JP6228971B2 - Ctla−4バリアント - Google Patents
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Description
本出願とともに出願された、ASCIIテキストファイル(名称CTLA4101P1Sequencelisting.txt;サイズ:107,814バイト;および作成日:2012年5月11日)の電子的に提出された配列表の内容は、参照により本明細書に全体として組み込まれる。
− 1315突然変異、すなわち、I16におけるS;S25におけるN;L58におけるG;S70におけるA;Q80におけるR;M85におけるS;およびK93におけるQ;
− 1322突然変異、すなわち、S25におけるN;G27におけるS;M54におけるK;N56におけるS;T59におけるS;F60におけるT;L61におけるQ;D63におけるY;S64におけるP;I65におけるN;およびK93におけるQ;
− 1321突然変異、すなわち、I16におけるS;S25におけるN;M54におけるK;L58におけるG;S70におけるA;Q80におけるR;M85におけるS;およびK93におけるQ;
− 1115突然変異、すなわち、I16におけるV;S25におけるN;L58におけるG;S70におけるA;M85におけるQ;およびK93におけるQ;
− 1299突然変異、すなわち、I16におけるR;A24におけるT;S25におけるN;G27におけるS;L58におけるA;S70におけるA;M85におけるQ;およびK93におけるQ;ならびに
− 1227突然変異、すなわち、I16におけるS;S25におけるN;G27におけるS;L58におけるA;S70におけるA;M85におけるQ;およびK93におけるH。
− 残基16におけるS;残基25におけるN;残基58におけるG;残基70におけるA;残基80におけるR;残基85におけるS;および残基93におけるQ;
− 残基25におけるN;残基27におけるS;残基54におけるK;残基56におけるS;残基59におけるS;残基60におけるT;残基61におけるQ;残基63におけるY;残基64におけるP;残基65におけるN;および残基93におけるQ;
− 残基16におけるS;残基25におけるN;残基54におけるK;残基58におけるG;残基70におけるA;残基80におけるR;残基85におけるS;および残基93におけるQ;
− 残基16におけるV;残基25におけるN;残基58におけるG;残基70におけるA;残基85におけるQ;および残基93におけるQ;
− 残基16におけるR;残基24におけるT;残基25におけるN;残基27におけるS;残基58におけるA;残基70におけるA;残基85におけるQ;および残基93におけるQ;または
− 残基16におけるS;残基25におけるN;残基27におけるS;残基58におけるA;残基70におけるA;残基85におけるQ;および残基93におけるH。
I16におけるR、S、VまたはT;
A24におけるT;
S25におけるNまたはP;
G27におけるS;
V32におけるI;
D41におけるG;
S42におけるG;
V44におけるE;
M54におけるK;
N56におけるSまたはG;
L58におけるA、G、SまたはP;
T59におけるSまたはA;
F60におけるT;
L61におけるQまたはP;
D62におけるG;
D63におけるY;
S64におけるP;
I65におけるN、D、VまたはT;
S70におけるA、T、MまたはH;
Q80におけるR;
M85におけるQ、S、V、R、KまたはL;
T87におけるS;
K93におけるQ、H、T、EまたはM;
L104におけるR、QまたはE;
I106におけるV;
N108におけるDまたはS;
I115におけるVまたはF;
C120におけるS;
T51における欠失。
I16におけるR、SまたはV;
A24におけるT;
S25におけるN;
G27におけるS;
M54におけるK;
N56におけるS;
L58におけるAまたはG;
T59におけるS;
F60におけるT;
L61におけるQ;
D63におけるY;
S64におけるP;
I65におけるNまたはD;
S70におけるA;
Q80におけるR;
M85におけるQまたはS;
K93におけるQまたはH;
C120におけるS。
− 1315突然変異、すなわち、I16におけるS;S25におけるN;L58におけるG;S70におけるA;Q80におけるR;M85におけるS;およびK93におけるQ;
− 1322突然変異、すなわち、S25におけるN;G27におけるS;M54におけるK;N56におけるS;T59におけるS;F60におけるT;L61におけるQ;D63におけるY;S64におけるP;I65におけるN;およびK93におけるQ;
− 1321突然変異、すなわち、I16におけるS;S25におけるN;M54におけるK;L58におけるG;S70におけるA;Q80におけるR;M85におけるS;およびK93におけるQ;
− 1115突然変異、すなわち、I16におけるV;S25におけるN;L58におけるG;S70におけるA;M85におけるQ;およびK93におけるQ;
− 1299突然変異、すなわち、I16におけるR;A24におけるT;S25におけるN;G27におけるS;L58におけるA;S70におけるA;M85におけるQ;およびK93におけるQ;ならびに
− 1227突然変異、すなわち、I16におけるS;S25におけるN;G27におけるS;L58におけるA;S70におけるA;M85におけるQ;およびK93におけるH。
(i)アミノ酸配列の配列番号68、配列番号43、配列番号37、配列番号38、配列番号36、配列番号42もしくは配列番号47;
(ii)最大10のアミノ酸突然変異を含有する(i)のバリアントであるアミノ酸配列(残基25は、突然変異しておらず、Nである);
(iii)1つ以上のアミノ酸突然変異を含む(i)のバリアントであるアミノ酸配列(残基25は、突然変異しておらず、Nであり、前記バリアントは、(i)と少なくとも70%の配列同一性を有する);または
(iv)NCIMBアクセッション番号41948のもとで寄託された核酸によりコードされるCTLA−4アミノ酸配列
を含むポリペプチド。
− 残基25におけるN;残基27におけるS;残基54におけるK;残基56におけるS;残基59におけるS;残基60におけるT;残基61におけるQ;残基63におけるY;残基64におけるP;残基65におけるN;および残基93におけるQ;
− 残基16におけるS;残基25におけるN;残基54におけるK;残基58におけるG;残基70におけるA;残基80におけるR;残基85におけるS;および残基93におけるQ;
− 残基16におけるV;残基25におけるN;残基58におけるG;残基70におけるA;残基85におけるQ;および残基93におけるQ;
− 残基16におけるR;残基24におけるT;残基25におけるN;残基27におけるS;残基58におけるA;残基70におけるA;残基85におけるQ;および残基93におけるQ;または
− 残基16におけるS;残基25におけるN;残基27におけるS;残基58におけるA;残基70におけるA;残基85におけるQ;および残基93におけるH
を含む、項14〜21のいずれか一項に記載のCTLA−4ポリペプチド。
残基20におけるF;残基21におけるE;残基117におけるS;および
残基38におけるY、残基40におけるT、残基42におけるE
(前記残基ナンバリングは、配列番号56に準拠して定義される)。
1つ以上の医薬賦形剤
を含む組成物。
1つ以上の医薬賦形剤
を含む組成物。
アミノ酸配列の配列番号36〜55またはNCIMBアクセッション番号41948のもとで寄託された核酸によりコードされるCTLA−4アミノ酸配列を含み、またはそれからなるCTLA−4ポリペプチドを提供すること;
1つ以上の突然変異を前記アミノ酸配列中に導入してさらなるCTLA−4ポリペプチドを提供すること;
前記さらなるCTLA−4ポリペプチドの安定性、親和性および/または効力を試験すること;ならびに
前記さらなるCTLA−4ポリペプチドを、1つ以上の医薬賦形剤を含む組成物に配合すること
を含む方法。
可溶性CTLA−4は、Tリンパ球の表面上で発現されたCD28と競合し、阻害がなければTリンパ球の共刺激および活性化をもたらすCD28へのリガンドCD80(B7.1)およびCD86(B7.2)の結合を阻害する。したがって、可溶性CTLA−4は、Tリンパ球の活性化を阻害する。外因性可溶性CTLA−4によるこの阻害の効力は、インビトロアッセイにおいて測定することができる。CTLA−4は、例えば、融合タンパク質として別の分子に場合によりコンジュゲートしていてよい。例えば、IgGFcが、本明細書の他箇所において記載のとおり存在し得る。アッセイを使用し、野生型CTLA−4(状況に応じて、Fcに場合によりコンジュゲートしている)を対照として使用してCTLA−4ポリペプチドが野生型よりも強力か強力でないかを定性的に測定することができ、効力の差の大きさに関する定量的情報も提供し得る。そのようなアッセイを実施する方法およびデータの統計的有意性を分析して定性または定量的情報を確実に生成する方法は、当分野において公知である。
CTLA−4ポリペプチドのCD80またはCD86結合親和性は、一価親和性として表面プラズモン共鳴を使用して測定してKDを決定することができる。結合親和性を計測し、KDを決定するための表面プラズモン共鳴の使用の実施例については実施例8を参照のこと。得られるKDは、野生型CTLA−4の配列番号35のものと比較することができ、またはCTLA−4ポリペプチド配列番号37(バリアント1322)、配列番号38(バリアント1321)、配列番号43(バリアント1299)、配列番号36(バリアント1315)、配列番号42(バリアント1115)、配列番号47(バリアント1227)もしくはNCIMBアクセッション番号41948のもとで寄託された核酸によりコードされるバリアント1299の1つのものと比較して相対親和性を決定することができる。CTLA−4ポリペプチドは、野生型CTLA−4の親和性と比較して大きいヒトCD86および/またはヒトCD80結合親和性を有し得る。
本明細書に記載のCTLA−4ポリペプチドは、CD80およびCD86の両方に結合し得るが、CD86に優先してCD80に選択的に結合し得る。野生型CTLA−4は、CD86と比較して大きいCD80結合親和性を有することが公知であり、本発明によるCTLA−4ポリペプチドも、CD86結合親和性よりも大きいCD80結合親和性を有し得る。しかしながら、CTLA−4ポリペプチドは、野生型CTLA−4と比較して大きい、CD86に優先するCD80結合選択性を有し得る。例えば、本明細書に記載の表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、野生型CTLA−4は、CD86結合親和性よりも約4倍大きいCD80結合親和性を示した。対照的に、CTLA−4ポリペプチドは、CD86結合親和性よりも10倍超、20倍超、30倍超、40倍超または50倍超大きいCD80結合親和性を示し得る。例えば、CTLA−4ポリペプチドは、CD86結合親和性よりも最大120倍または130倍大きいCD80結合親和性を示し得る。したがって、野生型CTLA−4の親和性と比較した場合、CTLA−4ポリペプチドは、CD86結合親和性よりもCD80結合親和性の大きい増加を示し得る。CD86を上回るCD80選択的優位性は、ヒトCD80およびヒトCD86について確認することができる。
CD80形質導入CHO細胞は、CD86形質導入CHO細胞と比較して増加したプライマリーヒトT細胞からのIL−2産生を誘導し(Slavik et al.JBC 274(5):3116−3124 1999);
CD80は、Jurkat T細胞中でCD86と比較して増加したNFκBおよびAP−1転写因子活性を誘導し(サイトカイン産生、例えば、IL−2に重要な因子)(Olsson et al.Int.Immunol.10(4):499−506 1998);
CD80は、ウイルス感染樹状細胞と相互作用するCD8+T細胞中でCD86と比較して増加したCD25発現を誘導し(T細胞の生存および増殖に重要)(Pejawar−Gaddy & Alexander−Miller J.Immunol.177:4495−4502 2006);
アレルギー喘息のネズミモデルにおいて、突然変異CTLA−4Ig分子を使用して、CD86ではなくてCD80が肺好酸球増加症の主なドライバーであることが見出された(Harris et al.J.Exp.Med.185(1)1997)。
好ましくは、本発明によるCTLA−4ポリペプチドは、野生型CTLA−4の交差反応性プロファイルを保持する。
CTLA−4ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも野生型CTLA−4の安定性を保持し、好ましくは、例えば、下記のとおりCTLA−4単独またはFc領域にコンジュゲート(例えば、融合)しているCTLA−4について計測されたときに野生型よりも安定である。
一実施形態において、本発明は、皮下または静脈内配合のための、および中程度から重度のRAまたは記載の他の病態の治療のための月1回、28日間隔以下の頻度の投与のための、延長された半減期を場合により有する(例えば、本明細書にさらに記載のYTE突然変異を含む)親和性最適化CTLA−4Ig分子を提供する。
CTLA−4ポリペプチドは、CTLA−4−Fcを含め、モノマーまたはマルチマー、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーまたはペンタマーであり得る。本明細書の他箇所において考察されるとおり、CTLA−4は、ダイマーを形成し得る。この天然ダイマー化は、CTLA−4をFcドメインまたは他のダイマー化ドメインにコンジュゲートすることにより増進することができる。
本明細書に記載のCTLA−4ポリペプチドアミノ酸配列を含み、またはそれからなるCTLA−4ポリペプチドを提供すること;
1つ以上の突然変異をアミノ酸配列中に導入してさらなるCTLA−4ポリペプチドを提供すること;ならびに
さらなるCTLA−4ポリペプチドの安定性、親和性および/または効力を試験すること
を含む方法である。
IgGFcアミノ酸配列の配列番号59にコンジュゲートしている、アミノ酸配列の配列番号43(バリアント1299)、配列番号37(バリアント1322)、配列番号38(バリアント1321)、配列番号36(バリアント1315)、配列番号42(バリアント1115)または配列番号47(バリアント1227)を含むCTLA−4ポリペプチド;および
1つ以上の医薬賦形剤
を含み、またはそれらからなっていてよい。
本発明のCTLA−4ポリペプチドは、月1回以下の頻度の投与により投与することができる。低頻度の投与は、一般に、患者および臨床医に対する負荷を低減させるために望ましいが、より低い治療有効性のリスクおよび/または製品用量の増加の必要性と関連し得る。本発明による効力、親和性および/または半減期の改善は、そのようなリスクを低減させ、従来の投与レジメンと比較して少ないまたは低頻度の投与の可能性を提供する。
大腸菌(Escherichia coli)DH5aバリアント1299=NCIMB41948
寄託日=2012年3月13日
CTLA−4Fc融合分子を生物学的効力を最適化するために使用される戦略は、2つの主要なアクティビティーからなるものであった。1つのアクティビティーは、CTLA−4ドメインの指向進化を実施してリガンドCD80およびCD86に対する改善された親和性、ならびにそのドメインの改善された安定性を選択するためのリボソームディスプレイの使用であった。リボソームディスプレイ選択からのアウトプットは、CTLA−4バリアントの多様な集団からなり、それを配列決定し、それらのコードユニーク配列をインビボT細胞刺激アッセイにおいて直接試験するためにFc融合相手とともに発現させた。このアプローチの利点は、多くの異なるCTLA−4バリアント(>1,000を試験した)を薬物様フォーマットで、すなわち、ダイマー化を増進するFcドメインに関して生物学的関連アッセイにおいて順位付けすることであった。この戦略の追加の特徴は、改善された生物学的機能に関連するCTLA−4突然変異の組換えを実施して相乗作用を介してさらなる効力の獲得を達成することであった。
リボソームディスプレイは、Swiss−ProtエントリーP16410、Fc領域が付属しない細胞外ドメインの残基38〜161に対応するモノマーヒトCTLA−4ドメインに対して実施した。この配列(配列番号35)は、野生型CTLA−4とも称される。CTLA−4リボソームディスプレイ構築物は、ヒトCTLA−4cDNAの要求部分を、リボソームディスプレイに要求される5’および3’調節エレメントを含有するベクター中にクローニングすることにより得た(Hanes et al,Meth.Enzymol.(2000)328:404)。この構築物は、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列の後に、CTLA−4コード配列の上流の原核リボソーム結合部位(Shine−Dalgarno配列)を含む。ヒトCTLA−4のダイマー化界面中のアミノ酸120(またはSwiss−ProtエントリーP16410におけるナンバリングによる157位)におけるシステインを、セリンに突然変異させ、他では改善されたCTLA−4配列の選択を妨げ得るリボソームディスプレイフォーマットにおけるCTLA−4分子のダイマー化を防止した。CTLA−4配列の下流で、線状ファージからの遺伝子IIIタンパク質の一部を、スペーサーとして作用するように含めてリボソームトンネル外へのCTLA4バリアントのディスプレイを可能とした。CTLA−4リボソームディスプレイ構築物は、ヌクレアーゼ分解に対するmRNAライブラリーの安定化を補助するためのmRNAレベルにおける5’および3’ステム−ループ配列も含有した。
上記のヒトCTLA−4リボソームディスプレイ構築物を、テンプレートとしても使用してエラープローンPCRを使用してランダムバリアントのライブラリーを生成した。エラープローンPCRは、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech)を製造業者の説明書に従って使用してCTLA−4遺伝子に適用した。反応を、分子当たり平均4つのアミノ酸突然変異および約2.5×1010のバリアント分子のライブラリーを与えるように調整した。このランダム突然変異誘発手順は、さらに選択プロセス中に取り込み、それを第3の選択ラウンドのアウトプットに適用してより多くの多様性をバインダーの濃縮集団に導入してからさらに選択した。
ヒトCTLA−4リボソームディスプレイ構築物をテンプレートとしても使用し、CD80およびCD86との相互作用に寄与する潜在性を有するCTLA−4分子の領域に標的化された突然変異誘発を有するバリアントのライブラリーを生成した。ヒトCTLA−4:ヒトCD80複合体(Protein Data Bank(PDB):1I8L)およびヒトCTLA−4:ヒトCD86複合体(PDB:1I85)の共結晶構造を試験して分子間、特にリガンドに近接するCTLA−4のアミノ酸側鎖間の結合相互作用を可視化した。アミノ酸59から65位(またはCTLA−4エントリーP16410のSwissProtナンバリングによる96から102位)を含むヒトCTLA−4タンパク質(配列番号35)の領域は、CD80およびCD86の方向に延びるループを形成することが確認された。この領域中の残基のそれぞれを、飽和(NNS)突然変異誘発を使用して完全にランダム化して約3.4×1010のバリアント分子のライブラリーを創成した。この「Loop4」ライブラリーは、重複オリゴヌクレオチド(配列番号33および配列番号34)を使用して標準的な技術により構築した。
ヒトCD80およびCD86へのヒトCTLA−4バリアントの改善された結合の選択を、Hanes et al(Meth.Enzymol.(2000)328:404)に記載のリボソームディスプレイ親和性ベース選択を使用して実施した。手短に述べると、CTLA−4バリアントDNAライブラリーを転写させ、次いで無細胞原核翻訳系中で翻訳させ、翻訳反応を停滞させて三元リボソームディスプレイ選択複合体(mRNA−リボソーム−タンパク質)を生成し、次いでそれをヒトCD80またはヒトCD86Fc融合タンパク質(R&D Systems)のいずれかとインキュベートした。CD80またはCD86結合複合体を、プロテインGコート磁気ビーズ(Dynal)とのインキュベーションにより捕捉し、結合三元複合体を磁気分離により回収した一方、未結合複合体を洗浄除去した。結合CTLA−4バリアントをコードするmRNAを逆転写およびPCRにより回収した。改善された結合を有するCTLA−4バリアントの選択をドライブするため、選択プロセスを、減少濃度のCD80またはCD86をいくつかのラウンドにわたり使用して繰り返した。
エラープローンPCRおよびLoop4指定ライブラリーからのCTLA−4バリアントの初回スクリーニング後、改善された活性に関連する突然変異を同定し、それを使用してさらなるCTLA−4バリアントを設計した。1つの戦略において、飽和(NNS)突然変異誘発を使用して配列番号35の16、25、58、70、85および93位(またはCTLA−4エントリーP16410のSwissProtナンバリングによる53、62、95、107、122および130位)が単一ライブラリー中で完全にランダム化されたホットスポット突然変異誘発ライブラリーを構築した。ライブラリーは、重複および突然変異誘発オリゴヌクレオチド(配列番号61から配列番号67(両端含む))を使用して創成した。次いで、このライブラリーを上記のとおり改善された親和性について選択した。
リボソームディスプレイ選択からのバリアントCTLA−4遺伝子を、ベクターpEU7.1中にクローニングした。このベクターは、IgG1Fc領域(配列番号56)とのインフレーム融合物としてのCTLA−4遺伝子の発現を可能とする。リボソームディスプレイアウトプットをPCR増幅させ、pEU7.1中にクローニングしてから大腸菌(E.coli)DH5−アルファ細胞中に形質転換した。PCRクローニングに使用されたオリゴヌクレオチドは、120位(Swiss−ProtエントリーP16410におけるナンバリングによる残基157)におけるセリンを野生型アミノ酸のシステインに復帰するようにも設計した。個々の形質転換体の配列決定後、ユニークなCTLA−4アミノ酸配列を有する合計1,000を上回るバリアントをタンパク質発現のために選択した。88のバリアントのバッチにおいて、コードプラスミドDNAを供給業者のプロトコル(Qiagen)に従って精製し、DNA濃度を使用して形質移入のための正確な量のDNAを計算することができるように分光光度法により260nmにおいて定量した。
3mlのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(ECACC)を、24ウェルプレート(Whatman 734−2558)の別個のウェル中で、25μMのL−メチオニンスルホキシイミン(Sigma M5379)を含有するCD−CHO培地(Invitrogen 10743−029)中で1ml当たり100万の細胞において播種した。細胞を含有する24ウェルプレートを通気性サンドイッチ蓋(Applikon biotechnology、Z365001224)により密封し、ディープウェルプレート(Applikon biotechnology、Z365001700)用クランプ中に配置した。細胞を250rpm、湿度80%、5%のCO2および37℃において振とうした。形質移入のため、3μgのプラスミドDNAを含有する50μlのNaCl 150mMを、21μgの直鎖25kDa PEI(Polysciences、23966)を含有する50μlと混合した。形成されたDNA−PEI複合体を細胞に添加し、複合体形成の開始と細胞への添加の間を15分間以下とした。形質移入から16から24時間後、細胞を300μl/ウェルのCD−CHO Efficient Feed B(Invitrogen A10240)の添加によりフィードした。プレートを、250rpm、湿度80%、5%のCO2および37℃においてさらに5から6日間振とうして成長培地中にタンパク質を発現させた。発現後、タンパク質を含有する使用済みの培養培地を3000rpmにおける10分間の遠心分離により澄明化した。Freedom Evo(登録商標)液体ハンドリングロボット(Tecan)を使用して澄明化された上清(1.2ml)を96ウェルフィルタープレート(3M Empore,12146036)に再分注した。残留細胞残屑を、真空ポンプおよびQIAvac 6Sバキュームマニホールド(Qiagen)を使用する濾過により除去した。1.8mlの澄明化された濾過上清を、PhyTip(RTM)プロテインA親和性カラム(Phynexus、PTP−92−20−01)、20μlの樹脂床容量)を使用してMinitrack(RTM)液体ハンドリングロボット(Perkin Elmer)により実施される精製のために処理した。PhyTip(RTM)カラムを500μlのNaP 20mM pH7.0によりコンディショニングした。次いで、PhyTip(RTM)カラムを、6×300μlバッチにおける粗製物上清を流すことによりロードし、200μlのD−PBS、200μlのNaP 20mM pH7.0により洗浄し、120μlの100mMのHEPES 140mMのNaCl pH3により溶出させ、20μlの1MのHEPES pH8.0により中和した。
Fc融合物としての個々のCTLA−4タンパク質のより大規模の調製のため、24ウェルプレート法に使用したものと同一の一般ステップを適用した。IgG1Fcへのインフレーム融合物としてのバリアントCTLA−4遺伝子を含有するプラスミドを大腸菌(E.coli)細胞から調製した。>100mgスケールにおけるタンパク質の調製のため、IgG1Fc遺伝子との直接インフレームでCTLA−4遺伝子を含有する構築物全体を、遺伝子合成により調製した。全ての場合、関心対象のタンパク質をコードするプラスミドDNAを調製し、発現のためにCHO細胞中に形質移入した。24ウェルプレートに代えて、より大きい容量の細胞を組織培養フラスコまたはウエーブバッグ(wave−bag)中で成長させてから培養物上清から精製した。ハーベストをプールし、濾過してからプロテインAクロマトグラフィーにより精製した。培養物上清を適切サイズのCeramic Protein A(BioSepra)のカラム上でロードし、50mMのTris−Hcl pH8.0、250mMのNaClにより洗浄した。0.1Mのクエン酸ナトリウム(pH3.0)を使用して結合IgGをカラム(oclumn)から溶出させ、Tris−Hcl(pH9.0)の添加により中和した。Nap10カラム(GE、17−0854−02)を使用して溶出した材料をPBSに緩衝液交換し、タンパク質のアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用してIgGの濃度を分光光度的に測定した。SEC−HPLCおよびSDS−PAGEを使用して精製されたタンパク質を凝集または分解について分析した。
本明細書に記載のスクリーニング戦略は、インビトロT細胞刺激アッセイにおける、Fc融合相手とともに発現された1,000を上回るCTLA−4バリアントの生物学的活性の計測を含んだ。全ての異なる突然変異誘発戦略(エラープローンPCR、標的化突然変異誘発、ホットスポット組換えおよび合理的組換えを含む)からのCTLA−4バリアントを、生物学的活性について試験し、同様にFc融合フォーマットで発現された野生型CTLA−4(配列番号35)に対するそれらの生物学的活性により順位付けした。
ヒト血液をCPT Vacutainer回収チューブ(BD Biosciences)中で回収し、400μlのCD4+RosetteSep精製試薬(Stem Cell Technologies)を添加した。20分間のインキュベーション後、チューブを1700gにおいて25分間回転させた。細胞を回収し、50mlのコニカルチューブに移し、350gにおいて10分間回転沈降させた。赤血球を、20mlのVitalize試薬中で再懸濁させ、30分から1時間インキュベートすることにより溶解させた。次いで、細胞を350gにおいて10分間回転沈降させ、T細胞培地(1%のAnti/Anti(Invitrogen)を補給したXvivo−15培地(Lonza))により1回洗浄した。1ml当たり100万の細胞のRajiおよびプライマリーヒトCD4+T細胞の懸濁液を完全T細胞培地中で調製し、96ウェルアッセイプレートに添加する直前まで別個に保持した。別個の96ウェルプレート(低タンパク質結合)において、CTLA−4バリアント分子の希釈物を、完全T細胞培地中で100μg/mlの初期濃度から出発し、12の1:5段階希釈を行って作製した。100μlのCTLA−4バリアント濃度のそれぞれを組織培養処理96ウェルアッセイプレートに分注した。RajiおよびヒトCD4+T細胞の細胞懸濁液を、1:1の比において混合し、抗CD3抗体(クローンUCHT1(BD Bioscience))を10μg/mlの最終濃度まで添加した。100μlの細胞懸濁液を、CTLA−4バリアントを含有するそれぞれのウェルに分注し、18から24時間インキュベートした。次いで、プレートを、350gにおいて5分間遠心分離し、上清を新たな96ウェルプレートに移すことによりハーベストした。ヒトIL−2Duosetキットを製造業者のプロトコル(R&D Systems)に従って使用してIL−2分泌を計測した。
2つの別個の動物からのカニクイザル血液をCPT Vacutainer回収チューブ(BD Biosciences)中で回収し、1700gにおいて25分間回転沈降させた。細胞を回収し、50mlのコニカルチューブに移し、350gにおいて10分間回転沈降させた。赤血球を、20mlのVitalize試薬中で再懸濁させ、30分から1時間インキュベートすることにより溶解させた。次いで、細胞を350gにおいて10分間回転沈降させ、T細胞培地(1%のAnti/Anti(Invitrogen)を補給したXvivo−15培地(Lonza))により1回洗浄した。別個の96ウェルプレート(低タンパク質結合)において、CTLA−4バリアント分子の希釈物を、完全T細胞培地中で100μg/mlの初期濃度から出発し、12の1:5段階希釈を行って作製した。100μlのCTLA−4Ig希釈物を組織培養処理96ウェルアッセイプレートに分注した。それぞれの動物からのPBMC細胞懸濁液を1;1の比において混合し、100μlの細胞懸濁液を、CTLA−4Ig希釈物を含有する全てのウェルに分注し、24時間インキュベートした。次いで、プレートを350gにおいて5分間回転させ、上清を新たな96ウェルプレートに移すことによりハーベストした。カニクイザルIL−2ELISAキットを製造業者のプロトコル(MABTech)に従って使用してIL−2分泌を計測した。
活性化HRP標識キット(Pierce)を使用してCTLA−4バリアントをセイヨウワサビペルオキシダーゼにより標識した。B7ファミリーメンバー(R&D Systems)の細胞外ドメインのFc融合タンパク質を、Maxisorpプレート(Nunc)上でPBS中5μg/mlの濃度において一晩コートした。プレートを1%のBSAによりブロッキングし、HRP標識CTLA−4バリアントを種々の濃度において添加し、発色基質(BD OptEIA基質、BD Biosciences)を使用して結合タンパク質の量を測定した。
抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)アッセイ
ヒト血液をCPT Vacutainer回収チューブ(BD Biosciences)中で回収し、1700gにおいて25分間回転沈降させた。細胞を回収し、50mlのコニカルチューブに移し、350gにおいて10分間回転沈降させた。赤血球を、20mlのVitalize試薬中で再懸濁させ、30分から1時間インキュベートすることにより溶解させた。次いで、細胞を350gにおいて10分間回転沈降させ、T細胞培地(1%のAnti/Anti(Invitrogen)を補給したXvivo−15培地(Lonza))により1回洗浄した。500,000のPBMCを200ulのXvivo−15培地中で種々の抗体およびFc融合タンパク質の存在下でプレーティングした。24時間のインキュベーション後、抗CD19抗体(BD Biosciences)および7−AAD(Molecular Probes)により染色することによりフローサイトメトリーを使用してBリンパ球生存率を測定した。生存B細胞の数は、CD19+および7−AAD−でもある前方/側方散乱特性による生存ゲート中の細胞の割合に500,000を乗じることによりそれぞれの試料について計算した。
ヒト血清を血清分離チューブ中で回収し、Xvivo−15培地に最終濃度10%w/vまで添加した。100,000のRaji B細胞を、種々の抗体およびFc融合タンパク質を含有する培地中で18時間インキュベートした。7−AAD(Molecular Probes)により染色することによりフローサイトメトリーを使用してRaji細胞生存率を測定した。生存細胞の数は、7−AAD−でもある前方/側方散乱特性による生存ゲート中の細胞の割合に100,000を乗じることによりそれぞれの試料について計算した。既に56℃において30分間加熱不活化されたヒト血清を含有する培地を対照として使用して補体介在性細胞傷害を確認した。TM改変を有する最も強力なCTLA−4バリアントの2つについてのエフェクター機能(ADCCおよびCDC)の無効化の実証を図5に示す。
CD80およびCD86試薬のクローニングおよび発現
ヒトおよびマウスからのCD80およびCD86の細胞外ドメイン(ECD)をコードするcDNA分子を、プライマー伸長PCRクローニングにより合成し、pDONR221(Invitrogenカタログ番号12536−017)中にクローニングした。ヒトおよびマウスCD80およびCD86についてのデータベース配列を使用した(表1参照)。カニクイザル配列は利用可能でなかったため、カニクイザルとアカゲザルとの間の予測される高い相同性に基づき、アカゲザルCD80(ensembleアクセッション番号ENSMMUG00000016367)およびCD86(ensembleアクセッション番号ENSMMUG00000000912)の配列を使用してカニクイザル中の遺伝子のコード配列を増幅させ得るプライマーを設計した。
CTLA−4:CD80およびCD86相互作用のSPR分析は、Biacore 2000 SPR装置上で実施した。約200RUのCTLA4バリアントを、CM5 Biacoreチップ(GE healthcareカタログ番号BR−1000−14)にアミンカップリングキット(GE healthcareカタログ番号BR−1000−50)を使用して第1級アミン基を介して共有結合させた。HBS−EP緩衝液(GE healthcareカタログ番号BR−1001−88)中のCD80およびCD86の用量調整物を、固定化CTLA−4バリアント上で流動させた。全てのトレースを二重参照減算した。会合および解離定数をフィットさせる1:1Langmuirモデルを使用するBiacore評価ソフトウェアを使用して分析を実施した。バリアントが極めて急速なカイネティックスを有した場合、平衡分析を実施した。
CTLA−4タンパク質の発現、精製および定量
Fcバリアント1から4と融合している天然CTLA4細胞外ドメインをコードするcDNAを、pEE12.4(Lonza)中にクローニングし、CHO細胞中で発現させた。手短に述べると、1×106のCHOK1SV細胞(Lonza)を、プログラムU−024および5mcgの線形化プラスミドDNAを有するSolution Vを使用するnucleofection(Lonza)により形質移入した。形質移入後、細胞をCD−CHO(Invitrogen)、1×GSサプリメント、および50μMのMSX中で培養した。細胞は形質移入から約2週間後に成長し始め、そのとき、それらをタンパク質産生のために振とうフラスコ中に拡張させた。精製のため、Mabselect捕捉ステップから出発し、次いでSuperQアニオン交換ポリッシングステップを行い、次いでSECを行って凝集物を除去する一連のステップを使用した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2中で貯蔵した。
異なるFcバリアントに融合しているCTLA−4分子に対して安定性試験を実施してそれらの安定性を比較し、最も安定なFc構成を決定した。試験された分子は:CTLA−4Fcバリアント−1(配列番号7);CTLA−4Fcバリアント−2(配列番号8);CTLA−4Fcバリアント−3(配列番号9);およびCTLA4Fcバリアント−4(配列番号10)を含んだ。Fcバリアント−1(配列番号57)、Fcバリアント−2(配列番号58)、Fcバリアント−3(配列番号59)およびFcバリアント−4(配列番号60)についてFc領域中のアミノ酸相違を図1Bで強調する。
Fcバリアント−3(配列番号59)に融合している最も強力なCTLA−4バリアント分子の6つに対して安定性試験を実施して最も安定なCTLA−4バリアントを決定した。このフォーマットで試験された分子は:バリアント1115(配列番号15)、バリアント1227(配列番号16)、バリアント1299(配列番号13)、バリアント1315(配列番号14)、バリアント1321(配列番号12)、バリアント1322(配列番号11)であった。
四価CTLA−4発現ベクターの設計および構築
ニトロフェノール結合IgG NIP74(重鎖配列番号17;軽鎖配列番号18)を足場として使用して、CTLA−4を抗体VHおよびVL鎖の両方のアミノ末端に融合することにより四価CTLA−4を産生した(図7A)。2ステップPCR戦略を使用してCTLA−4をVHおよびVLに融合し、次いでPCR産物を、抗体定常ドメインを含有するIgG発現ベクター中にサブクローニングすることにより発現構築物を産生した。一次PCRは、フレキシブルリンカーをCTLA−4の3’末端ならびにVHおよびVLの5’末端において付加する遺伝子特異的プライマー(配列番号21〜28)によりCTLA−4およびIgGVHおよびVLを増幅させた。二次「プルスルー(pull−through)」PCRは、相補的リンカー配列のアニーリングによりCTLA−4をVHおよびVLの5’末端に結合させた。最終CTLA−4−VH構築物は、BssHIIを5’末端において、およびBstEII部位を3’末端において導入するプライマー(配列番号29〜30)を使用して増幅させた。最終CTLA−4−VL構築物は、ApaLIを5’末端において、およびPacI部位を3’末端において導入するプライマー(配列番号31〜32)を使用して増幅させた。次いで、PCR産物をそれぞれの制限酵素により消化してからそれらを予め消化されたIgG発現ベクター(CTLA−4−VHカセットについてはpEU1.4、CTLA−4−VLカセットについてはpEU3.4)中に直接ライゲートし、それを使用して化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5−アルファ細胞を形質転換した。配列番号19および20に対応する正確なクローンを発現試験のために配列分析により同定した。
形質移入に要求されるプラスミド、CTLA−4重鎖融合物をコードするものおよびCTLA−4軽鎖融合物をコードするものの両方について、単一コロニーを使用して100μg/mLのアンピシリンを含有する100mlの2×TYブロスに植菌した。培養物を、37℃および300rpmにおいて一晩(16時間)インキュベートした。EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN;12362)を製造業者の説明書に従って使用してプラスミドDNAを細菌ペレットから単離した。形質移入の朝、CHO細胞を、25μMのL−メチオニンスルホキシイミン(Sigma;M5379)を含有するCD−CHO培地(Invitrogen;10743−029)中で1ml当たり100万の細胞において播種した。細胞を500mlの容量で培養し、37℃、140rpm、80%の湿度および5%のCO2においてインキュベートした。形質移入のためのDNA−PEI複合体を形成するため、250μgのそれぞれのベクターを混合し、150mMのNaCl中で希釈して1mlの最終容量で500μgのDNAを得た。次いで、DNAを1mlの5mg/mlのPEI(Polysciences;23966)と混合し、150mMのNaCl中で希釈し、室温において1分間インキュベートした。次いで、DNA−PEIミックスをCEP6培養物に慎重に添加し、次いでそれを24時間インキュベートしてから150mlのCD−CHO Efficient Feed B(Invitrogen;A10240)を添加した。次いで、培養物をさらに6日間インキュベートした。
Claims (11)
- 野生型CTLA−4の配列番号35と比較して大きいヒトCD80結合親和性、大きい効力および/または大きい安定性を有する単離CTLA−4ポリペプチドであって、配列番号35のバリアントであるアミノ酸配列を含み、前記バリアントは、配列番号35中の以下のアミノ酸突然変異を含む、前記ポリペプチド:
I16におけるR;
A24におけるT;
S25におけるN;
G27におけるS;
L58におけるA;
S70におけるA;
M85におけるQ;および
K93におけるQ。 - 野生型CTLA−4の配列番号35と比較して大きいヒトCD80結合親和性、大きい効力および/または大きい安定性を有する単離CTLA−4ポリペプチドであって、アミノ酸配列の配列番号43を含む、前記ポリペプチド。
- 野生型CTLA−4(配列番号35)よりも大きいヒトCD86結合親和性を有する、請求項1に記載のCTLA−4ポリペプチド。
- IgGFcアミノ酸配列にコンジュゲートしている、請求項1に記載のCTLA−4ポリペプチド。
- 前記IgGFcは、Fcエフェクター機能を低減させるように改変されたヒトIgG1Fcであり、天然ヒトIgG1Fcヒンジ領域を含む、請求項4に記載のCTLA−4ポリペプチド。
- 前記IgGFcアミノ酸配列は、配列番号59を含む、請求項4に記載のCTLA−4ポリペプチド。
- 核酸を含有する宿主細胞であって、前記核酸は、請求項1〜6のいずれか1項に記載のCTLA−4ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前記宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のCTLA−4ポリペプチド;および
1つ以上の医薬賦形剤
を含む組成物。 - 前記CTLA−4ポリペプチドは、配列番号59を含むIgGFcアミノ酸配列にコンジュゲートしている、請求項8に記載の組成物。
- 配列番号43のCTLA−4ポリペプチドアミノ酸配列の突然変異によりさらなるCTLA−4ポリペプチドを産生する方法であって:
アミノ酸配列の配列番号43を含み、またはそれからなるCTLA−4ポリペプチドを提供すること;
1つ以上の突然変異を前記アミノ酸配列中に導入してさらなるCTLA−4ポリペプチドを提供すること;および
前記さらなるCTLA−4ポリペプチドの安定性、親和性および/または効力を試験すること
を含む、前記方法。 - 前記さらなるCTLA−4ポリペプチドがFc領域にコンジュゲートしている、請求項10に記載の方法。
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