JPH08504573A - 過剰増殖性細胞の複製阻害方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、異常過剰増殖性ヒト細胞をその非悪性表現型に転換する方法に関する。この方法は、この細胞中にアデノウイルスE1A活性を有するポリペプチドをコードする核酸を導入すること、およびこのポリペプチドが生産されるような条件下で細胞を生育させることを包含する。本発明はまた、被験体中の異常過剰増殖性細胞の集団を、この過剰増殖性細胞のすべてではなく一部分で、アデノウイルスE1A活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列を発現させることにより、非過剰増殖性状態に転換する方法に関する。さらなる局面では、本発明は、異常過剰増殖性細胞の分化の促進に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 過剰増殖性細胞の複製阻害方法 本発明は、一部米国国立衛生研究所（NIH）認可7-R29-GM44573-03および研究 所援助許可基金番号第1-17071-6460からの援助でなされた。合衆国政府は本発明 において特定の権利を有する。 発明の背景 アデノウイルスは、ヒト細胞が天然の宿主である大きなDNAウイルスである。 実際に大抵の成人はある時期にアデノウイルスに感染したことがあり、主要な影 響は風邪に似た症状である。アデノウイルスは、げっ歯類においてその腫瘍遺伝 子作用のために、単に「DNA腫瘍ウイルス」と呼ばれる。アデノウイルスゲノム の発現は２段階で起こる。まず、E1AおよびE1B遺伝子をコードする初期遺伝子産 物が発現される。これらの産物は、後期遺伝子産物の発現に必要である。後期遺 伝子産物は、複製に必要なタンパク質およびウイルス構造タンパク質をコードす る。 アデノウイルスのE1A遺伝子によりコードされるタンパク質は、主に２つの観 点から研究されている。第１に、E1Aの243アミノ酸および289アミノ酸形態（243 アミノ酸タンパク質は289アミノ酸タンパク質のサブセットであるようにRNA前駆 体の 別のスプライシングから生じる）は、両者とも転写制御タンパク質である（J．F lint、T．Shenk、Ann. Rev. Gen. 23:141-161（1989））。第２に、これらのタ ンパク質は、他の腫瘍遺伝子により特定のけっ歯類細胞の腫瘍遺伝子形質転換を 促進し（H.E. Ruley、Nature 304:602-606（1983））、そして、このようにE1A は、一般に腫瘍遺伝子として分類される。E1Aタンパク質と種々の定義された細 胞性タンパク質との相互作用は、げっ歯細胞において、その腫瘍遺伝子作用を仲 介すると信じられている（J.M. Howeら、Proc. Natl. Acad. Sci. 87:5883-5887 （1990））。 ヒト細胞において、E1Aは、細胞系を形質転換するために他の腫瘍遺伝子と協 同するようには見えないが、しかし、弱い腫瘍形成性作用が２つの例でのみ報告 されている。例えば、胎児腎臓（F. Graham、J. Smiley、W. Russell、R. Nairn 、J. Gen. Virol. 36:59-72（1977））および胎児網膜芽細胞系（P.J. Byrd、K. W. Brown、P.H. Gallimore、Nature 298:67-71（1982））は安定にE1Aを発現し 、マウス中に注射されるとき弱い腫瘍形成性を有する。さらに、これらの形質転 換体は、E1Aと別の腫瘍遺伝子との同時トランスフェクション後に非常にまれに 生ずる。 細胞の正常および形質転換表現型は、腫瘍遺伝子および抗腫瘍遺伝子（腫瘍抑 制遺伝子）によりコードされる活性のバランスにより維持されると考えられる。 機能的な腫瘍抑制遺伝子産物の非存在は発癌に寄与する。逆に、これらの産物の 置 換または過剰発現は、腫瘍細胞の成長を調節することにおいて有用であることが 考えられる。現在のところ、限られた数の腫瘍抑制遺伝子が特徴付けられている に過ぎず、著名には、網膜芽細胞腫タンパク質（Huangら、Science 24:1563-156 6（1988））およびp53（Chenら、Science 250:1566-1570（1990））がある。し かし、腫瘍細胞に再導入されたとき、これらの両遺伝子産物は単に細胞を死滅さ せるのみである。 文献中の２つの報告がE1Aの腫瘍抑制作用を述べている。しかし、これらの作 用は両方とも、E1A発現の調節作用に関連しない付帯現象から生じた。E1Aで安定 にトランスフェクトされたラット肉腫細胞は、ヌードラットにおいて、それらの トランスフェクトされない相当物より腫瘍形成性でない（T.A. Walker、B.A．Wi lson、A.M. Lewis、J.L. Cook、Proc. Natl.Acad. Sci.，88:6491-6495（1991） ）。E1A発現細胞の腫瘍形成性の低下は、これらの細胞をナチュラルキラー細胞 による細胞溶解に感作させた結果であり、そしてこれらの細胞はなおヌードマウ スにおいて腫瘍形成性であった。第２の報告（D.Yu，K. Scorsone、M.C. Huang 、Molec. Cell Biol. 11:1745-1750（1991））は、E1Aがneuとして知られる腫瘍 遺伝子がマウス細胞系3T3の形質転換を妨げることを示した。E1Aはこのことを、 単にneuの発現を転写レベルで阻害することにより達成した。E1A耐性遺伝子プロ モーターを利用するキメラneu遺伝子でトランスフェクトされた3T3細胞は、E1A の存在下でさえ、なおneuにより形質転換された。上記の観察により示される様 式で腫瘍増殖を抑制するE1Aの使用は、腫瘍中のすべての細胞においてE1A発現を 必要とし得る。この要求は、所望の遺伝子を細胞集団の100%中に導入するための 技術が存在しないので、治療のための腫瘍抑制遺伝子の使用では実施を極度に制 限する。これらの欠点を考慮すると、腫瘍抑制遺伝子を用いて過剰増殖性（hype rproliferative）細胞の非調節的な複製を阻害する戦略は、まだ浮かび上がらな い。 このように、優勢に細胞成長に影響を及ぼす能力を付与された細胞の小サブ集 団によって細胞集団の過剰増殖を制御する必要性がある。本発明は、この必要性 を満足しそして関連する良好な利点を提供する。 発明の要旨 本発明は、異常過剰増殖性（pathologic hyperproliferative）ヒト細胞をそ の非悪性の表現型に転換する方法に関する。この作用は、neu以外の腫瘍遺伝子 により形質転換される細胞中でさえ生じる。この方法は、細胞に、アデノウイル スE1A活性を有するポリペプチドをコードする核酸を導入する工程、およびこの ポリペプチドが生産されるような条件下で上記細胞を生育させる工程を包含する 。本発明はまた、この過剰増殖性細胞のすべてではなくいくつかにおいて、被験 体中の異常過剰増殖性細胞集団の成長を、アデノウイルスE1A活性を有するポリ ペプチドをコードする単離された核酸配列を発現させることにより、阻害する方 法に関する。さらなる局面では、 本発明は、異常過剰増殖性細胞の分化の促進に関する。 図面の簡単な説明 図１。E1Aがトランスフェクトされた腫瘍細胞で安定に発現され得ることを示 す。安定にトランスフェクトされた細胞および親の細胞系からのE1Aタンパク質 の免疫沈降を示す。HT1080細胞（レーン1-5）、HeLa細胞（レーン6-8）、または A2058細胞（レーン9-11）に由来するE1A発現クローンからの［³⁵S］メチオニン 標識タンパク質を、抗E1A抗体（E）またはコントロール抗体（C）で免疫沈降し た。レーン：1-5、それぞれ、HT1080、p2AHT2a、plAneo3、p1Aneo15、およびp1A neo16：6-8、それぞれ、HeLa、Medg18、およびMedg28：9-11、それぞれ、A2058 、1A58c8-1、および1A58c11-1。E1Aタンパク質種に相当するバンドを括弧内に示 す。 図２。E1A発現細胞が、平坦な接触阻害された形態に転換することを示す。親 ヒト腫瘍細胞（上列）、ネオマイシン耐性トランスフェクトヒト腫瘍細胞（中列 ）、およびE1A発現ヒト腫瘍細胞（下列）の位相差顕微鏡写真を示す。下列は、H T1080neo^rおよびE1A発現HT1080の軟寒天上のコロニーの光学顕微鏡写真である。 図３。E1A発現が、トランスフェクト腫瘍細胞において、足場非依存性成長（ 軟寒天コロニー形成）の損失を引き起こすことを示す。親ヒト腫瘍細胞、ネオマ イシン耐性トランスフェクトヒト腫瘍細胞、およびE1A発現ヒト腫瘍細胞の軟寒 天コロ ニー形成アッセイを示す。 図４。E1Aがヒト腫瘍細胞の腫瘍形成性を低下させることを示す。ヌードマウ スにおける親腫瘍細胞（HT1080、A2058、およびHeLa）およびE1A誘導体の腫瘍形 成性を示す。 図５。E1Aコード配列のDNA配列（cDNA）（配列番号１〜４）。下段：243アミ ノ酸配列（配列番号１および２）。上段：289アミノ酸配列（配列番号３および ４）。 図６。逆形質転換（reverse-transforming）レトロウイルス構築物の構造。E1 A（12S cDNA）の243アミノ酸形態を、アデノウイルス地図位置610で、BstX1を用 いて切断し、そして5’末端を２本鎖オリゴヌクレオチドで再構築し、このよう に、すべてのE1A 5’非コード配列を除去した。このオリゴヌクレオチドのHindI II末端を平滑末端としそしてE1Aの3’末端をHpaI（地図位置1575）で切断してポ リA付加部位を除去した。得られたE1A配列をレトロウイルスベクターLNSX中にサ ブクローニングした（MillerおよびRosman、Biotechniques 7:980-990（1989） ）。次いで、レトロウイルスを上記テキストに記載のようにパッケージングした 。 発明の詳細な説明 本発明は、アデノウイルスE1A遺伝子が、予想に反して、ヒト腫瘍細胞の表現 型に対して、それらの接触阻害特性を回復し、そしてそれらの分化を促進するよ うに作用するいう観察から得られる。この作用は、neu以外の腫瘍遺伝子によっ て形 質転換した細胞でさえ起こる。アデノウイルス5 E1A遺伝子の安定した発現は、 足場非依存性成長および腫瘍形成活性を減少させ、再組織化を促進し、平坦形態 を誘導し、そしてヒト腫瘍細胞系で接触阻害を回復する。これらの基準により、 E1Aは、このヒトの系（context）で腫瘍抑制遺伝子として機能する。E1Aが他の 腫瘍遺伝子と協同してげっ歯類細胞を形質転換することができるという観察によ り与えられた明らかな逆説は、E1Aが上記の特定の形質転換および抗腫瘍遺伝子 活性を有するあるクラスの成長制御タンパク質の始原型であり得ることを示唆す る。 これらの予期されない観察は本発明の基礎を提供し、この観察は、１つの実施 態様で、異常過剰増殖性哺乳動物細胞を逆形質転換するための方法を提供する。 細胞を、E1A活性を有するポリペプチドをコードする有効量の核酸と、その核酸 がこの細胞に導入されるような条件下で接触させる。次いで細胞を、ポリペプチ ドを発現させるような条件下で生育させる。この方法は、インビトロまたはイン ビボで実施され得る。 本発明により、異常な組織中に位置する過剰増殖性細胞の形質転換表現型を、 例えば、E1A活性を有する単離された核酸であるレトロウイルスベクターを用い て形質移入することにより逆転させる方法が提供される。形質移入ベクターは、 直接注入または他の適切な適用により導入され得る。このような逆形質転換細胞 は、近隣の非形質移入細胞の成長を阻止し得る。 あるいは、本発明により、被験体において異常過剰増殖性細胞の集団を逆形質 転換する方法が提供され、この方法は、被験体から適切な細胞試料を得る工程、 この細胞を、E1A活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む適切なレト ロウイルスベクターと、核酸を細胞にトランスフェクトさせる間接触させる工程 を包含する。次いで、これらの細胞を上記核酸が発現されるような適切な条件下 で生育させる。次いで、活性発現細胞を被験体中に再注入する。 本明細書で使用する用語「過剰増殖性」は、細胞に関して言えば、自律成長能 力、即ち、正常の制御メカニズムとは独立に存在しそして増殖する能力を有する これらの細胞を含むが、これらに限定されない。過剰増殖性疾患は、病原性、即 ち、疾患状態を特徴付けまたは構成するとして分類され得るか、または、非病原 性、即ち、疾患状態を伴わないが正常から逸脱しているとして分類され得る。「 異常過剰増殖性」細胞は、乳癌、肉腫および他の新生物、膀胱癌、大腸癌、肺癌 、種々の白血病およびリンパ腫を含むがこれらに限定されない悪性の腫瘍成長に より特徴付けられる疾患状態で生じる。さらに、この用語は、甲状腺肥厚および 良性前立腺肥大のような状態に適用され得る。非異常過剰増殖性細胞の例は、例 えば、胎児組織中、乳汁分泌の進展の間の乳管上皮細胞中で見い出され、そして また創傷修復を伴う細胞に見い出される。異常過剰増殖性細胞は、特徴的に接触 阻害の損失、ならびに細胞の表面特性の変化および細胞間伝達のさらなる破壊を 示 すそれらの選択粘着能の低下を示す。 E1Aの配列は図５に提供される（配列番号１〜４）。E1A遺伝子産物は、悪性細 胞で発現するとき、得られる細胞が近隣の腫瘍細胞の成長を阻害し得るような表 現型に転換する能力を有する。そのような能力を本明細書ではE1A活性と呼ぶ。 本発明は、E1A、E1A活性を保持する天然配列に対するその機能的なサブユニット およびフラグメントおよび改変体を意図する。 本明細書で使用される用語「核酸」は、DNA、RNA、またはcDNAを意味する。用 語「E1A活性を有するポリペプチド」は、アデノウイルスE1A遺伝子産物の生物学 的活性を有する任意のアミノ酸配列を包含する。本発明の好ましい実施態様では 、このアミノ酸配列は、図５に示されるように、アデノウイルスE1A遺伝子の243 アミノ酸ポリペプチド産物（配列番号１および２）である。この243アミノ酸ポ リペプチドの機能的等価物はまた、本明細書で提供されるような接触阻害の促進 に特異的に影響し得るポリペプチドである。 本明細書で使用される用語「導入する」は、細胞中に外因性核酸分子を挿入す る任意の方法を包含し、そして宿主細胞の形質移入、トランスフェクション、マ イクロインジェクション、およびウイルス感染を含む。これらの手法を実施する 方法は当業者に公知である。本発明の好ましい実施態様では、上記核酸は、細胞 と上記核酸を含むレトロウイルスベクターとを、上記核酸が細胞中に挿入される ような条件下で接触させることにより細胞中に導入される。本発明の最も好まし い 実施態様では、上記ウイルスは複製不能レトロウイルスである。複製不能レトロ ウイルスは、ウイルスタンパク質を生産する能力を有さず、感染宿主細胞中でこ のベクターの拡散を妨害するウイルスとして定義される。本発明の実施に有用な ベクターの例は、当業者に周知であり、容易に入手可能である。 本発明で有用な単離された核酸は、アデノウイルスゲノムのE1A領域によりコ ードされるポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸である 。本発明の好ましい実施態様では、上記単離された核酸はアデノウイルスE1A領 域である。この領域は、当業者によりヌクレオチド560からヌクレオチド1542ま でであると定義される。 本発明はまた、新規な形態の癌治療を提供する。以前であれは、腫瘍細胞を死 滅させるための標的の抗癌遺伝子または薬剤が、100%の細胞が薬剤に曝され、遺 伝子を発現させるようにされる場合のみ、腫瘍を根絶するのに有効であった。こ の一定した曝露は、インビボであってもまれにしか達成されない。本発明の単離 された核酸を発現するようにトランスフェクトされた悪性細胞は、優勢に近隣の 腫瘍細胞の成長を妨害し得る。このように、小部分の悪性細胞を転換することに より、腫瘍が効果的に根絶されまたは阻害され得る。 以下の実施例は例示を意図しており、本発明を制限する意図はない。 実施例Ｉ 材料および方法 A2058黒色腫細胞およびHT1080線維肉腫細胞からの安定なE1A発現細胞系を、本 明細書に参考として援用されるFrischら、Oncogene 5:75-83（1990）中に記載さ れるように、プラスミドplAneoを用いて構築した。本明細書に参考として援用さ れるBrunetおよびBerk、Mol. Cell. Blol. 8:4799-4807（1988）に記載されるよ うに、E1A発現HeLa細胞は、L. BrunetおよびA. Berk（University of Californi a、Los Angeles）から得た。標識されたHT1080neo^rおよびA2058neo^r細胞は、シ ミアンウイルス40初期エンハンサー促進aph遺伝子（G418耐性をコードする）を 含むBluescriptプラスミド（Stratagene、La Jolla、CA）を用いたトランスフェ クションから得られた。 本明細書に参考として援用されるFreedmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7 2:4435-4439（1972）およびTuckerら、Cancer Res. 37:1571-1579（1977）に記 載のように、細胞を、60mmプレートあたりの細胞数、４×10⁴個（A2058および誘 導体）、３×10⁴個（HeLaおよび誘導体）、または２×10⁵個（HT1080および誘導 体）で塗抹し、そして14〜17日インキュベートした後、p-インドニトロテトラゾ リウムバイオレット（0.5mg/ml）を用いて16時間染色した。 細胞を、４〜５週齢の無胸腺症ヌードマウス（Harian-Sprague-Dawley）に、0 .25mlのリン酸緩衝生理食塩水中で、示された細胞数で注入した。細胞系あたり ９匹のマウスに注入し、 そして腫瘍を、示されたインキュベーション時間で解剖した。 細胞系の集密培養（２×10⁶個の細胞を含む）を、５%（vol/vol）透析ウシ胎 児血清を含有する無メチオニンダルベッコ改変イーグル培地中で、0.4mCi(1 Ci= 37 GBq）の［³⁵S］メチオニン（Tran³⁵S-ラベル、ICN）を用いて、35mmウェルで ５時間標識した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、そして1.0mlのRIP A-1［50 mM Tris-HCl、pH7.5/0.1% Nonidet P-40/250mM NaCl/アプロチニン（10 μg/ml）ロイペプチン（5μg/ml）1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド/5 mM EDTA/ダイズトリプシンインヒビター（10μg/ml）］中にかきとった。ウシ 血清アルブミンを0.5mg/mlまで添加した後、溶解液を、100μlの50%（wt/vol） プロテインＡ−セファロース（Pharmacia）スラリー（ウシ血清アルブミンを0.5 mg/mlで含むRIPA-1中で調製）を用いて４℃で30分間混合しそしてエッペンドル フ微量遠心分離器中で14,000rpmで10分間遠心分離することにより予備吸収し、 次いで0.5mlの試料を、1.5μgの抗E1Aモノクローナル抗体M73（12）またはコン トロール抗体［抗fosAb-1（Oncogene Sciences、Mineola、NY）］と０℃で２時 間インキュベートした。次いで、25μｌの50%プロテインA-セファローススラリ ーを添加し、そしてこのチューブを４℃で20分間混合し、その後２分間遠心分離 し、0.5mlのRIPA-1を用いて５回洗浄した。次いで、ペレットを60μｌの試料緩 衝液中に再懸濁し、そしてSDS/PAGEを用いて分析した。 実施例II 悪性細胞の逆形質転換 E1A遺伝子の発現を、本明細書に参考として援用されるFrischら、Oncogene 5: 75-83（1990）ならびにBrunetおよびBerk、Mol. Cell. Blol. 8:4799-4807（198 8）に記載のように、ノーザンブロット分析によりRNAレベルで立証した。そして 、本研究では、タンパク質発現を、E1A特異的モノクローナル抗体を用いた免疫 沈降により立証した（図１）。複数種のE1Aタンパク質がゲル上で検出された。 各場合において、E1Aトランスフェクト細胞は、それぞれの親細胞系またはaph 遺伝子単独でトランスフェクトされた細胞系と比較すると、比較的平坦であり、 「上皮様」である（図２Ａ）。これらの形態変化は、EdelmanおよびYahara、Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 73:2047-2051（1976）に記載されるように、形質転換 細胞は、正常細胞に比べてより屈折性であり、そしてより基質付着性ではない傾 向があるという広く報告された観察と一致する。この形態変化は、コロニーが最 初G418選択プレート上で同定されたときに観察され、表現型変化の誘導にはゲノ ム中の２次的な確率的な変化を必要としないことを示唆する。 表１ ヌードマウスにおける親腫瘍細胞（HT1080、A2058、およびHeLa）およびE1A誘導 体の腫瘍形成性 インビボでの細胞の腫瘍形成性は、一般に、足場非依存性コロニーを形成する それらの能力と相関する（Shinら、Proc. Natl. Acad. Scl. USA 72:4435-4439 （1972）およびTuckerら、Cancer Res. 37:1571-1579（1977）、これらは本明細 書に参考として援用されている）。足場非依存性成長を試験するために、細胞系 を軟寒天中に固定細胞数で塗抹し、そしてコロニー形成をモニターした。親腫瘍 細胞系は軟寒天中でコロニーを形 成したが（=１%効率）、これらの細胞系に由来するE1A発現クローンはコロニー を形成しなかった（図３）。事実、顕微鏡検査により、E1A発現クローンは軟寒 天上でコロニー形成の開始さえ行わないことが明らかとなり、成長速度の影響で あることは除外される。コロニー抑制表現型は、aph遺伝子単独でトランスフェ クトされそしてG418耐性に対して選択された15の別個のHT1080クローン間では決 して観察されなかった；これらの結果は、軟寒天コロニー抑制は、E1A遺伝子の 影響であって、選択過程の影響ではないことを示す。これらの観察は、E1A発現 が、ヒト腫瘍細胞を成長について足場依存性の表現型に転換し得ることを示す。 E1A発現がヒト腫瘍細胞系をインビボで非腫瘍形成性にするか否かを試験する ために、それらを無胸腺症ヌードマウスに皮下的に注入し、そして腫瘍形成をモ ニターした（図４）。親細胞系は、15〜17日のインキュベーション時間で大きな 腫瘍を形成した。対照的に、E1A発現A2058およびHT1080細胞は、検出不能または 非常に小さな腫瘍を生成した。E1Aのみでは、HeLa細胞において腫瘍形成性を部 分的に抑制したが（４倍）、これはおそらく、E1A遺伝子を駆動していたグルコ コルチコイド依存性のネズミ乳房腫瘍ウイルスプロモーターからの転写が、皮下 環境で補償されたためである。 さらに、E1Aが単に成長速度を遅延することによって、短時間では軟寒天コロ ニーおよび腫瘍が検出不能となったという可能性を排除するために、成長曲線を 作図した。E1Aは、集密 以下の腫瘍細胞の成長速度に実質的に影響しなかった。 腫瘍壊死因子αによる溶解に対しE1Aが特定の細胞を感作できることにより、 腫瘍抑制が増大された可能性もまた考えられた。しかし、⁵¹Cr標識p2AHT2a細胞 は、500単位/ml（感受性げっ歯類細胞のほぼ100%を死滅させるに十分な用量）の 腫瘍壊死因子αで、親HT1080細胞より18%だけ多い溶解が与えられただけであり 、これはあり得そうになかった。 このことは、ヒト細胞におけるE1Aの表現型への影響が記載された最初である 。本明細書で報告された実験は、E1Aが３つの別個のタイプのヒト腫瘍細胞を、 表現型では非形質転換状態に転換することを立証した。逆説的に言えば、アデノ ウイルスE1Aの表現型への影響は、主要なげっ歯類細胞を形質転換する、ras腫瘍 遺伝子との共同である。特定のげっ歯類細胞型がE1Aにより抗腫瘍遺伝子的に影 響されるようになり得るので、この不一致を種の違いのみによるとするのは、特 に、自然に形質転換されたげっ歯類細胞系におけるE1A発現の影響が報告されて いないので早計であり得る。 実施例III 接触阻害による腫瘍細胞成長の阻害 本実施例は、E1A発現により逆形質転換細胞との接触阻害によって、ヒト腫瘍 細胞の非調節的複製を阻害する方法を記載する。 E1Aウイルス発現ベクターの構築は、アデノウイルスタイプ ５の243アミノ酸（配列番号１および２）または289アミノ酸（配列番号３および ４）E1Aタンパク質をコードするcDNAをレトロウイルスベクター：LNCX、LNSX中 にサブクローニングすることにより達成した。（ベクターの記載については、Mi llerおよびRosman、Biotechniques 7:980-990（1989）を参照のこと；プラスミ ド構築の詳細については図６に記載している）。これらプラスミドDNAの10μgを 、実施例IIと同様にして、エコトロピック（ecotropic）パッケージング細胞系g pE86（ヒグロマイシン/ミコフェノール酸選択培地中に維持）にトランスフェク トした。トランスフェクションの48時間後、非選択のウイルスストックを、調製 培地を集め、遠心分離および凍結により清澄化することにより調製した。これら のウイルスストックを、35mmウェル中で、４μg/mlのポリブレンを含むDME/10% ウシ胎児血清培地中で12時間インキュベートすることにより、両栄養性（amphot ropic）パッケージング細胞系gpEam12（細胞はATCCから入手可能）を感染させる ために用いた。感染後24時間で、細胞を1:100〜1:300の比に分割し、そして感染 細胞を500μg/ml G418中で３週間の間選択した。ウイルス生産細胞系を35mmウェ ル中に広げ、そしてウイルスを含む調製培地を各系について調製した。ウイルス ストックを、ベクターLNCXおよびLNSX（これらは内部CMVまたはSV40初期エンハ ンサーを用いる転写をそれぞれ促進する）において、243アミノ酸E1Aまたは289 アミノ酸E1Aのいずれかを含む生産細胞系から調製した。 0.4mlのウイルスストックを、ポリブレンを含む培地中で3 5mmウェル中のHT1080細胞と８時間インキュベートすることにより、これらのス トックをヒト線維肉腫系HT1080を感染させるために用いた；感染後24時間で、感 染細胞を種々の比に分割し、そしてG418耐性クローンまたは感染細胞の混合集団 のいずれかをさらに分析した。 この結果は以下のようであった。ウイルスストックのいくつかで感染させた培 養物においては、非感染のコントロールと比べ形態的に変化はなかった。ウエス タンブロットは、おそらく生産細胞系中のレトロウイルスDNA配列の再配置の結 果として、これらの感染培養物がE1A発現については陰性であることを示した。 LNSXベクターにおけるE1Aの243アミノ酸型をコードするウイルスストックの１ つ（特に4/LNSX8）では、本質的に100%の細胞が、E1Aトランスフェクト細胞の形 態に非常に似た形態に転換した（図２参照）。インキュベーションを延長すると 、これらの細胞は、その上皮様形態を維持し、そして単層ステージを超えては成 長せず、成長の接触阻害を示唆した。これらの細胞は、リン酸カルシウムトラン スフェクト細胞系で見られるレベルに匹敵する細胞あたりのE1Aタンパク質量を 発現したが、このE1Aのすべてが、期待されたように243アミノ酸型であった。 他のウイルスストックでは、G418選択後、「形質転換形態」および「E1A形態 」クローンの混合物が注目された。重要なことに、より長いインキュベーション では、これらの培養物は、 結果的に（感染後２〜３週）ほぼ100%で「E1A形態」；即ち、上皮様の接触阻害 細胞に転換した。 後者の現象は、E1Aを発現する細胞が互いに接触阻害することを示す。それら はまた、腫瘍細胞を接触阻害する。腫瘍細胞は、期待されたように接触阻害信号 を「送信」し得ないが、「受信」し得そしてそれらに反応し得ることは、この観 察に一致する。これらの分化信号応答は、結果的に上段落中に記載された結論を 生じる。このように、細胞の一部分（そして全集団内でない）でE1Aを発現させ ることにより、接触阻害が過剰増殖性細胞集団内で達成され得る。 癌治療の重要な分岐を担う概念の進歩は以下のようである。腫瘍細胞を死滅さ せるための標的の遺伝子または薬剤は、100%の細胞が薬剤に曝されるか、または この遺伝子を発現させるようにされる場合にのみ、腫瘍を根絶するのに効果的で ある。この条件は、インビボであっても、まれにしか満足されない。E1A発現細 胞は、近接する腫瘍細胞の成長を優勢に阻害し得、そして腫瘍において細胞の小 部分にE1Aを発現させるようにすることにより、腫瘍を根絶し得る。レトロウイ ルスベタクーによるE1Aの送達がこの効果を達成し得る。E1Aは、現在特徴付けら れている腫瘍抑制遺伝子の中で、唯一、それが導入される細胞の生存を維持し、 そしてこの特性は、腫瘍成長を根絶するために利用され得る。 実施例IV 分化におけるE1Aの影響 野生型243アミノ酸E1A遺伝子を有するレトロウイルスを以下のように構築した 。プラスミド12Swt（Moranら、Mol. Cell. Biol. 6:3470-3480（1986））からの BstXI−PstI部分消化フラグメント（アデノウイルス地図位置610-1835を含む） を、アデノウイルス地図位置555-610を含む合成オリゴヌクレオチド（合成5'Hin dIII末端を有する）ならびにHindIIIおよびPstIで切断したBluescriptと、３方 向連結した（three-way ligated）。これにより、アデノウイルス由来の上流配 列なしで、完全243アミノ酸コード配列を含むプラスミドが生成された。次いで 、このプラスミド由来のHindIII-HpaIフラグメント（555-1575）（これはElaか ら3'ポリアデニル化配列を除去）をKlenow酵素で平滑末端とし、そしてレトロウ イルスベクターLNSX（MillerおよびRosman、前出、この文献は参照により本明細 書に援用されている）のStuI部位にサブクローニングした。パッケージング細胞 系gpE86を、このプラスミドで一時的にトランスフェクトし、そして得られたウ イルスストックを、両栄養性パッケージング細胞系gpEam12を感染させるために 用いた。G418（500μg/ml）耐性生産細胞系を、感染HT1080細胞にE1A発現を与え る能力についてウエスタンブロットによりスクリーニングした。 H88T1080線維肉腫細胞の同種性サブクローンであるH4を、４μg/mlポリブレン を含む成長培地中で、ウイルス上清液で ８時間感染させることにより、アデノウイルス５遺伝子を発現するようにした。 感染24時間後、細胞を再塗抹し、そして２〜３週間500μg/ml G418で選択した。 コロニーを釣り上げ、増殖させ、そして抗体M73（Oncogene Science）を用いる ウエスタンブロットによりEla発現についてスクリーニングした。 他の腫瘍細胞系を、同様の方法で、Elaを発現するようにした。位相差顕微鏡 観察は、HT1080細胞（ATCC受託番号CCL121）、A2058黒色腫細胞、Saos2骨肉腫細 胞、および正常線維芽細胞のすべてが、Ela遺伝子の導入および発現後、上皮型 の形態をとったことを示した。 電子顕微鏡観察をEla発現H4細胞において行い、そしてそれらが、固い結合お よびデスモソームのような上皮特異的結合構造を含むことが見い出された。 免疫蛍光法をまた、カバーグラス上で成長させたアセトン固定化細胞において 実行した。抗デスモプラキン（desmoplakin）抗体NW6（K. Green、Northwestern University）との反応後、細胞をローダミン標識抗マウス抗体と反応させ、そ してzeiss Axiovert蛍光顕微鏡で観察した。真性の上皮細胞のデスモソームに非 常に似た、抗体で標識された構造が、H4細胞のEla発現誘導体で観察されたが、 親H4細胞では観察されなかった。 本発明を開示される実施態様を参照して記載したが、当業者は、詳細に記載し た特定の実験は本発明の例示のためだけであることを容易に認識し得る。本発明 の意図を逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである 。 従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。 配列表 (1)一般的情報： (i)出願人：ラ ホヤ キャンサー リサーチ ファウンデーション (ii)発明の名称：過剰増殖性細胞の複製阻害方法 (iii)配列数：４ (iv)連絡住所 (A)住所人：キャンベル アンド フローアズ (B)番地：ラ ホヤ ビレッジ ドライブ 4370，スイート 700 (C)市：サンディエゴ (D)州：カリフォルニア (E)国：アメリカ合衆国 (F)郵便番号：92122 (v)コンピューター読み出し形態： (A)媒体型：フロッピーディスク (B)コンピューター：IBM PC互換用 (C)OS:PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0、バージョン #1.25 (vi)現在の出願データ： (A)出願番号 (B)出願日：1992年10月12日 (C)分類： (Viii)代理人／事務所情報 (A)氏名：パーキンス，スーザン エム． (B)登録番号：36,405 (C)照会／記録番号：FP=LJ 9770 (ix)電話回線情報： (A)電話：619-535-9001 (B)テレファックス：619-535-8949 (2)配列番号：1の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：1000塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：両形態 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：cDNA (iii)ハイポセティカル配列：NO (iv)アンチセンス：NO (ix)配列の特徴： (A)特徴を表す記号：CDS (B)存在位置：結合部(10..423, 678..993) (D)他の情報：／注記＝「このタンパク質は、RNA前駆体の別のスプライシ ング産物である。この形態のタンパク質は、配列番号３−４に示される、より大 きいE1Aタンパク質のサブセットである。」 (xi)配列：配列番号：１： (2)配列番号：2の情報 (i)配列の特色： (A)長さ：243アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列：配列番号：２： (2)配列番号：3の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：1000塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：両形態 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：cDNA (iii)ハイポセティカル配列：NO (iv)アンチセンス：NO (ix)配列の特徴： (A)特徴を表す記号：CDS (B)存在位置：結合部(10..561、678.993) (xi)配列：配列番号：３： (2)配列番号：4の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：289アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列：配列番号：４：

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異常過剰増殖性ヒト細胞を逆形質転換する方法であって、ここで該異常過 剰増殖性細胞はneu腫瘍遺伝子を過剰発現せず、該方法は、該過剰増殖細胞を、E 1A活性を有するポリペプチドをコードする核酸と、該異常過剰増殖性細胞中に該 核酸が導入されそして該ポリペプチドが発現されるような条件下で接触させる工 程を包含する、方法。 ２．前記単離核酸がアデノウイルスE1Aポリペプチドをコードする、請求項１ に記載の方法。 ３．前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１に記載の方法。 ４．前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項１に記載の方法。 ５．前記異常過剰増殖性細胞が悪性細胞である、請求項１に記載の方法。 ６．前記単離核酸が、前記細胞中に、該細胞を、該単離核酸配列を含む適切な レトロウイルスベクターと接触させることにより導入される、請求項１に記載の 方法。 ７．異常過剰増殖性ヒト細胞の分化を促進する方法であって、該過剰増殖細胞 を、E1A活性を有するポリペプチドをコードする核酸と、該異常過剰増殖性細胞 中に該核酸が導入されそして該ポリペプチドが発現されるような条件下で接触さ せる工程を包含する、方法。 ８．前記単離核酸がアデノウイルスE1Aポリペプチドをコードする、請求項７ に記載の方法。 ９．前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項７に記載の方法。 １０．前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項７に記載の方法。 １１．前記異常過剰増殖性細胞が悪性細胞である、請求項７に記載の方法。 １２．前記単離核酸が、前記細胞中に、該細胞を、該単離核酸配列を含む適切 なレトロウイルスベクターと接触させることにより導入される、請求項７に記載 の方法。 １３．異常過剰増殖性ヒト細胞のクローン集団の成長を阻害する方法であって 、以下の工程を包含する、方法： （ａ）該過剰増殖細胞の少なくとも一部分を、E1A活性を有するポリペプチド をコードする核酸と、該核酸が該異常過剰増殖性細胞のすべてではなく一部分に 導入されて転換細胞を形成するような条件下で接触させる工程； （ｂ）該転換細胞を、非転換細胞と、該異常過剰増殖性細胞集団の成長が該転 換細胞からの接触阻害によって低下するように接触させるようにする工程。 １４．前記接触工程がインビボで行われる、請求項１３に記載の方法。 １５．前記接触工程がインビトロで行われる、請求項１３に記載の方法。 １６．前記異常過剰増殖性細胞のクローン集団が悪性腫瘍である、請求項１３ に記載の方法。 １７．前記単離核酸が、前記細胞中に、該細胞を、該単離核酸配列を含む適切 なレトロウイルスベクターと接触させることにより導入される、請求項１３に記 載の方法。