividade do filtrado e pH do filtrado ainda assegu-ram formulação de substância de fármaco consistente. O rendimento da eta-pa assegura consistência de processo para a etapa de concentra-ção/diafiltração e enchimento. Os limites de ação para volumes de diafiltra-ção, condutividade e pH do filtrado e rendimento da etapa foram estabeleci-dos. Limites de ação para tempo de contenção de carga asseguram consis-tência de processo. O tempo de contenção de carga na UF Il de < 5 dias ésuportado por estudos de tempo de contenção em vaso de produto e o estu-do de estabilidade bioquímica. O limite de ação de rendimento de processode 20 a 62% foi recomendado. Dois PPs são definidos por limites de alertapara assegurar consistência de processo para a etapa, conforme apresenta-do.Tabela 17. Parâmetros de Processo para as etapas de concentra-ção/diafiltração e enchimento de substância de fármaco

<table>table see original document page 483</column></row><table>

informação foi obtida da Tabela 7 no Relato Final PAR: Purificação12.

EXEMPLO 30: Etapa de enchimento final de substância de fármaco

Após término da etapa de concentração de diafiltração II de C-TLA4-lg, a substância de fármaco CTI_A4-lg é enchida do saco de biopro-cesso de 300 L em garrafas de PC Biotainer pré-esterilizadas de 2 L e 10 Ldentro de um ambiente Classe 100.

O exterior de cada garrafa é desinfetado com uma solução deisopropanol a 70%. A vedação em torno da tampa de cada garrafa é removi-da e a garrafa é tarada antes de enchimento. Um cálculo é registrado no re-gistro de lote para assegurar que o peso do enchimento esteja entre 500gramas e 1950 gramas para garrafas de 2 L e entre 7500 gramas a 10200gramas para garrafas de 10 L. A substância de fármaco é distribuída usandouma bomba peristáltica nas garrafas Biotainer através de um filtro de0,45/0,2 μm e funil de enchimento de uso único. As garrafas são tampadas eas tampas presas hermeticamente em um ajuste de torque especificado. Atampa de cada garrafa cheia é vedada com fita e a fita é marcada e datada.Cada garrafa é etiquetada com informação de identificação, bem como adata de enchimento, o número seqüencial da garrafa enchida dentro do lotee as iniciais do operador.

Durante o processo de enchimento, monitoramento de ar e mi-cróbios na superfície e contagens de partícula são realizados. Amostras desubstância de fármaco são obtidas durante a operação de enchimento. Umaamostra é obtida antes de enchimento da primeira garrafa para testagem deendotoxina. Amostras adicionais para testagem de endotoxina são obtidasno meio e no final do processo de enchimento. Durante o processo de en-chimento, uma amostra é obtida para testagem de liberação de substânciade fármaco.

EXEMPLO 31: ESTUDOS DE IMUNOGENICIDADE

CTLA4-lg é uma proteína de fusão solúvel que consiste do do-mínio extracelular do antígeno 4 linfócito T citotóxico humano-associado (C-TLA-4) ligado à porção Fc modificada (dobradiça, domínios CH2 e CH3) deimunoglobulina (Ig) G1 humana. Ele é o primeiro em uma nova classe deagentes aprovados para o tratamento de artrite reumatoide (RA) que modulaseletivamente o sinal coestimulatório CD80/CD86:CD28 empregado paraativação completa de células T. Em RA1 foi postulado que um antígeno des-conhecido é apresentado via o principal complexo de histocompatibilidade eativa células T autorreativas na presença de um sinal coestimulatório. Sub-sequentemente, células T ativadas recrutam e ativam células imunes a ju-sante, orquestrando e perpetuando os processos celulares que levam à in-flamação e destruição articular (Choy e Panayi (2001) N Engl J Med,344(12): 907-916).

Agentes biológicos recombinantes terapêuticos, tais como C-TLA4-lg, podem ser imunogênicos e, portanto, têm o potencial de estimularuma resposta de anticorpo. A imunogenicidade contra agentes biológicospode, teoricamente, ter um impacto sobre a segurança, eficácia e farmacoci-nética. A eliminação anticorpo-mediada de uma terapia biológica pode resul-tar em uma redução nos níveis de fármaco, resultando em eficácia diminuí-da. A resposta de anticorpo pode também impedir o fármaco de se ligar aseu alvo farmacológico, o que também diminui a eficácia. Isso pode levar auma necessidade de escalonamento de dose com o tempo - a assim deno-minada "ascensão de fármaco". A ascensão de fármaco foi reportada com ouso prolongado de anticorpo anti-TNF, infliximab, no tratamento de RA (An-derson (2005) Semin Arthritis Rheum, 34(5 Supl): 19-22) e essa foi recente-mente notada como sendo um resultado de anticorpos anti-infliximab quelevam a uma redução na eficácia clínica em alguns pacientes (Haraoui e co-laboradores, (2006) J Rheumatol, 33(1): 31-36).

Aqui, a formação de anticorpos anti-CTLA4-lg e anti-CTLA4 eseu efeito potencial sobre a eficácia e segurança de tratamento com CTLA4-Ig foram examinados. Uma vez que provavelmente a CTLA4-lg inibe umaresposta imune em si, baseado em sua atividade como um modulador decoestimulação seletivo e respostas observadas em modelos não clínicos. Oefeito de 1-2 doses faltantes ou descontinuação de terapia sobre o nível deimunogenicidade também foi examinado. Finalmente, amostras soropositivasforam testadas com relação à atividade de anticorpo de neutralização.

Materiais e Métodos

Estudos Avaliados

Para determinar se a CTLA4-lg induz a uma resposta imunogê-nica em pacientes com RA1 uma resposta de anticorpo foi avaliada atravésde múltiplos ensaios clínicos em Fase Il e Ill compreendendo seis períodosde estudo DB e quatro OL em 2.237 pacientes com RA, os quais incluíampacientes que tinham respostas inadequadas ao metotrexato (MTX) ou tera-pia anti-TNF. Um estudo (Fase III) também avaliou a reunião de produto pa-ra o tratamento de RA como monoterapia (Tabela 40). Amostras foram, emgeral, avaliadas pré-estudo, através do tratamento e 56 e/ou 85 dias após aúltima dose para permitir tempo para eliminação de CTLA4-lg<table>table see original document page 486</column></row><table>Continuacao

<table>table see original document page 487</column></row><table>A incidência e tipo de eventos adversos peri-infusionais pré-especificados (AEs)1 AEs globais e AEs graves (SAEs) e descontinuaçõesforam examinados em pacientes que desenvolveram uma resposta de anti-corpo positiva contra CTLA4-lg ou CTLA4. O efeito da imunogenicidade so-bre a eficácia foi também examinado avaliando as respostas do AmericanCollege of Rheumatology (ACR) 20 and Health Assessment Questionnaireem pacientes com uma resposta de anticorpo positiva.Ensaios de Imunogenicidade

Formatos básicos de ensaio: Em virtude da alta reatividade cru- zada preexistente dirigida contra a porção Fc de CTLA4-lg no soro humano,particularmente em populações com RA1 dois ensaios imunoabsorventesenzima-ligados (ELISAs) formato-dirigidos foram usados para avaliar aresposta de anticorpo. O ensaio anti-CTLA4-lg mediu a resposta deanticorpo a todas as porções da molécula, mas tinha menor sensibilidade. O ensaio anti-CTLA4 mediu a resposta de anticorpo na porção CTLA4 apenas,removendo a região Ig e, assim, conferia maior sensibilidade. Ambos osensaios foram usados em um formato de titulação do ponto final (EPT)(Ensaio A) ou um formato de seleção (Ensaio B).

Formato de Ensaio A: métodos de ensaio de imunogenicidadeclínicos, duplamente cego, em fase Il

O ensaio anti-CTLA4-lg e o ensaio anti-CTLA4 usados duranteos ensaios de RA na Fase Il foram coletivamente referidos como Ensaio A.No Ensaio A, CTLA4-lg ou CTLA4 foi adsorvida sobre lâminas demicrotitulação com 96 poços que foram, então, incubadas com soro de teste(diluições seriais de 3 vezes, começando a 1:10). Os anticorpos ligadosforam detectados usando um coquetel de anticorpo anti-humano conjugadoà fosfatase alcalina (Southern Biotech, Birmingham, EU) e visualizados u-sando um substrato de Fosfato de p-NitroFenila (PNPP). Uma vez que ne-nhum anticorpo anti-CTLA4-lg humano ou soro de controle positivo estavadisponível, esses ensaios foram validados usando antissoro CTLA4-lg-específico gerado em um macaco cynomolgus. Os resultados de cada en-saio foram expressos como valores de EPT. Um paciente era consideradocomo sendo soro-convertido quando sua EPT aumentava em duas ou maisdiluições seriais (> 9 vezes) com relação àquela da EPT pré-dose individual(Dia 1).

Formato de Ensaio B: métodos de ensaio de imunoqenicidadeclínicos, de rótulo-aberto, em fase Ille Fase Il

Para os ensaios em fase Ill e períodos OL em Fase Il de 2 anos,os ensaios anti-CTLA4-lg e anti-CTLA4 foram modificados para reduzir abase não-específica, aprimorar a sensibilidade e o método para determinar apositividade foi alterado e foram coletivamente referidos como Ensaio B.Esses ensaios também foram validados usando anticorpos CTLA4-lg-específicos purificados de antissoro de macaco cynomolgus. Para cadaELISA, lâminas de microtitulação com 96 poços revestidas com CTLA4-lg(0,25 μg/mL) ou CTLA-4 (0,5 μg/mL) foram incubadas com soro de teste di-luído a 1:400 durante 2 horas a 22 ± 5 0C (anti-CTLA4-lg) ou diluído a 1:25durante 2 horas a 32-40 0C (anti-CTLA4). Após a incubação primária, anti-corpos ligados foram detectados com um coquetel de anticorpo anti-humanoconjugado à peroxidase de armorácia (HRP), seguido por substrato de te-trametil benzidina.

Os resultados para o ensaio anti-CTLA4-lg foram expressos co-mo uma pós-/pré-proporção calculada dividindo-se os valores de OD da a-mostra pós-dose pelo valor de OD da amostra pré-dose correspondente ana-lisada na mesma lâmina. A positividade foi baseada em valores de corte es-tabelecidos usando amostras de pacientes com RA placebo-tratados. Se ovalor de proporção era menor do que o corte, a amostra era consideradanegativa e reportada como um valor de titulação < 400. Qualquer valor queexcedia a esse corte era considerado condicionalmente positivo.

Os resultados para o ensaio anti-CTLA4 são expressos comoum valor de "Proporção 1" calculado dividindo-se a OD média de amostra desoro do paciente pela OD média do controle negativo sobre a mesma lâmi-na. A positividade foi baseada em valores estabelecidos usando soro empo-çado de pacientes com RA placebo-tratados como o controle negativo. Se ovalor era menos do que o corte especificado, a amostra era considerada ne-gativa e reportada como um valor de titulação de < 25. Qualquer valor queexcedia a esse corte era considerado condicionalmente positivo.Análises confirmatórias

Amostras condicionalmente positivas identificadas em cada en-saio (anti-CTLA4-lg e anti-CTLA4) e em cada formato de ensaio (Ensaios Ae B) foram avaliadas em um ensaio de imunodepleção para determinar aespecificidade da resposta. Amostras anti-CTLA4-lg positivas foram pré-incubadas com aproximadamente 40 μg/mL de CTLA4-lg (a porção CTLA4da molécula), outra proteína de fusão de Ig não-relacionada (CD40lg) ouuma proteína não-relacionada (ovalbumina) para identificar a região da mo-lécula contra a qual a reatividade anti-CTLA4-lg poderia ser dirigida (CTLA4,Ig ou região de junção). Amostras anti-CTLA4 positivas foram similarmentepré-incubadas com CTLA4-lg, a porção CTLA4 ou ovalbumina para confir-mar a especificidade da reatividade anti-CTLA4. Após pré-incubação, todasas amostras foram reanalisadas no mesmo formato de ensaio original descri-to acima. As amostras onde pré-incubação resultou em redução > 30% naOD da amostra pré-incubada comparado com a amostra não tratada foramconsideradas confirmadas positivas. Se confirmado, as amostras foram titu-ladas para identificar a diluição de soro que resulta em um valor de propor-ção igual ao corte do ensaio em particular e esse valor foi reportado como aEPT.

Avaliações de atividade de anticorpo de neutralização

Um bioensaio foi conduzido para avaliar a capacidade de amos-tras de pacientes com anticorpos fármaco-específicos contra CTLA4 parainibir ou neutralizar a atividade de CTLA4-lg (inibir a ligação a CD80/86), im-pedindo o mesmo de se ligar a CD80/86 sobre a superfície de células T.

Transfectantes de células T de Jurkat estáveis expressando um gene de Iu-ciferase sob o controle do promotor de interleucina (IL)-2 foram coestimula-dos com células B Daudi na presença de anticorpo anti-CD3. Essa coestimu-lação, mediada através da interação entre CD28 sobre a célula T Jurkat eCD80/86 sobre a célula B Daudi em combinação com anticorpo anti-CD3,ativa o promotor IL-2, levando à transcrição aumentada do gene de Iucifera-se e, consequentemente, expressão aumentada de proteína luciferase. Osinal Iuminescente é medido usando um Sistema de Ensaio de Luciferase.Uma vez que a CTLA4-lg bloqueia a interação CD80/86:CD28, adição deCTLA4-lg à mistura de célula bloqueia essa ativação do promotor IL-2 e di-minui a luminescência, enquanto que pré-incubação com um anticorpo deneutralização restauraria as interações de coestimulação e resulta em umaumento na luminescência.

A atividade de anticorpo de neutralização de CTLA4-lg foi avali-ada determinando a resposta de CTLA4-lg em concentrações de 0,1, 0,25ou 0,5 μg/mL no bioensaio na presença de soro soropositivo pós-dose a1:25 e comparação estatística do mesmo com a resposta na presença desua amostra correspondente no Dia 1. Um anticorpo monoclonal de murinoanti-CTLA4 humano (11D4) com atividade de neutralização de CTLA4-lg nobioensaio foi usado como um controle positivo em cada operação analítica.Em virtude das limitações inerentes no método de teste de bioensaio, apósamostras pós-dose com níveis existentes de CTLA4-lg < 1 μg/mL puderamser avaliadas, uma vez que níveis maiores de fármaco interferiam com aresposta de neutralização e diluição adicional da amostra diminuiria a sensi-bilidade do ensaio.

Avaliação farmacocinética

Análise farmacocinética da população (POPPK) foi realizada so-bre dados de amostra de soro de pacientes dos períodos DB dos ensaios naFase Ill onde uma resposta imune positiva foi confirmada. O modelo POPPKvalidado foi aplicado aos dados de concentração de soro de paciente indivi-dual e estimativas Bayesianas a posteriori máximas de valores de parâmetrode PK individuais foram obtidas. A distribuição de eliminação, estimativas devolume, valores de área sob a curva em estado uniforme (AUC) e valores deconcentração mínima do fármaco no corpo após dosagem (Cmin) para es-ses pacientes foram comparados com a distribuição desses valores em umconjunto de dados maior de pacientes dos mesmos ensaios que não tinhamdesenvolvido uma resposta imune.Resultados

Incidência de respostas anti-CTLA4-lg e anti-CTLA4

Um total de 2.237 pacientes tinham amostras de soro pré- e pós-Iinha de base e foram elegíveis para avaliação. Desses, 62 (2,8%) pacientestinham evidência de uma resposta anti-CTLA4-lg ou anti-CTLA4, conformedeterminado usando o Ensaio A ou B (FIG. 39). Nenhum paciente demons-trou uma resposta aos domínios Fc e CTLA4 da CTLA4-lg. Três pacientestinham uma resposta a região de junção. Quando o Ensaio B mais sensívelfoi usado, uma resposta de anticorpo a CTLA4-lg foi detectada em 60 de1.900 pacientes (3,0%) (FIG. 39).

Dos pacientes avaliados nos estudos em Fase Ill (n = 1.764),203 descontinuaram a terapia com CTLA4-lg durante os períodos DB ou OLou não entraram no período de estudo OL subsequente e tiveram soro cole-tado 56 e/ou 85 dias após descontinuação de terapia. Dos 203 pacientes, 15(7,4%) tiveram uma resposta imunopositiva a CTLA4-lg (molécula inteira; η =5, 2,5%) ou CTLA-4 (n = 10, 4,9%; Tabela 42). Dos 1.561 pacientes com RArestantes que completaram o período DB em Fase Ille continuaram no tra-tamento OL, 40 (2,6%) tiveram uma resposta de anticorpo positiva duranteos períodos DB ou OL: 33 (2,1%) a CTLA4-lg e 7 (0,4%) a CTLA-4. De modointeressante, no estudo em Fase Ila de CTLA4-lg como monoterapia, ne-nhum paciente soroconverteu para CTLA4-lg ou a porção CTLA-4 da molé-cula; contudo, o formato de Ensaio A menos sensível foi empregado.

Um total de 191 pacientes teve um período de mais de 30 diassem CTLA4-lg entre sua participação nos períodos DB e OL. Desses, 3(1,6%) pacientes tiveram uma resposta de anticorpo positiva a CTLA4-lg e 1(0,5%) paciente teve uma resposta de anticorpo positiva a CTLA-4 durante operíodo OL (Tabela 41). Soros também foram analisados de 587 pacientescom RA que faltaram a 1-2 doses da medicação de estudo e re-iniciaram emqualquer ponto durante o estudo. Desses pacientes, 15 (2,6%) demonstra-ram uma resposta de anticorpo positiva a CTLA4-lg e sete (1,2%) tiveramuma resposta de anticorpo positiva a CTLA-4 (Tabela 41).Tabela 41. Número (%) de pacientes soropositivos com uso interrompi-do de CTLA4-lg

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CTLA4 = antígeno-4 linfócito T citotóxico-associado; DB = duplamente cego;OL = rótulo-aberto

Efeito de metotrexato concomitante sobre a imunogenicidade

Um total de 2451 pacientes recebeu MTX concomitante e 493pacientes não. Em geral, o percentual de pacientes com uma resposta deanticorpo positiva a CTLA4-lg era geralmente similar, quer eles tenham re-cebido MTX concomitante ou não (2,3% vs 1,4%) (Tabela 42).

Tabela 42. Número de pacientes (%) com respostas anti-CTLA4-lg ouanti-CTLA-4 com ou sem receber metotrexato concomitante

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CTLA-4 = antígeno-4 linfócito-T citotóxico-associado

Impacto da imunogenicidade sobre a segurança e eficácia de CTLA4-lg

As taxas de AEs, SAEs, AEs peri-infusionais para todos os paci-entes positivos foram avaliados e nenhuma relação entre a imunogenicidadee segurança foram observadas. Similarmente, nenhuma relação entre a i-munogenicidade e eficácia foi notada; contudo, a interpretação desses da-dos é restrita em virtude do número limitado de pacientes que soroconverte-ram.

Atividade de neutralização de anticorpos anti-CTLA4-lg

Vinte e quatro amostras de soro de 20 pacientes foram confir-madas positivas para reatividade anti-CTLA4-lg no ensaio de seleção deanticorpo anti-CTLA4. Dessas, 14 amostras (coletadas de 13 pacientes) iamde encontro a valores exemplificativos (< 1 μg/mL de CTLA4-lg) para avalia-ção no bioensaio de neutralização. Dessas 13 amostras, 1 foi positiva no Dia56 e 10 foram positivas no Dia 85 pós-dose. Nove das 14 amostras (toma-das de 8 pacientes) exibiram atividade de anticorpo de neutralização. Com aexceção de septicemia em um paciente, não houve AEs medicamente signi-ficativas reportadas nesses pacientes em ou próximo do momento de soro-conversão que eram consideradas relacionadas ou possivelmente relaciona-das à terapia nesses oito pacientes. Dados de eficácia não foram coletadosdurante o período após descontinuação do estudo (56 e 85 dias após des-continuação), um período quando o número predominante de amostras eraadequado para avaliação de anticorpos de neutralização. Como tal, não foipossível avaliar os efeitos de anticorpos de neutralização sobre a eficácia.

Avaliação farmacocinética

Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados para 31 dos32 pacientes que tiveram uma resposta de anticorpo positiva durante o perí-odo DB dos ensaios em Fase ll/lll. Amostras de soro para análise de PK nãoforam necessariamente coletadas no dia em que uma resposta imune positi-va foi documentada. Modelamento de PK da população de dados de pacien-tes dos períodos de estudo DB sugeriu que os parâmetros de PK previstosnos 31 pacientes imunopositivos eram comparáveis àqueles em umapopulação maior de pacientes (n = 386) sem uma resposta imune positiva.

As concentrações séricas no dia de estudo durante o período DB quandosoroconversão foi documentada oscilavam de 1,16-24,21 μ9/ιτιΙ_, com a mai-oria das concentrações no soro entre 5-20 μg/mL Soroconversão não pare-ce afetar os níveis séricos. A distribuição de eliminação e volume de compar-timento central pelo estado de imunogenicidade são mostrados na figura 40.

Ensaio de eletroquimioluminescência MSD

Em um esforço para melhorar a sensibilidade do ensaio de imu-nogenicidade de ligação e a capacidade de detectar anticorpos na presençade fármaco (tolerância a fármaco), uma nova geração de ensaios de imuno-genicidade está sendo desenvolvida para monitorar anticorpos antifármaco aCTLA4-lg empregando a tecnologia Meso-Scale Discovery (MSD). Essa no-va tecnologia usa um rótulo que emite luz quando de estimulação eletroquí-mica iniciada na superfície do eletrodo de uma microlâmina. Foi mostradoque o formato MSD tem sensibilidade aprimorada e uma melhor capacidadede detectar anticorpos na presença de fármaco comparado com o formatoELISA. Essa tecnologia de fase em solução permite que o fármaco rotuladovenha a competir mais eficientemente com o fármaco no soro e tenha umamaior faixa dinâmica, proporção de sinal para ruído e capacidade de superfí-cie aumentada com relação ao formato ELISA. Diferente dos ELISAs atuais,os quais usam a porção CTLA4 da molécula ou a molécula inteira como o reagente de captura, o novo ensaio é um ensaio de ponte que emprega umamolécula de CTLA4-lg biotinilada e rutênio-rotulada que é incubada comamostras do paciente antes de ser adicionada a uma lâmina de MSD reves-tida com avidina. O sinal de eletroquimioluminescência emitido pelo rótulo derutênio é medido usando um instrumento MSD. Amostras positivas, baseadono ponto de corte de ensaio validado, serão ainda avaliadas através de imu-nodepleção com CTLA4-lg, CTLA4-T ou CD40lg no ensaio MSD para con-firmar a positividade e demonstrar para qual porção da molécula de CTLA4-Ig a imunogenicidade é dirigida e a titulação ponto final é definida.EXEMPLO 32: Parâmetros farmacocinéticos em macacos

A seis macacos cynomolgus fêmeas por grupo foi administradauma única dose intravenosa de 10 mg/kg de CTLA4-lg produzida a partir doprocesso CD-CH01. Um grupo de controle de seis macacos fêmeas recebeusolução salina (1 ml/kg). Para avaliar a bioatividade de CTLA4-lg, todos osmacacos foram imunizados intramuscularmente com 10 mg/animal do antí-geno células T-dependente hemocianina de caramujo megathura crenulata(KLH) dentro de 30 min antes de dosagem.

Os animais foram observados durante 6 semanas após trata-mento. Amostras de sangue foram obtidas pré-dose: a 3 e 30 min; a 1, 2, 4,8, 24 e 48 horas; e nos dias 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36 e 43 pós-dose para de-terminar e comparar os perfis farmacocinéticos. No relato farmacocinético,esses dias de estudo correspondem aos dias 0, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35e 42, respectivamente. Amostras de soro foram analisadas com relação aCTLA4-lg através de um método ELISA. Uma amostra de sangue compará-vel foi coletada de animais de controle nos mesmos dias e, quando apropri-ado, usada para avaliar a resposta de anticorpo anti-KLH. Avaliação da for-mação de anticorpos CTLA4-lg-específicos foi realizada sobre soro obtido deanimais tratados com CTLA4-lg pré-estudo e semanalmente depois. A for-mação de anticorpo KLH-específico foi determinada sobre amostras de soroobtidas de todos os animais antes de imunização e aproximadamente todasemana após isso durante pós-imunização de 4 semanas. Valores exemplifi-cativos adicionais para avaliação incluíam sobrevivência, sinais clínicos, e-xames físicos (incluindo avaliações neurológicas, taxa respiratória e auscul-tação), pesos corporais, temperaturas corporais e consumo de alimento.

Avaliações clínicas-patológicas foram conduzidas pré-estudo eno dia 45. Todos os animais foram retornados para o grupo após término doestudo.

Tabela 43. Parâmetros farmacocinéticos de CTLA4-lg produzida a partirde um processo da invenção

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Respostas de anticorpo fármaco-específicas ocorrem em ou a-pós o dia 29 em três de seis macacos tratados com o material de processoCD-CH01 (Tabela 43; figura 41). Aumentos mínimos (20%) no nitrogênio deuréia no sangue (BUN) e diminuições (14%) no potássio no soro em maca-cos tratados com o material de processo CD-CH01 não foram fisiológica outoxicologicamente significativos porque os valores estavam apenas margi-nalmente fora das faixas de controle históricas e, para BUN, um aumentoconcomitante na creatinina no soro não estava presente. Nenhuma outraalteração nos parâmetros de patologia clínica foi notada. Supressão acentu-ada da resposta de anticorpo a KLH (>94% da resposta de controle de pico)foi observada em macacos aos quais foi administrado material de processoCD-CH01. A imunogenicidade foi acentuadamente retardada até que os ní-veis de CTLA4-lg no soro caíssem abaixo dos níveis imunossupressivos deaproximadamente 1 μ9/ιηΙ_ em ou após o dia 29.

Patologia clínica. Amostras de sangue foram coletadas da veiafemoral de animais em jejum antes de dosagem (dia 13) e após a última co-leta de sangue para avaliação farmacocinética (dia 45). Urinálises foram rea-Iizadas com a urina coletada durante um período 18 horas pré-estudo (dia -13) e após a última coleta para avaliação farmacocinética (dia 45). Os se-guintes parâmetros analíticos foram determinados: hematologia: hemoglobi-na, hematócrito, contagem de eritrócitos, volume corpuscular médio, hemo-globina corpuscular média, concentração média de hemoglobina corpuscu-lar, contagem de reticulócitos, contagens totais e diferenciais de leucócitos,contagem de plaquetas e avaliação de morfologia celular em esfregaços desangue periférico foram determinados. Coagulação: tempo de pró-trobina,tempo de tromboplastina parcial ativado e fibrinogênio no plasma foram de-terminados. Química do soro: nitrogênio de uréia, creatinina, glicose, coles-terol total, proteína total, albumina, globulinas, proporção de albumi-na/globulina, aminotransferase de alanina, aminotransferase de aspartato,fosfatase alcalina, bilirubina total, triglicerídeos, gama glutamiltransferase,sódio, potássio, cálcio, cloreto e fósforo foram determinados. Urinálise: pro-dução, gravidade específica, pH, cor e aparência e determinações qualitati-vas de glicose, proteína, cetonas, bilirubina, sangue oculto e urobilinogênioforam determinados. Sedimentos urinários foram examinados microscopi-camente.

Resposta de anticorpo específica. Respostas de anticorpo fár-maco-específicas de magnitude comparável ocorreram em três de seis ma-cacos tratados com o material de processo CD-CH01 em ou após o dia 29.Conforme esperado, a imunogenicidade com o processo foi acentuadamenteretardada até que os níveis de CTLA4-lg no soro caíssem abaixo dos níveisimunossupressivos de aproximadamente 1 μg/mL em ou após o dia 29. Asrespostas médias de anticorpo CTLA4-lg-específicas para macacos aosquais foi fornecido material de processo CD-CH01 se tornaram positivas nodia 36 e atingiram um pico no dia 43 (o último ponto de tempo avaliado). Ti-tulações de pico de anticorpo em macacos individuais aos quais foram for-necidos materiais de processo CD-CH01 oscilavam de 23 a 10.448.

EXEMPLO 33: Desagregação sobre a coluna

O processo de desagregação através de uma resina de croma-tografia por afinidade é útil e tem aplicabilidade à todas as moléculas recom-binantes baseadas em IgG-Fc produzidas em células de mamífero. Caotro-pos podem ser usados para romper proteína ou material de elevado pesomolecular. Essa desagregação pode ser feita sobre a coluna para qualqueruma de tais proteínas. Esse exemplo fornece um método para realização doprocesso de desagregação sobre um material exemplificativo, isto é, CTLA4-Ig.

Material de CTLA4-lg de elevado peso molecular (HMW) produ-zido no biorreator de produção pode ser parcialmente convertido no dímerode CTLA4-lg funcional através do uso de agentes caotropicos em solução(modo de batelada) ou em subconjunto com a etapa de cromatografia porafinidade (modo sobre a coluna). Esse processo é referido como "desagre-gação". Baseado em estudos de caracterização analítica de material CTLA4-Ig desagregado, o material desagregado parece ser bioquimicamente com-parável ao material de controle não submetido ao processo de desagregação.

Em um processo de fermentação que produz moléculas de C-TLA4-lg da presente invenção, aproximadamente 20 a 25% da proteína C-TLA4-lg resultante podem estar na forma de material de HMW (isto é, agre-gado). Recuperação de uma porção desse material como um dímero funcio-nal, portanto, tem o potencial de uma intensificação global do rendimento deprocesso de > 10%.

Processo de desagregação no modo de batelada

A desagregação foi demonstrada no modo de batelada (em so-lução) através de tratamento com concentrações moderadas de agentes ca-otropicos, tais como cloridrato de guanidina ou uréia, seguido por rápida dilu-ição em um tampão de reduplicação com baixo teor de sal para ajudar a mo-lécula a obter sua conformação nativa.

CTLA4-lg purificada usando proteína A (resina usada MAbSe-lect) foi ajustada para uma concentração final de -4-5 mg/ml a ser usadacomo um material de iniciação para esses experimentos em batelada. Essafoi, então, contatada em uma proporção em volume de 1:1 com 2x tampõescaotrópicos concentrados para obter uma concentração final de caotropo de1-3 M (para cloridrato de guanidina) e 2-7 M (para uréia). Concentrações decloridrato de guanidina > 2 M e concentrações de uréia > 4 M foram eficazespara causar desagregação de material CTLA4-lg de HMW. A fase móvel u-sada para esses experimentos foi um sistema tamponado com fosfato emuma faixa de pH de 6,5-7,0. A reação de desagregação foi dissipada atravésde diluição rápida (em uma proporção volumétrica de 1:5) em um tampão dereduplicação consistindo de Tris a 50 mM, NaCI a 25 mM, pH de 8,5. Emexperimentos de desagregação em batelada, 50 a 60% do material de HMWsão convertidos em dímero de CTLA4-lg com um rendimento de etapa de >95%. A diminuição no nível de material de HMW observada após a etapa dedesagregação é mostrada na figura 42.

Processo de desagregação sobre a colunaPara superar limitações potenciais referentes à mistura e tanquedurante escalonamento do processo de desagregação em batelada, um pro-cesso combinando a etapa de captura por proteína Aea etapa de desagre-gação foi avaliado. Esse processo envolvia o uso da solução caotrópica co-mo o tampão de eluição para a etapa de proteína A, seguido por coleta dareunião de eluição no tampão de reduplicação/eluição.

Desempenho similar quanto à eficiência de desagregação foiobservada usando os processos em batelada e sobre a coluna. O procesode desagregação sobre a coluna teve uma vantagem distinta de diminuiçãodo número de etapas de processamento. Detalhes experimentais para a e-tapa de proteína A usando a etapa de desagregação sobre a coluna são re-sumidos na tabela a seguir. Resina usada: MAbSeIect (da GE Healthcare);altura de leito da coluna: 20-25 cm.<table>table see original document page 500</column></row><table>

Viabilidade de incorporação no processo a jusante

Uma operação de purificação em 3 colunas foi realizada paragerar material de processo final com e sem o uso de uma etapa de desagre-gação de proteína A sobre a coluna. Os rendimentos da etapa cromatográfi-ca obtidos das duas operações de purificação são fornecidos na Tabela 44.

Tabela 44. Rendimentos cromatográficos para o processo em 3 colunascom e sem desagregação

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A incorporação da etapa de desagregação em um processo em3 colunas resultou em um aprimoramento de aproximadamente 10% no ren-dimento de processo. As reuniãos de produto das duas seqüências de pro-cesso foram analisadas para avaliar a comparabilidade bioquímica do mate-rial de CTLA4-lg resultante.

As análises de N-glicana através de MALDI-TOF das duas reu-niãos de produto são mostradas na figura 43. Baseado nessas análises, omaterial parece comparável. Esse resultado por MALDI-TOF foi confirmadousando um método de ensaio de N-glicana baseado em HPLC. As análisesde HPLC demonstraram uma diferença de < 1,7% no pico de ácido siálicobiantenário entre o material de processo de controle e final desagregado.

Mapeamento de peptídeo tríptico também foi realizado sobre asduas reuniões ("pools") de produto para quantificar o percentual de peptí-deos deamidados e oxidados presentes no material purificado. Os resultados(resumidos na Tabela 45) demonstraram níveis de deamidação e oxidaçãocomparáveis para as duas amostras.

Tabela 45. Resultados do mapeamento peptídico

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Adicionalmente, os resultados do ensaio de ligação-B7 foram de101% e 98% para o material de controle e desagregado sobre a coluna, res-pectivamente.

Um método para desagregação de moléculas recombinantesbaseadas em IgG-Fc, tais como aquelas produzidas por células de mamífe-ro, compreendendo a etapa de contato de uma composição compreendendotais moléculas em uma forma agregada com um agente caotrópico (tal comocloridrato de guanidina ou uréia) em uma quantidade e durante um temposuficientes para desagregar pelo menos uma porção de tais moléculas agre-gadas, opcionalmente seguido por contato da referida porção desagregadade moléculas com um agente de reduplicação e/ou dissipação (tal como a-través de diluição rápida em um tampão de reduplicação com baixo teor desal para ajudar tais moléculas a obter a conformação nativa). Contato com oagente caotrópico pode, por exemplo, ser realizada no modo de batelada,semibatelada ou contínuo bem como, por exemplo, em solução (tal como nomodo em batelada) ou em conjunto com uma etapa cromatográfica, tal comodurante uma etapa de cromatografia por afinidade (modo sobre a coluna).

Um processo combinando uma purificação sobre a coluna, talcomo uma etapa de captura com proteína A, com o método de desagrega-ção antes mencionado, pode intensificar a eficiência global de processo e éoutra modalidade da invenção. Portanto, a presente invenção considera um método para desagregação de moléculas recombinantes baseadas em IgG-Fc, tais como aquelas produzidas por células de mamífero, compreendendoa etapa de contato de uma composição compreendendo tais moléculas naforma agregada com um agente caotrópico (tal como cloridrato de guanidinaou uréia) em uma quantidade e durante um tempo suficiente para desagre-gar pelo menos uma porção das referidas moléculas agregadas, em que oreferido contato ocorre sobre uma coluna de cromatografia, tal como onde oreferido agente caotrópico é empregado em solução para eluição da referidacoluna (tal como o tampão de eluição para uma coluna de proteína A), op-cionalmente seguido por contato da referida porca desagregada de molécu-las com um agente de reduplicação e/ou dissipação (tal como através dediluição rápida em um tampão de reduplicação com baixo teor de sal paraajudar a molécula a obter a conformação nativa).

A composição a ser contatada com tal agente caotrópico podecompreender moléculas recombinantes baseadas em IgG-Fc em outras for-mas que não uma forma agregada (tal como formas com uma única cadeiaou dímeros), além de compreender as referidas moléculas na forma agrega-da.

Moléculas baseadas em IgG-Fc exemplificativas podem incluirglicoproteínas, tais como as moléculas de CTLA4-lg da presente invenção.

EXEMPLO 34: Farmacocinética

Um estudo placebo-controlado, em fase 2B, multi-centro, aleató-rio, duplamente cego para avaliar a segurança e eficácia clínica de duas do-ses diferentes de CTLA4-lg administradas intravenosamente a indivíduoscom artrite reumatoide ativa enquanto recebe metotrexato: Nesse estudo, osindivíduos receberam CTLA4-lg em 2 doses diferentes (2 e 10 mg/kg) ouplacebo em combinação com MTX. CTLA4-lg foi produzida de acordo comum processo da invenção e fornecida em frascos individuais contendo 200 mgde CTLA4-lg. CTLA4-lg foi administrada IV a indivíduos nos dias 1, 15 e 30 ea cada 30 dias depois durante um ano. PK de múltiplas doses foi derivadade dados de concentração no soro vs. tempo obtidos durante o intervalo dedosagem entre os dias 60 e 90 de indivíduos que foram arrolados em umsubestudo de PK local-específico. Para os indivíduos no subestudo de PK1amostras de sangue foram coletadas antes de dosagem no dia 60 e para umperfil de PK começando no dia 60 a 30 minutos (correspondendo ao final dainfusão de CTLA4-lg), a 4 horas após o início de infusão e semanalmentedepois, até o dia 90. Um total de 90 indivíduos foram arrolados para partici-par no subestudo de PK. Contudo, perfis PK completos entre o intervalo dedosagem do dia 60 a 90 foram obtidos de 29 indivíduos (15 indivíduos dosa-dos a 2 mg/kg; 14 indivíduos dosados a 10 mg/kg).

Um sumário dos parâmetros de PK é apresentado na Tabela 46.

Os resultados do estudo mostraram que a Cmax e AUC(TAU)1 onde TAU =30 dias, aumentaram de uma maneira dose-proporcional. Para doses nomi-nais aumentando na proporção de 1:5, as médias geométricas da Cmax au-mentaram na proporção de 1:5,2, enquanto que a média geométrica para aAUC(TAU) aumentou na proporção de 1:5,0. Além disso, os valores de T-METADE, CLT e Vss pareciam ser independentes da dose. Nesses indiví-duos com RA, os valores médios de T-METADE, CLT e Vss estavam emtorno de 13 dias, ~ 0,2 mL/h/kg e - 0,07 L/kg, respectivamente. O pequenoVss indica que CTLA4-lg está confinada primariamente ao volume de fluidoextracelular. Baseado no esquema de dosagem em 2 e 4 semanas após aprimeira infusão, então, uma vez por mês após isso, condições em estadouniforme para CTLA4-lg foram atingidas em torno da terceira dose mensal.

Também, como um resultado do esquema de dosagem, as concentraçõesno soro estavam acima das concentrações séricas em estado uniforme du-rante os primeiros 2 meses após dosagem mensal. Comparação dos valoresséricos (Cmin) nos Dias 60, 90 e 180 indicaram que a CTLA4-lg não parecese acumular após dosagem mensal. Os valores em estado uniforme de Cminpara todos os indivíduos que receberam doses IV mensais de 2 e 10 mg/kgde CTLM-Ig oscilavam entre 4,4 a 6,7 μg/mL e 22,0 a 28,7 μg/mL, respecti-vamente.<table>table see original document page 505</column></row><table>Em pacientes com Ra, após múltiplas infusões intravenosas, afarmacocinética de CTLA4-lg mostrou aumentos proporcionais de Cmax eAUC com relação à faixa de dose de 2 mg/kg a 10 mg/kg. A 10 mg/kg, aconcentração no soro parecia atingir um estado uniforme em torno do dia 60,com uma concentração sérica média (faixa) de 24 (1-66) mcg/mL. Nenhumacúmulo sistêmico de CTLA4-lg ocorreu quando de tratamento repetido com10 mg/kg em intervalos mensais em pacientes com RA.

Análises farmacocinéticas da população em pacientes com RArevelaram que havia uma tendência à maior eliminação de CTLA4-lg comaumento do peso corporal. A idade e o sexo (quando corrigidos para o pesocorporal) não afetam a eliminação. Metotrexto (MTX), fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (NSAIDs), corticosteroides e agentes de blo-queio de TNF concomitantes não influenciam a eliminação de CTLA4-lg.EXEMPLO 35: Determinação de proporção molar de manose. fucose egalactose através de CE

Um método de eletroforese capilar foi desenvolvido para a análi-se quantitativa do teor de monossacarídeo neutro em LEA2 CTI_A4A29YL104E-Ig. Monossacarídeos neutros, incluindo manose, fucose e galactose, sãoliberados de amostras de CTI_A4A29YL104E-lg através de hidrólise ácida emuma condição de temperatura elevada (ácido trifluoroacético a 2M, 6 horas a95°C). Os monossacarídeos neutros liberados são, então, fluorescentementerotulados com ácido aminopireno trissulfônico (APTS), na presença de ácidoacético como um catalisador e NaBHaCN como um reagente de redução(APTS a 67mM, HAc a 330mM, NaBH3CN a 83mM, 3 horas a 55°C). Xiloseé adicionada a cada amostra e serve como um padrão interno. A proporçãode a área de pico de cada monossacarídeo neutro contra aquela do padrãointerno é utilizada para quantificação.

Reagentes: Solução de hidrólise (ácido trifluoroacético a 2M(TFA)); Solução de Derivatização I (ácido 8-amino-1,3,6-trissulfônico a 0,1M,sal de trissódio (APTS) solução aquosa); Solução de Derivatização Il (Na-BH3CN a 0,25M em ácido acético a 1M); Tampão de Operação (tetraboratode sódio a 60 ± 5 mM, pH9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a1Ν; HCI a 1Ν; metanol a 80%); Soluções de estoque de Padrão de Monos-sacarídeo de manose (Man), fucose (Fuc), galactose (GaI) e xilose (XyI) emuma concentração de 10 mg/ml; Solução de trabalho de monossacarídeo I:Solução de trabalho de padrão interno é 100 vezes diluição de solução deestoque de Xyl; Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de tra-balho padrão de mistura neutras, 100 vezes diluição de soluções de estoquede Man, Fuc e Gal.

Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CESystem; Detector: Sistema de detecção induzida a laser Beckman (LIF) aco-piado com P/ACE MDQ); Capilar não revestido (d.i. de 25 μm, d.e. de 360μm) comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ.

Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampãode Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura decartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição dodetector: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção deamostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5PSI; Tempo de operação:10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.

Hidrólise: 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 200 μL deTFA a 2M foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μl de Solu-ção de trabalho de xilose e 10 μl de Solução-padrão de mistura neutra fo-ram misturados com 200 μL de TFA a 2M para fazer o Padrão de monossa-carídeo. 10 μl de Solução de trabalho de xilose e 10 μL de amostra (por e-xemplo, CTLA^9yl104e-Iqi aproximadamente 1 mg/ml) foram misturadoscom 200 μL de TFA a 2M para fazer a amostra de teste. Todos os tubos fo-ram submetidos a turbilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante10 seg, seguido por incubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hi-drólise, as amostras foram colocadas a -20°C durante 10 min para esfriar. Asamostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem emum SpeedVac.

Derivatização: Amostras foram reconstituídas com 10 μL deSolução de Derivatização I. A amostra foi rapidamente misturada e 5 μL deSolução de Derivatização Il foram adicionados. As amostras foram carrega-das em uma centrífuga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°Cenquanto centrifugava a 2000 rpm.

Injeção de CE: O volume final das amostras após derivatizaçãofoi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho deCE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempode operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampãode Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrõesde monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho deCE (tempo de operação de 15 min). Após a operação de injeção de cadapadrão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibradocom água com grau para HPLC e tampão de Operação (Tabela 51). O ele-troferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 45,em que o pico 1 é manose; o pico 2 é xilose; o pico 3 é fucose; e o pico 4 égalactose.

Tabela 51. Método do instrumento

<table>table see original document page 508</column></row><table> ADEQUABILIDADE DE SISTEMA:

O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser si-milar àquele mostrado na figura 45, onde o pico 1 é manose; o pico 2 é xilo-se; o pico 3 é fucose; e o pico 4 é galactose.

Quando outros instrumentos de CE que não o sistema BeckmanMDQ são usados, o comprimento do capilar pode ser diferente daquele es-pecificado nesse método. Isso causará variações no tempo de migração deanalito, bem como na intensidade de pico. Mas o padrão de pico de analitosde monossacarídeo deverá permanecer o mesmo.

A resolução entre dois picos vizinhos para os primeiros Padrõesde Adequabilidade de sistema pode ser calculada de acordo com a seguinteequação:

<formula>formula see original document page 509</formula>

onde:

R: resolução

t2, t1: tempos de migração dos dois picos vizinhos respectiva-mente

W1, W2: larguras de pico na linha de base dos dois picos vizinhosrespectivamente

O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar usandoas seqüências de lavagem/enxágue. Se o problema persiste, substituir otampão antigo por tampão de operação recentemente preparado ou substitu-ir o capilar.

Para a última injeção de Adequabilidade de sistema, o últimopico (galactose) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguintefórmula:

<formula>formula see original document page 509</formula>

onde:

T: fator de configuração

W0,05: largura de pico a 5% de altura

f: largura da fronte de pico em pico máximo

Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as seqüências de lava-gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por Tam-pão de Operação recentemente preparado ou substituir o capilar. Proporçãode área de pico de galactose e xilose deve ter um RSD de <10%. O tempode migração de galactose precisa ser >15,0 minutos. O perfil de eletrofero-grama deverá ser equivalente à figura 45.

O RSD percentual para o padrão monossacarídico pode ser de-terminado através de comparação da proporção de áreas de pico do padrãointerno e componentes de padrão de monossacarídeo dividindo a área depico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrãointerno para cada injeção de padrão de monossacarídeo. O RSD percentualpode ser calculado para manose, fucose e galactose. O RSD deverá ser<10%.

Determinação das proporções molares de Monossacarídeos neutrospara Proteína

A proporção de áreas de pico de monossacarídeos neutros (porexemplo, Man, Gal e Fuc) com relação ao padrão interno Xilose pode sercalculada de acordo com as fórmulas proporcionadas abaixo de forma a de-terminar as proporções molares de cada monossacarídeo neutro para prote-ína. Por exemplo, a proporção de área de pico é igual à área de pico de mo-nossacarídeo (Gal, Fuc ou Man) dividido pela Área de pico de xilose, em queo desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de área de pico é igual a oumenor do que 10%. As seguintes equações podem ser usadas para calcularo seguinte:

Para proporção molar de Manose/Proteína:

<formula>formula see original document page 510</formula>

onde:

Rman: proporção molar de manose vs. proteína

Aman: área de pico (μV.seg) de manose na amostraAxyi: área de pico (μV.seg) de xilose na amostraAxyio: área de pico (μV.seg) média de xilose no padrão de mo-nossacarídeo

Ameno" área de pico (μV.seg) média de manose no padrão demonossacarídeo

Vman0:volume de manose contida na solução de trabalho de mo-nossacarídeo usada para hidrólise (em μL)

Cmano:concentração de manose contida na solução de trabalhode monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)

Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)

Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWLEa29y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTLA4A29YL104E-lg)(91,232 Da)

MW de manose: 180,2 dáltons.

Para proporção molar de Fucose/Proteína:

<formula>formula see original document page 511</formula>

onde:

RfC: proporção molar de fucose vs. proteína

Afuc: área de pico (μΝ/.seg) de fucose na amostra

Axyl: área de pico ^V.seg) de xilose na amostra

Axy10: área de pico (μΝ/.seg) média de xilose no padrão de mo-nossacarídeo

Afuc0: área de pico média (μΝ/.seg) de fucose no padrão de mo-nossacarídeo

Vfuco: volume de fucose contida na solução de trabalho de mo-nossacarídeo usada para hidrólise (em μL)

Cfuco: concentração de fucose contida na solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)

Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μί)

Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTI_A4A29YL104E-lg)(91,232 Da)

MW de fucose: 164,2 dáltons.

Para proporção molar de Galactose/Proteína:

<formula>formula see original document page 511</formula>onde:

Rgal: proporção molar de galactose vs. proteína

Agal: área de pico (μΝ/.seg) de galactose na amostra

Axyl-- área de pico (uV.seg) de xilose na amostra

Axyl0:área de pico (μΝ/.seg) média de xilose no padrão de monos-sacarídeo

Agaio: área de pico (μΝ/.seg) média de galactose no padrão demonossacarídeo

Vgaio:volume de galactose contido na solução de trabalho de mo-nossacarídeo usada para hidrólise (em μL)

Cgaio:concentração de galactose contido na solução de trabalhode monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)

Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)

Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTI_A4A29YL104E-lg)(91,232 Da)

MW galactose: 180,2 dáltons.

Tabela 52: Proporção molar média de Monossacarídeo para pro-teína de CTLA^9yl104e-I9

MONOSSACARÍDEO FAIXA

Manose 11-23

Fucose 4,2-7,5

Galactose 9,2-18

EXEMPLO 36: Determinação da proporção molar de GaINAc e GIcNAcatravés de CE

Um método de eletroforese em capilar foi desenvolvido para aanálise quantitativa do teor de amino monossacarídeo em CTLA4A29YL104E-lg,uma glicoproteína com 6 sítios de glicosilação N-Iigada e pelo menos 1 sítiode glicosilação O-ligada. Amino monossacarídeos, incluindo N-acetil galac-tosamina (GaINAc) e N-acetil glicosamina (GIcNAc), são liberados da amos-tra de CTLA^9yli04e-Iq através de hidrólise ácida em uma condição detemperatura elevada (HCI a 4N, 6 horas a 95°C). Os amino monossacarí-deos liberados vão para a etapa de reacetilação através de incubação comanidrido acético sobre gelo durante meia hora. Eles são, então, fluorescen-temente rotulados com ácido aminopireno trissulfônico (APTS), na presençade ácido acético como um catalisador e NaBH3CN como um reagente deredução (APTS a 67 mM, HAc a 330 mM, NaBH3CN a 83 mM, 3 horas a55°C). N-acetil manosamina é adicionada a cada amostra e serve como umpadrão interno. A proporção da área de pico de cada amino monossacarídeocontra aquela do padrão interno é utilizada para quantificação.

Reagentes: Solução de hidrólise (HCI a 4N); Solução de Deriva-tização I (ácido 8-amino-1,3,6-trissulfônico a 0,1 M, sal de trissódio (APTS)solução aquosa); Solução de Derivatização Il (NaBH3CN a 0,25M em ácidoacético a 1M); Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM,pH9,5); Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a 1N; HCI a 1N; metanol a80%); Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo de GaINAc1 Glc-NAc e ManNAc em uma concentração de 10 mg/ml; Solução de trabalho demonossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno é 100 vezes dilui-ção de solução de estoque de ManNAc; Solução de trabalho de monossaca-rídeo II: Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino, 100 vezes diluiçãode soluções de estoque de GaINAc e GIcNAc.

Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CESystem; Detector: Sistema de detecção induzida a laser Beckman (LIF) aco-plado com P/ACE MDQ).

Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampãode Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura decartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição dodetector: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção deamostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0.5PSI; Tempo de operação:10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.

Hidrólise: 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 200 μΙ_ deHCI a 4N foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μΙ_ de solu-ção de trabalho de ManNAc e 10 µl de Solução Padrão de Mistura Aminoforam misturados com 200 µl de HCI a 4N para fazer o Padrão de monos-sacarídeo. 10 µl. de solução de trabalho de ManNAc e 10 µl de amostra(por exemplo, amostra de CTUMa29yl104e-Iq, etc.; aproximadamente 1 mg/ml)foram misturados com 200 µl de HCI a 4N para fazer a amostra de teste.Todos os tubos foram submetidos a turbilhonamento durante 10 seg e centri-fugados durante 10 seg, seguido por incubação a 95°C durante 6 horas. A-pós a etapa de hidrólise, as amostras foram colocadas a -20°C durante 10min para esfriar. As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evapo-radas até secagem em um SpeedVac.

Reacetilação: Amostras hidrolisadas e secas foram reconstituí-das com 20 µl de tampão de reacetilação e 4 µl de anidrido acético, segui-do por mistura e com incubação sobre gelo (30 min). As amostras foramcentrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.As amostras foram, cada uma, reconstituídas com 100 µl de água com graupara HPLC e foram evaporadas até secagem com um SpeedVac.

Derivatização: Amostras reconstituídas (10 µl de Solução deDerivatização I HPLC) foram fornecidos 5 µl de Solução de Derivatização II.Após mistura, as amostras foram carregadas em uma centrífuga pré-aquecidae incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto centrifugava a 2000 rpm.

Injeção de CE: O volume final das amostras após derivatizaçãofoi levado para 100 µl através da adição de água com grau para HPLC e 10 µlde amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190 µl_água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho de CEfoi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempo deoperação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampão deOperação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrões demonossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho de CE(tempo de operação de 10 min). Após a operação de injeção de cada padrãoou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibrado com á-gua com grau para HPLC e tampão de Operação. O eletroferograma da A-dequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 46, em que o pico 1 éGaINAc; o pico 2 é ManNAc; e o pico 3 é GIcNAc.

Tabela 53. Metodo no instrumento

<table>table see original document page 515</column></row><table>

ADEQUABILIDADE DE SISTEMA:

O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser si-milar àquele mostrado na figura 46, onde o pico 1 é GaINAc; o pico 2 é Man-NAc; e o pico 3 é GIcNAc

Quando outros instrumentos de CE que não o sistema BeckmanMDQ são usados, o comprimento do capilar pode ser diferente daquele es-pecificado nesse método. Isso causará variações no tempo de migração deanalito, bem como na intensidade de pico. Mas o padrão de pico de analitosde monossacarídeo permanecerá o mesmo.

R= 2 (t2-ti) / (W1+W2)

onde:

R: resolução

t2, t1: tempos de migração dos dois picos vizinhos respecti-vamente

W1, W2: larguras de pico na linha de base dos dois picos vizi-nhos respectivamente

Para a última injeção de Adequabilidade de sistema, o últimopico (GIcNAc) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguintefórmula:

T = W0,05/2f

onde:

T: fator de configuração

Wo,os: largura de pico a 5% de altura

f: largura da fronte de pico em pico máximo

Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as seqüências de Iava-gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por Tam-pão de Operação recentemente preparado ou substituir o capilar. A propor-ção das áreas de pico de GIcNAc e ManNAc deve ter um RSD de <10%. Otempo de migração de GIcNAc deve ser <10,0 minutos. O perfil de eletrofe-rograma deverá ser equivalente à figura 46,

O RSD percentual para o padrão monossacarídico pode ser de-terminado através de comparação da proporção de áreas de pico do padrãointerno e componentes do padrão de monossacarídeo dividindo a área depico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrãointerno para cada injeção de padrão de monossacarídeo. O RSD percentualpode ser calculado para GaINAc e GIcNAc. O RSD deverá ser <10%.

Determinação das proporções molares de Amino monossacarídeos pa-ra Proteína

A proporção de áreas de pico de Amino monossacarídeos (porexemplo, GaINAc e GIcNAc) com relação ao padrão interno ManNAc podeser calculada de acordo com as fórmulas proporcionadas abaixo de forma adeterminar as proporções molares de cada amino monossacarídeo para pro-teína. Por exemplo, a proporção de área de pico é igual à área de pico demonossacarídeo (GaINAc ou GIcNAc) dividido pela área de pico de ManNAc,em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de área de pico éigual a ou menor do que 10%. As seguintes equações podem ser usadaspara calcular:Para proporção molar de GaINAc/Proteína:

AGalNAc x AManNAcO x VoaINAcO x MWleA29YAManNAC X AcaINAcO X Vp X Cp X 221,2

Rgsinac : proporção molar de GaINAc vs. proteínaAg3INAc: área de pico (μΝ/.seg) de GaINAc na amostraAiWanNAc : área de pico (μΝ/.seg) de ManNAc na amostraAManNAco: área de pico (μΝ/.seg) média de ManNAc no padrão demonossacarídeo

AGaiNAco: área de pico (μΝ/.seg) média de GaINAc no padrão demonossacarídeo

Ν/caiNAco: volume de GaINAc contido em solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em μL)

CGaiNAco:concentração de GaINAc contido na solução de trabalhode monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)

N/p: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)

Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTUMa29yl1 04E-lg)(91,232 Da)

MW GaINAc: 221,2 Dáltons.

Para proporção molar de GlcNAc/Proteína:

β _ AgIcNAc X AManNAcO X VgIcNAcO X CgIcNAcO X MWlEA29Y

GlcNAc AManNAe X AgIcNAcO X Vp X Cp X 221.2

onde;

Rgicnac : proporção molar de GIcNAe vs. proteínaAgicnac: área de pico (μΝ/.seg) de GIcNAc na amostraAManNAc: área de pico (μΝ/.seg) de ManNAc na amostra

AManNAco: área de pico (μΝ/.seg) média de ManNAc no padrão demonossacarídeo

Agicnaco: área de pico (μΝ/.seg) média de GIcNAc no padrão deRealNAc-

onde:monossacarídeo

Vgicnaco: volume de GIcNAc contido em solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em μι)

Cgicnaco: concentração de GIcNAc contido em solução de traba-Iho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)

Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)

Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise(em mg/mL)

MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTI_A4A29YL104E-lg)(91,232 Da)

MW GIcNAc: 221,2 Dáltons

Tabela 54: Proporção molar média de mois de Monossacarídeo para moisde proteína de CTLA4A29YL104E-lg

<table>table see original document page 518</column></row><table>

EXEMPLO 37: DEFINIÇÃO DE PERFIL DE CARBOIDRATO N-LIGADO DEOLIGOSSACARÍDEO DE CTLA4A29YL104E-lq ATRAVÉS DE CROMATO-GRAFIA DE TROCA DE ÀNIONS DE ELEVADO DESEMPENHO

As estruturas de carboidrato presentes sobre glicoproteínas po-dem afetar sua função e clearance in vivo. Portanto, é importante monitorara consistência estrutural dos carboidratos de lotes recombinantemente pro-duzidos de glicoproteínas. Aqui, carboidratos N-Iigados (asparagina-ligados)presentes sobre CTLA4A29YL104E-lg são monitorados. Nesse método, oligos-sacarídeos são clivados através de digestão enzimática com PNGase F(Peptídeo: N-Glicosidase F), separados através de cromatografia de troca deânions de elevado desempenho (HPAEC) e monitorados através de detec-ção eletroquímica (amperometria integrada). O cromatograma gerado é operfil de carboidrato N-Iigado1 em que perfis de amostras de CTI_A4A29YL104E-Ig deverão ser similares ao mesmo.

Reaqentes para Fases móveis para Isolamento dos oliqossacarídeosatravés de HPLC em fase reversa e carbono grafitado:Eluente 1 (ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA) em água comgrau para HPLC); Eluente 2: (TFA a 0,05% em acetonitrila a 60% (ACN)140% de água para HPLC (60: 40, ACN: H2O); Eluente 3: TFA a 0,05% emacetonitrila a 40%, isopropanol a 40% (IPA)1 20% de água para HPLC (40:40: 20, ACN: IPA: H2O)).

Reaqentes para a preparação de Fases móveis para definição de perfilde carboidrato de oligossacarídeo por HPAEC:

Eluente 1: acetato de sódio a 500 mM (NaOAc); Eluente 2: hi-dróxido de sódio a 400 mM (NaOH); água Milli-Q; Hidróxido de sódio a 4M(aproximadamente NaOH a4M); tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azidade sódio a 0,02%, pH = 7,5; Solução-estoque de trabalho de enzima PNGa-se F em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH =7,5; Solução-estoque de estaquiose (1,25 mg/mL); Padrão de Adequabilida-de de Sistema de Estaquiose (12,5 μg/mL).

INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES - (instrumentação equivalente podeser usada)

Instrumentação:

<table>table see original document page 519</column></row><table>Preparação de amostra: A um tubo de Eppendorfde 1,7 mL, 80µL de tampão de fosfato de Na a 50 mM contendo azida de Na a 0,02%, pHde 7 e 80 µl de amostra (~25µ9/µL para um total de 2 mg de C-TLA^9yli04e-Iq, etc.) foram adicionados, seguido por 16µL de 10X Tampãode desnaturação (SDS a 5%, ß-Mercaptoetanol a 10%). As amostras forammisturadas totalmente e subseqüentemente levadas à ebulição durante 2minutos para desnaturar as proteínas. Os frascos foram esfriados para atemperatura ambiente, então, 16 µl de NP40 (10%) e 40 µl da solução detrabalho de PNGase F foram adicionados e subseqüentemente misturados.

Após as amostras terem sido incubadas a 37°C durante 24 + 2 horas, elasforam transferidas para um frasco para amostrador automático de HPLC,pronto para injeção sobre o instrumento de HPLC.Condições de cromatoqrafia para Isolamento de oligossacarídeo:

<table>table see original document page 521</column></row><table>Condições de cromatografia para perfil de Oligo através de cromatogra-fia de troca de íons:

Temperatura da coluna Ambiente (22-25°C)

Taxa de fluxo 1 mL/min

Fases móveis e condições de gradiente

1: NaOAc a 500 mM

2: NaOH a 400 mM

3: água Milli-Q

Programa de gradiente

* o segundo valor para algumas etapas de gra-diente indica a extensão até a qual o gradientepode ser modificado de forma a ajustar o tempode retenção do Padrão de Adequabilidade de

<table>table see original document page 522</column></row><table>Tempo de retenção aproximado(RT; minutos) de acordo com TRdo Padrão de Adequabilidade deSistema (SS)

<table>table see original document page 523</column></row><table>

As amostras de CTLA4A29YL104E-lg podem ter um perfil de carboi-drato representado no cromatograma da figura 47. Os tempos de retençãode cada domínio, conforme identificado na figura 47, deverão ser aproxima-damente:

<table>table see original document page 523</column></row><table>

Tempos de retenção são dependentes do sistema e deverão sedesviar similarmente à estaquiose.

Cálculos

Placas teóricas (N): O número de placas teóricas (N) pode serdeterminado baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso éfeito através do sistema de análise de dados Millennium ou pode tambémser feito manualmente.

N = 16 (t/W)2

onde:

t: tempo de retenção medido a partir do momento de injeção atéo momento de eluição de pico na altura máxima.

W: largura de pico através de extrapolação dos lados para a li-nha de base.

N deve ser > 6000. Se a contagem de placa é menor do que6000, a coluna deverá ser substituída.

Fator de configuração (Τ): O fator de configuração da coluna(T) pode ser calculado baseado no pico de estaquiose usando a fórmula a-baixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Millennium ou po-de também ser feito manualmente.

T = (W0,05/2f)

onde:

W0,05: largura de pico a 5% de altura (0,05h).f: a medida (largura) da borda frontal de pico a W0i05 para o meiodo pico na altura máxima.

T deve ser <1,2. Se o fator de configuração for maior do que 1,2,a composição de tampão deverá ser avaliada, a coluna deverá ser substituí-da ou limpa.

área de Domínio %:

Domínio I: Soma das áreas de pico em tempos de retençãoaproximados de 10 -15 minutos (Picos 1A-1E; por exemplo, figura 47)

Domínio II: Soma dos picos de 21 - 27 minutos

Domínio III: Soma dos picos de 34 -40 minutos

Domínio IV: Área de pico para os Picos a 45 -56 minutos

Área de domínio individual

Area percentual de domínio =- χ 100%

Soma de todas as áreas de domínio

Área de pico principal percentual: A Área de pico % para cadaum dos principais cinco picos pode ser calculada para o seguinte usando aequação abaixo: Picos 1A, 1B, 1C, 2 (duas espécies não-decompostas), 3(duas espécies não-decompostas) e 4.

Área de pico para pico individual

Área percentual de pico = -χ 100%

Soma de todas as áreas de domínio

EXEMPLO 38: IDENTIFICAÇÃO ELETROFORÉTICA EM CAPILAR DECTLA4A29YL104E-lq EM SUBSTÂNCIA DE FÁRMACO E PRODUTO DE FÁRMACOCTLA4A29YL104E-lg é uma glicoproteína solúvel em água com ati-vidade imunossupressora. Um método de eletroforese em capilar usando umcapilar de sílica não-revestido foi usado para a identificação de CTLA4A29YL104E-lg.

As amostras (por exemplo, CTI_A4A29YL104E-lg, etc.) são aquecidas durante 5minutos a 70°C e, então, analisadas imediatamente através de detecção deUV ajustada a 214 nm para confirmar a identificação.

Adicionalmente, uma mistura a 1:1 de CTLA4A29YL104E-lg e dematerial de CTLA4-lg foi misturada e injetada para confirmar que as duasproteínas poderiam ser separadas e diferenciadas. Esse método pode dis-tinguir entre CTI_A4A29YL104E-lg de CTLA4-lg através de comparação do tem-po de migração do material de CTLA4A29YL104E-lg com a amostra.

EQUIPAMENTO (equipamento equivalente pode ser substituído):

<table>table see original document page 525</column></row><table>

REAGENTES E SOLUÇÕES: Tampão de Operação (borato desódio a 14,4 mM; dodecil sulfato de sódio a 17,3 mM; acetonitrila a 2,0%);tampão de diluição de fosfato (fosfato de sódio a 22,3 mM, dibásico; fosfatode sódio a 4,2 mM, monobásico; cloreto de sódio a 53,4 mM); Tampão dediluição de borato (NaB02 a 8,5 mM, pH de 9,6); soluções de trabalho dereferência ou amostra (10 ±1 mg/mL de amostra em tampão de diluição defosfato); soluções de injeção de referência ou amostra (10,0 μΙ_ de amostra +50 μL. de tampão de diluição de borato); Amostra 1: 1 solução de mistura deCTLA4-lg- CTI_A4A29YL104E-lg (10,0 μL de amostra de CTLA4-lg + 10,0 μL deamostra de CTLA4A29YL104E-lg + 50 μL de tampão de diluição de borato); so-lução de injeção.CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO:

<table>table see original document page 526</column></row><table>

* Comprimento total: da entrada para a saída do capilar

** Comprimento efetivo: da entrada do capilar para a janela dedetecção

O tempo de migração de amostra de CTLA4-lg do pico principalé cerca de 11,0 ± 0,4 minuto. O tempo de migração de amostra de C-TLA4A29YL104E-lg do pico principal é cerca de 12,0 ± 0,4 minuto. Os temposde migração do pico principal entre cada amostra deverão estar a pelo me-nos 0,6 minuto de distância (FIG. 48).

EXEMPLO 39: Hidrólise e análise por HPLC para determinação do teorde ácido N-acetil neuramínico e ácido N-glicolil neuramínico em C-

O grau de sialilação em proteínas recombinantes pode afetar afarmacocinética e taxa de clearance. CTI_A4A29YL104E-lg é uma proteína re-combinante que possui sítios de carboidrato N- e O-ligado. Os glicanos queocupam esses sítios possuem graus variáveis de sialilação. Além de hetero-geneidade estrutural de sua sialilação, o teor de ácido siálico individual po-deria variar de lote para lote. Uma medição global da proporção de ácidosiálico para proteína é, portanto, obtida.

O teor de ácido N-Acetil Neuramínico (NANA) e ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) presentes em CTLA4A29YL104E-lg foi examinado. Os áci-dos siálicos são liberados da proteína através de hidrólise ácida e, então,fluorescentemente rotulados com DMB. Os ácidos siálicos rotulados são se-parados sobre uma coluna RP-HPLC C-18 e quantificados a partir de umfator de resposta de um padrão de ácido siálico concorrentemente operado.Análise de dados e valores reportados (como proporção molar de NANA ouNGNA para proteína) são especificados nesse método exemplificativo. Esseexemplo descreve o método usado para determinar a quantidade de ácidoN-Acetil Neuramínico (NANA) e ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) presen-te em CTLA4A29YL104E-lg. Os ácidos siálicos são liberados da proteína atra-vés de hidrólise ácida. Os NANA e NGNA liberados são, então, fluorescen-temente rotulados com 1, 2,-diamino-4, 5-metilenoxibenzeno (DMB). Os áci-dos siálicos rotulados são separados sobre uma coluna RP-HPLC C-18 edetectados através de detecção fluorescente (Ex = 373 nm, Em = 448 nm).NANA e NGNA são quantificados baseado nos fatores de resposta dos pa-drões de NANA e NGNA concorrentemente operados. Os resultados do tes-te são reportados como proporção molar (MR) de NANA e NGNA para prote-ína, respectivamente.

Reagentes e Soluções: H2SO4 a 1,0 M; H2SO4 a 50 mM; rea-gente de rotulação por fluorescência (hidrossulfito de sódio a 18 mM(Na2S2O4), 2-mercaptoetanol a 7%, dicloridrato de 1,2-diamino-4,5-metileno-dioxibenzeno a 7 mM (DMB)); Tampão de Operação de Fase móvel A (Me-tanol a 20%); Tampão de Operação de Fase móvel B (Metanol a 70%); solu-ção-padrão de ácido N-acetil neuramínico (1 mg/mL); solução padrão de á-cido N-glicolil neuramínico (1 mg/mL); Padrões de Adequabilidade de siste-ma (50 μί das soluções de NANA ou NGNA em 900 μί de água); Soluçãode amostras (por exemplo, 2 mg/ml de CTI_A4A29YL104E-lg, etc.); Solução-padrão de estoque de trabalho de NANA (diluir estoque para 50 μg/mL); so-lução-padrão de Estoque de trabalho de NGNA (diluir estoque para 50μg/mL).

Hidrólise: 20 μί de cada um de padrão de NANA, padrão deNGNA, CTI_A4A29YL104E-lg e solução-padrão de adequabilidade de sistemaforam transformados em alíquotas em tubos para centrífuga de 1,5 mL dis-tintos e 200 μί de solução de ácido sulfúrico a 50 mM foram adicionados acada frasco. Os conteúdos foram misturados ligeiramente e incubados a80EC durante 1 hora V 5 minutos. Quando hidrólise está completa, a amostraé centrifugada rapidamente.

Rotulação por fluorescência: reagente de rotulação por fluo-rescência (200 μL) foi adicionada a cada amostra e misturado totalmente. Asamostras foram, então, incubadas no escuro a 80EC durante 45 V 5 e sub-seqüentemente esfriadas.

INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS (instrumentação equivalente pode ser usada):

<table>table see original document page 528</column></row><table>

Sistema de HPLC: módulo de separação Waters 2690/2695 ouequivalente

Detector de fluorescência: detector de fluorescência com com-primento de onda múltiplo Waters 2475 ou equivalente

Aquisição de dados: Waters Millennium 32 ou Empower.Coluna: Luna 5 μ, C18, 100 A, 150 χ 4,6 mm, Phenomenex, (Ca-tálogo No. 00F-4252-E0)

Bloco de aquecimento digital: WVR1 (Catálogo No. 13259-056)ou equivalente

MiniCentrífuga: WVR1 (Modelo No. C-1200) ou equivalente

Fase móvel A: MeOH a 10% (v/v)/90% de água

Fase móvel B: MeOH a 70% (v/v) /30% de água

Taxa de fluxo: 1 mL/min

Volume de injeção: 10 μL

Tempo de operação: 30 min

Temperatura da coluna: temperatura ambiente

Comprimento de onda de excitação: 373 nm

Comprimento de onda de emissão: 448 nm

Ganho: 1

Gradiente de eluição:

<table>table see original document page 529</column></row><table>

Preparo de padrões de ácido siálico (~ 5 mM)

Padrão de ácido N-acetil neuramínico (NANA, MW = 309,3) (~5 mM). Pesar precisamente 154,5 ± 1,0 mg de ácido N-acetil neuramínicoem um frasco volumétrico de 100 ml_. Dissolver e Q.S. até o volume comágua Dl, misturar bem. Transformar em alíquotas a solução em frascos crio-gênicos de 2 mL.

<formula>formula see original document page 529</formula>

P = Pureza de NANA - do COA do Vendedor (isto é, 99% = 0,99).

Padrão de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA, MW = 325,7)(~ 0,25 mM). Pesar precisamente 8,0 ± 1,0 mg de ácido N-glicolil neuramíni-co em um frasco volumétrico de 100 mL. Dissolver e Q.S. até o volume comágua Dl, misturar bem. Transformar em alíquotas a solução em um frascocriogênico de 2 mL.

<formula>formula see original document page 530</formula>

P = Pureza de NGNA - do COA do Vendedor COA (isto é, 99% = 0,99).

Os padrões de ácido siálico transformados em alíquota podemser armazenados a -20 °C durante até seis meses.

Preparação de mistura padrão de ácido siálico. Mistura-padrão de ácido siálico para adequabilidade de sistema e quantificação(NANA a 50 μΜ, NGNA a 1 μΜ). Adicionar 1 mL de NANA a 5 mM, 400 μΙ deNGNA a 0,25 mM em um frasco volumétrico de 100 mL. Q.S. até o volumecom água Dl e misturar bem. Transformar em alíquotas a mistura padrão deácido siálico em frascos criogênicos de 2 mL. A mistura-padrão de ácido siá-lico transformada em alíquota pode ser armazenada a -20°C durante até seismeses.

Preparação de amostra e Material de Referência. Desconge-lar as amostras de proteína a 2-8°C, misturar bem. Diluir as amostras e Ma-terial de Referência para aproximadamente 0,5 mg/mL CTIjMa29yl1 04E-lg(por exemplo, conc. de proteína = 25,0 mg/ml, adicionar 50,0 μL de proteínaem 2450 μL de água). Centrifugar as amostras de teste diluídas e material dereferência durante 5 minutos a 10.000 rpm de forma a remover as partículas.Hidrólise

Placebo: A um tubo para centrífuga de 2,0 mL, adicionar 50 μLde água Dl e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM. Isso serve como placebo.

Padrão de ácido siálico para Adequabilidade de sistema equantificação. A um tubo para centrífuga de 2,0 mL, adicionar 50 μL demistura de padrão de ácido siálico e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM.Preparar em duplicata. Denotar como Std 1 e Std2.

Material de Referência: A um tubo para centrífuga de 2,0 mL,adicionar 50 μL de material de referência de CTI_A4A29YL104E-lg diluído (-0,5 mg/mL) e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM. Preparar em duplicata, denotarcomo RM1 e RM2.

Amostras de teste: A um tubo para centrífuga de 2,0 ml_, adi-cionar 50 μΙ_ de substância de fármaco de CTI_A4A29YL104E-lg diluída 0,5mg/mL) e 200 μΙ_ de ácido sulfúrico a 50 mM. Preparar em duplicata. Deno-tar como S1-1, S1-2; S2-1, S2-2; S3-1, S3-2; etc. Submeter a turbilhonamen-to as amostras durante aproximadamente 5 segundos e centrifugar duranteaproximadamente 5-10 segundos. Colocar as amostras em um bloco de a-quecimento e incubar a 80°C ± 5°C durante Ihora ± 5 minutos. Deixar asamostras hidrolisadas esfriar para a temperatura ambiente. Centrifugar asamostras hidrolisadas rapidamente para forçar condensado no tubo (~ 10segundos em alta velocidade).

Derivatização. Pré-aquecer o bloco de aquecimento para 80°C± 5°C. Adicionar 200 μΙ_ de reagente de rotulação por fluorescência a cadaamostra hidrolisada. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5 se-gundos e centrifugar durante -10 segundos. Colocar as amostras em umbloco de aquecimento a 80°C ± 5°C durante 40 ± 5 minutos. Cobrir o blocode aquecimento com folha de alumínio, uma vez que a solução de rotulaçãoé sensível à luz. Deixar amostras derivatizadas esfriar para a temperaturaambiente. Submeter a turbilhonamento e centrifugar as amostras duranteaproximadamente 10 segundos para forçar o condensado no tubo.

Preparação de injeção. Assegurar que a coluna é equilibradacom fase móvel antes de análise. Transferir amostra suficiente (100 - 200μL) de cada tubo para centrifuga para um frasco para amostrador automáti-co com inserção limitada. Um carregamento típico para amostrador automá-tico para 10 injeções de amostra é como segue:<table>table see original document page 532</column></row><table>

onde Std 1 e Std 2 são as preparações de solução de mistura-padrão de áci-do siálico; RM1 e RM2 são os preparados para amostra de controles; eSéainjeção de amostra. As primeiras quatro injeções de padrão de ácido siálico(Amostra N0 2 & 3) (StdI) serão usadas para fins de Adequabilidade de sis-tema. As quatro injeções de Amostra N0 3 (StdI) e Amostra N0 4 (Std2) se-rão usadas para cálculo. Para injeções de amostra adicionais, repetir carre-gamentos 5 a 16 do amostrador automático.

ADEQUABILIDADE DE SISTEMA. O perfil de cromatograma deamostras de Adequabilidade de sistema deverá ser similar ao cromatogramamostrado na figura 49. Para as primeiras injeções de Padrão de Adequabili-dade de Sistema (StdI)1 as resoluções USP (R) para NGNA e NANA devemser > 1,5. Quatro injeções do Padrão de Adequabilidade de Sistema (StdI)deverão ir ao encontro dos seguintes valores exemplificativos: O RSD daárea de pico para NANA deve ser < 5%. O RSD da área de pico para NGNAdeve ser < 10%. O tempo de migração do pico de NGNA deve ser eluído a11,3 ± 2,0 minutos. O tempo de migração do pico de NANA deve ser eluídoa 16,0 ± 2,5 minutos. O RSD da área de pico de quatro injeções de padrão,(Std1, Amostra N0 3) e (Std2, Amostra N0 4) deve ser <10%. O RSD da áreade pico de todas as injeções de padrão entre faixas da seqüência deve ser<15%.

Preparação do sistema de HPLC: Colunas foram equilibradascom 98% de Tampão A e 2% de Tampão B a 1 mL/min durante 15 minutos.

10 μl de solução de adequabilidade de sistema fluorescentemente rotuladaforam injetados no sistema. A resolução de pico e o número de placas teóri-cas podem, então, ser calculados usando as seguintes equações:

2(T2-T1)R~ W2 + W1

onde: R = Resolução

T1 = Tempo de retenção (min) de ácido N-glicolil neuramínico

T2 = Tempo de retenção (min) de ácido N-acetil neuramínico

W1 = Largura de pico na linha de base de ácido N-glicolil neu-ramínico (min)

W2 = Largura de pico na linha de base de NANA (min)O valor de resolução deve ser 3 1,5.

O número de placas teóricas pode ser calculada usando a seguin-te equação:

<formula>formula see original document page 533</formula>

onde:

N = Número de placas teóricas

T2 = Tempo de retenção (min) de ácido N-acetil neuramínico

W2 = Largura de pico na linha de base de ácido N-acetil neura-mínico (min)

O número de placas teóricas deve ser 2000. O cromatograma deperfil de hidrólise de CTLA^9^104^ deverá ser similar à figura 49.

Amostras foram analisadas através de HPLC de fase reversa(RP-HPLC) na seguinte ordem: Padrões de NANA e NGNA foram primeiroinjetados, seguido por injeção de amostras, em duplicata se necessário (porexemplo, CTI_A4A29YL104E-lg, etc). Após análise de amostra, a coluna foi la-vada com Fase Móvel B durante 20 minutos a 0,5 mL/minuto. Se necessário,a coluna pode ser invertida.Determinação da proporção molar (MR) de ácido siálico (NANA ou NG-NA) para proteína

A proporção molar de ácidos siálicos para proteína pode ser cal-culada através do software Millennium ou Empower.

Fator de diluição:

Vproteína + VáguaD = Vproteína

onde

V proteína = volume de solução-estoque de proteína adicionado (Ml)

V água = volume de água adicionado (Ml)

Concentração de solução de trabalho de proteína (proteína usa-da para hidrólise) concentração (μΜ):

<formula>formula see original document page 534</formula>

onde:

Cdesconhecida ~ Concentração da solução de trabalho de proteína (μΜ),Ca28o = A2So concentração da solução-estoque de proteína (mg/ml),MW ctla4A29yli04E-ig = peso molecular de CTLA4A29YL104E-lg, 91232 Da.

Concentração de Ácidos siálicos na solução de trabalho de pro-teína (μΜ):

desconhecida std

onde:

Cdesconhecida= Concentração de ácido siálico (NANA ou NGNA)na amostra desconhecidaa

Cstd = Concentração de ácido siálico (NANA ou NGNA) no pa-drão (μΜ)

Au = área de pico de ácido siálico (NANA ou NGNA) na amostradesconhecida

A std - área de pico de ácido siálico (NANA ou NGNA) no padrão

Proporção molar (M.R.) de ácido siálico (NANA ou NGNA) para proteína:<formula>formula see original document page 535</formula>

Cálculo da Proporção molar total de ácido siálico para proteína (TSA):

TSA = proporção de NANA molar + proporção molar de NGNA

O desvio-padrão relativo para as contagens de área de dois pa-drões de NANA entre faixas deverá ser < 10%. O desvio-padrão relativo pa-ra as contagens de área de dois padrões de NGNA entre faixas deverá ser <10%. O desvio-padrão relativo para as contagens de área de dois hidrolisa-tos independentes deverá ser < 10%.

Em uma modalidade, a proporção molar média para ácidos siáli-cos na CTI_A4A29YL104E-lg deve estar dentro das faixas especificadas na tabe-Ia diretamente abaixo.

Faixa de proporção molar de Material de CTI_A4A29YL104E-lg

<table>table see original document page 535</column></row><table>

O desvio % da proporção molar para ácidos siálicos no material dereferência e amostras para as duas preparações de amostras deve ser <15%, <20%, <25%, <30% ou <35%.

EXEMPLO 40: UM BIOENSAIO BASEADO EM CÉLULA IN-VITRO PARACTLA4A29YL104E-lq

Células T requerem dois sinais para ativação e subsequente pro-liferação. O primeiro sinal é proporcionado através da interação de um pep-tídeo antigênico com o complexo TCR-CD3. O segundo sinal coestimulatórioocorre com a interação dentre CD29 sobre a célula Tea proteína B7 sobrea célula que apresenta antígeno. Quando de recebimento desses dois sinais,células T secretam a citocina lnterleucina-2 (IL-2). Liberação de IL-2 leva àativação e proliferação celular. CTLA4A29YL104E-lg, um composto imunossu-pressivo solúvel, também se liga à proteína B7 sobre as células apresentan-do antígeno, assim, bloqueando a interação funcional com CD28 e impedin-do o sinal coestimulatório que é necessário para a produção de IL-2.

Nesse método, células T Jurkat transfectadas com o gene deluciferase, sob o controle de do promotor de IL-2, são coestimuladas comcélulas B de Daudi na presença de anti-CD3. A coestimulação ativa o pro-motor de IL-2 o qual, por sua vez, produz proteína de luciferase. O sinal Iu-minescente resultante é medido usando um Sistema de Ensaio de Lucifera-se. Nesse sistema, CTLMa29yli04e-Iq produz uma diminuição dose-dependente na atividade de luciferase.

Esse método examina o efeito de CTUMa29yl1 04E-lg sobre o sinalcoestimulatório necessário para produção de IL-2. A presença de C-TUMa29yl1 04E-lg solúvel impede a sinalização entre a célula T e células a-presentando antígeno. Sem esse sinal, IL-2 não é produzida, assim, impe-dindo a expansão clonal de células T. Um vetor com o gene de luciferase foicriado usando o promotor de IL-2. As células T Jurkat foram, então, transfec-tadas com esse vetor repórter. Um clone positivo, Jurkat.CA, foi selecionadoe usado no método.

Esse bioensaio envolve estimulação de células T transfectadas(Jurkat.CA) com anti-CD3 e células B (Daudi). Coestimulação proporcionadapelas células B é inibida através da adição de CTI_A4A29YL104E-lg. As célulasJurkat.CA e Daudi são cultivadas nas cavidades de uma lâmina com fundoplano, branca, opaca com 96 cavidades e estimuladas com anti-CD3 na pre-sença de diferente concentrações de CTI_A4A29YL104E-lg. Após uma incuba-ção de 16 a 20 horas a 37°C, as cavidades são ensaiadas com relação àatividade de luciferase. Inibição de coestimulação através de CTUMa29yl104e-Ig é observada como uma diminuição dose-dependente na atividade de luci-ferase.

REAGENTES: Meio de cultura de células Daudi (soro fetal bovi-no a 10%, MEM piruvato de sódio a 1% em RPMI 1640); Meio de cultura decélula Jurkat.CA (soro de cabra a 10%, MEM piruvato de sódio a 1%, 400μg/mL de geneticina em RPMI 1640); Meio de bioensaio (0,2 μg/mL de anti-corpo anti-CD3 e solução de penicilina-estreptomicina a 1% em Meio de cul-tura de células Daudi); solução Bright-Glo Luciferase do sistema de ensaio(Promega, Catálogo N0 E2620).

INSTRUMENTAÇÃO: Nikon, microscópio invertido Diaphot 200;Luminômetro Packard TopCount NXT; Manipulador de líquido Tecan Gene-sis; Contador de células Coulter Vi-Cell; Zymark RapidPlate-96.Procedimento

Preparação de Soluções de trabalho: 3 mL de soluções deCTUMa29yl1 04E-lg (5000 ng/mL) em meio de bioensaio.

Meio de cultura de células Daudi. Adicionar 300 mL de RPMI1640 a uma unidade de filtro Corning de 1 L. Então, adicionar 100 mL desoro bovino fetal e 10 mL de MEM piruvato de sódio. Adicionar RPMI 1640 obastante para fazer 1 litro. Filtrar e armazenar a 4°C durante até um mês.

Meio de cultura de célula Jurkat.CA. Adicionar 300 mL deRPMI 1640 a uma unidade de filtro Corning de 1 L. Então, adicionar 100 mLde soro de cabra, 10 mL de MEM piruvato de sódio e 8 mL de geneticina a50 mg/mL (a concentração final é de 400 μg/mL). Adicionar RPMI 1640 obastante para fazer 1 litro. Filtrar e armazenar a 4°C durante até um mês.

Meio de bioensaio. Adicionar 100 mL de Meio de cultura de cé-lulas Daudi (2,1) a 100 mL de frasco médio. Então, adicionar anticorpo anti-CD3 para uma concentração de 0,2 μg/mL e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina (1.11). Misturar gentilmente através de inversão e armazenarem temperatura ambiente durante não mais do que 8 horas.

Solução de Iuciferase Bright-Glo. Preparar a solução, confor-me descrito no sistema (1.21), através da adição de tampão de ensaio aosubstrato Iuciferase e misturar através de inversão. O reagente deverá serusado dentro de 2 horas ou armazenado a -20°C e protegido da luz duranteaté 4 semanas.

Manutenção de Linhagem de células. Determinar o número decélulas por mL para as linhagens de célula Jurkat.CA e Daudi através decontagem com um contador de células. As células deverão estar entre 1 χ105 e 1,5 χ 106 células/mL. Combinar 12 χ 106 Células Jurkat.CA e 12 χ 106células Daudi em um tubo para centrífuga estéril. Centrifugar as células a~125 χ g durante 10 minutos em temperatura ambiente. Ressuspender to-talmente as células em 9 mL de Meio de cultura de células Daudi (2.1) repe-tidamente pipeteando gentilmente com uma pipeta sorológica até que ne-nhum grumo de célula esteja visível, a fim de proporcionar uma concentra-ção de 2,7 x106 células/mL. Verificar a concentração de células através decontagem das células sobre um contador de células. Cultivar as células res-suspensas nas cavidades de uma lâmina com 96 cavidades (1.3) a 75 mLpor cavidade (200.000 células por cavidade). Incubar a lâmina nos pontos deajuste da incubadora de 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85% enquanto ospadrões, controles de qualidade e amostras são preparados. Preparar con-centrações nominais de CTI_A4A29YL104E-lg para os padrões, controles dequalidade e amostras 1 e 2. Preparar 3 mL de solução de trabalho de mate-rial de CTI_A4A29YL104E-lg a 5000 ng/mL em meio de bioensaio (2.3) para usona Curva-padrão. Preparar 3 mL de solução de trabalho de material de C-TLA4A29YL104E-lg a 5000 ng/mL em meio de bioensaio (2.3) para uso na curvade controle de qualidade. Preparar 3 mL de cada uma das duas amostras desolução de trabalho de CTI_A4A29YL104E-lg a 5000 ng/mL em meio de bioen-saio (2.3) para uso nas curvas de amostra. (Concentrações aproximadaspara amostras de CTLA4A29YL104E-lg podem ser usadas para preparar ascurvas com 8 pontos e valores de potência relativa podem ser corrigidosconforme descrito em 5.5 quando a concentração determinada está disponí-vel).

Oito curvas de ponto foram preparadas para o padrão, controlede qualidade e amostras nas concentrações de 5000, 200, 100, 50, 25, 10, 5e 0,1 ng/mL de CTLA4A29YL104E-lg, conforme mostrado na Tabela 55 abaixopara as concentrações finais no ensaio, após diluição de duas vezes na lâ-mina, de 2500, 100, 50, 25, 12,5, 5, 2,5 e 0,05 ng/mL.

Tabela 55. Diluições usadas para gerar curvas-padrão.

<table>table see original document page 539</column></row><table>

Dois mapas de lâmina podem ser usados. O mapa de lâminaaleatória requer o uso de um manipulador de líquido para ajuste. O mapa delâmina ordenada tem triplicatas adjacentes e cada ponto de curva para osartigos de teste adicionados em um Iayout ordenado sequêncial. Para o ma-pa de lâmina aleatória, adicionar 75 μL de cada solução (4.8) às cavidadesapropriadas de uma lâmina contendo células (4.5) conforme mostrado nomapa de lâmina abaixo. Para o mapa de lâmina ordenada, adicionar 75 μLde cada solução (4.8) às cavidades apropriadas de duas lâminas contendocélulas (4.5) conforme mostrado no mapa de lâmina abaixo.

Vedar a(s) lâmina(s) com TopSeaI-A (1,22). Assegurar que avedação está hermeticamente no lugar. Não deverão existir vãos de ar. In-cubar a(s) lâmina(s) nos pontos de ajuste da incubadora de 37°C, 5% deCO2 e umidade de 85% durante 16 a 20 horas. Equilibrar a(s) lâmina(s) esolução de Iuciferase Bright-Glo (2.4) para a temperatura do instrumento.Adicionar 150 μL de solução de Iuciferase Bright-Glo a cada cavidade simul-taneamente e misturar. Colocar a lâmina no TopCount NXT imediatamenteapós mistura para equilibrar no escuro durante 10 minutos. Medir o sinal Iu-minescente no TopCount NXT usando uma integração de 1 segundo porcavidade ou conforme apropriado ao tipo particular de luminômetro usado. Oresultado do TopCount NXT é registrado. Quando usando o mapa de lâminaordenada, duas lâminas serão lidas. A primeira lâmina (de pé) será lida coma cavidade A1 no canto à esquerda superior. A segunda lâmina (invertida)será lida com a cavidade A1 no canto à direita inferior.<table>table see original document page 541</column></row><table><table>table see original document page 542</column></row><table>200.000 células foram adicionadas por cavidade de uma lâminacom 96 cavidades e foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 e umidade de85%. 12 χ 106 Células Jurkat.CA e 12 χ 106 células Daudi foram combinadasem um tubo para centrífuga estéril. As células foram centrifugadas a ~125 χg durante 10 minutos em temperatura ambiente e foram totalmente re-suspensas em 9 mL de Meio de cultura de células Daudi repetidamente pi-peteando gentilmente com uma pipeta sorológica até que mais nenhumgrumo de célula fosse visível, a fim de proporcionar uma concentração de2,7 x106 células/mL. 75 μΙ_ de cada solução da Tabela 55 foram adicionadosàs cavidades apropriadas de uma lâmina contendo células. A(s) lâmina(s)foi(ram), então, vedada(s) com TopSeaI-A e incubada(s) a 37°C, 5% de CO2e umidade de 85% durante 16 a 20 horas. Após as lâminas e solução deluciferase Bright-Glo terem sido equilibradas para a temperatura do instru-mento, 150 μΙ_ de solução de Iuciferase Bright-Glo foram adicionados a cadacavidade simultaneamente e foram misturados. A lâmina é, então, colocadano TopCount NXT imediatamente após mistura para equilíbrio no escuro du-rante 10 minutos. O sinal Iuminescente foi, então, medido em um TopCountNXT usando uma integração de 1 segundo por cavidade ou conforme apro-priado ao tipo particular de luminômetro usado.

O resultado do TopCount NXT foi registrado, lido em um pro-grama de análise de padrão e os dados foram transformados tomando seuIogaritmo (base 10). Os dados transformados de cada artigo foram adapta-dos a um modelo logístico com quatro parâmetros, conforme mostrado naequação abaixo:

<formula>formula see original document page 543</formula>

Equação 1.

onde:

A é o platô superior da curva, D é o platô inferior da curva, B é ofator de declínio e C é a concentração que produz um efeito igual à média deAeD.

Um F-teste R2 estatístico e com falta-de-adaptação pode ser cal-culado para cada artigo. Uma proporção do mínimo, máximo e declínio dosartigos de teste com relação ao material padrão pode também ser calculada.Além disso, intervalos de confiança para as proporções podem também sercomputados.

A potência relativa de cada artigo foi determinada através deadaptação de uma única equação aos dados do artigo de interesse combi-nados com os dados do artigo de referência.

<formula>formula see original document page 544</formula>

onde:

os parâmetros A, B e D são comuns à referência e artigo de testee Cr é o parâmetro referência, Ca é o parâmetro artigo de teste e a propor-ção Cr/Ca é a potência relativa. O superscrito / é uma variável indicadora.Ele é ajustado em igual a 1 se os dados se originam do artigo de interesse e0 se os dados se originam do material-padrão.

A potência relativa de cada artigo de teste foi traduzida para umaescala percentual e a potência relativa foi fornecida como resultado do pro-grama.

Ajuste de valores de potência relativa Obtidos com concen-trações aproximadas: Em virtude do "lag" de tempo entre recebimento daamostra e obtenção de uma concentração precisa de proteína, a amostrapode ser testada no ensaio em uma concentração aproximada e os resulta-dos ajustados quando a concentração precisa é determinada. Esse ajuste érealizado usando a Equação 2 abaixo, onde a potência relativa determinadano ensaio é multiplicada pela proporção da concentração de CTLA4A29YL104E-Ig usada para ajustar o ensaio para a concentração de amostra de C-TLA4A29YL104E-lg determinada.Equação 2:

<formula>formula see original document page 545</formula>

Exemplo:

Amostra foi testada em uma concentração de proteína de 25mg/mL no ensaio.

Potência relativa determinada foi de 105%.

A concentração de CTLA4A29YL104E-lg determinada foi estabele-cida como sendo de 25,5 mg/mL.

Potência relativa reportável = (105 * 25) / 25,5 = 103%.

Material-padrão: O valor de EC50 para o padrão do resultadodeverá estar entre 5 e 35 ng/mL. A diferença entre as concentrações-padrãode 2500 ng/mL e 0,05 ng/mL (faixa) deverá ser >40.000 contagens por se-gundo (CPS). O valor de R-quadrado para a referência deverá ser mais de0,95.

Os valores de potência relativa do artigo de teste na Tabela 9devem estar entre 25 e 175% do padrão de referência, o qual é a faixa doensaio. Se os valores de potência relativa estão fora dessa faixa, então, aamostra deve ser diluída ou concentrada de forma a cair dentro dessa faixae a amostra reanalisada.

Linhagem de células B Daudi:

Fonte: Células Daudi foram obtidas da ATCC. Um banco mestrefoi gerado, compreendido de 64 frascos. Um banco de trabalho foi criado apartir de um frasco de banco mestre após 4 passagens.

(NOTA: Passagem 0 é considerada o descongelamento e, então, 3 pas-sagens adicionais foram feitas antes de geração do banco de trabalho).

Meios: Células Daudi são desenvolvidas em Meio RPMI 1640(contendo HEPES e L-glutamina) suplementado com soro fetal bovino a 10%e piruvato de sódio a 1%.

Condições da incubadora: Células são mantida em um T-frasco ventilado a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 70-90%.Protocolo de descongelamento: Um frasco de células é remo-vido de um congelador de nitrogênio líquido e descongelado em um banhode água a 37°C. Os conteúdos são misturados com 10 mL de meio de cultu-ra. As células são contadas e, então, coletada através de centrifugação a125 χ g durante 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante é removidoe as células são suspensas em meio fresco a 3 χ 105 células viáveis/mL. Ascélulas são definidas como estando na passagem 0 nesse ponto.

Propriedades de crescimento: A linhagem de célula cresce emsuspensão.

Subcultura: Culturas são mantidas através de passagem duasvezes por semana com não mais do que 5 dias entre passagens. As célulassão passadas em um T-frasco ventilado com meio fresco entre 0,5 χ 105 e 2χ 105 células viáveis/mL As células não deverão atingir uma densidade demais de 1,5 χ 106 células/mL. As células deverão ser mais de 80% viáveis,conforme avaliado através de coloração com azul de tripano. A data e núme-ro de passagens deverão ser rotulados sobre o T-frasco após passagem.

Tempos de duplicação: O tempo de duplicação oscila de 18 a 26 horas.

Limitações de passagem: As células de um banco de trabalhodeverão ser passadas 3 vezes antes de uso no bioensaio, isto é, elas deve-rão estar na passagem 3 ou maior. As células deverão permanecer em cultu-ra apenas durante 20 passagens. Um novo frasco de trabalho deverá serdescongelado de cada vez.

Protocolo de congelamento: Células são congeladas de 5 a 10χ 106 células / mL em um criofrasco. Meio crioprotetor é preparado atravésde suplementação de meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO. Ascélulas são congeladas em uma taxa de 1°C/minuto até que elas atinjam atemperatura do nitrogênio líquido (~190°C).

Linhagem de célula T Jurkat.CA:

Fonte: Células T Jurkat foram transfectadas com um plasmídeoque codifica a molécula de CTI_A4-lg. Um banco de trabalho foi criado a par-tir de um frasco de banco mestre após 3 passagens.(NOTA: Passagem 0 é considerada o descongelamento e, então, 2 pas-sagens adicionais foram feitas antes de geração do banco de trabalho).

Meios: Células Jurkat.CA são desenvolvidas em Meio RPMI1640 (contendo HEPES e L-glutamina suplementado com soro de cabra a10% e piruvato de sódio a 1% suplementado com geneticina (G418 sulfato)em uma concentração final de 400 μg/mL

Condições da incubadora: Células são mantida em um T-frasco ventilado a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 70-90%.

Protocolo de descongelamento: A frasco de células é removi-do de um congelador de nitrogênio líquido e descongelado em um banho deágua a 37°C. Os conteúdos são misturados com 10 ml_ de meio de cultura.

As células são contadas e, então, coletadas através de centrifugação a 125χ g durante 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante é removido e ascélulas são suspensas em meio fresco a 3 χ 105 células viáveis/mL. As célu-Ias são definidas como estando na passagem 0 nesse ponto.

Propriedades de crescimento: A linhagem de célula cresce emsuspensão.

Subcultura: Culturas são mantidas através de passagem duasvezes por semana com não mais do que 5 dias entre passagens. As célulassão passadas em um T-frasco ventilado com meio fresco entre 0,5 e 2 χ 105células viáveis/mL As células não deverão atingir uma densidade de maisde 1,5 χ 106 células/mL. As células deverão ser mais de 80% viáveis, con-forme avaliado através de coloração com azul de tripano. A data e númerode passagens deverão ser rotulados sobre o T-frasco após passagem.

Tempos de duplicação: O tempo de duplicação oscila de 18 a26 horas.

Limitações de passagem: As células de um banco de trabalhodeverão ser passadas 3 vezes antes de uso no bioensaio, isto é, elas deve-rão estar na passagem 3 ou maior. As células as células deverão permane-cer em cultura apenas durante 20 passagens. Um novo frasco de trabalhodeverá ser descongelado de cada vez.

Protocolo de congelamento: Células são congeladas de 5 a 10χ 106 células/mL em um criofrasco. Meio crioprotetor é preparado através desuplementação de meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO. As cé-lulas são congeladas em uma taxa de 1°C/minuto até até que elas atinjam atemperatura do nitrogênio líquido (~190°C).

EXEMPLO 41: Determinação de Ligação bio-específica de CTLA4A29YL104E-lqao receptor de B7.1-lg através de Ressonância de plasmônio em super-fície (BIAcore)

A ligação relativa de amostras de CTI_A4A29YL104E-lg ao receptorde B7.1lg foi medida através de ressonância de plasmônio em superfícieusando o instrumento BIAcore. Nesse ensaio, CTLA4A29YL104E-lg se liga auma proteína de fusão de imunoglobulina B7.1 Ig derivada da proteína damembrana celular de APC B7.1. Após imobilização do receptor de B7.1 Ig emuma alta densidade sobre a superfície de um chip sensor ativado, materialde CTLA4A29YL104E-lg, controles de qualidade e amostras são diluídas paragerar sensorgramas de ligação. A taxa de ligação inicial (declínio)/Unidadesde ressonância (RU) ligadas de CTLA4A29YL104E-lg à superfície de B7.1lg i-mobilizada é medida sob as condições de transferência de massa Iimitativa(difusão) sobre essa superfície de B7.1lg de alta densidade. A taxa de liga-ção inicial em unidades de ressonância por segundo (RU's) se correlacionadiretamente com a concentração bioativa. As taxas de ligação de amostrassão calculadas em uma concentração ativa usando a curva-Padrão de Refe-rência, onde a taxa de ligação de um material de CTLA4A29YL104E-lg é plotadacontra a concentração. Os resultados finais são expressos pela ligação per-centual de amostra com relação ao material de CTI_A4A29YL104E-lg ou como aconcentração.

REAGENTES: Amine Coupling Kit BIA Certificado (o kit contémum frasco de cada: 115 mg de N-hidróxi-succinimida (NHS), 750 mg de N-etil-N'-(3-dimetila) (EDC) e etanolamina); Tampão de regeneração (citrato desódio a 10 mM, NaCI a 100 mM, pH 4,0).

INSTRUMENTAÇÃO: Instrumento BIAcore C com um computa-dor PC compatível (BIAcore (Catálogo No.BR-1100-51)); software de contro-le BIAcore C versão 1.0.2; Software de avaliação BIAcore 1.0; lâmina de mi-crotitulação com 96 cavidades para BIAcore com formato de U (Catálogo No.BR-1005-03); folhas vedantes para lâmina de microtitulação com 96 cavida-des BIAcore (Catálogo No. BR-1005-78).

Esboço do Método:

MATERIAIS

Chip sensor CM5, grau certificadoManual do instrumento BlAcore® C

Tampão de HBS BIA certificado, HEPES amM, pH de 7,4, NaCI a 150 mM, EDTAa 3,4 mM, tensoativo P20 a 0,005% v/vSolução BIAnormaIizing (solução de glicerol a 40%)

Amine Coupling Kit BIA certificado, 115 mgde N-hidróxi-succinimida, 750 mg de N-etil-N'-(3-dimetila)

Cloreto de sódio (NaCI)

Tampão de acetato pH 5,0

Citrato de sódio (C6H3Na3O)

Ácido clorídrico (HCI)

Kit de manutenção BIAcore

BIAcore AB (Catálogo N0. BR-1000-12)

BIAcore (Catálogo N0. BR-1005-11)

BIAcore (Catálogo N0. BR1001-88)

BIAcoreAB (Catálogo N0. BR-1002-22)

BIAcore (Catálogo N0. BR-1000-50)

Sigma (Catálogo N0. S-9888)

BIAcore (Catálogo N0. BR-1003-51)

Sigma (Catálogo N0. S^641)

Fisher Scientific (Catálogo N°. A144-212)

BIAcore (Catálogo N0. BR-1006-67)

REAGENTES

Amine Coupling Kit BIA Certificado. O kit contém um frascode cada: 115 mg de N-hidróxi-succinimida, 750 mg de N-etil-N'-(3-dimetila) eetanolamina. Transformar em alíquotas cada solução de acordo as orienta-ções do fabricante e armazenar conforme indicado abaixo:

Armazenar alíquotas de 11,5 mg/ml de N-hidróxi-succinimida(NHS) a -20°C. Essa alíquota congelada expira 2 meses a partir da data depreparo. Armazenar alíquotas de 75 mg/ml de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) a -20°C. Essa alíquota congeladaexpira 2 meses a partir da data de preparo. Armazenar alíquotas de etano-lamina-HCI a 1,0 M, pH de 8,5, a -20°C. Essa alíquota congelada expira 2meses a partir da data de preparo.

Tampão de regeneração (citrato de sódio a 10 mM, NaCI a100 mM, pH de 4,0). Pesar analiticamente 1,5 ± 0,1 g de Citrato de sódio e2,9 ± 0,1 g de NaCI. Adicionar 500 ml_ de água Milli-Q e ajustar o pH para4,0 com HCI a 1 N. Filtrar a solução com um filtro de 0,22 μηι, então, trans-formar em alíquotas de 500 mL em tubos cônicos de 45 mL/50 mL. A solu-ção expira 6 meses a partir da data de preparo quando armazenada a 2-8°C.

INSTRUMENTAÇÃO

InstrumentoBlAcoreCcomum BIAcore (Catálogo No.BR-1100-51)

computador PC compatível

Software de controle BIAeore C: BIAeore1 conforme fornecido com o ins-

trumento BIAeore C1 versão 1.0.2Software de Avaliação BIAeore1 conforme fornecido com o ins-

trumento BIAcore C1 versão 1.0Medidor de pH ORION1 Modelo 720A+

PREPARO DE CHIP SENSOR. Inserir um novo Chip sensorCM5 no orifício de cassete sobre a unidade detectora do instrumento. Ope-rar o sistema conforme descrito no Manual do BIAcore C usando Tampão deHBS-EP.

OPERAÇÃO DO INSTRUMENTO BIAcore C PARA FUNÇÃODE MÉTODO. O instrumento BIAcore C é controlado a partir de um compu-tador PC compatível sob o ambiente Microsoft Windows com o software decontrole BIAcore C. Refira-se às Instruções de Operação, "Operação do Ins-trumento BIAcore C" e "Calibração e Manutenção do Instrumento BIAcore C"para uso e manutenção do instrumento BIAcore C.

MÉTODO DE !MOBILIZAÇÃO DE B7.1lqPreparo de B7.1lg: Um frasco contendo B7.1lg foi descongela-do a 22,5 ± 5°C e diluído para uma concentração que imobiliza 3000-9000RU1 usando tampão de acetato a 10 mM, pH de 5,0 como diluente. Um fras-co de EDC, NHS e Etanolamina foram, cada um, descongelados do AmineCoupling Kit conforme descrito. Frascos com reagente e Iigante foram, en-tão, colocados no suporte de amostra, conforme orientado pelo programaBIAcore e imobilização foi iniciada de acordo com as orientações do instru-mento B IAcore.

PREPARO DE CURVA-PADRÃO DE CTI_A4A29YL104E-lq

Padrões e amostras (tal como CTUMa29yl1 04E-lg, etc) foram des-congelados em temperatura ambiente. Padrões usados para gerar uma cur-va-padrão foram diluídos para as concentrações-alvo da curva-padrão (250,500, 1000, 2000, 4000 e 8000 ng/mL).

Para a diluição de uma amostra de padrões (tal como um mate-rial de estoque de CTLA4A29YL104E-lg) e a concentração sendo de 25 mg/ml,pode-se realizar as seguintes diluições:

i. Diluir 1/50 (500 µg/mL) através da adição de 20 µl a 980 µlde HBS-EP

ii. Diluir para 16 µg/mL através da adição de 30 µLde 500µg/mL a 908 µLde HBS-EP

iii. Diluir serialmente em 1/2 etapas (500 µLda diluição anteri-or + 500 µl de HBS-EP) para 250 ng/mL

Cada padrão pode ser analisado em injeções em duplicata queresultarão em 2 valores de declínio.

AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE. As amostras de

Controle de Qualidade (QC) de CTLA4A29YL104E-lg são preparadas em Tam-pão de HBS-EP nos três níveis de concentração-alvo de 750, 2500 e 5000ng/mL e são congeladas em frascos plásticos de 7 mm como alíquotas de200 µl a -80°C. As concentrações de CTI_A4A29YL104E-lg nas amostras de QCsão determinadas em três experimentos de análise de concentração inde-pendentes usando esse método. Em cada experimento, todas as amostrasde injeções de QC devem ser aceitáveis, detectando dentro de ± 20% dasconcentrações nominais. As amostras de QC qualificadas e congeladas ex-piram 6 meses após preparo. No dia de um experimento, descongelar umfrasco de cada uma das três amostras de QC em temperatura ambiente. Co-locar as amostras de QC nas posições do suporte de amostra conformedescrito no wizard do método e analisar cada QC com injeções triplicatas.Alternativamente, QCs podem ser preparadas frescas no dia de análise.

AMOSTRAS DE TESTE DE CTLA4A29YL104E-lg. Amostras deCTUMa29yl1 04E-lg têm de ser diluídas para uma concentração dentro da faixado ensaio (entre 750 e 5000 ng/mL). Amostras com uma concentração apro-ximada conhecida de CTUMa29yl1'04E-lg deverão ser diluídas para uma con-centração-alvo de 2000 ng/mL. Após descongelamento das amostras emtemperatura ambiente, elas são diluídas para uma concentração-alvo de2000 ng/mL usando Tampão de HBS-EP. Diluições de amostra podem serpreparadas para análise em tubos de ensaio de polipropileno certificadospara BIAcore ou uma lâmina de microtitulação com 96 cavidades. O seguinteé um exemplo para a diluição de uma amostra de teste de CTUMa29yl104e-Iq:

Após descongelamento das amostras em temperatura ambiente,amostras de CTUMa29yl1°4E-lg foram diluídas para uma concentração dentroda faixa do ensaio (tal como entre 750 ng/ml e 5000 ng/mL). As amostrascom concentração aproximada conhecida de CTUMa29yu04e-Iq deverão serdiluídas para uma concentração-alvo de 2000 ng/mL usando Tampão deHBS-EP em tubos de ensaio de polipropileno certificados para BIAcore ouuma lâmina de microtitulação com 96 cavidades.

O seguinte é um exemplo para a diluição de uma amostra deCTUMa29yl104e-Iq (concentração = 25,0 mg/mL):

i. Diluir 1/50 (500 μg/mL) através da adição de 20 μΐ a 980 μΐde HBS-EP

ii. Diluir 1/25 (20 μg/mL) através da adição de 30 μί de 500μg/mL a 720 μΐ de HBS-EP

iii. Diluir 1/10 (2 μg/mL) através da adição de 100 μΐ de 20μg/mL a 900 μί de HBS-EP

Submeter a turbilhonamento em cada diluição na velocidademoderada durante 2-4 segundos. As amostras são preparadas em triplicata(três diluições independentes a partir da solução de amostra de estoque) ecada diluição é analisada com uma injeção. As amostras foram preparadasem triplicata (três diluições independentes a partir da solução de amostra deestoque) e cada diluição foi analisada com uma injeção.

COMEÇANDO ANÁLISE USANDO O SOFTWARE BIACORE

C: Abrir o software de controle BIAcore C e selecionar File-> Project->Published->8164-2 -> Concentration Analysis Wizard. Clicar em "Nexf eselecionar um modelo publicado apropriado para a análise a ser realizada,por exemplo, "CTLA^9yl1 04E-lg Sample Concentration Analysis. blw". Inseriro número máximo de amostras para a análise planejada. Esse número deamostras inclui réplicas, então, por exemplo, para analisar 8 amostras emtriplicata, o número 24 deverá ser inserido. Selecionar Célula de fluxo (1-4)sobre a qual o Iigante B7.1 Ig foi imobilizado. Clicar em "Nexf e inserir ID daamostra, fatores de diluição e número de réplicas. Clicar em "Nexf e verifi-car posições do frasco. Nesse ponto, as posições dos frascos podem sermovidas para os locais desejados. Clicar em "Nexf e confirmar o set-up eescolhas para o ensaio na tela "Preparation for Analysis". Clicar em "Nexfsobre a barra de rolagem. Colocar os padrões, QC's, soluções de regenera-ção e amostras de teste nas posições apropriadas. Clicar em "Starf paracomeçar a análise.

AVALIAÇÃO DE DADOS.

Iniciar o software BIAcore C e abrir o arquivo BIAcore***.blr quefoi gerado. Então, selecionar "Wizard Results" do menu "View"para avaliaros dados.

Valores exemplificativos para superfície de B7.Hq

A massa de B7.1 Ig imobilizada sobre uma célula de fluxo inati-vada foi expressa como RU's (unidades de ressonância). A massa de super-fície deverá estar entre 3000 a 9000 RU's para desempenho ótimo do ensai-o. Se a massa de superfície não vai de encontro a esse valor exemplificativo,um ajuste do tempo de ativação (injeção de EDC/NHS) ou da concentraçãode B7.1 Ig pode ser feito e outra célula de fluxo pode ser imobilizada.Valores exemplificativos para tendência de linha de base

A tendência de linha de base de cada operação foi calculadacomo a alteração percentual da linha de base ("valores de resposta absolu-tos") entre cada ciclo com relação à massa de superfície imobilizada do Ii-gante. A maior alteração percentual entre qualquer dois ciclos da operaçãodeve ser < 5,0%. Por exemplo: se a linha de base no ciclo 20 = 13500 RU1linha de base no ciclo 23 = 13650 RU e densidade de superfície de B7.1 Ig =6000 RU1 então, a tendência de linha de base = (13650-13500)/6000 χ 100 =2,5%.

Valores exemplificativos para os padrões

Valores exemplificativos se aplicam às concentrações de Curva-padrão em ou acima de 500 ng/ml_. O coeficiente de variação (CV %) dosvalores em cada valor de declínio em cada concentração-padrão usada paradeterminar a curva-padrão devem estar dentro de ±10%. Os valores médiosde concentração (ng/ml_) em cada concentração-padrão devem estar dentrode 15% do valor-alvo (nominal). A diferença entre a concentração calculadae o alvo (concentração nominal ) pode ser dividida pela concentração-alvo(nominal) e multiplicada por 100. Por exemplo, no padrão de 500 ng/mL, aconcentração calculada no BIAcore C é de 510 ng/mL. O desvio % será cal-culado como segue :

(510 ng/mL - 500 ng/mL) / 500 ng/mL χ 100% = 2,0%.

Valores exemplificativos para amostras de QC: O CV % dosvalores médios de concentração em triplicata para cada concentração-alvode amostra de QC devem estar dentro de ±10%. Os resultados da amostrade QC devem estar dentro de ±15% de seus respectivos valores-alvo duran-te pelo menos sete das nove determinações de QC. A diferença nos valoresde declínio entre a primeira e última injeção de QC ao nível de 2500 ng/mLdevem estar dentro de ±5,0%. Por exemplo, o primeiro valor de declínio é de10.366 RU/s e o último valor de declínio é 10.230 RU/s, a diferença percen-tual será como segue:

(10,366-10,230 ) / 10,366 χ 100% = 1,3%Valores exemplificativos para amostras de testeO CV % das observações em triplicata obtidas para cada con-centração-alvo de amostra de teste devem estar dentro de 20%. Os valoresde declínio para a amostra devem estar na faixa do método: declínio médiona amostra de controle de qualidade 1 < declínio médio da amostra < declí-nio médio da amostra de controle de qualidade 3.CÁLCULOS DE RESULTADOS PARA AMOSTRA

Para determinar a ligação percentual da amostra de teste comrelação ao material de CTI_A4A29YL104E-lg, um valor de concentração paracada amostra de teste é calculado a partir da Curva-padrão em ng/mL. O"Wizard Results" do instrumento BIAcore calcula a concentração de C-TLA4A29YL104E-lg na amostra não diluída em mg/mL, baseado no fator de dilu-ição inserido para cada amostra.

Determinação da ligação percentual: Um valor de concentra-ção média para cada amostra testada pode ser multiplicado por 100 e dividi-do pela concentração reportada de proteína da amostra conforme determi-nado através da absorbância medida a 280 nm (A28o)· O valor pode, então,ser reportado ao número inteiro mais próximo como ligação percentual comrelação à amostras-padrão. Por exemplo, a amostra foi diluída em um fatorde diluição de 12.500 (concentração de amostra de proteína de aproxima-damente 25 mg/mL). A concentração média de CTLA4A29YL104E-lg das inje-ções em triplicata da amostra é de 25,3 mg/mL. A A280 para a amostra é de24,2 mg/mL. A ligação percentual calculada com relação à amostras-padrãopode ser como segue : 25,3 mg/mL / 24,2 mg/mL χ 100% = 104,545 %.Modelo do Wizard de imobilização de CTLA4A29YL104E-lgParâmetros de injeção de imobilização

<table>table see original document page 555</column></row><table>Pontos reportados de imobilização

<table>table see original document page 556</column></row><table>

continuação

<table>table see original document page 556</column></row><table>

Exemplo 42: Correlações Entre dados analíticos de Carboidrato de C-TLA4-lg e dados farmacocinéticos

As estruturas de carboidrato sobre CTLA4-lg mostram um papelimportante na farmacocinética (PK) da composição terapêutica de CTLA4-lg.Vários métodos analíticos foram desenvolvidos para caracterizar essas es-truturas de carboidrato. Dois parâmetros analíticos se correlacionam bemcom as taxas de clearance: a proporção de ácido siálico (NANA) para prote-ína de CTLA4-lg e o percentual de Domínios Ill e IV do perfil de carboidrato. Um terceiro parâmetro (a proporção de galactose para manose a partir deanálise de monossacarídeo) também parece se correlacionar bem. Por e-xemplo, as especificações para esses parâmetros podem ser:Proporção de NANA:proteína de CTLA4-lg: > 8,0Perfil de carboidrato: Domínios Ill e IV > 25% (Método 1)

Proporção de Galactose: Manose £ 0,65Uma etapa importante no processo de fermentação de CTLA4-lgpode ser a seleção de parâmetros de coleta que maximizará o rendimento(titulação) do produto final compreendendo características especificadas a-qui (veja Tabela 6). Um dos parâmetros (proporção de NANA: proteína) ésuficientemente rápido e preciso para ser usado como um dos parâmetrosde coleta. Uma proporção molar-alvo de NANA para proteína de CTLA4-lgde cerca de 8,0 pode assegurar que a maioria da coleta terá uma proporçãode NANA >7,0. Intensificações durante purificação podem, subseqüente-mente, produzir moléculas de CTLA4-lg com uma proporção de NANA >9,0.CTLA4-lg é uma glicoproteína com vários sítios de glicosilaçãoN-ligada e O-ligada. As estruturas de carboidrato N-Iigadas são, tipicamente,bi- ou triantenárias e, se totalmente sialiladas, terminam com os carboidratosNANA-GaI-GIcNAc. A maioria das moléculas são apenas parcialmente siali-ladas e contêm algumas cadeias de carboidrato terminando com Gal ouGIcNAc. A ausência de resíduos de ácido siálico terminais (NANA) é um fa-tor que leva à taxas de exposição aumentadas da corrente sangüínea. Nes-se Exemplo, são apresentados dados indicando que a galactose terminaltambém proporciona alguma proteção contra clearance rápida.

Um parâmetro primário usado para avaliar glicosilação é a pro-porção molar de NANA: proteína de CTLA4-lg. Estudos de PK de macacotinham mostrado que clearance aceitável poderia ser obtida usando molécu-las de CTLA4-lg com uma proporção de NANA de 6,9. O primeiro Lote deMaterial de Processo Y de CTLA4-lg (composição de CTLA4-lg obtida doProcesso Y) testado em macacos tinha uma proporção de NANA de 7,1.Surpreendentemente, descobriu-se que ele era eliminado duas vezes tãorapidamente quanto o material de CTLA4-lg com uma proporção de NANAde 6,9. Uma revisão da análise de monossacarídeo das duas amostras indi-cou que o Material do Processo X tinha significativamente mais galactose doque o Processo com material de CD-CHO. Um processo foi desenvolvido, oqual incluía galactose na alimentação (CD-CH01). A CTLA4-lg produzidaatravés desse Processo tinha níveis de galactose e ácido siálico maiores doque o material do Processo Y. Os dados analíticos e de PK para material doProcesso com CD-CH01 são discutidos abaixo e comparados com o materi-al do Processo Y e do Processo X.

Métodos analíticos

O ensaio de perfil de carboidrato consiste na remoção enzimáti-ca das estruturas de carboidrato inteiras e sua separação através de croma-tografia de troca de ânions. Os picos de carboidrato se decompõem em qua-tro ou cinco agrupamentos ("domínios") baseado grandemente no númerode resíduos de ácido siálico em cada estrutura. O Domínio I é grandementeasialilado, o Domínio Il é monossialilado, o Domínio Ill é dissialilado, o Do-mínio IV é trissialilado e o Domínio V é tetrassialilado. A área sob cada picoou o Domínio pode ser determinado e reportada como um percentual da á-rea total sob todos os picos.

A taxa de clearance foi determinada através de injeção em tripli-cata em macacos de 10 mg/kg de CTLA4-lg, então, acompanhando a dimi-nuição da concentração no soro durante um período de 28 dias. A taxa declearance está relacionada á "área sob a curva" medida ou AUC. A AUC es-tá relacionada à clearance, uma maior taxa de clearance está relacionada auma menor AUC e uma menor taxa de clearance a um maior valor de AUC.Valores maiores representam clearance mais lenta de CTLA4-lg.

A figura 50 representa várias das muitas estruturas de carboidra-to N-Iigado encontradas em proteínas de mamífero. Todas as cadeias com-partilham uma estrutura central em comum contendo dois resíduos de Glc-NAc e três de manose. A partir desse núcleo, duas a quatro cadeias se es-tendem, consistindo em uma de três estruturas: -GIcNAc-GaI-NANA, -GIcNAc-GaI ou -GIcNAc (FIG. 50, estruturas (1), (2) e (3)). Admite-se que oácido siálico terminal (NANA) é responsável pela redução da clearance daproteína da corrente sangüínea. Foi uma surpresa verificar que a taxa declearance de CTLA4-lg duplicou em um estudo de PK de macaco (Tabela56), mesmo embora a proporção de NANA permanecesse a mesma (Tabela56 - amostras CTLA4-lg S1 e CTLA4-lg (-) Gal, respectivamente, na figuras51-52). Uma diferença observada entre as amostras, preparadas em diferen-tes meios, foi a proporção de galactose-para-proteína, a qual era significati-vamente maior na amostra preparada através do processo X do que atravésdo processo Y (CTLA4-lg). Isso sugeriu que a taxa de clearance foi primari-amente determinada pelos resíduos de GIcNAc terminais e que a galactoseterminal poderia proporcionar alguma proteção. Para aumentar a galactosi-lação de CTLA4-lg, galactose foi adicionada à alimentação para o ProcessoΥ. O novo Processo (CD-CH01; CTLA4-lg S2 na FIGS 51-52) aumentousignificativamente a galactose e proporções molares de NANA da CTLA4-lgno biorreatores.

Outros estudos de PK de macaco foram realizados. Esses incluí-ram produto de CTLA4-lg produzido através dos três diferente processes(Processo X, Processo Yeo Processo com CD-CH01; CTLA4-lg S1, C-TLA4-lg (-) Gal e CTLA4-lg S2, respectivamente na figuras 51-52). Além dis-so, CTLA4-lg com uma proporção muito baixa de NANA (recuperada de umaetapa de lavagem no procedimento de purificação; veja figura 62) foi testada.

Os dados analíticos e de P de todas as amostras testadas até o momentosão compilados na Tabela 56. No estudo de PK mais recente (Tabela 56),CTLA4-lg produzida a partir de uma operação de fermentação pelo ProcessoY prolongado (CTLA4-lg S3) foi avaliada.

A figura 51 mostra a correlação entre a proporção de NANA e osvalores de AUC em PK de macaco para todas as amostras nos quatro estu-dos. As amostras preparadas através do Processo Y (veja CTLA4-lg (-) Galna figura 51) e do Processo com CD-CH01 (CTLA4-lg S2 na figura 51) mos-traram uma forte correlação entre esses parâmetros, indicando que a pro-porção de NANA tem um impacto significativo sobre ataxa de clearance deCTLA4lg. Análise da tendência para esses pontos indica que, em NANA = 9,CTLA4-lg preparada através do Processo Y (CTLA4-lg (-) Gal) ou CD-CH01(CTLA4-lg S2) será eliminada em cerca da mesma taxa que o material deProcesso X CTLA4-lg S1). Redução da proporção de NANA para 8 reduz aAUC no PK de macaco em de cerca de 25%, enquanto que aumento da pro-porção para 10 aumenta a AUC em cerca de 25%. Embora haja uma fortecorrelação entre NANA e AUC dentro do contexto dos Processos Y (CTLA4-Ig (-) Gal) e CD-CH01 (CTLA4-lg S2), é importante lembrar que NANA = 7para material X (CTLA4-lg S1) com a mesma taxa de clearance que o mate-rial CD-CH01 (CTLA4-lg S2) com uma proporção de NANA de 9. Portanto, aproporção de NANA não é unicamente responsável pela determinação dataxa de clearance de CTLA4-lg.

Tabela 56. Avaliação de Carboidrato de CTLA4-lg. M-1 indicaque o Material de CTLA4-lg foi analisado usando o Método 1, M-2 indica queo Material de CTLA4-lg foi analisado usando um método ligeiramente dife-rente, Método 2, "PA" indica que o material que é uma amostra purificadaem proteína A do caldo de fermentação.<table>table see original document page 560</column></row><table><table>table see original document page 561</column></row><table>

<table>table see original document page 561</column></row><table><table>table see original document page 562</column></row><table>

Outro estudo de PK de macaco (Tabela 56) foi realizado paracomparar as taxas de clearance de CTLA4lg produzida através dos três dife-rentes processos (Processo X, Processo Y e Processo com CD-CH01). A-lém disso, CTLA4lg com uma proporção muito baixa de NANA (recuperadade uma etapa de lavagem no procedimento de purificação (PA)) foi incluídano estudo. CTLA4lg preparada através do Processo com CD-CHO em bior-reatores de 50L ou 5000L tinha proporções molares de NANA próximas doMaterial do Processo X e, no estudo de PK, ambos tinham valores de AUCde cerca de metade o valor do processo X. CTLA4lg produzida através doProcesso com CD-CH01 tinha uma maior proporção de NANA do que o ma-terial de Processo X (9,9 vs. 6,9) e um valor de AUC cerca de 30% maior,indicando uma taxa de clearance mais lenta. O material de lavagem pobre-mente sialilado e galactosilado (NANA = 2,3) foi eliminado extremamenterápido (AUC = 2337 hora-pg/ml vs. 15753 para o material de Processo X).

Outro estudo de PK de macaco (Tabela 56) comparou CTLA4lgpreparada através do Processo com CD-CH01 em biorreatores de 5.000 L ecoletada em diferentes dias. Durante o curso da operação de fermentação, aproporção de NANA, tipicamente, picos em torno do Dia 8, então, declinagradualmente. A partir de duas operações, alíquotas foram removidos nos Dias 12, 14 e 16, então, purificadas. Após purificação, as proporções deNANA oscilavam de 8,8 a 10,0. Nos Dias 12 e 14, amostras (NANA = 9,8 e10,0 respectivamente) tinham valores de AUC 20-30% maiores do que o ma-terial de Processo X. No Dia 16, a amostra (NANA = 8,8) tinha um valor deAUC quase idêntico ao material de Processo X.

Outra ferramenta analítica para avaliar a glicosilação de CTLA4-Ig é o perfil de carboidrato. Estruturas de carboidrato N-Iigado inteiras sãoenzimaticamente removidas e separadas através de HPLC de troca de â-nions. Um grande número de picos são gerados, os quais se decompõemem quatro ou cinco domínios (veja figuras 58-62). Os Domínios I e Il são es-truturas grandemente asialiladas e monossialiladas, enquanto que os Domí-nios Ill e IV e V são estruturas grandemente di- e tri- e tetrassialiladas.

Foi empiricamente observado que o percentual do perfil total nosDomínios Ill e IV se correlacionava bem com a AUC para todas as amostras,incluindo o material de Processo X (FIG. 52). Espera-se que a maioria dasestruturas nesses domínios sejam totalmente sialiladas e galactosiladas.Usando dados do grupo M-1, um percentual de Domínio Ill e IV de cerca de29% deverá ter a mesma taxa de clearance conforme o material de Proces-so X. Os dados dos Domínios Ill e IV a partir do Método 2 são, tipicamente,cerca de 4% menores (21% vs. 25%) do que os dados gerados através doMétodo 1.

Além disso, também foi observado que o percentual do perfil to-tal no Domínios I e Il se correlacionava bem com a AUC para todas as a-mostras (FIG. 57). Espera-se que a maioria das estruturas nesses domíniossejam estruturas grandemente asialiladas e monossialiladas. A figura 57mostra que a taxa de clearance foi maior nas amostras com um menor per-centual dos Domínios Iell versus aquelas amostras com um maior percen-tual dos Domínios I e II. A glicosilação diminuída dos Domínios I e Il se cor-relaciona com a presença presumivelmente aumentada de peptídeos glicosi-lados no Domínios Ill e IV.

Embora a proporção molar de ácido siálico para proteína tenhasido tradicionalmente usada para prever a taxa de clearance para CTLA4lg,diferentes meios de fermentação têm produzido moléculas com a mesmaproporção de NANA, mas diferentes taxas de clearance em estudos de PKde macaco. Para desenvolver uma melhor forma de prever as taxas de clea-rance, dois outros conjuntos de dados analíticos (análise de monossacarídeoe perfil de carboidrato) foram avaliados e comparados com dados de PK demacaco. O parâmetro analítico mais previsível foi a extensão de galactosila-ção de CTLA4lg. Para reduzir a variabilidade analítica desse ensaio, a pro-porção molar de galactose foi normalizada para a proporção molar de mano-se. A proporção de Gal:Man resultante se correlacionava bem com os resul-tados de AUC do estudo de PK de macaco para todas as amostras, incluin-do o material de Processo X. Esse resultado é consistente com um modeloem que a taxa de clearance de CTLA4lg é primariamente determinada pelonúmero de resíduos de GIcNAc terminais expostos sobre a molécula. Seesse modelo está correto, a extensão de galactosilação poderia prever astaxas de clearance melhor do que a sialilação. Para assegurar que compa-rabilidade farmacocinética (AUC > 75% de material do Processo X), umaespecificação para uma proporção de galactose para manose de Gal: Man >0,65 é recomendada para Substância de Fármaco de CTLA4-lg bruta purifi-cada (BDS).

Quando apenas material preparado através do Processo Y ouProcesso com CD-CH01 é analisado, a proporção molar de NANA para pro-teína pode prever as taxas de clearance precisamente. Essa relação não seaplica, contudo, ao material preparado através do Processo X. Para sercomparável ao Material do Processo X, CTLA4-lg preparada através do Pro-cesso Y ou do Processo com CD-CH01 deve ter uma proporção de NANA 2unidades maior (NANA = 9 para CD-CH01 é comparável com NANA = 7para o Material do Processo X). Em virtude do fato de o ensaio de ácido siá-lico ser preciso e ter um rápido tempo de operação, ele é útil como uma fer-ramenta analítica em-Processo para monitorar a qualidade da CTLA4lg du-rante a operação de fermentação.

Para manter farmacocinética comparável (AUC > 75% da refe-rência), uma especificação de NANA > 8 é recomendada para BDS purifica-da. Esse valor também representa um alvo razoável para coleta das opera-ções de fermentação. Em virtude do fato de o processo de purificação au-mentar a proporção de ácido siálico em pelo menos 2 unidades, ajuste doalvo de coleta em NANA = 8 assegurará um valor de coleta real de pelo me-nos NANA = 7. O processo de purificação aumenta esse valor para pelo me-nos NANA = 9, o qual é comparável com o material de Processo X e bemacima da especificação mínima recomendada antes mencionada da BDS.

O perfil de carboidrato também preveu os resultados de PK demacaco para Material de Processo X e Material de Processo Y quando aárea percentual sob os Domínios Ill e IV foi comparada com a AUC. Os Do-mínios Ill e IV consistem grandemente em estruturas de carboidrato total-mente sialiladas e galactosiladas.

Os dados na Tabela 56 podem ser ainda apresentados de modoa mostrar uma correlação entre um valor de AUC, o valor de NANA, o valorde Gal e o percentual total da soma da AUC dos Domínios Il e IV. Veja abai-xo:<table>table see original document page 566</column></row><table>

Essa tabela acima mostra que há uma correlação entre a somados Domínios Ill (e IV) e os resultados de PK da composição. A AUC dosDomínios Ill e IV e V são diretamente relacionadas à proporção molar deNANA e Gal para mois de proteína de CTLA4-lg. Portanto, a invenção pro-porciona composições caracterizadas pelo fato de que seu perfil de carboi-drato contém a soma dos Domínios Ill e IV ou a soma dos Domínios III1 IV eV de 18 a cerca de 37 AUC %. Em uma modalidade, a soma dos DomíniosII, IV e V é cerca de 19 a cerca de 36, é cerca de 20 a cerca de 35, é cerca de 21 a cerca de 34, é cerca de 22 a cerca de 33, é cerca de 23 a cerca de32, é cerca de 24 a cerca de 31, é cerca de 25 a cerca de 30, é cerca de 26a cerca de 29, é cerca de 27 a cerca de 28 AUC %. Em uma modalidade, ainvenção proporciona Composições de CTLA4-lg caracterizadas pelo fato deque o Domínio Ill tem uma AUC % do total de 19 ± 4; e o Domínio IV temuma AUC % do total de 7 ± 4.

Exemplo 43: Mapeamento tríptico de peptideo de CTLA4-lg

CTLA4-lg derivada de células de Ovário de Hamster Chinês(CHO) transfectadas é uma glicoproteína com uma massa molecular de a -proximadamente 92500 Dáltons. Mapeamento peptídico é um método alta-mente sensível para determinação da identidade da estrutura primária deuma proteína e é útil na detecção de modificações pós-traducionais. A prote-ína é desnaturada usando guanidina-HCI, reduzida e alquilada usando DTTe IAA. A proteína é dessalinizada usando colunas NAP-5 e a mistura digeri-da é analisada através de cromatografia de fase reversa (C18). Detecção depico é feita através de absorbância de UV a 215 nm.

REAGENTES: Solução de Fase móvel A (ácido trifluoroacético a0,02 % (TFA) em Água (v/v)); solução de Fase móvel B (TFA a 0,02% emACN a 95% (AcetonitriIa) e 5 % de água (v/v)); agente de alquilação (iodoa-cetamida a 200 mM (IAA)); Tampão de diluição (TRIS a 100 mM, NaCI a 25mM, pH de 8,0); Tampão de desnaturação (guanidina a 8 M, TRIS a 50 mM,pH de 8,0); Tampão de Digestão (TRIS a 50 mM, CaCI2 a 10 mM, pH de8,0); Agente de Redução (DTT a 100 mM).

INSTRUMENTAÇÃO: (instrumentação equivalente pode ser u-sada) colunas NAP-5 (Amersham, cat. N0 17-0853-02); Aquecedor paracoluna de HPLC; Waters System Alliance HPLC com aquecedor de coluna edetector de UV.

Redução e Alquilação: Amostras (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig1 padrões, etc.) foram diluídas para 10 mg/ml através da adição de águapara um volume final de 100 μL. (1 mg). 560 μΙ de tampão de desnaturação e35 μL de Agente de Redução (DTT a 100 mM) foram adicionados à amos-tras de 100 μL, misturados e centrifugados em uma microcentrífuga durante 3segundos. As amostras foram, então, incubadas a 50°C durante 20 minutos± 2 minutos. 35 μL de agente de alquilação (IAA a 200 mM) foram, então,adicionados a cada amostra e novamente as amostras foram misturadas ecentrifugadas em uma microcentrífuga durante 3 segundos. As amostrasforam subseqüentemente incubadas a 50°C durante 20 min. ± 2 minutos, noescuro. Após as colunas NAP-5 terem sido equilibradas entornando 3 volu-mes de coluna (cerca de 7-8 mL) de Tampão de Digestão, 500 μL das mistu-ras reduzidas e alquiladas foram entornadas sobre as colunas NAP-5, permi-tindo que o líquido drenasse através da coluna. As amostras foram, então,coletadas das colunas NAP-5 via eluição da amostra da coluna com 1 mL deTampão de Digestão.

Digestão: Amostras foram digeridas com 20 μί de tripsina (0,5μg/μL) em um banho de água a 38°C durante 4 horas (+ 0,5 hora). Quandode término da digestão, as amostras foram acidificada com 2,5 μΙ_ de TFA.As amostras foram, então, colocadas em frascos para amostrador automáti-co para subsequente análise.

Método de Instrumento: O método do instrumento é mostrado abaixo:

<table>table see original document page 568</column></row><table>

A coluna foi equilibrada com 100% tampão de fase móvel A du-rante 25 minutos antes das primeiras injeções. A absorbância de UV foi mo-nitorada a 215 nm enquanto a temperatura da coluna foi mantida a 37°C e atemperatura do amostrador automático a 4°C. Placebo de tampão de fasemóvel A foi operado antes do primeiro Padrão de Adequabilidade de Siste- ma, seguido por uma única injeção de 50 μΙ_ de cada amostra. Uma injeçãode Material de Referência deverá estar entre faixas a cada seis injeções deamostra. O cromatograma por mapeamento peptídico gerado para uma a-mostra de CTLA4-lg é representado pela figura 53. As diferenças de tempode retenção para os picos T2, T3, T15 e T19 (figura 53 e Tabela 57) entre oscromatogramas de Material de Referência inicial e entre faixas devem ser±0,5 min.

Tabela 57. Fragmentos teoricamente esperados de CTLA4-lg Digeridacom Tripsina

<table>table see original document page 568</column></row><table><table>table see original document page 569</column></row><table>

* Contém carboidrato N Ligado ** Contém carboidrato O Ligado

Número de placas teóricas: Eficiência de coluna, avaliada comoo número de placas teóricas, pode ser medida quantitativamente usando otempo de retenção e a largura de pico de acordo com a Equação:

<formula>formula see original document page 569</formula>

onde:

"w" é a largura de pico na linha de base medida através de ex-trapolação dos lados relativamente retos para a linha de base, "t" é o tempode retenção do pico medida a partir do momento de injeção até o momentode eluição do pico máximo.

Se N <50000, re-equilibrar a coluna.

Resolução: A resolução (R) entre 2 picos, por exemplo, picoT30 e pico T12 conforme indicado na figura 53, pode ser determinada usan-do a seguinte equação:<formula>formula see original document page 570</formula>

onde:

t1, t2 = tempos de retenção de pico dos fragmentos T30 epico T12, respectivamente

wi, W2 = largura de pico tangente-definida na linha de basedos picos com tempos de retenção ti e t2, respecti-vamente.

Se R < 1,5, a coluna deverá ser re-equilibrada e se o problemapersiste, a coluna deverá ser substituída.Valores exemplificativos:

A diferença entre as áreas de pico relativas para os picos T3,T15 e T19 no artigo de teste e Material de Referência deve ser <10,0%. AÁrea de pico relativa de um pico é definida como a área de pico expressacomo um percentual da área de pico de pico T2. A diferença entre as áreasde pico relativas do artigo de teste e a referência de Adequabilidade de sis- tema inicial é obtida conforme mostrado abaixo. A Área de pico relativa (Rsx)pode ser calculada para cada um dos picos T3, T15 e T19 no cromatogramado artigo de teste usando a fórmula:

<formula>formula see original document page 570</formula>

onde:

Rsx = Área de pico relativa do pico X no cromatograma

Asx = área de pico X na amostra e

As2 = área de pico T2 na amostra.

Similarmente, as áreas de pico relativas (Rrx) podem ser calcu-ladas para cada um dos picos T3, T15 e T19 no cromatograma-padrão. Adiferença entre as áreas de pico relativas na amostra e no padrão (DX) podesubseqüentemente calculada usando a fórmula:

Dx = [(Rsx-RRX)/(Rrx)HOOSe um único pico adicional está presente na amostra, a altura depico relativa para esse pico, quando comparado com pico T11, pode ser de-terminada através de uso da seguinte fórmula:

Altura de pico relativa Rt = (HT/Hn)*100 ondeHj = altura do pico com tempo de retenção t minHn = altura de pico T11, o pico mais alto no cromatograma.Em uma modalidade, se a altura de pico relativa do novo pico é<5,0%, então, o perfil é considerado como sendo consistente com o perfil depadrão de CTLA4-lg. Se a altura de pico relativa do novo pico é >5,0%, en-tão, o perfil é considerado como sendo consistente com o perfil do material-padrão de CTAL4-lg.

Os dados de oxidação percentual foram adquiridos usando umensaio de mapeamento tríptico por RP-HPLC que quantifica a área de oxi-dação percentual de Met85 na proteína para sulfóxido de metionina. Oxida-ção percentual no método é obtida através de medição por UV das áreas depico no mapeamento tríptico por RP-HPLC para o peptídeo tríptico T6, com-preendido dos resíduos 84-93 contendo Met85 e o peptídeo tríptico oxidadocorrespondente, T6ox, contendo Met(0)85. A área de oxidação percentualde Met85 em Met(0)85 é proporcional á área percentual do pico de T6ox:Oxidação percentual = 100 * Ατβοχ/ (At6ox + Ατβ)

onde,

Ατβ = área de pico para peptídeo tríptico T6, (84-93).Ατβοχ = área de pico para peptídeo tríptico T6ox, Met(0)85(84-93).

Os dados de deamidação percentual foi adquiridos usando umensaio de mapeamento tríptico por RP-HPLC que quantifica a área de oxi-dação percentual de deamidação no ensaio são obtidos através de mediçãopor UV das áreas de pico no mapeamento tríptico por RP-HPLC para o pep-tídeo tríptico T26, compreendido dos resíduos 281-302 contendo Asn294 edo peptídeo tríptico desamidado correspondente, T26deam1, contendo iso-Asp294. A área percentual de deamidação de Asn294 para isoAsp294, en-tão, é proporcional à área percentual do pico de T26deam1:

<formula>formula see original document page 571</formula>

ÁT26 + AT26deaml + ÁT26deam2 + Ar26deam3 + AT26djeaaii4

onde,

At26 = área de pico para T26, (281-302)AT26deami = área de pico para T26deam1, isoAsp294(281-302).AT26deam2 = área de pico para T26deam2, Asp299(281-302).AT26deam3 = área de pico para T26deam3, Asp294(281-302).AT26deam4 = área de pico para T26deam4, Asu294(281-302).EXEMPLO 44: Definição de perfil de carboidrato N-Iiqado de oligossa-

carideo de CTLA4-lg através de cromatografia de troca de ânions deelevado desempenho com Detecção eletroquímica

As estruturas de carboidrato presentes sobre glicoproteínas po-dem afetar sua função e clearance in vivo. Portanto, é importante monitorara consistência estrutural dos carboidratos de bateladas recombinantementeproduzidos de glicoproteínas. CTLA4-lg é uma proteína recombinante con-tendo sítios de glicosilação N Ligados e O Ligados (serina Ligados). Aqui,carboidratos N Ligados (asparagina-ligados) presentes sobre CTLA4-lg sãomonitorados. Nesse método, oligossacarídeos são clivados através de di-gestão enzimática com PNGase F (Peptídeo: N-Glicosidase F), então, isola-dos através de HPLC de fase reversa em um sistema com duas colunas,separados através de cromatografia de troca de ânions de elevado desem-penho (HPAEC) e monitorados através de detecção eletroquímica (ampero-metria integrada). O cromatograma gerado é o perfil de carboidrato N Liga-do, em que perfis de amostras de CTLA4-lg deverão ser similar ao mesmo.

Esse método descreve o procedimento para determinar o perfilde oligossacarídeo por HPAEC dos oligossacarídeos N Ligados liberadosdas amostras de CTLA4-lg. A finalidade do método é proporcionar perfiscromatográficos de oligossacarídeos N Ligados de Substância de Fármacode CTLA4-lg, o qual pode ser usado para análise comparativa. A glicosilaçãosobre a CTLA4-lg contém oligossacarídeos N Ligados. Esses oligossacarí-deos são liberados através de hidrólise enzimática com PNGase F durante ocurso de 22 horas. O perfil dos oligossacarídeos livres é obtido usando cro-matografia de troca de ânions em pH elevado empregando detecção eletro-química. Perfis de oligossacarídeo de Substância de Fármaco são avaliadoscontra amostras de Material de Referência concorrentemente operadas. Osresultados são reportados como desvio percentual de domínios e picos sele-cionados dos mesmos picos nos padrões de referência.<table>table see original document page 573</column></row><table>

MATERIAIS. Materiais equivalentes podem ser substituídos, a menos quede outro modo especificado.

Frascos de recuperação total Waters comsepto de silicone/PTFE ligado

Dispositivos de filtração Microcon YM 10CentrifugaiRapiGest SF

Waters Corporation, Catálogo No.186000234

Millipore, Catálogo No. 42407

Waters Corporation, Catálogo No.186001861

INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES. Instrumentação equivalente pode ser

usada, a menos que de outro modo especificado.

Instrumentação:

Sistema Alliance HPLC equipado Waters Corporationcom: Amostrador automático (refri-gerado), Eluent Degas ModuleDetector eletroquímico modelo 2465Coluna: CarboPac PA-1 4 χ 250 mmColuna de proteção: CarboPac PA-14 χ 50 mm

Sistema de coleta de dados Empo-

Dionex Corporation, Catálogo No. 35391Dionex Corporation, Catálogo No. 43096

Versão 3.2 ou versão BMS validada atual werCondições de cromatografia para perfil de oligossacarídeo atra-vés de cromatografia de troca de íons.

Temperatura da colunaTaxa de fluxo

Fases móveis e condições degradiente

1: NaOAca 500 mM2: NaOH a 400 mM3: Água com grau para HPLC

29 °C1 mL/min

Programa de gradiente

Time (min) %1 %2 %3Inicial 0 30 700,0 0 30 7011,0 0 30 7012,0 4 30 6620,0 10 30 6080,0 45 30 2581,0 0 30 70100 0 30 70

Ajustes do Waters 2465

Modo Pulso

Ajustes do Empower Faixa = 5μΑ

E1 = +0,05V E2 = +0.75V E3 = -O115Vt1 = 400 mseg t2 = 200 mseg t3 = 400 msegtempo de amostragem (ts) = 100 msegConstante de tempo (filtro) t = 0,1 segFaixa de offset = 5%Polaridade +Temperatura = 29°C

NOTA: Equilibrar a coluna e detector com a fase móvel inicial na taxa defluxo de análise durante aproximadamente 2 horas ou até a linha de baseestar estável antes de fazer injeções.

Temperatura do amostrador automático ajustada para:Volume de injeçãoTempo de operação

Tempos de retenção aproximados (RT; minutos) depicos dominantes em cada Domínio (veja figura 1);valores podem variar, dependendo do RT do Padrãode Adequabilidade de Sistema (SS)

SS:

Pico 1APico 1BPico 1CPico 1DPico 1EPico 2Pico 3:Pico 4:

4 0C60 μΐ

100 minutos

RTs aproximados (min)18,520,020,821,4

22.423,1

31.544,858,5Limpeza de eletrodo (Waters 2465). Seguir as instruções delimpeza no manual do detector. Usar a pasta fluida diamante fornecida no kitda célula de fluxo para polir a superfície do(s) eletrodo(s). Se polimento nãoproporciona resultados aceitáveis, substituir os eletrodos por um novo kit decélula de fluxo. Remonta a célula de fluxo usando um novo espaçador (50μm).

REAGENTES

NOTA: Rotular e documentar todos os preparados de reagente de acordocom os procedimentos do departamento.

Preparo de Fases móveis para definição de perfil de carboidratode oligossacarídeo por HPAEC.

Eluente 1 de HPAEC: acetato de sódio a 500 mM (NaOAc).Pesar 20,51 ± 0,05 g de Acetato de sódio (anídrico) em um cilindro graduadode 500 ml_ contendo 400 mL de água com grau para HPLC. Levar o volumepara 500 mL com água com grau para HPLC e agitar durante 5 minutos u-sando uma pipeta sorológica de plástico até completamente misturado. Fil-trar a solução através de a 0,2 μηι nylon filtro. Transferir para uma garrafa deeluente de 1 L. Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar asolução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.

Eluente 2 de HPAEC: hidróxido de sódio a 400 mM (NaOH).Usando um cilindro graduado de 1 L, medir 960 mL de água com grau paraHPLC e transferir para uma garrafa de eluente de 1 L limpa. Usando umapipeta sorológica de plástico, adicionar 40,0 mL de NaOH a 10 N diretamen-te na garrafa de eluente e misturar o eluente através de turbilhonamento.Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20 minutos. Aper-tar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em tem-peratura ambiente sob hélio durante até três semanas.

Tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a0,02%, pH = 7,5. Azida de sódio (NaN3) deverá ser manipulada com cuidadopara evitar inalação (tóxica) e contato com a pele (irritante). Consultar a folhade MSDS para requisitos adicionais. Após pesagem de NaN3l a área da ba-lança deverá ser totalmente limpa.

NaH2PO4 ± H2O 6,9 g

Na N3 0,2 g

H2O volume final de 1,0 litroPesar 6,9 g ± 0,1 g de NaH2PO4 ± H2O e 0,2 g NaN3 e dissolverem 800 mL de H2O com grau para HPLC em uma garrafa de reagente usan-do mistura contínua com uma barra de agitação. Usando um medidor de pH,ajustar o pH da solução para 7,5 usando NaOH a 10 M. Levar o volume finalpara 1,0 litro usando um cilindro graduado de 1 L. Armazenar a solução emtemperatura ambiente durante até seis meses.

Solução de trabalho de enzima PNGase F em tampão de fos-fato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5.tampão de fosfato de sódio a 50 mMazida de sódio a 0,02%, pH = 7,5, 1,8 mLPNGase F do kit, Catálogo No. P0704L, 0,2 mL

Pipetear 1,8 mL de tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azidade sódio a 0,02%, pH de 7,5 em um frasco criogênico de 1,8 mL. Adicionar0,2 mL de PNGase F do kit e misturar totalmente. Armazenar a solução a-20°C ou pelo menos durante até seis meses. A solução pode ser transfor-mada em alíquotas antes do congelamento.

Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo. Solução deestoque de estaquiose (1,25 mg/mL): Pesar 0,125 g de Estaquiose sobre umpapel de pesagem. Usar uma balança analítica e transferir para um frascovolumétrico de 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLCe misturar totalmente. Transformar em alíquotas em porções de 2 mL emcriofrascos Nalgene. Armazenar a solução a -20°C ou pelo menos duranteaté seis meses.

Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose (12,5µg/?t??-): Pipetear 1 mL do estoque a 1,25 mg/mL em um frasco volumétricode 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLC e misturartotalmente. Transformar em alíquotas porções de 200 µl em tubos para mi-crocentrífuga de 0,65 mL. Colocar os tubos em uma caixa de armazenamen-to apropriadamente rotulada. Armazenar a Solução de Adequabilidade deSistema a -20°C ou pelo menos durante até seis meses.

Preparo de padrão e amostra

Preparo de Material de Referência. A um frasco contendo 1 mgde RapiGest SF liofilizado, adicionar 625 µl de tampão de fosfato de Na a50 mM contendo azida de Na a 0,02%, pH de 7,5,

NOTA: Um único reservatório de RapiGest SF contendo tampão deverá serusado para todas as amostras dentro do conjunto de amostra. Vários frascosde RapiGest SF podem ser reconstituídos e combinados para proporcionarum volume adequado.

A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adicionar 120 µl do tam-pão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 µl de Material de Referência (~ 50mg/mL). A concentração final de RapiGest SF deverá ser de 0,12% peso/v.Adicionar 40 µl da solução de trabalho de PNGase F, misturar totalmente,centrifugar a amostra e colocar a 38 + 2°C durante 22 ± 2 horas (banho deágua ou o compartimento do amostrador automático Alliance). Pipetear aamostra em um filtro para centrífuga Microcon YM-100 e centrifugar a 13.000 gdurante 30 minutos. Colocar 200 µl de água para HPLC no filtro e enxaguaro filtrado através de centrifugação durante mais 30 minutos a 13.000 g.Submeter o filtrado combinado a turbilhonamento durante 15 segundos ecentrifugar a amostra durante 10 segundos. Usando uma pipeta, transferir asolução resultante (~ 380 µl) para um frasco para amostrador automático deHPLC de recuperação total.

Preparo de amostra: A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adi-cionar 120 µl do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 µl de amos-tra de proteína (esse volume deverá ser igual a entre 1 e 2 mg de CTLA4-lg).A concentração final de RapiGest SF deverá ser de 0,12% peso/v. Adicionar40 μL da solução de trabalho de PNGase F misturar totalmente através deturbilhonamento durante 10 segundos. Centrifugar a amostra e colocar a38 ± 2°C durante 22 + 2 horas (banho de água ou o compartimento do amos-trador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro para centrífugaMicrocon YM-100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Colocar 200μL de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através de centrifuga-ção durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado combinado aturbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra durante 10segundos. Transferir a solução resultante (~ 380 uL) para um frasco paraamostrador automático de HPLC de recuperação total.

Estabilização da célula do detector eletroquímico: Injetar 30μl do Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo de Estaquiose (12,5μg/mL). Assegurar que a altura de pico para estaquiose é > 800 nA. Assegu-rar que não há interferência elétrica excessiva da célula e que a linha de ba-se é uniforme. Se a sensibilidade à estaquiose ou a linha de base é inaceitá-vel, verificar a composição de tampão, limpar o eletrodo ou substituir o ele-trodo. Se interferência excessiva está presente, verificar a célula para asse-gurar remoção de todas as bolhas de ar. Re-estabilizar a célula e reinjetarpadrão de estaquiose. Se os problemas persistirem, tomar outras atitudes oucontatar seu supervisor.

Placas teóricas (N): Determinar o número de placas teóricas(N) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito a-través do sistema de análise de dados Empower ou pode também ser feitomanualmente.

N = 16 <t / W)2

onde:

t: tempo de retenção medido a partir do momento de injeçãoaté o momento de eluição de pico na altura máxima

W: largura de pico através de extrapolação dos lados para alinha de base.

N : deve ser > 6000. Se a contagem de placa é menos de6000, ajustar o gradiente de operação ou substituir a coluna.

Fator de configuração (T): Determinar o fator de configuraçãode coluna (T) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Issoé feito através do sistema de análise de dados Empower ou pode tambémser feito manualmente.

<formula>formula see original document page 579</formula>

onde:

W0,05: largura de pico a 5% de altura (0,05h).

f: a medida (largura) da borda frontal de pico a VM0t05 para o ápicedo pico.

T deve ser < 1,2. Se o fator de configuração é maior do que 1,2,verificar a composição de tampão, substituir a coluna ou limpar a coluna ereinjetar Padrão de Adequabilidade de Sistema.

Verificação do Tempo de Retenção do Padrão de Adequabi-lidade de Sistema de Estaquiose: O tempo de retenção é dependente dosistema. O Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose deverá exi-bir um tempo de retenção de 18,5 ± 2,0 minutos.

Material de Referência de CTLA4-lg. Observar o perfil de car-boidrato do Material de Referência entre as primeiras faixas injetadas antesde injeção de amostras. O perfil de carboidrato deverá ser similar àquelemostrado na figura 68. Tempos de retenção absolutos são dependentes dosistema. Assegurar que a diferença nos tempos de retenção entre os primei-ros picos no Domínio I (Pico 1A) e o principal pico no Domínio Ill (Pico 3)está entre 22 minutos e 28 minutos. Se delineamento dos picos não se as-semelha àquele obtido na figura 68, tomar as atitudes apropriadas (por e-xemplo, verificar a função do instrumento, limpar a coluna, verificar/substituirtampões, substituir a coluna) e reavaliar. O procedimento a seguir pode serusado para limpar a coluna: desligar a célula e limpar a coluna com Eluente1 a 80%, Eluente 2 a 20% durante 5 minutos, seguido por Eluente 1 a 50%,Eluente 2 a 50% durante 10 minutos. Reequilibrar a coluna e célula (com acélula ligada) em condições iniciais e reavaliar.

SEQÜÊNCIA DE INJEÇÃO:Ajustar a seqüência de injeção dos oligossacarídeos isoladoscomo segue :

Padrão de estaquiose (30 μL)Material de Referência (60 μL)Amostra(s) (60 μL)Material de Referência (60 μL)

É recomendado que < cinco amostras sejam operadas entre in-jeções de Material de Referência entre as faixas.ANÁLISE DE DADOS:

Processamento de cromatogramas. Processar os cromato-gramas para o Material de Referência e amostras no Empower. Ajustar pa-râmetros de integração de modo que o delineamento de pico e a linha debase sejam similares àqueles mostrados na figura 68. Pode ser preciso co-locar as linhas de integração manualmente. Realizar cálculos para áreas deDomínio relativas e com relação áreas de pico (veja tabelas incluídas naBreve Descrição da figura 68 e ao final desse Exemplo). Determinar os valo-res médios para esses parâmetros para o Material de Referência e para ca-da amostra se injeções repetidas foram feitas.

Para o Material de Referência, determinar o desvio relativo paraos Domínios I, II, III, Picos 1A e 1B para cada réplica com relação à médiade todas as réplicas.

Comparar os Perfis de Amostra com perfis de Material de Refe-rência.

Comparação Visual. Determinar se as amostras e Material deReferência têm o mesmo número de Domínios e picos primários. Picos pri-mários são aqueles picos rotulados na descrição da figura 68 (Picos 1A, 1B,1C, 1D, 2, 3e4).

Comparação de Quantificação Relativa. Comparar as áreasrelativas de amostras (Domínios I, Il e Ill e Picos 1A e 1B; se injeções repeti-das de amostras foram feitas, usar seus valores médios) com as áreas rela-tivas médias das injeções de Material de Referência entre as faixas. Deter-minar a diferença relativa dessas áreas a partir dos valores médios de Mate-rial de Referência.

Cálculos

Área de Domínio % (Área de Domínio relativa): Calcular a á-rea de Domínio % para os Domínios dos perfis para o Material de Referênciae amostras. Refira-se à figura 68 para padrão de Áreas de Domínio. Seguin-do o exemplo na figura 68, calcular as proporções percentuais de domíniousando a informação e fórmula a seguir (tempos de retenção são dependen-tes do sistema e refletem os resultados na figura 68:

Domínio I: Soma das áreas de pico em tempos de retençãoaproximados de 18-24 minutos (Picos 1A-1E)

Domínio II: Soma dos picos de 26-38 minutos

Domínio III: Soma dos picos de 39-50 minutos

Domínio IV: Soma dos picos de 51-64 minutos

Domínio V Soma dos picos de 65-75 minutos

NOTA: Janelas de tempo de retenção para os domínios se des-viarão de acordo com variações no desempenho cromatográfico diário. Ajus-tar os tempos consequentemente.

Área de domínio individual

% da área de domínio ■=- X 100%

Soma de todas as áreas de domínio

Para o Domínios I—III, calcular também os valores médios nasinjeções de Material de Referência entre as faixas, bem como nas amostras,se injeções repetidas foram feitas.

% da área de pico (Área de pico relativa). Calcular a % da á-rea de pico para os Picos 1A, 1B, 1C e 3 dos perfis para o Material de Refe-rência e amostras. Refira-se à figura 68 para padrão de áreas de pico; tem-pos de retenção são dependentes do sistema. Calcular as proporções per-centuais de pico usando a informação e fórmula a seguir:

Área de pico individual

% da área de pico individual - X 100%

Soma de todas as áreas de domínio

Cálculo da diferença percentual dos valores médios de Ma-terial de Referência. Usar a seguinte fórmula para calcular as diferençaspercentuais nas áreas relativas médias dos Domínios I-III1 Picos 1A e 1B deamostras comparado com Material de Referência:Dif % = |RM-S|/RM χ 100onde:

RM = valor de área relativa média de interesse para Material deReferência

S = valor de área relativa média de interesse para a amostra

11 = valor absoluto

Resultados: Resultados que têm de ser reportados são a dife-rença percentual calculada do Material de Referência para o Domínio I, oDomínio II, o Domínio II, pico 1A e pico 1B. Incluir um cromatograma repre-sentativo integrado para o Material de Referência e a amostra. Incluir as á-reas percentuais relativas dos Domínios I-Ill e Picos 1A e 1B para um déci-mo de um por cento para amostra e Material de Referência (média de inje-ções entre faixas). Adicionalmente, para cada uma das injeções de Materialde Referência entre as faixas, as áreas de Domínio % para os Domínios I, Ile Ill e áreas de pico % para os Picos 1A e 1B deverão estar dentro de 15%de seus valores médios.

As figuras 57-62, 68, 76 e 82-84 mostram dados resultantes dosperfis de oligossacarídeo N-Iigado conforme descrito aqui. A figura 68 repre-senta um perfil de oligossacarídeo N Ligado típico (Domínios I, II, III, IV e V ePicos 1A e 1B dentro de 5% das médias de lote). Picos 1A, 1B e 1C repre-sentam as estruturas de oligossacarídeo N Ligado de GO, G1 e G2.<table>table see original document page 583</column></row><table> A figura 68 mostra um perfil de carboidrato N ligado típico paracomposição de CTLA4-lg.

A tabela diretamente acima mostra dados tabulados para o perfilde oligossacarídeo N Ligado de CTLA4-lg.

A tabela diretamente abaixo mostra faixas observadas de C-TLA4-lg.

<table>table see original document page 583</column></row><table>

EXEMPLO 45: UM BIOENSAIO BASEADO EM CÉLULA IN-VITRO PARACTLA4-lq

Células T requerem dois sinais ou ativação e subsequente proli-feração. O primeiro sinal é proporcionado através da interação de um peptí-deo antigênico com o complexo TCR-CD3. O segundo sinal coestimulatórioocorre com a interação entre CD28 sobre a célula Tea proteína B7 sobrecélulas apresentando antígeno. Quando de recebimento desses dois sinais,células T secretam a citocina Interleucina 2 (IL-2). Liberação de IL-2 leva àativação e proliferação celular, CTLA4-lg, um composto imunossupressorsolúvel, também se liga à proteína B7 sobre células apresentado antígeno,assim, bloqueando a interação funcional com CD28 e prevenção do sinalcoestimulatório que é necessário para produção de IL-2.

Nesse método, Células T Jurkat transfectadas com o gene deluciferase, sob o controle do promotor de IL-2, são coestimuladas com Célu-Ias B de Daudi na presença de anti-CD3. A coestimulação ativa o promotorde IL-2 o qual, por sua vez, produz proteína de luciferase. O sinal Iumines-cente resultante é medido usando um Sistema de Ensaio de Luciferase.Nesse sistema, CTLA4-lg produz uma diminuição dose-dependente na ativi-dade de luciferase.

Esse método examina o efeito de CTLA4-lg sobre o sinal coes-timulatório necessário para produção de IL-2. A presença de CTLA4-lg solú-vel impede sinalização entre a célula T e células apresentando antígeno.Sem esse sinal, IL-2 não é produzida, assim, impedindo a expansão clonalde células T. Um vetor com o gene de luciferase foi criado usando o promo-tor de IL-2. As células T Jurkat foram, então, transfectadas com esse vetorrepórter. Um clone positivo, Jurkat.CA, foi selecionado e usado no método.

Esse bioensaio envolve estimulação de células T transfectadas(Jurkat.CA) com anti-CD3 e células B (Daudi). Coestimulação proporcionadapelas células B é inibida através da adição de CTLA4-lg. Jurkat.CA e célulasDaudi são cultivadas nas cavidades de uma lâmina com fundo plano, bran-ca, opaca com 96 cavidades e estimuladas com anti-CD3 na presença dediferente concentrações de CTLA4-lg. Após uma incubação de 16 a 20 ho-ras a 37°C, as cavidades são ensaiadas com relação à atividade de lucifera-se. Inibição de coestimulação através de CTLA4-lg é observada como umadiminuição dose-dependente na atividade de luciferase.

REAGENTES: Meio de cultura de células Daudi (soro fetal bovi-no a 10%, MEM piruvato de sódio a 1% em RPMI 1640); Meio de cultura decélula Jurkat.CA (soro de cabra a 10%, MEM piruvato de sódio a 1%, 400μg/mL de geneticina em RPMI 1640); Meio de bioensaio (0,2 μg/mL de anti-corpo anti-CD3 e solução de penicilina-estreptomicina a 1% em Meio de cul-tura de células Daudi); Solução de luciferase Bright-Glo do sistema de en-saio (Promega, Catálogo N0 E2620).INSTRUMENTAÇÃO: Nikon, microscópio invertido Diaphot 200;Luminômetro Packard TopCount NXT; Manipulador de líquido Tecan Gene-sis; Contador de células Coulter Vi-Cell; Zymark RapidPlate-96.Fluxograma de procedimento

Preparo de Soluções de trabalho: 3 ml_ de soluções de C-TLA4-lg (5000 ng/ml_) em meio de bioensaio.

Oito curvas de ponto foram preparadas para o padrão, controlede qualidade e amostras nas concentrações de 100, 4, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 e0,002 pg/mL de CTLA4-lg conforme mostrado na Tabela 58 abaixo para asconcentrações finais no ensaio, após diluição duas vezes na lâmina, de 50,2, 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05 e 0,001 μg/mLTabela 58. Diluições usadas para gerar Padrões de curva.

<table>table see original document page 586</column></row><table>

200.000 células foram adicionadas por cavidade de uma lâminacom 96 cavidades e foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 e umidade de85%. 12 χ 106 Células Jurkat.CA e 12 χ 10® células Daudi foram combinadasem um tubo para centrífuga estéril. As células foram centrifugadas a ~125 χg durante 10 minutos em temperatura ambiente e foram totalmente re-suspensas em 9 mL de Meio de cultura de células Daudi repetidamente pi-peteando gentilmente com uma pipeta sorológica até que mais nenhumgrumo de célula fosse visível, a fim de proporcionar uma concentração de2,7 x106 células/mL. 75 μL de cada solução da Tabela 58 foram adicionadosàs cavidades apropriadas de uma lâmina contendo células. A(s) lâmina(s)foram, então, vedada(s) com TopSeaI-A e incubada(s) a 37°C, 5% de CO2 eumidade de 85% durante 16 a 20 horas. Após as lâminas e solução de Iuci-ferase Bright-Glo terem sido equilibradas para a temperatura do instrumento,150 μl de solução de Iuciferase Bright-Glo foram adicionados a cada cavi-dade simultaneamente e foram misturados. A lâmina é, então, colocada noTopCount NXT imediatamente após mistura para equilíbrio no escuro duran-te 10 minutos. O sinal Iuminescente foi, então, medido em um TopCountNXT usando uma integração de 1 segundo por cavidade ou conforme apro-priado ao tipo particular de luminômetro usado.

O resultado do TopCount NXT foi registrado, lido em um pro-grama de análise-padrão e os dados foram transformados tomando seu lo-garitmo (base 10). Os dados transformados de cada artigo foram adaptadosa um modelo logístico com quatro parâmetros, conforme mostrado na equa-ção abaixo:<formula>formula see original document page 587</formula>

Equação 1:

onde:

Um F-teste R2 estatístico e com falta-de-adaptação pode sercalculado para cada artigo. Uma proporção do mínimo, máximo e declíniodos artigos de teste com relação ao material-padrão pode também ser calcu-lada. Além disso, intervalos de confiança para as proporções podem tambémser computados.

<formula>formula see original document page 587</formula>

Equação 2:

onde:

os parâmetros A, B e D são comuns à referência e artigo de tes-te e Cr é o parâmetro referência, Ca é o parâmetro artigo de teste e a pro-porção Cr/Ca é a potência relativa. O superscrito / é uma variável indicadora.Ele é ajustado em igual a 1 se os dados se originam do artigo de interesse eo se os dados se originam do Material de CTLA4-lg.

A média dos oito resultados de potência relativa de cada um dosoito conjuntos de dados analisados pode ser calculada e o desvio-padrãopode ser calculado usando a Equações 3 e 4, respectivamente. O resultadomédio é reportado como "potência relativa percentual" arredondado para onúmero inteiro mais próximo.Equação 3:

<formula>formula see original document page 588</formula>

Equação 4: Desvio-padrão = « 8(8-1)onde:

8 é o número de medições de potência

χ = medições individuais

Ajuste de Valores de potência relativa Obtidos com concen-trações aproximadas: Em virtude do "lag" de tempo entre recebimento daamostra e obtenção de uma concentração precisa de proteína, a amostrapode ser testada no ensaio em uma concentração aproximada e os resulta-dos ajustados quando a concentração precisa é determinada. Esse ajuste érealizado usando a Equação 5 abaixo, onde a potência relativa determinadano ensaio é multiplicada pela proporção da concentração de CTLA4-lg usa-da para ajustar o ensaio para a concentração determinada de CTLA4-lg naamostra.

Equação 5:

Potência relativa observada * concentração usada

Potência relativa reportável = -

Concentração determinada

Exemplo:

Amostra foi testada em uma concentração de proteína de 25mg/mL no ensaio.

Potência relativa determinada foi de 105%.

Concentração de CTLA4-lg determinada foi estabelecida comosendo de 25,5 mg/mL

Potência relativa reportável = (105 * 25) / 25,5 = 103%.

Os valores de potência relativa do artigo de teste devem estarentre 25 e 175% do padrão de referência, o qual é a faixa do ensaio. Se osvalores de potência relativa estão fora dessa faixa, então, a amostra deveser diluída ou concentrada de forma a cair dentro dessa faixa e a amostra re-analisada.

EXEMPLO 46: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE OLIGOSSACARÍ-DEOS O-LIGADOS

A glicosilação O Ligada de CTLA4-lg foi caracterizada por ma-peamento peptídico seguido por ESI-MS/MS e através de MALDI-TOF.Análise de T8 e T9 através de Mapeamento peptídico com ESI-MS/MS

Uma versão manual modificada do método de digestão trípticacom ESI-MS/MS in Iine usando um espectrômetro de massa Finnigan IonTrap foi realizada de forma a caracterizar glicopeptídeos O-Iigados T8 e T9(refira-se à Tabela 59 para identidade de peptídeo).

A figura 63 mostra o mapeamento tríptico de peptídeo de C-TLA4-lg, indicando que T8 elui ao final da frente de solvente e T9 elui emT27.

O espectro de massa total do peptídeo T8 é mostrado na figura64, onde o pico a 436,2 corresponde ao MW esperado do peptídeo T8 uni-camente carregado não modificado e o pico a 1092,2 corresponde ao MWde T8 unicamente carregado glicosilado. A massa correspondendo ao picoprincipal e sua estrutura (T8-HexNAc-Hex-NeuAc) são mostrados na Tabela61.Tabela 61

Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T03: Estruturas de oligossacarídeo do peptídeo T8

<table>table see original document page 590</column></row><table>

O espectro de massa total do peptídeo T9 é mostrado na figura65, onde íons dupla e triplamente carregados dos glicopeptídeos aparecem,correspondendo a uma faixa de glicoformas heterogêneas. O principal pico a1115,9 corresponde ao MW de T9 triplamente carregado glicosilado comHexNAc-Hex-NeuAc. Os picos a 1213,0 e 1334,8 correspondem aos pesosmoleculares do T9 triplamente carregado, glicosilados com HexNAc(NeuAc)-Hex-NeuAc e (HexNAc-Hex-NeuAc)2, respectivamente (Tabela 62). A glico-forma dominante é T9-HexNAc-Hex-NeuAc monossialilado, enquanto que asoutras glicoformas estão presentes em uma abundância muito menor.Tabela 62

Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T04: Estruturas de oligossacarídeo do peptídeo T9

<table>table see original document page 591</column></row><table>

De forma a determinar os sítios de O Ligação, mapeamento pep-tídico de CTLA4-lg foi realizados conforme previamente descrito no Exemplo4 e a fração T8-9 (em virtude de digestão incompleta através de tripsina) foicoletada e submetida a sequenciamento de Edman. Os dados de sequenci-amento mostraram que, no 1o ciclo, um pico extra aparece além de Ser. Otempo de retenção do pico extra não está em concordância com aquele dequalquer um dos padrões de aminoácidos, sugerindo que Ser na posição 1em T8 (Ser 129) é modificada e contém glicanas O Ligadas. O aparecimentode Ser e do pico extra indica que Ser é parcialmente modificada. Isso estáem concordância com os dados de MS para T8. Os experimentos de se-quenciamento também revelam o sítio de O Ligação em T9 como Ser 139.Em conclusão, dois sítios de glicosilação O Ligada foram identificados nosresíduos de aminoácido serina 129 e serina 139. a glicana predominantepresa aos dois sítios é HexNAc-Hex-NeuAc.Análise por MALDI-TOF de peptídeo T9

Análise por MALDI-TOF de peptídeo T9 demonstra a presençade várias glicoformas (FIG. 66). O pico com um MW de 2690,8 é consistentecom o fragmento T9. O pico com um MW de 2893,7 se refere a T9 maisHexNAc. O pico com um MW de 3055,7 se refere a T9 mais HexNAc-Hex. Opico com um MW de 3345,8 indica T9 mais HexNAc-Hex-NANA. Galactose eN-Acetil Galactosamina foram detectadas em T9 baseado em análise demonossacarídeo, portanto, é postulado que as principais espécies O Ligadasem T9 são GaINAc-GaI-NANA. Análise por MALDI-TOF de peptídeo T8 nãofoi realizada em virtude dos baixos rendimentos de recuperação.EXEMPLO 47: VARIANTES COM OXIDAÇÃO E DEAMIDAÇÃO EM C-TLA4-lq

Oxidação e deamidação variantes de produto comuns de peptí-deos e proteínas. Elas podem ocorrer durante fermentação, coleta/cla-rificação de célula, purificação, armazenamento de Substância de Fármaco/produto de fármaco e durante análise da amostra.

Oxidação de proteína é, tipicamente, caracterizada pela adiçãoquímica de um ou mais átomos de oxigênio à proteína. Vários aminoácidos,Met, Cys, Tyr, His e Trp, são mais suscetíveis à oxidação comparado comoutros aminoácidos naturais. O aminoácido com o maior grau de suscetibili-dade à oxidação é metionina. A maior parte da oxidação de proteína identifi-cada até o momento tem sido a oxidação de metionina à variante de sulfóxi-do. Oxidação em proteínas pode ser causada por vários mecanismos dife-rentes. O mecanismo comum de oxidação ocorre a partir de exposição à luzou catálise com metal de transição.

Deamidação é a perda de NH3 de uma proteína, formando umintermediário de succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário desuccinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 u do peptídeo pre-cursor. A subsequente hidrólise resulta em um aumento de massa de 18 u.Isolamento do intermediário de succinimida é difícil em virtude da instabilida-de sob condições aquosas. Como tal, deamidação é tipicamente detectávelcomo aumento de massa de 1 u. Deamidação de uma asparagina resulta emácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de deami-dação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, resistênciaiônica, seqüência primária, conformação de polipeptídeo local e estruturaterciária. Os resíduos de aminoácido adjacentes à Asn na cadeia peptídicaafetam as taxas de deamidação. Gly e Ser após uma Asn em seqüências deproteína resultam em uma maior suscetibilidade è deamidação.

MATERIAIS e MÉTODOS

Amostra: padrão de CTLA4-lg

Mapeamento peptídico com Tripsina/Asp-N/Tripsina e Qui-miotripsina de CTLA4-lg: Proteínas foram desnaturadas e reduzidas emtampão de Tris a 50 mM (pH de 8,0) contendo guanidina a 6 M e ditiotreitol a5 mM (DTT). Após 20 minutos de incubação a 50 °C, iodoacetamida (IAM)foi adicionada para uma concentração final de 10 mM e a amostra foi incu-bada no escuro a 50 cC durante mais 20 minutos. A mistura alquilada e re-duzida foi carregada sobre a coluna NAP-5 e, então, eluída com Tris a 50mM, CaCb a 10 mM, pH de 8,0. Tripsina com grau para sequenciamento(2% peso/peso, enzima : proteína) foi adicionada e incubada durante 4 horasa 37 °C. No caso de digestão de Asp-N, Asp-N com grau para sequencia-mento (4% peso/peso, enzima : proteína) foi adicionada e a amostra foi in-cubada durante 16 horas a 37 °C.

No caso de digestão com tripsina e quimiotripsina, a proteínaestava em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5. Tripsina comgrau para sequenciamento (4%, peso/peso, enzima: proteína) foi adicionadae a amostra foi incubada durante 4 horas a 37°C. Quimiotripsina foi adicio-nada (4%, peso/peso, enzima: proteína) e a amostra incubada durante 16horas a 37 °C. As amostras foram armazenadas a -20 °C após a digestão.

Misturas peptídicas foram separadas através de eluição em gra-diente a partir de uma coluna Atlantis C18 (2,1 χ 250 mm) sobre uma Works-tation de HPLC Waters Alliance (Waters, Milford, MA) a 0,120 mL/min. A co-luna foi diretamente conectada ao Q-Tof micro (Waters, Milford, MA) equipa-do com uma fonte de ionização por eletropulverização e os espectros demassa foram coletados. No caso de mapeamento peptídico de Asp-N, mistu-ras peptídicas foram separadas sobre uma coluna Varian C18 (4,6 χ 250mm) a 0,7 mL/min usando a mesma Workstation de HPLC. As colunas foramequilibradas com solvente A (TFA a 0,02% em água) e os peptídeos forameluídos aumentando a concentração de solvente B (acetonitrila a 95%/TFA a0,02% em água). Uma válvula de derivação pós-coluna foi usada para dire-cionar 15% do fluxo para o Q-Tof micro. O instrumento foi operado no modopositivo (m/z 100-2000). A tensão do capilar foi ajustada a 3000 V.

Análise de peptídeos por MS/MS: Frações de cromatografiaem fase reversa foram coletadas e infundida no Q-Tof micro em uma taxa defluxo de 20 μΙ_/ιτιίηυίο. Os espectros de MS/MS foram adquiridos usandoenergia de colisão otimizada para o peptídeo individual (oscilando de 25 a 42eV).

RESULTADOS

Oxidacão de CTLA4-lq: CTLA4-lg tem sete metioninas por ca-deia simples: Met1l Met531 Met54, Met85, Met971 Met162 e Met338. Mapeamentopeptídico foi usado para identificar as variantes de produto oxidativas emcada um desses sítios. Oxidações de Met1, Met85 e Met162 são identificadasusando a técnica de mapeamento tríptico de peptídeo (FIG. 67A-B). Nenhu-ma oxidação de Met338 é detectada. Os fragmentos trípticos contendo Met531Met54 ou Met97 são grandes peptídeos contendo carboidratos N-Iigados hete-rogêneos. Esses peptídeos não são passíveis de identificação e quantifica-ção relativa de oxidação. Portanto, proteólise usando múltiplas enzimas, asquais produzem peptídeos não-glicosilados mais curtos, foi realizada. O pep-tídeo de Asp-N EVCAATYMMGN (46-56) e peptídeo tríptico / quimiotrípticoMYPPPY (97-102) são usados para determinar a oxidação de Met53, Met54 eMet97. A quantificação relativa de oxidação de metionina é calculada de a-cordo com a área de pico percentual dos cromatogramas de íons extraídos.

As quantidades relativas de peptídeos oxidados são listadas na Tabela 63.Oxidação sobre seis das sete metioninas de CTLA4-lg com cadeia simples édetectada. Os picos AeB são as formas unicamente oxidadas do peptídeoEVCAATYMMGN (46-56) (pico 3). Peptídeos dos picos 2A e 2B são isobári-cos e têm um aumento de massa de 16 u quando comparado com a massado peptídeo não modificado. Cada pico representa a oxidação em diferentesMet. O grau da oxidação é diferente nos dois sítios.<table>table see original document page 595</column></row><table>A quantidade estimada total de oxidação de metionina em C-TLA4-lg é calculada como sendo de 2,0% para CTLA4-lg. Isso é calculadoatravés da adição do percentual total de oxidação em cada sítio e dividindopelo número total de metioninas, o qual é sete. Análise por MS/MS foi reali-zada sobre peptídeos oxidados e nativos listados na Tabela 63.

Todos os peptídeos, com exceção de D5, são sequenciados u-sando MS/MS. O aminoácido oxidado é determinado através da diferença demassa dentro da série de íons b e y. Os espectros de MS/MS do peptídeoT1 oxidado e nativo requer os íons precursores duplamente carregados emm/z 741,4 e 733,4. A diferença de massa é de 8 u (para o estado duplamen-te carregado) que é de 16 u quando corrigida para o estado carregado. Opeptídeo tríptico T1 (1-14) contém o resíduo de Met1. O peptídeo nativo eseu derivado oxidado são separados da linha de base através de cromato-grafia de fase reversa. O cromatograma de íons para íons duplamente car-regados de T1 e seus derivados é mostrado na figura 67A-B. A série de íonsb e y é os íons predominantes produzidos em dissociação induzida por coli-são. Os íons y6-y13 têm as mesmas massas modificada e não modificada.O íon b2 do peptídeo oxidado é 16 u maior do que o íon b2 correspondentedo peptídeo nativo. A série de íons b e y, tomada junto com as massas depeptídeo, identificam metionina 1 como o aminoácido modificado no peptí-deo T1. Da mesma forma, oxidações de Met nos peptídeos AT1, T6, T10 eMYPPPY (97-102) são identificadas.

Deamidacão de CTLA4-lg: CTLA4-lg tem 15 asparaginas porcadeia simples. Três asparaginas são conhecidas por estarem presas à es-truturas de carboidrato N-ligado. Mapeamento peptídico foi usado para iden-tificar e quantificar relativamente a deamidação que ocorre nos outros 12resíduos de Asn. Deamidações de Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 e Asn344são identificadas através do mapeamento tríptico de peptídeo por LC/MS(Tabela 64). A quantificação relativa de deamidação de asparagina é calcu-Iada de acordo com a área de pico percentual dos cromatogramas de íonextraídos. As quantidades relativas de peptídeos desamidados são listadasna Tabela 64. A quantidade total estimada de deamidação de asparagina emCTLA4-lg é calculada como sendo de 0,3% para CTLA4-lg. Isso é calculadoatravés da adição do percentual total de deamidação em cada sítio e dividin-do por 15. Análise por MS/MS foi realizada sobre peptídeos desamidados enativos listados na Tabela 64.<table>table see original document page 598</column></row><table>O aminoácido desamidado é determinado através da diferençade massa dentro da série de íons b e y. Por exemplo. Se existem dois picosdesamidados para o peptídeo T15 - massas de 905,0 u. Pico 1 elui antes dopico nativo; o pico 3 elui após o pico nativo. Peptídeos trípticos e suas for-mas amidadas são separados da linha de base sobre a coluna de fase re-versa. Análise por MS/MS foi realizada sobre os peptídeos trípticos e peptí-deos desamidados são listados na Tabela 64. Os Picos 1-3 contêm os mes-mos íons y1 e y2, indicando que os aminoácidos C-terminais são os mesmospara todos os três picos; contudo, os íons y3-y14 dos picos 1 e 3 são 1 umaiores do que os íons correspondentes do pico 2. A diferença de massaentre y2 e y3 é de 114 u para o pico 2; isso corresponde a um resíduo deAsn. A 115 u para os picos 1 e 3 é um aumento de massa de 1 u comparadocom a massa do resíduo de Asn; isso corresponde ao ácido aspártico ouisoaspártico. Da mesma forma, deamidações em T12, T25, T26 e T30 foramidentificadas e os íons de fragmento identificam sítios de modificação.

Deamidações de asparagina e oxidações de metionina são de-terminados a partir de análises de LC/MS e LC/MS/MS da clivagem com en-dopeptidase de CTLA4-lg. As modificações são identificadas através dedesvios nas massas entre os peptídeos modificados e não modificados. Osaminoácidos modificados são identificados através de sequenciamento porMS/MS. Seis oxidações de metionina e cinco deamidações de asparaginapor cadeia simples estão presentes no material de CTLA4-lg em um peque-no percentual. Descobriu-se que Met1, Met53, Met54, Met85, Met97 e Met162 deCTLA4-lg são todas oxidadas. Verificou-se que essas oxidações determina-das de CTLA4-lg são menos de 2,5% de todas as metioninas de CTLA4-lg.Descobriu-se que Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 e Asn344 de CTLA4-lg sãotodas desamidadas em baixas quantidades. Verificou-se que essas deami-dações determinadas de CTLA4-lg são menos de 0,5% de todas as aspara-ginas em CTLA4-lg.

Exemplo 48 - Ensaios de endotoxina bacteriana para CTLA4-lg e C-TLA4a29yl1 04E-lq

Em uma modalidade, a composição de Substância de Fármacode CTLA4-lg tem menos de ou igual a 0,15 EU/mg de endotoxina bacteriana.CTLA4-lg é ensaiada com relação à presença de endotoxinas bacterianasusando a técnica de coagulação em gel Limulus Amebocyte Lysate (LAL)baseada na USP<85>. No preparo para e aplicação do ensaio, observarprecauções ao manipular espécimes de forma a evitar contaminação micro-biana bruta; tratar quaisquer recipientes ou utensílios empregados para des-truir endotoxinas estranhas que possam estar presentes sobre suas superfí-cies, tal como aquecimento em um forno quente usando um ciclo validado.

Reagente LAL: (Associates of Cape Cod, Inc.- ou equivalen-te). Limulus liofilizado. Reagente Amebocyte Lysate (LAL), tal como Pyrotell,deverá ser armazenado de acordo com as instruções do fabricante. Reagen-te LAL reconstituído pode ser mantido congelado durante não mais do queum mês e não deverá ser descongelado ou congelado mais de uma vez.

Padrões de endotoxina: (Associates of Cape Cod, Inc.- ouequivalent). O padrão de controle de endotoxina (CSE) usado nos testesdeve ser rastreável e padronizado contra Padrão de Referência de Endoto-xina (RSE). Armazenar recipientes na reconstituídos de endotoxina em umrefrigerador; uma vez reconstituído, eles podem ser mantidos a 2°-8°C du-rante não mais do que 14 dias, a menos que validação durante períodosmais longos mostrem reatividade adequada.Testagem de lotes de Produção

A falta de inibição de produto ou intensificação do procedimentoLAL deverá ser validada para cada formulação de fármaco. Testagem doslotes de produção é realizada usando três unidades individuais representan-do o início, meio e final de produção. Essas unidades podem ser operadasindividualmente ou empoçadas. Um controle de produto positivo representa-tivo da amostra na concentração de teste, inoculado com duas vezes aquantidade de CSE (ou RSE) como a sensibilidade rotulada do ensaio, deveser incluído para um testa válido. Ajustar o pH de modo que a solução deproduto/lisato final esteja na faixa de 6,0 a 8,0 usando tampão de HCI1 NaCIestéril isento de endotoxina ou outro. Em algumas situações, pode ser útilusar um agente de tamponamento, tal como Pyrosol, como uma alternativaao ajuste de pH. Refira-se às orientações do fabricante para uso específico.Uso de agente de tamponamento para reconstituição de Iisato

Um agente de tamponamento, tal como Pyrosol (Associates ofCape Cod, Inc.) dirigido a reconstituir o Iisato usado para testagem e é proje-tado para amplificar a capacidade de tamponamento do lisato. Lisato recons-tituído com Pyrosol pode ser usado para amostras de teste ou diluições deamostra que possam, de outro modo, requerer ajuste de pH com ácido oubase ou as quais se precipitam quando de ajuste do pH. Quando combinadocom a amostra de teste, lisato reconstituído com Pyrosol proporciona umacor rosa para indicar que o pH está na faixa para um teste válido. Se foradessa faixa, a cor será amarela ou púrpura; nesse caso, a amostra de testerequererá ajuste de pH adicional. Métodos específicos orientarão o uso dePyrosol para reconstituição de lisato.

Uso de tampão de inibição de glicana para reconstituição de lisato

Um tampão de inibição de glicana, tal como Glucashield (Asso-ciates of Cape Cod, Inc.) é usado para reconstituir o lisato usado para testa-gem e é projetado para bloquear interferência potencial por glicana. Lisatoreconstituído com Glucashield pode ser usado para amostras de teste oudiluições de amostra que possam conter contaminação por glicana. Interfe-rência proveniente de contaminação por glicana pode dar origem a falsospositivos em determinados materiais de teste, de modo que uso do lisatoreconstituído com Glucashield pode bloquear ou reduzir a interferência, per-mitindo um número reduzido de falsos positivos. Métodos específicos orien-tarão o uso de Glucashield para reconstituição de lisato.

Diluições de amostra

Se necessário para se aproximar do nível de concentração deendotoxina na amostra, preparar uma série apropriada de diluições da amos-tra em água isenta de endotoxina estéril. Submeter a turbilhonamento e adi-cionar 0,1 mL de cada preparado a ser testado a cada um de dois tubos deensaio de vidro estéreis isentos de endotoxina de 10 χ 75 mm.

Preparo de soluções-padrão de endotoxina para Curva-padrão

Reconstituir o frasco de endotoxina com água isenta de endoto-xina conforme as instruções do fabricante. Misturar o frasco vigorosamentesobre um misturador com turbilhonamento intermitentemente durante 30 mi-nutos. Preservar o concentrado em um refrigerador a 2°-8°C durante nãomais do que 4 semanas. Misturar vigorosamente usando um misturador comturbilhonamento durante não menos de 3 minutos antes de uso. Consultar oCertificado de Análise do fabricante para verificar a concentração do estoquede endotoxina e preparar uma série de diluições de padrão de endotoxina,projetados para colocar o endpoint entre faixas, tal como no exemplo a se-guir:

0,5 mL (1000 EU/mL) + 9,5 mL de água isenta de endotoxina =50 EU/mL

5,0 mL (50 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxina = 25EU/mL

1,0 mL (25 EU/mL) + 9,0 mL de água isenta de endotoxina = 2,5EU/mL

1,0 mL (2,5 EU/mL) + 9,0 mL de água isenta de endotoxina =0,25 EU/mL

5,0 mL (0,25 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxina =0,125 EU/mL

5,0 mL (0,125 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxina =0,06 EU/mL

5,0 mL (0,06 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxina =

0,03 EU/mL

5,0 mL (0,03 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxina =0,015 EU/mL

Certifique-se de submeter vigorosamente a turbilhonamento ca-da diluição durante pelo menos 30 segundos antes prosseguir para a próxi-ma diluição. Incluir um controle negativo de água do diluente usado. Subme-ter a turbilhonamento e adicionar 0,1 mL de cada uma das concentrações de0,125 EU/mL, 0,06 EU/mL, 0,03 EU/mL, 0,015 EU/mL (ou curva alternativa)e o controle negativo de água, a cada um de dois tubos de ensaio de vidroestéreis isento de endotoxina de 10 χ 75 mm para proporcionar duas curvasrepetidas.

Preparo de solução de reagente LAL

Remover o reagente LAL Iiofilizado do congelador. Adicionar as-septicamente 5,0 mL de água isenta de endotoxina (a menos que de outromodo orientado pelo método específico, usar um tampão de reconstituição)ao frasco. Agitar ou girar o frasco para dissolver o reagente.Preparo de controle de produto positivo

Todos os produtos devem ser testados com um controle de pro-duto positivo. Refira-se ao método específico aplicável para instruções sobreo preparo do controle positivo. Se nenhuma instrução é proporcionada, pre-parar o controle de produto positivo para conter endotoxina reforçada a 2X onível da sensibilidade do lisato, em combinação com o produto em seu nívelde teste. Quando de testagem de Água para injeção ou água High QualityProcess, usar a diluição do padrão de endotoxina reconstituída de modoque, quando adicionado à amostra, a concentração de endotoxina será 2X asensibilidade da solução LAL. Por exemplo, se a sensibilidade do lisato =0,06 EU/mL, adicionar 0,1 mL de uma solução de endotoxina a 2,5 EU/mL a1,9 mL de amostra de teste (na forma conforme adicionado à solução LAL) =0,125 EU/mL. O volume da solução de endotoxina não é maior do que 0,1mL e a diluição global não é menor do que 1: 20.Procedimento de teste

1. Distribuir assepticamente 0,1 mL da solução de reagente LALem cada uma das amostras de tubos de ensaio e tubos com padrão de en-dotoxina, tomando cuidado para evitar contaminação cruzada entre os tubos.

NOTA: Colocar qualquer reagente restante em um congeladorem torno de menos 10°C a menos 25°C.

2. Refira-se à bula do lisato específico para instruções de mistu-ra da mistura de produto-lisato.

3. Colocar cada tubo em um dispositivo de incubação, tal comoum banho de água ou bloco de aquecimento mantido a 37° ± 1°C. Registraro tempo de início de incubação e a temperatura do banho de água ou blocode aquecimento.4. Incubar cada tubo, sem perturbar, durante 60 ± 2 minutos.

5. Após a incubação, registrar o ponto final da incubação e ob-servar cada tubo invertendo gentilmente o tubo 180°. Um resultado positivo édenotado por um gel firme, o qual permanece firme quando invertido cuida-dosamente, um resultado negativo é caracterizado pela ausência de tal gelou através da formação de um gel viscoso que não mantém sua integridade.Manipular os tubos cuidadosamente e evitar submeter os mesmos à vibra-ções, as quais poderiam causar observações falso-negativas.Avaliação

A menor concentração em cada série de réplica para proporcio-nar um resultado positivo é denominada o endpoint. Calcular o endpoint demédia geométrica par ao teste através do procedimento a seguir:

Média geométrica = o anti-logaritmo da soma logarítmica dosendpoints de gelificação dividido pelo número de ensaios de endpoint repeti-dos. O teste é válido contanto que o endpoint de média geométrica estejadentro uma diluição de duas vezes da sensibilidade do Iisato rotulado, o con-trole de produto positivo seja positivo e o controle negativo de água seja ne-gativo. Determinar o nível aproximado de endotoxina bacteriana em ou sobreo artigo de teste através de comparação da sensibilidade do Iisato rotuladocom os resultados positivos ou negativos acoplados aos fatores de diluiçãodo artigo testado. O artigo vai ao encontro dos requisitos do teste se não háformação de um gel firme ao nível de endotoxina especificado nos monográ-ficos individuais ou especificação.

Método para CTLA4A29YL104E-lg

Esse método é usado para quantificar endotoxinas bacterianasnas amostras de Substância de Fármaco e produto de fármaco de C-TLA4A29YL104E-lg usando o método turbidimétrico cinético LAL. Os resultadossão reportados como EU/mL e EU/mg de produto de fármaco equivalente.Termos:

LAL - Iisato de Limulus Amebocyte

CSE - Endotoxina-padrão de controle

EU - unidades de endotoxina na Farmacopeia Norte AmericanaEU/mg - Unidades por miligrama de endotoxina na FarmacopeiaNorte Americana

EU/mL -Unidades por mililitro de endotoxina na Farmacopeia

Norte Americana

LRW - LAL Reagent Água

Solução turbidimétrica de Iisato de Limulus Amebocytec(Pyrotell-T®). Deixar os frascos de Pyrotell-T® e PyroSol® aquecer para atemperatura ambiente durante 30 minutos antes de abrir. Remover a veda-ção de metal do Pyrotell-T® e remover assepticamente a rolha. ReconstituirPyrotell-T® com 5,0 mL de tampão de reconstituição PyroSol®. Girar a garra-fa gentilmente para misturar até completamente dissolvida. Reconstituir otampão imediatamente antes de uso. Pyrotell-T® reconstituída pode ser man-tida a 2-8°C durante não mais do que 24 horas. Cobrir a parte de cima dorecipiente com uma camada de Parafilm®.

Solução de endotoxina padrão de controle. Deixar o frasco deCSE (1.2) aquecer para a temperatura ambiente durante 30 minutos antesde abrir. Remover a vedação metálica do frasco e remover assepticamente arolha. Levantar cuidadosamente a rolha apenas o bastante para deixar o arentrar, desse modo, quebrando o vácuo. Reconstituir endotoxina-padrão decontrole (CSE) com 5,0 mL de LRW (1.4). Vedar com Parafilm®. Submeter aturbilhonamento vigorosamente durante um minuto, em intervalos de 5-10minutos durante um intervalo de 30-60 minutos em temperatura ambiente.CSE está, então, pronta para. Refira-se ao Certificado de Análise do fabri-cante para obter a potência da endotoxina-padrão de controle (CSE) emUSP-EU por frasco vs. o lote específico de Pyrotell-T®. Calcular a USP-EU/mL da CSE no frasco. CSE reconstituída pode ser mantida a 2-8°C du-rante 30 dias. Após cada uso, vedar o recipiente com um novo Parafilm®.Exemplo:

Para um frasco tendo uma potência de 6.000 USP-EU/frascoreconstituído com 5,0 mL de LRW1 a potência seria 1.200 USP-EU/mL.

<formula>formula see original document page 605</formula>

Ajuste de Parâmetros de ensaio no software Pyrosoft-11®Parâmetros gerais. Ajustar parâmetros na aba General Test In-formation, conforme mostrado na Tabela abaixo.

Informação gerai de teste

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Opções

<table>table see original document page 606</column></row><table>

Atribuições de Tubo - Exemplo

<table>table see original document page 606</column></row><table><table>table see original document page 607</column></row><table>

Preparo de concentrações de Curva-padrão.

Preparo de solução de trabalho de estoque-padrão de con-trole de endotoxina (CSE, 2.2) a 4 USP-EU/mL. Preparar a solução de tra-balho de CSE em uma potência de 4 EU/mL. Calcular o volume de LRW ne-cessário para a diluição usando a Equação 1. Adicionar 20 µl_ de soluçãoCSE (2.2) na quantidade apropriada (Equação 1) de LRW (1.4) em um tubode poliestireno (1.9). Submeter a turbilhonamento a diluição durante 30 se-gundos.

Exemplo:

Para uma solução CSE em uma potência de 1,200 EU/mL, adi-cionar 20 µl de solução CSE a 5,980 µl de LRW.

<formula>formula see original document page 607</formula>

Preparo de solução de trabalho de estoque CSE a 0,64EU/mL. Preparar a solução de trabalho de CSE em uma potência de 0,64USP-EU/mL através da adição de 1,6 mL de solução de estoque CSE a 4USP-EU/mL a 8,4 mL de LRW em um tubo de poliestireno. Submeter a turbi-lhonamento durante 30 segundos.

Preparo de Soluções-padrão de estoque. Soluções-padrõesde estoque são preparadas a 0,128, 0,064, 0,032, 0,016, 0,008 e0,004 EU/mL a partir da solução de trabalho de CSE em tubos de poliestire- no. Submeter a turbilhonamento cada tubo durante 30 segundos após dilui-ção. Um esquema de diluição é mostrado na tabela abaixo.Esquema de diluição para Soluções-padrão de estoque

<table>table see original document page 608</column></row><table>

* A diluição final de duas vezes ocorre nos tubos de reação.Preparo de amostra

Preparo de amostra de Substância de Fármaco. Preparar a dilui-ção de amostra para 0,25 mg/mL. Calcular o volume de LRW necessáriopara a diluição usando a Equação abaixo. Remover cuidadosamente a partede cima do recipiente de amostra e adicionar 50 μL de amostra na quantida-de apropriada (Equação abaixo) de LRW em um tubo de poliestireno parafazer uma solução a 0,25 mg/mL. Submeter a turbilhonamento a amostradurante 30 segundos. Cobrir a parte de cima do recipiente de amostra comuma camada de Parafilm®.

Exemplo:

Para uma amostra tendo uma concentração de 24,7 mg/mL, adi-cionar 50 μL (0,05 mL) de amostra a 4,89 mL de água.

Equação 2:

0,05*: Concentração de proteína (mg/mL)

Volume LRW (mL) =

-0,05 mL

0,25 mg/mL

Preparo de amostra de Iiofilizado de Produto de fármaco.NOTA: Um único lote de Produto de fármaco consiste em três amostras dis-tintas, "início", "meio" e "fim".

Reconstituir um frasco de produto de fármaco com água LALReagent de acordo com as especificações de Identificação de produto (PI).

Diluir a amostra reconstituída para 0,25 mg/mL. Calcular o volume de LRWnecessário para a diluição usando a Equação 2. Remover cuidadosamente aparte de cima do recipiente de amostra e adicionar 50 μί de amostra naquantidade apropriada (Equação 2) de LRW em um tubo de poliestireno parafazer uma solução a 0,25 mg/mL. Submeter a turbilhonamento a amostradurante 30 segundos. Cobrir a parte de cima do recipiente de amostra comParafilm®.

Preparo de amostra de Produto de fármaco pronta para uso.

Diluir a amostra para 0,25 mg/ml_. Calcular o volume de LRW necessáriopara a diluição usando a Equação 3. Remover cuidadosamente a parte decima do recipiente de amostra e adicionar 10 µl de amostra à quantidadeaproriada (Equação 3) de LRW em um tubo de poliestireno para fazer umasolução a 0,25 mg/mL. Submeter a turbilhonamento a amostra durante 30segundos. Cobrir a parte superior do recipiente de amostra com Parafilm®.

Exemplo:

Para uma amostra tendo uma concentração de 125,0 mg/mL,adicionar 10 µl (0,01 mL) de amostra a 4,99 mL de água.

Equação 3:

0,01*: Concentração de proteína (mg/mL)

Volume LRW (mL) =

-0,01 mL

0,25 mg/mL

Placebo de Produto de fármaco pronto para uso. Diluir um pla-cebo (conforme se ele estivesse em uma concentração nominal de produtode fármaco de proteína de 125 mg/mL) para 0,25 mg/mL. Isso é equivalentea uma diluição de 1: 500. Calcular o volume de LRW necessário para a dilui-ção usando a Equação 3. Remover cuidadosamente a parte superior do re-combinante de amostra e adicionar 10 µl de amostra até a quantidade apro-priada (Equação 3) de LRW em um tubo de poliestireno para fazer uma so-lução equivalente a 0,25 mg/mL.

Controle positivo água. O controle positivo é preparado a partirda Curva-padrão através da adição de 100 µl de 0,032 EU/mL de padrão a100 µl de LRW nos tubos de reação.Ajuste do tubo de reação - Exemplo

<table>table see original document page 610</column></row><table>

Adição de reagente Pyrotell-T®. Adicionar 50 μL de solução dePyrotell-T® a cada tubo de reação (controle negativo, padrões, amostras,amostras reforçadas e controle positivo água) com uma pipeta de repetição.Submeter a turbilhonamento cada tubo durante 1-2 segundos e inserir osmesmos na cavidade atribuída (Tabela 1) no instrumento Pyros Kinetix.ANALISE DE DADOS

Análise. O software PyroSoft®-11 realizará uma autoanálise detodos os padrões, controles e amostras e reportará os resultados para a a-mostra em EU/mL ao término da operação. Cada amostra em duplicata éreportada como um valor médio de das duas. Se um dos tubos do valor compar em duplicata não é detectados pelo software PyroSoft®-11, esse tubopode ser excluído de análise de dados adicional e os resultados re-calculados. Recuperação (controle de amostra positivo) será calculada ba-seado na quantidade de endotoxina na amostra mais a quantidade endotoxi-na reforçada na amostra (0,016 EU/mL).

Converter o valor de EU/mL para o valor de EU/mg de amostradiluída de Substância de Fármaco ou Produto de fármaco.

Os dados brutos são gerados como EU/mL e reportados comoEU/mg de proteína. Para converter EU/mL para EU/mg, dividir o valor deendotoxina (EU/mL) pela concentração de proteína (0,125 mg/mL). Os resul-tados são reportados em um quadro significativo.

Exemplo:

Para a amostra tendo 0,23 EU/mL no ensaio, o valor de reportá-vel EU/mg será de 2 EU/mg (1,8 arredondado para um quadro significativo)."0,23EU/mL

'= 1,84EU/mg = 2EU/mg

_0,125mg/mL

Resultados para amostra de Substância de Fármaco. Os re-sultados são determinados como um quadro significativo. O QL do ensaio é0,02 EU/mg. Se a amostra é <0,02 EU/mg, o resultado reportável é [<QL,(QL = 0,02 EU/mg)].

Resultados para amostra de Produto de fármaco. A médiadas três amostras para cada Lote de produto de fármaco ("começo", "meio"e "final") em EU/mg é o resultado reportável para amostras de produto defármaco em um quadro significativo. Para o caso onde uma ou mais dasamostras para um Lote são <QL (0,02 EU/mg), o valor de 0,02 EU/mg seráusado para cálculo da média. Se o resultado médio reportável é <0,02EU/mg, o resultado reportável é [<QL, (QL = 0,02 EU/mg)].Exemplo:

<table>table see original document page 612</column></row><table>

Para esse Exemplo, o placebo de produto de fármaco seria re-portado como: 3 EU/mL, equivalente a 0,02 EU/mg em uma concentraçãonominal de produto de fármaco de 125 mg/mL.

Adequabilidade de sistema. A amostra de Substância de Fár-maco deverá ser recebida em recipientes de poliestireno a 2-8°C. Se as a-mostras são recebidas em diferentes recipientes em uma temperatura dife-rente, elas não podem ser usadas no ensaio. O coeficiente de determinaçãopara a Curva-padrão (r2) deve ser >0,99. Se o valor de r2 é <0,99, o ensaio não é válido e deve ser repetido. A concentração média de endotoxina parao controle negativo deve ser <0,002 EU/mL. Se o controle negativo é >0,002EU/mL, o ensaio não é válido e deve ser repetido. O valor de amostra refor-çada deve cair dentro da faixa de 50 - 200% do valor esperado. Se o valorde amostra reforçada é <49 % ou >201% do valor esperado, o ensaio não éválido e deve ser repetido. A concentração média de endotoxina para o con-trole positivo água deve cair dentro da faixa de 50-200% da mesma concen-tração na Curva-padrão. Se o valor do controle positivo, água, é <49 % ou>201 % do valor esperado, o ensaio não é válido e deve ser repetido. Valoresde endotoxina para as amostras deve cair dentro da faixa da Curva-padrãode endotoxina (entre 0,002 e 0,064 USP-EU/mL). Se as amostras são<0,002 EU/mL, elas estão abaixo do QL do ensaio e reportar-se à seção 5.4.Se amostras são >0,064 USP-EU/mL, as amostras devem ser ainda diluídaspara a faixa do ensaio.

Exemplo 49 - Testes de limites microbianos (Bioburden) para CTLA4-lg

Esse método proporciona procedimentos de teste para estimati-va do número de microorganismos aeróbicos viáveis presentes e para isen-ção de espécies microbianas designadas. Em uma modalidade, a composi-ção de CTLA4-lg deverá ter a bioburden em um nível de <1 CFU/10 mL. Nopreparo para e na aplicação dos testes, observar precauções assépticas aomanipular os espécimes. O termo "Crescimento" é definido como a presençae proliferação presumida de microorganismos viáveis. A validade dos resul-tados do teste repousa grandemente sobre a demonstração de que os espé-cimes de teste aos quais eles são aplicados não inibem, em si, o crescimen-to, sob as condições de teste, de microorganismos que possam estar pre-sentes. Essa demonstração incluirá estimulação de espécimes apropriada-mente preparados do material a ser testado com culturas viáveis distintas deorganismos de estimulação apropriados para assegurar que o teste não ini-be o crescimento dessas classes de organismo, por que elas estariam pre-sentes no material testado. Qualquer parte de qualquer produto de beta Iac-tame o qual é usado para testagem deve ser tratada com uma quantidadeadequada de penicilinase de acordo com os procedimentos validados.Fluidos de diluição e Meios

1. Preparo de meio de cultura e fluidos de diluição. Meios decultura e fluidos de diluição podem ser preparados ou meios de cultura desi-dratados podem ser usados contanto que, quando reconstituídos diretamen-te pelo fabricante ou distribuidor, eles tenham ingredientes similares e/ouproporcionem meios comparáveis àqueles obtidos de uma formulação forne-cida aqui. No preparo de meios através das fórmulas, dissolver os sólidossolúveis na água, usando calor se necessário, para obter dissolução comple-ta e adicionar soluções de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio em quanti-dades suficientes para proporcionar o pH desejado no meio quando ele estápronto para uso. Os meios têm de ser esterilizados em uma autoclave usan-do um procedimento de esterilização validado. Determinar o pH após esteri-lização a 25° + 2°C.Promoção de Crescimento

a) Cada batelada de meio submetido à autoclave é testado comrelação à sua capacidade de promover o crescimento através de inoculaçãode recipientes de teste em duplicata de cada meio com menos de 100 mi-croorganismos e incubação de acordo com as condições especificadas abai-xo. Os organismos não podem ter mais de 5 passagens da cultura de seme-aduramente recebida da ATCC.

b) O meio de teste é satisfatório se evidência de crescimentoaparece dentro de 48-72 horas para bactérias e 5 dias para fungos. O testede promoção de crescimento pode ser conduzido simultaneamente com ouso do meio de teste para testagem de materiais. Contudo, a testagem demateriais é considerada inválida se esse teste de promoção de crescimentonão tem sucesso.

Microorganismos de teste para uso em testagem de meioque promove o crescimento

<table>table see original document page 614</column></row><table>

*Outras espécies Salmonella não patogênicas também podem ser adequa-das.

Procedimento para contagem de micróbios aeróbicos totais ou conta-gem combinada total de mofos e Ievedos

a) Preparo de amostra. A menos que de outro modo orientadopelo método específico, preparar o espécime para testagem como segue.Refira-se à seção apropriada abaixo para informação adicional com relaçãoaos meios e procedimentos de incubação, dependendo de qual teste estásendo realizado.

i) Pós brutos e matérias primas - Dissolver ou suspender 10gramas ou 10 ml_ de amostra em 90 mL de tampão de fosfato estéril, pH de

7,2. Misturar bem e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petriestéreis.

ii) Cápsulas - Transferir assepticamente 2 envoltórios de cápsulae seus conteúdos para 20 ml_ de tampão de fosfato estéril, pH de 7,2. Aque-cer em um banho de água (aproximadamente 45°C) durante cerca de 10minutos. Agitar vigorosamente até que a suspensão se torne uniforme etransferir 1,0 ml_ para cada um de dois discos de Petri estéreis.

iü) Pós para suspensão - Reconstituir a amostra de acordo comas orientações no rótulo usando tampão de fosfato estéril, pH de 7,2 como odiluente. Agitar bem e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petriestéreis.

iv) Soluções/Suspensões - Transferir 1,0 mL para cada um dedois discos de Petri estéreis.

v) Comprimidos - Transferir 4 comprimidos (comprimidos durosdeverão primeiro ser pulverizados com um pilão estéril) para 20 mL de tam-pão de fosfato estéril, pH de 7,2. Agitar tem até que os comprimidos desinte-grem ou dissolvam completamente e transferir 1,0 mL para cada um de doisdiscos de Petri estéreis.

vi) Envoltórios de cápsula - Transferir 25 envoltórios de cápsulapara 100 mL de tampão de fosfato estéril, pH de 7,2 e aquecer em um banhode água (aproximadamente 45°C) durante cerca de 15 minutos, agitandointermitentemente para dissolver. Agitar bem e transferir 1,0 mL para cadaum de dois discos de Petri estéreis.

vii) Pomadas - Em um recipiente estéril, empoçar aproximada-mente 5 mL de cada uma de 3 amostras tomadas através do lote e misturar.Transferir 0,1 mL dessa amostra empoçada para cada um de dois discos dePetri estéreis. Dispersar a amostra sobre a superfície do meio com o auxíliode uma haste de vidro curvada estéril ("hockey stick"). Usando uma hasteestéril separada para cada lâmina, incubar conforme descrito em "ContagemAeróbica Total".

b) Filtração em membrana. Como uma alternativa aos proce-dimentos em lâmina, um procedimento de teste de filtração em membranaadequado validado pode ser usado. Esse pode ser especialmente útil paraprodutos contendo substâncias inibitórias.

c) Retestagem. Para fins de confirmar um resultado duvidosoatravés de qualquer um dos procedimentos a seguir, um reteste pode serrealizado usando duas vezes e meia (mínimo) do tamanho da amostra inici-al, com ajustes de diluente apropriados.Teste com relação à contagem de micróbios aeróbicos totais

1. Preparar as amostras a serem testadas conforme descrito. Acada lâmina, adicionar 15-20 mL de TSA estéril o qual tenha sido fundido eesfriado para aproximadamente 45°C. Cobrir cada gentilmente inclinar ouagitar o disco para misturar a amostra com o ágar e deixar os conteúdos so-lidificar em temperatura ambiente. Inverter as lâminas e incubar durante 48 a72 horas a 30°-35°C.

2. Após incubação, examinar as lâminas com relação ao cresci-mento usando um dispositivo de ampliação, tal como um Quebec ColonyCounter, contar o número de colônias e calcular os resultados em uma baseunitária (por comprimido, cápsula, mL, gram, etc.) conforme designado naespecificação dos materiais e avaliar a aceitabilidade contra a especificaçãodos materiais.

3. Caracterizar adicionalmente a contaminação bacteriana atra-vés de coloração de gram e morfologia microscópica. Submeter bactériasgram-negativas e cocos gram-positivos à testagem bioquímica (ou meiosalternativos adequados de identificação).

Nota: Quando de contagem das colônias, de forma a facilitar adiferenciação de crescimento de colônias do Material que está sendo testa-do, algumas vezes é aconselhável usar uma solução a 2% de cloreto de2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) como um agente de intensificação para observaro crescimento microbiano. TTC é um indicador de oxidação-redução incolorque se torna vermelho quando é hidrogenado através dos açúcares de redu-ção encontrados em células vivas, desse modo, tornando a colônia de umacor vermelho profundo. Usar TTC, inundar a lâmina de Petri com aproxima-damente I mL da solução a 2% e incubar a lâmina a 30°-35°C durante apro-ximadamente 2 horas. Colônias microbianas corarão diferentemente de ou-tro material presente sobre a lâmina e podem ser mais facilmente contadas.

C. Teste para contagem total combinada de mofos e Ievedos

1. Preparar as amostras a serem testadas conforme descrito. Acada lâmina, adicionar 15-20 ml_ de SDA estéril o qual tenha sido fundido eesfriado para aproximadamente 45°C. Cobrir cada disco e gentilmente incli-nar ou agitar o disco para misturar a amostra com o ágar e deixar os conteú-dos solidificar em temperatura ambiente. Inverter as lâminas e incubar du-rante 5 a 7 dias a 20°-25°C.

[NOTA: Não mexer nas lâminas durante incubação, porque adispersão de mofo dentro da lâmina proporcionaria uma contagem maior doque aquela realmente presente.]

2. Após incubação, examinar as lâminas com relação ao cresci-mento usando um dispositivo de ampliação, tal como um Quebec ColonyCounter, contar o número de colônias e calcular os resultados em uma baseunitária (por comprimido, cápsula, ml_, gram, etc.) conforme designado naespecificação dos materiais e avaliar a aceitabilidade contra a especificaçãodos materiais.

3. Caracterizar adicionalmente a contaminação fúngica atravésda morfologia macroscópica e microscópica. Onde apropriado, submeter osIevedos à testagem bioquímica (ou meios alternativos adequados de identifi-cação).

Procedimento para Testagem da ausência de organismos indesejáveis

a) Preparo de amostra - A menos que de outro modo especifica-do pelo Método específico, preparar a amostra para testagem conforme des-crito acima na seção preparo de amostra para os mofos e Ievedos aeróbicostotais e totais combinados. Refira-se à seção apropriada abaixo para infor-mação adicional, dependendo de qual teste está sendo realizado.

b) Filtração em Membrana - Como uma alternativa aos procedi-mentos de pré-enriquecimento, um procedimento de teste de filtração emmembrana validado pode ser usado. Esse pode ser especialmente útil paraprodutos contendo substâncias inibitórias.

c) Retestagem - Para fins de confirmar um resultado duvidosoatravés de qualquer um dos procedimentos a seguir, um reteste pode serrealizado usando duas vezes e meia (mínimo) do tamanho da amostra inici-al, com ajustes de diluente apropriados.

B. Teste com relação à ausência de Staphylococcus aureuse Pseudomonas aeruginosa. A uma amostra, adicionar TSB para fazer 100mL, misturar e incubar durante 24-48 horas a 30°-35°C. Examinar o meiocom relação ao crescimento e, se presente, usando um Ioop de inoculação,colocar uma porção em um meio seletivo, incubar e examinar com relaçãoàs características listadas abaixo (kits de identificação comercialmente dis-poníveis podem substituir os testes de reação individuais):

Características de Staphvlococcus aureus

<table>table see original document page 618</column></row><table>

Transferir colônias suspeitas representativas do ágar seletivopara tubos individuais contendo 0,5 mL de plasma de mamífero (de prefe-rência coelho ou cavalo), incubar a 37°C, examinar a 3-4 horas e, substanci-almente, em intervalos adequados durante até 24 horas com relação à coa-gulação.

Características de Pseudomonas aeruginosa

<table>table see original document page 618</column></row><table>

*Para o teste de pigmento, colocar colônias suspeitas represen-tativas do Centrimide Ágar em discos de PSF e PSP. Cobrir e incubar a

35°C ± 2°C durante um mínimo de três dias. Examinar as lâminas sob luzUV.

**Para o teste de oxidase, confirmar quaisquer colônias sus-peitas transferindo para tiras ou discos impregnados com dicloridrato deN,N-dimetil-o-fenilenodiamina; se não há desenvolvimento de uma cor rosamudando para púrpura, a amostra vai ao encontro dos requisitos com rela-ção à ausência de Pseudomonas aeruqinosa. Note que kits de teste comer-cialmente disponíveis os quais foi demonstrado ter um bom desempenho deum modo aceitável também podem ser usados.

Se nenhum crescimento é observado ou se nenhuma das colô-nias se conforma ao conjunto de características listadas nas tabelas acima,a amostra vai ao encontro dos requisitos do teste com relação à ausênciadesse organismo.

Teste com relação à ausência de espécies Salmonella e Escherichiacoli

Transferir a amostra para um recipiente estéril para conter umtotal 100 mL de meio Fluido de Lactose e incubar a 30°-35°C durante 24-48horas. Agitar gentilmente e examinar com relação ao crescimento. (Kits deidentificação comercialmente disponíveis podem substituir os testes de rea-ção individuais).

a) Salmonella - se crescimento está presente em meio Fluido de Lactose:

1. Transferir porções de 1,0 mL para tubos de 10 mL com meioFluido de Selenita-Cistina e meio Fluido de Tetrationato1 misturar e incubar a30°-35°C durante 24-48 horas.

2. Por meio de um Ioop de inoculação, colocar porções de am-bos os meios sobre meio de ágar Brilliant Green, meio de ágar Xilose-Lisina-Deóxicolato e meio de ágar de sulfito de bismuto. Cobrir, inverter e incubar a30°-35°C durante 24-48 horas e examinar com relação às característicasmorfológicas listadas abaixo:

<table>table see original document page 619</column></row><table>

3. Identificação adicional pode ser conduzida transferindo colô-nias suspeitas para um tubo com ponta/declive com meio triplo de açúcar-ferro-ágar primeiro riscando a superfície do declive e, então, colocando o fiopor baixo da superfície. Incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas e examinar.Se nenhum tubo mostra evidência de declives alcalinos (vermelhos) e pon-tas ácidos (amarelo) (com ou sem formação concomitante da cor preta daponta), a amostra vai ao encontro dos requisitos do teste com relação à au-sência do gênero Salmonella.

b) Escherichia coli - se crescimento está presente no meio deIactose fluido:

1. Por meio de um Ioop de inoculação, colocar uma porção emmeio de ágar MacConkey. Cobrir, inverter e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas.

2. Se nenhuma das colônias resultantes mostra uma aparênciavermelho-tijolo (com uma possível zona circundante de bile precipitada) esão bastonetes gram negativos (Cocos-BaciIos), a amostra vai ao encontrodos requisitos do teste com relação à ausência de Escherichia coli.

3. Se as colônias combinam com essa descrição, transferir asmesmas para meio de ágar Levine-Eosin-Methylene Blue. Cobrir os discos,inverter e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas. Se nenhuma das colôniasexibe as características de um brilho metálico sob a luz refletida e aparênciaazul-preta sob luz transmitida, a amostra vai ao encontro dos requisitos doteste com relação à ausência de Escherichia coli.

Fórmulas de meio

1. Tampão de fosfato. pH de 7.2

a) Solução de estoque: fosfato de potássio monobásico 34,0 g;Água (destilada ou desionizada) 1000 ml_; Hidróxido de sódio TS 175 mL.

Dissolver 34 gramas de potássio monobásico; fosfato em cerca de 500 mLde água contido em um frasco volumétrico de 1000 mL. Ajustar para pH de7,1-7,3 através da adição de Hidróxido de sódio TS (cerca de 175 mL), adi-cionar água até volume e misturar. Esterilizar e armazenar sob refrigeração(2°-8°C) até uso.

b) Solução de trabalho. Para uso, diluir a solução de estoquecom água em uma proporção de 1 a 800 e esterilizar.

2. TSA (Ágar de tripticase de soja/ágar de digestão de soja comcaseína). Digestão pancreática de caseína 15,0 g; digestão com papaína defarinha de soja 5,0 g; Cloreto de sódio 5,0 g; Ágar 15,0 g; Água 1000 mL; pHapós esterilização: 7,3 ± 0,2.

3. TSB (Caldo de tripticase de soja/caldo de digestão de caseínade soja). Digestão pancreática de caseína 17,0 g; digestão com papaína de

farinha de soja 5,0 g; Cloreto de sódio 5,0 g; fosfato de sódio dibásico 2,5 g;Dextrose 2,5 g; Água 1000 mL; pH após esterilização: 7,3 ± 0,2;

4. SDA (Ágar de dextrose de Sabouraud); Dextrose 40 g; Mistu-ra de partes iguais de digestão péptica de tecido animal e digestão pancreá-tica de caseína 10,0 g; Ágar 15,0 g; Água 1000 mL; misturar e levar à ebuli-ção para obter uma solução; pH após esterilização: 5,6 ± 0,2,

5. FLM (meio de Iactose fluido). Extrato de carne 3,0 g; diges-tão pancreática de Gelatina 5,0 g; Lactose 5,0 g; Água 1000 mL; Esfriar tãorapidamente quanto possível após esterilização. pH após esterilização: 7,1 ± 0,2.

Exemplo 50 - Análise de Gel de Focalizacão Isoelétrica de CTLA4-lq

A finalidade desse exemplo é determinar o ponto isoelétrico,número de isoformas e micro heterogeneidade de CTLA4-lg.Materiais

Kit de Calibração IEF (pH de 3 a 10), (Amersham Pharmacia,Catálogo N0 17-0471-01) ou (pH de 2,5 a 6,5), (Amersham Pharmacia, Catá-logo No. 17-0472-01).

Ampholine PAGpIate gel: pH de 4,0 a 6,5, (Amersham Pharma-cia, Catálogo N0 80-1124-81).

Aplicadores de amostra de IEF (Amersham Pharmacia, CatálogoN0 80-1129-46).

Tiras de eletrodo de IEF (Amersham Pharmacia, Catálogo N0 80-1104-40).

Ácido fosfórico (85%), (EMD, Catálogo N0. PX0995-6).

Equipamento

Multiphor Il Electrophoresis System, (GE Healthcare, CatálogoN0 18-1018-06).Preparo de Reagentes

Solução Tampão de Anodo (ácido glutâmico a 0,1 M em ácidofosfórico a 0,5 M) (pavios embebidos com a mesma são colocados sobre olado (+) do esfregaço).

Exemplo:

3,4 mL de ácido fosfórico a 85%1,47 g de ácido glutâmico a ±0,02 gÁgua com grau para HPLC

Combinar os reagentes acima em um cilindro graduado de 100mL, compondo até 100 mL com água com grau para HPLC, tampar e inver-ter várias vezes para misturar.

Armazenar a solução a 2-8°C durante até seis meses.Solução Tampão de Catodo (β-alanina a 0,1 M) (pavios embebidos com amesma são colocados sobre o lado (-) do esfregaço).

Exemplo:

0,9 g de β-alanina a ± 0,02 gÁgua com grau para HPLC.

Combinar os reagentes acima em um cilindro graduado de 100mL, compondo até 100mL com água com grau para HPLC, tampar e inverter várias vezes para mis-turar.

Armazenar a solução a 2-8°C durante seis meses.Solução de Fixação (ácido 5-sulfo-salicílico a 3,5% em ácido tricloroa-cético a 12%).

Exemplo:

240 g de ácido tricloroático a ± 5,0 g70 g de ácido 5-sulfo-salicílico a ±2,0 g2000 mL de água para HPLC

Combinar os reagentes acima para compor um volume de 2000mL.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até trêsmeses.Solução de coloração:

Misturar a solução GeICode Blue Reagent imediatamente antesde uso invertendo gentilmente e agitando a garrafa várias vezes.

Nota: É importante misturar o reagente de coloração antes deentornar ou distribuir para assegurar que uma amostra de reagente homo-gênea de usada.

Preparo de Controle de Coloração:

Reconstituir a Anidrase Carbônica Il com água com grau paraHPLC para fazer uma solução de estoque a 1,0 mg/mL.10 µl. de solução de estoque são combinados com 90 µl_ de á-

gua com grau para HPLC para proporcionar uma solução de trabalho a 0,10µg/µl.

carregar 10 µl da solução a 0,10 µg/µl sobre o gel (carga de 1,0 µg)·

Procedimento

Diluição de amostra

Preparar uma solução de amostra a 20 µg/µL e material de refe-rência em água para HPLC.

Concentração desejada(2 µg/µl-)

- x 200 µl. = µl de amostra adicionado até um volume final de 200 µl

Concentração de amostra

(50 µg/µl)

Exemplo:

2 µg/µl

- x 200 µl = 0,04 ? 200 µl = 8 µl de amostra (adicionar 192 µl de água HPLC) 50 µg/µl

Aparelho e Preparo de Gel

Conectar a placa de resfriamento da unidade de eletroforese

Multiphore Il ao Circulador Termostático e ajustar a temperatura a 10°C ±2°C.

Nota: Deixar o circulador pelo menos 20 minutos para atingir atemperatura acima.

Remover o gel do refrigerador. Cortar cuidadosamente ao longodos lados do envelope, certificando-se de não cortar o gel/suporte de gel.Adicionar aproximadamente 1,0 ml_ de água com grau para H-PLC a uma borda da plataforma de resfriamento.

Colocar uma borda do gel/suporte de gel na água de modo quea ação capilar transporte a água através de toda a borda do gel. Lentamen-te, certificar-se de que bolhas de ar não estão encerradas, aplicar o gel atra-vés da plataforma de resfriamento. Água com grau para HPLC adicional po-de ser aplicada se necessário.

Remover o filme transparente da superfície do gel.

Embeber um eletrodo com Solução Tampão de Anodo e colocarsobre a borda do gel mais próxima das marcações (+) da plataforma de res-friamento.

Embeber um eletrodo na Solução Tampão de Catodo e colocarsobre o outro lado do gel, o qual está mais próximo das marcações (-) sobrea placa de resfriamento.

Após as tiras de eletrodo terem sido aplicadas, cortar cuidado-samente o excesso usando uma lâmina de barbear nova, de modo que astirar terminam na borda do gel e não no suporte de gel.

Aplicar pedaços de aplicação de amostra sobre as marcações (-)do lado mais próximo sobre a plataforma de resfriamento, certificando-se deque há bom contato entre os pedaços de aplicação de amostra e o gel.

Nota: Certificar-se de que os aplicadores de amostra de IEF nãotocam a tira embebida com tampão de catodo, não vazam para o tampão decatodo e estejam suficientemente separadas para assegurar que cada a-mostra ocorre separadamente. Um aplicador de amostra deverá estar fir-memente colocado sobre o pedaço de gel.

Colocar o prendedor de eletrodo da unidade Multiphor Il e ali-nhar os eletrodos ao longo do centro dos cabos de eletrodo sobre o gel. Co-nectar os dois eletrodos do prendedor de eletrodo à unidade de base e colo-car a tampa de segurança em posição. Usando fita adesiva, cobrir os orifí-cios na tampa de segurança para impedir o gel de secar. Conectar os eletro-dos ao suprimento de energia. Pré-focalizar o gel com o conjunto de supri-mento de energia nos ajustes abaixo, até a tensão atingir >300V.Tabela 1. Ajustes de suprimento de energia para géis de IEF pré-foco

<table>table see original document page 625</column></row><table>

Carregamento de gel

Após o gel ter sido pré-focalizado, desligar o suprimento de e-nergia, remover a tampa de segurança, desconectar os eletrodos e removero prendedor de eletrodo da unidade Multiphor II.

Carregar as amostras sobre aplicadores de amostra em umaseqüência específica. Para esse procedimento, certifique-se de que a tira detampão de catodo (-) está próxima do analista.

As amostras são carregadas da direita para a esquerda. Primei-ro, fazer duas ou mais aplicações dos padrões de calibração de IEF (fileiras1 & 2), uma do material de referência (fileira 3), uma da amostra de teste N01 (fileira 4), uma do preparado de controle de calibração (fileira 5), uma deamostra de teste N0 2 (fileira 6), uma do material de referência (fileira 7) euma do padrao de calibração de IEF (fileira 8).

Adicionar as terceira e quarta amostras aplicando uma aplicaçãode material de referência (fileira 9), uma aplicação de amostra de teste N0 3(fileira 10), uma aplicação do reparo de controle de coloração (fileira 11),uma aplicação de amostra de teste N0 4 (fileira 12), uma aplicação de mate-rial de referência (fileira 13) e uma aplicação de padrão de calibração de IEF(fileira 14). As quinta e sexta amostras são aplicadas repetindo o mesmopadrão que as amostras 3 e 4, usando as fileiras 15 a 20. O padrão de car-regamento de amostra é mostrado na Tabela 2.Tabela 2. Dilução de amostra e padrão de carregamento de gel

<table>table see original document page 626</column></row><table>

Eletroforese. Quando o gel está carregado, colocar o prendedorde eletrodo da unidade Multiphor Il e alinhar os eletrodos ao longo do centrodos cabos de eletrodo sobre o gel. Conectar os dois eletrodos do prendedorde eletrodo à unidade de base e colocar a tampa de segurança em posição.Usando uma fita adesiva, cobrir os orifícios na tampa de segurança para im-pedir o gel de secar. Conectar os eletrodos ao suprimento de energia. Ajus-tar tensão, corrente e energia apropriados e começar a operação.Tabela 3. Ajustes de suprimento de energia para operação dos géis deIEF

<table>table see original document page 626</column></row><table>

Após o gel ter sido operado, desligar o suprimento de energia,remover a tampa de segurança, desconectar os eletrodos e remover o pren-dedor de eletrodo da unidade Multiphor II. Remover cuidadosamente os ca-626bos de eletrodo e aplicadores de amostra do gel.

Nota: Você pode colocar o gel de esfregaço diretamente em so-lução de fixação e deixar os cabos de eletrodo e peças de aplicação flutuardo gel.

Remover o gel/suporte de gel da lâmina de resfriamento e colo-car em um disco plano contendo um volume suficiente de solução de fixação(etapa 3.3) para manter o gel úmido. Cobrir com um envoltório plástico e co-locar sobre uma plataforma orbital e incubar 20 - 60 minutos. Registrar ostempos inicial e final sobre a planilha de IEF.

NOTA: Géis de IEF deixados em fixador muito tempo algumasvezes delaminam. Isso é evitado limitando o tempo de fixação para aproxi-madamente uma hora.

4.5 Coloração do gel

Após fixação, enxaguar o gel 3 χ 5 minutos com um volume sufi-ciente de água com grau para HPLC para manter o gel úmido. Registrar ostempos inicial e final sobre a planilha de IEF.

Após mistura da solução de Reagente de Coloração GeICodeBlue antes de uso (etapa 3.4), colocar o gel em um volume suficiente de co-rante para manter o gel úmido. Incubar 15-24 horas em um recipiente her-meticamente vedado para impedir evaporação de reagente. Registrar ostempos inicial e final sobre a planilha de IEF.

Géis corados são descorados substituindo a Solução de Colora-ção por água com grau para HPLC. Enxaguar o gel com pelo menos trêstrocas de água durante um período de 1-2 horas. Registrar os tempos iniciale final sobre a planilha de IEF. Após descoloração, o gel está pronto paraexploração.

Nota: Lavagens adicionais podem ser requeridas para reduzira coloração debase sobre o gel de IEF.

Adequabilidade de sistema

Padrões de focalização isoelétrica deverão ser facilmente distin-guidos da base. Padrões de proteína que migram para valores de pl entre4,0 e 6,5 são visíveis sobre o gel. Padrões de proteína com pis que estãofora dessa faixa não são visíveis sobre o gel. Os marcadores de pl a 3,50,4,55, 5,20 e 5,85 são identificados e rotulados sobre a imagem do gel.Tabela 4: Componentes dos padrões de calibração IEF

<table>table see original document page 628</column></row><table>

Um controle de coloração-padrão de anidrase carbônica Il (pl de5,4) em um baixo nivel de carregamento de proteína (1,0 μg) é usado paravisualização da consistência de coloração do gel. Essa banda deve ser fa-cilmente distinguida da base através de inspeção visual da imagem de gelexplorada.

O material de referência de CTLA4-lg deverá ser enumerado a10-22 bandas dentro da faixa de pl de 4,3 a 5,6.

A intensidade cumulativa percentual das principais bandas pro-eminentes de material de referência de CTLA4-lg deverá estar >90% dentroda faixa de pl de 4,3 a 5,3.

Para o material de referência, confirmar através de inspeção vi-suai que existem três bandas principais focalizadas entre os marcadores depl de 4,5 - 5,2 (veja figura para o padrão das bandas principais).Exploração e análise de gel

Após eletroforese e coloração, todos os géis são explorados u-sando um densitômetro. Os arquivos de imagem são armazenados sobre odisco rígido/network local do computador e arquivados via a network de árealocal. A análise das imagens de gel exploradas é realizada usando o softwa-re ImageQuant TL (v2003.03). Os parametros de exploração e análise sãolistados na Tabela 5. As explorações são geradas e quantificadas usando osprocedimentos do departamento.

Tabela 5 - Parametros de exploração e análise de gel

Nota: Os procedimentos acima proporcionam etapas básicaspara a análise de imagens de gel. Os parametros de exploração na Tabelasão definidos. Os parametros de detecção de banda na Tabela são ajustesiniciais sugeridos. Ajuste dos parametros de detecção de banda pode sernecessário para identificar precisamente bandas em virtude de alteraçõesfísicas do gel (tal como encolhimento do gel após coloração/descoloração) ealteração do formato e desvio de banda do gel. Corrigir manualmente quais-quer bandas que faltam ou que foram erroneamente identificadas.

Explorar os géis usando os parametros de exploração definidosna Tabela. Toda a análise e avaliações do gel deverão ser feitas a partir daimagem explorada. Abrir um arquivo de imagem (dados brutos explorados)de <1D Gel Analysis> no ImageQuantTL. Ir para <Contrast> na barra deferramentas e diminuir o parâmetro <lmage Histogram> até que todas asbandas estejam claramente visíveis. Selecionar <Lane Creation> e ecolher<Manual> para ajustar <Number of Lanes> a ser analisado. Ajustar <Lane% Width> para 100% para cobrir as fileiras de gel. Alinhar apropriadamentefileiras únicas se necessário. Usar o método <Rolling Ball> para subtrair abase. Detectar bandas usando os ajustes iniciais <Minimum Slope>, <Noi-se Reduction>, <%Maximum Peak> listados na Tabela 3. Ajuste dessesvalores é necessário para identificar precisamente as bandas. Computar ovalor de pl de banda usando o marcador de pl padrão dos marcadores rotu-lados listados na Seção Adequabilidade de Sistema para o gel com pH/pl de4,0-6,5. Pular as etapas de calibração e normalização. Enumerar o númerode bandas dentro da faixa de pl de 4,3 a 5,6. Exportar os resultados na pla-nilha do Excel para documentação e relatório adicionais.

Cálculo da Intensidade Cumulativa Percentual de AmostrasCom relação ao Material de referência.

Nota: A intensidade cumulativa percentual para a amostra é opercentual de bandas que migram dentro da faixa de pl de 4,3-5,3, quandocomparado com 100% de todas as bandas presentes na fileira. A seguinteequação deverá ser usada para o cálculo da intensidade cumulativa percen-tual de amostras com relação ao material de referência:

<formula>formula see original document page 630</formula>

Nota: Refira-se ao padrão de carregamento de gel; o material dereferência próximo a uma amostra deverá ser usado para o cálculo. Se o15 material de referência tem um valor cumulativo de 100% e a amostra tem umvalor de 95%, o percentual relativo da amostra é 95/100*100 = 95%. Se areferência tem um valor cumulativo de 95% e a amostra tem um valor de100%, o percentual relativo da amostra é 100/95*100 = 105%.Reportagem de resultados

Reportar o número de bandas enumerados dentro da faixa de plde 4,3 - 5,6. Reportar a intensidade cumulativa percentual com relação à-quela do material de referência de CTLA4-lg dentro da faixa de pl de 4,3 -5,3 (veja figura para um exemplo de como reportar a análise de gel IEFquantitativa definida nesse método). Confirmar através de inspeção visualque existem três bandas principais focalizadas entre os marcadores de pl4,5 - 5,2 com relação ao material de referência (veja figura 1 para o padrãode bandas principais) e reportar o número de bandas principais observadodentro dos marcadores de pl 4,5 - 5,2. Confirmar, através de inspeção visu-al, que nao existem mais novas bandas significativas entre os marcadoresde pl 4,5 - 5,2 com relação ao material de referência.

Em determinadas modalidades, os resultados desse métodomostrarão bandas em uma faixa de pl de 4,3- 5,6 ou 4,3 - 5,3, sendo identifi-cadas de 10 a 22 bandas, com a intensidade de banda cumulativa de 90 -110%. Em outra modalidade, a faixa de pl é de 4,5 - 5,2 com 3 bandas prin-cipais. Em outra modalidade, a faixa de pl é 4,3- 5,6 com 10 a 22 bandas.Em outra modalidade, a faixa de pl é 4,3 - 5,3 com uma intensidade de ban-da cumulativa de 95 - 105%. Em outra modalidade, a faixa de pl é de 4,5 -5,2 com 2 bandas proeminentes.

Exemplo 51: SDS-PAGE de CTLA4-lq

O exemplo mostra o exame de CTLA4-lg sob condições reduzi-das e não-reduzidas através de SDS-PAGE.

Materiais

2X Tampão de Amostra de Tris-Glicina (Tris-GIy) SDS (Invitro-gen, Catálogo N0 LC2676).

10X Agente de Redução de Amostra "NuPAGE" (Invitrogen, Ca-tálogo N0 NP0004).

Gel de Tris-glicina a 4-20% - cavidades de 1,0 mm χ 12 (Invitro-gen, Catálogo N0 EC60252BOX).

10X tampão de Operação de Tris-Glicina SDS (Invitrogen, Catá-logo N0 LC2675).

Padrão Não Corado de Faixa Ampla Markl2TM (Invitrogen, Ca-tálogo N0 LC5677).

Reagente de Coloração GeICode Blue (Azul Coomassie), (Pier-ce, Catálogo N0 24590: 500 mL; Catálogo No. 24592: 3,5 L).

Kit SilverSnap® Stain Il (coloração com prata) (Pierce, CatálogoN0 24612).

Instrumentação:

Xcell SureLock Mini Cell (Invitrogen, Catálogo No. EI0001).

Suprimento de energia para eletroforese (OWL Separation Sys-tems, Catálogo N0 OSP-300).

Reagentes:Solução de fixação para corante Azul Coomassie (metanol a50% e ácido acético a 7% em água com grau para HPLC).

Exemplo:

A um recipiente graduado de tamanho apropriado contendo umabarra de agitação:

Adicionar 500 mL de Metanol.

Adicionar 70 mL de Ácido acético.

Ajustar o volume para 1000 mL com água com grau para HPLC.

Armazenar em temperatura ambiente durante até seis meses.

Corante azul Coomassie (GeICode Blue). Usar retificação dorecipiente. Adicionar quantidade suficiente para cobrir o gel, aproximada-mente 50 mL para um mini gel (10 χ 10 cm) em uma pequena bandeja. Ar-mazenar a 2-8°C durante até um ano.

Solução de Fixação de Corante de Prata (etanol a 30% e ácido acético a 10% em água com grau para HPLC).

A um recipiente graduado de tamanho apropriado contendo umabarra de agitação: Adicionar 300 mL de Etanol. Adicionar 100 mL de Ácidoacético. Ajustar o volume para 1000 mL com água com grau para HPLC.Misturar solução e armazenar a solução em temperatura ambiente duranteaté seis meses. Solução de Lavagem de gel (etanol a 10%).

A um tubo para centrífuga de 50 mL: Adicionar 1,0 mL de Inten-sificador (Kit de Coloração com Prata). Adicionar 50 mL de Corante de Prata(Kit de Coloração com Prata). Tampar o tubo e misturar através de leve tur-bilhonamento durante 3 a 5 segundos. Solução de Trabalho de Revelador.

Preparar imediatamente antes de uso.

A um tubo para centrífuga de 50 mL: Adicionar 1 mL de Intensifi-cador (Kit de Coloração com Prata). Adicionar 50 mL de Revelador (Kit deColoração com Prata). Tampar o tubo e misturar através de leve turbilhona-mento durante 3 a 5 segundos. 1X tampão de Operação de Tris-GlicinaSDS. Preparar no dia de uso. A um cilindro graduado: Adicionar 900 mL deágua com grau para HPLC. Adicionar 100 mL de 10X tampão de Operaçãode Tris-Glicina-SDS. Combinar os reagentes acima, cobrir com parafilme einverter várias vezes para misturar.

Controle de Coloração. Adicionar 1 mL de água com grau paraHPLC a um frasco contendo 2 mg de inibidor de Tripsina (controle de colora-ção). Isso proporcionará uma solução de estoque a 2 µg/µL estável duranteseis meses a -200 C. Para impedir degradação em virtude numerosos ciclosde congelamento/descongelamento, transferir alíquotas de 50 µL para pe-quenos tubos e armazenar a -200 C. Adicionar 25 µL de solução de estoquea 75 µL de água com grau para HPLC a fim de proporcionar uma solução a0,5 µg/µL. Adicionar 40 µl da solução a 0,5 µg/µL a 160 µl de água comgrau para HPLC a fim de proporcionar uma concentração de 0,1 µg/µL. Adi-cionar 10 µl da solução a 0,1 µg/µL, 50 µl de 2X tampão de Amostra deTrisGIy e 40 µl de água com grau para HPLC a um tubo para microcentrífu-ga. A concentração final do controle de coloração de inibidor de Tripsina éde 0,01 µg/µL. Amostras analisadas quanto à liberação e coradas com AzulCoomassie são carregadas em uma concentração de 10 mg por 10 µl.

Para géis com Azul Coomassie, diluir o Material de referência eamostra em água com grau para HPLC para uma concentração de 10 µg/µL.Exemplo: Adicionar 80 µl de uma solução de amostra de Material de Refe-rência a 50 µg/µL + 320 µl de água com grau para HPLC. Para Amostrasnão-reduzidas, adicionar 10 µl da solução concentrada a 10 µg/µL a 50 µlde 2X tampão de Amostra de Tris-Gly e 40 µl de água com grau para HPLCem um tubo para microcentrífuga. Para as Amostras reduzidas, adicionar10 µl da solução a 10 µg/µL a 50 µl de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly,30 µl de água com grau para HPLC e 10 µl de 10X Agente de Redução.Para géis corados com prata, diluir ainda uma solução a 10 µg/µL para 1µg/µL em água com grau para HPLC. Exemplo: Adicionar 40 µl de soluçãoa 10 µg/µL + 360 µl de água com grau para HPLC. Para Amostras não-reduzidas, adicionar 10 µl da solução a 1 µ9/µl a 50 µl de 2X tampão deAmostra de Tris-Gly e 40 µl de água com grau para HPÍC em um tubo paramicrocentrífuga. Para as Amostras reduzidas, adicionar 10 µl da solução a1 µg/µl, 50 µl de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly, 30 µl de água comgrau para HPÍC e 10 µl de 10X Agente de Redução a um tubo para micro-centrífuga. Para o placebo, combinar 50 μΙ_ de 2X tampão de Amostra deTris-Gly e 50 μΙ_ de água com grau para HPLC em um tubo para microcentrí-fuga.

Tabela 6: A faixa de peso molecular (kDa) para bandas esperadas deproteína mínima que podem estar presentes em amostras de abataceptreduzidas e não-reduzidas

<table>table see original document page 634</column></row><table>

Remover o(s) gel(éis) de sua embalagem e enxaguar o exteriorcom água com grau para HPLC para remover pedaços de poliacrilamida.Remover cuidadosamente o pente da cavidade certificando-se de que ascavidades estão retificadas com uma ponteira de carregamento de gel senecessário. Encher as cavidades com água com grau para HPLC e sacudirde modo que a água seja removida das cavidades. Repetir o enxágue dascavidades mais duas vezes. 5.2 Inserir os géis no aparelho XCeII de modoque a face curta da lâmina faceia a câmara interna. Se apenas um gel estásendo usado, inserir uma lâmina de Plexiglass sobre o.lado oposto. Cunharo(s) gel(éis) hermeticamente, formando uma câmara interna e uma externa.Encher a câmara interna com 1X tampão de Operação de Tris-Glicina SDS.Verificar quanto a vazamentos, então, encher a câmara externa com 1Xtampão de Operação de Tris-Glicina SDS. Todos os géis devem conter pelomenos uma fileira com Placebo e uma fileira com marcador de peso molecu-lar. Adicionar um Controle de Coloração para géis corados com Azul Coo-massie apenas. Usar ponteiras de carregamento de gel. Carregar pelo me-nos um "Placebo" entre as amostras reduzidas e não-reduzidas. Tratar osmarcadores de peso molecular como amostra reduzida. Isso ajudará a pre-venir a redução das amostras não-reduzidas em virtude de carregamento deagente de redução. Prender a parte de cima do aparelho Xcell e conectar oseletrodos ao suprimento de energia. Ajustar a corrente para 25 mAmps porgel e ajustar a tensão (v) e energia (w) para o máximo. Se operando doisgéis, ajustar a corrente para 50 mAmps. Ajustar a corrente quando operandodois géis em um aparelho ou múltiplos aparelhos Xcell sobre o mesmo su-primento de energia. Submeter à eletroforese durante 60 ± 5 minutos ou atéque a frente de tampão se mova pelo menos 80% da distância de migraçãodisponível. Registrar o tempo de início e tempo de término sobre a planilha.Separar cuidadosamente duas lâminas plásticas contendo o gel separandocom uma faca para gel. Após separação do gel, seguir o procedimento paracoloração.

Coloração com Azul Coomassie - Colocar o gel em 50 mL desolução de Fixação Azul Coomassie (metanol a 50% e ácido acético a 7%)durante 15 minutos. Enxaguar o gel 3 vezes com ~100 mL de água comgrau para HPLC durante 5 minutos, durante um total de 15 minutos. Adicio-nar o corante Azul Coomassie diretamente ao(s) gel(éis) e incubar durante15 a 24 horas. Os géis corados são descorados substituindo o reagente decoloração Azul Coomassie por 100 mL de água com grau para HPLC. Após1 hora de descoloração, o gel está pronto para exploração.

Exploração e análise de gel. Após eletroforese e coloração, osgéis são explorados usando um densitômetro. Os arquivos de imagem sãoarmazenados no disco rígido do computador e/ou rede e arquivados via anetwork de área local. A análise das imagens de gel exploradas é realizadausando o software ImageQuant TL (v2003.03). As explorações são geradase quantificadas usando os procedimentos do departamento.

Tabela 4: Parâmetros de exploração e análise de gel

<table>table see original document page 635</column></row><table>

Através de inspeção visual, a principal banda de CTLA4-lg redu-zida deve aparecer como uma banda ampla que migra para uma posiçãoproximal ao marcador de peso molecular de 55.400 Da (dehidrogenase glu-tâmica).

Exemplo 52 - DETERMINAÇÃO DE IMPUREZAS DE PROTEÍNA EM CÉ-LULAS HOSPEDEIRAS DE OVÁRIO DE HAMSTER CHINÊS (CHO) EMSUBSTÂNCIA DE FÁRMACO DE CTLA4A29YL104E-lq ATRAVÉS DE ELISA

Esse exemplo descreve um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) para quantificar os níveis de contaminação de proteína resi-dual CD-CH01 de células hospedeiras (HCP) em amostras de teste. UmaIgG anti-CD CH01 HCP policlonal de coelho é primeiro revestida sobre alâmina de microtitulação. Amostras-padrão de referência de HCP1 controlesde qualidade e Substância de Fármaco CTLA4A29YL104E-lg são incubadascom a IgG anti-CD CH01 HCP de coelho ligada. Após lavagem das lâminasde microtitulação, o anticorpo de IgG anti-CD CH01 HCP de coelho policlo-nal/Biotina é adicionado, o qual se liga ao HCP capturado durante a etapainicial. As lâminas de microtitulação são lavadas para remover quaisqueranticorpos policlonais não ligados. Estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre é adicionada e as lâminas de microtitulação são novamente lavadaspara remover quaisquer anticorpos conjugados não ligados. CromogênioTMB é, então, adicionado para proporcionar uma reação colorimétrica. Areação é terminada com ácido sulfúrico e a absorbância é medida a 450 nm em um leitor para microlâmina com 96 cavidades. A cor se desenvolve emproporção à quantidade HCP capturado. As concentrações de amostra sãodeterminadas baseado em uma curva-padrão gerada através de plotagemda absorbância versus concentração de HCP na faixa de 4,11 ng/mL a 3000ng/mL.

A linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO)(DG44) é usada na produção de CTl_A4A29YL104E-lg. Para a produção de pro-teína CD-CH01 (HCP), células DG44 foram estavelmente transfectadas como vetor recombinante pD16 e desenvolvidas em meio CD-CH01 suplemen-tado com galactose e Recombulina. Os anticorpos policlonais para essa ver- são do ELISA foram gerados em coelhos brancos New Zealand imunizadoscom um concentrado de material CD-CH01 HCP. Anticorpos de coelho fo-ram purificados por afinidade (Proteína A), então, submetidos à diálise emsolução salina tamponada com fosfato e concentrados. Aproximadamente 50mg da fração de IgG de anticorpo anti-CD-CH01 de coelho foi biotiniladousando química com N-hidróxi-sulfo-succinimida éster. O anticorpo anti-CHOI de coelho não modificado é usado para revestir lâminas de microtitu- lação com 96 cavidades. Ele captura CD-CH01 HCP1 o qual é detectadopelos anticorpos anti-CD-CH01 de coelho biotinilado. O conjugado de Es-treptavidina/Peroxidase de Rábano-silvestre se liga à biotina e uma reaçãocolorimétrica com cromogênio TMB é usada para quantificar CD-CH01 HCP.

Esse método é projetado para determinar quantitativamente osníveis residuais de proteína CD-CH01 em células hospedeiras através de

ELISA para testagem de liberação de material de Substância de Fármaco deCTLA4A29YL104E.|g

ESBOÇO DO MÉTODOAnticorpo anti-CD-CH01 de coelho é biotinilado usando um kitde biotinilação com hexanoato de sulfo-succinimidila-6 (biotinamido) comoreagente de biotinilação. O reagente de biotinilação da PIERCE (produto N021335) com SuIfo-NHS-LC-Biotina pode ser usado. O anticorpo é rotulado de acordo com as recomendações do fabricante no manual fornecido com oreagente de biotinilação. Após rotulação e separação sobre a coluna de ex-clusão de tamanho, a incorporação de biotina é determinada e a amostra écongelada em alíquotas de 50 μΙ_ em ou abaixo de -70°C. A proporção debiotina/lgG do produto final deverá estar entre 2 e 4. Armazenar em ou abai-xo de -70°C.

Revestimento da lâmina. Preparar uma solução a 8 pg/mL deanti-CD-CH01 HCP purificada de coelho em Tampão de Carbonato a serusado para o revestimento de lâminas de microtitulação (12 mL de soluçãosão requeridos por lâmina de microtitulação). Adicionar 100 pL dessa solu-ção a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Immulon 4 usandouma pipeta com múltiplos canais calibrada. Cobrir a lâmina de microtitulaçãocom parafilme e incubar a 4°C durante 18 + 2 horas.

Lavagem e Bloqueio de lâmina. Lavar a lâmina três vezes comTampão de Lavagem usando um instrumento para lavagem de lâminas. Adi-cionar 300 pL de SeaBIock a cada cavidade usando uma pipeta com múlti-plos canais calibrada. Incubar a lâmina durante 1 hora a 22,5 ± 5°C. Prepa-rar concentrações-Padrão de referência de proteína CD-CH01 e Amostrasde controle de qualidade em tubos de polipropileno estéreis graduados de 15mL. Diluir as amostras de Material de referência e controle de qualidade u-sando Diluente Teknova (1,21). A concentração-padrão é preparada no diado experimento nas concentrações listadas no exemplo abaixo:Diluições para Amostras de Curva-padrão (Exemplo para Preparo Diá-rio)

A concentração de estoque de proteína CD-CH01 é de 5,7mg/mL.

Diluição A:26,3 μl (5,7 mg/mL) + 4,973 mL PTB Diluente = 30 pg/mlDiluição Β:

0,6 mL (30 μg/mL) + 5,4 mL de Diluente 3000 ng/mL2 mL (3000 ng/mL) + 4 mL de Diluente 1000 ng/mL2 mL (1000 ng/mL) + 4 mL de Diluente 333,3 ng/mL2 mL (333,3 ng/mL) + 4 mL de Diluente 111,1 ng/mL2 mL (111,1 ng/mL) + 4 mL de Diluente 37,0 ng/mL2 mL (37,0 ng/mL) + 4 mL de Diluente 12,3 ng/mL2 mL (12,3 ng/mL) +4 mL de Diluente 4,11 ng/mL0 + 4 mL de Diluente 0 ng/mL

Análise de Concentração, Armazenamento e Expiração de QC

Amostras de Controle de Qualidade (QC) em três concentra-ções-alvo diferentes (25, 100 e 700 ng/mL) são preparadas e usadas frescasno dia de análise ou preparadas em maiores quantidades e armazenadascongeladas em alíquotas em ou abaixo -70°C. Alíquotas congeladas sãoanalisadas em três experimentos independentes. O resultado médio calcula-do dos três experimentos é reportada em um Certificado de Análise (COA)para cada uma das três amostras de QC. No dia do experimento, amostrascongeladas de QC são descongeladas e analisadas conforme descrito abai-xo. Após descongelamento, cada amostra de QC é submetida a turbilhona-mento em velocidade média 2-4 segundos. Amostras congeladas de QC ex-piram 6 meses após a data de preparo. Elas são usadas em sua concentra-ção nominal reportada sobre o COA. QC recentemente preparada expira 24horas após preparo.

Diluições para Amostras de Controle de Qualidade (QC) (exemplo)Diluição A: 26,3 μί (5,7 mg/mL) + 4,973 mL de Diluente = 30μg/mL

233 μl (30 μg/mL) + 9,767 mL de Diluente = 700 ng/mL (QC 1)1,43 mL (700 ng/mL) + 8,57 mL de Diluente = 100 ng/mL (QC 2)2,5 mL (100 ng/mL) + 7,5 mL de Diluente = 25 ng/mL (QC 3)

Preparo de amostra. Diluir as amostras de Substância de Fár-maco para aproximadamente 12,5, 6,25 e 3,125 mg/mL.Diluição A: 400 μΙ_ amostra (~25 mg/mL) + 400 μΙ_ de diluente =12,5 mg/mL

Diluição B: 400 μ1_ (-12,5 mg/mL) + 400 μΐ de diluente = 6,25mg/mL

Diluição C: 400 μί (-6,25 mg/mL) + 400 μΐ de Diluente = 3,125mg/mL

Lavagem de lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Tampãode Lavagem usando um lavador para lâminas. Adicionar 100 pL por cavida-de de cada concentração-padrão, amostras e amostras de QC em triplicata àlâmina bloqueada e lavada. Cada concentração de QC é adicionada duasvezes a um total de seis cavidades por lâmina. Veja mapa de lâmina no Mé-todo em Anexo para colocação sugerida. Incubar durante 1 hora a 22,5 ±5°C. Repetir a etapa lavagem 5 vezes. Diluir anti-CD-CH01 HCP/Biotina decoelho para 2 μg/mL em Tampão Teknova. Submeter a turbilhonamento asolução aproximadamente 2-4 segundos em velocidade média. Adicionar100 pL por cavidade. Incubar durante 1 hora a 22,5 ± 5°C. Repetir a etapalavagem 5 vezes. Diluir Estreptavidina-HRP (SA-HRP) apropriadamente emTampão Teknova (exemplo: diluição a 1/20.000 usualmente resulta em leitu-ras de absorbância aceitáveis). Adicionar 100 μί de diluição de SA-HRP acada cavidade e incubar a 22,5 ± 5°C durante 1 hora. Remove o cromogênioTMB do refrigerador e decantar um mínimo de 10 mL por lâmina em um re-cipiente adequado. Colocar em um local escuro e deixar ir para a temperatu-ra ambiente. Repetir a etapa lavagem 5 vezes. Adicionar 100 μί de cromo-gênio TMB a cada cavidade e incubar a 22,5 ± 5°C durante aproximadamen-te 2 minutos. Cessar a reação com cromogênio através da adição de 100 μίde H2SO4 a 1N a cada cavidade. Adicionar Solução de Término às lâminas ecavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionado para asse-gurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzima em cadacavidade. Medir a absorbância a 450 nm com um comprimento de onda dereferência de 630 nm sobre um leitor para lâmina com 96 cavidades apropri-ado.

ANÁLISE DE DADOS. O modelo "CH01 Elisa modelo.ppr" doprograma Softmax é ajustado para gerar valores médios, desvios-padrão,CVs %, concentrações calculadas, parâmetros de adaptação de curva, etc.

Curva-padrão. Dados-Padrão de Referência são adaptados auma curva-padrão usando uma função de adaptação de curva com quatroparâmetros:

<formula>formula see original document page 641</formula>

onde:

Y = valor de absorbância (A450-A630)

A = valor de absorbância correspondendo ao assíntota mínimo

D = valor de absorbância correspondendo ao assíntota máximo

C = absorbância correspondendo à metade da diferença absolu-ta entre os valores assintóticos máximo e mínimo (ponto de inflexão).

B = o declínio no ponto de inflexão da curva

X = concentração de CD-CH01 HCP

O modelo "CH01 Elisa modelo.ppr" do programa Softmax de-termina o coeficiente de correlação (R2) da linha de regressão para os pa-drões usando a média calculada.

VALORES EXEMPLIFICATIVOS. Determinar se os resultados-Padrão, QC e amostras vão ao encontro dos valores exemplificativos Iista-dos abaixo.

Valores exemplificativos para os padrões. O coeficiente decorrelação (R2) para a Curva-padrão deve ser > 0,99. A base média para aconcentração-padrão de zero ng/mL deve ser <0,2 unidades de absorbância.Se duas ou mais das sete concentrações nominais da curva-padrão, exclu-indo zero e concentrações abaixo o QL (12,3 ng/mL), não vão ao encontrodas condições 6.1.4 e 6.1.5, o ensaio é considerada inválido e deve ser re-petido. A média dos valores calculados (ng/mL) em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e concentra-ções abaixo do QL (12,3 ng/mL) deve estar dentro de 20% do valor-alvo(nominal). O coeficiente de variação (CV%) dos valores de absorbância emtriplicata em cada concentração-padrão, excluindo zero e concentrações a-baixo do QL (12,3 ng/mL) deve ser menor de 20%. Para assegurar que pelomenos dois pontos de dados congruentes estão disponíveis para cálculo; ospadrões, controles de qualidade e amostras são carregados em cavidadesem triplicata. Analisar cada valor em triplicata separadamente. Reduzir o va-lor que repousa mais distante do alvo. Recalcular a curva e reanalisar osvalores exemplificativos.

Exemplo:

<table>table see original document page 642</column></row><table>

O único valor que está mais distante do valor-alvo de 25 ng/mL é12 ng/mL. Eliminando o valor de 12 ng/mL da triplicata, a média dos valoresrestantes irá ao encontro dos valores exemplificativos. Se é mostrado que amédia dos dois valores restantes ainda não vão ao encontro dos valores e-xemplificativos, então, o ponto único é eliminado e a curva é recalculada.Exemplo:

<table>table see original document page 642</column></row><table>

O valor médio é > 20% do alvo, a despeito de qual valor é elimi-nado, portanto, o ponto único cai da curva e a curva será recalculada.

Valores exemplificativos para amostras de QC. A amostra deQC é um conjunto de seis cavidades na concentração estabelecida. Pelomenos quatro das seis cavidades para uma amostra de QC devem estardentro de 20% do nominal para que a amostra de QC seja aceitável. Todasas três amostras de QC devem ser aceitáveis. Se esses valores exemplifica-tivos não são obtidos, o ensaio deve ser repetido.

Valores exemplificativos para amostras de teste. O valor deabsorbância para a amostra de teste ensaiada deve ser menor do que amaior QC. Se o valor excede aquele da maior amostra de QC1 a amostra deteste deve ser diluída suficientemente de modo a obter um valor médio entre700 e 12,3 ng/mL. Pelo menos uma de três diluições de amostra (12,5, 6,25e 3,125 mg/mL) deve cair dentro da faixa da curva-padrão para um resultadoreportável, a menos que a absorbância para todas as diluições esteja abaixoo QL do ensaio. Nesse caso, as amostras de teste são reportadas como<QL. A média dos valores de absorbância em triplicata da diluições de a-mostra que são maiores do que o QL e cai dentro da faixa do ensaio deveráexibir uma CV de menos do que 20%.

CÁLCULO E REPORTAGEM DE RESULTADOS DE CON-CENTRAÇÃO DE CD-CHOI HCP NAS AMOSTRAS. Cálculo de concentra-ção de CD-CH01 HCP nas amostras. Multiplicar os resultados médios daamostra pelo fator de diluição apropriado (isto é 2, 4 e 8) para obter a con-centração de CD CH01 HCP na amostra não diluída em ng/mL para cadaumas das diluições. Determinar a média para os resultados daquelas dilui-ções que caem dentro da faixa do ensaio. Dividir o resultado pela concentra-ção de proteína de CTI_A4A29YL104E-lg reportada (mg/mL) para obter a con-centração de CD CH01 HCP em ng/mg de CTLA4A29YL104E-lg.Cálculo exemplificativo:

Resultado médio da amostra: 235 nq de CD-CHQ1 HCP/mL = 9,4 ng/mgCone. de proteína: 25,0 mg/mL

NOTA: ng de CD-CH01 HCP/ mg de produto (ng/mg) é equiva-lente a partes por milhão (ppm).

Exemplo 53: DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE PROTEÍNA A EM C-TLA4A29YLi04E.|g ATRAVÉS DE ELISA

Esse ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) quantificaos níveis de contaminação de Proteína A em amostras de teste de C-TLA4A29YL104E-lg. Antiproteína A de coelho é primeiro revestida sobre umalâmina de microtitulação. Amostras-padrão de referência de Proteína A, con-troles de qualidade, controles de recuperação e CTI_A4A29YL104E-lg são incu-badas com a IgG antiproteína A de coelho ligada. Após lavagem das lâminasde microtitulação, anticorpo monoclonal antiproteína A de coelho biotiniladaé adicionado, o qual se liga à proteína A capturada durante a etapa inicial.As lâminas de microtitulação são lavadas para remover quaisquer anticorposmonoclonais não ligados. Estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre é,então, adicionada após uma hora de incubação; a lâmina de microtitulação énovamente lavada para remover quaisquer anticorpos conjugados não liga-dos. Cromogênio TMB é, então, adicionado para proporcionar uma reaçãocolorimétrica. A reação é terminada com ácido sulfúrico e as densidades óp-ticas são medidas a 450 nm em um leitor para microlâmina com 96 cavida-des. A cor se desenvolve em proporção à quantidade de Proteína A captura-da. As concentrações de amostra são determinadas baseado sobre umacurva-padrão gerada través de plotagem da densidade óptica versus a con-centração de Proteína A na faixa de 0,188 ng/mL a 12 ng/mL.

ESBOÇO DO MÉTODO

Revestimento da lâmina com Anticorpo de captura. Prepararuma solução a 1 μg/mL de anticorpo antiproteína A de coelho em Tampãode Revestimento e adicionar 100 μΙ_ da solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Costar. Incubar a 4°C durante 18 ± 2 horas.Lavagem e Bloqueio de lâmina. Lavar as lâminas três vezescom Solução de Lavagem usando o lavador de lâminas. Adicionar 200 μί deSuperBIock® a cada cavidade. Incubar a lâmina de microtitulação durante60 minutos em temperatura ambiente.

Preparo de Padrão de Referência. Preparar Padrão de Refe-rência através de mistura da quantidade apropriada de Material de referênciaProteína A no volume apropriado de tampão de acetato. Submeter a turbi-Ihonamento solução em velocidade média durante 2-4 segundos. Incubar asamostras de Padrão de referência, Controle de Qualidade e Controle de Re-cuperação durante 10 minutos em temperatura ambiente antes de adição àlâmina de microtitulação.

Exemplo: Material de referência Proteína A, concentração deestoque de 2,3 mg/mL

1: 200 10 μL (2,3 mg/mL) + 1990 μί (Tampão de acetato) =11500 ng/mL

1: 479 10 μί (11500 ng/mL) + 4780 μί (Tampão de acetato) =

2 mL (24 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 12 ng/mL2 mL (12 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 6 ng/mL2 mL (6 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 3 ng/mL2 mL (3 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 1,5 ng/mL2 mL (1,5 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 0,75 ng/mL2 mL (0,75 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 0,375 ng/mL2 mL (0,375 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 0,188 ng/mL0 mL + 2 mL (Tampão de acetato) = 0 ng/mL

Cada concentração-padrão é analisada em triplicata. Colocar assobre lâminas de microtitulação conforme descrito no método em

Preparo de amostras de controle de qualidade. Amostras deControle de Qualidade (QC) de Proteína A são preparadas em tampão deacetato em três níveis de concentração-alvo de 0,5, 2 e 5 ng/mL. Elas sãopreparadas frescas no dia do experimento ou em maiores quantidades e24 ng/mL

amostrasanexo.congeladas em alíquotas de 750 μΙ_ a < -70°C. As concentrações de Proteí-na A nas amostras de QC congeladas são predeterminadas em três experi-mentos ELISA de proteína A independentes usando esse método e os resul-tados da concentração média calculada são reportados como as concentra-ções "nominais" de QC em um Certificado de Análise para cada amostra deQC.

No dia de um experimento, descongelar um frasco de cada umadas três amostras de QC em temperatura ambiente. Analisar cada concen-tração de QC duas vezes (em duas análises em triplicata por concentração ).Colocar as amostras de QC sobre lâminas de microtitulação conforme des-crito no método em anexo.

Material de referência Proteína A, 2,3 mg/mL1: 200 10 μΙ_ (2,3 mg/mL) + 1990 μί (Tampão de acetato) =11500 ng/mL

1: 479 10 μΐ (11500 ng/mL) + 4780 μΐ (Tampão de acetato) =24 ng/mL

833,3 μL (24 ng/mL) + 3,166 mL (Tampão de acetato) = 5 ng/mL (QC1)1,600 mL (5 ng/mL) + 2,4 mL (Tampão de acetato) = 2 ng/mL(QC2) 1 mL (2 ng/mL) + 3 mL (Tampão de acetato) = 0,5 ng/mL (QC3)

Preparo da amostras de teste. Preparar concentrações de 2,5mg/mL, 1,25 mg/mL e 0,625 mg/mL das amostras de teste de C-TLA4A29YL104E-lg em tubos de polipropileno usando tampão de acetato (pH de3,5). Amostras de teste são incubadas durante aproximadamente 10 minutosem temperatura ambiente antes de adição à lâmina de microtitulação.

Lavagem da lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Soluçãode Lavagem usando o lavador de lâminas. O lavador de lâminas deverá serajustado para encher as cavidades com 300 μί de tampão de lavagem, tem-po de embebimento zero. Adicionar 100 μί de cada de Padrão de Referên-cia, Controle de Qualidade, Controle de Recuperação e amostras de teste acada cavidade e incubar durante uma hora em temperatura ambiente. Repe-tir a etapa. Diluir anticorpo antiproteína A biotinilado com Diluente Teknovapara uma concentração desejada, conforme indicado através de otimizaçãopara cada novo lote. Por exemplo, fazer uma diluição a 1: 64.000 para o con-jugado de anticorpo monoclonal antiproteína A/biotina, submeter a turbilho-namento em velocidade média e adicionar 100 μL a cada cavidade usandouma pipeta com múltiplos canais. Incubar em temperatura ambiente duranteuma hora.

Diluir Estreptavidina-Peroxidase de Rábano-silvestre com Dilu-ente Teknova para uma concentração desejada, conforme indicado atravésde otimização para cada novo lote. Por exemplo, fazer uma diluição a 1:80.000 para a Estreptavidina-Peroxidase de Rábano-silvestre. Submeter aturbilhonamento em velocidade média e adicionar 100 μL a cada cavidade eincubar durante 30 minutos em temperatura ambiente. Repetir a etapa, maslavar cinco vezes. Adicionar 100 μL de cromogênio TMB a cada cavidade.Incubar em temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos. Adensidade óptica para uma maior concentração para a Curva-padrão deveráestar entre 0,980 e 1.400. Cessar a reação com cromogênio através da adi-ção de 100 μL/cavidade de H2SO4 a 1N. Adicionar Solução de Término àslâminas e cavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionadopara assegurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzimaem cada cavidade. Medir a absorbância a 450 nm com um comprimento deonda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâmina com 96 cavidadesapropriado.

ANÁLISE DE DADOS. Refira-se ao modelo do programa Soft-Max para um ELISA de Proteína A uma vez que ele gera a média, desvios-padrão e CV%s, etc. Todos os cálculos realizados nas seções Análise deDados serão realizados usando um modelo.ppr para ELISA de proteína A noSoftMax Pro.

Calcular a média dos valores de absorbância em triplicata (Abs)obtida para cada concentração de referência e amostra ensaiada. Calcularum modelo de dados para um padrão de Proteína A usando uma regressão

com quatro parâmetros ponderada da forma:

<formula>formula see original document page 647</formula>onde:

Abs = absorbância

min = valor de absorbância correspondendo ao assíntotamínimo

max = valor de absorbância correspondendo ao assíntotamáximo

ED5O = absorbância correspondendo à metade da diferençaabsoluta entre os valores assintóticos máximo e mí-nimo

B= o declínio do ponto de inflexão de adaptação da curva

C = Concentração de Proteína A

VALORES EXEMPLIFICATIVOS

Valores exemplificativos para os padrões. Os valores exem-plificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acima do Iimi-te quantitativo (QL)1 uma vez que valores abaixo do QL são usados apenaspara ajudar a estabelecer os extremos da curva. O coeficiente de determina-ção (R2) para a Curva-padrão deverá ser > 0,99. A base média para o pa-drão de zero ng/mL deverá ser < 0,08 unidade de absorção. A média dosvalores calculados (ng/mL) em cada concentração-padrão usada para de-terminar a curva-padrão exceto zero e o QL devem estar dentro de 15% dovalor-alvo (nominal). A média dos valores de absorbância em triplicata do QLda curva-padrão deve exibir um CV% de menos do que 20% e estar dentrode 20% do alvo.

Exemplo 54 - ELISA PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA SEME-LHANTE A MCP-1 em CTLA4A29YL104E-lq

Esse ELISA é realizado para determinar a concentração de Pro-teína semelhante a MCP-1 em CTLA4A29YL104E-lg. As concentrações de umacurva-padrão (0,4 a 25,6 ng/mL), Controle de Qualidade e amostras de testesão aplicadas à lâminas de microtitulação absorvidas com anticorpo anti-MCP-1 de camundongo de cabra e incubadas durante 60 minutos em tem-peratura ambiente (22,5 ± 5°C). As lâminas são lavadas, anticorpo secundá-rio (IgG anti-MCP-1 de rato de coelho) é adicionado e incubadas durante 60minutos a 22,5 ± 5°C. As lâminas são lavadas, IgG anticoelho de cabra con-jugado com Peroxidase de Rábano-silvestre é adicionada a cada cavidade eincubada durante 30 minutos a 22,5 ± 5°C. As lâminas são lavadas e cromo-gênio TMB é adicionado para proporcionar uma reação colorimétrica. Apóscessar a reação H2SO4 a 1N, as densidades ópticas são medidas a 450 nmem um leitor para microlâmina com 96 cavidades e os dados são modeladosusando uma curva de regressão com 4 parâmetros. A concentração de Pro-teína semelhante a MCP-1 é, então, calculada para cada amostra de testecom relação ao Material de referência MCP-1. A concentração é reportada em ng de proteína semelhante a MCP-1 por mg (partes por milhão, ppm) deamostra dividindo o resultado obtido com relação à Curva-padrão e a con-centração de amostra não diluída. Esse método permite a determinação deimpurezas semelhantes a MCP-1 em amostras biológicas derivadas de cul-tura de células, incluindo em-processo, Substância de Fármaco e produto defármaco purificado. Proteína semelhante a MCP-1 pode estar presente emamostras biológicas produzidas em cultura de células de Ovário de HamsterChinês (CHO). Dois anticorpos policlonais foram identificados, os quais seligam a uma impureza semelhante a MCP-1 purificada de células de CHO.Os anticorpos são dirigidos contra MCP-1 de murino e rato (intacta) e ambosreagem cruzadamente proteína semelhante a MCP-1 de células de CHO, oque é demonstrado nesse relatório.

Revestimento da lâmina. Para revestimento, diluir anticorpoanti-MCP-1 de camundongo de cabra para 5 μg/mL com Tampão de Reves-timento. Revestir as lâminas com 100 μL/cavidade. Cobrir as lâminas comvedantes para lâmina e incubar a 22,5±5°C durante 12 a 18 horas. Lavar alâmina. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem usando umlavador de lâminas. O lavador deverá ser ajustado em três lavagens, 300 μΙ_/cavidade com um tempo de embebimento zero. Alternativamente, as lâminaspodem ser lavadas manualmente. Adicionar 300 μί de solução a cada cavi-dade de cada lâmina usando uma pipeta com múltiplos canais calibrada.Esvaziar as cavidades sacudindo em uma pia e secar gentilmente sobre pa-péis toalha. Repetir três vezes.Bloqueio de lâmina. Adicionar 300 μΙ_ Tampão de Bloqueio &Estabilizante de Revestimento a cada cavidade usando uma pipeta com múl-tiplos canais calibrada. Incubar as lâminas durante uma a duas horas a22,5±5°C.

Lavagem e armazenamento de lâmina. Lavar as lâminas trêsvezes com Solução de Lavagem conforme descrito sob 4.2. Encher as lâmi-nas com 300 μL Tampão de Revestimento por cavidade, cobrir com vedan-tes para lâmina e armazenar no escuro a 2-8°C durante até uma semana.

Preparo dos padrões. A partir do estoque de Proteína seme-Ihante a MCP-1, preparar uma solução a 25,6 ng/mL em PTB e diluir daí emetapas de diluição serial (1: 2) para 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 ng/mLusando PTB como diluente. Alternativamente, padrões congelados podemser usados através de preparo de uma grande quantidade de padrões.Transformar em alíquotas e armazenar a -70°C a -80°C. Evitar congelamen-to/descongelamento repetido. Padrões congelados precisam ser qualificadoscontra Controles de qualidade em três operações ELISA independentes. OsPadrões congelados e QC devem ser aceitáveis em cada operação. Apóstérmino de três operações aceitáveis, um Certificado de Análise é emitido.Padrões congelados serão usados em suas concentrações nominais. Eles expiram 3 meses a partir da data de preparo.

Exemplo para uma referência de MCP-1 com uma concentraçãode estoque de 0,97 mg/mL:

a) Preparar 2,5 mL de 5200 ng/mL em PTB:13,4 mL de estoque + 2,487 mL de Diluente

b) Preparar 160 mL de 25,6 ng/mL em PTB:788 mL de estoque a +160 mL de Diluente

Misturar cada solução através de turbilhonamento do tubodurante aproximadamente 2-3 segundos e, então, invertendo gentil-mente 2-3 vezes.

Controle de qualidade. Controles de qualidade (QCs) são pro-teína semelhante a MCP-1 preparada em concentrações nominais de 17,7ng/mL, 5,3 ng/mL e 1,2 ng/mL em PTB. Preparar uma grande quantidade deQCs1 transformar em alíquotas e armazenar a -70°C a -80°C durante até3 meses. Evitar congelamento/descongelamento repetido. Os controles dequalidade são qualificados contra a Curva-padrão em três operações ELISAindependentes. O QC deve ser aceitável em cada operação. Após términode três operações aceitáveis, o resultado da média calculada para cada QCaceitável é reportado e um Certificado de Análise é emitido. O QC será usa-do em suas concentrações calculadas. Eles expiram três meses a partir dadata de preparo. Exemplo para o preparo de diluições de QC congeladas apartir de uma referência de MCP-1 com uma concentração de estoque de0,97 mg/mL:

b) Preparar diluição final de Proteína semelhante a MCP-Is a-mostras de controle de qualidade como segue:

<table>table see original document page 651</column></row><table>

Misturar cada solução através de turbilhonamento 2-3 segundose, então, inverter gentilmente 2-3 vezes. Alternativamente, QCs podem serpreparados frescos no dia de análise.

Amostras de teste. Amostras de teste são preparadas atravésda adição de 200 μL da amostra de teste a 200 pL de PTB e sujeição a turbi-lhonamento durante 2-4 segundos. Adicionar padrões de referência, contro-les de qualidade (x2) e amostras de teste à lâmina, em triplicata, 100 μL porcavidade e incubar durante 1 hora a 22,5±5°C (não usar as cavidades exter-nas). Preparar anticorpo secundário anti-MCP-1 de rato de coelho em tam-pão de PTB em uma concentração de 2 μg/mL em um volume suficiente pa-ra as lâminas usadas no ensaio. Submeter a turbilhonamento a solução a-proximadamente 2-4 segundos. Repetir a lavagem, mas lavar cinco vezes.Adicionar 100 μL da solução de anticorpo secundário a cada cavidade e in-cubar durante 60 minutos a 22,5±5°C. Preparar solução de anticorpo terciá-rio anti-coelho de cabra conjugado com HRP (por exemplo, diluição a1:20.000 ou diluição apropriada) usando PTB como diluente. Submeter aturbilhonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos. Repetir a lava-gem. Adicionar 100 μΐ_ de conjugado de HRP a cada cavidade e incubar a22,5±5°C no escuro durante 30 minutos. Repetir a lavagem. Adicionar 100μΙ_ de TMB a cada cavidade e incubar a 22,5±5°C no escuro durante 3-6minutos ou até a cor apropriada ter se desenvolvido. Cessar a reação comcromogênio através da adição de 100 μΙ_ de H2SO4 a 1N na mesma ordemconforme a adição de cromogênio foi feita. Ler as densidades ópticas a 450nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm sobre um leitorpara lâminas com 96 cavidades apropriado.

REDUÇÃO DE DADOS

Usar o software Softmax® com o arquivo de protocolo MCP-l.ppr para construir uma curva-padrão usando uma regressão comquatro parâmetros ponderada da forma,onde:

A = valor de absorbância450 correspondendo ao assíntota mí-nimo.

D = valor de absorbância45o correspondendo ao assíntotamáximo.

c = concentração correspondendo à metade da diferença abso-luta entre os valores assintóticos máximo e mínimo.B= o declínio aproximado da porção linear da curva,x= concentração-padrão de referência.

Reportar os resultados apenas para amostras com dados acei-táveis para Curvas-Padrão, controles de qualidade e amostras de teste.

Valores exemplificativos para os padrões. Os valores exem-plificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acima o QL(0,8 ng/mL), uma vez que valores abaixo do QL são usados apenas paraajudar a estabelecer os extremos da curva. A base média (o zero ng/mL depadrão) deve ser <0,1 unidade de absorção. A concentração média recalcu-lada de MCP-1 (ng/mL) em cada concentração-padrão usada para determi-nar a curva-padrão deve estar dentro de 15% do valor-alvo (nominal). O coe-ficiente de variância (CV%) dos valores de A450 em triplicata em cada con-centração-padrão usada para determinar a curva-padrão deve ser <15%. Amédia dos valores de A450 em triplicata no QL da curva-padrão deve exibiruma CV% de < 20% e recalcular para dentro de 20% do alvo (concentraçãonominal, 0,8 ng/mL). Cada valor da triplicata usado para calcular a médiaserá analisado separadamente. O valor que repousa mais distante da médiacairá, a curva recalculada e os valores exemplificativos reanalisados. Se émostrado que a média dos dois valores restantes ainda não vai ao encontrodos valores exemplificativos, então, o ponto único é eliminado e a curva érecalculada.

Valores exemplificativos para amostras de QC. A amostra deQC é definida como um conjunto de três cavidades na concentração estabe-lecida, portanto, para as três concentrações nominais estabelecidas nesse método, há um total de seis amostras de QC. As concentrações recalculadasde pelo menos duas das três cavidades para uma amostra de QC devemestar dentro de 20% da concentração-alvo previamente determinada (vejaCOA) para que a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos quatro das seisamostras de QC devem ser aceitáveis; duas das seis amostras de QC (nãoduas na mesma concentração) podem ser inaceitáveis e não mais do que 6das 18 cavidades com amostra de QC podem se desviar mais de 20% dasrespectivas concentrações-alvo. Se esses valores exemplificativos não sãoobtidos, o ensaio deve ser repetido.

Valores exemplificativos para amostras de teste. A concen-tração média calculada de MCP-1 deve ser menor do que a concentração damaior QC. Se a concentração média calculada de MCP-1 é > 0,8 ng/mL (oQL), a CV% das determinações em triplicata deve ser < 20%. Se essa con-dição não é obtida, o resultado da amostra não é válido e deve ser repetido.Se esse critério é obtido, a concentração média calculada de MCP-1 é usadapara calcular o resultado final. Se a concentração calculada de MCP-1 é <0,8 ng/mL (QL), a amostra é reportada como < QL e o valor "< 0,8 ng/mL" éusado no cálculo do resultado final.Exemplo 55 - DETECÇÃO DE DNA DE CHO EM CTLA4A29YL104E-lq e C-TLA4-lq ATRAVÉS DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE QUANTI-TATIVA

Esse procedimento foi desenvolvido para detectar DNA de CHOresidual nas amostras de Substância de Fármaco usando um ensaio de rea-ção em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). PCR é areplicação de uma mistura de DNA. Esse ensaio usa uma sonda fluorogêni-ca para detectar um produto de PCR de CHO específico à medida que elese acumula durante o ensaio. A taxa de amplificação do produto de PCR édiretamente proporcional à quantidade DNA de iniciação presente na amos-tra.

Conversão do valor de DNA para picograma / miligrama. Ovalor de pg/mL é dividido pela concentração da amostra, determinada atra-vés da absorbância a 280 nm. Cálculo exemplificativo para a amostra tendouma concentração de proteína de 50 mg/ml_ e um valor reportado a partir daBio-confiança = 0,67 fg/μL-.

Etapa 1: Conversão para pg/mL = 0,67 pg/mL.

Etapa 2: Conversão para pg/mg = (0,67 pg/mL / 50,0 mg/mL) =0,013 pg/mg.

Exemplo 56: ANÁLISE DE CTLA4A29YL104E-lq ATRAVÉS DE SDS-PAGE

Esse exemplo descreve a análise de CTI_A4A29YL104E-lg para aavaliação da pureza de Substância de Fármaco e produto de fármaco deCTI_A4A29YL104E-lg. CTI_A4A29YL104E-lg é uma proteína de fusão manipuladaconsistindo em um domínio de ligação a Iigante modificado do antígeno 4 delinfócito T citotóxico (CTLA4) e a região Fcyl de IgG humana. CTLA4A29YL104E-lgtem um peso molecular de -92 kDáltons e um peso molecular evidente de97 kDáltons (não-reduzida) ou 55 kDálton (reduzida). Eletroforese de C-TLA4A29YLi04E_|g sobre géjs de sDS-poliacrilamida em gradiente de 4-20%separa as espécies monoméricas principais de espécies de maior peso mo-lecular (agregados, dímeros e multímeros de maior ordem), bem comoquaisquer espécies de baixo peso molecular (fragmentos de degradação).Exploração densitométrica e quantificação por ImageQuantTL® de géis co-rados com Azul Coomassie proporciona uma medida da pureza de proteína.Os resultados são reportados como pureza percentual de CTI_A4A29YL104E-lgsob condições reduzidas e não-reduzidas.

REAGENTES

NOTA: Todos os reagentes podem ser substituídos por alternati-vas equivalentes. 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS. Adicionar100 mL de 10X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS a um cilindro gra-duado de 1 litro. Q.S. para 1 litro com água Milli-Q ou com grau para HPLC.Cobrir, inverter várias vezes para misturar. Esse reagente deverá ser prepa-rado no dia de ensaio.

NOTA: Preparar um volume adicional se necessário.

Reagente de Coloração Azul Coomassie. Misturar a soluçãode Reagente GeICode Blue Stain imediatamente antes de uso invertendogentilmente ou entornando e girando a garrafa várias vezes. Tal mistura éespecialmente importante quando usando o recipiente GeICode de 3,5 Lcom uma bomba manual (Catálogo No. 24592). Não agitar a garrafa paramisturar a solução. NOTA: É importante misturar o reagente de coloraçãoantes de distribuição para assegurar que a solução é homogêneo.

Solução de Fixação: Metanol a 50% /Ácido acético a 7% emÁgua. Combinar 500 mL de metanol e 70 mL de ácido acético em um cilin-dro graduado de 1 litro. Q.S. com água Milli-Q para 1 litro e Misturar. A solu-ção de fixação solução é estável em temperatura ambiente durante até seismeses. NOTA: A solução de fixação deverá ser preparada em uma coifaquímica.

Preparo de Controle de Coloração. Reconstituir o inibidor detripsina para fazer uma solução a 2 mg/mL de estoque usando água Milli-Q.Preparar alíquotas de 50 μι. e congelar a -30 ± 10°C durante até 6 meses.Usar o seguinte plano de diluição para diluir uma solução de proteína de es-toque para uma concentração de trabalho:

25 μLde solução de estoque + 75 μL de água Milli-Q = 0,5 μg/μL40 μL de 0,5 μg/μL + 160 μL de água Milli-Q = 100 ng/μL.

Usar a tabela diretamente abaixo para preparar a solução decarregamento de Controle de Coloração.

Preparo de amostra para controle de coloração

<table>table see original document page 656</column></row><table>

Carregamento de 10 μί do Preparado de Controle de Coloraçãoproporcionará uma carga de proteína de 100 ng.

PREPARO DE PADRÃO E AMOSTRA

Carregamento-Padrão para Processo Fixo, Substância de Fár-maco GLP/GMP, Produto de Fármaco ou Amostras de Estabilidade.

Diluição para Géis Corados com Azul Coomassie. Diluir osartigos de teste e material de referência para a concentração de trabalho de1,0 μg/μL e carregar reduzido e não-reduzido com marcadores de peso mo-lecular com peso molecular conforme descrito na Tabela diretamente abaixo.Diluição de amostra e carregamento de gel para gel corado com azulCoomassie

<table>table see original document page 656</column></row><table>

Placebo = Carga de 10 μί de 1 X Tampão de amostra NR

NOTA: A banda de controle de coloração é incluída sobre a i-magem de gel explorada para inspeção visual a fim de avaliar a Adequabili-dade de sistema. A banda de controle de coloração está ausenta na imagemde gel derivada para manter a consistência do relatório de gel.

Preparo de amostra e Eletroforese. Diluição de amostra parauma carga de proteína de 10 μο/ΡϋβϊΓβ. Seguir o método abaixo para prepa-rar amostras para uma carga de 10 μg/10 μΙ_. Usando água Milli-Q como odiluente, diluir as amostras de teste e material de referência para 10 mg/mLde CTLA4A29YL104E-lg. Concentrações aproximadas podem ser usadaspara os cálculos. Por exemplo: se a amostra de Substância de Fármaco deCTLA4A29YL104E-lg tem uma concentração de 25 mg/mL, preparar umadiluição a 1: 2,5 (adicionar 40 μΙ_ de amostra a 60 μΙ_ de água Milli-Q). Seguira tabela diretamente abaixo para preparar a amostra final para eletroforese.Usar tubos para microcentrífuga para essas diluições.

Diluição de Amostras de teste

<table>table see original document page 657</column></row><table>

NOTA: Ajustar o volume da solução de proteína e água Milli-Qconforme necessário para obter um volume final de 100 μL.

NOTA: Se a concentração de amostra é < 10 mg/mL, preparar aamostra final de acordo com a tabela acima. Ajustar o volume da solução deproteína e água para maximizar a carga de proteína sobre o gel.

Aquecimento de Amostra. Após preparo de diluições de amos-tra, fechar os tubos para microcentrífuga e submeter o tubo a turbilhonamen-to para misturar a solução. Aquecer a(s) amostra(s) em um banho de água a80 ± 5°C durante 2,0 ± 0,5 minuto (usar um cronômetro calibrado). Removera(s) amostra (s) do calor e deixar que a(s) mesma(s) esfrie para a tempera-tura ambiente. Inverter os tubos várias vezes para remover a condensaçãode cima e dos lados dos tubos.

Aparelho e Preparo de Gel. Remover o gel de sua embalageme remover cuidadosamente o pente, certificando-se de que as paredes dascavidades estejam retificadas. As cavidades pode ser retificadas com umaponteira de carregamento de gel, se necessário. Inserir o gel na unidade deeletroforese de modo que a lâmina de vidro curta faceie a câmara interna.Se apenas um único gel tem de ser operado, inserir um espaçador de Plexi-glass sobre o lado oposto. Cunhar o(s) gel(éis) hermeticamente para vedar acâmara interna da câmara externa. Encher completamente a câmara internacom 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS. Verificar quanto a vaza-mentos, então, encher a câmara externa do fundo das cavidades com 1Xtampão de operação de Tris-Glicina-SDS. Enxaguar gentilmente as cavida-des usando uma pipeta com 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDSpara remover qualquer acrilamida residual. Repetir o enxágue da cavidadeaté que as cavidades estejam completamente limpas e definidas.

Carregamento de Amostra. Usando ponteiras de carregamentode gel, carregar cada cavidade com 10 μί de amostra. Encher todas as filei-ras com placebo com 10 μΙ_ de 1X Tampão de Amostra de Não-Redução.Isso ajudará a prevenir a redução da amostra em virtude de carregamentodo agente de redução e manter uma concentração de sal por todo o gel.

Eletroforese. Fixar a caixa de gel, cobrir e conectar os eletrodosao suprimento de energia. Ajustar a corrente para 25 mAmps/gel (mA) e a-justar a tensão (v) e energia (w) para o máximo. NOTA: O ajuste do supri-mento de energia pode variar de vendedor para vendedor. Ajustar para obter25 mA/gel. Submeter o gel à eletroforese durante 60 minutos ou até que ocorante do tampão de amostra atinja apenas o fundo do gel. Desligar o su-primento de energia, desconectar os condutores e remover o(s) gel(éis) dodispositivo. Separar cuidadosamente as lâminas plásticas. Manter a lâminaplástica com o gel preso sobre a solução de fixação apropriada para a técni-ca de coloração. Submergir o gel na solução até que o gel se desloque dalâmina plástica.

Fixação em Gel. NOTA: Todas as etapas são realizadas emtemperatura ambiente com ligeira rotação sobre o agitador orbital. NOTA:Realizar coloração em um recipiente hermeticamente vedado para impedirevaporação de reagente. NOTA: Embora o volume citado possa ser usado, éimperativo que o gel seja completamente coberto em todas as etapas. O ta-manho do gel e bandeja de coloração devem ser levados em conta na de-terminação dos volumes necessários. Após eletroforese, adicionar 50 mL desolução de fixação (solução de metanol a 50%/ácido acético a 7%) durante15 minutos. Enxaguar o gel 3 vezes durante 5 minutos cada com ~100 ml_de água Milli-Q. Misturar a solução de Reagente de Coloração Coomassieantes de uso e adicionar 50 ml_ para um minigel de 8 χ 10 cm. Reagenteadicional pode ser requerido se uma bandeja maior for usada. Agitar gentil-mente a bandeja usando um Agitador Orbital durante 20 ± 1 hora. Para con-sistência, corar todos os géis no mesmo operador durante o mesmo tempo.Descorar através de substituição do Reagente de Coloração Coomassie com100 ml_ de água Milli-Q. Após 1 hora de descoloração, o gel está pronto paraexploração.

EXPLORAÇÃO DE GEL E ANÁLISE

Após eletroforese e coloração, todos os géis são explorados u-sando um densitômetro e analisados usando o software ImageQuantTL®. Osarquivos de imagem são armazenados sobre o disco rígido local do compu-tador e arquivados via a network de área local. Os parâmetros de exploraçãoe análise são listados na tabela diretamente abaixo.

Exploração de gel e parâmetros de análise

<table>table see original document page 659</column></row><table>

NOTA: Os Parâmetros de Exploração nessa Tabela não devemser alterados durante exploração. Os Parâmetros de Detecção de Banda,Largura % de fileira (ajustado a 75%) e Correção de Base (ajustado em umraio de 200), são recomendados para todas as análises de imagem de gelexploradas (quaisquer alterações precisam ser documentadas). Ajuste dosparâmetros Declínio Mínimo, Redução de Interferência e Pico Máxima %pode ser necessário para identificar precisamente bandas em virtude de dife-renças nas propriedades físicas do gel, tal como encolhimento do gel apóscoloração/descoloração ou diferenças no formato da banda de gel. Corrigirquaisquer bandas que faltam ou erroneamente identificadas. Refira-se aomanual do ImageQuantTL (v2003.03) e instruções na tela para informaçãoadicional para parâmetros de detecção de banda.

Explorar o gel usando os parâmetros listados na Tabela acima.Todas as análises e avaliações do gel deverão ser feitas na imagem explo-rada. Abrir um arquivo de imagem de gel (imagem explorada) do <1D GelAnalysis> no software ImageQuantTL. Ir para <Contrast> na barra de ferra-mentas e ajustar o parâmetro <lmage Histogram - High> para 0,3 para inten-sificar a imagem de gel para visualização clara de todas as bandas.

NOTA: Essa etapa é para fácil visualização da imagem de gelpara permitir a análise e não tem impacto sobre o resultado quantitativo. Nãousar a imagem de gel quantificada para fins de avaliação visual de bandasde gel ou reportagem de gel.

Selecionar <Lane Creation> e escolher <Manual> para ajustar<Number of Lanes> a ser analisado. Ajustar <Lane % Widht> para 75%. Ali-nhar apropriadamente as fileiras únicas se necessário. Usar o método <Rol-Ling Ball> para subtrair a base. Para somar precisamente a base, ajustar<Radius> a 200. Detectar bandas usando os ajustes iniciais <Minimum Slo-pe>, <Noise Reduction> e <%Maximum Peak> listados na Tabela 4. Ajustedesses valores podem ser necessários para identificar precisamente as ban-das. Avaliar manualmente quaisquer bandas que faltam ou que foram erro-neamente identificadas. Determinar o peso molecular de banda através deuso do marcador de peso molecular listado abaixo. Pular as etapas de cali-bração e normalização. Exportar os resultados, incluindo pesos moleculares,volume de banda e % de banda em uma planilha no Excel para documenta-ção e relatório adicional. Onze dos doze padrões de peso molecular listadosna Tabela 5 deverão ser facilmente distinguidos da base (Figura 79).

Nota: A cadeia B de insulina (3,500 Da) e cadeia A de insulina(2,500 Da) podem aparecer como uma única banda ampla ou a cadeia A deinsulina pode não ser visualmente identificada sobre o gel.

Padrões de peso molecular Mark 12<table>table see original document page 661</column></row><table>

Nesse exemplo, as bandas principais do artigo de teste, paranão-reduzidos (monômero) e reduzidos (cadeia simples), têm de ter asmesmas posições relativas sobre o gel que o material de referência C-TLA4A29YL104E-lg. Vide figura 79. O controle de coloração do padrão inibi-dor de tripsina de soja (21,500 Da) a 100 ng/carga deve ser visível sobre aimagem de gel explorada (Figura 79, fileira 12). Com a exceção de umabanda mínima sob condição de não-redução que é comumente observada(cadeia simples) proximal ao marcador molecular com peso de 55,400 Da1 aintensidade relativa percentual de qualquer banda adicional no gel coradocom azul Coomassie deverá ser < 2% para o material de referência.

NOTA: Uma estimativa de peso molecular da banda principalnão pode ser precisamente determinada em virtude sua distribuição não-gaussiana. Inspeção visual do material de referência reduzido proporcionauma única banda ampla que migra para uma posição proximal ao marcadorde peso molecular de 55,400 Da (veja figura 79). A pureza percentual para aprincipal banda reduzida deve ser > 97%. Inspeção visual da banda principaldo material de referência não reduzido proporciona uma única banda amplaque migra para uma posição proximal aos marcadores de peso molecular de97,400 Da e 116,300 Da (figura 79, fileira 2). A pureza percentual da princi-pal banda de material de referência deve ser > 97%. Inspeção visual da prin-cipal banda de material de referência não-reduzido proporciona uma únicabanda ampla major que migra para uma posição proximal aos marcadoresde peso molecular de 97,400 Da e 116,300 Da (figura 79, fileira 2). A purezapercentual da principal banda de material de referência deve ser > 97%.Exemplo 57 - UM MÉTODO DE HPLC PARA A DETERMINAÇÃO QUAN-TITATIVA DE TRITON X-100 EM CTLA4A29YL104E-lq

Triton X-100 é determinado em um baixo nível de partes por mi-lhão (ppm) (<10 ppm) em amostras de proteína de CTLA4A29YL104E-lg atravésde HPLC. O método envolve extração de Triton X-100 sobre meios de extra-ção em fase sólida, seguido por lavagem com água para remover a proteínaresidual e eluição do Triton X-100 com acetonitrila. O eluato de acetonitrila é cromatografado usando uma coluna Phenomenex Hypersil C1 e uma fasemóvel consistindo em acetonitrila: água (80: 20). Detecção é através de UVa 225 nm. O método é linear entre 1-22 ppm com o limite de detecção sendode 0,25 ppm. CTI_A4A29YL104E-lg, um agente imunossupressor em potencial, éuma proteína de fusão de segunda geração, consistindo no domínio de Iiga-ção a Iigante do antígeno 4 de linfócito T citotóxico e da região constante decadeia pesada de IgGI humana. Triton X-100, um tensoativo não-iônico, éusado para inativação viral na purificação de CTLA4A29YL104E-lg. Mesmo em-bora o Triton X-100 seja removido, níveis residuais ou ausência do tensoati-vo da proteína precisa ser estabelecida para fins de qualidade do produto eregulatórios. Para essa finalidade, um método capaz de detecção e quantifi-cação de níveis residuais de Triton X-100 foi desenvolvido. Triton X-100 éextraído da proteína sobre um meio de SPE e eluído com acetonitrila paraanálise através de HPLC.Preparo - padrão

Placebo. Qualquer amostra ou Padrão de Referência previa-mente analisado através desse método e verificado como não contendo ní-veis detectáveis de Triton X-100 pode ser usado como o placebo. A concen-tração de proteína no placebo e amostra deverá ser similar. O placebo deve-rá ser operado junto com a(s) amostra(s).

Solução - Padrão de Estoque. Pesar precisamente 10,0 V 1,0mg de Triton X-100 em um frasco volumétrico de 100 mL e diluir o volumecom água e misturar.NOTA: Triton Χ-100 dissolve lentamente em água. Examinar a solução comrelação à dissolução completa (tipicamente após 15 minutos) antes de uso.Triton X-100 é mais viscoso do que a água, de modo que quantidades nãodissolvidas são visíveis na presença de água.

Solução-Padrão de Trabalho. Colocar 25 pL da solução padrãode estoque de Triton X-100 em 0,5 mL do placebo de CTI_A4A29YL104E-lg. Mis-turar totalmente através de sujeição a turbilhonamento ou outro meio apro-priado. Solução-padrão de trabalho contém aproximadamente 5 ppm (ou 5μg/mL em peso/vol.) de Triton X-100.

NOTA: As soluções-padrão deverão ser preparadas frescas dia-riamente.

Preparo de amostra. A amostra é usada como está. O placebodeverá ser operado junto com a(s) amostra(s).

Extração de Triton X-100 de Soluções-Padrão e Amostra. Asetapas de extração descritas abaixo são realizadas sob um vácuo de 0,08-0,13 m (3-5 polegadas) de Hg.

Ativação do Meio de Extração de Fase Sólida (SPE). Levantara tampa do manipulo de vácuo e colocar tubos de ensaio na prateleira den-tro do manipulo. Esses são tubos de ensaio de "resíduo". Recolocar a tampae colocar tubos de SPE sobre o manipulo de vácuo, certificando-se de quehá um tubo de ensaio de "resíduo" por baixo de cada tubo de SPE. Adicionarum mL de acetonitrila a cada tubo e aplicar vácuo aos tubos até que todo oacetonitrila tenha passado através do leito de meio. Repetir etapa. Concen-trar o Triton X-100 sobre o Meio SPE a partir da Matriz-Padrão/Amostra. Emtubos de SPE ativados separados, pipetear 0,50 mL de cada da solução-padrão de trabalho, amostras e placebo. Aplicar vácuo aos tubos de SPE atéa solução ter passado completamente através do leito de meio. Remover aproteína residual do Leito de SPE. Adicionar um mL de água a cada tubo deSPE e aplicar vácuo aos tubos até que a água tenha passado através doleito de meio. Repetir etapa. Eluir o Triton X-100 do Leito de SPE. Desligar ovácuo para o manipulo para levar a unidade para a pressão normal. Levan-tar gentilmente a tampa do manipulo, com os tubos de SPE-padrão e amos-tra ainda presos. Substituir os tubos de ensaio de "resíduo" por um conjuntode tubos de ensaio pré-rotulados (para padrão, placebo e amostras) paracoletar qualquer Triton X-100 que possa ter eluído dos Leitos de SPE nasetapas seguintes. Esses são os tubos de ensaio de eluato. Recolocar a tam-pa do manipulo, certificando-se de que cada Leito de SPE de amostra, pla-cebo e padrão tem o respectivo tubo de ensaio de eluato por baixo. Adicio-nar 0,50 mL de acetonitrila a cada tubo de SPE e aplicar vácuo aos tubosaté que todo o acetonitrila tenha passado através do leito de meio. Desligaro vácuo para o manipulo e levantar a tampa para recuperar os tubos de en-saio de eluato. Colocar os eluatos de acetonitrila do padrão, amostras e pla-cebo em frascos para amostrador automático para injeção no sistema cro-matográfico.

ADEQUABILIDADE DE SISTEMA

Equilibrar a coluna/sistema com a fase móvel durante cerca deuma hora antes de iniciar as injeções. Obter o cromatograma da solução-padrão. O tempo de retenção para Triton X-100 deverá ser 5 V 1 minuto. Aeficiência da coluna para Triton X-100, avaliada como o número de placasteóricas, N, deve ser > 2000 lâminas/coluna quando calculada de acordocom a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 664</formula>

onde:

té o tempo de retenção do pico de Triton X-100 e wé a largurana linha de base do pico de Triton X-100 obtida através de extrapolação doslados do pico para a linha de base. Fazer pelo menos três injeções da solu-ção-padrão. O RSD percentual das contagens de área das últimas três inje-ções não deverá ser mais de 3,0%.

Subtrair o cromatograma de placebo dos cromatogramas de pa-drão e amostra e proceder os seguintes cálculos:

<formula>formula see original document page 664</formula>onde:

<formula>formula see original document page 665</formula>

Exemplo 58 - Ensaio para determinação de Teor de DNA celular de CHOem composição de CTLA4-lg

Esse procedimento foi desenvolvido para detectar DNA de CHOresidual nas amostras de Substância de Fármaco de CTLA4-lg usando umensaio de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qP-CR). PCR é a replicação de uma mistura de DNA. Esse ensaio usou umasonda fluorogênica para detectar um produto de PCR de CHO específico àmedida que ele se acumula durante o ensaio. A taxa de amplificação do pro-duto de PCR é diretamente proporcional à quantidade de DNA de iniciaçãopresente na amostra. O objetivo é detectar a quantidade DNA genômico deCHO nas amostras de Composições de CTLA4-lg.

A amostra é analisada através de detecção de DNA de CHO emamostras biológicas através de Análise por Reação em Cadeia de Polimera-se Quantitativa. Cálculos são realizadas e os resultados são reportados paraduas situações representativas nas unidades de pg/mg. Se os resultadossão menores do que o limite de quantificação do ensaio, os resultados sãoreportados como < Q.L. e o Q.L. do ensaio é registrado. Há uma conversãodo valor de DNA para picograma/miligrama. O valor de pg/mL é dividido pelaconcentração da amostra, determinada através da absorbância a 280 nm.

Cálculo exemplificativo para a amostra tendo uma concentraçãode proteína de 50 mg/mL e um valor reportado a partir da Bioconfiança =0,67 fg/μL..

Etapa 1: Conversão para pg/mL = 0,67 pg/mLEtapa 2: Conversão para pg/mg = (0,67 pg/mL / 50,0 mg/mL) =0,013 pg/mg.

Exemplo 59 - Determinação de proteína MCP-1 em Amostras biológicase em Composições de CTLA4-lg

O exemplo apresenta métodos usados para quantificar proteínasemelhante a MCP-1 residual em amostras biológicas e amostras de C-TLA4-lg.Materiais:

Anticorpo de neutralização anti-MCP-1de camundongo de cabra (JE anti-murino [MCP-1])

Anti-MCP-1 de rato de coelho

Conjugado de HRP/ IgG anticoelho decabra (H+L)

R&D Systems, (Catálogo No.AB-479-NA), Armazenar a -20°C

Pepro Tech, (Catálogo No. 500-P76),Armazenar a -20°C

Southern Biotech (Catálogo No.4050-05). Armazenar a 2-8°C

Reagentes

Solução salina tamponada com fosfato (PBS, Tampão deFosfato a 10 mM, NaCI a 137 mM, KCI a 2,7 mM, pH de 7,3 a 7,5). Prepa-rar de acordo as orientações do fabricante sobre a garrafa. A um vaso detamanho suficiente, adicionar água com grau para HPLC, péletes de PBS euma barra de agitação. Sobre uma lâmina em agitação, misturar até que ospéletes e sal estejam dissolvidos. Ajustar o pH de 7,3 para 7,5 conforme ne-cessário com Hidróxido de sódio ou Ácido clorídrico. Agitar até bem mistura-do. Filtrar através de uma unidade de filtro descartável de 0,22 μΐη. Armaze-nar a solução a 2-8°C durante até 30 dias a partir da data de preparo.

MCP-1 (Proteína-1 quimiotática de monócitos) é uma proteínahumana a qual exerce um papel no recrutamento de monócitos a locais delesão e infecção. Uma proteína pode ser considerada semelhante a MCP-1baseado na homologia e reatividade cruzada com anticorpos contra a MCP-1. Uma vez que os anticorpos usados no ELISA reconhecem apenas umaporção da proteína-alvo, formas truncadas de MCP-1 podem reagir no en-saio mesmo embora elas possam não ser tecnicamente ativas. Assim, qual-quer variante de MCP-1 de hamster a qual reage no ensaio será quantificadade modo que o ensaio detecta MCP-1 de comprimento total e quaisquer va-riantes de MCP-1 as quais contenham os epítopos corretos. Note que, usan-do uma mistura de anticorpo policlonal, é mais provável que uma série deepítopos sejam representados.

Solução de Lavagem (Tampão de Fosfato a 1,0 mM, NaCI a137 mM, KCI a 0,27 mM, pH de 7,3 a 7,5 contendo Tween 20 a 0,01%v/v). A 4,0 L de água destilada ou com grau para HPLC1 adicionar uma barrade agitação, 2 comprimidos de PBS, 28,8 g de NaCI e 0,4 mL de Tween 20.Misturar gentilmente até que todos os conteúdos estejam dissolvidos. Ajustaro pH de 7,3 para 7,5 conforme necessário com Hidróxido de sódio ou Ácidoclorídrico. Armazenar a 2-8°C durante até 30 dias a partir da data de prepa-ro.

Diluente (PBS, pH de 7,3 a 7,5 contendo BSA a 1% peso/v eTween 20 a 0,05% v/v). (Por favor, note que isso é uma alternativa ao usode diluente comercialmente disponível). A 4 L de solução salina tamponadacom fosfato, adicionar uma barra de agitação, 40 g de BSA e 2 mL de Tween20. Misturar gentilmente até que todos os conteúdos estejam dissolvidos.Filtrar através de um filtro de 0,22 μηι. Armazenar a 2-8°C durante até 30dias a partir da data de preparo quando armazenado sem abrir ou 7 dias a-pós abrir.

Reagente de revestimento de lâmina. Reconstituir vários fras-cos de anticorpo anti-MCP-1 de camundongo de cabra conforme as instru-ções do fabricante, misturar invertendo gentilmente várias vezes e combinar.Preparar alíquotas e armazenar a -20°C durante até um ano (não exceder adata de expiração do fabricante). Evitar congelamento e descongelamentorepetidos. Alternativamente, os frascos com amostra Iiofilizada podem serarmazenados a -20°C durante mais de seis meses. Quando de reconstitui-ção, o anticorpo pode ser armazenado a 2-4°C durante um mês.

Reagente secundário. Reconstituir um frasco de anticorpo anti-MCP-1 de rato de coelho conforme as instruções do fabricante, misturar in-vertendo gentilmente várias vezes. A solução é armazenada a 2-8°C duranteaté quatro semanas. Alternativamente, os frascos com amostra Iiofilizadasão estáveis a -20°C durante mais de um ano.

Reagente terciário. Empoçar vários frascos de IgG anticoelhode cabra (H+L) HRP e misturar invertendo gentilmente várias vezes. Prepa-rar alíquotas e armazenar a -20°C durante até 2 anos (não exceder a datade expiração do fabricante). Evitar congelamento e descongelamento repeti-dos. Uma vez descongelado, o frasco pode ser armazenado a 2 a 8°C du-rante até 30 dias.

Preparo de Padrões. A partir do estoque de Proteína semelhan-te a MCP-1, preparar uma solução a 25,6 ng/mL em diluente e diluir a partirdaí em etapas de diluição serial (2 vezes) para 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8 e 0,4.0 ng/mL de padrão é diluente não diluído.

Exemplo para o preparo de Padrões usando Material de referên-cia MCP-1 com uma concentração de estoque de 0,97 mg/mL:

a) (Solução A) Preparar 2,5 mL de 5200 ng/mL em diluente:13,4 uL de estoque + 2,487 mL de Diluente

b) (Solução B) Preparar 3,9 mL de 25,6 ng/mL em diluente:19,2 uL de estoque a + 3,881 mL de Diluente

Preparar os padrões restantes usando os volumes definidos a-baixo:

<table>table see original document page 668</column></row><table>

Misturar cada solução através de turbilhonamento em ajustemédio durante aproximadamente 2-3 segundos e, então, gentilmente inver-tendo 2-3 vezes.

Preparo de Amostras de controle de qualidade. Preparar a-mostras de Controle de Qualidade (QC) a partir de um frasco de Proteínasemelhante a MCP-1 em diluente. Preparar uma concentração de estoquede solução a 520 ng/mL a partir da qual as seguintes amostras de controlede qualidade para congelamento são feitas: 11,0 ng/mL, 5,3 ng/mL e 1,2ng/mL. Diluir conforme descrito na tabela abaixo.

Exemplo para o preparo de QCs usando Material de referência MCP-1com uma concentração de estoque de 0,97 mg/mL:

b) (Solução B) Preparar 5,0 mL de 520 ng/mL em diluente:500 uL de estoque a + 4,500 mL de Diluente

c) Preparar diluição final de amostras de QC de proteína seme-Ihante a MCP-1 como segue:

<table>table see original document page 669</column></row><table>

Preparo de Amostras de teste. Cada amostra de teste consisteem artigo de teste diluído. Amostras de teste são preparadas através da adi-ção de 200 μί da amostra de teste a 200 μί de diluente. Misturar cada solu-ção através de turbilhonamento em velocidade média durante aproximada-mente 2 - 3 segundos e, então, gentilmente invertendo 2-3 vezes.

Procedimento. Revestir a lâmina. Diluir anticorpo anti-MCP-1 decamundongo de cabra para 5 μg/mL com PBS. Misturar o anticorpo e solu-ção de PBS através de turbilhonamento em ajuste médio durante aproxima-damente 2-3 segundos e, então, gentilmente invertendo 2-3 vezes. Usan-do uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μι. dessa solução a cadacavidade. Cobrir as lâminas com vedantes para lâmina e incubar em tempe-ratura ambiente durante 12 a 18 horas. Lavar a lâmina. Lavar as lâminas trêsvezes com Solução de Lavagem usando um lavador de lâminas. Ajustar olavador em três lavagens, 300 μL/cavidade com um tempo de embebimentozero. Alternativamente, as lâminas podem ser lavadas manualmente. Adicio-nar 300 μL- de Solução de Lavagem a cada cavidade de cada lâmina usandouma pipeta com múltiplos canais. Esvaziar as cavidades sacudindo em umapia e blot gentilmente sobre papéis toalha. Repetir três vezes.

Bloqueio de lâmina. Adicionar 300 μί de CSBB a cada cavida-de usando uma pipeta com múltiplos canais. Incubar as lâminas durante a-proximadamente 60 ± 10 minutos em temperatura ambiente.

Adição de Amostras. Adicionar padrões de referência, contro-les de qualidade (dois conjuntos de cada concentração) e amostras de testeà lâmina, em triplicata, 100 μL/cavidade e incubar durante aproximadamente60 ± 10 minutos em temperatura ambiente. Não usar as cavidades externas.Preparar anticorpo secundário anti-MCP-1 de rato de coelho. Diluir estoquede anticorpo anti-MCP-1 de rato de coelho para 2 μς/ι-ηΙ. ou diluição apropri-ada (conforme testagem de equivalência de lote ou COA) em diluente emum volume suficiente para as lâminas usadas no ensaio. Submeter a turbi-Ihonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos em velocidade mé-dia. Repetir a lavagem de lâmina, mas lavar cinco vezes. Usando uma pipetacom múltiplos canais, adicionar 100 μΙ. da solução de anticorpo secundário acada cavidade e incubar durante 60 ± 10 minutos em temperatura ambiente.Preparar solução de anticonjugado de HRP terciário de coelho de cabra (0,5μg/mL ou diluição apropriada) usando diluente. Misturar conjugado de HRPatravés de turbilhonamento em ajuste médio durante aproximadamente 2-3segundos e, então, gentilmente invertendo 2 - 3 vezes. Diluir para a concen-tração estabelecida conforme o SOP do departamento para qualificação dereagente. Repetir a lavagem de lâmina cinco vezes. Usando uma pipeta commúltiplos canais, adicionar 100 μΐ. de conjugado de HRP a cada cavidade eincubar em temperatura ambiente no escuro durante aproximadamente 30 □5 minutos. Repetir a lavagem de lâmina cinco vezes. Usando uma pipetacom múltiplos canais, adicionar 100 μΙ_ de TMB a cada cavidade e incubarem temperatura ambiente no escuro durante aproximadamente 2,5 - 4 minu-tos. Usando uma pipeta com múltiplos canais, parar a reação de TMB atra-vés da adição de 100 μί de H2SO4 a 1,0N na mesma ordem conforme a adi-ção de TMB foi feita. Ler as densidades ópticas a 450 nm com um compri-mento de onda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâminas com 96cavidades.

Valores exemplificativos. Os valores exemplificativos para ospadrões se aplicam àqueles valores em ou acima do limite quantitativo (QL)(0,8 ng/mL), uma vez que valores abaixo do QL são usados apenas paraajudar a estabelecer os extremos da curva. A média, usando o cálculo abai-xo, base (o zero ng/mL de padrão) devem ser <0,1 unidade de absorção.

<formula>formula see original document page 671</formula>

onde:

X1,2,3 = um valor específico em um conjunto de dados

N = número de valores em um conjunto de dadosCada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo o zero, 0,4 e o QL (0,8 ng/mL) devem estar dentro de 15%do valor-alvo (nominal). O coeficiente de variância (CV%) dos valores AB450em triplicata em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, com exceção do zero, 0,4 e o QL (0,8 ng/mL), devem ser <15%. Aconcentração média calculada de MCP-1 para a amostra de teste de com-posição de CTLA4-lg deverá ser <11,0 ng/mL. Se a concentração médiacalculada de MCP-1 é > 0,8 ng/mL (o QL de ensaio) calcular a CV% das de-terminações em triplicata e os valores exemplificativos devem ser < 20%. Seos valores exemplificativos são reunidos, a concentração média de MCP-1 éusada para computar ppm. Se a concentração calculada de MCP-1 é < 0,8ng/mL (QL de ensaio), a amostra é reportada como < QL e o valor "< 0,8ng/mL" é usado na computação de ppm. A CV% da determinação em tripli-cata não é considerada.

A amostra de QC é definida como um conjunto de três cavidadesna concentração estabelecida, portanto, para as três concentrações nomi-nais estabelecidas nesse método, há um total de seis amostras de QC. Asconcentrações de pelo menos duas das três cavidades para uma amostra deQC devem deve estar de 20% da concentração nominal estabelecida paraque a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos doze das dezoito determi-nações de amostra de QC devem estar dentro de 20% de seus respectivosvalores-alvo. Seis das dezoito amostras de QC (não três na mesma concen-tração ) podem se desviar mais de 20% do respectivo valor nominal. Pelomenos quatro das seis amostras de QC devem ser aceitáveis. Duas sãopermitidas como sendo inaceitáveis, contanto que elas não estejam ambasna mesma concentração.

Avaliação de dados. Usar o Software Softmax® com o arquivode protocolo MCP-1.ppr para construir uma curva-padrão usando uma re-gressão com quatro parâmetros ponderada da forma,onde:

A = valor de absorbância45o correspondendo ao assíntotamínimo

D = valor de Absorbância45o correspondendo ao assíntotamáximo

c = Concentração correspondendo à metade da diferençaabsoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimob = o declínio aproximado da porção linear da curvaχ = concentração-padrão de referênciaCálculos para a concentração de Proteína semelhante a

MCP-1. A quantidade de Proteína semelhante a MCP-1 na amostra de testepode ser calculada usando o Software Softmax lâmina Reader. O exemploabaixo ilustra como os resultados finais podem ser reportados. Uma diluiçãode duas vezes de cada amostra é ensaiada. A concentração calculada émultiplicada pelo fator de diluição apropriado (2) a fim de proporcionar aconcentração no artigo de teste não diluído.Exemplos:

1) Amostra de teste diluída é 10,0 ng/mL.Concentração de proteína semelhante a MCP-1 em um artigo deteste não diluído é:

10 ng/mL χ 2 = 20 ng/ml de MCP-1

2) Resultado da amostra diluída é "<0,8 ng/mL".Concentração de proteína semelhante a MCP-1 em um artigo deteste não diluído é:

"<0,8 ng/mL" χ 2 = "<1,6 ng/mL" de MCP-1

Para reportar o resultado final em ng de proteína semelhante aMCP-1 por mg de amostra (ppm), dividir o resultado obtido acima pela con-centração não diluída de amostra.Exemplos:

1) Concentração de teste de amostra de proteína = 50 mg/mLConcentração de proteína semelhante a MCP-1 = 200 ng/mL:200 ng/ml de MCP-1 / 50 mg/mL = 4 ng/mg

A amostra é reportada como 4 ppm (partes por milhão)

2) Concentração de teste de amostra de proteína = 50 mg/mLConcentração de proteína semelhante a MCP-1 = "<1,6 ng/mL":"<1,6 ng/mL" MCP-1 / 50 mg/mL = "<0,032 ng/mg"

A amostra é reportada como "<QL,(<0,032 ppm)".

Exemplo 60: Ensaio para determinação de níveis residuais de proteínaCD-CHQ1 através de ELISA para testagem de liberação de material deSubstância de Fármaco de CTLA4-lg

Tampão de Carbonato. A um vaso adequado contendo umabarra de agitação, adicionar: 200 mL com água com grau para HPLC, parafazer 2 cápsulas de Tampão de Carbonato. Usando uma placa de agitação,misturar até o material estar em solução. Usando um medidor de pH, ajustaro pH para 9,6 conforme necessário com NaOH a 1N ou H2SO4. Usando umaplaca de agitação, misturar a solução durante um mínimo de 5 minutos. Fil-trar a solução através de um filtro de 0,22 μm. Armazenar a solução a 2 -8°C durante até 30 dias e rotular conforme os procedimentos do departa-mento.

Tampão de Lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,05% v/v,pH de 7,4). A uma garrafa de 4 L de água com grau para HPLC com umabarra de agitação, adicionar 20 comprimidos de PBS. Adicionar 2 mL deTween 20. Usando uma placa de agitação, misturar até o material estar emsolução. Usando um medidor de pH, ajustar o pH para 7,4 conforme neces-sário com NaOH a 1N ou HCI a 1N. Usando uma placa de agitação, misturara solução durante um mínimo de 5 minutos. Armazenar a solução a 2 - 8°Cdurante até 30 dias e rotular conforme os procedimentos do departamento.

Estreptavidina-HRP. Adicionar 0,5 mL de água com grau paraHPLC a um frasco de Estreptavidina-HRP. Para misturar, tampar o frasco esubmeter a turbilhonamento gentilmente durante aproximadamente 10 se-gundos. Adicionar 0,5 ml de glicerol ao frasco de Estreptavidina-HRP. Mis-turar. Verificar a clareza da solução extraindo a solução em uma pipeta dePasteur limpa. Se a solução não está clara, misturar conforme 3.3.2 e repetir3.3.5 até que a solução esteja clara. Determinar o esquema de diluição a-propriado a ser usado para o lote de Estreptavidina HRP de acordo com osprocedimentos do departamento. Transformar em alíquotas volumes de 20μL em tubos com tampa de rosca de 0,5 ml_. Tampar e colocar em uma cai-xa de armazenamento de células. Armazenar a solução a - 20°C durante até 365 dias e rotular conforme os procedimentos do departamento.

Solução de Término (H2SO4 a 1 N). Em uma coifa, colocar umrecipiente adequado sobre uma placa de agitação. Adicionar uma barra deagitação. Adicionar 485,6 ml_ de água com grau para HPLC. Ligar a placa deagitação para iniciar a agitação de água. Adicionar lentamente 14,4 ml_ de15 H2SO4 concentrado. A solução é estável durante 90 dias quando armazena-da em temperatura ambiente. Rotular a solução conforme os procedimentosdo departamento.

Procedimento. Revestir a lâmina. Preparar uma solução a 8μg/mL de anticorpo anti-CD CH01 de coelho purificado em Tampão de Car-bonato a ser usado para revestimento de lâminas de microtitulação (10 mLde solução são requeridos por lâmina de microtitulação). Adicionar 100 μΙ_dessa solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Immulon 4usando uma pipeta com múltiplos canais, cobrir a lâmina de microtitulaçãocom parafilme e incubar a 2-8°C durante 18 ± 2 horas.

Lavagem de lâmina. Lavar a lâmina três vezes com 300 μL detampão de lavagem usando um instrumento para lavagem de lâminas. (Al-ternativamente, a lâmina pode ser lavada manualmente usando uma pipetacom múltiplos canais.) Após a última lavagem, a lâmina deverá ser viradapara baixo e seca sobre uma toalha de papel colocada sobre uma superfícierígida.

Bloqueio de lâmina. Usando uma pipeta com múltiplos canais,adicionar 300 μί de SeaBIock a cada cavidade. Incubar a lâmina no escurodurante 1 hora (± 6 minutos) em temperatura ambiente. As lâminas devemser enroladas com folha de alumínio ou colocadas em uma câmara ou seca-dor. Preparar amostras de Curva-padrão usando Diluente Teknova em tubosde polipropileno estéreis graduados de 15 ml_ de acordo com o esquema dediluição abaixo.

Nota: O esquema de diluição abaixo é para 5 lâminas. Ajustaros volumes conforme necessário para o número de lâminas no ensaio.

Obter a concentração de proteína do Padrão de Referência deproteína CD-CH01 (Padrão de Referência) do Certificado de Análise (COA).Preparar uma solução a 30 pg/mL de Padrão de Referência de proteína CD-CH01. Calcular o volume requerido de Padrão de Referência de proteínaCD-CH01 para obter uma solução a 30 pg/mL. O volume mínimo de transfe-rência para o Padrão de Referência de proteína CD-CH01 deverá ser de 10μL

Concentração desejada χ volume desejado

Fórmula: Volume =

Concentração de material de referência

Nota: Assegurar que as unidades são compatíveis.

<formula>formula see original document page 675</formula>

Exemplo: 25mg/mL

Calcular o volume de Diluente subtraindo o volume requerido dePadrão de Referência de proteína CD-CH01 do volume desejado.Fórmula: (Volume desejado) - (volume do Padrão de Referência) = (Volumede diluente)

Exemplo: 10,0 mL - 0,012 mL = 9,988 mL de Diluente

Adicionar o volume calculado de Padrão de Referência de prote-ína CD-CH01 a um tubo estéril de 15 mL o qual contém um volume calcula-do de diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento em um ajusteentre durante 2-4 segundos. Preparar os padrões restantes. A tabela abai-xo é mostrada como um exemplo:<table>table see original document page 676</column></row><table>

Tampar o tubo após cada etapa de diluição e submeter a turbi-Ihonamento gentilmente durante 2-4 segundos antes de prosseguir para apróxima etapa de diluição.

Preparar Soluções de Controle de Qualidade (QC) usando Dilu-ente Teknova em tubos de polipropileno estéreis graduados de 15 mL deacordo com o esquema de diluição abaixo. Obter a concentração de proteínado Material de referência de proteína CD-CH01 (Mat ref) do Certificado deAnálise (COA). Preparar uma solução a 30 μg/mL de Padrão de Referênciade proteína CD-CH01 (Mat ref). Tampar o tubo e submeter a turbilhonamen-to em um ajuste entre durante 2-4 segundos. Preparar soluções de QC nasconcentrações de 700, 100 e 25 ng/ml_. Um esquema de diluição exemplifi-cativo é mostrado abaixo:

<table>table see original document page 676</column></row><table>

Tampar o tubo para cada solução de QC e submeter a turbilho-namento gentilmente durante 2-4 segundos. Soluções de Controle de Qua-Lidade podem ser preparadas frescas no dia do ensaio ou elas podem sertransformadas em alíquotas e congeladas. Determinar a concentração realdas três soluções de QC em três experimentos independentes. Calcular amédia dos resultados dos três experimentos para cada solução de QC eemitir um COA para cada uma das três soluções de QC. Essas concentra-ções de QC experimentalmente determinadas têm de ser usadas como valo-676res alvo quando se realiza análise sobre amostras de CTLA4-lg. Armazenaras soluções de QC em alíquotas prontas para uso a -70°C. Soluções de QCexpiram 6 meses após preparo. Remover as soluções de QC do armazena-mento no dia de ensaio e descongelar em temperatura ambiente. Submetera turbilhonamento as soluções de QC descongeladas em velocidade médiadurante 2-4 segundos antes de uso.

Preparo de amostra. Preparar aproximadamente a 12,5 mg/mLde solução para cada amostra de CTLA4-lg a ser analisada em diluente a-través da adição de 250 μΐ_ de amostra de Substância de Fármaco a 750 μίde diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente duran-te 2 - 4 segundos. Preparar uma solução a 6,25 mg/mL para cada amostrade CTLA4-lg a ser analisada através da adição de 400 da solução a 12,5mg/mL a um tubo contendo 400 μί de diluente. Tampar o tubo e submeter aturbilhonamento gentilmente durante 2-4 segundos. Preparar uma soluçãoa 3,125 mg/mL para cada amostra de CTLA4-lg a ser analisada através daadição de 400 da solução a 6,25 mg/mL a um tubo contendo 400 μί de dilu-ente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente durante 2 - 4segundos. Lavar a lâmina repetindo a etapa de lavagem. Adicionar 100 μίpor cavidade de cada concentração de soluções de padrão, amostras e QC em triplicata à lâmina bloqueada e lavada. Cada solução de QC é adicionadaduas vezes a um total de seis cavidades por lâmina. Incubar durante 1 horano escuro (± 6 minutos) em temperatura ambiente. Repetir a lavagem 5 ve-zes. Remover a Estreptavidina-HRP do congelador e deixar ir para a tempe-ratura ambiente. Diluir anticorpo anti-CD CHOI-Biotina de coelho para 2μg/mL em Tampão Teknova. Submeter a turbilhonamento a solução aproxi-madamente 2-4 segundos em velocidade média. Usando uma pipeta commúltiplos canais, adicionar 100 μί por cavidade. Incubar durante 1 hora (± 6minutos) no escuro em temperatura ambiente. Diluir a Estreptavidina-HRPpara a concentração estabelecida para uso no ensaio baseado na qualifica-ção do lote de reagente conforme o procedimento do departamento. Tampare submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos emvelocidade média. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100µL de diluição de Estreptavidina-HRP a cada cavidade. Incubar em tempera-tura ambiente no escuro durante 1 hora (± 6 minutos). Repetir. Usando umapipeta com múltiplos canais, adicionar 100 µL de cromogênio TMB a cadacavidade. Incubar em temperatura ambiente durante 2 minutos (± 12 segun-dos). Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 µL/cavidadede Solução de Término (H2SO4 a 1 N). Adicionar Solução de Término às lâ-minas e cavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionadopara assegurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzimaem cada cavidade. Usando um leitor para lâmina SpectraMax Plus, medir a absorbância a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630nm sobre um leitor para lâmina com 96 cavidades apropriado.

Avaliação de dados. Refira-se ao modelo do programa Soft-Max, uma vez que ele gera a média, desvios-padrão e CVs %, etc. Determi-nar cada um dos valores exemplificativos usando os valores de absorbância em triplicata obtidos para cada referência, QC e diluições de amostra ensai-ada. Gerar a Curva-padrão. Modelar os dados de Padrão de Referência u-sando uma regressão com quatro parâmetros da forma.

<formula>formula see original document page 678</formula>

onde:

<formula>formula see original document page 678</formula>

AB = Absorbância a 450 nanômetros

A= Valor de absorbância correspondendo ao assíntota mínimo

D = Valor de absorbância correspondendo ao assíntota má-ximo

c = Concentração correspondendo à metade da diferençaabsoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo

B =o declínio aproximado da porção linear da curvaX = Concentração de material de referência CD-CH01

Determinar o coeficiente de determinação (R2) da linha de re-gressão para os padrões usando a média calculada usando a fórmula acima.Calcular a concentração de CD-CH01 nas amostras. Multiplicar os resulta-dos médios da amostra pelo fator de diluição apropriado (isto é, 4, 8 e 16)para obter a concentração de CD-CH01 na amostra original em ng/ml. Divi-dir o resultado pela concentração de proteína de CTLA4-lg reportada(mg/ml) para obter a concentração de CD-CH01 em ng/mg de CTLA4-lg.Determinar a média de todos os resultados, a qual cai dentro da faixa dacurva-padrão. Calcular a concentração de proteína CD-CH01 na amostranão diluída aplicando o fator de diluição. Para determinar a concentração deproteína CD-CH01 com relação à concentração de amostra de CTLA4-lg,dividir pela concentração não diluída.Cálculo exemplificativo:

Resultado médio da amostra 235 ng de CD CHOP/mL= 4,7 ng/mg

BMS - concentração de 188667 50 mg/mL

Nota: ng de CD/mg de produto de CH01 (ng/mg) é equivalentea partes por milhão (ppm).

Valores exemplificativos. Valores exemplificativos para os pa-drões. O coeficiente de determinação (R2) para a Curva-padrão deverá ser>0,99. A base média para o padrão de zero ng/mL deverá ser <0,10 unida-des de absorção. A média dos valores calculados (ng/mL) em cada concen-tração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e con-centrações abaixo QL (12,3 ng/mL), deve estar dentro de 20% do valor-alvo(nominal), conforme determinado pelo software. O coeficiente de variação(% CV) dos valores de absorbância em triplicata em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e concentra-ções abaixo QL (12,3 ng/mL), devem ser menos de 20%, conforme determi-nado pelo software. Para assegurar que pelo menos dois pontos de dadoscongruentes estão disponíveis para cálculo, os padrões, controles de quali-dade e amostras são carregados em cavidades em triplicata. Analisar cada valor em triplicata separadamente. Reduzir o valor que repousa mais distan-te do alvo.

Exemplo:<table>table see original document page 680</column></row><table>

O único valor que está mais distante do valor-alvo de 50 ng/mL éng/mL. eliminando o valor de 25 ng/mL da triplicata, a média dos valoresrestantes irá ao encontro dos valores exemplificativos.

Se é mostrado que a média dos dois valores restantes ainda nãovão ao encontro dos valores exemplificativos, então, o ponto único é elimi- nado e a curva é recalculada.

Exemplo:

<table>table see original document page 680</column></row><table>

O valor médio é >20% do alvo, a despeito de qual valor é elimi-nado, portanto, o ponto único cai da curva e a curva será recalculada. Ape-nas 2 pontos sobre a curva-padrão podem ser eliminados.

Valores exemplificativos para amostras de QC. A amostra deQC é definida como um conjunto de três cavidades na concentração estabe-lecida, portanto, para as três concentrações nominais estabelecidas nessemétodo, há um total de seis amostras de QC. Pelo menos duas das três ca-vidades para uma amostra de QC devem estar dentro de 20% do nominalpara que a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos quatro das seis amos-tras de QC devem estar dentro de 20% de suas respectivas concentrações-alvo; duas das seis amostras de QC (não duas na mesma concentração)podem exceder o desvio de 20% do nominal, conforme calculado pelo soft-ware. Não mais do que 6 das 18 cavidades com amostra de QC podem se desviar mais de 20% das respectivas concentrações-alvo.

Valores exemplificativos para amostras de teste. A absor-bância média para a amostra de teste ensaiada deve ser menor do que omaior ponto sobre a curva-padrão. Se a absorbância média da amostra ex-cede a absorbância média de 3000 ng/mL de padrão, a amostra de testedeve ser diluída suficientemente de modo a obter uma absorbância médiaentre 3000 e 12,3 ng/mL. A absorbância média de pelo menos uma de trêsdiluições de amostra (12,5, 6,25 e 3,125 mg/ml) deve cair dentro da faixa dacurva-padrão para um resultado reportável, a menos que a absorbância mé-dia para todas as diluições esteja abaixo a absorbância média da QL (12,3ng/mL de padrão). Nesse caso, as amostras de teste são reportadas como <QL. A média dos valores de absorbância em triplicata da diluições de amos-tra que é maior do que a QL e cai dentro da faixa da curva-padrão deve exi- bir uma CV de menos do que 20%, conforme determinado pelo software. Se,quando de eliminação de uma das absorbâncias em triplicata e recálculo daCV ainda é > 20% ou se duas diluições de amostra têm CV's para a absor-bância maior do que 20% e cai dentro da faixa da curva-padrão, a análisedessa amostra deve ser repetida.

Exemplo 61 - Ensaio para quantidade residual de Triton X-100 na com-posição de CTLA4-lg

Materiais

Frascos para HPLC

Tubos de extração em fase sólida

Coluna

Waters, Kit Total Recovery Vial, Tampa de roscacom septo de silicone/PTFE pré-dividido ligado (Ca-tálogo 186000385)

Nota: Frascos de vidro são requeridosWaters OASIS HLB, 30 mg/1 cc, (Catálogo No.WAT094225)

Thermo Electron Corp. SAS Hypersil1 5μ, 4,6 χ 250 mm(Número de parte 30505-254630)

Instrumentação

Cromatografia de líquidoDetectar

Processador de Coluna de SPEBalança Analítica

Integração

Módulo de Separação Waters 2695

Detectar de UV com Comprimento de Onda Duplo

Waters 2487

Manipulo a Vácuo JT Baker, Modelo Spe-21Qualquer balança capaz de pesar precisamente0,01 mg

Waters Empower Data System

Preparo de Reagentes

Preparo de Fase móvel: Acetonitrila: Água (80: 20). Para 1L,misturar completamente com uma barra de agitação, 800 mL de acetonitrilae 200 mL de água purificada ou com grau para HPLC. Filtrar através de umfiltro de náilon de 0,2 μιτι. Desgasseificar a fase móvel usando um desgas-seificador in-line, tal como um Alliance System ou usando purgação com hé-lio. Preparar fresca diariamente.

NaOH a 2N. Pesar e quantitativamente transferir 80 ± 1 g deNaOH sólido para um frasco de 1 L. Compor o volume com água purificadaou com grau para HPLC. Misturar bem com uma barra de agitação e filtraratravés de um aparelho com filtro de 0,22 μιτι. Alternativamente, diluir seri-almente o NaOH em uma solução a 10N. Armazenar até 6 meses em tempe-ratura ambiente.

Tampão de Substância de Fármaco. Pesar e transferir quanti-tativamente 3,45 g de NaH2PO4 H2O e 2,92 g de NaCI para um frasco de 1L. Adicionar aproximadamente 800 ml_ de água purificada ou com grau paraHPLC. Misturar bem com uma barra de agitação e compor o volume comágua purificada ou com grau para HPLC. Ajustar o pH para 7,5 com NaOH a2N. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,22 μιτι. Armazenaraté 4 meses a 4°C.

Preparo de Padrão de placebo de amostra. Qualquer amostraou material de referência de CTLA4-lg previamente analisado e verificadocomo não contendo níveis detectáveis de Triton X-100 pode ser usado comoo Placebo de Amostra. A proteína de Placebo de Amostra deverá ser opera-da junto com a(s) amostras(s). Triton X-100 dissolve lentamente em água.Examinar a solução com relação à dissolução completa (tipicamente após 15minutos) antes de uso. Triton X-100 é mais viscoso do que a água, de modoque quantidades não dissolvidas são visíveis na presença de água.

Preparo de Padrão de Estoque de Triton X-100 a 10,0 pg/mLN0 1. Pesar precisamente 10,0 ± 1,0 mg de Triton X-100 em um frasco volu-métrico de 100 mLe diluir até o volume com água; e misturar gentilmentecom uma barra de agitação. Rotular como Padrão de Estoque de TX100 A.Tomar 10 mL de Padrão de Estoque de TX100 A em um frasco volumétricode 100 mL. Diluir até o volume com água. Rotular como Padrão de Estoquede TX100 N0 1. Preparar fresca diariamente.

Preparo de Padrão de Estoque de Triton X-100 a 10,0 pg/mLN0 2. Pesar precisamente 10,0 ± 1,0 mg de Triton X-100 em um frasco volu-métrico de 100 ml_ e diluir até o volume com água; e misturar gentilmentecom uma barra de agitação. Rotular como Padrão de Estoque de TX100 B.Tomar 10 mL de Padrão de Estoque de TX100 em um frasco volumétrico de100 mL. Diluir até o volume com água. Rotular como Padrão de Estoque deTX100 N0 2. Preparar fresca diariamente.

Preparo de Solução de Avaliação de Adequabilidade de sis-tema de TX100 N0 1 (SS N0 1). A partir do Padrão de Estoque de TX100 N01, preparar uma Solução de Avaliação de Adequabilidade de sistema deTX100 a 5,0 pg/mL através de diluição de 300 μ!_ de Padrão de Estoque deTX100 N0 1 com 300 μΙ_ de acetonitrila. Misturar bem através de pipetea-mento e centrifugação.

Preparo de Solução de Avaliação de Adequabilidade de sis-tema de TX100 N0 2 (SS N0 2). A partir do Padrão de Estoque de TX100 N02, preparar a 5,0 pg/mL de Solução de Avaliação de Adequabilidade de sis-tema de TX100 através de diluição de 300 pL de Padrão de Estoque deTX100 N0 1 com 300 pL de acetonitrila. Misturar bem através de pipetea-mento e centrifugação.

Preparo de Controle de passe de TX100, Padrão de Limite,Controle de falha. A partir do Padrão de Estoque de TX N0 1, preparar asolução identificada na Tabela abaixo.

<table>table see original document page 683</column></row><table>

Preparo de Amostra. A amostra é usada sem concentração oudiluição.

Procedimento: Extração de Triton X-100 do Padrão e Soluçãode amostra. CUIDADO: As etapas de extração descritas abaixo são realiza-das sob um vácuo de 0,08 - 0,09 m (3-3,5 polegadas) de Hg.

Ativação do meio de Extração em Fase Sólida (SPE). Levan-tar a tampa do manipulo de vácuo e colocar tubos de ensaio de 12 χ 75 mmvazios na prateleira dentro do manipulo. Esses são tubos de ensaio "residu-ais". Recolocar a tampa e colocar os cartuchos de SPE sobre o manipulo devácuo, certificando-se de que haja um tubo de ensaio "residual" por baixo decada tubo de SPE. Adicionar 1000 μL de acetonitrila a cada cartucho de SPEe aplicar vácuo até que toda a acetonitrila tenha passado através do leito demeio. Repetir com mais 1000 μΐ_ de acetonitrila. Adicionar 500 μΙ_ de águapurificada ou com grau para HPLC a cada cartucho de SPE e aplicar vácuoaté que toda a água tenha passado através do leito de meio. Repetir commais 500 μL de água purificada ou com grau para HPLC.

Concentração de Triton X-100 sobre o Meio de SPE Media10 para o Padrão de Limite e Controles. Pipetear 500 μΙ_ de cada do Padrãode Limite, Controle de Passe, Placebo de Controle de Falha e amostras se-paradamente sobre cartuchos de SPE ativados. Aplicar vácuo aos tubos deSPE até que cada solução tenha passado completamente através do leite demeio.

Remoção de Proteína residual do glóbulo de SPE. Adicionar1000 pL de água a cada cartucho de SPE e aplicar vácuo aos tubos até aágua tenha passado através de do leito de meio. Repetir etapa com mais1000 μL de água.

Eluição de Triton X-100 do glóbulo de SPE. Desligar o vácuopara o manipulo para liberar a pressão da unidade para zero. Levantar gen-tilmente a tampa do manipulo, com os cartuchos de SPE ainda presos.Substituir os tubos de ensaio "residuais" por um conjunto de tubos de ensaiode "eluato" pré-rotulado ou frascos para amostrador automático (Padrão deLimite, controle de passe, controle de falha, placebo e amostras pré-rotuladas) para coletar qualquer Triton X-100 que elui dos glóbulos de SPE.Recolocar a tampa do manipulo, certificando-se de que cada Padrão de Li-mite, controle de passe, controle de falha, placebo e amostras de cartuchode SPE tenha um respectivo tubo de eluato ou frasco para amostrador au-tomático por baixo. Adicionar 500 pL de acetonitrila a cada cartucho de SPEe aplicar vácuo aos tubos até que todo acetonitrila tenha passado através doleito de meio. Desligar o vácuo para o manipulo e levantar a tampa para re-cuperar os tubos de ensaio de eluato ou frascos para amostrador automáti-co. Se usando tubos de ensaio de eluato, colocar os eluatos de acetonitrila,Padrão de Limite, controle de passe, controle de falha, placebo e amostrasem frascos para amostrador automático para injeção no sistema cromatográ-fico. Se usando frascos para amostrador automático para coletar o eluato,colocar os frascos diretamente no sistema cromatográfico.Condições de operação

Comprimento de onda

Sensibilidade

Fase móvel

Taxa de fluxo

Volume de injeção

Temperatura da coluna

Tempo de retenção aproximado

Tempo total de operação

Temperatura do amostrador automático

225 nm0,1 AUFS

Acetonitrila: água (80: 20)0,8 mL/min25 μΙ_

Ambiente (20-25°C)Triton X-100: 5,0 ± 1 minuto10 minutos10 ± 4°C

Adequabilidade de sistema. Ajustar o sistema cromatográfico;deixar a lâmpada aquecer e equilibrar o sistema com fase móvel durantepelo menos uma hora antes de análise. Injetar SS N0 1 um mínimo de qua-tro vezes. Usar a segunda injeção SS N0 1 para todas as análises de Ade-quabilidade de sistema, a menos que de outro modo especificado. O tempode retenção para Triton X-100 deverá ser de 5,0 ± 1 minutos. A eficiência dacoluna para Triton X-100, avaliada como o número de placas teóricas (N)1deve ser > 2000 lâminas/ coluna quando calculada de acordo com a seguin-te equação:

<formula>formula see original document page 685</formula>

onde:

t = tempo de retenção do pico de Triton X-100 medido a par-tir do momento de injeção até o momento de eluição dopico máximo.

w = largura do pico de Triton X-100 medido extrapolando oslados do pico para a linha de base.

A resolução entre o pico de Triton X-100 e o pico adjacente maispróximo (se presente) deve ser >1.onde:

t = tempos de retenção do pico de Triton X-100 e do pico

adjacente no padrãoW = larguras correspondentes das bases dos picos obtidosatravés de extrapolação dos lados dos picos para a linhade base.

Calcular os fatores de resposta das últimas três injeções SS N0 1usando a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 686</formula>

onde:

A= Área de pico de Triton X-100

W = Peso de Triton X-100 (em mg) usado no preparo da solu-ção padrão de estoque de TX100 correspondenteOs fatores de resposta das últimas três injeções de SS N0 1 de-ve ter um desvio-padrão relativo (RSD) de < 10%. Calcular o RSD% usandoa seguinte equação:

<formula>formula see original document page 686</formula>

onde:

η = número de medições na amostraχ = medições individuaisComparar o fator de resposta da única injeção de SS N0 2 com ofator de resposta médio das últimas três injeções de SS N0 1. A diferençapercentual entre o fator de resposta de SS N0 2 e o fator de resposta médiodas três injeções SS N0 1 deve ser < 10%. Calcular a diferença percentualusando a seguinte equação.

<formula>formula see original document page 686</formula>

onde:RF1 = Fator de resposta médio das três injeções SS N0 1

RF2 = Fator de resposta de SS N0 2

Fazer uma única injeção de Amostra Placebo pós-SPE. Se osníveis de Triton X-100 são encontrados, fazer mais duas injeções da amos-tra de Placebo. Se Triton X-100 está presente, 1 descartar a Substância defármaco de CTLA4-lg e fazer novo Padrão de Limite e Controles com umnovo lote de Substância de fármaco de CTLA4-lg previamente analisado everificar se não contém níveis detectáveis de Triton X-100. Se os valoresexemplificativos acima não são obtidos, estender o equilíbrio da coluna du-rante mais uma hora e reinjetar a solução-padrão. Se os valores exemplifica-tivos ainda não são obtidos, executar as seguintes etapas. Verificar vaza-mentos certificando-se de que todas as conexões de tubulação estão firmes.Se equilíbrio estendido não funciona, ajustar o teor orgânico da fase móvele/ou fazer uma nova batelada da fase móvel e re-preparar a SS N0 1 e SSN0 2. Trocar a coluna se equilíbrio estendido e/ou ajuste da fase móvel nãoresultam nos valores exemplificativos requeridos. Antes de repetir, equilibrardurante pelo menos uma hora.

Seqüência de Injeção, equilibrar preliminarmente o sistema deHPLC e operar com sucesso o acima. Fazer uma única injeção de tampãopara substância de fármaco pós-SPE, referir-se à seção acima, como umplacebo de calibração. Observar se não há resposta de Triton X-100. Se umpico está presente no tempo de retenção do pico de Triton X-100, continuara injetar o placebo até que não haja nenhuma resposta. Fazer uma únicainjeção de substância de fármaco de CTLA4-lg pós-SPE, referir-se à seçãoacima, como uma amostra de placebo. Observar se não há resposta de Tri-ton X-100. Esse cromatograma deverá ser subtraído dos cromatogramas depadrão, controle e amostra antes que processamento de dados seja realiza-do. Fazer injeções em duplicata do Controle de Passe, Padrão de Limite eControle de Falha. Fazer uma única injeção do tampão para substância defármaco e nenhuma resposta de Triton X-100 deve ser notada. Fazer inje-ções em duplicata das amostras. As injeções de amostra são colocadas emfaixas através de injeções em duplicata de Padrão de Limite e uma injeçãodo tampão para substância de fármaco, de modo que não hajam mais de 10injeções de amostra entre as faixas de Padrão de Limite e injeções de subs-tância de fármaco. O final da operação deve ser terminado com injeções emduplicata do Padrão de Limite e uma injeção do placebo de tampão parasubstância de fármaco.

Processamento de dados. Subtrair o cromatograma da injeçãode Amostra de Placebo de todos os cromatogramas-padrão, controle e a-mostra antes de prosseguir com o processamento de dados. Assegurar queos picos de Triton X-100 nos cromatogramas de Padrão de Limite, Controlee amostra são apropriadamente integrados. O pico de Triton X-100 na amos-tra, se presente, deve estar dentro da mesma janela de tempo de retençãoque o Padrão de Limite. Calcular a média da área de pico de cada conjuntode injeções em duplicata. Injeções em duplicata devem ter uma diferença %na área de pico de < 10%. Se a injeção em duplicata do Padrão de Limite,Controle de Passe ou Controle de Falha não vão de encontro a esse critério,toda a operação é considerada inválida e precisará ser repetida. Se as inje-ções em duplicata da amostra falham em ir de encontro a esse critério, aamostra é considerada invalida e precisa ser repetidas. Todas as outras a-mostras, controle e padrões são considerados válidos na medida em queeles vão ao encontro do critério de < 10%. A área média de pico para o picode Triton X-100 em todas as faixas de Padrões de Limite, incluindo as inje-ções finais, deve estar dentro de 10% da área média de pico do Padrão deLimite. Se qualquer Padrão de Limite intermediário falha em ir ao encontrodo requisito de comparação de 10%, todas as amostras analisadas apóspassar o último Padrão de Limite são consideradas inválidas e devem ser re-analisadas.

Avaliação de Padrão de Limite, Controle de Passe, Falha deAmostras de Controle. Comparar as áreas médias de pico de Triton X-100para o Padrão de Limite, Controle de Passe e Controle de Falha. A área depico da Amostra de Controle de Falha deve ser maior do que aquela do Pa-drão de Limite. A área de pico da Amostra de Controle de Passe deve sermenor do que aquela do Padrão de Limite. Se ambas as condições não sãoreunidas, continuar a avaliação das amostras.

Avaliação de Amostras. A área média de pico de Triton X-100do Padrão de Limite devem ser corrigida para levar em conta a quantidadede material pesado no preparado de Padrão de Estoque de Triton X-100 N01, como segue:

Al = Als X (10,00 mg/peso)

onde:

Al = Área de pico corrigida para o limite de 0,5 pg/mL

Als = Área de pico média de Triton X-100 das faixas de Padrõesde Limite

Nota: Al é a área corrigida no limite de 0,5 pg/mL e será usada para compa-ração de amostras.

Comparar a área média de pico de Triton X-100 da amostra comAl. Se a área de pico < Al, a amostra passa na especificação. Se a área depico > Al, a amostra falha na especificação. Reportar os resultados que pas-saram na especificação como "<0,50 ppm" ou que falharam na especificaçãocomo ">0,50 ppm" ou conforme de outro modo requerido pela convenção derelato de dado

Exemplo 62 - Ensaio para quantificar a quantidade proteína A residualem material de substância de fármaco de CTLA4-lqMateriais

Anticorpo antiproteína A de coelho Sigma, (Catálogo No. P3775)

Anticorpo monoclonal antiproteína A biotinilado Sigma, (Catálogo No. B3150)

Reagentes

Tampão de Revestimento de carbonato. A um vaso adequa-do, adicionar: uma barra de agitação. Adicionar 500 mL de água com graupara HPLC ou Millipore. Adicionar os conteúdos de 5 cápsulas de carbonato.Agitar até bem misturado. Verificar e ajustar o pH para 9,6 ± 0,1. Usar NaOH(1,16) ou HCI (1,23). Entornar a solução em um sistema de esterilização comfiltro de 500 mL. Aplicar um vácuo para esterilizar em filtro a solução. Sobcondições assépticas, remover a unidade de filtro e tampar a garrafa. A so-lução é estável durante 30 dias quando armazenada a 2 - 8°C. Rotular a so-lução como "Tampão de Revestimento de carbonato".

Tampão de Lavagem: (PBS + Tween 20 a 0,05%): A uma gar-rafa de 4 L de água com grau para HPLC ou Millipore1 adicionar: uma barrade agitação. Adicionar 20 comprimidos de PBS. Adicionar 2,0 mL de Tween20. Verificar e ajustar o pH para 7,4 ±0,1. Usar NaOH ou HCI. Usando umaplaca de agitação, agitar até bem misturado. A solução é estável durante 30dias quando armazenado a 2 - 8°C. Rotular a solução como "Tampão deLavagem".

Solução de Término (H2SO4 a 1 N) ou usar ácido sulfúrico a1.000 Normal de VWR sem diluição. Em uma coifa, colocar um recipienteadequado sobre uma placa de agitação. Adicionar uma barra de agitação.Adicionar 485,6 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Ligar a placade agitação para iniciar a agitação de água. Adicionar lentamente 14,4 mLde H2S04concentrado. A solução é estável durante 30 dias quando armaze-nada em temperatura ambiente. Rotular o recipiente como "Solução de Tér-mino".

Tampão de acetato (ácido acético a 0,5M, cloreto de sódio a0,1 M, Tween 20 a 0,1%, pH de 3,5). Em uma coifa, colocar um recipienteadequado sobre uma placa de agitação. Adicionar uma barra de agitação.Adicionar 400 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Ligar a placade agitação para iniciar a agitação de água. Adicionar lentamente 14,8 mLde ácido acético glacial concentrado. Agitar até bem misturado. Adicionar 2,9g de cloreto de sódio. Agitar até bem misturado. Verificar e ajustar o pH para3,5 ± 0,1. Usar NaOH ou HCI. Adicionar 0,5 mL de Tween 20. Agitar até bemmisturado. Ajustar para um volume final de 500 mL com água com grau paraHPLC ou Millipore. Agitar até bem misturado. A solução é estável durante 30dias quando armazenada a 2 - 8°C. Rotular o recipiente como "Tampão deacetato".

Anticorpo antiproteína A de coelho. Remover o frasco do re-frigerador e deixar ir para a temperatura ambiente. Adicionar 2,0 mL de águacom grau para HPLC ou Millipore. Transformar em alíquotas volumes de 20μL em tubos com tampa de rosca de 0,5 mL. Tampar e colocar em uma cai-xa de armazenamento de células. A solução é estável durante 365 diasquando armazenada a - 20°C.

Anticorpo antiproteína A biotinilado. Remover o frasco do re-frigerador e deixar ir para a temperatura ambiente. Adicionar 1,0 ml_ de águacom grau para HPLC ou Millipore. Transformar em alíquotas volumes de 60μl em tubos com tampa de rosca de 2,0 mL. Tampar e colocar em uma cai-xa de armazenamento de células. A solução é estável durante 365 diasquando armazenada a - 20°C.

Estreptavidina-HRP. Adicionar 0,5 mL de água com grau paraHPLC ou Millipore a um frasco de Estreptavidina-HRP. Para misturar, tamparo frasco e submeter a turbilhonamento gentilmente durante aproximadamen-te 10 segundos. Adicionar 0,5 mL de glicerol ao frasco de Estreptavidina-HRP. Tampar o frasco e inverter gentilmente o frasco várias vezes. Verificara clareza da solução extraindo a solução em uma pipeta de Pasteur limpa.Transformar em alíquota volumes de 20 μί em tubos com tampa de rosca de0,5 mL. Tampar e colocar em uma caixa de armazenamento de células. Asolução é estável durante 365 dias quando armazenada a - 20°C.

Preparo de Padrão. Obter a concentração de proteína do mate-rial de referência Proteína A (mat ref) do Certificado de Análise (COA). Pre-parar uma solução a 11,500 ng/mL de material de referência Proteína A des-congelando a solução de estoque de Proteína A em temperatura ambiente.Calcular o volume requerido de material de referência Proteína A para obteruma solução a 11,500 ng/mL. Volume mínimo de transferência deverá ser 10μL.

<formula>formula see original document page 691</formula>

Nota: Assegurar que as unidades são compatíveis.

<formula>formula see original document page 691</formula>

Exemplo;

Calcular o volume de Tampão de acetato (3,4) subtraindo o vo-lume requerido de material de referência Proteína A do volume desejado.Fórmula: (Volume desejado) - (volume do Padrão de Referência) = (Vo-lume de diluente)

Exemplo: 10.0 mL - 0,920 mL = 9,180 mL de Diluente

Adicionar o volume calculado de material de referência ProteínaA a um tubo estéril de 15 mL o qual contém um volume calculado de tampãode acetato. Tampar o tubo. Submeter a turbilhonamento gentilmente (ajuste4 no Aparelho de turbilhonamento Genie 2) durante 2 - 4 segundos. Prepararos padrões restantes usando os volumes definidos abaixo:

<table>table see original document page 692</column></row><table>

Tampar o tubo após cada etapa de diluição e submeter a turbi-lhonamento gentilmente durante 2-4 segundos antes de prosseguir para apróxima etapa de diluição. Incubar Padrão de Referência e Amostras de con-trole de qualidade durante 10 minutos em temperatura ambiente antes deadição à lâmina de microtitulação. Cada concentração-padrão é analisadaem cavidades em triplicata.

Preparo de Amostras de teste. Preparar concentrações de 5mg/mL, 2,5 mg/mL e 1,25 mg/mL das amostras de teste de CTLA4-lg emtubos de polipropileno usando tampão de acetato. Descongelar a amostra deCTLA4-lg em temperatura ambiente antes de uso para preparar diluições.Calcular o volume requerido de amostra de teste para obter uma solução a5,0 mg/mL. Volume mínimo de transferência deverá ser de 10 μL.<formula>formula see original document page 693</formula>

Exemplo:

5.1.3 Calcular o volume de Tampão de acetato subtraindo ovolume requerido de amostra de teste do volume desejado.Fórmula: (Volume desejado) - (amostra de teste volume) = (Volume dediluente)

Exemplo: 1,0 mL - 0,200 mL = 0,800 mL de Diluente

Adicionar o volume calculado de amostra de teste a um tubo es-téril de 15 mL o qual contém um volume calculado de tampão de acetato.Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente (ajuste 4 no Apa-relho de turbilhonamento Genie 2) durante 2-4 segundos. As amostras sãoincubadas durante 10 minutos em temperatura ambiente antes de adição àlâmina de microtitulação.

Preparo de Amostras de controle de qualidade. Obter a con-centração de proteína do material de referência Proteína A do COA. Prepa-rar uma solução a 11,500 ng/mL de material de referência Proteína A. Pre-parar amostras de Controle de Qualidade (QC) conforme descrito em a tabe-la abaixo.

<formula>formula see original document page 693</formula>

Transformar em alíquotas volumes de 700 μί em tubos comtampa de rosca de 2,0 mL. Tampar e colocar em uma caixa de armazena-mento de células. A solução é estável durante 180 dias quando armazenadaa - 70°C ou abaixo. As concentrações de Proteína A nas amostras de QCtêm de ser predeterminadas através de: Realização de 3 ensaios ELISA deProteína A independentes usando esse método. A media dos 18 resultados(3 ensaios independentes vezes 6 cavidades por ensaio) deverá ser calcula-da. A concentração de Proteína A para cada amostra de QC será atribuída acada preparado. No dia de um experimento, descongelar um frasco de cadaamostra de QC em temperatura ambiente ou fazer amostras de QC frescasa partir do frasco de estoque de Proteína A. Submeter a turbilhonamentogentilmente (ajuste 4 no Aparelho de turbilhonamento Genie 2) durante 2 - 4segundos.

Procedimento. Revestir a lâmina com Anticorpo de captura. Ob-ter a concentração de proteína do Anticorpo antiproteína A de coelho dosfabricantes COA. Calcular o volume requerido de Anticorpo antiproteína A decoelho para obter 10 mL de uma solução a 100 pg/mL. Volume mínimo detransferência deverá ser de 10 μL.

<formula>formula see original document page 694</formula>

Nota: Assegurar que as unidades são compatíveis.

<formula>formula see original document page 694</formula>

Exemplo: 25mg/mL

Calcular o volume de Diluente subtraindo o volume requerido deAnticorpo antiproteína A de coelho do volume desejado.Fórmula: (Volume desejado) - (Volume de anticorpo) = (Volume de dilu-ente)

Exemplo: 3,0 mL - 0,012 mL = 2,988 mL de Diluente

Adicionar o volume calculado de Anticorpo antiproteína A decoelho a um tubo estéril de 15 mL, o qual contém um volume calculado dediluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente durante 2- 4 segundos. Preparar uma solução a 1 μg/mL de anticorpo antiproteína Ade coelho em Tampão de Revestimento, usando as fórmulas. Adicionar 100μl da solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Immulon IV.Incubar a 2-8°C durante 18 ± 2 horas. Lavar as lâminas três vezes com So-lução de Lavagem usando o lavador de lâminas com 300 μί de tampão delavagem e tempo de embebimento zero. As lâminas podem, alternativamen-te, ser lavadas usando uma pipeta com múltiplos canais. Usando uma pipetacom múltiplos canais, adicionar 200 μL de SuperBIock® a cada cavidade.Incubar a lâmina de microtitulação no escuro durante 60 minutos em tempe-ratura ambiente. Repetir a lavagem. Adicionar 100 μL de cada de Padrão deReferência, Controle de Qualidade e amostras de teste à lâmina de ensaio.Incubar a lâmina de microtitulação no escuro durante 60 minutos, ±10 minu-tos, em temperatura ambiente. Repetir a lavagem. Obter a concentração deproteína do Anticorpo antiproteína A de Biotina dos fabricantes COA. Prepa-rar 1,0 mL de uma solução a 1,0 mg/mL de Anticorpo antiproteína A de Bio-tina em diluente. Submeter a turbilhonamento em velocidade média. Adicio-nar 50 μΙ_ de solução a 1 mg/mL (7,9,1) a 0,950 mL de diluente. Submeter aturbilhonamento em velocidade média. Adicionar 150 μL de solução a 50μg/mL (7,9,3) a 14,850 mL de diluente. Adicionar 100 μL a cada cavidadeusando uma pipeta com múltiplos canais. Incubar em temperatura ambientedurante 60 minutos ±10 minutos. Repetir a lavagem. Diluir Estreptavidina-HRP como segue: Adicionar 10 μL de Estreptavidina-HRP a 0,990 pL de Di-luente para proporcionar 0,01 mg/mL de Estreptavidina-HRP. Submeter aturbilhonamento em velocidade média. Adicionar 80 μί de 0,01 mg/mL deEstreptavidina-HRP a 39,920 mL de Diluente. Submeter a turbilhonamentoem velocidade média. Adicionar 100 μL a cada cavidade usando uma pipetacom múltiplos canais. Incubar durante 30 minutos, ± 5 minutos, em tempera-tura ambiente. Remover o TMB do refrigerador e decantar um mínimo de 10mL por lâmina de TMB em um recipiente adequado. Colocar em um localescuro e deixar ir para a temperatura ambiente. Repetir a lavagem, mas Ia-var cinco vezes. Adicionar 100 μL de cromogênio TMB a cada cavidade. In-cubar em temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos, ± 1minuto. Cessar a reação com cromogênio através da adição de 100 μL/ ca-vidade de Solução de Término. Adicionar Solução de Término às lâminas ecavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionado para asse-gurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzima em cadacavidade. Medir a absorbância(AB) a 450 nm com um comprimento de ondade referência de 630 nm.Valores exemplificativos.

Valores exemplificativos para a Curva-padrão. Os valoresexemplificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acimado limite quantitativo (QL)1 uma vez que valores abaixo do QL são usadosapenas para ajudar a estabelecer os extremos da curva. O coeficiente dedeterminação (R2) para a Curva-padrão deverá ser > 0,99, conforme deter-minado pelo software SoftMax PRO. A base média para o padrão de zerong/mL deverá ser <0,08 unidades de absorção. A média dos valores calcula-dos (ng/mL) em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão exceto zero e o QL deve estar dentro de 15% do valor-alvo (nomi-nal), conforme determinado pelo software. O coeficiente de variação (CV%)dos valores AB450 em triplicata em cada concentração-padrão usada paradeterminar a curva-padrão, excluindo zero e QL, deve ser ±15%, conformedeterminado pelo software. A média dos valores de absorbância em triplicatado QL da curva-padrão deve exibir um CV% de menos do que 20% e estardentro de 20% do alvo, conforme determinado pelo software. Para assegurarque pelo menos dois pontos de dados congruentes estão disponíveis paracálculo, os padrões, controles e amostras são carregados em cavidades emtriplicata. Cada valor da triplicata usado para calcular a média será analisadoseparadamente.

Por exemplo:

Valor-alvo (ng/mL) Valor real (ng/mL)2,5 1,2

2,3

2,5

O único valor que está mais distante do valor-alvo de 2,5 ng/mLé 1,2 ng/mL. Eliminando o valor de 1,2 ng/mL da triplicata, a média dos valo-res restantes irá ao encontro dos valores exemplificativos. Se, quando de re-cálculo, outro ponto não vai. ao encontro dos valores exemplificativos, então,o ensaio não é válido e deve ser refeito. Se é mostrado que a média dosdois valores restantes ainda não vão ao encontro dos valores exemplificati-vos, então, o ponto único (todas as 3 cavidades) é eliminado e a curva é re-calculada.

Valores exemplificativos para amostras de QC. A QC amostraé definida como um conjunto de três cavidades na concentração estabeleci-da, portanto, para as três concentrações nominais estabelecidas nesse mé-todo, há um total de seis amostras de QC (para um total de 18 cavidades).Pelo menos duas das três cavidades para uma amostra de QC devem estardentro de 20% do nominal para que a amostra de QC seja aceitável. Pelomenos quatro das seis amostras de QC devem ser aceitáveis; duas das seisamostras de QC (não duas na mesma concentração ) e não mais do que 6das 18 cavidades com amostra de QC podem se desviar mais de 20% dasrespectivas concentrações-alvo.

Valores exemplificativos para amostras de teste. Cada umdos valores das amostras de teste em triplicata ensaiadas deve estar dentrode 20% do valor médio nessa concentração, conforme determinado pelosoftware. Se dois ou mais valores AB450 médios não podem ser calculadosporque eles estão acima do maior ponto sobre a curva-padrão, então, a a-mostra devem ser re-ensaiada em diluições maiores até pelo menos doisdos três valores caiam sobre a curva-padrão. A CV% das observações emtriplicata obtidas para cada concentração-alvo de amostra de teste deve ser£ 20%, conforme determinado pelo software.

Cálculos. Refira-se ao modelo do programa SoftMax para umELISA de Proteína A uma vez que ele gera a média, desvios-padrão e CV%.Calcular a média dos valores de Absorbância (AB) em triplicata obtidos paracada concentração de referência e amostra ensaiada. Calcular um modelode dados para um padrão de Proteína A usando uma regressão com quatroparâmetros ponderada da forma:

<formula>formula see original document page 697</formula>

onde:

min = valor AB correspondendo ao assíntota mínimomax = valor AB correspondendo ao assíntota máximoED5O = AB correspondendo à metade da diferença absolutaentre os valores assintóticos máximo e mínimo

B =o declínio aproximado da porção linear da curvaC = Concentração de Proteína A

Cálculo de Concentração de Proteína A nas amostras. Multi-plicar os resultados médios da amostra pelo fator de diluição apropriado (istoé 2, 4 e 8), para obter a concentração de Proteína A na amostra original emng/ml_. Dividir o resultado pela concentração de proteína de CTLA4-lg repor-tada (mg/ml_) para obter a concentração de Proteína A, em ng/mg, em C-TLA4-lg.

Cálculo exemplificativo:

<formula>formula see original document page 698</formula>

Concentração de Abatacept 50 mg/m L

Nota: ng de Proteína A/mgde CTLA4-lg (ng/mg) é equivalente a partes pormilhão (ppm).

Cálculos para a concentração de Proteína A em Ng/mL deAmostras. A quantidade Proteína A nas amostras de teste é calculada u-sando o presente software SoftMax usando a equação de regressão. Trêsdiluições de cada amostra são ensaiadas. A concentração calculada é multi-plicada pelo fator de diluição apropriado a fim de proporcionar a concentra-ção na amostra de teste inicial.

Exemplo:

A concentração da amostra de teste é 50 mg/mL.

Diluição de amostra Fator de diluição

5 mg/mL 10

2,5 mg/mL 20

1,25 mg/mL 40

5 mg/mL de amostra - Dados por ELISA que determinam a con-centração de Proteína A é 10 ng/mL

10 ng/mL χ 10 (fator de diluição) = 100 ng/mL de Proteína A naamostra de teste

2,5 mg/mL de amostra - Dados por ELISA que determinam aconcentração de Proteína A é 5,0 ng/mL

5 ng/mL χ 20 (fator de diluição) = 100 ng/mL de Proteína A naamostra de teste

1,25 mg/mL de amostra - Dados por ELISA que determinam aconcentração de Proteína A é 2,5 ng/mL

2,5 ng/mL χ 40 (fator de diluição) = 100 ng/mL de Proteína A naamostra de teste

Calcular a concentração média a partir dos três valores.Reportagem de resultados. Os resultados podem ser reportados em ter-mos de % peso/peso de proteína total, ng de Proteína A/mg de proteína to-tal", de outro modo referido como "ppm" (peso/peso).

Exemplo:

0,0001% peso/peso = 1 ng/mg = 1 ppm (peso/peso)

Cálculo exemplificativo:

<formula>formula see original document page 699</formula>

Amostras as quais resultam em um valor de AB450 menor do que

o AB450 de QL (0,188 ng/mL) deverão ser reportadas como "menos de QL".

Amostras as quais resultam em um valor de AB450 maior do que o AB450 de

QL (0,188 ng/mL) deverão ser reportadas ao número inteiro mais próximocomo partes por milhão (ppm).

Exemplo:

A concentração de amostra é 50 mg/mL. A maior concentraçãode amostra analisada é 5 mg/mL (diluição a 1/10). O AB450 da amostra émenor do que QL.

<formula>formula see original document page 699</formula>

Reportar como "< QL = 0,04 ppm"Exemplo 63: Métodos para obter proporções molares de amino monos-sacarídeos (N-acetil qalactosamina, N-acetil qlicosamina) para proteínaem amostras de substância de fármaco de CTLA4-lq.Reagentes

Solução de hidrólise (solução aquosa de HCI a 4 N). Adicio-nar 160 mL de HCI a 6 N e 80 mL de água com grau para HPLC a uma gar-rafa de vidro de 250 mL. Agitar para misturar bem. Armazenar a 2-8° C du-rante até 6 meses.

Solução de Derivatização I (solução aquosa de APTS a 0,1M). Adicionar 192 pL de água com grau para HPLC a 10 mg de pó de APTSem um frasco de vidro. Submeter o frasco a turbilhonamento 5-10 segundospara dissolver completamente o APTS. Armazenar a -20°C durante até umano.

Solução de Derivatização Il (ácido acético a 1 M e NaBH3CNa 0,25 M). Diluir 20 pL de ácido acético com 320 pL de água com grau paraHPLC (diluição de 17 vezes) em um tubo para centrífuga a 0,4 mL para fazeruma solução de ácido acético a 1 M. Pesar 2,0±0,5 mg de NaBH3CN em umfrasco criogênico. Usando a seguinte fórmula, adicionar um volume apropri-ado da solução de ácido acético a 1 M para fazer NaBH3CN a 0,25 M:Volume (pL) = 103 χ (peso de NaBH3CN em mg)/(62,84 g/mol χ 0,25 mol/L)

Nota: Preparar imediatamente antes de uso. Cianoborohidretode sódio (NaBH3CN) deverá ser armazenado no escuro em um secador.Sub-divisão do reagente em uma série de criofrascos de 2,0 mL para arma-zenamento é recomendada para evitar abertura repetida da garrafa de rea-gente original como segue:

Pesar 1,0 g ± 0,2 mg de cianoborohidreto de sódio em um crio-frasco de 2,0 mL. Transformar em alíquota os conteúdos todos de cianobo-rohidreto de sódio da garrafa original dessa maneira. Tampar hermeticamen-te e rotular os criofrascos seqüencialmente (1,2,3, etc.) junto com o nome doreagente, número de lote e uma data de expiração de 6 meses. Os frascosdeverão ser vedados com parafilme para evitar umidade. Pesar cianoborohi-dreto de sódio para a Solução de Derivatização Il não mais do que três timesa partir do mesmo criofrasco. Anotar isso e do número de seqüência do crio-frasco na folha de dados do laboratório. Um pico de reagente observado noperfil de CE ou pobre rotulação pode ocorrer após abertura repetida do crio-frasco ou com esse lote de cianoborohidreto de sódio em particular. Se issoafeta os resultados, descartar o criofrasco que está sendo usado e pesarreagente de um criofrasco com o próximo número de seqüência ou de umnovo lote de cianoborohidreto de sódio.

Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM, pHde 9,5). Pesar 0,210 ± 0,02 g de bicarbonato de sódio em um béquer de vi-dro limpo de 100 ml_. Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e mis-turar sobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dis-solvidos. Ajustar o pH para 9,5 ±0,1 com NaOH a 10 N. Adicionar água comgrau para HPLC para levar o volume final para 100 mL. Filtrar a solução earmazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses.

Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pHde 9,25). Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sódio em um béquer de vidrolimpo de 100 mL. Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturarsobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvi-dos. Ajustar o pH para 9,25 ±0,10 com NaOH a 10 N. Adicionar água comgrau para HPLC para levar o volume final para 100 mL para uma concentra-ção final de 60 ± 5 mM. Para uma solução a 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) detetraborato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação.Para uma solução a 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02) de tetraborato de sódio eseguir as instruções acima para dissolução e titulação. Armazenar em tem-peratura ambiente durante até 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolu-ção de pico (conforme definido na seção adequabilidade de sistema) é afe-tada (valor R < 1,0).

Opcional: Diluir solução de tampão de tetraborato (MicroSoIv)através da adição de 120 mL de água ultra pura a 80 mL de tampão de te-traborato de sódio a 150 mM para uma concentração final de 60 mM (± 5mM). Titular com NaOH a 10N para levar o pH da solução para 9,25 (± 0,1).Para uma solução de tetraborato a 55 mM, diluir 66 mL de tampão de tetra-borato de sódio a 150 mM em 114 mL de água ultra pura. Titular conformeacima. Para uma solução de tetraborato a 65 mM, diluir 78 mL de tampão detetraborato de sódio a 150 mM em 102 mL de água ultra pura. Titular con-forme acima. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante ummáximo de 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico (con-forme definido na seção adequabilidade de sistema) é afetada (valor R < 1,0).

Soluções de enxágue de capilar

Solução de NaOH a 1 N: Adicionar 1 mL de solução de NaOH a10 N em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 9 mL de águacom grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.

Solução de HCI a 1 N: Adicionar 1 mL de solução de HCI a 6 Nem um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 5 mL de água comgrau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg. Arma-zenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.

Solução de metanol a 80%: Adicionar 8 mL de metanol comgrau para HPLC em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 2 mLde água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 me-ses.

Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo:

N-Acetll Glicosamina (GaINAc). Pesar precisamente 5 + 1 mgde GaINAc em um frasco criogênico de 2,0 mL. Adicionar 1 mL de águacom grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissol-vida. Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).

N-Aeetil Galaetosamina (GIcNAc): Pesar precisamente 5 ± 1 mg de GIcNAc em um frasco criogênico de 2,0 mL. Adicionar 1 mL de águacom grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissol-vida. Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).

N-Aeetil Manosamina (ManNAe): Pesar precisamente 5 + 1 mgde ManNAc em um frasco criogênico de 2,0 mL. Adicionar 1 mL de águacom grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissol-vida. Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).

Armazenar soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeoa -20° C durante até 1 ano:

Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de traba-lho de padrão interno. Diluir solução de estoque de ManNAc 100 vezes comágua com grau para HPLC através da adição de 20 μΙ_ de solução de esto-que de ManNAc em um frasco criogênico de 2 ml_, o qual já contém 1980 pLde água com grau para HPLC. Submeter a turbilhonamento aproximadamen-te 5 a 10 segundos. Armazenar a solução de trabalho de padrão interno a 2-8°C durante até 6 meses.

Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de Traba-Iho Padrão de Mistura Amino. Em um frasco criogênico de 2,0 mL contendo1960 pL de água com grau para HPLC, adicionar 20 pL de soluções de es-toque de GaINAc e GIcNAc, respectivamente. Submeter a turbilhonamentoaproximadamente 5 a 10 segundos. Armazenar a Solução de Trabalho Pa-drão de Mistura Amino a 2-8°C durante até 6 meses.

Soluções de amostra e material de referência. Descongelar aamostra de proteínas a 2-8°C e misturar ligeiramente através de inversão.Diluir as amostras e material de referência com água com grau para HPLCpara cerca de 1,0 mg/mL. Anotar a concentração para três situações repre-sentativas.

<table>table see original document page 703</column></row><table>

Procedimento

Hidrólise. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10pL de solução de trabalho de ManNAc e 200 pL de Solução de Hidrólise a 4N. Isso serve como uma corrente de sistema. Em um tubo para centrífuga de-0,65 mL, adicionar 10 pL de solução de trabalho de ManNAc e 10 pL de So-lução-Padrão de Mistura Amino. Adicionar ainda 200 μL de Solução de Hi-drólise a 4N. Isso serve como padrão de monossacarídeo para quantificaçãoe Adequabilidade de sistema. Preparar em duplicata. Em um tubo para cen-trífuga de 0,65 ml_, adicionar 10 pL de solução de trabalho de ManNAc e 10μL de solução de material de referência de CTLA4-lg (aproximadamente 1mg/mL). Adicionar ainda 200 pL de solução de HCI a 4N. Preparar em dupli-cata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 ml_, adicionar 10 μL de solução detrabalho de ManNAc e 10 pL de solução de amostra (aproximadamente 1mg/mL). Adicionar ainda 200 pL de solução de HCI a 4N. Preparar em dupli-cata. Submeter a turbilhonamento as amostras durante aproximadamente 10segundos e centrifugar durante aproximadamente 5-10 segundos. Colocaras amostras em uma prateleira para frasco com 96 posições e incubar emum forno a 95°C durante 6 horas. Após hidrólise, colocar as amostras hidro-lisadas a -20°C durante 10 minutos para esfriar. Centrifugar rapidamente asamostras hidrolisadas até que qualquer condensado seja forçado para ofundo do tubo (5-10 segundos em alta velocidade). Evaporar as amostrasaté secagem em um SpeedVac. Reconstituir cada amostra com 100 μL deágua com grau para HPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evapo-rar as amostras até secagem em um SpeedVac.

Reacetilação. Reconstituir cada amostra com 10 pL de tampãode reacetilação M6 e submeter a turbilhonamento 5-10 seg. para misturarbem. Adicionar 4 pL de reagente de reacetilação M3 em cada tubo. Subme-ter a turbilhonamento durante aproximadamente 5-10 segundos. Incubar so-bre gelo durante 30 minutos. Evaporar as amostras até secagem em umSpeedVac. Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau paraHPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras atésecagem em um SpeedVac.

Derivatização. Colocar a microcentrífuga no forno para equili-brar para a temperatura do forno de 55°C. Reconstituir cada amostra com 10μL de Solução de Derivatização I (solução de APTS a 0,1 M). Submeter aturbilhonamento aproximadamente 5-10 segundos. Adicionar 5 pL da Solu-ção de Derivatização Il (HAc a 1M e NaBH3CN a 0,25 M). Submeter a turbi-Ihonamento aproximadamente 5-10 segundos e centrifugar. Carregar rapi-damente os frascos de amostra na centrífuga pré-aquecida e colocar a cen-trífuga de volta no forno a 55 °C. Incubar durante 3 horas enquanto centrifu-ga a 2000 rpm. Isso impede a condensação de solvente sobre a superfíciedo frasco.

Preparo de instrumentação

5.4.1 Instalar um novo capilar, enxaguar no modo de alta pres-são (80 PSI) usando as seguintes etapas: NaOH a 1 N durante 20 minutos;água com grau para HPLC durante 10 minutos; tampão de tetraborato desódio a 60 mM durante 10 minutos.

Operação diária

Antes de cada operação do dia, operar as seqüências de Iava-gem/enxágue para enxaguar o capilar.

Uso de NaOH a 1N pode causticar o interior de capilares de dife-rentes vendedores e causa um desvio nos tempos de migração por toda aoperação. Se isso faz com que o tempo de migração do último pico(GIcNAc) seja mais de 10,0 minutos, pode ser necessário substituir NaOH a1N por NaOH a 0,1 N ou água com grau para HPLC para o enxágue da etapa 2.

Preparo para injeção:

Após derivatização, deixar as amostras esfriar até a temperaturaambiente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos em temperatura ambi-ente, até o condensado ser forçado para o fundo do tubo.

Adicionar 85 pL de água com grau para HPLC a cada tubo paralevar o volume final de cada amostra para 100 pL. Submeter a turbilhona-mento durante 5-10 segundos.Transferir 10 μL de amostra de cada tubo para um microfrascopara CE e adicionar 190 μL de água com grau para HPLC a cada tubo.Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos.Etapas de enxágue e seqüência de injeção:

Nota: Para cada quatro injeções, trocar o Tampão de Operaçãode CE por Tampão de Operação de CE recentemente preparado (em virtudedo efeito de depleção tônica). Realizar enxágue do capitara 275,8 kPa (40 psi).

<table>table see original document page 706</column></row><table><table>table see original document page 707</column></row><table>

*Nota: Repetir a seqüência para até três amostras em duplicata

e agrupar com 2 injeções de cada preparado de Padrão de monossacarídeo.Usar todas as oito injeções de Padrões de Adequabilidade de sistema paraamostras colocadas em grupos de três. Se operando com mais de três a-mostras, operar as amostras adicionais conforme mostrado na seqüênciaacima começando com a linha 19. Completar a seqüência operando a ade-quabilidade de sistema (Padrão de mono) conforme mostrado nas linhas 47a 53 na Tabela.

**Faixas de amostra com duas injeções de cada preparado dematerial de referência de CTLA4-lg.Adequabilidade de sistema

Nota: Valores de Adequabilidade de sistema são determinadosusando as primeiras injeções de Padrão de Adequabilidade de sistema, amenos que de outro modo especificado. O eletroferograma do primeira ade-quabilidade de sistema deverá ser similar àquele mostrado na figura 1, ondeo pico 1 é GaINAc; o pico 2 é ManNAc; o pico 3 é GIcNAc.

0,0001 mg/mL de proteína A

50 mg/mL de amostra de teste

χ 100% = 2 ng/mg = 2 ppm

onde:

R = resolução

t2 , ti = tempos de migração dos dois picos vizinhos respec-

tivamente

Wi1 W2 = larguras de pico na linha de base dos dois picosvizinhos respectivamente

O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar com asseqüências de lavagem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tam-pão antigo por Tampão de Operação recentemente preparado ou substituir ocapilar.

T=W0,05/2f

onde:

T= fator de configuração

W0, 05 - largura de pico a 5% de alturaf = largura da fronte de pico em pico máximoSe T > 1,4, enxaguar o capilar com as seqüências de lava-gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampãode operação recentemente preparado ou substituir o capilar.6.1 As injeções repetidas de Padrões de Adequabilidade de sistema deverãoir ao encontro dos seguintes valores exemplificativos:

• Proporção de área de pico de GIcNAc vs. MaNAc: RSD < 10%(calculada na etapa 7,1)

· Tempo de migração de GIcNAc deverá ser <10,0 minutos

• O perfil deverá ser equivalente à figura 1 onde os três picossão observados e o padrão interno (ManNAc) é o pico de número 2.

Se qualquer um dos valores exemplificativos acima não é obtidoantes de testagem das amostras, primeiro aumentar a tensão se o tempo demigração de GIcNAc é mais de 10,0 minutos. Em seguida, se a proporção deárea de pico é > 10%, preparar tampão de CE fresco tendo certeza de seupH ou substituir o capilar. Após ajuste do instrumento, repetir as injeções deAdequabilidade de sistema. Quando de análise do perfil de pico, se uma di-minuição significativa na altura de pico de ManNac ocorre, verificar se de-terminados cabos de fibra óptica no módulo de LIF não estão mal alinhados.

Determinar o RSD percentual para o padrão monossacarídicoatravés de comparação da proporção de componentes de áreas de pico dopadrão interno e padrão de monossacarídeo. Dividir a área de pico para ca-da componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno paracada injeção de padrão de monossacarídeo. Calcular o RSD percentual paraGaINAc e GIcNAc para as faixas dos dois padrões. O RSD deverá ser <10%. Se esse valor médio exemplificativo não é obtido, então, o capilar de-verá ser enxaguado ou substituído conforme acima.Cálculos

Cálculo de Proporção de área de pico de GaINAc e GIcNAc comrelação ao padrão interno (ManNAc). Usado sobre injeções repetidas dosprimeiros quatro Padrões de Adequabilidade de Sistema de modo a ir aoencontro dos valores exemplificativos e realizar os mesmos cálculos sobretodas as faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema injetados antes eapós amostra(s).

Proporção de área de pico = Dividir a área de pico para cadacomponente monossacarídico (GlcNAc, GaINAc) pela área de pico do pa-drão interno (ManNAc) para cada injeção de Padrão de Adequabilidade desistema.

Calcular uma média das proporções de área de pico para Glc-NAc e GaINAc nos Padrões de Adequabilidade de Sistema. Também calcu-lar um desvio-padrão (S.D.) e desvio-padrão relativo percentual (%RSD)

Valores exemplificativos: RSD para a proporção de área depico de GIcNAc < 10%. Faixas de dois Padrões de Adequabilidade de Sis-tema injetados antes e após amostra(s): RSD percentual para a proporçãode área de pico de GIcNAc e GaINAc < 10%.

Se esse valor exemplificativo médio não é obtido (RSD > 10%),então, o capilar precisa ser re-enxaguado com os procedimentos de enxá-gue e aquelas faixas de amostras e padrões de monossacarídeo precisamser operadas novamente. Se o valor exemplificativo médio ainda não é obti-do, substituir o capilar e enxaguar conforme estabelecido, operar as faixasde amostras e padrões de monossacarídeo novamente.

Proporção de área de pico =

área de pico de monossacarídeo

Área de pico de MaNAc

Desvio-padrão

onde:

<formula>formula see original document page 710</formula>

Calcular a proporção molar de GaINAc/Proteína:

<formula>formula see original document page 710</formula>

onde:

RGalNAc -AGaINAc =

proporção molar de GaINAc vs. proteínaárea de pico (μν-seg) de GaINAc na amostraAManNAc = área de pico (pVseg) de ManNAc na amostraAManNAco = área média de pico (μΝ/ seg) de ManNAc no pa-drão de monossacarídeoAg3InacO = área média de pico (μν-seg) de GaINAc no padrãode monossacarídeo

VGaiNAco = volume de GaINAc contido na solução de trabalhode monossacarídeo usada para hidrólise (em μΙ_)CGaiNAeo = concentração de GaINAc contido na solução detrabalho de monossacarídeo usada para hidrólise(em mg/mL)

Vp = volume de amostra de proteína usada para hidróli-se (em μL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada parahidrólise (em mg/mL)MWctuv4 -ig- Peso molecular de material de referência de C-TLA4-lg

MWgicnac = Peso molecular de GaINAc (221,2 dáltons)Agrupamento de padrões. Quando de cálculo das proporçõesmolares de material de referência de CTLA4-lg e amostras, usar todas asoito faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema. Calcular as médiasdas áreas de pico para inclusão nessa equação. Essa deve ser usada paraas primeiras três amostras. Para todas as outras amostras, sempre usar aárea média de pico das próximas quatro faixas-padrão de monossacarídeo eas quatro faixas-padrão anteriores de monossacarídeo para cálculos da pro-porção molar.

Calcular a proporção molar de GlcNAc/Proteína

AgIcNAc χ AManNAcO x VgIcNAcO x CgIcNAcO x MWCTLA4-IgiRgüINAc--

onde:

AManNAc X AgIcNAcO X Vp X Cp X MWgIcNAc

Rgicnac = proporção molar de GIcNAc vs. proteínaAgicnac = área de pico (pV seg) de GIcNAc na amostraAManNAc = área de pico (pV seg) de ManNAc na amostraAwianNAco = área média de pico (pVseg) de ManNAc no pa-drão de monossacarídeoAgicnaco = área média de pico (pVseg) de GIcNAc no padrãode monossacarídeo

Vgicnaco = volume de GIcNAc contido na solução de trabalhode monossacarídeo usada para hidrólise (em pL)Cgicnaco = concentração de GIcNAc contido na solução detrabalho de monossacarídeo usada para hidrólise(em mg/mL)

Vp = volume de amostra de proteína usada para hidróli-se (em μL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada para

hidrólise (em mg/mL)MWcTLA4-ig = Peso molecular de material de referência de Ο-

TLA4-lg as per COA

MWgicnac = Peso molecular de GIcNAc (221,2 dáltons)Valores exemplificativos. O RSD percentual para as propor-ções de área de pico das duas faixas de Padrão Amino de Adequabilidadede Sistema não deverá exceder a 10%. A proporção molar média para ami-no monossacarídeos no material de referência deve estar dentro da faixasespecificadas. Para cada componente, o RSD % para os quatro resultados(injeção em duplicata de preparados em duplicada) devem ser </= 25%.Faixa de proporção molar de material de referência de CTLA4-lg

Monossacarídeo FaixaGaINAc 2,0-3,2GIcNAc 18-32

Reportagem de resultados. Reportar o resultado médio como onúmero de moléculas de GaINAc por molécula de CTLA4-lg e número demoléculas de GIcNAc por molécula de CTLA4-lg. Reportar os resultados deproporção molar para duas situações representativas. Para cada componen-te, o RSD % para os quatro resultados (injeção em duplicata de preparadosem duplicada) devem ser </= 25%.Exemplo 64: Métodos para obter proporções molares de monossacarí-deos neutros (manose, fucose. galactose) para proteína em amostrasde substância de fármaco de CTLA4-lg.Reagentes

Solução de hidrólise (solução aquosa de TFA a 2 M). Adicio-nar 148 µL de TFA e 852 µL de água com grau para HPLC a um tubo paramicrocentrífuga de 1,7 mL. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 se-gundos. Escalonar conforme necessário. Preparar a solução imediatamenteantes de uso.

Solução de Derivatização I (solução aquosa de APTS a 0,1

M). Adicionar 192 µL de água com grau para HPLC a 10 mg de pó de APTSem um frasco de vidro. Submeter a garrafa a turbilhonamento 5-10 segundospara dissolver completamente o APTS. Armazenar a -20°C durante até umano.

Solução de Derivatização II (ácido acético a 1 M e NaBH3CNa 0,25 M). Diluir 20 pL ácido acético com 320 pL água com grau para HPLC(diluição de 17 vezes) em um tubo para centrífuga a 0,4 mL para fazer umasolução de ácido acético a 1 M. Pesar 2,0±0,5 mg de NaBH3CN em um fras-co criogênico. Usando a seguinte fórmula, adicionar um volume apropriadoda solução de ácido acético a 1 M para fazer NaBH3CN a 0,25 M.

Volume (µL) = 103 ? (peso de NaBH3CN em mg)/62,84 g/mol ? 0,25 mols/L)

• Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) deverá ser armazenadono escuro em um secador.

• Subdivisão do reagente em uma série de criofrascos de 2,0mL para armazenamento é recomendado para evitar abertura repetida dagarrafa de reagente original como segue:

• Pesar 1 g í 0,2 mg de cianoborohidreto de sódio em um crio-frasco de 2,0 mL. Transformar em alíquota os conteúdos todos de cianobo-rohidreto de sódio da garrafa original dessa maneira.

Tampar hermeticamente e rotular os criofrascos seqüencial-mente (1,2,3, etc.) junto com o nome do reagente, número de lote e umadata de expiração de 6 meses.• Os frascos deverão ser vedados com parafilme para evitar u-midade.

• Pesar cianoborohidreto de sódio para a Solução de Derivatiza-ção Il não mais do que três times a partir do mesmo criofrasco. Anotar isso eo número de seqüência do criofrasco na folha de dados do laboratório.

Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 + 5 mM, pH de 9,25)

Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sódio em uma garrafa devidro de 100 ml_ limpa.

Ajustar o pH para 9,25 ± 0,10 com NaOH a 10 N.

Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume finalpara 100 mL para uma concentração final de 60 mM (± 5 mM).

Para uma solução a 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetraboratode sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação.

Para uma solução a 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02 g) de tetrabora-to de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação.

Armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses. Pre-parar tampão fresco se a resolução de pico (conforme definido na seção a-dequabilidade de Sistema) é afetada (valor R < 1,0).

Opcional: Diluir solução de tampão de tetraborato (MicroSoIv)através da adição de 120 mL de água ultra pura a 80 mL de tampão de te-traborato de sódio a 150 mM para uma concentração final de 60 mM (± 5mM). Titular com NaOH a 10N para levar o pH da solução para 9,25 (± 0,1).

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante um má-ximo de 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico (conformedefinido na seção adequabilidade de Sistema) é afetada (valor R < 1,0).

Soluções de enxágue de capilar

Solução de NaOH a 1 N

Adicionar 1 mL de solução de NaOH a 10 N em um tubo de plás-tico graduado de 14 mL contendo 9 mL de água com grau para HPLC. Mistu-rar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6meses.

Solução de HCI a 1 N:

Adicionar 1 mL de solução de HCI a 6 N em um tubo de plásticograduado de 15 mL contendo 5 mL de água com grau para HPLC. Misturarbem através de turbilhonamento 5-10 seg.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6meses.

Solução de metanol a 80%:

Adicionar 8 mL de metanol com grau para HPLC em um tubo deplástico graduado de 15 mL contendo 2 mL de água com grau para HPLC.Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.

Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6meses.

Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo

Manose (Man)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de manose em um frasco criogêni-co de 2,0 mL.

Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bematravés de turbilhonamento 5-10 seg.Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).Fucose (Fuc)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de fucose em um frasco criogênico

de 2,0 mL.

Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bematravés de turbilhonamento 5-10 seg.

Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).Galactose (GaI)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de galactose em um frasco criogê-nicode2,0mL.

Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).Xilose (XyI)

Pesar precisamente 5 ± 1 mg de xilose em um frasco criogênicode 2,0 mL.

Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).

Armazenar as soluções de estoque de Padrão de Monossacarí-deo a -20°C durante até 1 ano.

Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de traba-lho de padrão interno. Para fazer a solução de trabalho de padrão interno,diluir solução de estoque de xilose 100 vezes com água com grau para H-PLC através da adição de 20 pL de solução de estoque de xilose (3.6.4) emum frasco criogênico de 2 mL, o qual já contém 1980 pL de água com graupara HPLC. Submeter a turbilhonamento durante aproximadamente 5 a 10segundos. Armazenar essa solução de trabalho de padrão interno a 2-8°Cdurante até 6 meses.

Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de traba-lho padrão de mistura neutra. Em um frasco criogênico de 2,0 mL contendo1940 pL de água com grau para HPLC, adicionar 20 pL de soluções de es-toque de manose, fucose e galactose, respectivamente. Submeter a turbi-Ihonamento durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Armazenar essasolução de trabalho de padrão interno a 2-8°C durante até 6 meses.

Soluções de amostra e material de referência: Descongelar aamostra de proteínas a 2-8°C e misturar ligeiramente através de inversão.Diluir as amostras e material de referência com grau para HPLC para cercade 1,0 mg/mL.

Condições de operação CE

<table>table see original document page 717</column></row><table>

Procedimento

Hidrólise: Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10pL de solução de trabalho de xilose e 200 pL de solução de TFA a 2M. Issoserve como uma corrente de sistema. Em um tubo para centrífuga de 0,65mL, adicionar 10 pL de solução de trabalho de xilose e 10 pL de solução detrabalho padrão de mistura neutra. Adicionar ainda 200 pL de solução deTFA a 2M e submeter a turbilhonamento durante 3-4 seg. Isso serve comopadrão de monossacarídeo para quantificação e Adequabilidade de Sistema.Preparar em duplicata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10pL de solução de trabalho de xilose e 10 pL de solução de material de refe-rência de CTLA4-lg (aproximadamente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 pL desolução de TFA a 2M e submeter a turbilhonamento durante 3-4 seg. Prepa-rar em duplicata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 pL desolução de trabalho de xilose e 10 pL de solução de amostra (aproximada-mente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 pL de solução de TFA a 2M e subme-ter a turbilhonamento durante 3-4 seg. Preparar em duplicata. Submeter aturbilhonamento as amostras durante aproximadamente 20 segundos e cen-trifugar durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Colocar as amostras emuma prateleira para frasco com 96 posições e incubar em um forno a 95 0Cdurante 6 horas. Após hidrólise, colocar as amostras a -20 0C durante 10minutos para esfriar. Centrifugar rapidamente as amostras hidrolisadas atéque qualquer condensado seja forçado para o fundo do tubo (5 a 10 segun-dos em alta velocidade). Evaporar as amostras até secagem em um Speed-Vac. Reconstituir cada amostra com 100 μΙ_ de água com grau para HPLC esubmeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras até secagemem um SpeedVac.

Derivatização: Colocar a microcentrífuga no forno para equili-brar para a temperatura do forno de 55°C. Reconstituir cada amostra com 10pL de Solução de Derivatização I (solução de APTS a 0,1 M). Submeter aturbilhonamento aproximadamente 5-10 segundos. Adicionar 5 pL da Solu-ção de Derivatização Il (HAc a 1M e NaBH3CN 0,25 M). Submeter a turbi-lhonamento aproximadamente 5-10 segundos e centrifugar. Carregar rapi-damente os frascos de amostra na centrífuga pré-aquecida e colocar a cen-trífuga de volta no forno a 55 °C. Incubar durante 3 horas enquanto centrifu-ga a 2000 rpm. Isso impede a condensação de solvente sobre a superfíciedo frasco.

Preparo de instrumentação: Instalar um novo capilar, enxaguarem no modo de alta pressão (80 PSI) usando as seguintes etapas:

NaOH a 1 N durante 20 minutos.

Água com grau para HPLC durante 10 minutos.

Tampão de tetraborato de sódio a 60 mM durante 10 minutos.

Operar as seqüências de lavagem/enxágue para enxaguar o ca-pilar. Então, operar o Padrão de Adequabilidade de sistema (padrão de mo-nossacarídeo) para assegurar que o sistema é adequado. Uso de NaOH a1N, pode causticar o interior de capilares de diferentes vendedores e causaum desvio nos tempos de migração por toda a operação. Se isso faz comque o tempo de migração do último pico (galactose) seja mais de 15,0 minu-tos, podendo ser necessário substituir NaOH a 1N por NaOH a 0,1 N ou águacom grau para HPLC para o enxágue da etapa 2. Quando uso de um capilarequivalente e do procedimento de lavagem acima não é adequado, uso demetanol a 80% e/ou HCI a 1N pode ser necessário para que o último pico(galactose) esteja dentro dos valores exemplificativos de 15,0 minutos.

Preparo para injeção: Após derivatização, deixar as amostrasesfriar para a temperatura ambiente. Centrifugar aproximadamente 10 se-gundos em temperatura ambiente, até o condensado ser forçado para o fun-do do tubo. Adicionar 85 μΙ_ de água com grau para HPLC a cada tubo paralevar o volume final de cada amostra para 100 pL. Submeter a turbilhona-mento durante 5-10 segundos. Transferir 10 pL de amostra de cada tubopara um micro frasco para CE e adicionar 190 pL de água com grau paraHPLC a cada tubo. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos.

Seqüência de etapas de enxágue e injeção:

<table>table see original document page 719</column></row><table><table>table see original document page 720</column></row><table>

*Repetir a seqüência para até três amostras em duplicata e a-grupar com 2 injeções de cada preparado de Padrão de monossacarídeo.Usar todas as oito injeções de Padrões de Adequabilidade de sistema paraamostras colocadas em grupos de três. Se operando com mais de três a-mostras, operar as amostras adicionais conforme mostrado na seqüênciaacima começando com a linha 19.

**Faixas de amostra com duas injeções de cada preparado dematerial de referência de CTLA4-lg.

Adequabilidade de Sistema. O eletroferograma da primeiraAdequabilidade de Sistema deverá ser similar a um onde o pico 1 é manose;o pico 2 é xilose; o pico 3 é fucose; e o pico 4 é galactose.

Nota: Quando outros instrumentos de CE que não o BeckmanPACE MDQ têm de ser usados, em virtude das várias configurações de car-tuchos contendo o capilar de separação, o comprimento do capilar poderiaser diferente daquele especificado nesse s método. Isso causaria variaçõesno tempo de migração de analito, bem como na intensidade de pico.

<formula>formula see original document page 721</formula>

onde:

R = resolução

t2, ti = tempos de migração dos dois picos vizinhos, respec-tivamente

W-i, W2 = larguras de pico na linha de base dos dois picos vizi-nhos, respectivamente

O valor de R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar comas seqüências de lavagem/enxágue; se o problema persiste, substituir otampão antigo por tampão de operação recentemente preparado ou substitu-ir o capilar.

T=W0,05/2f

onde:

T = fator de configuração

Wo,o5 = largura de pico a 5% de altura

f = largura da fronte de pico em pico máximo

Injeção repetida dos primeiros quatro Padrões de Adequabilida-de de Sistema deverá ir ao encontro dos seguintes valores exemplificativos:• Proporção de área de pico de galactose vs. xilose: RSD <10%.

• Tempo de migração de galactose precisa ser <15,0 minutos

• O perfil deverá ser equivalente à figura 1, onde os quatro picossão observados e o padrão interno (Xilose) é o pico de número 2.

Se qualquer um dos valores exemplificativos acima não são ob-tidos, primeiro aumentar a tensão se o tempo de migração de galactose émais de 15,0 minutos. Em seguida, se a proporção de área de pico é > 10%,então, preparar tampão de CE fresco tendo certeza de seu pH ou substituir ocapilar.

Após ajustes no instrumento, repetir injeções de adequabilidadede sistema. Quando de análise do perfil de pico, se uma diminuição significa-tiva na altura de pico de Xilose ocorre, verificar se determinados cabos defibra óptica no módulo de LIF não estão mal alinhados. Determinar o RSDpercentual para o padrão monossacarídico através de comparação da pro-porção de áreas de pico dos componentes de padrão interno e padrão demonossacarídeo. Dividir a área de pico para cada componente monossaca-rídico pela área de pico do padrão interno para cada injeção padrão de mo-nossacarídeo. Calcular o RSD percentual para manose, fucose e galactosepara as faixas dos dois padrões. O RSD deverá ser < 10%. Se esse valormédio exemplificativo não é met, então, o capilar deverá ser enxaguado ousubstituído conforme acima. Faixas de amostras e padrões de monossacarí-deo precisam ser repetidas.

Cálculos. Cálculo da proporção de área de pico de Man, Fuc eGal com relação ao padrão interno (Xilose). Usado sobre injeções repetidasdos primeiros quatro Padrões de Adequabilidade de Sistema de modo a ir aoencontro dos valores exemplificativos e realizar os mesmos cálculos sobretodas as faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema injetados antes eapós amostra(s). Proporção de área de pico = Dividir a área de pico paracada componente monossacarídico (Man, Fuc e Gal) pela área de pico dopadrão interno (Xilose) para cada injeção de Padrão de Adequabilidade desistema.<formula>formula see original document page 723</formula>

Calcular uma média das proporções de área de pico paraMan,Fuc e Gal nos Padrões de Adequabilidade de Sistema. Também calcular odesvio-padrão (S.D.) e desvio-padrão relativo percentual (%RSD).

Valores exemplificativos: RSD para a proporção de área depico de Galactose < 10%. Faixas de dois Padrões de Adequabilidade de Sis-tema injetados antes e após amostra(s):

RSD percentual para a proporção de área de pico de Man, Fuc e Gal <10%.

Se esse valor exemplificativo médio não é obtido (RSD > 10%), então, o capilar precisa ser re-enxaguado com os procedimentos de enxá-gue e aquelas faixas de amostras e padrões de monossacarídeo precisamser operadas novamente. Se o valor exemplificativo médio é ainda não éobtido, substituir o capilar e enxaguar. Operar as faixas de amostras e pa-drões de monossacarídeo novamente.

<formula>formula see original document page 723</formula>

onde:

η = número de medições na amostra

χ = medições individuais

<formula>formula see original document page 723</formula>

Calcular a proporção molar de Manose/Proteína

<formula>formula see original document page 723</formula>

onde:

Rivian = proporção molar de Manose (Man) vs. proteína

AMan = área de pico (μν-seg) de Man na amostra

Axyi = área de pico (μΝ/ seg) de Xilose (XyI) na amostra

Axyio = área média de pico (pV seg) de Xyl no padrão de

monossacarídeoAMano = área média de pico (pVseg) de Man no padrão

de monossacarídeoVMano = volume de Man contido na solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em μΙ_)CMano = concentração de Man contida na solução de tra-

balho de monossacarídeo usada para hidrólise(em mg/mL)

Vp = volume de amostra de proteína usada para hidró-lise (em μL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada parahidrólise (em mg/mL)

MWcTLA4-ig = Peso molecular de material de referência deCTLA4-lg conforme o Certificado de Análise (COA)MWMan = Peso molecular de Manose (180,2 dáltons)

Agrupamento de padrão. Quando de cálculo das proporçõesmolares de material de referência de CTLA4-lg e amostras, usar todas asoito faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema. Calcular as médiasdas áreas de pico para inclusão nessa equação. Essa deve ser usada paraas primeiras três amostras. Para todas as outras amostras, sempre usar aárea média de pico das próximas quatro faixas de padrões de monossacarí-deo e as quatro faixas de padrões anteriores de monossacarídeo para cálcu-los da proporção molar.

Calcular a proporção molar de Fucose/Proteína:

<formula>formula see original document page 724</formula>

onde:

Rfuc = proporção molar de Fucose (Fuc) vs. proteína

Afuc = área de pico (pVseg) de Fuc na amostra

AXyi = área de pico (μν-seg) de Xilose (XyI) na amostra

Axyio = área média de pico (μν-seg) de Xyl no padrão demonossacarídeo

Afuco = área média de pico (μν-seg) de Fuc no padrão demonossacarídeoVfuco = volume de Fuc contido na solução de trabalho de

monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)Cfuco = concentração de Fuc contida na solução de traba-

Iho de monossacarídeo usada para hidrólise (emmg/mL)

Vp = volume de amostra de proteína usada para hidró-lise (em pL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada parahidrólise (em mg/mL)

MWCTLA4-ig= Peso molecular de material de referência deCTLA4-lg conforme o Certificado de Análise (COA)MWfuc = Peso molecular de Fucose (164,2 dáltons)

Calcular a proporção molar de Galactose/Proteína:

<formula>formula see original document page 725</formula>

onde:

Açaí XAXyio XVGaIOxCGaIOxMW CTLA4-lg

Xyl ΧΑα„,ο XF PXC ρ XAiW,

Rg3I = proporção molar de Galactose (GaI) vs. proteínaAcai = área de pico (pVseg) de Gal na amostraAxyI = área de pico (pVseg) de Xilose (XyI) na amostraAxy10 = área média de pico (pVseg) de Xyl no padrão demonossacarídeo

AGa10 = área de pico (pVseg) average de Gal no padrãode monossacarídeo

Vga10 = volume de Gal contido na solução de trabalho demonossacarídeo usada para hidrólise (em pL)

Cga10: = concentração de Gal contido na solução de traba-lho de monossacarídeo usada para hidrólise (emmg/mL)

Vp = volume de amostra de proteína usada para hidró-lise (em pL)

Cp = concentração de amostra de proteína usada parahidrólise (em mg/mL)MWdLM-Ig = Peso molecular de material de referência deCTLA4-lg conforme o Certificado de Análise (COA)MWcai = Peso molecular de Gal (180,2 dáltons)Nota: Quando de cálculo de proporções molar de material de

referência de CTLA4-lg e amostras, usar a faixa do último preparado de Pa-drão de Adequabilidade de Sistema e do próximo preparado de Padrão deAdequabilidade de Sistema. Calcular a média das áreas de pico para inclu-são nessa equação. Essa deve ser usada para as primeiras seis amostras.Para todas as outras amostras, sempre usar a área média de pico das duasfaixas de padrões de monossacarídeo para cálculos da proporção molar.

Valores exemplificativos. O RSD percentual para a proporçãode área de pico para as duas faixas de Padrão de Adequabilidade de Siste-ma não deverão exceder a 10%. A proporção molar média para monossaca-rídeos neutros no material de referência pode estar dentro da faixas especi-ficadas na Tabela abaixo. Para cada componente, o RSD% para os quatroresultados (injeções em duplicata de preparados em duplicada) devem ser</= 25 %.

Faixa de proporção molar de material de referência de CTLA4-lg

Monossacarídeo FaixaManose 11-18Fucose 4,2-7,5Galactose 9,2-18

Reportagem de resultados. Reportar o resultado médio comonúmero de moléculas de manose por molécula de CTLA4-lg, número de mo-léculas de fucose por molécula de CTLA4-lg e número de moléculas de ga-Iactose por molécula de CTLA4-lg. Reportar os resultados de proporção mo-lar para duas situações representativas. Para cada componente, o RSD %para os quatro resultados (injeções em duplicata de preparados em duplica-da) deve ser </= 25%.

Exemplo 65 - Quantificação por mapeamento tríptico de CTLA4-lg Oxi-dação e DeamidaçãoA finalidade do método é monitorar a consistência lote-a-lote deCTLA4-lg usando um procedimento de mapeamento peptídico tríptico ma-nual com detecção e quantificação específicas de metionina oxidação e as-paragina deamidação. Mapeamento peptídico envolve a proteólise ou outrafragmentação de uma proteína para criar um conjunto bem definido de frag-mentos peptídicos os quais são, então, analisados, usualmente através deHPLC. O cromatograma ou mapeamento peptídico é muito sensível mesmoà menor alteração na estrutura química da proteína e é, assim, útil para de-tecção e caracterização de modificações pós-traducionais. A amostra de pro-teína de CTLA4-lg é desnaturada em tampão de guanidina a 8 M-HCI e asligações em ponte de dissulfeto de cisteína reduzidas com ditiotreitol e S-alquiladas com iodoacetamida antes de digestão com a enzima proteolítica,tripsina. A mistura resultante de peptídeos trípticos é, então, analisada atra-vés de cromatografia de líquido de alto desempenho em fase reversa (RP-HPLC) com detecção por UV a 215 e 280 nm. Algumas abreviações são lis-tadas abaixo:

Asn AsparaginaAsp Ácido aspárticoAsu Amino-succinimidaisoAsp Acido isoaspárticoMet(O) Sulfóxido de metioninaT26 Peptídeo tríptico (281-302)T26deam1 Peptídeo tríptico isoAsp294 (281-302)T26deam2 Peptídeo tríptico Asp299 (281-302)T26deam3 Peptídeo tríptico Asp294 (281-302)T26deam4 Peptídeo tríptico Asu294 (281-302)T6 Peptídeo tríptico (84-93)T6ox Peptídeo tríptico Met(0)85(84-93)

PRODUTOS QUÍMICOS e REAGENTES

Fase móvel A - TFA a 0,1% em água com grau para HPLC

Transferir os conteúdos todos de uma ampola de 1 mL de TFApara 1000 mL de água com grau para HPLC e misturar totalmente para pre-parar TFA a 0,1% (Fase móvel A). O TFA a 0,1% pode ser armazenado emtemperatura ambiente durante até dois meses.

Fase móvel B - TFA a 0,1% em 80% de ACN e 20% de água com graupara HPLC

Transferir os conteúdos todos de uma ampola de 1 mL de TFApara 800 mL de acetonitrila e 200 mL de água com grau para HPLC e mistu-rar totalmente para preparar TFA a 0,1% em 80% de ACN (Fase móvel ?) oqual pode ser armazenado em temperatura ambiente durante até dois me-ses.

Tampão de diluição - TRIS a 100 mM, NaCI a 25 mM, pH de 7,6

Dissolver 14,0 g de Trizma Pre-Set Crystal, pH de 7,6, e 1,46 gde NaCI em 1000 mL de água com grau para HPLC através de agitação dasolução sobre uma placa de agitação magnética. Filtrar a solução através deuma unidade de filtro de 0,2 µ?t?. Armazenar a solução a 2 a 8 °Cdurante atédois meses.

Tampão de desnaturação - guanidina a 8 M, TRIS a 50 mM, pH de 8,0

Dissolver 152,8 g de cloridrato de guanidina e 1,4 g de TrizmaPre-Set Crystal, pH de 8, em 90 mL de água com grau para HPLC atravésde agitação da solução sobre uma placa de agitação magnética. Ajustar opH para 8,0 com HCI ou NaOH e levar para o volume final de 200 mL comágua com grau para HPLC. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 µ??.Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até seis meses.

Tampão de Digestão - TRIS a 50 mM, CaCI2 a 10 mM, pH de 7,6

Dissolver 7,0 g de Trizma Pre-Set Crystal, pH de 7,6, e 1,47 g deCaCb em 1000 mL de água com grau para HPLC através de agitação dasolução sobre uma placa de agitação magnética. Filtrar a solução através deum filtro de 0,2 µ??. Armazenar a solução a 2 a 8 °Cdurante até dois meses.

Agente de Redução - ditiotreitol a 200 mM (DTT)

A 30,8 ± 0,2 mg de DTT, adicionar 1000 µ? de água imediata-mente antes de uso e submeter a turbilhonamento até dissolvida. A soluçãoexpira 24 horas a partir do momento de preparo.Reagente de Alquilação - iodoacetamida a 400 mM (IAM)

A 74,0 ± 0,5 mg iodoacetamida, adicionar 1000 µ? de água ime-diatamente antes de uso e submeter a turbilhonamento até dissolvida. A so-lução expira 24 horas a partir do momento de preparo.HCI a 1,0 M

Diluir 8,7 mL de ácido clorídrico concentrado para 100 mL comágua com grau para HPLC. Armazenar a solução em temperatura ambientedurante até dois meses.

PADRÕES E CONTROLESPadrão peptídico T6ox, 30 μΜ

O padrão sintético de peptídeo tríptico T6ox é AIa-Met(O)-Asp-Thr-Gly-Leu-Tyr-Ile-Cys-Lys · 2TFA, FW 1358,4, -95% de pureza em peso.Armazenar o sólido hermeticamente vedado a -20°C e sempre aquecer até a temperatura ambiente em um secador para impedir a absorção de umidade.Pesar 1,0 ± 0,1 mg de T6ox, registrar o peso exato e dissolver em 1,50 mLde Tampão de Digestão. Adicionar 40 uL de DTT a 200 mM e colocar a 37°Cdurante 20 min. Esfriar para a temperatura ambiente, adicionar 48 μί de io-doacetamida a 400 mM e alquilar em temperatura ambiente no escuro, du-rante 30 min. Diluir para um volume final de 24,5 mL com Tampão de Diges-tão a fim de proporcionar uma solução-padrão a 30 ± 3 μΜ. Armazenar alí-quotas de 1 mL do padrão T6ox a 30 μΜ a -70°C durante até 24 meses.Padrão peptídico T26deam1, 30 μΜ

O padrão sintético de peptídeo tríptico T26deam1 é Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-lle-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-isoAsp-Gly-GIn-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys · 2TFA, FW 2773,7, -85% de pureza em peso. Armazenar o sólidohermeticamente vedado a -20°C e sempre aquecer para a temperatura am-biente em um secador para impedir a absorção de umidade. Pesar 1,0 ± 0,1mg de T26deam1, registrar o peso exato e dissolver em 1 mL de acetonitrilaa 30% v:v em Tampão de Digestão. Diluir para um volume final de 10,7 mL afim de proporcionar uma solução-padrão a 30 + 3 μΜ. Armazenar alíquotasde 1 mL do padrão T26deam1 a 30 μΜ a -70°C durante até 24 meses.

PREPARO DE PADRÕES E AMOSTRAS

Redução e Alquilação

A faixa de concentração de proteína para mapeamento peptídico

é de aproximadamente 20 mg/mL. Se a concentração de proteína é >20mg/mL, diluir a amostra com tampão de diluição para uma concentração finalde aproximadamente 20 mg/mL. Preparar pelo menos 100 μΙ_ de soluçãodiluída. Em um tubo para centrífuga de 1,7 ml_, adicionar 100 μΐ_ de soluçãode CTLA4-lg a 20 mg/mL (2 mg) (amostra ou material de referência) a 550μl de Tampão de desnaturação. Adicionar 35 μΐ_ de Reagente de Redução a200 mM, submeter o tubo a turbilhonamento durante 3-5 segundos, então,centrifugar durante aproximadamente 3 segundos. Incubar os tubos a 37°Cdurante 20 ± 2 minutos. Adicionar 38,5 μΙ_ de Reagente de Alquilação a 400mM a cada tubo, submeter a turbilhonamento durante 3-5 segundos, então,centrifugar durante aproximadamente 3 segundos. Incubar as amostras emtemperatura ambiente no escuro durante 20 ± 2 minutos. Colocar as colunasNAP-5 em a stand. Usar uma coluna por amostra. Enquanto as amostrasestão em incubação em IAM, equilibrar as colunas NAP-5 com 7,5 mL deTampão de Digestão. Descartar o efluente por procedimentos locais. Adicio-nar 500 μl das misturas reduzidas e alquiladas over as colunas NAP-5,permitindo que o líquido drene através da coluna. Descartar o efluente porprocedimentos locais. Adicionar 1,0 mL de Tampão de Digestão às colunasNAP-5 e coletar o efluente em tubos para centrífuga de 1,7 mL e misturarligeiramente o efluente coletado.

Digestão. Reconstituir um frasco de tripsina (20 μg) para cadamL de amostra ou material de referência a ser digerido, mais um frasco detripsina adicional, com 86 μί cada de tampão de tripsina (fornecido com aenzima) para proporcionar 0,25 μg/μL. Empoçar os conteúdos dos frascosde tripsina juntos em um frasco. Digerir cada amostra com 80 μί da soluçãode tripsina empoçada acima por mL de amostra a 37 0C durante 120 + 12minutos. Quando de término da digestão, acidificar as amostras com 40 μίde HCI a 1,0 M por mL de amostra e submeter a turbilhonamento durante 3-5 segundos. Pipetear 100 μί. de cada uma das digestões de amostras e domaterial de referência em frascos para amostrador automático. Preparar umcontrole de adequabilidade de sistema adicional contendo 95 μί de materialde referência digerido misturado com 5 μί. de padrão peptídico T6ox a 30μΜ e 5 μί de padrão peptídico T26deam1 a 30 μΜ a fim de proporcionaruma digestão reforçada com T6ox a 5% e T26deam1 a 5%. Colocar todos osfrascos no amostrador automático a 5 ± 5°C para análise por HPLC. Arma-zenar todas as amostras digeridas restantes a -70°C.CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

A tabela abaixo mostra a taxa de fluxo e o gradiente de cromatogra-fia.

<table>table see original document page 731</column></row><table>

Equilibrar a coluna a 55 °C com 100% de fase móvel A durantepelo menos 25 minutos antes da primeira injeção. Monitorar a absorbânciade UV a 215 nm e 280 nm. A tubulação da coluna para o detector deverá terum diâmetro interno < 0,01" de forma a minimizar a difusão de ampliação debanda. Manter a temperatura da coluna a 55 ± 2°C. Manter a temperatura doamostrador automático a 5 ± 5°C. A fase móvel A é usada como a injeção deplacebo. Faixas de amostra (não mais do que dez a cada vez) são injeçõesde material de referência. A tabela abaixo mostra a seqüência de injeçãopara a análise cromatográfica. Note que todos os volumes de injeção são de25 μl, exceto quanto à amostra de controle consistindo em material de refe-rência reforçado com padrões peptídicos T6ox a 5% e T26deam1 a 5% paraa qual 28 μl são injetados:

<table>table see original document page 731</column></row><table>VALORES EXEMPLIFICATIVOS

Valores exemplificativos. O perfil por mapeamento peptídicopara o material de referência deve ser visualmente comparável ao cromato-grama apresentado na figura 1 com relação ao número, tamanho relativo eordem de eluição de picos significativos para os traços a 215 nm e 280 nm.As diferenças de tempo de retenção para os picos T4, T25 e T27 no materialde referência inicial e nas faixas não deverão exceder a ± 0,5 minuto. O nú-mero de placas teóricas (N) deve ser > 100.000. Se N < 100.000, re-equi-librar a coluna. Se o problema persiste, substituir a coluna. A resolução (R)deve ser > 1,5 para os picos T2 e T12. Se R < 1,5, re-equilibrar a coluna. Seo problema persiste, substituir a coluna. O cromatograma a 280 nm do pa-drão de referência reforçado com T6ox e T6deam1 a 5% deve mostrar umaumento para o pico de T6ox eluindo a ~33,0 min, conforme mostrado nafigura 85. O cromatograma a 215 nm do padrão de referência reforçado comT6ox e T6deam1 a 5% deve mostrar um aumento para o pico de T26deam1eluindo a -66,5 min, conforme mostrado na figura 87.

Valores exemplificativos de amostra. Os cromatogramas deinjeção do primeiro material de referência e da amostra deverão ser visual-mente equivalentes com relação ao número, tamanho relativo e ordem de elu-ição de picos significativos para os traços a 215 nm e 280 nm conforme indi-cado para os picos rotulados na figura 85, com exceção dos picos oxidadose/ou desamidados para T6ox e T26deam, os quais são reportados separa-damente. Os tempos de retenção para os picos T4, T25 e T27 na amostradevem estar dentro de ± 0,5 minuto do tempo de retenção para os picos cor-respondentes de injeção do primeiro material de referência.

CÁLCULOS. NOTA: Usar os dados a 215 nm para esses cálcu-los, a menos que de outro modo especificado. Os tempos de retenção depicos T4, T25 e T27 (figura 85) nas operações com faixas de material de re-ferência não diferem em mais de 0,5 min (figura 85).

Número de Placas teóricas. A eficiência de coluna, avaliadacomo o número de placas teóricas (N), é calculada usando o tempo de re-tenção e a largura de pico T27 a partir da operação de material com referên-cia, (Figura 85), de acordo com a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 733</formula>

onde:

w = a largura de pico na linha de base medida através de extra-polação dos lados relativamente retos para a linha de base.

t = o tempo de retenção do pico T27 medido a partir do momentode injeção até o momento de eluição do pico máximo.

Resolução. A resolução (R) entre o pico T12 e pico T2 (Figura85) é calculada usando a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 733</formula>

onde:

t1, t2 = tempos de retenção do pico T12 e pico T2, respectivamente

wi, W2 = largura de pico tangente-definida na linha de base dospicos com tempos de retenção ti e t2, respectivamente.

Para todas as amostras e padrões, calcular a oxidação percen-tual de Met85 a partir dos dados de área de pico a 280 nm como segue :

<formula>formula see original document page 733</formula>

onde:

AT6 = área de pico para T6, (84-93) no traço a 280 nm

AT6ox = área de pico para T6ox, Met(0)85(84-93), no traço a 280 nm

Para todas as amostras e padrões, calcular a deamidação per-centual de Asn294 para dados da área de pico a 215 nm, conforme mostra-do na figura 87:

<formula>formula see original document page 733</formula>

onde:Ατ26 = área de pico para T26, (281-302), no traço a 215 nmAT26deami = área de pico para T26deam1, isoAsp294(281-302), notraço a 215 nm

AT26deam2 = área de pico para T26deam2, Asp299(281-302), notraço a 215 nm

AT26deam3 = área de pico para T26deam3, Asp294(281-302), notraço a 215 nm

AT26deam4 = área de pico para T26deam4, Asu294(281-302), notraço a 215 nm

Fragmentos teoricamente esperados de digestões trípticas de CTLA4-lg (re-fira-se à figura 85)

Fragmento Resíduo Seqüência

T1 1-14 MHVAQPAWLASSR

T2 15-28 GIASFVCEY ASPGK

15 T3 29-33 ATEVR

T4 34-38 VTVLR

T5* 39-83 QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD-

SICTGTS SGNQVNLTIQGLRT6 84-93 AM DTG LYIC K

T7* 94-128 VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVID-

PEPCPDSDQEPKT8** 129-132 SSDK

T9** 133-158 THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK

T10 159-165 DTLMISR

T11 166-184 TPEVTCVWDVSH EDPEVK

T12 185-198 FNWYVDGVEVHNAK

T13 199-202 TKPR

T14* 203-211 EEQ YNSTYR

T15 212-227 WSVLTVLHQDWLNGK

T16 228-230 EYK

T17 231-232 CK

T18 233-236 VSNKT19 237-244 ALPAPIEKT20 245-248 TISKT21 249-250 AKT22 251-254 GQPRT23 255-265 EPQVYTLPPSRT24 266-270 DELTKT25 271-280 NQVSLTCLVKT26 281-302 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT27 303-319 TTPPVLDSDGSFFLYSKT28 320-324 LTVDKT29 325-326 SRT30 327-349 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKT31 350-356 SLSLSPG

* Contém carboidrato N-ligado.** Contém carboidrato O-ligado.

Exemplo 66 - Estudo com uma única dose em seres humanos saudá-veis

Um estudo com uma única dose, randomizado, em um únicolocal foi usado para avaliar a farmacocinética de CTLA4-lg (produzida atra-vés do processo com CD-CH01) em indivíduos saudáveis. Treze (13) indiví-duos que preenchiam os Valores Exemplificativos de Inclusão e Exclusãoforam admitidos na unidade de estudo clínico e receberam CTLA4-lg produ-zida pela CD-CH01 de processo como uma única infusão intravenosa de 10mg/kg durante 30 minutos. Cada indivíduo foi observado na unidade de es-tudo clínico durante 24 horas após a infusão. Amostras de sangue foramcoletadas em pontos de tempo especificados após dosagem durante até 71dias para quantificação de CTLA4-lg. Os indivíduos foram avaliados quantoà farmacocinética: Cmax1 Tmax, AUC (INF), T-HALF1 CLT e Vss para cadaindivíduo foram derivados da concentração no soro versus os dados de tem-po. CTLA4-lg foi fornecida como uma formulação a 200 mg/frasco. A indiví-duos saudáveis foi administrada uma infusão IV de 30 minutos de 10 mg/kgde CTLA4-lg. Determinações de PK, segurança e determinação imunogêni-ca foram avaliados em pontos de tempo específicos no Dia 71 após dosa-gem.

MÉTODOS ESTATÍSTICOS:

Tamanho de amostra: O tamanho de amostra de 13 indivíduosproporcionou 90% de confiança de que a estimativa da proporção de médiageométrica estaria dentro de 15% do valor verdadeiro para Cmax e dentrode 10% do valor verdadeiro para AUC(INF) para CTLA4-lg.

Análise estatística: Dados demográficos do indivíduo, examesfísicos, dados de laboratório e sinais vitais foram resumos. A incidência de eventos adversos foi colocada em uma tabela pelo sistema corporal e gravi-dade. Para Cmax e AUC(INF) de CTLA4-lg, intervalos de 90% de confiançapara as proporções das médias geométricas de população para a CD-CH01de processo foram calculados a partir dos resultados de uma análise de va-riância sobre Iog(Cmax) e Iog(AUC).

RESULTADOS FARMACOCINÉTICOS: Os resultados farmaco-cinéticos foram determinados usando um programa de análise não compar-timental validado. Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos de 13 indi-víduos dosados com CTLA4-lg de CD-CH01 de processo. A tabela a seguirlista os parâmetros farmacocinéticos para CTLA4-lg em indivíduos saudá-veis. A Tabela abaixo mostra uma estatística somatória para os parâmetrosfarmacocinéticos de CTLA4-lg.

<table>table see original document page 736</column></row><table>

CTLA4-lg tinha valores médios de T-HALF de aproximadamente17 dias em indivíduos saudáveis, consistente com meias-vidas obtidas emindivíduos com psoríase (10 - 18 dias) e pacientes com artrite reumatoide(aproximadamente 13 dias). Os valores médios de Vss observados de 0,09 a0,10 L/kg indicaram que a CTLA4-lg estava confinada primariamente ao sis-tema vascular e não distribuída significativamente nos espaços extravascula-res.

A tabela a seguir mostra as concentrações no soro (ng/ml) porindivíduo.

Indivíduo tratamento dias tempü"(hõrã) concentração

<table>table see original document page 737</column></row><table>Ensaio no soro para CTLA4-lg

Amostras de soro foram analisadas com relação à CTLA4-lg a-través de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) em um total de25 operações analíticas. Todos os dados analíticos foram ao encontro dosvalores exemplificativos estabelecidos antes de análise de amostra, indican-do que o método ELISA era preciso e apurado para a quantificação de C-TLA4-lg em amostras de estudo. Um resumo dos parâmetros de curva-padrão e dados médios de QC para CTLA4-lg no soro são apresentados naTabela 48. A variabilidade entre e dentre as operações das QCs analíticas para CTLA4-lg foi de 4,5% e 3,5% CV1 respectivamente. As concentraçõesmédias observadas das amostras de QC analíticas desviaram em menos de± 8,9% dos valores nominais (Tabela 48).

Tabela 48: Sumário de dados de controle de qualidade para oensaio de CTLA4-lg em soro humano

<table>table see original document page 738</column></row><table>

A média e desvios-padrão para as concentrações de CTLA4-lgno soro para todos os indivíduos através do processo são apresentados naTabela diretamente abaixo. As concentrações médias de CTLA4-lg no soroversus os perfis do tempo durante 71 dias são apresentadas na figura 44.Concentração média no soro vs. dados de tempo para CTLA4-lg (ng/ml)

<table>table see original document page 739</column></row><table>

Estatística resumida para os parâmetros farmacocinéticos(Cmax, AUC (INF)1 CLT1 Vss1 Tmax e T-HALF) é apresentada na Tabela 50.Os resultados indicaram que CTLA4-lg produzida através de um processoda invenção tinha um valor de T-HALF médio de aproximadamente 17 dias(faixa de 7-25 dias). Os valores de Vss observados de 0,09 a 0,10 L/kg indi-caram que CTLA4-lg estava confinada primariamente ao volume de fluidoextracelular.

Tabela 50: Estatística resumida para parâmetros farmacocinéticos deCTLA4-lg produzida através do processo da invenção

<table>table see original document page 739</column></row><table>

Os resultados indicaram que a T-HALF média para CTLA4-lgproduzida através do processo da invenção era de aproximadamente 17 di-as. Os valores de clearance e volume de distribuição também são apresen-tados na Tabela 50.

A farmacocinética de CTLA4-lg em indivíduos adultos saudáveisapós uma única infusão intravenosa de 10 mg/kg e em pacientes com RAapós múltiplas infusões intravenosas de 10 mg/kg é apresentada na Tabela47.

Tabela 47

<table>table see original document page 740</column></row><table>Exemplo 67 - Seqüência de DNA do plasmídeo pcSDhuCTLA4lg

1 GATCTCCOGA TCOCCTATQG TCGACTCTCA GTACftATCTG CTCTGATGCC GCATfiGTTAftCTAGAGGGCT AOGGGArACC AGCTCAGAGT CATGTTAGAC GftGACTACGG CGTATCAATT

Sl GCCAGTATCT GCTCCCTGCT TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTTCGGTCATAGA CGAGGGACGA ACACACAACC TCCAGCGACT CATCACGOGC TCGTTTTAAA

121 AAGCTACAAC AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGCTTCGATGTTG TTCCGTTCCG AACTGGCTGT TAACGTACTT CTTAGACGAA TCCCftATCCG

promotor de CMV

181 GTTrTGCGCT GCTTCGOGAT GTACGGGCCA GATATAOGOG TTGACATTGA TTATTGACTACAAAACGOGA CGftAGCGCTA CATGCCCGGT CTATATGCGC AACTGTAACT AATAACTGAT

241 GTTATTAATA GTAATCAATT ACG3GGTCAT TAGTTCATAG CCCATATATG GAGTTCCGCGCAATAATTAT CATTAGTTAA TGCCCCAGTA ATCAAGTATC GGGmTATAC CTCAftGGCGC

3 01 TTACftTAACT TACGGTAftAT GGCCCGCCTG GCTGACOGCC CAACGACCCC CGCCCATTCAAATCTATTGA ATGCCATTTA CCGSGCGGAC CGftCTGGCGG GTTGCTGGGG GOGGGTAACT

361 CGTCAATAAT GACGTATGTT CCCATAGTAA CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGrPZAATGCAGTTATm CTGCATACAA GGGmTCATT GOGGTTATCC CTOAAAGGTA ACTGCAGTTA

421 GGG1X3GACTA TTTACGGTAft ACTGCCCACT TQGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAftCCCACCTGAT AAATGCCATT TGACGGGTGA ACCGTCATGT AGTTCACATA GTATACGGTT

431 GTACGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA AATGGCCCGC CTOGCATTAT GCCCAGTACACATGCGGGGG ATAftClSCftG TTACTGCCAT TTACCG3GCG GACCGTAATA CGGGTCATGT

TGAOCTTATH GGACTTTCCT ACTTGG-CAGT ACATCTACST ATTAGTCATC GCTATTACCAACTGGftATAC CCTGAAAGGA TGAACGGTCA TGTAGATGCA TAATCAGTAG CGATAATGGTNcoI

""" promotor de CMV

601 TGGTGATGCG GTTTTGGGAG TACATCAATG GGCGTGGATA GCQGTTTGAC TCAOGGQGATACCACTACGC GAAAftCOSTC ATGTAGTTAC CCGCACCTAT OSCCAAACTG AGTTGCCCCTA

661 TTCCAAGTCT CCACCCCATT GACGTCAATG GGAGT TTGlT TTGGCACCAA AATCAAQ3QGAAGGTTCAGA iGGTGGGGTAA CTGCAGITAC CCTCAAACAA AACCGTGCTT TTAGTTGCCC

721 ACTTTCCAAA ATGTCGTAAC AACTCCGCCC CATTGAOGCA AftTGGGCGGT AGGCGTCTACTGAAfiGGTTT TACfoGCATTG TTGfilGGOGGG GTAACTGCGT TTACCOGCCA TCCGCACATC

781 GGTGGGAGGT CTATATAAGC ÂGAGCTCTCT GGCTflACTBfi AGAACCCACT GCTTACTGGCCCACCCTCCA GATATATTCG TCTCGftGfiGA CCGATTGATC TCTTQSGTGft OGAATCACCG

HindIII BairiHI

841 ITATCGAAAT TAATACGACT CftCTATflJGGG AGACOCAAGC TTQ3TACCGA GCTCGGATCCAATftGCTTTA ATTATGCTGA GTGATATCCC TCTGGGTTCG AACCATGGCT CGAGCCTAQG

PstI

EcoRI ?-huCTLA4 Ig-

901 ACTftGTflACG GCCGCCAGTG TGCTGGflATT CTGCAGATAfi CTTCACCAAT GQGTGTACTGTGATCATTGC CGGOGGTCAC ACGRCCTTflA GACGTCTATC GflAGTGGTTA CCCACATGAC

LTQR TLL SLV LA LL FPS MAS961 CTCACACAGA GGACGCTGCT CAGTCTGGTC CTTGCACTCC TGTTTCCAftG CATOGCGAGCGAGTCTGTCT CQTGCGAOGA GTCflGACCftG GaACGTGflGG ACAAAGGTTC GTACOGCTOG

MflMH VAQ PAV VLAS SRG IAS1021 ATGGCAATCC AOGlGGCCCft GCCTGiCTCTG GTACTGGCCA GCAGCOGAfiG CATCGCCAGCTACCETTACG TCCACCGGGT CGGACGACAC CATGACCGGT CGTÜ3GCTCC GTAGOGGTOG

FVCE YflS PG K ATBV RVT VLR1081 TTTGTGTGTG AGTATGCATC TCCAGGCAflA GCCACTGAGG TCOGGGTGAC AGrPSCTTCQG

AftACACACAC TCATACGTAfi AGGTCCGTTT CGGTGACTCC AfiGCCCACTG TCACGAAfiCC----------------------------huCTLA-412---------------------------

QA DS Q VT EVC AA TY MMG HBLH 41 CAGGCTGACA GCCAGGTaAC TGAAGTCTGT GOGGCftACCT A.CATGAiBSGG GAATGAGITGGTCGGACTGT CGGT2CACTG ACTTCAGACA CGCCGTTGGA TGTAGTACOC CTTACTCAA.C

TFLD DSI CTG TSSG NQV NLT1201 ACCTTCCTfiG ATGATTCCAT CTGQiOGGGC ACCTOCAGTG GAAATCAAGT GAftCCTCACTTGGftAGGATC TACTAAGGTA GAOGTGCCCG TQGAGGTCAC CITTAGTTCA CTTQGAGTGA

IQGL RAM DTG LY IC KVE LMY1261 ATCCAAGGAC TGAGGGCCAT GGACA1CGGGA CTCTACATCT GCAAQGTQGA GCTCATGTA.CTAGGTTCCTG ACTCCCOSTA CCTGTGCCCT GAGATGTAGA CGTTCCACCT CGAGTAGATG

PPPY Y LG IGN GTQI YVI DP B1321 CCACCGCCAT ACTACCTGffi CATAGGCAAC GGRACCCAGA TTTATGTAAT TGftTCCAGAAQGTGGCGGTA TGATGGACCC GfTATCOGTTG CCTTGGSTCT AAATACATTA ACTAGGTCTT

PCPD SDQ EPK SSDK THT SPP1381 CCGTGCCCAG ATTCTGATCA G3AGCCCAAA TCTTCTGACA AAACTCACAC ATCCCCACCGGGCACGGGTC TAAGACTAGT CCTCSGGTTT AGAAGACTGT ITTGAGTGra TAGQSGTGGC

S PAP ELL GGS SVFL FPP KPK1441 TCCQCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGATCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACXZCftAGAGGGGTCGTG GACTTGAGGA CCCCCCTAGC AGTCftGAAGG AGAftQGGGGG TTTTGGGTTC

DTLM ISR TPE VTCV VVD VSH1501 GACACCCTCA TGATCTCCQG GAC02CTGAG GTCACATGOG TGGTSGTGGA CGTSftGCCACCTGTGG3AGT ACTAGAGGGC CTQGGGACTC CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCQGTG

EDPE VKF NWY VDGV EVH NAK1561 GfiAGACCCTG AQ3TCAAGTT CfiACTGGTAC GTGGACGGCG TGGftQGTGCA TAATGCCftAGCTTCT33GAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG CftCCIGCQGC ACCTCCACGT ATTAOSCTTC...............- —.........huCTLA4 Ig......-.....................

TKP R EEQ YNS TY RV VSV LTVIS 21 ACAAAGOGGC GGGAGGAGCA GTACAftCAGC ACGTACCGTG TGGTCftGOGT CCTCACCGTCTGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTOG TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGISGCAG

LHQD WLN GK E YKCK VSN KALIS 81 CTGCACCAGG AGTQGCTGAft TGGCAAGGAG TACAAiGTGCft AGGTCTCCAA CAAAGCCCTCGAOGTQGTOC TGACC5GACTT ACCGTTCCTC AT3TTCACGT TCCAGftGGTT GTTTQSGGfeG

PAPI BKT IS K AKGQ PRE PQV1741 CCAGCCCCCA TCGAGftAAAC CftTCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTGQGTCG G3GGT AGCTCTTTrIS GTAGAGGTTT CG3TTTCCOG TCGGGGCTCT TQGTGTCCAG

SmaI

YTLP PSR DEL TKNQ VSL TCL18Q1 TACACCCTGC CCOCftTCCCG GGATGAGCTG ACCAftGAftCC AGGTCAGCCT GACCTGCCTGATGTGQGÂOG GQGGTAGGGC CCTACTCGAC TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC

VKGF YPS DIA VEWE SNG QP E1861 CTCftAAGGCT TCTATCCCAG OGACATCGCC GTGGftGTGGG .AGAGCAftTGG GCftGCCQGAGCftGTTTCOGft AGATAGGGTC GCTGTAGCGG CACCTCftCCC TCTCGTTACC CGTOGGCCTC

NN YK TTP PVL DSDG SPF LY S1921 AJl1CAACTACA AGftCCAOGCC TCCCGTGCTE GACTCCGAOG GCTCCTTCTT CCTCTA-CftGCTTGTTGATGT TCTG3TGCGG AGQG1CACGftC CTGAGGCTGC 05AGGAAGAA GGAGftTGTCG

KLTV DKS RWQ QGNV FSC SVM1981 AAGCTCACOG TGGACftAGMl CAGGiDGGCAG CASGGGftACS TCTTCTCATS CTCCCTGAT3TTCGACT3GC ftCCTGTTCTC GTCCACCGTC GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACEftC

HEAL HNH Y TQ KSLS LSP GK*2 041 CftTGAQGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT COCTGTCTOC GQGTAAATCAGTACTCCGAG ACGTGTTGGT GAT3TGCGTC TTCTCGGftGA GGGftCftGAGG CCCATTTftCT2101 GTGOGACGGC CGGCAAGCCC CCGCTCCCOG GGCTCTCGCG OTGGeRCGAG GATGCTTCTACAQGCTGCGG GCCGTTCGGG GGCGftQGCGC CCGAGAGCGC CAGCGTGCTC CTAOGAAGAT

Sinal de poliadenilação de BGH------

2161 GAGGGCCCTA TTCTATAGTG TCAOCTAAAT GCTftGAGCTC GCTGftTCAGC CTCGACTGTGCTCQCQGGAT AAfiATATCAC AGTGGATTTA CGATCTCGAG CGACTAGTCG GAGCTGACAC

2221 CCTTCTAGTT GCCftiGCCATC TGTTGTITGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCITr GACCCTQGAftGGAAGATCAA CGGTOGGTAG ACAACAAACG GGGAGGGGGC ACGGAAGGAA CTGGGACCTT

2281 GGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTftATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA TTGTCTGAGTCCACGCTGftG GGTGACAGGA AAQGATTATT TTACTCCTTT AACGTAGOGT AACAGACTCA

2341 AGGTGTCATT CTATTCTGGG GGGTGGGGTGTCCACAGTAA GATAAGACCC CCCACCCCAC

2401 GACAATAGCA GGCftTGCTOG GGATGCGGTGCTGTTATCGT CCGTACGACC CCTACGCCAC

2461 A-GCTGQQGCT CTAQGtXJGTA TCCCCACGCGTCGACCCCGA GATCCCCCAT AGGGGTGCGC

2521 CTGGTGGTTA CGGGCAGCGT GACCGCTACACftCCACCftAT GCGCGTCGCft CTGGCGATGT

2,581 GCTTTCTTCC CTTCCTrTCT CGCCAQGTTCCGAAAGAAGG GAAQGAAAGA GCQGTGCAAG

2641 GGAAACTCOC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGACCTTTCAGGG GTCOGAGGGG TCGTCCGTCT

2701 GCAftCCAGGT GTGGftAAGTC CCCAGGCTCCCGTTGGTCCA CACCTTTCAG GGGTCCGAGG

GGGCAGGACA GCAftQSGQGA GGftTTGQGAACCCGTCCTGT CGTTCCCCCT CCTAACCCTT

GGCTCTATGG CTTCTGAiGG1C GGAAftGAACCCCGASATACC GAAGACTCCG CiCTTTCTTGG

CCCTGTAGCG GCGCATTAAG CGCGGOSGGTGQGACATCGC CGCGTAATTC GCGCOGCCCA

CTTGOCAGCG CCCTftSCGCC CGCTCCTTTCGftftCGGTCGC QGGftlOGCQG GQGAGGAAAS

GCCCTGTGGA ATGTGTGTCA GrTTAGGGTGTCGGGACACCT TACACACAST CAATOCCACA

AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCATCATACGTTT CGTAQGTAGA GTTAftTCAGT

CCAGCAQGCA GAAGTATGCA AAGCftTGCATGGTCGTCCGT CTTCATACGT TTCGTAOGTA2761 CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCOSCCC CTflACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCGGAGTTAftTCA GTCG TTG3TA TCAGGGCGGG GATTGAGGCG GGTAGGGGGG GGATTGAGGC

Ncol ?----------Promotor SV40-----------

2321 CGCAGTTCCS CCCATTCTCC GCCCCATOGC TGACTAArTT ΠΤΤΤΑΤΤΤΑ TGCAGAGGCC

GGGTCAftQGC GGGTAftGftGG CGGGGTACCG ACTGATTAAA AftAfiATAAAT ACGTCTCCGG-------------------------------------------------------------->

2S81 GftQGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAG AftGTAGTGftG GAGGCTTTTT TQGftGGCCTACTCCGGCQGA GCCGGAGACT CGATAAGGTC TTCATCACTC CTCCGftftAftA ACCTCTGSAT

HindIII

2 941 QGCTTTTGCA AAftAGCTTGG ACAGCIOAGG GCTGOGATTT CGCGCCAAAC TTGACGGCAA

CCGftftAftCGT TT TTCGAACC TGTCGACTCC CGACGCTAAA GCGCGGTTTG AACTGCCGTT

.......dhfr--------

3 001 TCCTAGCGTG AAGGCTG3TA GGATTTTATC CCCGCTGCCA TCATGSTTCG ACCATTGftAC

AGGATCGCAC TTCCGACCAT CCTAAAftTAG GGGCGAQ3GT AGTACCftAGC TGGTAACTTG

3 061 TGCATCGTCG CCGTGTCCCft AGAXATGGGG ATTGGCAftGft ACGSAGACCT ACCCTGGCCTACGTAGCAGC GGCACAQGGT TCTATACCCC TAACOGTTCT TGCCTCTGGA TGGGftCOSGft

3121 CCGCTCftGSA ACGAGTTCAA GTACTTCCAA AGAATGACCA CAACCTCTTC ACTGGAAGGTQGQGAGTCCT TGCTCAAGTT CftTGAAGGTT TdTTACTGGT GTTGGAGAAG TCACCTTCCA

3181 AAA.CAGAATC TGGTGftTTAT GGGTAGGAftA ACCTGSTTCT CCATTCCTCA GAftGAATCGATTTGTCTTAG ACCACTAATA CCCATCCTTT TGGAOCAAGft GSTAAGGACT CTTCTTAGCT

3241 CCTITAAAGG ACAGAftTTftA TATAGTTCTC AGTAGAGAftC TEftAAGAftCC ACCACGAQGftGGAftATTTOC TGTCTTAATT ATATCAAGAG TCATCTCITG AGTTTCTTGG TGGTGCTCCT-------------------------------dhfi---------------------------------

3301 GCTCftTTTTC TTGCCAAAfiG TTTQGATGAT GCCiTAAGAC TTATTGAACA ACOGGAATrIGOGAGTAftAAG AAQ3GTTTTC AAACCTACTA CGGAATTCTG AATAACITGT TGSCCTTAAC

33Sl GCAAGTAAAG TAGACATGGT TTGGATAGTC GGAGGCAGTT CTGTTTACCA GGAAGCCATCCGXTCATTTC ATCTGTACOA AACCTATCAG CCTCOGTCAA GACAAATGGT CCTTQGCTAe

3421 AATCAACCAG GCCACCTCAG A1CTCIITGTG ACAAGGATCA TiSCAGGAATT TGAAAGTGACTTAGTTGGTC CGSTGGftS-TC PGfeSAAACAC TCTTTCCTAGT ACCTCCTTAA ACTTTCACTG

3481 ACGTTTTTCC CAGAAATTGA T1TGGGGAAA TATAAACITC TCCCAGAATA CCCAGGOSTCTGCAAAAAGG GTCTTTAACT AAACCCCTTT ATATTTGAAG AGGGTCTTAT GQGTOSGCftS

3541 CTCTCTGAGG TCCAGGAGGA AAAAGGCftTC AAGTATAAGT TTGAAGrTCTA CGAGAAGAAAGAGfilGACTCC AGGTCCTCCT TTTECOGTftG TTCATATTCA AACTTCAGAT GCTCTTCTTT

3SQ1 GACTAACAQG AAGATGCTTT CAAGTTCTCT GCTCCCCTCC TAAAGCTATG CATTTTTATACTGATTGTCC TTCTACGAAA GTTCAAGAGA CGAGGGGAGG ATTTCGATAC GTAAAAATAT

NcoI BglII

3661 AGACCATOGG ACTTTTGCTG GCTTTAGATC TTTGTGAAGG AACCTTACTT CTGTGGTGTGTCTGGTACCC TGAAAACGAC CGAAATCTAG AAACACITCC TTGGftATGAA GACACCACAC

3721 ACATAATTGG ACAAACTACC TACAGAGATT TAAAGCTCTA AGGTAAATAT AAAATTCTTATGTATTAACC ΤΏ TT TGATGG ATGTCTCTAA ATTTOGAGAT TCCATTTATA TTTTAAAAAT

3781 AGTGTATAAT GTGTTAAACT ACTGATTCTA ATTGTTTGT1G TATTTTAGAT TCCAACCTftTTCACATATTA CACAATTTGA TGACT.AAGAT TAACAAACAC ATAfiAATCTA AGGTTGGATA

3841 GGAACTGATG AATQSGAGCA GTGGTQGAAT GCCTTTAATG AGGAAAACCT GTTTTGCTZACCTTGACTAC TTACCCTCGT CACCACCTTA CGGAAATTAC TCCTTTTGGA CAAAACGAGT3 901 GMfiAAATCC CftTCTACTGA TGATGAGGCT ACTGCTGACT OTnAACATTC TA.CTOCTCCACTTCTTTACG GTAiGATCACT ACTACTCQSA TEaACQACTGA GAGTTCTAAG ATGAGGAGGT

3 961 AAAAAGAAGA GAAAGGTAGA AfiACCCCAAG GACTTTCCTT CAGAATlXSCT AAfiTTTTTTG

tttttcttct ctttccatct tctggggttc ctgaaaggfta gtcttaaoga ttcaaaaaac

4 G 21 AfiTCATGCTG TGTTTAGXftA TAGAACTC TT GCTTGCTTTG CTATT TACAC CACAAAGGAA

TCAfiTACGAC ACAAATCATT ATCTTGAGAA CGAAQGAAAC GATAAATGTG GTGTTTCCTT

4081 AAAGCTGCAC TGCTATACAA GAAAATTATG GAAAAATATT CTGTAACCTT TATAAGTAGGTTTCEACGTG ACGATATGrTT CTTTTAATAC CTTTTTATAA GACATTGGAA ATATTCATCC

4141 CATAACAGTT ATAATCATAA CATACTGTTT TITCTTACTC CACACAGGCA TAGAGTGTCTGTTATTCTCAA TATTAGTATT CTATGACAAA AAAGAATGAG CTGTGTCCGT ATCTCACAGA

4201 GCTATTAATA ACTATGCTCA AAAATTGTGT ACCTTTAGCT TTrTAATTTG TAAAGGGGTTCGATAATTAT TGATACGAGT TTTTAACACA TQGAAATCGA AAAATTAAAC ATTTCCCCAA

4261 AATAAGGAAT ATTrTGATGTA TAGTGCCTTG ACTAfiAGATC ATAATCASCC ATACCACATTTTATTCCTTA TAAACTACAT ATCACGGAAC TGATCTCTAG TATTAfiTCGG TATGGTGTAA

4321 TGTAGAGGTT TTACTTCCTT TAAAAAACCT CCCACACCTC CCCCTC-AACC TGAAACATAAACATCTCCAA AATGAACGAA ATTTTTrTCSA GG3TGTQGAG GGGGACTTGG ACTTTGTATT

4381 AATGAATGCft ATTGTTCTTG TTAACTTGTT TATTGCAGCT TATAATGGTT ACAAATAAAfiTTftCITACGT TAACAACAAC AATrTGAACAA ATAACGTCGA ATATTACCAA TCTTTATTTC

4441 CAATftGCATC ACAAATTTCA CAAATAASfiC MTTriTTCR CTGCATTCTA GTTGTGGfITTGTTATCGTAG TGTTTAAAGT GTTTATTTCG TAAAAAAAGT GACGTAAGAT CAACACCAAA

4501 GTCCAAACTC ATCAATCTAT CTTATCAT1GT CDGGATCGGC TGGAT3ATCC TCCAfiCGCGGCAGGTTTGAG TAGTTACATA GAATAGTftCA GACCTAGCCG ACCTACTAGG AiGGTCISCGCC

4561 GGATCTCATG CTGGAGTTCT TCGCCCACCC CAACTTCTTT ATTCCAGCTT ATAATGGTTACCTAGAGTAC GAQCTCAAiGA AG1CGGGTGGG GTTSAACAAA TAAOGTCGAA TATTACCAAT4621 CfiAATAAAGC AAEAGCATCA CAAftTTTCftC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCEAGGttTIATTTOG TTATCGTAGT GITrAAAGTG TTTATrTTCGT AAAftAAASTG AGGTAAGATC

4681 TTGTGGTTTG TCCftAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGTATACCGT CGACCTCTAGAACACCAAAC AGGTTTGAGT AGTTACATAG AArAGTACAG ACATATGGCA GCTGGAGATC

4741 CTAGAGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCACGATCTOSAAC CGCATTAGTA CCA5TAT03A CAAAGGACAC ACTTTAACAA TAGGOGAGTXJ

4301 AATTCCACftC AACftTACGftG COGGAAGCAT AftAGTGTAAft GCCTGGGGTG CCTAATGffiTTTAAGGTGTG TDGTATGCTC G3CCTTCGTA TTTCftCATTr QGGRCCCCAC GGATTACTCA

4361 GAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACIGCCCGCT TrTCCAGTCGG GAftACCTGTCCTCGATTGftG TGTAATTAAC GCAftCGCGAG TGACGGGCGA AAGGTCAGCC CTTK3GACAG

4 921 GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAftCG CGCGGGGAGA GGCQGTTTGC GTATTGQGOGCACGGTCGAC GTAATTACTT AGCCGGTTGC GCGCOCCTCT CCGGCAAACG CATAftCCCGC

4 981 CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCQGTC GTTCGGCTGC GGCGftGCGGTGftGAAQGCGA AiGGAGCGftGT GACTGAGCGA CGCGftGCCÃG CAAGCCGACG CCGCTCGCCA

5041 ATCAGCTCAC TCAAftGGOGG TAftTAOSGTT ATCCftCftGAA TCAGGGGATA ACGCAGSftAATAGTCGftGTXS AGTTTCCGCC ATTATGCCftA TAGGTGTCTT AGTOCCCTftT TGCGTCCTTT

?------------------------CoIElori-----------------------------

SlOl GftACATGTGA GCAflAftGGCC AGCAAAAGGC CAGGftACCGT AAAftAGGCCG CGITGCTGGCCTTGTACACT CGTTTTCCGG TCGTTTTCQG GTCCTTQGCft TTTTTCCGSC GCAACGACOG

Slfil GTTTrTTCCAT AiGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACftAA AftTOGACGCT CAftGTCAGSSCftAAAAGGTA TCCGftGGCGG GGGGACTGCT CGTAGTGTTT TTAGCTGCGA GTTCftGTCTC

5221 GTGGCGftAftC CCGACAG3AC TATAAAGATA CCAQ3CGITT CCCQCTGGftA GCTCCCTCGTCACCGCTTTG GGCTGTCCTG ATATTTCTAT GGTCCGCAAA GGGQGACCTT CHAGGGAGCA............................CoIElori --------------------------------

5281 GCGCTCTCCT GTTCCGftCCC TGCCGCTTAC CGGArEACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGGOGCSAGfiGGA CAAGGCTG2G ACGGCGAATG GCCTATGGAC AGGCGGAAAG AGGGAAGCCC

5341 AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG ISGGmTCTC AGTTCGGTGT AGGTCETTCGTTQ2CAOCGC GAAAGAGTTA CGAGTGCGAC ATCCATAaAG TCAAGCCACA TCCAGCAAGC

ApaLI

S40X CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CCTTGftGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGGGAGGTTCGAC ODGACACACG T3CTTQ3GGG GCAAGTCGGG CT-GGCGACGC GGAATAGGCC

S461 TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACITA TCGOCACTGG CftGCAGCCACATTGftTAGCft GAACTCAGGT TGGGiC1CATTC TGTGCTGAAT AffiXJGTGftCC GTCGTCGGTG

SS 21 TGGTAACAGG ATTftGCftGftG OGftGGTATGT AQGCGGTGCT ACAGftGTTCT TGAftGTQGTGACCATTGTCC TftATOGTCTC GCTCCftTACft TCCGCCftCGA TGTCTCfiftGft ACTTCftCCftC

SS 81 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAftGGftCftGT ATTTGGTATC TGGGCTCTGC TGAftGCCAGTOGGATTGftTG COGATGTGAT CITCCTCTCft TAAACCATAG ACGCJGAGftCG ACTTCGGTCA

SS41 TACCTTeGGft AftAftGAGTDS GTAGCTCrTTG ATCCGGCAftA CAAACCACCG CTGGTAGCSGATGGAAGCCT ΤΤΊΤCTCAAC CATCSftGftAC TftfiGOCGTTT GTTTQGTQGC GACCATCGCC

5701 TGGTTΊΤΓTT GTTTGCftAGC AGCfiGftTTAC GOGCAGftAftA AAftGGATCTC AftGftAGATOCACCAAftAftAA CAAACGTTCG TCGTCTAATG CGOGTCTTTT TTTCCTAGAG TTCTTCTAGG

__________________7

57 61 TTTGftTCTTT TCTAOGOGGT 'CTGACGCTCft STSGAftCGftA AACTCACGTT AAGQGATTTTAAACTAGftAft AGATGCCCCA GACTGQGftGT CftCCTTGCTT TTGAGTGCAft TTCCCTAfiAA5821 GSTCATGAGft TTATCfiAAAA GGATCTTCAC CTAGftTCCTT T1EAAfiTTAftA AATGAAGITTCCAGTACTOT AATAGTmT CCTAGAAfi1DG GATCTAGGAA AAT1PTAfiTTT TTACTTCAAA

<-----ampR-----

SB 81 TAAATCAATC TAAAGmTAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAGATTTAGTTAG ATTTCATATA TACTCATTTG AAOCAGiWITG TCAfiTGGTTA CGAATTAGTC

5941 TGAiGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TOSTTCATCC ATAGTTGCCT GACTGCCCGTACTCCGTQ3A TAGAGTCGCT AGACftiGATAA AGCAAGTAGG TATCAA03GA CTGAGGQGCA

S001 0GTGTA3ATA ACTACGATAC GGGAJGGGCTr ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACCGCACATCTAT TGATGCTATG CCCPCCCGAA TQGTAGACCG GGGTCACGAC GTTACTATGG

5061 GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGftTTT ATCAGCAATA AACCAGCCftG CCGGAAGGGCCGCTCTGG3T GOGAGTGGCC GAiQGTerAftA TAGTCGTTAT TTGGTCGtJTC GGCCTTCCCG

6121 CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTiCTATTA ATTGTTGCCGGCT0GQ3TCT TCACCAS3AC GTTGAAATAG GOSGAGCTTAG CTCfiGATAAT TAACAAQGGC

Sl81 GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTCCTACCCTTCGftTCT CATTCATCAA GCGGTCftATT ATCAAACGCG TTGCAftCAftC GGTAftCGATG

6241 AGGCATCGTG GTGTCAOGCT CGTCGTTTGG TATGGCTECA TTCAGCTCCG GTTCCCAACGTCCGTAGCAC CACftGTSOSA GCAGCAAACC ATACCJGAftGT AAGTCGAGGC CAftOGGTTGC

£301 ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCQCATGTT GTGCAAAAAft GCGGTTftGCT CCTTOGGtTCCTAG TTC Q3 CT CAATGTACTA GGGGGTACAA CACGTTTTTr OGCCAATOGA GGAAGOCAGG-------------------------------anipR---------------------------------

6361 TCCGATCGTT GTCfiGASiSTA AGTTGGCCGC ACTGTrTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACTAGGCTAGCAA CAGTCTTCAT TiZAACCGGCG TCftCAATAGT GAGTACCAftT ACCGTCGTGA

5421 GCATAATTCT CGTATTAAGA CTTA CICTCA GAftTGftCAGT TGCCATCCGT ACGGTftGGCA AAGATG CTTT TTC lEftQSAAA TCTGTGACTG AGftCACTGAC GTGftGTACTC GftCTCATGAG6481 AACCAAGTCA TTGGTTCAGrT ITCTGftGAAT ASGA CTCTTA AGTGTATGCG TCACATACGC GQGAOCGAGT CGCTGGCTCA TGCTCTTGCC ACGAGAftCGG CGGQSTCftAT GCCGCftGITA6541 ACGSGATAAT TGCOCTATTA ACGGCGCCAC TGGCG CQGTG ATAGCAGAftC TATOGTCTTG TTTAftAAGTG AAftTTTTCAC CTCATCftTTG GftGTAGTAftC GAAAftCGITC CTTTTGCftAG6601 TTQGGQGCGA AAGOCCCGCT AAACTCTGAA TT TGAGAGT T GGATCTTAOC CCTftGAATGG GCIGTTGftGA CGftCAACTCT TCCftGTTCGA TGTAftCCCAC AGGTCftAGCT A.CATTGGGTG ApaLI «ti ^rrO ηέ 6SS1 TGGTGCACCC AACTGATCTT AGCACGTOSG TTGACTAGAA CftGCATCTTT GTQGTAGAftA TACTTTCftCC ATGAftAGTGG AGCGTTTCTG TCGCMAGAC GGIGftGCftAA CCftCTCGITT6721 AA.CAGGAAGG TTGTCCTTOC CAAAATGCQG GTTTTAQ3GC CftAAAAAQ3G AftTAftGGGCG GTTTTITCCC TTftTTCCCGC ACACGGftAAT TGTGC CTTTA GTTGftftTftCT CAftCTTATGft6781 - - ? CATACTCTTC CTATGAGAAG CTTrTTTCftAT ATTATTGAftG GAftAAASTTA TAATAACTTC CATTiaTCAG GTAftATAGTC GGTralTTGlX! CCAATAACAG TCftTGAGCQG A.CTACTCGCC6S41 ATACATATTT TAIGTATAftA GAATGTATTT AGAftAAftTftA CTTACftTAftA TCTITTrArT ACftAftTASGG TGTT TATCCC GITQOGCGCA CAfiGGCGCST CATT TCCCQG GTAAftQSGGC BglII

£901 AflAfiGTTGCCA CCTOftCGTCG ACGGATCGGG ATTTTCACGGT GÍ3ACTCCAGC TCCCTAGCCC T

Os Exemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18,

21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 acima se referem, em particular, à proteína de C-TLA4-lg tendo SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18 e os Exemplos 19, 20,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57 acimase referem, em particular, à proteína de CTLA4-lg tendo SEQ ID NO: 4, 11,12, 13, 14, 15 ou 16. Conforme descrito na presente especificação, os méto-dos relativos a e usos dessas proteínas nos Exemplos são ilustrativos demétodos relativos a e usos de outras proteínas de CTLA4-lg da invenção.

Composições exemplificativas e não Iimitativas compreendendomoléculas de CTLA4-lg da invenção incluem tais composições em que:

(1) as moléculas de CTLA4-lg compreendem qualquer uma oumais de SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18 e as moléculas de CTLA4-lgtêm uma área de menos do que ou igual a cerca de 5,0 por cento de espé-cies de elevado peso molecular de CTLA4-lg (ou tetrâmeros de CTLA4-lg)conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho edetecção espectrofotométrica (um método de medição para o qual é apre-sentado no Exemplo 10). Mais particularmente, a invenção proporciona taiscomposições ainda tendo uma ou mais das seguintes características:

não excedendo uma quantidade máxima de endotoxina bacteri-ana de 0,35 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg ou 76,8 EU/mL (a qual podeser uma ausência de endotoxina bacteriana); um método para medição des-sa característica é apresentado no Exemplo 48;

não excedendo uma bioburden máxima de 1 CFU/10 ml_ ou 1CFU/mL (a qual pode ser uma ausência de bioburden); um método para me-dição dessa característica é apresentado no Exemplo 49;

fornecimento (como moléculas de CTLA4-lg ou como a referidacomposição) de (a) cerca de 10 a 22 bandas com uma faixa de pl de cercade 4,3 a cerca de 5,6, intensidade de banda cumulativa de 90% -110% emuma faixa de pl de cerca de 4,3 a cerca de 5,3 e cerca de 3 bandas princi-pais em uma faixa de pl de cerca de 4,5 a cerca de 5,2 ou (b) isoformas deCTLA4-lg dominantes tendo um pl que é menos de ou igual a 5,1 e pelo me-nos 90% das moléculas de CTLA4-lg exibem um pl menos de ou igual a cer-ca de 5,3; um método para medição dessa característica é apresentado noExemplo 50;

uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento das molécu- las de CTLA4-lg são espécies oxidadas das mesmas e uma área de menosdo que ou igual a 2,5 por cento das moléculas de CTLA4-lg são espéciesdesamidadas das mesmas; métodos para medição dessas característicassão apresentados no Exemplo 47;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma área de mais de ou igual a95,0 por cento de dímeros de CTLA4-lg conforme determinado através decromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; ummétodo para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 10;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma área de menos do que 5,0por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg (ou tetrâme-ros de CTLA4-lg) conforme determinado através de cromatografia por exclu-são de tamanho e detecção espectrofotométrica; um método para mediçãodessa característica é apresentado no Exemplo 10;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma área de menos do que ouigual a 0,5 por cento de espécies de baixo peso molecular (ou monômerosde CTLA4-lg) conforme determinado através de cromatografia por exclusãode tamanho e detecção espectrofotométrica ou uma área de menos do que0,5 por cento de espécies de baixo peso molecular (ou monômeros de C-TLA4-lg) conforme determinado através de cromatografia por exclusão detamanho e detecção espectrofotométrica; um método para medição dessacaracterística é apresentado no Exemplo 10;

não excedendo uma quantidade máxima de DNA de 2,5 pico-grama/mg de moléculas de CTLA4-lg ou 2,5 picograma/mg de dímero deCTLA4-lg (a qual pode ser uma ausência de DNA); um método para medi-ção dessa característica é apresentado no Exemplo 58;

não excedendo uma quantidade máxima de MCP-1 de 3,0ng/mg de moléculas totais de CTLA4-lg, 5 ppm ou 5 ng/mg de dímero deCTLA4-lg (a qual pode ser uma ausência de MCP-1); um método para medi-ção dessa característica é apresentado no Exemplo 59;

não excedendo uma quantidade máxima de proteína de célulashospedeiras (também conhecida como proteína celular) de 25 ng/mg de mo-léculas de CTLA4-lg ou 50 ng/mg de dímero de CTLA4-lg (a qual pode seruma ausência de proteína de células hospedeiras ou proteína celular); ummétodo para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 60;

não excedendo uma quantidade máxima de Triton X-100 de 1,0ng/mg de moléculas de CTLA4-lg (a qual pode ser uma ausência de Triton-X); um método para medição dessa característica é apresentado no Exem-plo 61;

não excedendo uma quantidade máxima de Proteína A de 5,0ng/mg de moléculas de CTLA4-lg (a qual pode ser uma ausência de Proteí-na A); um método para medição dessa característica é apresentado no E-xemplo 62;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deGIcNAc para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 15 a cerca de 35; um méto-do para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 63;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deGaINAc para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; um mé-todo para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 63;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 8,0 a cerca de 17; um méto-do para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 64;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média defucose para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), expres-sa como mols/mol de proteína, de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; um métodopara medição dessa característica é apresentado no Exemplo 64;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média demanose para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 7,7 a cerca de 22; um méto-do para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 64;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg),expressa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 8,0, tal como decerca de 8,0 a cerca de 12,0; um método para medição dessa característicaé apresentado no Exemplo 16;as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deNANA para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), expres-sa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 8,0, tal como de cercade 8,0 a cerca de 12,0; um método para medição dessa característica é a-presentado no Exemplo 16;

as moléculas de CTLA4-lg têm glicosilação N-ligada, de modoque o Domínio I exibe uma área percentual de cerca de 24,5% a cerca de35,2% ou o Domínio Il exibe uma área percentual de cerca de 26,3% a cercade 34,1% ou o Domínio Ill exibe uma área percentual de cerca de 21,9% acerca de 31,5% ou o Domínio IV e Domínio V exibem uma área percentualde cerca de 7,9% a cerca de 18,6%; um método para medição dessa carac-terística é apresentado no Exemplo 44;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deNGNA para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), expres-sa como mols/mol de proteína, de menos do que ou igual a 1,5; um métodopara medição dessa característica é apresentado no Exemplo 16.

A invenção proporciona tais composições como isoladas ousubstancialmente purificadas. A invenção proporciona tais composições co-mo composições farmacêuticas ou composições farmaceuticamente aceitá- veis. A invenção proporciona composições tendo qualquer permuta ou com-binação dessas características.

A invenção proporciona tais composições como isoladas ousubstancialmente purificadas. A invenção proporciona tais composições co-mo composições farmacêuticas ou composições farmaceuticamente aceitá-veis. A invenção proporciona composições tendo qualquer permuta ou com-binação dessas características:

(2) as moléculas de CTLA4-lg compreendem qualquer uma oumais de SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 24 (por exemplo C-TLA4A29YL104E-lg), as moléculas de CTLA4-lg têm uma área de menos do queou igual a 5,0 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg(ou tetrâmeros de CTLA4-lg) conforme determinado através de cromatogra-fia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica (um método demedição para o qual é apresentado no Exemplo 25); . Mais particularmente,a invenção proporciona tais composições ainda tendo uma ou mais das se-guintes características:

as moléculas de CTLA4-lg têm uma área de mais de ou igual a95,0 por cento de dímeros de CTLA4-lg conforme determinado através decromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; ummétodo para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 25;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma área de menos do que ouigual a 1,0 por cento de espécies de baixo peso molecular de CTLA4-lg (oumonômeros de CTLA4-lg) conforme determinado através de cromatografiapor exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; um método paramedição dessa característica é apresentado no Exemplo 25;

fornecimento (como moléculas de CTI_A4-lg ou como a referidacomposição) de cerca de 8-15 bandas com uma faixa de pl de cerca de 4,5a cerca de 5,6 e intensidade de banda cumulativa de 95% - 105% em umafaixa de pl de 4,5 a 5,6; um método para medição dessa característica é a-presentado no Exemplo 22;

não excedendo uma quantidade máxima de DNA de cerca de2,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-lg; um método para medição dessa ca-racterística é apresentado no Exemplo 55;

não excedendo uma quantidade máxima de Proteína A de 5ng/mg de moléculas de CTLA4-lg; um método para medição dessa caracte-rística é apresentado no Exemplo 53;

não excedendo uma quantidade máxima de MCP-1 de 5 ng/mgde moléculas de CTLA4-lg; um método para medição dessa característica éapresentado no Exemplo 54;

não excedendo uma quantidade máxima de proteína de célulashospedeiras (também conhecida como proteína celular) de 50 ng/mg de mo-léculas de CTLA4-lg; um método para medição dessa característica é apre-sentado no Exemplo 52;

não excedendo uma quantidade máxima de endotoxina bacteri-ana de 0,42 EU/mg de moléculas de CTLA4-lg; um método para mediçãodessa característica é apresentado no Exemplo 48;

não excedendo uma bioburden máxima de 1 CFU/ml; um méto-do para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 49;

não excedendo uma quantidade máxima de Triton X-100 de 2ppm; um método para medição dessa característica é apresentado no E-xemplo 57;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg),expressa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 5,0, tal como decerca de 5,0 a cerca de 9,0 ou de cerca de 5,0 a cerca de 10,0; um métodopara medição dessa característica é apresentado no Exemplo 39;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deNANA para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), expres-sa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 5,0, tal como de cercade 5,0 a cerca de 9,0 ou de cerca de 5,0 a cerca de 10,0; um método paramedição dessa característica é apresentado no Exemplo 39;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média deGaINAc para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 0,8 a cerca de 4,0; um mé- todo para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 36;

as moléculas de CTl_A4-lg têm uma proporção molar média deGIcNAc para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 14 a cerca de 35; um méto-do para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 36;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média degalactose para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 8,0 a cerca de 14; um méto-do para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 35;

as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média defucose para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), expres-sa como mols/mol de proteína, de cerca de 1,7 a cerca de 9,3; um métodopara medição dessa característica é apresentado no Exemplo 35;as moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção molar média demanose para moléculas de CTLA4-lg (ou para dímeros de CTLA4-lg), ex-pressa como mols/mol de proteína, de cerca de 9 a cerca de 18; um métodopara medição dessa característica é apresentado no Exemplo 35.

A invenção proporciona tais composições como sendo isoladasou substancialmente purificadas. A invenção proporciona proteínas e com-posições tendo qualquer permuta ou combinação dessas características.

Os Exemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17,18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 acima se referem, em particular, à proteína deCTLA4-lg de (1) acima embora, conforme descrito na presente especifica-ção, os métodos referentes a e usos de tais proteínas nesses Exemplos sãoilustrativos de métodos referentes a e usos de outras proteínas de CTLA4-lgda invenção.

Os Exemplos 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57 acima se referem, em particular, à proteína deCTLA4-lg de (2) acima embora, conforme descrito na presente especifica-ção, os métodos referentes a e usos de tais proteínas nesses Exemplos sãoilustrativos de métodos referentes a e usos de outras proteínas de CTLA4-lgda invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Bristol-Myers Squibb Company

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE DMA COMPOSIÇÃO

<130> 10734 TW

<140> 95147641

<141> 19/12/2006

<150> 60/849.543

<151> 05/10/2006

<150> 60/752.267

<151> 20/12/2005

<150> 60/752.150

<151> 20 /12/ 2005

<160> 77

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1223

<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> CTLA4Ig

<220>

<221> CDS

<222> (11)..(1159)

<400> 1

400> 1

agcttcacca atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg 4 9

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu1 5 10

gtc ctt gca ctc ctg ttt cca age atg gcg age atg gea atg cac gtg 97

Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val1 5 20 25

gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc age age cga ggc ate gcc age ttt 145

Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe30 35 40 45

gtg tgt gag tat gca tet cca ggc aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca 193

Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr50 55 60

gtg ctt cgg cag gct gac age cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc 241

Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr65 70 75

tac atg atg ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc ate tgc acg 289

Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr80 85 90

ggc acc tcc agt gga aat caa gtg aac ctc act ate caa gga ctg agg 337

Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg

95 100 105

gcc atg gac acg gga ctc tac ate tgc aag gtg gag ctc atg tac cca 385

Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro

110 115 120 125

ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att 433

Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile

130 135 140

gat cca gaa ccg tgc cca gat tet gat cag gag ccc aaa tet tet gac

481Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp

145 150 155

aaa act cac aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 529

Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

160 165 170

tcg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate 577

Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile175 180 185

tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa 625

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

190 195 200 205

gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 673

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

210 215 220

aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt 721

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

225 230 235

gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 7 69

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

240 245 250

gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag 817

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu255 260 265

aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 8 65

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

270 275 280 285

acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg 913

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

290 295 300

acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg 961

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

305 310 315

gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1009

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

320 325 330

ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac 1057

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp335 340 345

aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1105

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

350 355 360 365

gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg 1153

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

370 375 380

ggt aaa tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc cgggctctcg cggtcgcacg 1209

Gly Lys

aggatgcttc taga

1223<210> 2<211> 383

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4Ig

<400> 2

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys225

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser230 235 240Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys370 375 380

<210> 3

<400> 3

ESSA SEQÜÊNCIA FOI DEIXADA INTENCIONALMENTE EM BRANCO<210> 4

<211> 384

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4A29YL104E

<400> 4

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser85 90 95Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr115 120 125

Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu130 135 140

Pro Cys Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr145 150 155 160

His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr245 250 255

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu275 280 285

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys290 295 300

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp325 330 335

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser340 345 350

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala355 360 365Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys370 375 380

<210> 5

<211> 359

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> CTLA4Ig - Aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO:2

<400> 5

Met Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg1 5 10 15

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr20 25 30

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu35 40 45

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp50 55 60

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val85 90 95

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr100 105 110

Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu115 120 125

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp210 215 220Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys355

<210> 6<211> 358

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4Ig - aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO:2

<4 00> 6

Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly1 5 10 15

Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu20 25 30

Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val35 40 45

Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp50 55 60

Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu85 90 95Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln100 105 110

Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro115 120 125

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu130 135 140

Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp145 150 155 160

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp165 170 175

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly180 185 190

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn195 200 205

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp210 215 220

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro225 230 235 240

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu245 250 255

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn260 265 270

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile275 280 285

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr290 295 300

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys305 310 315 320

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys325 330 335

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu340 345 350

Ser Leu Ser Pro Gly Lys355<210> 7

<211> 357

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4Ig - aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO:2

<400> 7

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys115 120 125

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu130 135 140

Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser195 200 205

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu210 215 220

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala225 230 235 240Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro245 250 255

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln260 265 270

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala275 280 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr290 295 300

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser340 345 350

Leu Ser Pro Gly Lys355

<210> 8<211> 358

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4Ig - aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO:2

<400> 8

Met Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg15 10 15

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr20 25 30

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu35 40 45

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp50 55 60

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val85 90 95

Glu Leu

Met

Tyr100

Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr105 110Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu115 120 125

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly355

<210><211><212>

9

357PRT<213> seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4Ig - aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO:2

<400> 9

Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly1 5 10 15

Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu20 25 30

Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val35 40 45

Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp50 55 60

Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu85 90 95

Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln100 105 110

Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro115 120 125

Lys Ser Ser Asp LysThr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu130 135 140

Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp145 150 155 160

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp165 170 175

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly180 185 190

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn195 200 205

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp210 215 220

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro225 230 235 240

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu245 250 255Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn260 265 270

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile275 280 285

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr290 295 300

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys305 310 315 320

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys325 330 335

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu340 345 350

Ser Leu Ser Pro Gly355

<210> 10<211> 356

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> CTLA4Ig - aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO:2

<400> 10

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile15 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile100 105 110

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Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val165 170 175

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1 5

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gggtggacta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 480

gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 54 0

tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 600

tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 660

ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 720

actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 780

ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc 840

ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc ttggtaccga gctcggatcc 900

actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt ctgcagatag cttcacca atg ggt gta 957

Met Gly Val1

ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca ctc ctg ttt 1005Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe5 10 15

cca age atg gcg age atg gca atg cac gtg gcc cag cct gct gtg gta 1053Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val20 25 30 35

ctg gcc age age cga ggc ate gcc age ttt gtg tgt gag tat gca tet 1101

Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser40 45 50

cca ggc aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac 114 9Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp55 60 65

age cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag 1197Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu70 75 80

ttg acc ttc cta gat gat tcc ate tgc acg ggc acc tcc agt gga aat 1245Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn85 90 95

caa gtg aac ctc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc 1293Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu100 105 110 115

tac ate tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc 1341Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly120 125 130

ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca 138 9Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro135 140 145

gat tet gat cag gag ccc aaa tet tet gac aaa act cac aca tcc cca 1437

Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro

150 155 160

ccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtc ttc ctc ttc 1485

Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe

165 170 175ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc 1533

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val180 185 190 195

aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 1581

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe200 205 210

aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 1629Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro215 220 225

cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc 1677

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr230 235 240

gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1725Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val245 250 255

tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 1773Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala260 265 270 275

aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 1821Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg280 285 290

gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 18 69

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly295 300 305

ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 1917

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro310 315 320

gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1965Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser325 330 335

ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 2013Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln340 345 350 355

ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 2061

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His360 365 370

tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tgagtgcgac 2107

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys375 380

ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc gcggtcgcac gaggatgctt ctagagggcc 2167

etattetata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 2227

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 2287

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 2347

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 2407

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 2467

gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 2527

ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 2587tcccttcctt tctcgccacg ttcgccctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt 2647ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 2707ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 2767agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 2827ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 2887cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 2947gcaaaaagct tggacagctg agggctgcga tttcgcgcca aacttgacgg caatcctagc 3007gtgaaggctg gtaggatttt atccccgctg ccatcatggt tcgaccattg aactgcatcg 3067tcgccgtgtc ccaagatatg gggattggca agaacggaga cctaccctgg cctccgctca 3127ggaacgagtt caagtacttc caaagaatga ccacaacctc ttcagtggaa ggtaaacaga 3187atctggtgat tatgggtagg aaaacctggt tctccattcc tgagaagaat cgacctttaa 3247aggacagaat taatatagtt ctcagtagag aactcaaaga accaccacga ggagctcatt 3307ttcttgccaa aagtttggat gatgccttaa gacttattga acaaccggaa ttggcaagta 3367aagtagacat ggtttggata gtcggaggca gttctgttta ccaggaagcc atgaatcaac 3427caggccacct cagactcttt gtgacaagga tcatgcagga atttgaaagt gacacgtttt 3487tcccagaaat tgatttgggg aaatataaac ttctcccaga atacccaggc gtcctctctg 3547aggtccagga ggaaaaaggc atcaagtata agtttgaagt ctacgagaag aaagactaac 3607aggaagatgc tttcaagttc tctgctcccc tcctaaagct atgcattttt ataagaccat 3667gggacttttg ctggctttag atctttgtga aggaacctta cttctgtggt gtgacataat 3727tggacaaact acctacagag atttaaagct ctaaggtaaa tataaaattt ttaagtgtat 3787aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt gtgtatttta gattccaacc tatggaactg 3847atgaatggga gcagtggtgg aatgccttta atgaggaaaa cctgttttgc tcagaagaaa 3907tgccatctag tgatgatgag gctactgctg actctcaaca ttctactcct ccaaaaaaga 3967agagaaaggt agaagacccc aaggactttc cttcagaatt gctaagtttt ttgagtcatg 4027ctgtgtttag taatagaact cttgcttgct ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg 4087cactgctata caagaaaatt atggaaaaat attctgtaac ctttataagt aggcataaca 4147gttataatca taacatactg ttttttctta ctccacacag gcatagagtg tctgctatta 4207ataactatgc tcaaaaattg tgtaccttta gctttttaat ttgtaaaggg gttaataagg 4267aatatttgat gtatagtgcc ttgactagag atcataatca gccataccac atttgtagag 4327gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 4387gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 4447atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 4507ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc 4567atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 4627agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 4687ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc 4747ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 4807cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 4867ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 4927ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 4987gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5047cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 5107tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 5167cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 5227aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 5287cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 5347gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 5407ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 5467cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 5527aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 5587tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 5647ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 5707tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 5767ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 5827agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 5887atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 5947cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6007ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6067ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6127agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 6187agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 6247gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgtcaaggc 6307gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt ccccgatcgt 6367tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tcataattct 6427cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 6487ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 6547accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 6607aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 6667

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 6727

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 6787

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 6847

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 6907

cctgacgtcg acggatcggg a 6928

<210> 18<211> 124

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> seqüência do domínio extracelular de CTLA4

<400> 18

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp115 120

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 19

agaaaagggg ctggagagat ggctcagtgg ttaagagca 39

<210> 20

<211> 9

<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> oligonucleotídeo sintético

<400> 20gtactcagg

<210> 21<211> 10<212> DNA<213> seqüência Artificial<220> <223> oligonucleotideo sintético<400> 21agtcagagac

<210> 22<211> 48<212> DNA<213> seqüência Artificial<220> <223> oligonucleotideo sintético<400> 22cggcagatct ctgtgagttt gaggccagcc tggtctacaa

<210> 23<211> 48<212> DNA<213> seqüência Artificial<220> <223> CTLA4Ig<220> <221> CDS<222> (1)..(1149)<400> 23

atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gcaMet Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala1 5 10 15

ctc ctg ttt cca age atg gcg age atg gca atg cac gtg gcc cag cctLeu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro20 25 30

96

gct gtg gta ctg gcc age age cga ggc ate gct age ttt gtg tgt gagAla Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu35 40 45

144

tat gca tet cca ggc aaa tat act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cggTyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg50 55 60

192

cag gct gac age cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atgGln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

240

ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc ate tgc acg ggc acc tccGly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser85 90 95

288

agt gga aat caa gtg aac ctc act ate caa gga ctg agg gcc atg gacSer Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp100 105 110

336

acg gga ctc tac ate tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tacThr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr115 120 125

384

tac gag ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu130 135 140ccg tgc cca gat tct gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cacPro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His145 150 155 160

480

aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtcThr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val165 170 175

528

ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg accPhe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr180 185 190

576

cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gagPro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu195 200 205

624

gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aagVal Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys210 215 220

672

aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc ageThr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser225 230 235 240

720

gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aagVal Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys245 250 255

tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ateCys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile260 265 270

816

tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg cccSer Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro275 280 285

864

cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctgPro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu290 295 300

912

gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aatVal Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn305 310 315 320

960

ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tccGly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser325 330 335

1008

gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age aggAsp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg340 345 350

1056

tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctgTrp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu355 360 365

1104

cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tgaHis Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys370 375 380

1152

<210><211><212><213><220><223><400>

24

124

PRT

seqüência Artificial

Domínio extracelular de CTLA4 com A29Y e L104E24Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp115 120

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220»

<223> peptídeo tríptico

<400> 25

Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg1 5 10 15

<210> 26<211> 14

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 26

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg1 5 10

<210> 27

<211> 14

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 27

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys1 5 10

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220><223> peptídeo tríptico

<400> 28

Ala Thr Glu Val Arg1 5

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 29

Val Thr Val Leu Arg1 5

<210> 30

<211> 45

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 30

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met1 5 10 15

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser20 25 30

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg35 40 45

<210> 31<211> 10<212> PRT<213> seqüência Artificial<220> <223> peptídeo tríptico<400> 31

Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile

1 5 10

<210> 32

<211> 35

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 32

Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly1 5 10 15

Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln20 25 30

Glu Pro Lys35

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220><223> peptídeo tríptico

<400> 33

Ser Ser Asp Lys1

<210> 34

<211> 26<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo sintético

<4 00> 34

Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys20 25

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<4 00> 35Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg1 5

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 36

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro1 5 10 15

Glu Val Lys

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo sintético

<400> 37

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys1 5 10

<210> 38

<211> 4

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 38Thr Lys Pro Arg1

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220><223> peptídeo tríptico

<400> 39

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 40

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys1 5 10 15

<210> 41

<211> 4

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 41

Val Ser Asn Lys1

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 42

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

1 5

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 43

Thr Ile Ser Lys1

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 44

Gly Gln Pro Arg1

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 45

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg1 5 10

<210><211>

465<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 46Asp Glu Leu Thr Lys1 5

<210> 47

<211> 10<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 47

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys1 5 10

<210> 48

<211> 22<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 48

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln1 5 10 15

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys20

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 49

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser1 5 10 15

Lys

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 50Leu Thr Val Asp Lys1 5

<210> 51

<211> 23

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico

<400> 51

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu1 5 10 15His Asn His Tyr Thr Gln Lys20

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 52Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 53

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo tríptico37

<400> 54

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr1 5

<210> 55

<211> 11<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 55

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His1 5 10

<210> 56

<211> 15

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 56

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr1 5 10 15

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 57

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys1 5

<210> 58

<2ll> 7

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 58Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 59Tyr Thr Glu Val Arg1 5

<210> 60<211> 35

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 60

Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly1 5 10 15

Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln20 25 30Glu Pro Lys35

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 61

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met1 5 10 15

Gly

<210> 62<211> 28<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 62

Asn Arg Leu Gly Gln Ile Thr Leu Asn Val Gln Asn Gly Ser Ser Thr1 5 10 15

Gly Thr Cys Ile Ser Asp Asp Leu Phe Thr Leu Glu20 25

<210><211><212><213><220><223><400>Val Cys Glu Tyr1

634

PRT

seqüência Artificial

peptideo tríptico63

<210><211><212><213><220><223><400>Cys Leu Val Lys1

644

PRT

seqüência Artificial

peptideo tríptico64

<210><211><212><213><220><223><400>

655

PRT

seqüência Artificial

peptideo tríptico65

Ser Cys Ser Val Met

<210><211><212><213><220><223>

6615PRT

seqüência Artificialpeptideo tríptico<400> 66

Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys1 5 10 15

<210> 67

<211> 26<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 67

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met1 5 10 15

Gly Asn Arg Leu Gly Gln Ile Thr Leu Val20 25

<210> 68<211> 18<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 68

Gln Asn Gly Ser Ser Thr Gly Thr Cys Ile Ser Asp Asp Leu Phe Thr1 5 10 15

Leu Glu

<210><211><212><213><220><223><400>

698

PRT

seqüência Artificial

peptideo tríptico69

Thr Cys Ile Ser Asp Asp Leu Phe

<210><211><212><213><220><223><400>

7011PRT

seqüência Artificial

Peptideo Asp-N70

Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn1 5 10

716

PRT

seqüência Artificial

<210><211><212><213><220>

<223> peptideo tríptico

<400> 71

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr1 5

<210><211><212><213><220>

7223PRT

Seqüência Artificial<223> Peptídeo tríptico

<400> 72

Trp Gln Gln Gly Asp Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu1 5 10 15

His Asn His Tyr Thr Gln Lys20

<210> 73

<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (14) . . (14)

<223> iso-Asp

<400> 73

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln1 5 10 15

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys20

<210><211><212><213><220><223>

7415PRT

seqüência ArtificialPeptídeo Sintético

<220><221><222><223><400>

M0D_(7):Cam74

RES(7)

Val Ile Asp Pro Glu Pro Xaa Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys1 5 10 15

<210> 75<211> 6<212> PRT<213> seqüência Artificial<220> <223> Tag sintética 6x His<400> 75His His His His His His1 5

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Asp-N

<400> 76

Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser1 5

<210> 77

<211> 13

<212> PRT<213> seqüência Artificial

<220>

<223> peptideo tríptico

<400> 77

Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu1 5 10

Claims

1. Método para obtenção de uma composição compreendendouma população isolada de moléculas de CTLA4-lg de um meio de culturalíquido, o meio compreendendo uma população inicial de moléculas de C-TLA4-lg em que (1) moléculas de CTLA4-lg da população inicial têm um oumais resíduos de ácido siálico, (2) o número de resíduos de ácido siálico pormolécula de CTLA4-lg varia dentro da população inicial, (3) a população ini-cial compreende dímero de CTLA4-lg e agregados de elevado peso molecu-lar e (4) o meio de cultura líquido contém MCP-1, o referido método sendocaracterizado pelo fato de que compreende:(a) coleta do meio de cultura líquido de uma cultura de célulasde mamífero expressando moléculas de CTLA4-lg;(b) separação das moléculas de CTLA4-lg de componentes celu-lares;(c) separação das moléculas de CTLA4-lg da MCP-1;(d) separação de dímeros de CTLA4-lg de agregados de eleva-do peso molecular de CTLA4-lg; e(e) separação das moléculas de CTLA4-lg em duas ou mais fra-ções, em que pelo menos uma fração tem uma maior proporção molar deácido siálico para moléculas de CTLA4-lg comparado com pelo menos umafração;em que as etapas (b), (c), (d) e (e) são realizadas simultanea-mente ou em qualquer ordem, de modo a obter a referida composição.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que: (a) as moléculas de CTLA4-lg da composição têm como carac-terística uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-lgde mais do que ou igual a 8,0 e uma área de espécies de elevado peso mo-lecular de CTLA4-lg de menos do que ou igual a 2,5 por cento, conformedeterminado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecçãoespectrofotométrica; e (b) a composição compreende uma quantidade deMCP-1 de menos do que ou igual a 3 ng/mg de moléculas de CTLA4-lg.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que: (a) as moléculas de CTLA4-lg da composição têm como carac-terística uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-lgde mais do que ou igual a 5,0 e uma área de espécies de elevado peso mo-lecular de CTLA4-lg de menos do que ou igual a 4,0 por cento, conformedeterminado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecçãoespectrofotométrica; e (b) a composição compreende não mais do que 5ppm de MCP-1.

4. Método para isolamento de uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, o referido método sendo caracterizado pelo fato deque compreende:(i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida com-preendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lg;(ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânionspara obter um produto de proteína eluído;(iii) sujeição do produto de proteína da etapa (ii) à cromatografiade interação hidrofóbica de modo a obter um produto de proteína enriqueci-do;(iv) sujeição do produto de proteína de (iii) à cromatografia porafinidade para obter um produto de proteína eluído e enriquecido; e(v) sujeição do produto de proteína de (iv) à cromatografia detroca de ânions de modo a isolar uma composição compreendendo molécu-las de CTLA4-lg.

5. Método para isolamento de uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, o referido método sendo caracterizado pelo fato deque compreende:(i) obtenção de um sobrenadante de cultura de célula de umacultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem molécu-las de CTLA4-lg;(ii) sujeição do sobrenadante à cromatografia de troca de ânionspara obter um produto de proteína eluído;(iii) sujeição do produto de proteína da etapa (ii) à cromatografiade interação hidrofóbica de modo a obter um produto de proteína enriqueci-do;(iv) sujeição do produto de proteína de (iii) à cromatografia porafinidade para obter um produto de proteína eluído e enriquecido; e(v) sujeição do produto de proteína de (iv) à cromatografia detroca de ânions de modo a isolar uma composição compreendendo molécu-las de CTLA4-lg;em que as moléculas de CTLA4-lg da composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg têm uma proporção de ácido siálico de > 8,0moles por mol de proteína;em que as moléculas de CTLA4-lg da composição compreen-dendo moléculas de CTLA4-lg têm menos de 3% de multímeros de CTLA4-lg maiores do que a forma dimérica; eem que a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg tem comocaracterística MCP-1 ^ 5 ng/mg de dímero de CTLA4-lg.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que (a) a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtidana etapa (ii) tem como característica uma área de menos do que ou igual a-25,7 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-lg, con-forme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e de-tecção espectrofotométrica, (b) a composição compreendendo moléculas deCTLA4-lg obtida na etapa (iii) tem como característica uma área de menosdo que ou igual a 2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular deCTLA4-lg, conforme determinado através de cromatografia por exclusão detamanho e detecção espectrofotométrica, (c) a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtida na etapa (iv) tem como característica umaárea de menos de ou igual a 2,5 por cento de espécies de elevado peso mo-lecular, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de ta-manho e detecção espectrofotométrica e (d) a composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg obtida na etapa (v) tem como característica uma á-rea de menos do que ou igual a 2,0 por cento de espécies de elevado pesomolecular, conforme determinado através de cromatografia por exclusão detamanho e detecção espectrofotométrica.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que (a) a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtidana etapa (iii) tem como característica menos do que 5600 ng/ml de MCP-1,(b) a composição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtida na etapa(iv) tem como característica menos do que 38 ng/ml de MCP-1 e (c) a com-posição compreendendo moléculas de CTLA4-lg obtida na etapa (v) temcomo característica menos do que 9,5 ng/mg de MCP-1.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que: (a) a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizadausando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions compreendendoum grupo funcional amina primária, secundária, terciária ou quaternária; umtampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 75 mM e NaCI acerca de 360 mM e tendo um pH de cerca de 8,0; e um tampão de eluiçãocompreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 850 mM etendo um pH de cerca de 7,0; (b) a cromatografia de interação hidrofóbica daetapa (iii) é realizada usando: uma resina de interação hidrofóbica compre-endendo um grupo funcional fenila, um octila, um propila, um alcóxi, um buti-Ia ou um isoamila; e um único tampão de lavagem compreendendo HEPESa cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de-7,0; (c) a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando: umaresina de cromatografia por afinidade compreendendo proteína A; um tam-pão de lavagem compreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de-250 mM e tendo um pH de cerca de 8,0; e um tampão de eluição compreen-dendo glicina a cerca de 100 mM e tendo um pH de cerca de 3,5; e (d) acromatografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando: um tam-pão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI de cercade 120 mM a cerca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0; e um tampãode eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 200mM e tendo um pH de cerca de 8,0.

9. Método para isolamento de uma composição compreendendomoléculas de CTLA4-lg, o referido método sendo caracterizado pelo fato deque compreende:(i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida com-preendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lg e,em qualquer ordem:(ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade demodo a obter uma composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-ig;(iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânionsde modo a obter uma composição eluída e enriquecida compreendendo mo-léculas de CTLA4-lg;(iv) sujeição da fração solúvel à cromatografia de interação hi-drofóbica para obter uma composição eluída e enriquecida compreendendomoléculas de CTLA4-lgem que a etapa de cromatografia por afinidade é realizada pri-meiro.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando umtampão de eluição compreendendo guanidina ou uréia.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que compreende:(i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida com-preendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-lg;(ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade paraobter um produto de proteína eluído;(iii) sujeição do produto de proteína da etapa (ii) à cromatografiade troca de ânions de modo a obter um produto de proteína enriquecido eeluído; e(iv) sujeição do produto de proteína da etapa (iii) à cromatografiade interação hidrofóbica para obter uma composição mais enriquecida com-preendendo moléculas de CTLA4-lg.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que a composição obtida na etapa (iv) tem como característicauma área de espécies de elevado peso molecular de menos de cerca de-2,5%, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de ta-manho e detecção espectrofotométrica e o percentual de proteína celular émenos do que cerca de 95 ng/ml e o percentual MCP-1 é menos do que cer-ca de 5 ppm.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que: (a) a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada u-sando uma resina compreendendo proteína A; um tampão de lavagem com-preendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCI a cerca de 150 mM e tendoum pH de cerca de 7,5; e um tampão de eluição compreendendo glicina acerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 3; (b) a cromatografia de trocade ânions da etapa (iii) é realizada usando uma coluna tendo uma resina detroca ânions compreendendo um grupo funcional amina primária, secundá-ria, terciária ou quaternária; um tampão de lavagem compreendendo HEPESa cerca de 50 mM e NaCI a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de 7;e um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCIa cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 7; (c) a cromatografia de in-teração hidrofóbica da etapa (iv) é realizada usando: uma resina de intera-ção hidrofóbica compreendendo um grupo funcional fenila, octila, propila,alcóxi, butila ou isoamila; e um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e (NH4)2SO4 a cerca 1,2M e tendo um pH de cer-ca de 7.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10a 13, caracterizado pelo fato de que as moléculas de CTLA4-lg compreen-dem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10a 13, caracterizado pelo fato de que as moléculas de CTLA4-lg compreen-dem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 18.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10a 13, caracterizado pelo fato de que as moléculas de CTLA4-lg compreen-dem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10a 13, caracterizado pelo fato de que as moléculas de CTLA4-lg compreen-dem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 24.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendemoléculas de CTLA4-lg obtidas através do método como definido em qual-quer uma das reivindicações 10 a 13.