DE69834652T2

DE69834652T2 - Adenovirale vektoren, spezifisch für zellen, die den androgen-rezeptor exprimieren, und methoden für ihre verwendung

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Publication number: DE69834652T2
Application number: DE69834652T
Authority: DE
Inventors: De-Chao Foster City YU; R. Daniel Palo Alto HENDERSON; R. Eric Cupertino SCHUUR; G. Henry San Mateo LAMPARSKI
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: US6436394B1; EP1017836B1; AU745847B2; US20030091538A1; US7319033B2; EP1017836A2; US6197293B1; WO1998039466A3; ATE327339T1; DE69834652D1; CA2282812A1; WO1998039466A2; AU6187698A; JP2001515351A; US20090297483A1; CA2282812C

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung bezieht sich auf Zelltransfektion unter Verwendung von Adenovirusvektoren, besonders replikationskompetenten Adenoviren, und Verfahren ihrer Verwendung. Genauer bezieht sie sich auf die zellspezifische Replikation von Adenovirusvektoren in Zellen, die den Androgenrezeptor exprimieren, insbesondere Prostatacarcinomzellen, durch die Verwendung eines Probasin-Transkriptionsregulationselementes.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt drei signifikante Erkrankungen der Prostata: benigne Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs und Prostatitis. Die Kosten der Behandlung dieser drei Erkrankungen sind immens. Die jährliche Behandlung von Prostataerkrankungen in den Vereinigten Staaten fordert 4,4 Millionen Arztbesuche, 836.000 Krankenhauseinweisungen und kostet über $ 3 Milliarden in 1985. Annähernd einer von vier Männern über einem Alter von 55 leidet an einer Prostataerkrankung der einen oder anderen Form. Prostatakrebs ist die am schnellsten wachsende Ursache von Krebs in Männern, wobei für 1995 in den Vereinigten Staaten annähernd 244.000 neue Fälle diagnostiziert und ungefähr 44.000 Todesfälle berichtet worden sind. Aufgrund der alternden US-Bevölkerung ist es wahrscheinlich, dass die Häufigkeit von BPH und Prostatakrebs steigen werden.
BPH verursacht Harnabflussstörung, was in Harninkontinenz resultiert. Sie geschieht in annähernd 80 % der Männer mit dem Alter von 80. Von unreguliertem Dihydrotestosteron wird angenommen, dass es hyperplastisches Prostatawachstum verursacht. Pharmakotherapie für die Behandlung von BPH zielt gegenwärtig auf das Relaxieren des glatten Muskels der Prostata (alpha-Blockade) und Reduzieren des Prostatavolumens (Androgenunterdrückung). Klinische Versuche in Phase III befinden sich auf dem Weg, um selektive alpha₁-Blocker, Antiandrogene und 5-alpha-Reduktaseinhibitoren für die Behandlung von BPH zu evaluieren. Der Vielversprechendste unter diesen ist Finasterid, welches eine Fähigkeit gezeigt hat, Rückgang der hyperplastischen Prostatadrüse in einer Mehrheit von Patienten zu bewirken. Mocellini et al. (1993) Prostate 22: 291.
BPH wird chirurgisch mit einer transurethralen Resektion der Prostata (TURP) behandelt. Dieses Vorgehen ist sehr häufig: 500.000 TURPs werden in den Vereinigten Staaten jedes Jahr durchgeführt und 25 % der Männer werden eine Chirurgie irgendwann in ihrem Leben erfordern, um Harnabflussstörung zu erleichtern. Dies macht BPH zur zweithäufigsten Ursache von Operation in Männern. Das TURP-Vorgehen erfordert etliche Tage Krankenhauseinweisung ebenso wie die Chirurgie selber. Die durchschnittlichen medizinischen Erstattungskosten einer TURP in 1987-Dollar betrugen $ 8.000; in 1993-Dollar ist dies 14.000 %. Unglücklicherweise ist eine Nebenwirkung der TURP die Elimination des Ductus ejaculatorius ebenso wie der Nervenfasern des Penis, was in Impotenz in 90 % der Patienten resultiert. Eine TURP wird durch die Entnahme einer Biopsie aus dem Patienten eingeleitet, um zu bestimmen, ob die Vergrößerung der Prostata benigne oder kanzerös ist, was ebenfalls zu den Kosten hinzukommt. Hypertrophie kann auch behandelt werden durch die transurethrale Insertion eines röhrenförmigen Stents oder ausdehnbaren Dilatationskatheters, um die Durchgängigkeit des Urethrumlumens zu erhalten. US-Patent Nr. 4,893,623, erteilt am 16. Januar 1980 an Rosenbluth et al.; und US-Patent Nr. 5,527,336, erteilt am 18. Juni 1996 an Rosenbluth et al..
Eine alternative Therapie für Prostataerkrankungen involviert die Bestrahlungstherapie. Es wurde ein Katheter entwickelt, welcher Prostatagewebe während Mikrowellenbestrahlung quetscht; dies erhöht die Therapietemperatur, auf welche das Prostatagewebe distaler zu der Mikrowellenantenne erhitzt werden kann, ohne übermäßiges Erhitzen von nahe liegendem Nicht-Prostatagewebe. US-Patent Nr. 5,007,437, erteilt am 16. April 1991 an Sterzer et al.. Eine Kombination aus einer Strahlungsenergievorrichtung, integriert mit einem Harndrainagekatheter vom Foley-Typ wurde auch entwickelt. US-Patent Nr. 5,344,435, erteilt am 6. September 1994 an Turner et al..
Prostatakrebs ist nun der am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Männern. Prostatakrebs ist latent; viele Männer tragen Prostatakrebszellen ohne offenkundige Krankheitsanzeichen. Autopsien von Personen, die an anderen Ursachen starben, zeigen Prostatakrebszellen in 30 % der Männer im Alter von 50; im Alter von 80 ist die Prävalenz 60 %. Weiter kann es bei Prostatakrebs bis zu 10 Jahre dauern, den Patienten nach der anfänglichen Diagnose zu töten.
Prostatakrebs wird in knapp über 100.000 Männern in den Vereinigten Staaten jedes Jahr neu diagnostiziert, von welchen über 40.000 an der Erkrankung sterben werden. Es gibt auch eine hohe Morbidität. Krebsmetastasen im Knochen (spätes Stadium) sind häufig und oftmals verbunden mit unkontrollierbaren Schmerzen. Metastasenbildung geschieht auch an Lymphknoten (frühes Stadium).
Die Erkrankung schreitet fort von einer gut begrenzten Masse innerhalb der Prostata zu einem Zusammenbrechen und der Invasion der lateralen Ränder der Prostata, zu Metastasen an örtliche Lymphknoten, zu Metastasen im Knochenmark. Die Aggressivität von Prostatatumoren variiert breit. Gewisse Tumoren sind vergleichsweise aggressiv, wobei sie sich alle 6 Monate verdoppeln, wohingegen andere äußerst langsam wachsend sind, wobei sie sich einmal alle 5 Jahre verdoppeln. Als eine Konsequenz der langsamen Wachstumsrate sind nur wenige Krebszellen zu einem Zeitpunkt aktiv teilend. Als ein Ergebnis davon, ist Prostatakrebs im Allgemeinen gegen Bestrahlung und Chemotherapie resistent, obwohl beide therapeutischen Modalitäten breit verwendet werden. Chirurgie ist die Hauptstützte der Behandlung, ist aber ebenfalls im Großen unwirksam und entfernt auch die Ducti ejaculatorii, was in Impotenz resultiert.
Unglücklicherweise wird in 80 % der Fälle die Diagnose von Prostatakrebs getroffen, wenn die Erkrankung bereits in die Knochen metastasiert hat. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung, dass Prostatakrebse häufig an Metastasestellen schneller wachsen als innerhalb der Prostata selber, der Stelle des Primärkrebses.
In diesem Stadium gibt es keine effektive cytotoxische Chemotherapie für Prostatakrebs. Gegenwärtige therapeutische Techniken schließen die Verwendung von chemischen Formen von medizinischer Kastration durch Einstellen der Androgenproduktion in den Hoden oder direktes Hemmen der Androgenproduktion in der Prostata ein. Für die Behandlung von Prostatakrebs werden orale Östrogene und Analoga für Luteinisierung-Releasinghormon ebenso verwendet, wie chirurgische Entfernung von Drüsen, die Androgene produzieren (Orchidektomie oder Adrenalektomie). Östrogene werden jedoch nicht länger empfohlen aufgrund von schweren, sogar lethalen kardiovaskulären Komplikationen. Luteinisierungshormon-Releasinghormon-(LHRH-) Analoga werden stattdessen verwendet. Hormontherapie schlägt jedoch unweigerlich mit der Zeit mit der Entwicklung von hormonresistenten Tumorzellen fehl. Es ist nicht bekannt, ob sich diese Zellen als eine Mutation der ursprünglich hormonsensitiven Zellen oder als eine gesonderte Klasse von Zellen entwickeln. Ferner, da 20 % der Patienten nicht auf Hormontherapie ansprechen, wird angenommen, dass hormonresistente Zellen beim Einsetzen der Therapie vorhanden sind.
Von Estramustin, ein Steroidderivat von Stickstofflost, wurde ursprünglich gedacht, dass es geeignet ist für die gerichtete Arzneimittelzufuhr durch Konjugation von Östrogen an toxischem Stickstofflost. Klinische Versuche waren jedoch niederschlagend, wenn Überleben als ein Endpunkt genommen wird. Finasterid, ein 4-aza-Steroid (Proscar^® von Merck & Co.) inhibiert das Enzym, das für die intrazelluläre Umwandlung von Testosteron zu Dihydrotestosteron, das potenteste Androgen in der Prostata, verantwortlich ist. Von Casodex^® wird gedacht, dass es die zelluläre Aufnahme von Testosteron durch Hemmen von Androgenrezeptoren im Kern inhibiert. Annähernd alle fortgeschrittenen Prostatakrebszellen sprachen jedoch auf Androgenunterdrückung nicht an. Es wurden auch Indolcarbazolderivate wie K-252a kürzlich entwickelt, um Prostataerkrankungen zu behandeln. US-Patent Nr. 5,516,771, erteilt am 14. Mai 1996 an Dionne.
Keine dieser Techniken für die Behandlung von Prostataerkrankungen war allumfassend erfolgreich. Nach lokalisierter Therapie entwickeln bis zu 40 % der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung und ein großer Teil sämtlicher Patienten letztendlich eine metastatische Erkrankung. Behandlung für fortgeschrittene Erkrankung, anfänglich einschließend hormonelle Manipulationen und palliative Radiotherapie, zeigte eine symptomatische Erleichterung, aber kein erkrankungsfreies Langzeitüberleben. Die Verwendung von cytotoxischen Mitteln bei der Handhabung von hormonresistentem fortgeschrittenem Prostatakrebs bleibt schlecht definiert. Einige wenige einzelne Mittel wurden zur „Standardtherapie", obwohl die Demonstration ihrer Wirksamkeit durch heutige Standards fehlt. Kombinationschemotherapie wird häufig genutzt, obwohl ihr Beitrag zur Gesamtpatientenführung im Großen unsubstantiiert ist, besonders wenn die kritische Bewertung von Effizienzparametern verwendet wird. Neuere Ansätze unter Verwendung von Chemohormontherapie und hormonalen Primingtherapien schlugen fehl. Chemotherapie in hoher Dosis mit Transplantationsregimes werden in der älteren Population nicht gut toleriert, zu welchen die meisten Opfer von Prostatakrebs gehören. Ein Wachstumsfaktorinhibitor, Suramin, zeigte vielversprechende anfängliche Ergebnisse. Es wurde bis jetzt jedoch noch von keiner Therapie gezeigt, dass sie das Gesamtüberleben in Patienten mit fortgeschrittenem, durch Hormon nicht beeinflussbarem Prostatakrebs verbessert. US-Patent Nr. 5,569,667, erteilt am 29. Oktober 1996 an Grove et al..
Ein hauptsächliches, in der Tat überwältigendes Hindernis der Krebstherapie ist das Problem der Selektivität; das heißt, die Fähigkeit, die Vermehrung von Tumorzellen zu inhibieren, während die Funktion normaler Zellen unbeeinflusst bleibt. Folglich beträgt das therapeutische Verhältnis des Abtötens von Tumorzellen zum Abtöten von normalen Zellen bei traditioneller Tumorchemotherapie nur 1,5:1. Es werden folglich wirksamere Behandlungsverfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen für Therapie und Prophylaxe von Prostatahyperplasie und Neoplasie gebraucht.
Von besonderem Interesse ist die Entwicklung von spezifischeren, gerichteten Formen an Therapie für Prostataerkrankungen. Im Gegensatz zu konventionellen Krebstherapien, welche in verhältnismäßig unspezifischer und oftmals ernsthafter Toxizität oder Impotenz resultieren, zielen spezifischere Behandlungsmodalitäten darauf ab, maligne Zellen selektiv zu inhibieren oder abzutöten, während gesunde Zellen intakt belassen werden.
Ein möglicher Behandlungsansatz für Prostataerkrankungen ist Gentherapie, wobei ein Gen von Interesse in die maligne Zelle eingeführt wird. Boulikas (1997) Anticancer Res. 17: 1471–1505. Das Gen von Interesse kann ein Protein kodieren, welches sich nach Behandlung mit einer anderen Verbindung in eine toxische Substanz umwandelt, oder ein Enzym, das eine Prodroge zu einem aktiven Arzneimittel umwandelt. Zum Beispiel macht das Einführen des Thymidinkinase kodierenden Herpes-Simplex-Gens (HSV-tk) Zellen konditional sensitiv für Ganciclovir (GCV). Zjilstra et al. (1989) Nature 243: 435; Mansour et al. (1988) Nature 336: 348; Johnson et al. (1989) Science 245: 1234; Adair et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4574; und Capecchi (1989) Science 244: 1288. Alternativ kann das Gen von Interesse eine Verbindung kodieren, die direct toxisch ist, wie zum Beispiel Diphtherietoxin (DT). Damit diese Behandlungen spezifisch für Prostatazellen gemacht werden, kann das Gen von Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionsregulationselementes sein, das spezifisch (d. h. bevorzugt) die Transkription eines operabel gekoppelten Polynukleotids in den Prostatazellen steigert. Zell- oder gewebespezifische Expression kann durch die Verwendung von zellspezifischen Enhancern und/oder Promotoren erreicht werden. Siehe Allgemein Huber et al. (1995) Adv. Drug Delievery Rev. 17: 279–292, WO 96/17053, WO 96/34969 und WO 97/01358, sie beschreiben alle Adenovirusvektoren, umfassend heterologe Gene unter der Kontrolle von gewebespezifischen Regulationselementen.
Eine Reihe von viralen und nicht viralen (z. B. Liposomen) Vehikeln oder Vektoren wurden entwickelt, um diese Gene zu transferieren. Von den Viren wurden Retroviren, Herpesvirus, adenoassoziiertes Virus, Sindbisvirus, Pockenvirus und Adenoviren für die Verwendung bei Gentransfer vorgeschlagen, wobei auf Retrovirusvektoren und Adenovirusvektoren der Schwerpunkt der häufigsten gegenwärtigen Forschung liegt. Verma und Somia (1997) Nature 387: 239–242. Adenoviren sind unter den am einfachsten zu Produzierenden und Aufzureinigenden, wohingegen Retroviren instabil sind, schwierig zu produzieren und zu reinigen sind und in das Wirtsgenom integrieren können, wodurch die Möglichkeit von gefährlichen Mutationen steigt. Weiterhin hat Adenovirus den Vorteil, eine hohe Effizienz der Transduktion zu bewirken und erfordert nicht Zellproliferation für eine effiziente Zelltransduktion. Für allgemeine Hintergrundreferenzen im Hinblick auf Adenovirus und die Entwicklung von adenoviralen Vektorsystmen siehe Graham et al. (1973) Virology 52: 456–467; Takiff et al. (1981) Lancet 11: 832–834; Berkner et al. (1983) Nucleic Acid Research 11: 6003–6020; Graham (1984) EMBO J 3: 2917–2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67: 5911–5921; und Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802–0086.
Wenn sie als Gentransfervehikel verwendet werden, sind Adenovirusvektoren oftmals so gestaltet, dass sie replikationsdefekt sind und folglich bewusst so verändert sind, dass sie es in den Zielzellen von Interesse nicht vermögen, zu replizieren. In diesen Vehikeln sind die frühen Adenovirusgenprodukte E1A und/oder E1B deletiert und sind in trans durch die Verpackungszelllinie 293 bereitgestellt. Graham et al. (1987) J. Gen. Virol. 36: 59–72; Graham (1977) J. Genetic Virology 68: 937–940. Das zu transduzierende Gen ist häufig in Adenovirus in der deletierten E1A- und/oder E1B-Region des Virusgenoms inseriert. Bett et al. (1994). Replikationsdefekte Adenovirusvektoren als Vehikel für die effiziente Transduktion von Genen wurden beschrieben, unter anderem von Stratford-Perricaudet (1990) Human Gene Therapy 1: 241–256; Rosenfeld (1991) Science 252: 431–434; Wang et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol. 309: 61–66; Jaffe et al. (1992) Nat. Gent. 1: 372–378; Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581–2584; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143–155; Stratford-Perricaudet et al. (1992) J. Clin. Invest. 90: 626–630; Le Gal Le Salle et al. (1993) Science 259: 988–990; Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 225–234; Ragot et al. (1993) Nature 361: 647–650; Hayaski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 23872–23875; und Bett et al. (1994).
Der eigentlich ausschließliche Mittelpunkt in der Entwicklung von Adenovirusvektoren für die Gentherapie ist die Verwendung von Adenovirus einzig als ein Vehikel für das Einführen des Gens von Interesse, nicht als ein Effektor selbst. Replikation von Adenovirus wurde als ein unerwünschtes Ergebnis angesehen, hauptsächlich aufgrund der Immunantwort des Wirts. Bei der Behandlung von Krebs durch replikationsdefekte Adenoviren beschränkt die Immunantwort des Wirtes die Dauer von Wiederholungsdosen auf zwei Ebenen. Erstens sind die Capsidproteine des Adenoviruszufuhrvehikels selbst immunogen. Zweitens werden späte Virusgene häufig in transduzierten Zellen exprimiert, wodurch eine zelluläre Immunität ausgelöst wird. Folglich wurde die Fähigkeit, wiederholt Cytokine, Tumorsuppressorgene, Ribozyme, Suizidgene oder Gene, welche eine Prodroge zu einem aktiven Arzneimittel umwandeln, zuzuführen, durch die Immunogenität von sowohl dem Gentransfervehikel und den viralen Genprodukten des Transfervehikels als auch der vorübergehenden Art der Genexpression beschränkt. Es gibt einen Bedarf für Vektorkonstrukte, die in der Lage sind, im Wesentlichen alle Krebszellen in einer minimalen Anzahl von Applikationen zu eliminieren bevor die spezifische immunologische Antwort gegen den Vektor die weitere Behandlung verhindert.
Ein vollständig gesonderter und nicht verwandter Bereich der Forschung bezieht sich auf die Beschreibung von gewebespezifischen Transkriptionsregulationsproteinen.
Rattenprobasin-(PB-) Gen
Das Rattenprobasin-(PB-) Gen kodiert ein nukleäres und sezerniertes Protein, Probasin, das nur in der dorsolateralen Prostata exprimiert wird. Dodd et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 10731–10737; Matusik et al. (1986) Biochem. Cell. Biol. 64: 601–607; und Sweetland et al. (1988) Mol. Cell. Biochem. 84: 3–15. Die dorsolateralen Lappen der Mausprostata werden als mit der peripheren Zone der humanen Prostata am meisten homolog erachtet, wo gedacht wird, dass annähernd 68 % der menschlichen Prostatakrebse ihren Ursprung nehmen. Immunhistochemie mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern zeigte eine duale zelluläre Lokalisierung von PB innerhalb des Cytoplasmas und des Nukleus von Epithelzellen der Prostata. Die Expression dieses Gens wird sowohl durch Zink als auch durch Testosteron (T) oder ein Derivat davon über den Androgenrezeptor (AR) vermittelt. T, das dominante Hodenandrogen diffundiert passiv in die Zelle und bindet entweder direkt an den AR oder durchläuft eine enzymatische Reduktion auf 5α-Dihydrotestosteron (DHT) oder eine Aromatisierung zu Östrogenen. Wenn T oder DHT erst einmal an den AR binden, durchmacht das Proteinkonformationsänderungen, Chaperonproteine wie Hitzeschockproteine dissoziieren von dem Rezeptor und der aktivierte Rezeptor kann dann DNA binden. Johnson et al. (1986) In: Steroid Receptors and Disease (Sheridan, Hrsg.), Seiten 207–228, Dekker, New York; und Chan et al. (1989) In: Pediatric Endocrinology (Collu et al., Hrsg.) Seiten 81–124, Raven Press, New York.
Der androgenaktivierte AR bindet an spezifische DNA-Enhancersequenzen, genannt androgenresponsive Elemente (AREs oder ARE-Stellen). Wenn er erst einmal an ARE verankert ist, ist der AR in der Lage, Transkriptionsaktivität in entweder einer positiven oder negativen Weise zu regulieren. Lindzey et al. (1994) Vitamins and Hormones 49: 383–432. Die 5'-TRE-(Transkriptionsresponseelement) Region des PB-Gens enthält zwei ARE-Stellen, die erforderlich sind für die Androgenregulation. Rennie et al. (1993) Mol. Endocrinol. 7: 23–36; Internationale Anmeldung PCT/CA93/00319, veröffentlicht als WO 94/0359, 17. Februar 1994 an Matusik.
Der AR gehört zu einer Kernrezeptorsuperfamilie von deren Mitgliedern angenommen wird, dass sie hauptsächlich als Transkriptionsfaktoren wirken, welche die Genaktivität durch Bindung an spezifische DNA-Sequenzen, hormonresponsive Elemente, regulieren. Carson-Jurica et al. (1990) Endocr. Rev. 11: 201–220. Diese Familie schließt die anderen Steroidhormonrezeptoren ebenso wie die Thyroidhormon-, den Retinsäure- und die Vitamin-D-Rezeptoren ein. Der Progesteron- und Glucocorticoidrezeptor sind strukturell am engsten verwandt mit dem AR. Tilley et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 327–331; Zhou et al. (1994) Recent Prog. Horm. Res. 49: 249–274; und Lindzey et al. (1994) Vit. Horm. 49: 383–432.
Kürzlich wurde die den humanen und Ratten-AR kodierende cDNA kloniert. Chang et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7211–7215; Lubahn et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 1265–1275; und Trapman et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 241–248. Die Ratten- und humanen AR-mRNA zeigen einen hohen Grad von Sequenzähnlichkeit in den kodierenden Regionen und den 5' UTRs.
Das AR-Gen selbst ist ein Ziel von Androgenregulation. Diese Modulation mag ein wichtiges Niveau der Kontroll, wobei die physiologischen Wirkungen von Testosteron moduliert werden, darstellen. Androgen fördert die Herauf- und Herunterregulation von AR-mRNA in einer Gewebe- und möglicherweise stadiumspezifischen Weise. Nastluk et al. (1994) Endocrin. 134: 640–649 : Shan et al. (1995) Endocrin. 136: 3856–3862; und Prins et al. (1995) Biol. Reprod 53: 609–619. In den Hoden wird AR-Protein in Sertoli-Zellen, Leydig-Zellen und peritubulären Zellen exprimiert, aber nicht in den sich entwickelnden Keimzellen. Grootegoed et al. (1977) Mol. Cell. Endocrinol. 9: 159–157; und Buzek et al. (1988) Biol. Reprod. 39: 39–49. Hormone wie zum Beispiel follikelstimulierendes Hormon (FSH) und Testosteron beeinflussen die Produktion von AR. Verhoeven et al. (1988) Endocrinology 122: 1541–1550; und Blok et al. (1989) Mol. Cell. Endocrinol. 63: 267–271; Quarmby et al. (1990) Mol. Endocrinol. 4: 22–28.
Herauf- und Herunterregulation von AR-mRNA kann in verschiedenen Zelllinien, die mit einer AR-cDNA transfiziert worden sind, reproduziert werden. Burnstein et al. (1995); Mol. Cell. Endocrinol. 115: 177–186 und Dai et al. (1996) Steroids 61: 531–539. Sowohl in COS-1- als auch in LNCaP-Zellen, die AR-cDNA exprimieren, fördert Androgen die Herunterregulation von AR-mRNA. Burnstein et al. (1995). Die Prostatazelllinien PC3 und DU145 exprimieren keinen endogenen AR, wenn diese Zellen jedoch mit AR-cDNA transfiziert werden, zeigt das Gen androgene Heraufregulation. Dai et al. (1995). Sowohl Herauf- als auch Herunterregulation von AR-mRNA in den AR-cDNA exprimierenden Zellen liegen an Sequenzen innerhalb der AR-cDNA. Der heterologe Cytomegalovirus-(CMV-) Promoter, der die Expression der AR-cDNA antreibt, ist selbst nicht für die androgene Regulation von AR-cDNA-Expression verantwortlich. Burnstein et al. (1995); und Dai et al. (1996). Deshalb wird die androgenvermittelte differenzielle Regulation von AR-cDNA-Expression durch die AR-cDNA in einer zelllinienspezifischen Weise verliehen. Burnstein et al. (1995); Dai et al. (1996).
Der molekulare Mechanismus der AR-mRNA-Autoregulation ist komplex, wobei sowohl transkriptionelle als auch posttranskriptionelle Mechanismen in diesen Vorgang verwickelt sind. Prins et al. (1995) Biol. Reprod. 53: 609–619; Wolf et al. (1993) Mol. Endocrin. 7: 924–936; und Blok et al. (1992) Mol. Cell. Endocrin. 88: 153–164. Die 5'-Region des AR-Gens scheint keine AREs zu enthalten. Blok et al. (1992) Mol. Cell. Endocrin. 88: 153–164. Der Mechanismus von androgenvermittelter Heraufregulation von AR-mRNA ist [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen: „in"] PC3-Zellen (Prostatakrebszelllinie), die eine transfizierte humane AR-(hAR-) cDNA exprimieren, wurde studiert. Eine androgenresponsive Region innerhalb der AR-kodierenden Sequenz wird durch AR gebunden und enthält zwei unterschiedliche AREs, die synergistisch wirken, um AR-mRNA-Heraufregulation zu übermitteln. Dai et al. (1996) Mol. Endocrin. 10: 1582–1594.
Prostataerkrankungen sind allgemein resistent gegen eine Behandlung durch Standardtherapie. Folglich ist es kritisch, neue therapeutische Ansätze für diese Erkrankung zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung spricht diesen Bedarf durch Bereitstellen von adenoviralen Vektoren an, die für die Replikation in AR-produzierenden Zellen spezifisch sind.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführung stellt die Erfindung einen Adenovirusvektor bereit, umfassend ein Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle eines Probasin-Transkriptionsresponseelementes (PB-TRE), worin der Adenovirusvektor einer Zielzelle selektive Toxizität verleiht. Das PB-TRE ist in der Lage, Genexpression spezifisch an Zellen zu übermitteln, welche einem PB-TRE erlauben, zu funktionieren, wie zum Beispiel Zellen, die den Androgenrezeptor exprimieren, z. B. Prostatazellen. Das PB-TRE umfasst einen Promoter und/oder Enhancer von einem Probasingen und ist in der Lage, Genexpression spezifisch an Zellen zu übermitteln, die den Androgenrezeptor exprimieren. In einer Ausführung umfasst ein PB-TRE einen Promoter aus einem Probasingen. In einer Ausführung umfasst ein PB-TRE einen Enhancer aus einem Probasingen. In einer Ausführung ist das PB-TRE in Zellen transkriptionell aktiv, welche einem PB-TRE erlauben, zu funktionieren, wie zum Beispiel Zellen, die den Androgenrezeptor (AR) exprimieren.
In gewissen Ausführungen umfasst ein PB-TRE die Nukleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 1. In gewissen Ausführungen umfasst ein PB-TRE einen Teil von Sequenz ID Nr. 1, der in der Lage ist, zellspezifische Transkription in AR-produzierenden Zellen wie Prostatazellen zu vermitteln. In einer anderen Ausführung umfasst ein PB-TRE die Sequenz von ungefähr –286 bis ungefähr +28 im Verhältnis zu der Transkriptionsstartstelle eines Probasingens (Nukleotide ungefähr 141 bis ungefähr 454 der Sequenz ID Nr. 1). In einer anderen Ausführung umfasst ein PB-TRE die Sequenz von ungefähr –426 bis ungefähr +28 im Verhältnis zu der Transkriptionsstartstelle eines Probasingens (Nukleotid ungefähr 1 bis ungefähr 454 von Sequenz ID Nr. 1). In einer anderen Ausführung umfasst ein PB-TRE die Sequenz bis ungefähr –236 bis ungefähr –223 und/oder die Sequenz bis ungefähr –140 bis ungefähr –117 (Nukleotide ungefähr 191 bis ungefähr 204 und/oder ungefähr 286 bis ungefähr 310, bzw. von Sequenz ID Nr. 1) im Verhältnis zu der Transkriptionsstartstelle eines Probasingens, kombiniert mit einem Probasin- oder Nicht-Probasinpromoter. In einer anderen Ausführung umfasst ein PB-TRE eine oder zwei ARE-Stellen (androgenresponsive Elemente), kombiniert mit einem Probasin- oder einem Nicht-Probasinpromoter. In jeder Ausführung ist ein PB-TRE als ein Transkriptionsresponseelement oder Transkriptionsregulationselement definiert, das in der Lage ist, Transkription in einer Zelle, wie zum Beispiel einer Prostatazelle, zu bewirken, welche einem PB-TRE erlaubt, zu funktionieren, wie zum Beispiel eine Zelle, die den Androgenrezeptor exprimiert.
In gewissen Ausführungen umfasst das Adenovirus ein PB-TRE, welches wiederum wenigstens ein Androgenresponseelement (ARE) umfasst. In gewissen Ausführungen ist das ARE ARE-1 oder ARE-2 von entweder dem Probasingen oder dem AR-Gen. In anderen Ausführungen umfasst der Andenovirusvektor ein PB-TRE, welches wiederum ein ARE umfasst, wie zum Beispiel ARE-2. In anderen Ausführungen umfasst der Adenovirusvektor ein Probasin-Transkriptionsresponseelement, welches wiederum sowohl ARE-1 als auch ARE-2 umfasst.
In gewissen Ausführungen ist das PB-TRE von Rattenursprung. In gewissen Ausführungen ist das Ratten-PB-TRE in der Lage, prostataspezifische Genexpression in Menschen zu vermitteln.
In gewissen Ausführungen trägt das Adenovirusgen unter der Kontrolle eines PB-TRE zu Cytotoxizität (direkt oder indirekt) bei, wie zum Beispiel ein Gen, das für virale Replikation essentiell ist. In einer Ausführung ist das Adenovirusgen ein frühes Gen. In einer anderen Ausführung ist das frühe Gen E1A. In einer anderen Ausführung ist das frühe Gen E1B. In noch einer anderen Ausführung befinden sich beide, E1A und E1B, unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE. In anderen Ausführungen ist das für Replikation essentielle Adenovirusgen ein spätes Gen. In verschiedenen Ausführungen ist das zusätzliche späte Gen L1, L2, L3, L4 oder L5. In einer anderen Ausführung ist das unter der Kontrolle eines PB-TRE befindliche Adenovirusgen das Adenovirus-Death-Protein-Gen (ADP).
In einer anderen Ausführung umfasst das ein Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE umfassende Adenovirus weiter wenigstens ein zusätzliches Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle von wenigstens einem zusätzlichen prostataspezifischen Transkriptionsregulationselement. In einer Ausführung umfasst eine Zusammensetzung dieses Adenovirus. In einer Ausführung umfasst diese Zusammensetzung weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff. In einer Ausführung ist das wenigstens eine zusätzliche prostataspezifische Transkriptionsregulationselement ein zweites PB-TRE. In einer Ausführung kann das wenigstens eine zusätzliche PB-TRE eine Sequenz haben, die sich von jener des ersten PB-TRE unterscheidet. In einer Ausführung umfasst das wenigstens eine zusätzliche prostataspezifische Transkriptionsregulationselement ein prostataspezifisches Antigen-(PSA-) Transkriptionsregulationselement.
In anderen Ausführungen kann der Adenovirusvektor weiter ein heterologes Gen oder Transgen umfassen, worin dieses Transgen sich unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE befindet. In einer Ausführung ist das heterologe Gen ein Reportergen. In einer Ausführung ist das heterologe Gen für das Zellüberleben konditionell erforderlich. In gewissen Ausführungen ist das Transgen ein cytotoxisches Gen.
In gewissen Ausführungen stellt die Erfindung den/die Adenovirusvektor(en) der Erfindung mit einem hydrophilen Polymer („Maskiermittel") komplexiert bereit, um ein maskiertes Adenovirus zu schaffen. Das hydrophile Polymer wird angeheftet (kovalent oder nicht kovalent) an die Capsidproteine des Adenovirus, besonders Hexon und die Faserproteine. In weiteren bevorzugten Ausführungen ist das Maskiermittel Polyethylenglycol (PEG), das kovalent an einen Adenovirusvektor der gegenwärtigen Erfindung gekoppelt ist.
Der Vektor der Erfindung kann verwendet werden in einem Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs in einem Individuum wird bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens einer wirksamen Menge eines Adenovirusvektors, in welchem ein Adenovirusgen sich unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE befindet, an ein Individuum umfasst. In einer Ausführung ist das Adenovirusgen essentiell für die virale Replikation. In einer Ausführung ist das Adenovirusgen ein frühes Gen. In einer Ausführung ist das Adenovirusgen E1A. In einer Ausführung ist das Adenovirusgen E1B. In einer Ausführung ist das Adenovirusgen ADP. In einer Ausführung umfasst das PB-TRE einen Enhancer von einem Probasingen. In einer Ausführung umfasst das PB-TRE einen Promoter aus einem Probasingen und einen Enhancer aus einem Probasingen. In einer Ausführung umfasst das Adenovirus weiter ein zusätzliches Adenovirus, das sich unter der Transkriptionskontrolle von wenigstens einem zusätzlichen prostataspezifischen Transkriptionsregulationselement befindet. In einer Ausführung umfasst das zweite prostataspezfische Transkriptionsregulationselement ein prostataspezifisches Antigen-(PSA-) Transktiptionsregulationselement. In einer Ausführung ist das zusätzliche Adenovirusgen für die virale Replikation essentiell. In einer Ausführung ist das zusätzliche Adenovirusgen ein frühes Gen. In einer Ausführung ist das zusätzliche Adenovirusgen E1A. In einer Ausführung ist das zusätzliche frühe Adenovirusgen E1B. In einer Ausführung ist das zusätzliche Adenovirusgen ein spätes Gen. In verschiedenen Ausführungen kann das späte Gen L1, L2, L3, L4 oder L5 sein. In einer Ausführung ist das zusätzliche Adenovirusgen ADP.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die mit jedem der hierin beschriebenen Adenovirusvektor(en) transformiert ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein Adenovirus, das ein Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE umfasst.
In einer Ausführung umfasst die Zusammensetzung weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Kits bereit, welche einen hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren) enthalten.
Eine andere Ausführung der Erfindung ist ein Adenovirus, welches sich vorzugsweise in Säugerzellen, die AR exprimieren, repliziert.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Vermehren eines Adenovirus bereitgestellt, das für Zellen spezifisch ist, welche einem PB-TRE erlauben, zu funktionieren, wie zum Beispiel Zellen, die einen Androgenrezeptor exprimieren, wobei dieses Verfahren das Kombinieren irgendeines der hierin beschriebenen Adenovirusvektor(en) mit Zellen umfasst, welche einem PB-TRE erlauben, zu funktionieren, wie zum Beispiel Zellen, die AR exprimieren, wobei dieses Adenovirus vermehrt wird.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Zielzelle bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Zelle, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine den Androgenrezeptor exprimierende Zelle, mit jedem hierin beschriebenen Adenovirus umfasst, worin das Adenovirus in die Zelle eindringt.
In einem anderen Aspekt werden Verfahren zum Detektieren von Zellen bereitgestellt, die Probasin in einer biologischen Probe exprimieren, umfassend das Kontaktieren von Zellen in einer biologischen Probe mit einem hierin beschriebenen Adenovirusvektor(en) und Detektieren der Replikation des Adenovirusvektors, falls vorhanden.
In einer Ausführung wird ein Verfahren zum Detektieren von Zellen bereitgestellt, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die Androgenrezeptor in einer biologischen Probe exprimieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Kontaktieren einer biologischen Probe mit einem Adenovirusvektor, umfassend ein Gen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE, unter Bedingungen, die für die PB-TRE vermittelte Genexpression in Zellen, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die Androgenrezeptor exprimieren, geeignet sind; und Bestimmen, ob PB-TRE Genexpression in der biologischen Probe vermittelt wird, wobei durch PB-TRE vermittelte Genexpression für die Anwesenheit von Zellen anzeigend ist, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die den Androgenrezeptor exprimieren. In einer Ausführung ist das Gen ein heterologes (Nicht-Adenovirusgen). In einer Ausführung ist das heterologe Gen ein Reportergen und die Produktion des Produktes des Reportergens wird detektiert.
In einer anderen Ausführung wird ein Verfahren zum Verleihen von selektiver Toxizität an eine Zielzelle bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Zelle, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine androgenexprimierende Zelle, mit jedem hierin offenbarten Adenovirus umfasst, worin das Adenovirus in die Zelle eindringt.
In einer Ausführung wird ein Adenovirus bereitgestellt, welches ein heterologes Gen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE umfasst. In einer Ausführung ist das heterologe Gen ein Reportergen. In einer Ausführung ist das heterologe Gen für das Zellüberleben konditional erforderlich. In einer Ausführung wird ein Verfahren zum Detektieren von Zellen in einer Probe bereitgestellt, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die den Androgenrezeptor umfassen, umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren einer biologischen Probe mit einem Adenovirusvektor, umfassend ein Gen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE, unter Bedingungen, die für PB-TRE vermittelte Genexpression in Zellen, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Androgenrezeptor exprimierende Zellen, geeignet sind; und Bestimmen, ob PB-TRE-Genexpression in der biologischen Probe vermittelt, wobei PB-TRE vermittelte Genexpression für die Anwesenheit von den Androgenrezeptor exprimierenden Zellen anzeigend ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 bildet die Sequenz der 5'-flankierenden Region des Rattenprobasin-(PB-) Gens, einschließend die PB-TRE-Region, ab.
2A und 2B bilden schematische Diagramme verschiedener Adenovirusvektoren ab, in welchen verschiedene Gene sich unter der Kontrolle eines PB-TRE befinden.
3 ist ein Säulendiagramm, das Ergebnisse eines Luciferasetests abbildet, der zellspezifische Genexpression, angetrieben durch ein PB-TRE, in LNCaP (PSA-plus und Androgen-abhängige Prostatacarcinomzellen) und PC-3 (PSA-minus und Androgenunabhängige Prostatacarcinomzellen) zeigt.
4 ist eine schematische Abbildung eines adenoviralen Vektors, in welchen E1A und E1B sich unter der Kontrolle eines PB-TRE befinden, wobei E1A und E1B in umgekehrten Orientierungen sind.
5A und 5B sind schematische Abbildungen einer Adenovirus-Death-Protein-(ADP-) Kassette für die Insertion in Ad. Pfeile unterhalb der 5A zeigen Primerpositionen an. 5B bildet das Fragment nach Doppelstrangbildung, enthaltend die Y-Leitsequenz und die ADP-kodierende Sequenz, ab.
6 ist ein Säulendiagramm, das die reduzierte Replikation in Nicht-Prostatazellen eines Adenovirus, CN739, zeigt, in welchem mehrere frühe adenovirale Gene unter die Kontrolle von prostataspezifischen TREs gestellt werden.
7 ist ein Liniendiagramm, das die Ein-Schritt-Wachstumskurve eines Adenovirus, CN739, erläutert, in welchen mehrere adenovirale frühe Gene unter die Kontrolle von prostataspezifischen TREs in Prostata-(LNCaP) und Nicht-Prostatazellen (hMVEC) gestellt sind.
8 ist ein Liniendiagramm, das Serum-PSA-Spiegel in Mäusen zeigt, die mit einem Adenovirus, CN739, behandelt worden sind, in welchem mehrere adenovirale frühe Gene unter die Kontrolle von prostataspezifischen TREs gestellt sind.
9 ist ein Liniendiagramm, das die Wirksamkeit eines Adenovirus, CN739, in welchem mehrere frühe adenovirale Gene unter die Kontrolle von prostataspezifischen TREs gestellt sind, bei der Behandlung eines Prostatakrebstumors in Mäusen erläutert.
10 ist ein Diagramm, das die Cytotoxizität eines adenoviralen Vektors, der die kodierende Sequenz für ein Adenovirus Death Protein (ADP), CN751, (ausgefüllte Quadrate) enthält, im Vergleich mit Kontrolle CN702 (ausgefüllte Kreise), Rec 700 (ausgefüllte Dreiecke) und Scheininfektion (Xs), abbildet.
11 ist ein Diagramm, das extrazelluläre Virusausbeute von CN751 (ausgefüllte Quadrate) und CN702 (ausgefüllte Kreise) vergleicht.
12 ist ein Diagramm, das Tumorvolumen in Mäusen, die LNCaP-Tumorxenotransplantate beherbergen, herausgefordert mit CH751 („H"), CN702 („J") oder Puffer („B"), vergleicht.
13 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens für die kovalente Pegylierung eines Adenovirus. Bei diesem Verfahren wird Succinimidylsuccinamid verwendet, um kovalent mit Methoxy-PEG an Adenovirus anzuheften. Das pegylierte Adenovirus wird von den Reaktionsbestandteilen durch Ionenaustauschchromatographie abgetrennt.
14 zeigt eine grafische Halbtondarstellung von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese-(SDS-PAGE-) Gel (Mobilitätsverschiebung) von pegylierten Adenovirusproteinen. Die Spuren 1 und 2 sind nicht pegyliertes CN706 (Kontrolle), die Spuren 3 bis 6 sind CN706, pegyliert unter verschiedenen pH- und Temperaturbedingungen (Spur 3: pH 7,6, Raumtemperatur (RT); Spur 4: pH 7,6, 4 °C; Spur 5: pH 8,2, RT; Spur 6: pH 8,2, 4 °C).
15 ist ein Chromatogramm von Ionenaustauschchromatographieanalyse von peglyiertem Adenovirus (PEG-706), vermischt mit Kontrolladenovirus CN706.
Arten, die Erfindung durchzuführen
Wir entdeckten und konstruierten replikationskompetente Adenovirusvektoren, enthaltend ein Probasin-(PB-) Transkriptionsregulationselement (PB-TRE), welche vorzugsweise in Zellen, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Prostatazellen, die den Androgenrezeptor (AR) exprimieren, replizieren können, und wir entwickelten Verfahren unter Verwendung dieser Adenovirusvektoren. Die Adenovirusvektoren dieser Erfindung können wenigstens ein Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE umfassen, welches spezifisch durch Bindung an Androgenrezeptor heraufreguliert wird. Das Adenovirusgen kann zum Beispiel ein Gen sein, das zu Cytotoxizität (direkt oder indirekt) beiträgt, wie zum Beispiel ein Gen, das für die adenovirale Replikation notwendig ist. Dieses Replikationsgen ist vorzugsweise wenigstens ein frühes Gen. Alternativ kann das unter der Kontrolle eines PB-TRE befindliche Adenovirusgen ein Adenovirus Death Protein-(ADP-) Gen sein. Alternativ kann das Adenovirusgen unter der Kontrolle eines PB-TRE ein spätes Replikationsgen sein. Das Adenovirus kann wahlweise wenigstens einanderes Gen umfassen, wie zum Beispiel ein Adenovirusgen oder ein Transgen unter der Kontrolle eines anderen TREs, welches von dem PB-TRE unterschiedlich ist. Durch das Sorgen für zellspezifische. Transkription von wenigstens einem für die Replikation erforderlichen Adenovirusgen, stellt die Erfindung Adenovirusvektoren bereit, die für spezifisch cytotoxische Wirkungen aufgrund von selektiver Replikation verwendet werden können. Selektive Replikation ist besonders nützlich im Zusammenhang mit Krebs, in welchem gerichtetes Zellabtöten wünschenswert ist. Die Adenovirusvektoren sind für die Behandlung von Krebsen wie Prostata nützlich. Die Vektoren können auch zum Detektieren der Anwesenheit von Androgenrezeptor produzierenden Zellen in zum Beispiel einer geeigneten biologischen (wie zum Beispiel klinischen) Probe nützlich sein. Weiter kann der/die Adenovirusvektor(en) wahlweise selektiv eines oder mehrere Proteine von Interesse in einer Zielzelle durch die Verwendung eines PB-TRE produzieren.
Wir fanden heraus, dass die Adenovirusvektoren der Erfindung vorzugsweise in Zellen replizieren, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel AR-produzierenden Zellen (d. h. in einer signifikant höheren Ausbeute als in Nicht-AR-produzierenden Zellen). Diese Replikationspräferenz ist indiziert durch Vergleichen des Replikationsspiegels (d. h. Titer) in Zellen, die einem PB-TRE erlauben, zu funktionieren, mit dem Replikationsspiegel in Zellen, die einem PB-TRE nicht zu funktionieren erlauben. Die Replikationspräferenz ist sogar noch signifikanter, da die Adenovirusvektoren der Erfindung tatsächlich in einer signifikant niedrigeren Rate in Zellen replizieren, welche einem PB-TRE nicht erlauben, zu funktionieren, als Wildtypvirus. Vergleich des Titers eines PB-TRE produzierenden Zelltyps mit dem Titer eines PB-Mangelzelltyps stellt ein Schlüsselanzeichen bereit, dass die Gesamtreplikationspräferenz aufgrund der reduzierten Replikation in PB-Mangelzellen ebenso wie die Replikation in PB-produzierenden Zellen erhöht ist. Folglich nutzt die Erfindung und zieht einen Vorteil aus dem, was als ein unerwünschter Aspekt von adenoviralen Faktoren erachtet worden ist, nämlich ihre Replikation und mögliche gleichzeitige Immunogenität. Eine entfliehende Infektion wird verhindert aufgrund der zellspezifischen Anforderungen für virale Replikation. Ohne zu wünschen, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, bemerken die Erfinder, dass die Produktion von Adenovirusproteinen dazu dienen kann, das Immunsystem zu aktivieren und/oder zu stimulieren, entweder allgemein oder spezifisch in Richtung zu Zielzellen, die adenovirale Proteine produzieren, was eine wichtige Überlegung im Zusammenhang mit Krebs sein kann, wo Patienten oftmals mäßig bis stark immunkomprimiert sind.
Unter wenigstens gewissen Bedingungen ist das PB-TRE in der Lage, einen signifikant höheren Grad von Zellspezifität zu vermitteln, als zwei andere prostataspezifische TREs, das prostataspezifisch Antigen-TRE (PSA-TRE) oder das humane glanduläre Kallikrein-TRE (hKLK2-TRE). In Experimenten mit Adenoviren, in welchen mehrere adenovirale Replikationsgene unter der Kontrolle von mehreren prostataspezifischen TREs waren, zeigten die PB-TRE umfassenden Adenoviren einen signifikant höheren Grad an zellspezifischer Replikation als Viren, umfassend ein PSA-TRE oder hKLK2-TRE. Diese Ergebnisse sind im Detail in dem Beispielabschnitt beschrieben. Diese Erkenntnisse sind besonders überraschend, da menschliche Prostatazellen getestet worden sind und das PB-TRE von der Ratte gewonnen worden ist, wohingegen das PSA-TRE und hKLK-2TRE aus humaner DNA gewonnen worden sind.
Wie in dem Beispielabschnitt gezeigt, wurden zwei adenovirale Vektoren konstruiert, in welchen zwei Adenovirusgene, E1A und E1B, unter der Kontrolle eines PSA-TRE oder eines PSA-TREs sind. E1A ist vertretbarerweise wichtiger für die virale Replikation als E1B, da E1A von irgendwelchen anderen viralen Genen, einschließlich E1B, exprimiert wird und für die E1B-Expression erforderlich ist. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651: 175–208; Flint (1986) Advances Virus Research 31: 169–228; Grand (1987) Biochem. J. 241: 25–38. Der Vektor, in welchem ein PB-TRE E1A-Expression kontrolliert, zeigte eine unerwartet höhere Spezifität der Replikation als der Vektor, in welchem ein PSA-TRE E1A kontrolliert. Folglich kann wenigstens unter gewissen Bedingungen ein PB-TRE einen größeren Grad an Zellspezifität der viralen Replikation erlauben als ein PSA-TRE.
Das PB-TRE ist ebenfalls zellspezifischer als TRE von humanem glandulärem Kallikrein-1-Gen (hKLK2) oder hKLK2-TRE. Ähnlich wie das Probasingen ist das hKLK2-Gen ausschließlich in der Prostata exprimiert, wird durch Androgene hauptsächlich durch Transkriptionsaktivierung heraufreguliert und enthält AREs in seinem TRE. Wolf et al. (1992) Molec. Endocrinol. 6: 753–762. Morris (1989) Clin. Exp. Pharm. Physiol. 16: 345–351; Qui et al. (1990) J. Urol. 144: 1550–1556; Young et al. (1992) Biochem. 31: 818–824; Schedlich et al. (1987) DNA 6: 429–437; Young et al. (1992) Biochem. 31: 818–824; Schedlich et al. (1987) DNA 6: 429–437; und Murtha et al. (1993) Biochem. 32: 6459–6464. Wie im Beispielabschnitt gezeigt, wurde in zwei gesonderten adenoviralen Vektoren ein PSE-TRE unter die Kontrolle von E1A-Expression gestellt. In einem Vektor wurde E1B durch ein PB-TRE kontrolliert; in dem anderen kontrollierte ein hKLK2-TRE die E1B-Expression. Folglich, während PB-TRE und hKLK2 beide prostataspezifisch sind, zeigte der adenovirale Vektor, in welchem PB-TRE E1B kontrollierte, unerwarteterweise eine bis zu 8-fach höhere Zellspezifität in der Replikation als der Vektor, in welchem hKLK2 E1B kontrollierte. Folglich kann zumindest unter gewissen Bedingungen ein PB-TRE einen größeren Grad an Zellspezifität der Replikation in humanen Prostatazellen erlauben als jedes von zwei anderen prostataspezifischen TREs, ein PSA-TRE oder ein hKLK2-TRE. Diese Ergebnisse sind sogar noch überraschender unter Berücksichtigung, dass ein PB-TRE aus Ratten gewonnen worden ist, während sowohl ein PSA-TRE als auch ein hKLK2-TRE human sind.
In dem Beispielabschnitt präsentierte Daten zeigen auch, dass ein Adenovirus, in welchem zwei prostataspezifische TREs die Replikation von zwei adenoviralen Genen kontrollieren, in der Lage ist, LNCaP-Tumore in Nacktmäusen zu behandeln. Nachdem tastbare Tumore ausgebildet worden waren, wurden den Mäusen Adenoviren injiziert, in welchen ein PB-TRE E1A kontrolliert und ein PSA-TRE auch E1B kontrolliert. Die meisten der Tiere (4/7) waren frei von tastbaren Tumoren am Tag 42. Dieses günstige Ergebnis wurde mit nur einer einzelnen Adenovirusdosis erhalten. Diese Studie zeigte, dass ein Adenovirus der vorliegenden Erfindung gegen LNCaP-Tumortransplantate in vivo wirksam war.
Allgemeine Techniken
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, solange nicht anderweitig angegeben, übliche Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanten Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie nutzen, welche innerhalb des Fachwissens liegen. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt, wie zum Beispiel „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, Hrsg., 1984); „Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, Hrsg., 1987); „Methods in Enzymology" (Acadmic Press, Inc.); „Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Wie & C. C. Blackwell, Hrsg.); „Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, Hrsg., 1987); „Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); „PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Multis et al., Hrsg., 1994); und „Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., Hrsg., 1991).
Für Techniken im Zusammenhang mit Adenovirus, siehe unter anderem Felgner und Ringold (1989) Nature 337: 387–388; Berkner und Sharp (1983) Nucl. Acids Res. 11: 6003–6020; Graham (1984) EMBO J. 3: 2917–2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67: 5911–5921; und Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802–8806.
Definitionen
Ein "Probasingen-(PB-) Transkriptionsresponseelement", "Probasin-(PB-) Transkriptionsregulationselement", "PB-TRE", "PBE" und Ähnliche geben eine Polynukleotidsequenz, vorzugsweise eine DNA-Sequenz, an, welche die Transkription einer operabel gekoppelten Polynukleotidsequenz in einer Wirtszelle, die einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, steigert, wie zum Beispiel eine Wirtszelle, die den Androgenrezeptor exprimiert, wie zum Beispiel eine Prostatazelle. Ein PB-TRE steigert folglich den Transkriptionsgrad einer operabel gekoppelten DNA-Sequenz in einer Prostatazelle im Verhältnis zu dem Transkriptionsgrad in einer Nicht-Prostatazelle. Ein PB-TRE umfasst wenigstens einen Teil eines PB-Promoters und/oder eines PB-Enhancers (welcher ein ARE oder Androgenrezeptorbindungsstelle einschließen kann). Das PB-TRE kann einen heterologen (nicht-PB-TRE) Promoter und einen PB-TRE-Enhancer oder einen PB-TRE-Promoter und einen heterologen Enhancer umfassen. Verfahren sind hierin zum Messen der Aktivität eines PB-TRE und folglich zum Bestimmen, ob eine gegebene Zelle einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, beschrieben.
Wie detaillierter hierin beschrieben, kann ein PB-TRE jede einer Anzahl von Konfigurationen umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf einen PB-Promoter, einen PB-Enhancer, einen PB-Promoter und einen PB-Enhancer (vorzugsweise umfassend eine ARE-Stelle), einen PB-Promoter und einen Nicht-PB-(heterologen) Enhancer; einen Nicht-PB (heterologen) Promoter und einen PB-Enhancer; einen Nicht-PB-Promoter und mehrere PB-Enhancer; und Multimere der Vorstehenden. Verfahren sind hierin zum Messen der Aktivität eines PB-TRE beschrieben und folglich zum Bestimmen, ob eine gegebene Zelle einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt. Promoter und Enhancer eines PB-TRE können in jeder Orientierung und/oder Distanz von der kodierenden Sequenz von Interesse sein und umfassen Multimere der Vorstehenden, solange die gewünschte zellspezifische PB-Transkriptionsaktivität erhalten wird. Transkriptionsaktivierung kann in einer Anzahl von Wegen gemessen werden, die in der Technik bekannt sind (und detaillierter unten beschrieben sind), wird jedoch allgemein durch Detektion und/oder Quantifizierung von mRNA oder des Proteinproduktes der kodierenden Sequenz unter der Kontrolle von (d. h. operativ gekoppelt an) eines PB-TRE gemessen. Wie hierin diskutiert kann ein PB-TRE variierende Längen haben und eine variierende Sequenzzusammensetzung haben. Durch „Transkriptionsaktivierung" oder eine „Steigerung in der Transkription" ist beabsichtigt, dass Transkription über Grundwerte in der Zielzelle (d. h. Zellen, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel AR-produzierende Zellen) um wenigstens ungefähr das Doppelte, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 5-fache, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 10-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 20-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 50-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 100-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 200-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 400- bis ungefähr 500-fache, sogar noch bevorzugter ungefähr das 1000-fache gesteigert wird. Grundwerte sind allgemein das Maß an Aktivität, falls vorhanden, in einer Nicht-AR-produzierenden Zelle oder das Maß an Aktivität (falls vorhanden) eines Reporterkonstruktes, dem ein PB-TRE fehlt, wie getestet in einer AR-produzierenden Zelle. Wahlweise kann ein Transkriptionsterminator oder Transkriptions-„Silencer" stromaufwärts des PB-TRE platziert werden, wodurch folglich eine ungewollte durchlesende Transkription des kodierenden Segmentes unter der Transkriptionskontrolle des PB-TRE verhindert wird. Auch kann der endogene Promoter des kodierenden Segmentes, das unter die Transkriptionskontrolle des PB-TRE gestellt werden soll, wahlweise deletiert werden.
Eine „funktionell konservierte" Variante eines PB-TRE ist ein PB-TRE, welches sich von einem anderen PB-TRE unterscheidet, aber welches immer noch die Fähigkeit bewahrt, die Transkription eines operabel gekoppelten Polynukleotids zu steigern, besonders zellspezifische Transkriptionsaktivität. Der Unterschied in PB-TREs kann an Unterschieden in linearen Sequenzen liegen, die zum Beispiel aus einzelnen oder mehreren Basenmutation(en), Addition(en), Deletion(en), Insertionen) und/oder Modifikationen) der Basen stammen. Die Unterschiede können auch aus Änderungen in dem/den Zucker(n) und/oder Verknüpfungen) zwischen den Basen eines PB-TRE stammen.
Wie hierin verwendet, gibt „prostataspezifische Genexpression" Genexpression an, welche hauptsächlich in Prostatazellen oder in Zellen geschieht, die die Genprodukte exprimieren, die typisch sind für Prostatazellen, die jedoch zu einem geringeren Grad in anderen Zellen geschieht. „Prostataspezifische Genexpression" gibt an, dass diese Genexpression wenigstens ungefähr doppelt, vorzugsweise wenigstens ungefähr 5-fach, vorzugsweise ungefähr wenigstens 10-fach, bevorzugter wenigstens ungefähr 20-fach, bevorzugter wenigstens ungefähr 50-fach, bevorzugter wenigstens ungefähr 100-fach, noch bevorzugter wenigstens ungefähr 200-fach, noch bevorzugter wenigstens ungefähr 400- bis ungefähr 500-fach, noch bevorzugter wenigstens ungefähr 1000-fach höher in Prostatazellen oder in Zellen, die Genprodukte exprimieren, die typisch sind für Prostatazellen, als in anderen Zellen ist. Gene, die prostataspezifische Genexpression zeigen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf prostataspezifisches Antigen und Androgenrezeptor.
Ein „prostataspezifisches Transkriptionsresponseelement", „prostataspezifisches Transkriptionsregulationselement", „prostataspezifisches TRE", „PS-TRE" und Ähnliche geben ein DNA-Segment an, das in der Lage ist, prostataspezifische Genexpression zu vermitteln (d. h. regulieren) und/oder zu steigern. Solch ein Segment ist verkörpert durch, aber nicht beschränkt auf ein Probasin-Transkriptionsregulationselement (PB-TRE) und prostataspezifisches Antigentranskriptionsregulationselement (PSA-TRE), das TRE des humanen glandulären Kallikrein-1-Gens (hGK-1 oder hKLK2, kodierend das hK2-Protein), Transkriptionsregulationselemente davon, welche in der Lage sind, prostataspezifische Genexpression zu vermitteln.
„Prostataspezifischer Antigen-(PSA-) Promoter-Enhancer", „prostataspezifisches Antigen-(PSA-) Transkriptionsregulationselement", „PSA-TRE", „prostataspezifischer Antigen-Promoter-Enhancer", „PSE" oder Ähnliche sind hierin definiert als Transkriptionsregulationselement(e), abgeleitet aus der 5'-Region des prostataspezifischen Antigens (PSA) und ausreichend, prostataspezifische Genexpression zu vermitteln. Ein PSA-TRE umfasst wenigstens einen Teil eines PSA-TRE-Promoters und/oder eines PSA-TRE-Enhancers. Das PSA-TRE kann einen heterologen (Nicht-PSA-TRE-) Promoter und einen PSA-TRE-Enhancer oder einen PSA-TRE-Promoter und einen heterologen (Nicht-PSA-TRE-) Enhancer umfassen. Verfahren zum Messen der Aktivität eines PSA-TRE und folglich zum Bestimmen, ob eine gegebene Zelle einem PSA-TRE zu funktionieren erlaubt, sind hierin beschrieben.
Das in Sequenz ID Nr. 2 abgebildete PSA-TRE ist dasselbe wie jenes das in Genbank-Zugangsnummer U37672 wieder gegeben und veröffentlicht ist. Schuur et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7043–7051. Eine Varianten-PSA-TRE-Nukleotidsequenz ist abgebildet in Sequenz ID Nr. 3. Dies ist das in dem CN706-Klon 35.190.13 enthaltene PSA-TRE. CN706 ist ein adenoviraler Vektor, in welchem sich das E1A-Gen in Ad5 unter der Transkriptionskontrolle eines PSA-TRE befindet. CN706 zeigt selektive Cytotoxizität gegen PSA exprimierende Zellen in vitro und in vivo. Rodriguez et al. (1997) Cancer Res. 57: 2559–2563. CN706 wurde durch 293- und LNCaP-Zellen hindurchgeführt. Ein Klon, genannt 35.190.13, wurde isoliert. Die Struktur dieses Klons wurde durch PCR, Restriktionsendonukleaseverdauung und Southern Blotting bestätigt. Beide DNA-Stränge des CN706-Klons 35.190.13 wurden zwischen den Positionen 1 und 3537 sequenziert. Sieben einzelne Basenpaaränderungen wurden im Vergleich mit der von Schuur et al. (1996) berichteten Sequenz in dem PSA-TRE gefunden. Diese Punktmutationen sind nicht in dem ARE und es ist folglich unwahrscheinlich, dass sie die Funktion des Enhancers beeinflussen. Eine Mutation wurde in dem PSA-Promoter gefunden, aber es ist nicht wahrscheinlich, dass sie die Genexpression dieses Promoters beeinflusst. Zusätzlich zu diesen Mutationen wurde eine Fehlsinnmutation in dem ersten Exon von E1A gefunden. Dieser C-zu-G-Übergang an Position 3032 resultiert in einer Glu-zu-Arg-Änderung in der E1A-Proteinsequenz. Diese Mutation scheint die E1A-Funktion nicht zu vermindern.
„Androgenrezeptor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, dessen Funktion ist, spezifisch an Androgen zu binden, und als eine Konsequenz der spezifischen Bindung, ein Androgenresponseelement (ARE) zu erkennen und zu binden, wonach der AR in der Lage ist, die Transkriptionsaktivität zu regulieren. Der AR ist ein nukleärer Rezeptor, der, wenn er aktiviert ist, an zelluläre androgenresponsive(s) Elemente) bindet. In normalen Zellen ist der AR durch Androgen aktiviert, aber in nicht normalen Zellen (einschließlich malignen Zellen) kann der AR durch nicht-androgene Mittel aktiviert werden, einschließlich anderen Hormonen als Androgenen. In den Begriff „Androgenrezeptor" sind mutierte Formen eines Androgenrezeptors, solange die Funktion ausreichend bewahrt ist, eingeschlossen. Mutanten schließen Androgenrezeptoren mit Aminosäureadditionen, -insertionen, -verkürzungen und – deletionen ein, solange die Funktion ausreichend bewahrt ist. In diesem Zusammenhang ist ein funktioneller Androgenrezeptor einer, der sowohl Androgen als auch nach Androgenbindung ein ARE bindet.
Ein „Adenovirusvektor" oder „adenoviraler Vektor" (wird austauschbar verwendet) ist ein Begriff, der in der Technik gut verstanden ist und allgemein ein Polynukleotid (hierin definiert) umfasst, umfassend alles oder einen Teil eines Adenovirusgenoms. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung enthält ein Adenovirusvektor ein PB-TRE, operabel gekoppelt an ein Polynukleotid. Das operabel gekoppelte Polynukleotid kann adenoviral oder heterolog sein. Ein adenovirales Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung kann jedes von etlichen Formen sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf nackte DNA, DNA, die in einer Adenovirushülle verkapselt ist, DNA, die in einer anderen viralen oder virusähnlichen Form (wie zum Beispiel Herpes-simplex-Virus und AAV) verpackt ist, DNA, die in Liposomen verpackt ist, DNA, die mit Polylysin komplexiert ist, mit synthetischen polykationischen Molekülen komplexiert ist, mit Transferrin konjugiert ist und mit Verbindungen wie PEG komplexiert ist, um das Molekül immunologisch zu „maskieren" und/oder die Halbwertszeit zu steigern, oder konjugiert an ein nicht-virales Protein. Vorzugsweise ist das Polynukleotid DNA. Wie hierin verwendet, schließt „DNA" nicht nur die Basen A, T, C und G ein, sondern schließt auch jedes ihrer Analoga oder modifizierte Formen dieser Basen wie methylierte Nukleotide, Internukleotidmodifikationen wie ungeladene Verknüpfungen und Thioate, die Verwendung von Zuckeranaloga und modifizierte und/oder alternative Gerüststrukturen wie Polyamide ein. Für Zwecke dieser Erfindung sind Adenovirusvektoren in einer Zielzelle replikationskompetent.
Der Begriff „Polynukleotid" oder „Nukleinsäure", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeder Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Folglich schließt dieser Begriff ein, aber ist nicht beschränkt auf einzel-, doppel- oder mehrfachsträngige DNA oder RNA, genomische DNA, cDNA, DNA-RNA-Hybride oder ein Polymer, umfassend Purin- und Pyrimidinbasen oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte, nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen. Das Gerüst des Polynukleotids kann Zucker- und Phosphatgruppen (wie sie typischerweise in RNA oder DNA gefunden werden können) oder modifizierte oder substituierte Zucker- oder Phosphatgruppen umfassen. Alternativ kann das Gerüst des Polynukleotids ein Polymer aus synthetischen Untereinheiten wie zum Beispiel Phosphoramidate umfassen und kann folglich ein Oligodesoxynukleosidphosphoramidat (P-NH₂) oder ein gemischtes Phosphoramidat-Phosphodiester-Oligomer sein. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841–8; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2318–23; Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966–73. Eine Phosphothioatverknüpfung kann anstelle einer Phosphodiesterverknüpfung verwendet werden. Braun et al. (1988) J. Immunol. 141: 2084–9; Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32: 1057–1064. Zusätzlich kann ein doppelsträngiges Polynukleotid aus dem einzelsträngigen Polynukleotidprodukt durch chemische Synthese, entweder durch Synthetisieren des komplementären Stranges und Annealing des Stranges unter geeigneten Bedingungen oder durch Synthetisieren des komplementären Strangs de novo unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einem geeigneten Primer erhalten werden.
Die Folgenden sind nicht beschränkende Beispiele von Polynukleotiden: ein Gen oder Genfragment, Exons, Introns, mRNA, tRNA, rRNA, Ribozyme, cDNA, rekombinante Polynukleotide, verzweigte Polynukleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNA jeder Sequenz, isolierte RNA jeder Sequenz, Nukleinsäuresonden und Primer. Ein Polynukleotid kann modifizierte Nukleotide umfassen, wie zum Beispiel methylierte Nukleotide und Nukleotidanaloga, Uracyl, andere Zucker und Kopplungsgruppen wie Fluorribose und Thioat und Nukleotidverzweigungen. Die Sequenz aus Nukleotiden kann durch Nicht-Nukleotidbestandteile unterbrochen sein. Ein Polynukleotid kann nach der Polymerisation weiter modifiziert sein, wie zum Beispiel durch Konjugation mit einem Markierungsbestandteil. Andere Arten an Modifikation, die in diese Definition eingeschlossen sind, sind Caps, Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon und Einführen von Mitteln für das Anheften des Polynukleotids an Proteine, Metallione, Markierungsbestandteile, andere Polynukleotide oder einen festen Untergrund.
Ein Polynukleotid oder eine Polynukleotidregion hat einen gewissen Prozentsatz (zum Beispiel 80 %, 85 %, 90 % oder 95 %) an „Sequenzidentität" mit einer anderen Sequenz, das bedeutet, dass, wenn sie angeordnet werden, die Prozentsätze der Basen beim Vergleichen der beiden Sequenzen dieselben sind. Diese Anordnung und prozentuale Homologie oder Sequenzidentität kann unter Verwendung von Softwareprogrammen bestimmt werden, die in der Technik bekannt sind, zum Beispiel jene, die beschrieben sind in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg., 1987), Ergänzung 30, Abschnitt 7.7.18, Tabelle 7.7.1. Ein bevorzugtes Anordnungsprogramm ist ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania).
Wie hierin verwendet, ist „eine Zelle, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt", eine Zelle, in welcher die Funktion eines PB-TRE „ausreichend konserviert" ist, „eine Zelle, in welcher ein PB-TRE funktional ist" ist, eine Zelle, in welcher ein PB-TRE, wenn es operabel zum Beispiel an ein Reportergen gekoppelt ist, die Expression des Reportergens um wenigstens das Doppelte, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 5-fache, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 10-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 20-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 50-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 100-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 200-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 400- bis 500-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 1000-fache im Vergleich mit der Expression desselben Reportergens steigert, wenn es an das PB-TRE nicht operabel gekoppelt ist. Verfahren zum Messen von Spiegeln (entweder relativ oder absolut) der Expression sind in der Technik bekannt und sind hierin beschrieben.
„Unter Transkriptionskontrolle" ist ein in der Technik wohl verstandener Begriff und gibt an, dass Transkription einer Polynukleotidsequenz, gewöhnlich eine DNA-Sequenz, davon abhängt, dass sie operabel (operativ) an ein Element gekoppelt ist, welches zu dem Starten von Transkription beiträgt oder sie fördert. Wie unten festgestellt, bezieht sich „operabel gekoppelt" auf Nebeneinanderliegen, worin die Elemente sich in einer Anordnung befinden, die ihnen zu funktionieren erlaubt.
Wie hierin verwendet, ist „Cytotoxizität" ein Begriff, der in der Technik gut verstanden ist, und bezieht sich auf einen Zustand, in welchem eine oder mehrere biochemischen oder biologischen Funktionen einer Zelle fehlerhafterweise beeinträchtigt (d. h. inhibiert oder erhöht) sind. Diese Aktivitäten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Metabolismus, zelluläre Replikation, DNA-Replikation, Transkription, Translation und Aufnahme von Molekülen. „Cytotoxizität" schließt Zelltod und/oder Cytolyse ein. Tests sind in der Technik bekannt, welche Cytotoxizität anzeigen, wie zum Beispiel Farbstoffausschluss, ³H-Thymidinaufnahme und Plaquetests. Der Begriff „selektive Cytotoxizität", wie er hierin verwendet ist, bezieht sich auf die Cytotoxizität, die durch einen Adenovirusvektor der vorliegenden Erfindung einer Zelle, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, verliehen wird, wenn sie mit der Cytotoxzitität verglichen wird, die durch das Adenovirus einer Zelle, welche einem PB-TRE nicht zu funktionieren erlaubt, verliehen wird. Solche Cytotoxizität kann zum Beispiel durch Plaquetest, Reduktion oder Stabilisierung der Größe von tumorumfassenden Zielzellen oder Reduktion oder Stabilisierung von Serumspiegeln eines für die Tumorzellen charakteristischen Markers oder eines gewebespezifischen Markers, z. B. ein Krebsmarker wie prostataspezifisches Antigen, gemessen werden.
„Replikation" und „Vermehrung" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Fähigkeit eines Adenovirusvektors der Erfindung, sich zu replizieren oder zu vermehren. Dieser Begriff ist in der Technik gut verstanden. Für Zwecke dieser Erfindung schließt Replikation die Produktion von Adenovirusproteinen ein und ist allgemein gerichtet auf die Reproduktion von Adenovirus. Replikation kann unter Verwendung von Tests gemessen werden, die in der Technik Standard sind und hierin beschrieben sind, wie zum Beispiel ein Bursttest oder Plaquetest. „Replikation" und „Vermehrung" schließen jede Aktivität, die direkt oder indirekt in den Vorgang der Virusherstellung involviert ist, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf virale Genexpression, die Produktion viraler Proteine, Nukleinsäuren oder anderer Bestandteile, das Verpacken von viralen Komponenten in vollständige Viren und Zelllyse, ein.
Ein „heterologes Gen" oder „Transgen" ist jedes Gen, das im Wildtypadenovirus nicht vorhanden ist. Vorzugsweise wird das Gen auch nicht in der Zielzelle vor dem Einführen durch den Adenovirusvektor exprimiert oder vorhanden sein. Beispiele bevorzugter Transgene sind unten bereitgestellt.
Ein „heterologer" Promoter oder Enhancer ist einer, der nicht mit einer 5'-flankierenden Sequenz von Probasingen im Zusammenhang steht oder von ihr abgeleitet ist. Beispiele eines heterologen Promoters oder Enhancers sind der Albuminpromoter oder -enhancer und andere virale Promotoren und Enhancer wie zum Beispiel SV40.
Ein „endogener" Promoter, Enhancer oder TRE ist nativ für oder abgeleitet von Adenovirus.
Der Begriff „operabel gekoppelt" bezieht sich auf die Orientierung von Polynukleotidelementen in einer funktionellen Beziehung. Ein TRE ist mit einem Kodiersegment operabel gekoppelt, falls das TRE die Transkription der kodierenden Sequenz fördert. Operabel gekoppelt bedeutet, dass die verknüpft werdenden DNA-Sequenzen allgemein fortlaufend sind und sie sich, wo es notwendig ist, um zwei proteinkodierende Regionen zu verbinden, fortlaufend und in demselben Leseraster befinden. Da jedoch Enhancer allgemein funktionieren, wenn sie von dem Promoter durch etliche Kilobasen getrennt sind, und Intronsequenzen von variabler Länge sein können, können gewisse Polynukleotidelemente operabel gekoppelt sein, aber nicht fortlaufend sein.
Eine „Wirtszelle" schließt eine einzelne Zelle oder Zellkultur ein, welche ein Empfänger jedes Vektors dieser Erfindung sein kann oder war. Wirtszellen schließen Nachfahren einer einzelnen Wirtszelle ein und die Nachfahren müssen nicht notwendigerweise vollständig identisch (in der Morphologie oder im Gesamt-DNA-Komplement) mit der elterlichen Ursprungszelle aufgrund von natürlichen, zufälligen oder gewollten Mutation und/oder Änderung sein. Eine Wirtszelle schließt mit einem adenoviralen Vektor dieser Erfindung in. vivo oder in vitro transfizierte oder infizierte Zellen ein.
Eine „Zielzelle" ist jede Zelle, die einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt. Vorzugsweise ist eine Zielzelle eine Säugerzelle, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine Zelle, die Androgenrezeptor exprimiert, vorzugsweise eine Säugerzelle, die endogen Androgenrezeptor exprimiert, bevorzugt eine humane Zelle und bevorzugter eine humane Zelle, die in der Lage ist, einem PB-TRE zu erlauben, dass es funktioniert, und die einen Androgenrezeptor exprimiert.
Wie hierin verwendet, beziehen sich „neoplastische Zellen", „Neoplasie", „Tumor", „Tumorzellen", „Krebs" und „Krebszellen" auf Zellen, welche ein verhältnismäßig autonomes Wachstum zeigen, so dass sie einen fehlerhaften Wachstumsphänotypen zeigen, der durch einen signifikanten Verlust der Kontrolle der Zellproliferation gekennzeichnet ist. Neoplastische Zellen können benigne oder maligne sein.
Eine „biologische Probe" umfasst eine Reihe von Probentypen, gewonnen aus einem Individuum, und kann in einem diagnostischen oder Überwachungstest verwendet werden. Die Definition umfasst Blut und andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben wie Biopsieproben oder Gewebekulturen oder davon abgeleitete Zellen und die Nachfahren davon. Die Definition inkludiert auch Proben, welche in irgendeiner Weise nach ihrer Beschaffung manipuliert worden sind, wie zum Beispiel durch Behandlung mit Reagenzien, Solubilisierung oder Anreicherung für gewisse Bestandteile wie Proteine oder Polynukleotide. Der Begriff „biologische Probe" umfasst eine klinische Probe und schließt auch Zellen in Kultur, Zellüberstände, Zelllysate, Serum, Plasma, biologische Fluide und Gewebeproben ein.
Ein „Individuum" ist ein Vertebrat, bevorzugt ein Säuger, bevorzugter ein Mensch. Säuger schließen ein, sind jedoch nichtbeschränkt auf Bauernhoftiere, Sporttiere und Haustiere.
Eine „effektive Menge" ist eine Menge, die ausreichend ist, günstige oder gewünschte klinische Ergebnisse zu bewirken. Eine effektive Menge kann in einer oder mehreren Applikationen verabreicht werden. Für Zwecke dieser Erfindung ist eine effektive Menge eines adenoviralen Vektors eine Menge, die ausreichend ist, das Fortschreiten des Erkrankungszustands zu lindern, zu verbessern, zu stabilisieren, umzukehren, zu verlangsamen oder zu verzögern.
Wie hierin verwendet, ist „Behandlung" ein Ansatz, um günstige oder gewünschte klinische Ergebnisse zu erzielen. Für Zwecke dieser Erfindung schließen günstige oder gewünschte klinische Ergebnisse ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die Erleichterung von Symptomen, die Verminderung des Erkrankungsausmaßes, Stabilisieren (d. h. nicht Verschlechtern) des Erkrankungszustandes, Verhindern des Ausbreitens (d. h. Metastase) von Erkrankung, Verzögern oder Verlangsamen des Erkrankungsfortschreitens, Verbesserung oder Linderung des Erkrankungszustandes und Remission (ob teilweise oder total), ob detektierbar oder undetektierbar. „Behandlung" kann auch ein Verlängern des Überlebens im Vergleich mit dem erwarteten Überleben, falls keine Behandlung empfangen wird, bedeuten.
Ein „maskiertes Adenovirus" ist ein Adenovirus, welches mit einem hydrophilen Polymer („Maskiermittel") komplexiert worden ist. Die Adenoviren sind jene, die in der gegenwärtigen Erfindung offenbart werden. Maskiermittel haben vorzugsweise eine niedrige Immunogenität. Beispiele annehmbarer hydrophiler Polymere schließen ein: Polyethylen/Polypropylen-Copolymere, Polyacrylsäureanaloga, Zuckerpolymere wie Cellulose, Polyformaldehyd, Poly(N-vinylpyrollidon), Polyethylengloycol (PEG) und Ähnliche. Das hydrophile Polymer kann durch kovalentes oder nicht kovalentes Anheften an die Capsidproteine des Virus, besonders die Hexon- und Fasercapsidproteine, komplexiert sein. Ein bevorzugtes hydrophiles Polymer ist PEG und ein bevorzugtes maskiertes Adenovirus ist PEG, das kovalent an ein Adenovirus gekoppelt ist („kovalent pegyliertes Adenovirus").
„Lindern" einer Erkrankung bedeutet, dass das Ausmaß und/oder unerwünschte klinische Manifestierungen eines Erkrankungszustandes reduziert und/oder der Zeitverlauf des Fortschreitens verlangsamt oder verlängert wird, im Vergleich mit dem Nicht-Verabreichen von adenoviralen Vektoren der vorliegenden Erfindung.
Adenovirale Vektoren mit Replikationsspezifität für Androgenrezeptor-produzierende Zellen
Die vorliegende Erfindung stellt auch adenovirale Vektorkonstrukte bereit, welche ein adenovirales Gen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE umfassen. Vorzugsweise ist das Adenovirusgen eines, das zu Cytotoxizität beiträgt (ob direkt und/oder indirekt), bevorzugter eines, das zu Zelltod beiträgt oder ihn bewirkt und sogar noch bevorzugter ist das adenovirale Gen unter der Transkriptionskontrolle eines PB-TRE ein Gen, das für die adenovirale Replikation essentiell ist. Beispiel adenoviraler Gene, welche zu Cytotoxizität beitragen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf ein Adenovirus Death Protein (ADP). Wenn der/die Adenovirusvektor(en) selektiv (d. h. bevorzugt) replikationskompetent für die Vermehrung in Zielzellen ist, wodurch einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt wird, wie zum Beispiel Zellen, die den Androgenrezeptor (AR) exprimieren, werden diese Zellen bevorzugt nach adenoviraler Proliferation abgetötet werden. Durch Kombinieren, in vitro oder in vivo, des/der Adenovirusvektors(en) mit der Mischung aus Prostata- und Nicht-Prostatazellen repliziert/en der/die Adenovirusvektor(en) bevorzugt in den Zielprostatazellen. Wenn die Zielzellen erst einmal aufgrund von selektiver cytotoxischer und/oder cytolytischer Replikation zerstört werden, ist die Adenovirusvektorreplikation signifikant reduziert, wodurch folglich die Möglichkeit des Entgleisens der Infektion und unerwünschte Bystander-Wirkungen vermindert werden. In-vitro-Kulturen können bewahrt werden, um kontinuierlich die Mischung (wie zum Beispiel eine Biopsie oder andere geeignete biologische Probe) für das Auftreten (d. h. Anwesenheit) und/oder Wiederauftreten der Zielzelle, z. B. jede Zelle, die einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine Androgenrezeptorproduzierende Krebszelle, zu überwachen. Um Cytotoxizität weiter sicherzustellen, können auch eines oder mehrere Transgene mit einer cytotoxischen Wirkung vorhanden sein und sich unter selektiver Transkriptionskontrolle befinden. In dieser Ausführung mag man ein höheres Vertrauen bereitstellen, dass die Zielzellen zerstört werden. Zusätzlich oder alternativ kann ein Adenovirusgen, das zu Cytotoxizität und/oder Zelltod beiträgt (wie zum Beispiel ADP), in den adenoviralen Vektor inkludiert sein, entweder ohne Transkriptionskontrolle oder unter selektiver Transkriptionskontrolle.
Die in dieser Erfindung verwendeten PB-TREs werden aus Nagerzellen abgeleitet, einschließend, aber nicht beschränkt auf Ratten. Vorzugsweise wird das PB-TRE von Rattenzellen abgeleitet. In einer Ausführung umfasst das PB-TRE einen Promoter eines Probasingens. In einer Ausführung umfasst das PB-TRE einen Enhancer aus einem Probasingen. In einer anderen Ausführung umfasst das PB-TRE einen Promoter aus einem Probasingen und einen Enhancer aus einem Probasingen. In gewissen Ausführungen, worin das PB-TRE einen Enhancer von einem Probasingen umfasst, kann der Enhancer mit einem Promoter aus einem Probasingen oder einem Promoter aus einem anderen Gen kombiniert sein. In gewissen Ausführungen, worin das PB-TRE einen Promoter aus einem Probasingen umfasst, kann der Promoter mit einem Enhancer aus einem Probasingen oder einem Enhancer aus einem anderen Gen kombiniert sein. Zusätzlich kann das PB-TRE mehrere Promotoren und/oder mehrere Enhancer, abgeleitet aus dem Probasingen oder anderem Gen oder anderen Genen, umfassen.
Ein DNA-Fragment, umfassend die 5'-flankierende PB-DNA, nt ungefähr –426 bis ungefähr +28 (Sequenz ID Nr. 1), trägt ausreichend Information, um die prostataspezifische, entwicklungsmäßig und hormonell regulierte Expression eines heterologen (Nicht-Probasin-) Gens in transgenen Mäusen zu lenken. Greenberg et al. (1994) Mol. Endocrinol. 8: 230–239; Foster et al. (1997) Cancer Res. 57: 3325–30. Ferner war diese Expression sowohl spezifisch männlich und auf die Epithelzellen der lateralen, dorsalen und ventralen Prostatalappen beschränkt. Die Demonstration, dass die Fremdgenaktivität Präkastrationsspiegel erreichte, wenn transgene Mäuse mit Testosteron ergänzt worden sind, zeigt, dass das PB-angetriebene Reportergen auf Androgene in vivo ansprechend war. Ferner könnte ein PB-TRE die Expression der großen Tumorantigen kodierenden Region von Affenvirus 40 in der Prostata der transgenen Mäuse antreiben. Greenberg et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3439–3443.
Demgemäß ist ein PB-TRE in einer Ausführung die Sequenz, die stromaufwärts des Probasin kodierenden Abschnittes liegt, umfassend zum Beispiel die in 1 gezeigte Sequenz (Sequenz ID Nr. 1). Diese Sequenz, zum Beispiel von ungefähr –426 bis ungefähr +28 im Verhältnis zu der Transkriptionsstartstelle, umfasst Proteinbindungsstellen, von denen angenommen wird, dass sie wichtig oder essentiell bei der zellspezifischen Transkription sind, einschließend ARE-1, ARE-2, eine CAAT-Box und eine TATAA-Box.
Alternativ umfasst ein PB-TRE zum Beispiel das DNA-Fragment stromaufwärts des PB-Gens zwischen den Basenpaaren ungefähr –286 und ungefähr +28 im Verhältnis zum Transkriptionsstart (Nukleotide ungefähr 141 bis ungefähr 454 von Sequenz ID Nr. 1). Rennie et al. (1993) Mol. Endocrinol. 7: 23–36. Sequenzanalyse enthüllte, dass dieses PB-TRE zwei ARE-Stellen (genannt ARE-1, auch bekannt als ARBS-1, welches einem Glucocorticoidresponseelement gleicht, bei ungefähr –236 bis ungefähr –223 relativ zum Transkriptionsstart (Nukleotide ungefähr 191 bis ungefähr 204 von Sequenz ID Nr. 1); und ARE-2, auch bekannt als ARBS-2, welches eine einzige Sequenz bei ungefähr –140 bis ungefähr –117 ist (Nukleotide ungefähr 286 bis ungefähr 310 von Sequenz ID Nr. 1)), die für Androgenregulation erforderlich sind, enthält. Eine einzelne Basenmutation in ARE-1 oder ARE-2 kann in dem Verlust von Androgeninduktion resultieren. Rennie et al. (1993) Mol. Endocrinol. 7: 23–36. Ein Fragment aus 5'-flankierender PB-DNA, enthaltend die zwei ARE-Stellen, könnte die Expression der bakteriellen Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) antreiben; Expression war prostataspezifisch und durch Androgene induzierbar, aber nicht durch Glucocorticoide. Greenberg et al. (1994) Mol. Endocrinol. 8: 230–239. Ähnlich wie das Probasingen wird das AR-Gen selber durch zwei ARE-Stellen stromaufwärts des kodierenden Abschnitts reguliert. Die erste ARE-Stelle des AR-Gens, ARE-1, erinnert an eine Hälfte des palindromischen Hormonresponseelementes und die zweite, ARE-2, ist identisch mit einem Teil der Probasinsequenz. Dai et al. (1996) Mol. Endocrinol. 10: 1582–94. Ein PB-Enhancer ist durch eine ARE-Stelle oder ein Paar an ARE-Stellen oder jede andere Sequenz, die in der Lage ist, einen Promoter bei der prostataspezifischen Transkription zu unterstützen, veranschaulicht. Ein sauberes Beabstanden zwischen ARE-Stellen kann für ihre Funktion ebenfalls wichtig sein.
Ein PB-TRE kann ebenfalls Multimere umfassen. Zum Beispiel kann ein PB-TRE eine Tandemreihe aus wenigstens zwei, wenigstens drei, wenigstens vier, wenigstens fünf PB-Promoterfragmenten umfassen. Alternativ könnte ein PB-TRE einen oder mehrere PB-Promotoren zusammen mit einem oder mehreren PB-Enhancern haben. Diese Multimere können auch Nicht-PB-Promoter- und/oder -Enhancersequenzen enthalten. Mehrere AREs wurden beim Konstruieren eines Transkriptionsregulationselementes, das durch Androgenrezeptor in vitro stark induzierbar ist, miteinander verbunden. Snoek et al. (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 59: 243–50. Bei Basensubstitutionen zwischen ARE-Stellen, falls mehrere ARE-Stellen in ein einzelnes PB-TRE inkludiert sind, wie es in der Technik bekannt ist, ist es unwahrscheinlich, dass Änderungen in der zellspezifischen Transkription verursacht werden, obwohl Deletionen die Transkription reduzieren oder steigern können, falls sie Bindungsstellen zu nah zueinander oder zu weit entfernt voneinander bringen oder sie rotieren, so dass sie sich auf gegenüberliegenden Stellen der DNA-Helix befinden, wie es in der Technik bekannt ist. Folglich, während die Erfinder nicht durch eine einzelne Theorie gebunden zu werden wünschen, ist es möglich, dass gewisse Modifikationen in modulierten resultierenden Expressionsspiegeln resultieren werden, einschließlich gesteigerten zellspezifischen Expressionsspiegeln.
Eine Reihe von kleineren Variationen der offenbarten PB-TRE-Sequenzen ist in der Lage, zellspezifische Transkription in Zellen, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Androgenrezeptor produzierende Zellen, zu vermitteln. Von gewissen Punktmutationen in einem Hexamer, das sowohl in ARE-1- als auch in ARE-2-Stellen in dem PB-TRE konserviert ist, ist bekannt, dass sie die AR-Bindung und Genaktivierung reduzieren. Rennie et al. (1993). Unter Berücksichtigung der ARE-Konsensussequenz und Ähnlichkeit der AREs mit dem Glucocorticoidresponseelement-(GRE) Motiv, gefunden bei der Androgenregulation des C3(1)-Gens, PSA-Gens und geschlechtsbeschränkten Proteingens [Rennie et al. (1993); Claessens et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 164: 833–840; De Vos et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 3439–3443; Riegman et al. (1992) Mol. Endocrin. 5: 1921–1930; Adler et al. (1991) Mol. Endocrin. 5: 1587–1596; und Dai et al. (1996) Mol. Endocrinol. 10: 1582–94], würde ein Fachmann erkennen, dass gewisse Änderungen hochkonservierter Basen in und um die AREs wahrscheinlich Genaktivierung und Zellspezifität negativ beeinflussen, während Änderungen in Basen, die nicht hochkonserviert sind, wahrscheinlich keine solchen Wirkungen haben werden. Gewisse Mutationen sind auch in der Lage, PB-TRE-Aktivität zu steigern, wie zum Beispiel die Änderung innerhalb des ARE-2 von vier Basen bei –130 bis –127 von CCAA zu TACT oder GTCT, was eine größere Induktion als das Wildtyp-PB-TRE zeigte. Internationale Anmeldung PCT/CA93/00319, veröffentlicht als WO 94/03594, 17. Februar 1994 für Matusik. Testen der Wirkungen der Änderung von Basen kann in vitro oder in vivo durch jedes in der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie zum Beispiel Mobilitätsverschiebungstests oder das Transfizieren von Vektoren, die diese Änderungen enthalten, in AR exprimierende und AR nicht exprimierende Zellen.
Als ein Beispiel, wie PB-TRE-Aktivität bestimmt werden kann; kann eine Polynukleotidsequenz oder ein Satz solcher Sequenzen unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden, wie zum Beispiel chemische Synthese, ortsgerichtete Mutagenese, PCR und/oder rekombinante Verfahren. Die zu testende(en) Sequenzen) können in einen Vektor, der ein geeignetes Reportergen enthält, das ein Reporterprotein kodiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galactosidase (kodiert durch das lacZ-Gen), Luciferase (kodiert durch das luc-Gen), alkalische Phosphatase, grünes fluoreszierendes Protein und Meerrettichperoxidase, inseriert werden. Solche Vektoren und Tests sind unter anderem von gewerblichen Quellen leicht erhältlich. Demzufolge geschaffene Plasmide werden in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, um für Expression des Reportergens, wie es durch das mutmaßliche PB-TRE kontrolliert wird, unter Verwendung von in der Technik bekannten Transfektionsverfahren zu testen, wie zum Beispiel Calciumphosphatfällung, Elektroporation, Liposomen (Lipofektion) und DEAE-Dextran. Geeignete Wirtszellen schließen jeden Zelltyp ein, der Androgenrezeptor produziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Prostatazellen, einschließlich Prostatatumorzellen wie LNCaP. Ein Androgenrezeptor kodierendes Gen kann in jede Zelle transformiert sein und in jeder Zelle exprimiert sein, die normalerweise AR nicht exprimiert; in solch einer Zelle wird ein PB-TRE funktional sein: Androgenrezeptor nicht produzierende Zellen wie HLF, HLE und 3T3, und die AR nicht produzierenden Prostatakrebszellen PC3 und DU145, können als eine Kontrolle verwendet werden. Ergebnisse werden durch Messen des Expressionsmaßes des Reportergens unter Verwendung von Standardtests gewonnen. Der Vergleich der Expression zwischen AR-produzierenden Zellen und den Kontrollzellen zeigt die Anwesenheit oder Abwesenheit von Transkriptionsaktivierung an. 3 ist ein Säulendiagramm, das Ergebnisse eines Luciferasetests abbildet, wodurch zellspezifische Genexpression, angetrieben durch ein PB-TRE, in LNCaP (PSA plus und androgenabhängige Prostatacarcinomzellen) und PC-3 (PSA minus und androgenunabhängige Prostatacarcinomzellen) gezeigt wird.
Einem PB-TRE der vorliegenden Erfindung kann ein Silencer fehlen oder nicht fehlen. Die Anwesenheit eines Silencers (d. h. ein negativ regulierendes, in der Technik bekanntes Element) kann beim Abschalten der Transkription (und folglich Replikation) in nicht permissiven (d. h. AR nicht produzierenden) Zellen unterstützen. Folglich kann die Anwesenheit eines Silencers eine gesteigerte zellspezifische Replikation durch effektiveres Verhindern der adenoviralen Vektorreplikation in Nicht-Zielzellen verleihen. Alternativ kann das Fehlen eines Silencers beim Bewirken von Replikation in Zielzellen unterstützen, wodurch folglich eine gesteigerte zellspezifische Replikation aufgrund von effektiverer Replikation in Zielzellen verliehen wird.
Wie durch Fachleute leicht erkannt werden wird, ist ein PB-TRE eine Polynukleotidsequenz und kann als solche eine Funktion über eine Reihe von Sequenzpermutationen zeigen. Verfahren der Nukleotidsubstitution, -addition und -deletion sind in der Technik bekannt und leicht erhältliche funktionale Tests (wie zum Beispiel der CAT- oder Luciferasereportergentest) erlauben einem Durchschnittsfachmann, zu bestimmen, ob eine Sequenzvariante die erforderliche zellspezifische Transkriptionsfunktion zeigt.
Folglich schließt die Erfindung auch Adenovirusvektoren ein, umfassend funktional konservierte Varianten der hierin offenbarten PB-TRE-Nukleinsäuresequenzen, welche Nukleinsäuresubstitutionen, -additionen und/oder -deletionen einschließen. Es ist möglich, dass gewisse Basenmodifikationen in erhöhten Expressionsspiegeln oder Zellspezifität resultieren werden. Das Erreichen von erhöhten Expressionsspiegeln kann besonders wünschenswert sein in dem Falle von aggressiveren Formen von Prostatacarcinom oder, wenn ein schnelleres und/oder aggressiveres Muster an Zelltötung gewünscht wird (aufgrund des immunkomprimierten Zustands des Individuums, zum Beispiel).
Verschiedene replikationskompetente Adenovirusvektoren können gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht werden, in welchen ein einzelnes oder mehrere Adenovirusgen(e) unter der Kontrolle eines PB-TRE sind.
Zum Beispiel kann ein PB-TRE in einen Adenovirusvektor unmittelbar stromaufwärts von und operabel gekoppelt an (d. h. in solch einer Weise orientiert, dass es in der Lage ist, Expression anzutreiben von) ein Replikationsgen, z. B. ein frühes Gen wie E1A oder E1B oder ein spätes Gen wie L1, L2, L3, L4 oder L5, eingeführt sein.
Verschiedene andere replikationskompetente Adenovirusvektoren können gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht werden, in welchen zusätzlich dazu, dass sie ein Adenovirusgen(e) haben, das/die unter der Kontrolle eines PB-TREs ist/sind, andere Adenovirusgen(e) sich unter der Kontrolle eines anderen exogenen (Nicht-Adenovirus-) Promoters befinden. Dieser Promoter kann ein gewebespezifischer Promoter-Enhancer sein, zum Beispiel das PSA-TRE (Transkriptionsregulationselement von prostataspezifischem Antigen) des prostataspezifischen Antigengens (PSA), das bevorzugt in Prostatazellen exprimiert wird. In einer Ausführung umfasst das PSA-TRE einen annähernd 1,5 kb großen Enhancer und ein 0,5 kb großes Promotersegment, abgeleitet aus der nativen Region stromaufwärts des kodierenden Segmentes von PSA. Der Enhancer in Menschen ist zwischen nt –5322 und nt –3739, relativ zu der Transkriptionsstartstelle des prostataspezifischen Antigen-(PSA-) Gens, in Menschen lokalisiert. Der Promoter besteht aus ungefähr nt –540 bis nt ungefähr +12. In einer anderen Ausführung ist das PSA-TRE auf einem einzelnen Fragment ungefähr 5 bis ungefähr 6 kb stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle vorhanden und umfasst einen PSA-TRE-Enhancer und einen PSA-TRE-Promoter. Der Enhancer enthält drei Regionen, die prostataspezifische DNA-Bindungsproteine binden, wovon eines ein mutmaßliches Androgenresponseelement enthält. Der Promoter enthält typischerweise TATA- und CAAT-Boxen, ebenso wie ein zweites mutmaßliches Androgenresponseelement. Ein PSA-TRE kann einen Nicht-PSA-TRE-Promoter in Kombination mit einem PSA-TRE-Enhancer(n) oder einen PSA-TRE-Promoter in Kombination mit einem Nicht-PSA-TRE-Enhancer(n) umfassen, vorausgesetzt, dass die Kombination eine prostataspezifische Genexpression vermittelt. Das PSA-TRE ist vollständiger beschrieben, unter anderem in den US-Patenten mit den Nummern 5,648,478 und 5,698,443; und Lundwall et al. (1987) FEBS Lett. 214: 317, Lundwall (1989) Biochim. Biophys. Res. Commun. 161: 1151–1159; Riegmann et al. (1991) Molec. Endocrin. 5: 1921; Schuur et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7043–7051; und Zhang et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3143–50.
Ein PB-TRE kann in einen Adenovirusvektor unmittelbar stromaufwärts eines frühen Gens wie E1A eingeführt und daran operabel gekoppelt sein und das PSA-TRE kann unmittelbar stromaufwärts eines anderen frühen Gens wie E1B eingeführt und daran operabel gekoppelt sein. Alternativ kann PB-TRE stromaufwärts eines E1B eingeführt und daran gekoppelt sein, während das PSA-TRE unmittelbar stromaufwärts von E1A eingeführt und daran gekoppelt ist.
In einer Ausführung befinden sich E1A und E1B unter der Kontrolle von einem oder mehreren PB-TREs, indem des folgende Konstrukt gemacht wird. In Wildtypadenovirus befinden sich E1A und E1B in Tandemorientierung. Ein die kodierende Region von E1A- bis zum E1B-Promoter enthaltendes Fragment wird aus dem Adenovirusgenom ausgeschnitten und in der umgekehrten Orientierung wieder inseriert (4). In dieser Konfiguration befinden sich die E1A- und die E1B-Promotoren zueinander benachbart, gefolgt von dem kodierenden Segment von E1A in umgekehrter Orientierung (so dass weder der E1A- noch der E1B-Promoter operabel an E1A gekoppelt ist), gefolgt von E1B in umgekehrter Orientierung in Bezug auf E1A. PB-TRE(s) kann können zwischen die kodierenden Regionen von E1A und E1B (welche sich in umgekehrter Orientierung befinden) inseriert sein, so dass diese Regionen unter der Kontrolle des/der TRE(s) sind. Geeignete Promotersequenzen werden proximal zu der E1A- und der E1B-Region inseriert, wie in 4 gezeigt. Folglich kann ein PB-TRE sowohl E1A als auch E1B lenken. Solch eine Konfiguration kann zum Beispiel mögliche Loop-out-Ereignisse verhindern, welche geschehen können, falls zwei PB-TREs in intaktes (natives) AD-Genom, jeweils eines in 5'-Richtung der kodierenden Regionen von E1A und E1B, inseriert wurden. Durch Einführen einer Polyklonierungsstelle zwischen E1A und E1B können andere Arten an prostataspezifischen TREs inseriert werden, wie zum Beispiel ein Transkriptionsregulationselement des prostataspezifischen Antigens (PSA-TRE), oder andere zellspezifische Regulationselemente, vorzugsweise jene im Zusammenhang mit einem Erkrankungszustand wie Neoplasma. Folglich kann dieses Konstrukt allgemein Verwendung für zellspezifische, temporäre oder andere Mittel der Kontrolle der Adenovirusgene E1A und E1B finden, wodurch ein zweckdienlicher und starker Weg bereitgestellt wird, adenovirale Replikation von einem ausgewählten Transkriptionsparameter abhängig zu machen.
Wie in dem Beispielabschnitt gezeigt, zeigten Adenovirusvektoren, in welchen sich mehr als ein Adenovirusreplikationsgen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs befindet, einen unerwartet höheren Grad an Zellspezifität der Replikation im Vergleich mit Adenovirusvektoren, in welchen nur ein Gen durch ein PB-TRE kontrolliert wird. In einem Vektor zeigte das Stellen von sowohl E1A als auch E1B unter die Transkriptionskontrolle von Kopien eines PB-TRE Synergie; die Zellspezifität der Replikation war unerwarteterweise besser als wenn nur E1A durch PB-TRE kontrolliert war. In einem anderen Vektor erlaubte das Stellen von zwei adenoviralen Replikationsgenen unter die Kontrolle von zwei unterschiedlichen prostataspezifischen TREs, ein PB-TRE und ein PSA-TRE, eine viel höhere Spezifität als das Stellen eines einzelnen Gens unter die Kontrolle eines prostataspezifischen TREs (PSA-TRE).
Verschiedene andere replikationskompetente Adenovirusvektoren können gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht werden, in welchen sich Reportergen(e) unter der Kontrolle eines PB-TRE befinden, zusätzlich dazu, dass ein einzelnes oder mehrere Adenovirusgen(e) sich unter der Kontrolle eines PB-TRE befinden.
Zum Beispiel kann ein PB-TRE in einen Adenovirusvektor unmittelbar stromaufwärts eines frühen Gens wie E1A oder E1B eingeführt und daran operabel gekoppelt sein und dieses Konstrukt kann auch ein zweites PB-TRE enthalten, das die Expression eines Reportergens lenkt. Das Reportergen kann ein Reporterprotein kodieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galactosidase (kodiert durch das lacZ-Gen), Luciferase, alkalische Phosphatase, grünes fluoreszierendes Protein und Meerrettichperoxidase. Für die Detektion einer mutmaßlichen Prostatazelle(n) in einer biologischen Probe, kann die biologische Probe mit einem modifizierten adenoviralen Vektor kontaktiert sein, in welchem sich ein Reportergen (z. B. Luciferase) unter der Kontrolle eines PB-TREs befindet. Das PB-TRE wird in Zellen transkriptional aktiv sein, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben (z. B. jene Zellen, die Androgenrezeptor exprimieren), und Luciferase wird produziert werden. Diese Produktion erlaubt die Detektion von Androgenrezeptor produzierenden Zellen zum Beispiel in einem menschlichen Wirt oder in einer biologischen Probe. Alternativ kann ein Adenovirusvektor konstruiert sein, in welchem sich das ein Produkt kodierende Gen, das konditionell für das Überleben erforderlich ist (z. B. ein Antibiotikaresistenzmarker), unter der Kontrolle eine PB-TRE befindet. Wenn dieser Adnenovirusvektor in eine biologische Probe eingeführt wird, werden Androgenrezeptor produzierende Zellen antibiotikaresistent werden. Ein Antibiotikum kann dann in das Medium eingeführt werden, um Zellen abzutöten, die einem PB-TRE nicht zu funktionieren erlauben.
Mit „Transkriptionsaktivierung" oder einer „Zunahme in der Expression" ist gemeint, dass die Transkription über Basalwerte in der Zielzelle (d. h. eine Zelle, die einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine AR-produzierende Zelle) um wenigstens ungefähr das 2-fache, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 5-fache, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 10-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 20-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 50-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 100-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 200-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 400- bis ungefähr das 500-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 1000-fache, gesteigert wird. Vergleiche zwischen oder unter verschiedenen PB-TREs können bewertet werden, zum Beispiel durch Messen und Vergleichen der Expressionsspiegel in einer einzelnen AR-produzierenden Zelllinie. Es wird verstanden, dass die absolute Transkriptionsaktivität eines PB-TRE von etlichen Faktoren abhängen wird, wie zum Beispiel der Art der Zielzelle, der Zuführweise und der Form eines PB-TRE und der kodierenden Sequenz, die transkriptionell selektiv aktiviert werden soll. Um verschiedene verwendete Plasmidgrößen zu kompensieren, können Aktivitäten als relative Aktivität pro Mol transfiziertes Plasmid ausgedrückt werden. Alternativ kann das Transkriptionsmaß (d. h. mRNA) unter Verwendung von Standard-Northern-Analyse und Hybridisierungstechniken gemessen werden. Transfektionsspiegel (d. h. Transfektionseffizienzen) werden durch Cotransfizieren eines Plasmids gemessen, das ein unterschiedliches Reportergen unter der Kontrolle eines unterschiedlichen TREs kodiert, wie zum Beispiel der Immediate-Early- Promoter von CMV. Diese Analyse kann auch negative Regulationsregionen, d. h. Silencer, anzeigen.
Es wird verstanden, dass es, um diese Erfindung zu praktizieren, nicht notwendig ist, PB-TREs mit maximaler Aktivität oder mit minimaler Größe zu verwenden. Der erforderliche Grad an Aktivität wird unter anderem durch die beabsichtigte Verwendung und das gewünschte Ergebnis bestimmt. Zum Beispiel ist es möglich, falls ein adenoviraler Vektor der Erfindung verwendet wird, um Zellen auf Androgenrezeptor produzierende Aktivität zu überwachen, dass weniger als der maximale Ansprechgrad durch PB-TRE ausreichend sein wird, um qualitativ die Anwesenheit solcher Zellen anzuzeigen. Ähnlich, falls er für die Behandlung oder Linderung eines Erkrankungszustandes verwendet wird, kann ein weniger als maximales Ansprechen für das gewünschte Ergebnis ausreichend sein, falls zum Beispiel die Androgenrezeptor produzierenden Zellen nicht besonders virulent sind und/oder das Erkrankungsausmaß vergleichsweise begrenzt ist.
Die Größe eines PB-TRE wird zum Teil von der Kapazität des adenoviralen Vektors bestimmt werden, welche wiederum von der bedachten Form des Vektors abhängt (siehe unten). Allgemein wird eine minimale Größe bevorzugt, da dies möglichen Raum für die Insertion anderer Sequenzen bereitstellt, welche wünschenswert sein können, wie zum Beispiel Transgene (unten diskutiert) oder andere zusätzliche Regulationssequenzen. Falls aber keine zusätzlichen Sequenzen beabsichtigt werden oder falls zum Beispiel ein adenoviraler Vektor aufrechterhalten und frei von allen viralen Verpackungsbeschränkungen zugeführt wird, kann eine größere DNA-Sequenz verwendet werden, solange der resultierende adenovirale Vektor replikationskompetent gemacht wird.
Falls keine Adenovirussequenzen deletiert worden sind, kann ein adenoviraler Vektor mit zusätzlichen Sequenzen verpackt sein, die sich auf ungefähr 5 % der Genomgröße oder annähernd 1,8 kb addieren. Falls keine essentiellen Sequenzen aus dem Adenovirusgenom entfernt werden, dann können zusätzliche 4,6 kb eines Inserts toleriert werden (d. h. insgesamt ungefähr 1,8 kb plus 4,6 kb, was ungefähr 6,4 kb gibt). Beispiele nicht essentieller adenoviraler Sequenzen, die deletiert sein können, sind E3 und E4 (solange das E4-ORF6 bewahrt wird).
Um unspezifische Replikation zu minimieren, sollten endogene (d. h. Adenovirus-) TREs vorzugsweise entfernt werden. Dies würde auch für mehr Platz für Inserts in einem adenoviralen Vektor sorgen, was von besonderer Sorge sein kann, falls ein adenoviraler Vektor als ein Virus verpackt werden wird (siehe unten). Sogar noch wichtiger ist, dass die Deletion von endogenen TREs eine Möglichkeit eines Rekombinationsereignisses verhindern würde, wodurch ein PB-TRE deletiert wird und das endogene TRE Transkriptionskontrolle ihrer jeweiligen kodierenden Adenovirussequenzen übernimmt (wodurch folglich unspezifische Replikation erlaubt wird). In einer Ausführung wird ein adenoviraler Vektor der Erfindung so konstruiert, dass die endogenen Transkriptionskontrollsequenzen von adenoviralem/n Genen) deletiert werden und durch ein PB-TRE ersetzt werden. Endogene TREs können jedoch in dem/n Adenovirusvektor(en) aufrechterhalten werden, vorausgesetzt, dass ausreichend zellspezifische Replikationspräferenz bewahrt wird. Diese Ausführungen können durch Bereitstellen eines PB-TRE konstruiert werden, das zwischen dem endogenen TRE und der kodierenden Sequenz des Replikationsgens liegt. Die erforderliche zellspezifische Replikationspräferenz wird angegeben durch das Durchführen von Tests, die die Replikation des Adenovirusvektors in einer den Androgenrezeptor exprimierenden Zelle mit der Replikation in einer Zelle, die den Androgenrezeptor nicht produziert, vergleicht. Allgemein ist beabsichtigt, dass Replikation über Grundwerte in der Zielzelle (d. h. einer Zelle, die einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine AR-produzierende Zelle) um wenigstens ungefähr das 2-fache, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 5-fache, vorzugsweise wenigstens ungefähr das 10-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 20-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 50-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 100-fache, bevorzugter wenigstens ungefähr das 200-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 400- bis ungefähr das 500-fache, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr das 1000-fache gesteigert wird. Die akzeptable Abweichung kann empirisch bestimmt werden (unter Verwendung von zum Beispiel Northern-Tests oder anderen Tests, die in der Technik bekannt sind, oder in dem Beispielabschnitt beschriebene Tests) und wird von der beabsichtigten Verwendung des adenoviralen Vektors und/oder dem gewünschten Ergebnis abhängen.
Geeignete Zielzellen sind jeder Zelltyp, der einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt. Bevorzugt werden Zellen, die den Androgenrezeptor exprimieren oder produzieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Tumorzellen, die den Androgenrezeptor exprimieren. Besonders bevorzugt sind Prostatacarcinomzellen und jegliche Metastasen, die AR produzieren. Besonders bevorzugt sind jene Zellen, in welchen die Androgenrezeptorproduktion unter Verwendung von Tests gemessen werden kann, die in der Technik Standard sind, wie zum Beispiel RIA, ELISA und Western-blot (Immuntest), um Spiegel der AR-Proteinproduktion zu bestimmen, oder Northern-blots, um Spiegel der AR-mRNA-Produktion zu bestimmen. Alternativ können solche Zellen identifiziert sein und/oder gekennzeichnet sein durch ihre Fähigkeit, ein PB-TRE transkriptional zu aktivieren (d. h. einem AFP-TRE erlauben, das es funktioniert).
Jeder der verschiedenen Adenovirusserotypen kann verwendet werden, wie zum Beispiel Ad2, AD5, Ad12 und Ad40. Für Zwecke der Erläuterung wird der Adenovirusserotyp 5 (Ad5) hierin durch Beispiel veranschaulicht.
In gewissen Ausführungen wird ein PB-TRE mit einem Adenovirusgen verwendet, das für die Vermehrung essentiell ist, so dass Replikationskompetenz vorzugsweise in der Zielzelle erzielbar ist, die einem PB-TRE zu funktionieren erlaubt, wie zum Beispiel eine den Androgenrezeptor exprimierende Zelle. Vorzugsweise ist das Gen ein frühes Gen, wie zum Beispiel E1A, E1B, E2 oder E4 (E3 ist für die virale Replikation nicht essentiell).
Bevorzugter ist das frühe Gen unter der PB-TRE-Kontrolle E1A und/oder E1B. Es kann mehr als ein frühes Gen unter die Kontrolle eines PB-TRE oder eines anderen prostataspezifischen TRE gestellt werden. Beispiel 1 stellt eine detailliertere Beschreibung solcher Konstrukte bereit.
Das E1A-Gen wird unmittelbar nach der viralen Infektion (0–2 Stunden) und vor jeglichen anderen viralen Genen exprimiert. E1A-Protein wirkt als ein trans-wirkender, positiv wirkender Transkriptionsregulationsfaktor und ist für die Expression der anderen frühen viralen Gene E1B, E2, E3, E4 und die dem Promoter proximal befindlichen starken späten Gene erforderlich. Trotz der Nomenklatur werden die dem Promoter proximal liegenden Gene, angetrieben durch den starken späten Promoter, während frühen Zeiten nach der Ad5-Infektion expimiert. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651: 175–208; Flint (1986) Advances Virus Research 21: 169–228; Grand (1987) Biochem. J. 241: 25–38. In der Abwesenheit eines funktionellen E1A-Gens schreitet die virale Infektion nicht fort, da die für die virale DNA-Replikation erforderlichen Genprodukte nicht produziert werden. Nevins (1989) Adv. Virus Res. 31: 35–81. Die Transkriptionsstartstelle von Ad5-E1A befindet sich in dem Virusgenom bei nt 498 und die ATG-Startstelle des E1A-Proteins befindet sich bei nt 560.
Das E1B-Protein wirkt in trans und ist für den Transport von später mRNA aus dem Kern in das Cytoplasma notwendig. Defekte in der E1B-Expression resultieren in schlechter Expression später viraler Proteine und in einer Unfähigkeit, die Wirtszellproteinsynthese abzuschalten. Der Promoter von E1B wurde als das definierende Element des Unterschiedes in dem Wirtsbereich von Ad40 und Ad5 in Zusammenhang gebracht: klinisch ist Ad40 ein Enterovirus, wohingegen Ad5 akute Konjunktivitis verursacht. Bailey et al. (1993) Virology 193: 631; Bailey et al. (1994) Virology 202: 695–706. E1B-Proteine sind auch für das Virus notwendig, um durch den Wirtszellzyklus auf die virale Replikation auferlegte Beschänkungen zu überwinden und auch, um die apoptotischen Wirkungen von E1A zu reduzieren. Goodrum et al. (1997) J. Virology 71: 548–561. Der E1B-Promoter von Ad5 besteht aus einer einzelnen hochaffinen Erkennungsstelle für SpI und aus einer TATA-Box.
Die E2-Region des Adenovirus kodiert für Proteine im Zusammenhang mit der Replikation des adenoviralen Genoms, einschließlich dem 72 kDa DNA-Bindungsprotein, dem 80 kDa Vorläuferendprotein und der viralen DNA-Polymerase. Die E2-Region von Ad5 wird in einer Orientierung rechts von den zwei Promotoren transkribiert, genannt früher E2-Promotor (E2 early) und später E2-Promotor (E2 late), kartierend bei 76,0 bzw. 72,0 Karteneinheiten (engt. map units). Während der späte E2-Promoter transient während den späten Infektionsstadien aktiv ist und unabhängig von dem E1A-Transaktivatorprotein ist, ist der frühe E2-Promoter während den frühen Phasen der viralen Replikation entscheidend.
Der frühe E2-Promoter, kartierend in Ad5 von 27050–27150, besteht aus einer hauptsächlichen und einer untergeordneten Transkriptionsstartstelle, wobei die letztere zu ungefähr 5 % der E2-Transkripte beiträgt, zwei nicht-kanonischen TATA-Boxen, zwei E2F-Transkriptionsfaktorbindungsstellen und eine ATF-Transkriptionsfaktorbindungsstelle.
Für einen detaillierten Überblick der E2-Promoterarchitektur siehe Swaminathan et al., Curr. Topics in Micro. and Imm. (1995) 199 Teil 3: 177–194.
Der späte E2-Promoter überlappt mit den kodierenden Sequenzen eines durch den Gegenstrang kodierten Gens und ist deshalb für die genetische Manipulation nicht zugänglich.
Der frühe E2-Promoter überlappt jedoch nur für wenige Basenpaare mit Sequenzen, die für ein 33 kDa-Protein auf dem Gegenstrang kodieren. Bemerkenswerterweise ist die SpeI-Restriktionsstelle (Ad5-Position 27082) Teil des Stoppkodons für das oben genannte 33 kDa-Protein und trennt die hauptsächliche frühe E2-Transkriptionsstartstelle und TATA-Bindungsproteinstelle von den stromaufwärts liegenden Transkriptionsfaktorbindungsstellen E2F und AT2 praktischerweise ab. Deshalb würde die Insertion eines PB-TRE mit SpeI-Enden in die SpeI-Stelle in dem I-Strang den endogenen frühen E2-Promoter von Ad5 unterbrechen und sollte eine AR-beschränkte Expression von E2-Transkripten erlauben.
Das E4-Gen produziert eine Anzahl von Transkriptionsprodukten. Die E4-Region kodiert für zwei Polypeptide, die für das Stimulieren der Replikation von viraler genomischer DNA und für das Stimulieren der späten Genexpression verantwortlich sind. Die Proteinprodukte der offenen Leseraster (ORF) 3 und 6 können beide diese Funktionen durch Binden des 55 kDa-Proteins von E1B und Heterodimeren aus E2F-1 und DP-1 durchführen. Das ORF-6-Protein erfordert für Aktivität Wechselwirkung mit dem 55 kDa E1B-Protein während es das ORF-3-Protein nicht tut. In der Abwesenheit von funktionellem Protein von ORF 3 und ORF 6 werden Plaques mit einer Effizienz mit weniger als 10^–6 als Wildtypvirus produziert. Um weiter die virale Replikation auf Zellen zu beschränken, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel AR-produzierende Zellen, können die E4-ORFs 1-3 deletiert sein, was die virale DNA-Replikation und die späte Gensynthese von E4-ORF-6-Protein abhängig macht. Durch Kombinieren solch eines Vektors mit Sequenzen, in welchen die E1B-Region durch ein PB-TRE reguliert wird, kann ein Virus gewonnen werden, in welchem sowohl die E1B-Funktion als auch die E4-Funktion von einem E1B lenkenden PB-TRE abhängig sind.
Die für die gegenwärtige Erfindung relevanten starken späten Gene sind L1, L2, L3, L4 und L5, welche Proteine des Ad5-Virusvirions kodieren. Sämtliche dieser Gene (die typischerweise für Strukturproteine kodieren) sind möglicherweise für die adenovirale Replikation erforderlich. Die späten Gene befinden sich sämtlich unter der Kontrolle des starken späten Promoters (major late promoter; MLP), der in Ad5 bei ungefähr +5986 bis ungefähr +6048 lokalisiert ist.
Zusätzlich zum Verleihen von selektiver Cytotoxizität und/oder cytolytischer Aktivität aufgrund von bevorzugter Replikationskompetenz in Zellen, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die Androgenrezeptor exprimieren, können die Adenovirusvektoren dieser Erfindung weiter ein heterologes Gen (Transgen) unter der Kontrolle eines PB-TRE inkludieren. Auf diesem Wege können verschiedene genetische Möglichkeiten in Zielzellen, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Androgenrezeptor exprimierende Zellen, besonders Prostatacarcinomzellen, eingeführt sein. Zum Beispiel kann es in gewissen Fällen wünschenswert sein, den Grad und/oder die Rate an cytotoxischer Aktivität zu erhöhen, aufgrund von zum Beispiel der verhältnismäßig refraktären Art oder besonderen Aggressivität der Androgenrezeptor produzierenden Zielzelle. Dies könnte bewerkstelligt werden durch Koppeln der zellspezifischen replikativen cytotoxischen Aktivität mit zellspezifischer Expression von zum Beispiel HSV-tk und/oder Cytosindesaminase (cd), welche Zellen fähig macht, 5-Fluorcytosin (5-FC) zu dem chemotherapeutischen Mittel 5-Fluoruracil (5-FU) zu metabolisieren. Die Verwendung dieser Transgentypen kann auch eine Bystanderwirkung verleihen.
Andere wünschenswerte Transgene, die über einen Adenovirusvektor(en) eingeführt sein können, schließen Gene ein, die cytotoxische Proteine kodieren, wie zum Beispiel die A-Ketten von Diphtherietoxin, Ricin oder Abrin [Palmiter et al. (1987) Cell 50: 435; Maxwell et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7: 1576; Behringer et al. (1988) Genes Dev. 2: 453; Messing et al. (1992) Neuron 8: 507; Piatak et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 4937; Lamb et al. (1985) Eur. J. Biochem. 148: 265; Frankel et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 415], Gene, die einen Faktor kodieren, der in der Lage ist, Apoptose zu starten, Sequenzen, die Gegensinntranskripte oder Ribozyme kodieren, welche unter anderen Fähigkeiten gegen mRNAs gerichtet sein können, die für die Proliferation essentielle Proteine kodieren, wie zum Beispiel Strukturproteine oder Transkriptionsfaktoren; virale oder andere pathogene Proteine, worin sich das Pathogen intrazellulär vermehrt, Gene, die eine veränderte Cytoplasmavariante einer Nuklease (z. B. Rnase A) oder Protease (z. B. Awsin, Papain, Proteinase K, Carboxypeptidase, etc.) kodieren oder das Fas-Gen kodieren und Ähnliche. Andere Gene von Interesse schließen Cytokine, Antigene, Transmembranproteine und Ähnliches ein, wie zum Beispiel IL-1, -2, -6, -12, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IFN-α, -β, -γ, TNF-α, -β, TGF-α, -β, NGF und Ähnliche. Die positiven Effektorgene könnten in einer frühen Phase verwendet werden, gefolgt von cytotoxischer Aktivität aufgrund von Replikation.
In gewissen Ausführungen wird das Adenovirus Death Protein (ADP), das innerhalb der E3-Region kodiert ist, in dem Adenovirusvektor aufrechterhalten (d. h. ist enthalten) (5). Das ADP-Gen unter der Kontrolle des starken späten Promoters (MLP) scheint für ein Protein zu kodieren (ADP), das beim Beschleunigen von Wirtszelllyse wichtig ist. Tollefson et al. (1996) J. Virol. 70 (4): 2296; Tollefson et al. (1992) J. Virol. 66 (6): 3633. Folglich können das ADP-Gen enthaltende adenovirale Vektoren den andenoviralen Vektor potenter machen, wodurch eine effektivere Behandlung und/oder ein geringeres Dosierungserfordernis möglich gemacht werden. Siehe Beispiel 6.
Demgemäß stellt die Erfindung einen adenoviralen Vektor bereit, der eine Polynukleotidsequenz einschließt, die ein ADP kodiert. Eine ein ADP kodierende DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz eines ADPs sind in Sequenz ID Nr. 21 bzw. Sequenz ID Nr. 22 abgebildet. Kurz, eine ADP-kodierende Sequenz wird vorzugsweise aus Ad2 (da dies der Stamm ist, in welchem ADP am vollständigsten charakterisiert worden ist) unter Verwendung von in der Technik bekannten Techniken, wie zum Beispiel PCR, gewonnen. Vorzugsweise wird auch die Y-Leitsequenz (die eine wichtige Sequenz für die korrekte Expression von späten Genen ist) gewonnen und an die ADP-kodierende Sequenz ligiert. Die ADP-Kodierungssequenz (mit oder ohne die Y-Leitsequenz) kann dann in das adenovirale Genom eingeführt werden, zum Beispiel in die E3-Region (wo die ADP-kodierende Sequenz durch den MLP oder den E3-Promoter gelenkt wird). Die ADP-Kodierungssequenz könnte auch in andere Örtlichkeiten des Adenovirusgenoms inseriert werden, wie zum Beispiel die E4-Region. Alternativ könnte die ADP-Kodierungssequenz operabel an einen heterologen Promoter gekoppelt sein (mit oder ohne Enhancer(en)), einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen anderen viralen Promoter, einen prostataspezifischen Promoter wie zum Beispiel das Rattenprobasin-TRE (PB-TRE).
In gewissen Ausführungen stellt die Erfindung adenovirale Vektoren bereit, welche ein zusätzliches Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle eines zweiten PB-TRE umfassen. Beispiele eines zusätzlichen Adenovirusgens unter der Transkriptionskontrolle sind ADP (oben diskutiert) und Gene, die für die Replikation notwendig sind, wie zum Beispiel frühe Gene. Zum Beispiel kann ein adenoviraler Vektor konstruiert werden, so dass ein erstes PB-TRE die Transkription eines frühen Gens reguliert, wie zum Beispiel E1A oder E1B, und ein zweites PB-TRE reguliert die Transkription eines anderen frühen Gens. Diese multiplen Konstrukte können wünschenswerter sein dahingehend, dass sie mehr als eine Quelle an Zellspezifität in Bezug auf Replikation bereitstellen. Wie in dem Beispielabschnitt gezeigt, inhibierte solch ein Doppelkonstrukt erfolgreich Tumorwachstum in Tumorxenotransplantate beherbergenden Mäusen.
Jeder der hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren kann in einer Reihe von Formen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf nackte Polynukleotid-(gewöhnlich DNA-) Konstrukte. Adenovirale Vektoren können alternativ Polynukleotidkonstrukte umfassen, die mit Mitteln komplexiert sind, um Eindringen in Zellen zu erleichtern, wie zum Beispiel kationische Liposomen oder andere Verbindungen wie Polylysin; in infektiöse Adenoviruspartikel (welche den/die adenoviralen Vektoren) immunogener machen kann) verpackt sein; in andere partikuläre virale Formen wie HSV oder AVV verpackt sein; mit Mitteln komplexiert sein, um eine Immunantwort zu steigern oder zu dämpfen; oder mit Mitteln komplexiert sein, die In-vivo-Transfektion erleichtern, wie zum Beispiel DOTMA, DOTAP^TM und Polyamine.
Die Erfindung stellt auch ein Adenovirus bereit, das in der Lage ist, vorzugsweise in Zellen zu replizieren, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Androgenrezeptor produzierende Zellen. „In einer Androgenrezeptor produzierenden Zelle vorzugsweise replizierend" bedeutet, dass das Adenovirus mehr in einer Zelle repliziert, die sämtliche die für PB-Expression gebrauchten Faktoren und Cofaktoren produziert, als in einer Zelle, die solche Faktoren und Cofaktoren nicht produziert. Vorzugsweise repliziert das Adenovirus in signifikant höheren Spiegeln in Zellen, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel AR-produzierende Zellen, als in AR nicht produzierenden Zellen. Vorzugsweise wenigstens ungefähr 2 mal höher, vorzugsweise wenigstens ungefähr 5 mal höher, bevorzugter wenigstens ungefähr 10 mal höher, immer noch bevorzugter wenigstens ungefähr 50 mal höher, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 100 mal höher, immer noch bevorzugter wenigstens ungefähr 400 bis 500 mal höher, immer noch bevorzugter wenigstens ungefähr 1000 mal höher, am bevorzugtesten wenigstens ungefähr 1 × 10⁶ höher. Am bevorzugtesten repliziert das Adenovirus ausschließlich in AR-produzierenden Zellen (d. h. repliziert nicht oder in sehr geringen Spiegeln in AR nicht produzierenden Zellen).
Falls ein adenoviraler Vektor, umfassend ein Adenoviruspolynukleotid; in ein ganzes Adenovirus (einschließlich das Capsid) verpackt wird, kann das Adenovirus selber ausgewählt werden, um weiter das Targeting zu steigern. Zum Beispiel vermitteln Adenovirusfasern Primärkontakt mit zelluläre/mn Rezeptor(en), die beim Tropismus helfen. Siehe zum Beispiel Amberg et al. (1997) Virol. 227: 239–244. Falls eine bestimmte Unterklasse eines Adenovirusserotyps Tropismus für eine Zielzellart und/oder reduzierte Affinität für Nicht-Zielzelltypen zeigte, könnten solch eine Untergattung (oder Untergattungen) verwendet werden, um weiter die Zellspezifität von Cytotoxizität und/oder Cytolyse zu steigern.
In gewissen Ausführungen wird/werden ein Adenovirusvektor(en) der Erfindung mit einem hydrophilen Polymer komplexiert, um ein maskiertes Adenovirus zu schaffen. Das hydrophile Polymer wird angeheftet (kovalent oder nicht kovalent) an die Capsidproteine des Adenovirus, besonders die Hexon- und Faserproteine. In bevorzugten Ausführungen werden die Adenovirusvektoren der gegenwärtigen Erfindung mit Maskierungsmiteln komplexiert, um maskierte Adenovirusvektoren zu schaffen. Maskierte Adenoviren sind vorteilhaft aufgrund von: (a) dem Maskieren der Adenovirusoberfläche gegen Adenovirus neutralisierende Antikörper oder Opsinine, die im Blutkreislauf sind, und (b) Steigern der systemischen Zirkulationszeit von Adenoviruspartikeln durch Reduktion unspezifischer Clearancemechanismen in dem Körper (d. h. Makrophagen, etc.). Im In-vivo-Zusammenhang resultiert die systemische Zufuhr von maskiertem Adenovirus in einer längeren Zirkulation von viralen Partikeln, geringerer Immunogenität und gesteigerter Bioverteilung mit einer Abnahme in der Clearance durch die Leber und Milz. Ausgedehnte Forschung wurde gemacht über die Modifikation von Proteinen und Lipiden mit hydrophilen Polymeren (genauer PEG), den Erfindern ist jedoch nicht irgendeine andere Verwendung von Maskierungsmitteln in Verbindung mit Adenovirus oder Adenoviruskonstrukten bewusst.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Adenovirus der Erfindung vor, das mit einem Maskierungsmittel komplexiert ist. Vorzugsweise ist das Maskierungsmittel PEG. Ein Schema eines Verfahrens der Herstellung eines maskierten Adenovirus ist in 13 abgebildet (siehe auch Beispiel 8). Eine bevorzugte Ausführung ist ein maskiertes Adenovirus, umfassend hierin beschriebene(n) Adenovirusvektor(en), mit einer bevorzugteren Ausführung, umfassend ein pegyliertes Adenovirus, das ein hierin beschriebenes Adenovirus umfasst. Die Erfindung stellt auch Verfahren bereit, diese maskierten Adenoviren, die aus der Beschreibung hierin ersichtlich sind, herzustellen und zu verwenden.
Das Maskierungsmittel kann verschiedene Molekulargewichte haben, solange der gewünschte Komplex und die erforderliche Funktionalität gewonnen werden. Die meisten aus gewerblichen Quellen erhaltenen Maskierungsmittel sind normalerweise im Verhältnis zu dem festgestellten Molekulargewicht polydispers (d. h. das Maskierungsmittel wird in einer Verteilung von Molekulargewichten in der Umgebung des normalen Molekulargewichtes geliefert). Beim Maskieren von Adenoviren gemäß der gegenwärtigen Erfindung nützliche Maskierungsmittel haben nominale Gewichte von ungefähr 2.000 bis ungefähr 50.000, vorzugsweise ungefähr 2.500 bis ungefähr 30.000, vorzugsweise ungefähr 3.000 bis ungefähr 25.000, bevorzugter ungefähr 5.000 bis ungefähr 20.000. Vorzugsweise ist das nominale Molekulargewicht niedriger als 20.000, bevorzugter weniger als ungefähr 10.000, bevorzugter weniger als ungefähr 7.500, bevorzugter weniger als ungefähr 5.000. Vorzugsweise ist das Maskierungsmittel PEG mit einem nominalen Molekulargewicht von weniger als ungefähr 5.000 Da. Mischungen aus Maskierungsmitteln mit unterschiedlichen Gewichten sind ebenfalls bedacht.
Die Maskierung kann kovalent oder nicht kovalent angeheftet werden. In dem Falle nicht kovalenter Anheftung, kann die Anheftung über elektrostatische, hydrophobe oder Affinitätswechselwirkungen geschehen. Die für die nicht kovalente Anheftung verwendeten Maskierungsmittel können modifizierte Maskierungsmittel sein (d. h. das Maskierungsmittel wird synthetisiert oder modifiziert, um bestimmte chemische Einheiten zu enthalten, die normalerweise in dem Maskierungsmittel nicht gefunden werden). Für elektrostatische Anheftung an adenovirale Vektoren nützliche Maskierungsmittel werden Maskierungsmittel sein, welche geladene Einheiten enthalten oder modifiziert oder synthetisiert worden sind, um geladene Einheiten zu enthalten, die an die Adenovirusoberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung binden. Negativ geladene Maskierungsmittel schließen Maskierungsmittel ein, die Phosphatgruppen, Sulfatgruppen, Carboxygruppen und Ähnliches enthalten. Quaternäre Amingruppen sind als positiv geladene Einheiten für die elektrostatische, nicht kovalente Anheftung von Maskierungsmitteln an Adenovirus nützlich. Maskierungsmittel, die hydrophobe Gruppen enthalten oder modifiziert oder synthetisiert worden sind, um hydrophobe Gruppen zu enthalten, wie zum Beispiel Lipide (z. B. Phosphatidylethanolamin und Ähnliche), und andere hydrophobe Gruppen (wie zum Beispiel Phenylgruppen oder lange Alkylketten) können an adenovirale Vektoren durch hydrophobe Wechselwirkung mit stabilen hydrophoben Regionen auf dem Virus komplexiert sein. Affinitätsmaskierungsmittel können unter Verwendung jedes kleinen Moleküls, Peptids oder Proteins, welches ein Adenovirus bindet, gemacht werden. Die Affinitäts- und hydrophoben Einheiten können an das Maskierungsmittel durch jedes in der Technik bekannte Verfahren angeheftet sein, vorzugsweise durch chemisches Vernetzen mit einem chemischen Vernetzer.
Falls das Maskierungsmittel kovalent angeheftet wird, wird vorzugsweise ein chemischer Vernetzer verwendet, um kovalent das Maskierungsmittel an das Adenovirus zu binden. Der Vernetzer kann jeder Vernetzer sein, der in der Lage ist, eine kovalente Verknüpfung oder Brücke zwischen dem Maskierungsmittel und dem Adenovirus zu schaffen. Direktes Vernetzen, in welchem das Adenovirus, Maskierungsmittel und ein gesondertes Vernetzungsmolekül zur Reaktion gebracht werden, kann genutzt werden, um kovalent maskiertes Adenovirus zu schaffen, unter Verwendung jedes in der Technik bekannten chemischen Vernetzers, welcher Vernetzungen zwischen dem Maskierungsmittel und Protein schaffen wird. Entweder kann das Maskierungsmittel oder das Adenovirus vor der Vernetzungsreaktion modifiziert sein, so dass der chemische Vernetzer mit den beiden Molekülen reagieren wird (z. B. kann das Maskierungsmittel modifiziert sein, um Amingruppen hinzuzufügen, wodurch ihm erlaubt wird, mit dem Adenovirus durch Vernetzungsmittel vernetzt zu werden, welche mit Aminen reagieren).
Vorzugsweise werden entweder das Maskierungsmittel oder das Adenovirus als erstes durch Reaktion mit einem Vernetzungsmittel aktiviert. Nicht umgesetzter Vernetzer wird dann aus dem Maskierungsmittel oder Adenovirus entfernt. Die Aktivierungsreaktion resultiert vorzugsweise in einem oder zwei Molekülen Vernetzungsmittel pro Molekül Maskierungsmittel, bevorzugter ein einzelnes Molekül Vernetzungsmittel pro Molekül Maskierungsmittel, bevorzugter ein einzelnes Molekül Vernetzungsmittel pro Molekül Maskierungsmittel. Das aktivierte Maskierungsmittel oder Adenovirus wird dann unter den geeigneten Reaktionsbedingungen mit Adenovirus vermischt (falls das Maskierungsmittel aktiviert wird) oder Maskierungsmittel (falls das Adenovirus aktiviert ist), um maskiertes Adenovirus zu bilden. Vorzugsweise wird das Maskierungsmittel aktiviert und dann mit Adenovirus zur Reaktion gebracht.
Das bevorzugte Maskierungsmittel ist PEG. Bevorzugte aktivierte PEGs schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: nukleophile Vernetzungs-PEGs wie PEG mit endständigem Amin, PEG-Aminosäureester, PEG-Hydrazinhydrochlorid, Thiol-PEGs und Ähnliche; Carboxyl-PEGs, einschließlich Succinat-PEG, carboxymethyliertes PEG, PEG-Propionsäure und PEG-Aminosäuren; Schwefelwasserstoff selektive PEGs wie PEG-Maleimid, PEG-Orthopyridyldisulfid und Ähnliches; heterofunktionale PEGs, einschließlich Aminen und sauren PEG, NHS-Maleimid-PEG und NHS-Vinylsulfon-PEG; PEG-Silane; Biotin-PEGs, Vinylderivate von PEG wie Allyl-PEG, PEG-Acrylat, PEG-Methacrylat und Ähnliche; und elektrophil aktive PEGs, einschließlich PEG-Succinimidylsuccinat, PEG-Succinimidylsuccinamid, PEG-Succinimidylproprionat, Succinimidylester von carboxymethyliertem PEG, PEG2-NHS, Succinimidylester von Aminosäuren-PEGs, Pendant (engl. pendant) modifizierte PEG-NHS-Ester (wie jene, die von Innophase, Inc. erhältlich sind), PEG-Glycidylether (Epodix), PEG-Oxycarbonylimidazol, PEG-Nitrophenylcarbonate, PEG-Trichlorphenylcarbonate, PEG-Treslat, PEG-Aldehyd, PEG-Isocyanat, Copolymere von PEG-Allylether und Maleinsäureanhydrid, PEG-Vinylsulfon und andere aktivierte PEGs, wie es für einen Fachmann ersichtlich sein wird. Das aktivierte PEG ist vorzugsweise PEG-N-Hydroxysuccinimidylsuccinamid oder PEG-Succinimidylsuccinat, bevorzugter PEG-N-Hydroxysuccinimidylsuccinamid. Die adenoviralen Vektoren können der Zielzelle in einer Reihe von Wegen zugeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Liposomen, allgemeine Transfektionsverfahren, die in der Technik wohl bekannt sind, wie zum Beispiel Calciumphosphatfällung, Elektroporation, direkte Injektion und intravenöse Infusion. Das Zufuhrmittel wird zum großen Teil von dem bestimmten adenoviralen Vektor (einschließlich seiner Form), ebenso wie der Art und Lokation der Zielzellen abhängen (d. h. ob sich die Zellen in vitro oder in vivo befinden).
Falls sie in verpackten Adenoviren verwendet werden, können Adenovirusvektoren in einem geeigneten physiologisch annehmbaren Träger in einer Dosis von ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10⁴ verabreicht werden. Die Multiplizität der Infektion wird allgemein im Bereich von ungefähr 0,001 bis 100 liegen. Falls er als ein Polynukleotidkonstrukt verabreicht wird (d. h. nicht als ein Virus verpackt), können ungefähr 0,01 μg bis 1.000 μg eines adenoviralen Vektors verabreicht werden. Der/die adenoviralen Vektoren) können ein oder mehrere Male verabreicht werden, in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Zweck und dem Immunantwortpotential des Wirts, oder können als mehrere gleichzeitige Injektionen verabreicht werden. Falls eine Immunantwort nicht erwünscht ist, kann die Immunantwort durch Nutzen einer Reihe von Immunsuppressionsmitteln reduziert werden, um zum Beispiel eine wiederholte Applikation ohne eine starke Immunantwort zu erlauben. Falls er als eine andere virale Form verpackt wird, wie zum Beispiel HSV, wird eine zu verabreichende Menge auf Standardwissen über jenes bestimmte Virus (welches leicht erhältlich ist von zum Beispiel veröffentlichter Literatur) basiert und kann empirisch bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Wirtszellen bereit, umfassend die (d. h. transformiert mit den) hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren. Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen können verwendet werden, solange die für die Aufrechterhaltung in jenem Wirt erforderlichen Sequenzen, wie zum Beispiel geeignete Replikationsstartpunkt(e) vorhanden sind. Praktischerweise werden ebenfalls selektierbare Marker bereitgestellt. Wirtsysteme sind in der Technik bekannt und brauchen im Detail hierin nicht beschrieben werden. Prokaryotische Wirtszellen schließen bakterielle Wirtszellen ein, zum Beispiel E. coli, B. subtilis, und Mycobakterien. Unter den eukaryotischen Wirtszellen sind Hefe, Insekt, Vögel, Pflanze, C. elegans (oder Nematode) und Säugerwirtszellen. Beispiele von Pilz-(einschließlich Hefe-) Wirtszellen sind S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), Arten von Candida, einschließlich C. albicans und C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris und Yarrowia lipolytica. Beispiele von Säugerzellen sind COS-Zellen, Maus-L-Zellen, LNCaP-Zellen, chinesische Hamsterovar-(CHO-) Zellen, menschliche embryonale Nieren-(HEK-) Zellen und Zellen der Grünen Meerkatze. Xenopus-laevis-Oocyten und andere Zellen aus Amphibienursprung können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Wirtszellen schließen auch alle Zellen ein, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die Androgenrezeptor und/oder Proteine und andere Faktoren produzieren, die für die Expression des Probasins notwendig sind, ob der AR und/oder die anderen Faktoren natürlich oder rekombinant erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung inkludiert auch Zusammensetzungen, einschließlich pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren enthalten. Solche Zusammensetzungen sind für die Applikation in vivo nützlich, zum Beispiel, wenn der Grad an Transduktion und/oder Wirksamkeit des Zellabtötens in einem Individuum gemessen werden. Vorzugsweise umfassen diese Zusammensetzungen weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff. Diese Zusammensetzungen, welche eine effektive Menge eines adenoviralen Vektors dieser Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfassen können, sind für die systemische Applikation an Patienten in Dosiseinheitsformen, sterilen parentheralen Lösungen oder Suspensionen, sterilen nicht parentheralen Lösungen oder oralen Lösungen oder Suspensionen, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen und Ähnlichem geeignet. Formulierungen für die parentherale und nicht parentherale Arzneimittelzufuhr sind in der Technik bekannt und sind dargelegt in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing (1990). Zusammensetzungen inkludieren auch lyophilisierte und/oder rekonstituierte Formen der adenoviralen Vektoren der Erfindung (einschließlich jenen, die als ein Virus verpackt sind, wie zum Beispiel als Adenovirus).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Kits, enthaltend einen adenoviralen Vektor dieser Erfindung. Diese Kits können für diagnostische und/oder Überwachungszwecke verwendet werden, vorzugsweise Überwachung. Vorgänge unter Verwendung dieser Kits können durch klinische Laboratorien, Versuchslaboratorien, medizinische Praktiker oder private Individuen durchgeführt werden. Durch diese Erfindung verkörperte Kits erlauben einem, die Anwesenheit von Zellen zu detektieren, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Androgenrezeptor produzierende Zellen, in einer geeigneten biologischen Probe, wie zum Beispiel Biopsieproben.
Die Kits der Erfindung umfassen einen hierin beschriebenen adenoviralen Vektor in geeigneter Verpackung. Das Kit kann wahlweise zusätzliche Bestandteile bereitstellen, die bei dem Vorgehen nützlich sind, einschließend, aber nicht beschränkt auf Puffer, Entwicklungsreagenzien, Markierungen, Reaktionsoberflächen, Mittel für die Detektion, Kontrollproben, Instruktionen und Auslegungsinformation.
Zubereitung der Adenovirusvektoren der Erfindung
Die Adenovirusvektoren dieser Erfindung können unter Verwendung von rekombinanten Techniken, die in der Technik Standard sind, zubereitet werden. Allgemein wird ein PB-TRE in 5'-Richtung zu dem adenoviralen Gen von Interesse inseriert, vorzugsweise ein adenovirales Replikationsgen, bevorzugter eines oder mehrere frühe Replikationsgene (obwohl ein spätes) Gene) verwendet werden kann/können). Ein PB-TRE kann zubereitet werden unter Verwendung von Oligonukleotidsynthese (falls die Sequenz bekannt ist) oder rekombinanten Verfahren (wie PCR und/oder Restriktionsenzyme). Praktische Restriktionsstellen, entweder in der natürlichen Adeno-DNA-Sequenz oder durch Verfahren wie PCR oder ortsgerichtete Mutagenese eingeführt, stellen eine Insertionsstelle für ein PB-TRE bereit. Demgemäß können praktische Restriktionsstellen für das Annealing (d. h. Inserieren) eines PB-TRE an den 5'- und 3'-Enden eines PB-TRE unter Verwendung von Standardrekombinationsverfahren wie PCR gentechnisch verändert werden.
Für das Herstellen von adenoviralen Vektoren dieser Erfindung verwendete Polynukleotide können unter Verwendung von Standardverfahren in der Technik wie chemische Synthese, rekombinante Verfahren und/oder aus biologischen Quellen gewonnen werden.
Adenovirale Vektoren werden praktischerweise durch homologe Rekombination oder In-vitro-Ligation von zwei Plasmiden zubereitet, wobei eines den linken Teil des Adenovirus und das andere den rechten Teil bereitstellt und wobei eines oder beide wenigstens ein Adenovirusgen unter der Kontrolle eines PB-TRE enthalten. Falls homologe Rekombination verwendet wird, sollten die zwei Plasmide wenigstens ungefähr 500 bp Sequenzüberlappung teilen. Jedes Plasmid, soweit gewünscht, kann unabhängig manipuliert werden, gefolgt von Cotransfektion in einen kompetenten Wirt, wodurch komplementierende Gene soweit geeignet oder die geeigneten Transkriptionsfaktoren für das Starten der Transkription von einem PB-TRE für die Vermehrung des Adenovirus bereitgestellt werden. Plasmide werden allgemein in eine geeignete Wirtszelle wie 293-Zellen oder LNCaP-Zellen etc. unter Verwendung geeigneter Transduktionsmittel wie kationischen Liposomen eingeführt. Alternativ kann In-vitro-Ligation der rechten und linken Teile des Adenovirusgenoms verwendet werden, um rekombinante Adenovirusabkömmlinge, enthaltend sämtliche der für die Replikation essentiellen Teile des Adenovirusgenoms, zu konstruieren. Berkner et al. (1983) Nucleic Acid Research 11: 6003–6020; Bridge et al. (1989) J. Virol. 63: 631–638.
Praktischerweise sind Plasmide erhältlich, die die notwendigen Teile des Adenovirus bereitstellen. Das Plasmid pXC.1 (McKinnon (1982) Gene 19: 33–42) enthält das linke Ende von Wildtyp-Ad5, vom nt 22 bis 5790 von Adenovirus 5. pBHG10 (Bett. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802–8806; Microbix Biosystems Inc., Toronto) stellt das rechte Ende von Ad5 bereit, mit einer Deletion in E3. Die Deletion in E3 schafft Raum in dem Virus, um ein 3 kb PB-TRE zu inserieren, ohne den endogenen Enhancer-Promoter zu deletieren. Das Gen für E3 ist auf dem Gegenstrang von E4 (r-Strang) lokalisiert. pBHG11 [Bett. et al. (1994)] stellt sogar eine noch größere E3-Deletion bereit (zusätzliche 0,3 kb sind deletiert).
Für die Manipulation der frühen Gene ist die Transkriptionsstartstelle von Ad5-E1A bei nt 498 und die ATG-Startstelle des E1A-Kodierungssegmentes liegt bei nt 560 in dem Virusgenom. Diese Region kann für die Insertion eines PB-TRE verwendet werden. Eine Restriktionsstelle kann durch Nutzen der Polymerasekettenreaktion (PCR) eingeführt werden, wo der Primer, der genutzt wird, auf das Ad5-Genom beschränkt sein oder einen Teil des Plasmids involvieren kann, das die genomische Ad5-DNA trägt. Zum Beispiel können, wo pBR322 verwendet wird, die Primer die EcoRI-Stelle in dem pBR322-Gerüst und die XbaI-Stelle bei nt 1339 von Ad5 verwenden. Indem PCR in zwei Schritten durchgeführt wird, wobei überlappende Primer im Zentrum der Region eine 30-Sequenzänderung einführen, was in einer einzigen Restriktionsstelle resultiert, kann man für die Insertion von PB-TRE an jener Stelle sorgen. Beispiel 1 stellt eine detailliertere Beschreibung eines adenoviralen Vektors bereit, in welchem sich E1A unter der Kontrolle von PB-TRE befindet.
Eine ähnliche Strategie kann für die Insertion eines PB-TRE verwendet werden, um E1B zu regulieren. Der E1B-Promoter von Ad5 besteht aus einer einzelnen hochaffinen Erkennungsstelel für SpI und einer TATA-Box. Diese Region erstreckt sich von Ad5 nt 1636 bis 1701. Durch Insertion eines PB-TRE in diese Region kann man für zellspezifische Transkription des E1B-Gens sorgen. Durch Nutzen der linken Region, modifiziert mit dem E1A regulierenden zellspezifischen Responseelement, als die Matrize für das Einführen eines PB-TRE, um E1B zu regulieren; wird der resultierende Adenovirusvektor von den zellspezifischen Transkriptionsfaktoren für die Expression von sowohl E1A als auch E1B abhängen. Beispiel 1 stellt eine detailliertere Beschreibung bereit, wie solche Konstrukte zubereitet werden können. Ähnlich kann ein PB-TRE stromaufwärts des E2-Gens inseriert sein, um seine Expression zellspezifisch zu machen. Der frühe E2-Promoter, der in Ad5 von 27050–27150 kartiert, besteht aus einer hauptsächlichen und einer untergeordneten Transkriptionsstartstelle, wobei die letztere zu ungefähr 5 % der E2-Transkripte beiträgt, zwei nicht-kanonischen TATA-Boxen, zwei E2F-Transkriptionsfaktorenbindungsstellen und eine ATF-Transkriptionsfaktorbindungsstelle (für einen detaillierten Überblick über die E2-Promoterarchitektur siehe Swaminathan et al., Curr. Topics in Micro. and Imm. (1995) 199 Teil 3: 177–194).
Der späte E2-Promoter überlappt mit den kodierenden Sequenzen eines durch den Gegenstrang kodierten Gens und ist deshalb für genetische Manipulation nicht zugänglich. Der frühe E2-Promoter überlappt jedoch nur einige wenige Basenpaare mit Sequenzen, die für ein 33-kDa-Protein auf dem Gegenstrang kodieren. Bemerkenswerterweise ist die SpeI-Restriktionsstelle (Ad4-Position 27082) Teil des Stoppkodons für das oben genannte 33kDa-Protein und trennt praktischerweise die hauptsächliche frühe E2-Transkriptionsstartstelle und TATA-Bindungsproteinstelle von den stromaufwärts liegenden Transkriptionsfaktorbindungsstellen E3F und ATF ab. Deshalb würde die Insertion eines PB-TRE mit SpeI-Enden in die SpeI-Stelle in dem 1-Strang den endogenen frühen E2-Promoter von Ad5 stören und sollte eine AR-beschränkte Expression von E2-Transkripten erlauben.
Für E4 muss man den rechten Teil des Adenovirusgenoms verwenden. Die E4-Transkriptionsstartstelle liegt vorwiegend bei ungefähr nt 35609, die TATA-Box bei ungefähr nt 35638 und das erste AUG/CUG von ORF 1 liegt bei ungefähr nt 35532. Virtanen et al. (1984) J. Virol. 51: 822.831. Unter Verwendung jeder der obigen Strategien für die anderen Gene kann ein PB-TRE stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle eingeführt sein. Für die Konstruktion eines Adenovirus voller Länge mit einem in die E4-Region inserierten PB-TRE, werden die Cotransfektion und homologe Rekombination in W162-Zellen durchgeführt (Weinberg et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 5383–5386), welche E4-Proteine in trans bereitstellen, um Defekte bei der Synthese dieser Proteine auszugleichen.
Verfahren zum Verpacken von Adenoviruspolynukleotiden in Adenoviruspartikel sind in der Technik bekannt und in den Beispielen beschrieben.
Die Verfahren zur Zubereitung von maskiertem Adenovirus variieren mit dem Maskierungsmittel und der Anheftungsweise (kovalent oder nicht kovalent). Maskiertes Adenovirus mit nicht kovalent angeheftetem Maskierungsmittel wird durch gründliches und inniges Vermischen des Adenovirus und des Maskierungsmittels zubereitet. Kovalentes Vernetzen wird durch Vermischen der Reaktionsbestandteile unter Bedingungen erreicht, die für das Vernetzungsreagenz passend sind. Chemische Vernetzungsprotokolle sind in der Technik wohl bekannt. Die exakten Reaktionsbedingungen für jeden gegebenen chemischen Vernetzer werden mit der Vernetzerchemie und den Modifikationen (falls überhaupt) an dem PEG und dem Adenovirus variieren, was für einen Fachmann ersichtlich sein wird. Wenn das Maskierungsmittel PEG ist, beträgt das molare Verhältnis von Adenovirus zu PEG vorzugsweise zwischen 1 : 1 × 10⁶ und 1 : 1 × 10⁷, bevorzugter ungefähr 1 : 4 × 10⁶. Für das bevorzugte aktivierte PEG, PEG-NHS-Succinamid, ist das aktivierte PEG vorzugsweise zwischen 0,5 bis 5 mM in der Vernetzungsreaktion vorhanden, bevorzugt ungefähr 2 mM. Vorzugsweise ist Adenovirus in der Vernetzungsreaktion zwischen 10⁶ und 10¹², bevorzugter ungefähr 5 × 10⁹. Unter Verwendung des bevorzugten aktivierten PEG, liegt der pH-Wert der Vernetzungsreaktion vorzugsweise zwischen ungefähr 7 und 9, bevorzugter zwischen ungefähr 7,5 und 8, und die Reaktion wird vorzugsweise für 10 bis 30 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 4 °C bis Raumtemperatur (ungefähr 20 °C) laufen gelassen.
Nach der Vernetzungsreaktion, wird das maskierte Adenovirus von den Reaktionsbestandteilen abgetrennt. Die Separation kann durch jedes einem Fachmann bekannte Verfahren bewerkstelligt werden, einschließlich Chromatographieverfahren wie Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Elektrophoreseverfahren oder Filtrationsverfahren wie Dialyse, Diafiltration oder Ultrafiltration.
Verfahren unter Verwendung der Adenovirusvektoren der Erfindung
Die gegenständlichen Vektoren können für eine breite Reihe von Zwecken verwendet werden, welche mit dem gewünschten oder beabsichtigten Ergebnis variieren werden. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung Verfahren unter Verwendung der oben beschriebenen adenoviralen Vektoren ein.
In einer Ausführung werden Verfahren zum Verleihen selektiver Cytotoxizität in Zellen bereitgestellt, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die Androgenrezeptor exprimieren, umfassend das Kontaktieren der Zellen mit einem hierin beschriebenen Adenovirusvektor. Cytotoxizität kann unter Verwendung von Standardtests der Technik gemessen werden, wie zum Beispiel Farbstoffausschluss, ³H-Thymidineinbau und/oder Lyse.
In einer anderen Ausführung werden Verfahren bereitgestellt zum Vermehren eines Adenovirus, das für Zellen spezifisch ist, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel jene Zellen, die Androgenrezeptor exprimieren. Diese Verfahren schließen das Kombinieren eines Adenovirusvektors mit Zellen ein, wodurch dieses Adenovirus vermehrt wird.
Eine andere Ausführung stellt Verfahren zum Abtöten von Zellen, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Zellen, die den Androgenrezeptor exprimieren, in einer Mischung aus Zellen bereit, umfassend das Kombinieren der Zellmischung mit einem Adenovirus der vorliegenden Erfindung. Die Zellmischung ist allgemein eine Mischung aus normalen Zellen und Krebszellen, die den Androgenrezeptor produzieren, und kann eine In-vivo-Mischung oder eine In-vitro-Mischung sein.
Die Erfindung inkludiert auch Verfahren zum Detektieren von Zellen in einer biologischen Probe, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie zum Beispiel Androgenrezeptor exprimierende Zellen. Diese Verfahren sind besonders nützlich zum Überwachen des klinischen und/oder physiologischen Zustands eines Individuums (d. h. Säugers), ob vor einem experimentellen oder klinischen Hintergrund. In einem Verfahren werden Zellen einer biologischen Probe mit einem Adenovirus in Kontakt gebracht und die Replikation des adenoviralen Vektors wird detektiert. Alternativ kann die Probe mit einem Adenovirus kontaktiert werden, in welchem ein Reportergen sich unter der Kontrolle eines PB-TRE befindet. Expression des Reportergens zeigt die Anwesenheit von Zellen an, die dem PB-TRE erlauben zu funktionieren, wie zum Beispiel Androgenrezeptor produzierende Zellen. Alternativ kann ein Adenovirus konstruiert werden, in welchem ein für das Zellüberleben konditional erforderliches Gen unter die Kontrolle eines PB-TRE gestellt wird. Dieses Gen kann zum Beispiel Antibiotikaresistenz kodieren. Das Adenovirus wird in die biologische Probe eingeführt und später wird die Probe mit einem Antibiotikum behandelt. Die Anwesenheit überlebender Zellen, die Antibiotikaresistenz exprimieren, zeigt die Anwesenheit von Zellen an, welche einem PB-TRE zu funktionieren erlauben. Eine geeignete biologische Probe ist eine, in welcher Androgenrezeptor produzierende Zellen anwesend sein können oder die verdächtigt wird, dass sie anwesend sind. Allgemein ist in Säugern eine geeignete klinische Probe eine, in welcher Krebszellen, die Androgenrezeptor produzieren, wie zum Beispiel Prostatakrebszellen, verdächtigt werden, dass sie anwesend sind. Solche Zellen können zum Beispiel durch Nadelbiopsie oder anderes chirurgisches Vorgehen gewonnen werden. Zu kontaktierende Zellen können behandelt werden, um Testbedingungen wie selektive Anreicherung und/oder Löslichmachung zu fördern. In diesen Verfahren können Androgenrezeptor produzierende Zellen unter Verwendung von In-vitro-Tests, die Proliferation detektieren und in der Technik Standard sind, detektiert werden. Beispiele solcher Standardtests schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bursttests (welche Virusausbeuten messen) und Plaquetests (welche infektiöse Partikel pro Zelle messen). Auch kann Vermehrung detektiert werden durch Messen spezifischer adenoviraler DNA-Replikation, was auch Standardtests sind.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Zielzelle bereit, umfassend das Kontaktieren der Zielzelle mit einem hierin beschriebenen Adenovirusvektor, worin der adenovirale Vektor in die Zelle eindringt.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Zielzelle bereit, umfassend das Kontaktieren der Zielzelle mit einem hierin beschriebenen Adenovirusvektor, wobei der adenovirale Vektor in die Zelle eindringt.
Die Erfindung stellt weiter Verfahren zum Unterdrücken von Tumorzellwachstum bereit, vorzugsweise von einer Tumorzelle, die Androgenrezeptor exprimiert, umfassend das Kontaktieren einer Tumorzelle mit einem adenoviralen Vektor der Erfindung, so dass der adenovirale Vektor in die Tumorzelle eindringt und selektive Cytotoxizität für die Tumorzelle zeigt. Tumorzellwachstum kann durch jedes in der Technik bekannt Mittel bewertet werden, einschließend aber nicht beschränkt auf Messen der Tumorgröße, Bestimmen, ob Tumorzellen proliferierend sind, unter Verwendung eines ³H-Thymidininkorporationstests oder durch Zählen von Tumorzellen. „Unterdrücken" von Tumorzellwachstum bedeutet jeder oder sämtliche der folgenden Zustände: Verlangsamen, Verzögern und Stoppen von Tumorwachstum, ebenso wie Tumorschrumpfung. „Unterdrücken" von Tumorwachstum gibt einen Wachstumszustand an, der verkürzt ist, wenn er mit Wachstum ohne Kontakt mit, d. h. Transfektion durch einen hierin beschriebenen adenoviralen Vektor, verglichen wird.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Erniedrigen der Spiegel eines Tumorzellmarkers in einem Individuum bereit, umfassend das Verabreichen eines adenoviralen Vektors der vorliegenden Erfindung an das Individuum, worin der adenovirale Vektor selektiv cytotoxisch gegen Zellen, die den Tumorzellmarker produzieren, ist. Tumorzellmarker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf PSA, hK2 und carcinoembryonales Antigen. Verfahren zum Messen der Spiegel eines Tumorzellmarkers sind Durchschnittsfachleuten bekannt und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf immunologische Tests wie enzymgekoppelter Immunabsorptionstest (ELISA), unter Verwendung von für den Tumorzellmarker spezifischen Antikörpern. Allgemein wird eine biologische Probe aus dem zu testenden Individuum gewonnen und ein geeigneter Test wie ein ELISA wird an der biologischen Probe durchgeführt.
Die Erfindung stellt auch Behandlungsverfahren bereit, in welchen eine effektive Menge eines/von hierin beschriebenen adenoviralen Vektors(en) an ein Individuum verabreicht wird. Die Behandlung unter Verwendung eines/von adenoviralen Vektors(en) ist in Individuen mit prostataspezifischen Erkrankungen indiziert, wie oben beschrieben, wie zum Beispiel Hyperplasie und Krebs. Auch indiziert sind Individuen, von denen gedacht wird, dass sie ein Risiko für das Entwickeln von mit Prostata im Zusammenhang stehenden Erkrankungen haben, wie zum Beispiel jene, welche eine Erkrankung hatten, welche entfernt worden ist, und jene, welche eine Familiengeschichte von mit Prostata im Zusammenhang stehenden Erkrankungen hatten. Die Bestimmung der Geeignetheit des Verabreichens von adenoviralem/n Vektoren) der Erfindung wird unter anderem von bewertbaren klinischen Parametern wie serologischen Anzeichen und histologischer Untersuchung von Gewebebiopsien abhängen. Allgemein wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen adenoviralen Vektor(en), in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel verabreicht. Pharmazeutische Zusammensetzungen sind oben beschrieben.
Die Menge an zu verabreichendem/n adenoviralem/n Vektoren) wird von etlichen Faktoren abhängen, wie zum Beispiel dem Applikationsweg, dem Zustand des Individuums, dem Grad an Aggressivität der Erkrankung, dem bestimmten genutzten PB-TRE und dem bestimmten Vektorkonstrukt (d. h. dessen Adenovirusgen(e) unter PB-TRE-Kontrolle sind).
Falls es als ein verpacktes Adenovirus verabreicht wird, von ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10¹⁴, vorzugsweise von ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10¹², bevorzugter von ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10¹⁰. Falls ein Polynukleotidkonstrukt (d. h. nicht als ein Virus verpackt) verabreicht wird, können ungefähr 0,01 μg bis ungefähr 100 μg verabreicht werden, vorzugsweise 0,1 μg bis ungefähr 500 μg, bevorzugter ungefähr 0,5 μg bis ungefähr 200 μg. Mehr als ein adenoviraler Vektor kann verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend. Verabreichungen werden typischerweise periodisch gegeben, während jegliche Antwort überwacht wird. Applikation kann zum Beispiel intratumoral, intravenös oder intraperitoneal gegeben werden.
Die adenoviralen Vektoren der Erfindung können alleine oder in Verbindung mit anderen aktiven Mitteln verwendet werden, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, welche das gewünschte Ziel fördern.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern, aber nicht um sie zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Adenovirusvektoren enthaltend ein frühes Gen unter der Kontrolle eines Transkriptionselementes abgeleitet aus einem Probasintranskriptionsresponseelement (PB-TRE)
1.A. Das Probasintranskriptionsresponseelement (PB-TRE)
Das 454 Nukleotidfragment (nt ungefähr –426 bis ungefähr +28) des Ratten-PB-TRE, welches zwei Androgenresponseelemente (ARE-Stellen), eine CAAT-Box und eine TATAA-Box enthält (1, Sequenz ID Nr. 1) wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von genomischer Ratten-DNA als Matrize und den folgenden synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert:

42.2.1 (Sequenz ID Nr. 4): 5'-GATCACCGGTAAGCTTCCACAAGTGCATTTAGCC-3', PinAI-Stelle unterstrichen und
42.2.2 (Sequenz ID Nr. 5): 5'-GATCACCGGTCTGTAGGTATCTGGACCTCACTG-3' oder Oligonukleotide
42.2.3 (Sequenz ID Nr. 6): 5'-GATCCGGCCGAAGCTTCCACAAGTGCATTTAGCC-3' EagI-Stelle unterstrichen, und
42.2.4 (Sequenz ID Nr. 7): 5'-GATCCGGCCGCTGTAGGTATCTGGACCTCACTG-3'.

Die Oligonukleotide schufen eine einzige PinAI-(AgeI-) Stelle (A/CCGGT) oder EagI-Stelle (C/GGCCG) an beiden Enden des PCR-Fragments. Die PCR-Fragmente wurden in den pGEM-T-Vektor (Promega) ligiert, um die Plasmide CN249 und CN250 zu erzeugen. Ähnlich wurde CN256 unter Verwendung derselben Strategie geschaffen, aber das PB-TRE-Fragment wurde in den pCRT-Vektor (Invitrogen) ligiert; CN271 ist mit CN250 identisch, aber mit einer HindIII-Stelle an dem 5'-Ende. Diese Plasmide stellen die PB-TRE-DNA-Fragmente für die unten berichteten Konstrukte bereit. In etlichen der unten beschriebenen Adenovirusvektoren waren die endogenen (adenoviralen) TREs nicht deletiert; stattdessen war in jedem Konstrukt das PB-TRE zwischen das endogene TRE (z. B. das E1A-TRE) und sein jeweiliges kodierendes Segment (z. B. das E1A-Kodierungssegment) inseriert. In anderen Vektoren wurde der endogene (Ad5-) Promoter-Enhancer deletiert und der prostataspezifische Promoter-Enhancer wurde unmittelbar stromaufwärts eines frühen Gens platziert.
1.B. Konstruktion eines PB-TRE-Adenovirus, umfassend ein Adenovirusgen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen Transkriptionsregulationselementes
1.B.1. PB-TRE-gelenktes E1A-Ad5-Plamid (CN251)
Ein Adenovirusvektor, in welchem sich Expression eines frühen Gens, E1A, unter der Kontrolle von PB-TRE befindet, wurde wie folgt konstruiert.
CN124 ist ein Derivat des Konstruktes pXC.1, welches das linke Wildtypende von Ad5 enthält, von nt 22 bis 5790, einschließend sowohl E1A als auch E1B (McKinnon (1982) Gene 19: 33–42). CN124 hat neben anderen Änderungen auch eine künstliche PinAI-Stelle bei Ad5 nt 547 (zwischen dem E1A-Transkriptionsstart bei nt 498 und dem E1A kodierenden Segment, beginnend mit ATG bei 560).
Um CN124 aus pXC.1 zu konstruieren, führten wir eine AgeI-Stelle 12 bp 5' zu dem E1A-Startcodon (Ad5 547) durch oligonukleotidgerichtete Mutagenese und gekoppelte PCR ein. Um dies zu erreichen, wurde pXC.1 unter Verwendung der folgenden Primer PCR-amplifiziert:
5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA (15.133A) (Sequenz ID Nr. 8), enthaltend eine EcoRI-Stelle, und
5'-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA (15.134B) (Sequenz ID Nr. 9), enthaltend ein zusätzliches A, um eine AgeI-Stelle einzufügen. Dies schuf ein Segment von der EcoRI-Stelle in dem pBR322-Gerüst bis Ad5 560. Ein zweites Segment von pXC.1 von Ad 541 bis zu der XbaI-Stelle beim Ad-Nukleotid 1339 wurde unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
5'-GCATTCTCTAGACACAGGTG (15.133B) (Sequenz ID Nr. 10), enthaltend eine XbaI-Stelle, und
5'-TCCGACACCGGTGACTGAAA (15.134A) (Sequenz ID Nr. 11), enthaltend ein zusätzliches T, um eine AgeI-Stelle einzuführen. Diese zwei PCR-amplifizierten DNA-Segmente wurden vermischt und mit den Primern 15.133A und 15.133B amplifiziert, um ein DNA-Segment von der EcoRI-Stelle zu der XbaI-Stelle von pXC.1 zu schaffen. Dieses DNA-Segment umfasst die am weitest links liegenden 1317 Basen der Ad-Sequenz und enthält eine AgeI-Stelle bei Ad 547. Dieses DNA-Segment wurde verwendet, um das entsprechende Segment von pXC.1 zu ersetzen, um dadurch CN95 zu schaffen.
Eine EagI-Stelle wurde stromaufwärts der E1B-Startstelle durch Inserieren eines G-Restes bei Ad5 1682 durch oligonukleotidgerichtete Mutagenese geschaffen, wie oben. Um die Insertion eines PB-TRE in eine EagI-Stelle zu vereinfachen, wurde die endogene EagI-Stelle in CN95 durch Verdauung mit EagI, Behandlung mit Mungbohnennuklease und Religation entfernt, um CN114 zu konstruieren. Die Primer:
5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA (15.133A) (Sequenz ID Nr. 8), enthaltend eine EcoRI-Stelle und
5'-GCCCACGGCCGCATTATATAC (9.4) (Sequenz ID Nr. 12), enthaltend eine EagI-Stelle und
5'-GTATATAATGCGGCCGTGGGC (9.3) (Sequenz ID Nr. 13), enthaltend ein zusätzliches G und eine EagI-Stelle, und
5'-CCAGAAAATCCAGCAGGTACC (24.020) (Sequenz ID Nr. 14), enthaltend eine KpnI-Stelle, wurden verwendet, um das Segment zwischen 1682 und der KpnI-Stelle bei Ad5 2048 zu amplifizieren. Coamplifikation der beiden Segmente mit den Primern 15.133A und 24.020 ergab ein Fragment mit einer EagI-Stelle bei Ad5 1682, welches verwendet wurde, um die entsprechende EcoRI/KpnI-Stelle in pXC.1 zu ersetzen, um CN124 zu konstruieren.
CN124 wurde mit PinAI linearisiert und mit alkalischer Kälberdarmphosphatase (New England Biolabs) dephosphoryliert. CN249 wurde mit PinAI verdaut, um das PB-TRE- Fragment freizusetzen. Das PB-TRE-Fragment wurde dann in das mit PinAI linearisierte CN124 ligiert, wodurch CN251 erzeugt wurde. CN253 ist ähnlich wie CN251, mit der Ausnahme, dass sich das PB-TRE-Fragment in umgekehrter Orientierung befindet.
Folglich enthält das Konstrukt CN251 das PB-TRE, das stromaufwärts des E1A-Kodierungssegmentes in das Adenovirus-5-Genom inseriert und daran operabel gekoppelt ist. Der Vektor CN253 ist ähnlich, aber das PB-TRE befindet sich in der umgekehrten Orientierung.
1.B.2. PB-TRE-gelenktes E1B-Ad5-Plasmid (CN254)
Es wurde ein Adenovirusderivat, in welchem sich die Expression eines anderen frühen Gens, E1B, unter der Kontrolle des PB-TRE befindet, wie folgt konstruiert.
CN124, welches das linke Ende von Ad5 trägt, wie oben beschrieben, enthält ebenfalls eine künstliche EagI-Stelle bei Ad5 nt 1682, oder unmittelbar stromaufwärts des E1B-Kodierungssegmentes. Das PB-TRE-Fragment wurde aus CN250 mit EagI ausgeschnitten und in CN124, das mit EagI verdaut worden war, inseriert. Dies erzeugte CN254, welches das PB-TRE unmittelbar stromaufwärts des E1B-Kodierungssegmentes und operabel daran gekoppelt enthält.
CN255 ist mit CN254 identisch, aber die Orientierung des PB-TRE-Inserts ist umgekehrt.
CN275 ist dasselbe wie CN254, aber mit einer HindIII-Stelle an dem 5'-Ende.
1.C. Konstruktion von Adenovirusvektoren, in welchen die Expression eines Adenvirusreplikationsgens durch PB-TRE kontrolliert wird und die Expression des anderen durch ein anderes prostataspezifisches TRE kontrolliert wird.
1.C.1. Adenovirusvektor, umfassend ein PB-TRE-gelenktes E1A und durch einen anderen Promoter-Enhancer, PSA-TRE, gelenktes E1B (CN257)
Ein Adenovirusvektor, in welchem sich die Expression des E1A-Gens unter der Kontrolle des PB-TRE befindet, und die Expression des E1B-Gens sich unter der Kontrolle des Transkriptionsregulationselementes für prostataspezifisches Antigen (PSA-TRE) befindet, wurde wie folgt konstruiert. Die PSA-TRE-Region wurde im Detail unter anderem beschrieben in den US-Patenten mit den Nummern 5,648,478 und 5,698,443; Lundwall (1989) Biochim. Biophys. Res. Commun. 161: 1151–1159; und Zhang et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3143–50.
CN125 ist ein Adenovirusderivat (vom linken Ende), in welchem die Expression des E1B-Gens von einem PSA-TRE gelenkt wird und in welchem eine PinAI-Stelle stromaufwärts des E1A-Gens liegt, dessen Expression durch seinen Wildtyp-(endogenen) Promoter gelenkt wird. CN125 wurde durch Inserieren des PSA-TREs als ein EagI-Fragment aus CN105 in die EagI-Stelle von CN124 (unmittelbar stromaufwärts des E1B-Gens) abgeleitet.
Das PinAI-PB-TRE-Fragment wurde dann in mit PinAI, welches unmittelbar stromaufwärts von E1A spaltet, verdautes CN125 inseriert. Dies schuf das Konstrukt CN257, welches ein Plasmid ist, das ein PB-TRE-gelenktes E1A und PSA-TRE-gelenktes E1B enthält. CN258 ist ähnlich wie CN257, aber mit der umgekehrten Orientierung des PB-TRE-Fragmentes.
1.C.2. Ad5-Plasmid, umfassend PSA-TRE-gelenktes E1A und PB-TRE-gelenktes E1B (CN273)
Ein Adenovirusvektor wurde konstruiert, in welchem die Expression von E1A durch den exogenen Nicht-PSA-TRE-Promoter-Enhancer vermittelt wird und in welchem die Expression von E1B durch PB-TRE vermittelt wird.
Das Konstrukt CN257, welches ein von PB-TRE gelenktes E1A und ein von PSA-TRE gelenktes E1B enthaltendes Plasmid ist, wurde oben beschrieben.
CN273 wurde mit einer Positionsänderung zwischen PSA-TRE und PB-TRE in CN257 konstruiert. CN143 ist ein pBluescript-(Stratagene, La Jolla, California) Derivat, enthaltend das PSA-TRE-Fragment. Dieses Fragment wurde mit PinAI ausgeschnitten und in mit PinAI verdautes CN254 ligiert. Das Endkonstrukt ist ein Plasmid, enthaltend PSA-TRE-gelenktes E1A und PB-TRE-gelenktes E1B. CN274 ist ähnlich wie CN273, mit der Ausnahme der umgekehrten Orientierung von PB-TRE.
1.D. Konstruktion von Adenovirusvektoren, in welchen die Expression von mehr als einem Adenovirusreplikationsgen durch ein PB-TRE kontrolliert wird
1.D.1. PB-TRE-gelenktes E1A- und PB-TRE-gelenktes E1B-Ad5-Plasmid (CN268)
Ein Adenovirusvektor, in welchem die Expression von sowohl E1A als auch E1B durch PB-TRE gelenkt sind, wurde wie folgt konstruiert.
CN251, oben beschrieben, umfasst ein PB-TRE-Fragment, das unmittelbar stromaufwärts des E1A-Kodierungssegmentes inseriert ist.
CN268 wurde erzeugt durch Inserieren eines zweiten PB-TRE vor dem E1B-Gen in CN251. Ein PB-TRE-Fragment wurde aus CN250 durch EagI-Verdauung ausgeschnitten und in EagI-verdautes CN251 ligiert, um CN268 zu schaffen. Das Endkonstrukt ist ein Plasmid mit E1A lenkendem PB-TRE und einem zweiten, E1B lenkenden PB-TRE. CN269 ist dasselbe wie CN268, aber die Orientierung des zweiten PB-TRE ist umgekehrt.
Zusätzlich war in Experimenten (unten beschrieben), in welchen adenovirale Vektoren konstruiert worden sind, worin zwei Gene sich unter der Kontrolle von zwei gesonderten, für Prostatazellen spezifischen TREs befanden, die Wirkung synergistisch (d. h. die Steigerung in der Zellspezifität der Transkription ist mehr als additiv).
1.E. Konstruktion von Adenovirusvektoren, in welchen sich die Expression von Reportergenen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TRE befinden
1.E.1. PB-TRE-gelenktes Reportergenplasmid (CN280, CN281)
Ein Adenovirusvektor, der das gesamte Strukturgen von Glühwürmchenluciferase (luc), gelenkt durch ein PB-TRE, enthält, wurde wie folgt konstruiert.
CN280 wurde von pGL3-Basic (Promega) für Transfektionsexperimente abgeleitet. Ein PB-TRE-Fragment wurde aus CN249 durch NcoI/SacI-Verdauung ausgeschnitten und in mit NcoI-/SacI-verdautes pGL3-Basic ligiert, um CN280 zu produzieren. Das Endkonstrukt ist ein Plasmid, das das gesamte Strukturgen von luc, gelenkt durch PB-TRE, enthält.
CN281 wurde aus demselben Vorgehen erzeugt, mit der Ausnahme, dass ein PB-TRE-Fragment in pGL3-Enhancer (Promega) ligiert wurde.
1.E.2. AR-Heraufregulation von PB-TRE-gelenkter Reportergenezpression
Um die Spezifität von PB-TRE-gelenkter Genexpression zu testen, wurde die Region der 5'-flankierenden PB-DNA (ungefähr –426 bis ungefähr +28), einschließlich der endogenen Promotersequenzen, stromaufwärts des Glühwürmchenluciferasegens inseriert, um ein chimäres PB-TRE-luc-Plasmid (CN280) (siehe oben) zu erzeugen. Transiente Transfektion von LNCaP-(PSA-produzierende und AR-produzierende Prostatacarcinomzellen) und PC-3-Zellen (PSA-Mangel- und AR-Mangel-Prostatacarcinomzellen) wurde durchgeführt. Transfektion schloss das kationische lipidvermittelte Verfahren unter für einen anderen Vektor, pCMV-βgal, standardisierten Bedingungen ein. Die in 3 präsentierten Ergebnisse zeigen, dass LNCaP-Zellen, mit CN280 transfiziert, ungefähr 400 mal mehr Aktivität als der Hintergrund haben, was anzeigt, dass das PB-TRE intakt ist. Weiter war die Gesamtluciferaseaktivität, die in den zellulären Extrakten von LNCaP-Zellen wiedergewonnen wurde, viel höher (ungefähr 30-40-fach) als jene, die in PC-3-Zellen gemessen worden ist. Folglich zeigen die Ergebnisse, dass PB-TRE-Expression in AR-produzierenden, PSA-produzierenden Zellen heraufreguliert ist, und dass PB-TRE in der Lage ist, spezifische Expression in den Androgenrezeptor-produzierenden Zellen zu vermitteln.
1.F. Homologe Rekombination für die Erzeugung der rekombinanten Adenovirusvektoren, enthaltend ein PB-TRE
Von den oben beschriebenen Plasmiden, in welchen sich ein Adenovirusgen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs befindet, enthielten viele nur das linke Ende von Adenovirus. Um ganze Adenoviren zu konstruieren, die Adenovirusgen(e) unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs umfassen, wurden diese Plasmide mit Adenovirusplasmiden vom rechten Ende homolog rekombiniert.
Eine menschliche embryonale Nierenzelllinie, 293, exprimiert die E1A- und E1B-Gene von Ad5 effizient und zeigt eine hohe Transfektionseffizienz mit Adenovirus-DNA. Für diese Experimente wurden 293-Zellen mit einem Ad5-Plasmid vom linken Ende und einem Ad5- Plasmid vom rechten Ende cotransfiziert. Homologe Rekombination erzeugt ganze PB-TRE-enthaltende Adenoviren mit den erforderlichen genetischen Elementen für die Replikation in 293-Zellen. Kurz, 5 μg CN251 (PB-TRE-E1A) und BHG11 (welches den rechten wt-Teil von Adenovirus enthält) wurden in 293-Zellen cotransfiziert. Die Zellen wurden mit Medium überschichtet und infektiöses Virus, erzeugt durch In-vivo-Rekombination, wurde durch cytopathische Wirkung detektiert und isoliert. Plaquegereinigte Stämme eines Vektors, umfassend ein PB-TRE, genannt CN737, wurden etabliert. Die Struktur des rekombinanten Virus wurde durch PCR, Restriktionsendonukleaseverdauung und Southern-Blot-Analyse charakterisiert. Das virale Genom von CN737 ist das Ad5 voller Länge, worin E1A sich unter der Kontrolle eines PB-TRE befindet.
Die zu kombinierenden Plasmide wurden in 293-Zellen unter Verwendung von kationischen Liposomen wie Lipofectin (DOTMA: DOPE^TM, Life Technologies) cotransfiziert. Die beiden Plasmide (jeweils 10 μg in 500 μl Minimalmedium (MEM) ohne Serum oder andere Additive) wurden mit einem vielfachen molaren Überschuss an Liposomen in 200 μl desselben Puffers vermischt. Die DNA-Lipidkomplexe wurden dann auf die Zellen gegeben und bei 37 °C, 5 % CO₂, für 16 Stunden inkubiert. Nach Inkubation wurde das Medium zu MEM mit 10 % fötalem Rinderserum gewechselt und die Zellen werden weiter bei 37 °C, 5 % CO₂ für 10 Tage mit zwei Medienwechseln inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Zellen und Medium in Röhrchen übertragen, dreimal eingefroren und wieder aufgetaut und das Lysat wurde verwendet, um 293-Zellen bei der geeigneten Verdünnung zu infizieren, um individuelle Viren als Plaques zu detektieren. Erhaltene Plaques wurden zweimal plaquegereinigt und Viren wurden für die Anwesenheit der gewünschten Sequenzen durch PCR und gelegentlich durch DNA-Sequenzieren charakterisiert. Für weitere Experimente wurden die Viren im großen Maßstab durch Cäsiumchloridgradientenzentrifugation gereinigt.
Zusätzliche Viren, die das gesamte Adenovirusgenom mit einem oder mehreren frühen Genen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs enthalten, wurden ebenfalls konstruiert. Die Viren CN738, CN739 und CN740 wurden mit demselben Ansatz erzeugt, mit der Ausnahme, dass CN251 (PB-TRE – E1A) Plasmid mit 254 (PB-TRE – E1B), CN257 (PB-TRE – E1A, PSA-TRE – E1B) bzw. CN273 (PSA-TRE – E1A, PB-TRE – E1B), ersetzt wurde. In jedem dieser Viren wurde das prostataspezifische TRE (PB-TRE oder PSA-TRE) zwischen das geeignete kodierende Segment (zum Beispiel E1A oder E1B) und seinen entsprechenden endogenen Promoter inseriert. Diese Viren wurden deshalb durch Verändern von einer oder zwei identischen Kopien des Ratten-PB-TREs stromaufwärts von einem oder zwei essentiellen frühen Genen von Adenovirus 5, E1A und E1B, konstruiert.
Kurz, CN737 ist ein Adenovirus vom Typ 5, welches ein PB-TRE stromaufwärts des E1A-Gens enthält; CN738 enthält PB-TRE stromaufwärts von E1B; und CN740 enthält zwei identische Kopien von PB-TRE stromaufwärts von E1A und E1B.
Beispiel 2
Testen eines mutmaßlichen PB-TRE
Plasmide, die ähnlich wie ein Reporterplasmid sind, wie zum Beispiel das oben beschriebene CN280, können verwendet werden, um die Prostataspezifität von mutmaßlichen prostataspezifischen TREs (PS-TREs) oder PS-TRE-Varianten wie PB-TRE-Varianten zu testen. Das zu testende PS-TRE kann Mutationen, wie zum Beispiel Deletionen oder Insertionen, zwischen Bindungsstellen haben, von denen bekannt ist, dass sie bei der PS-TRE-Aktivität wichtig sind (z. B. Stellen sind, etc.), oder können Basensubstitution in diesen Stellen selber haben. Zum Beispiel sind gewisse Varianten in den AREs (Androgenrezeptorbindungsstellen) von PB-TREs bekannt und oben und in der Literatur beschrieben. Rennie et al. (1993) Mol. Endocrinol. 7: 23–36. Zusätzliche PB-TRE-Varianten können zum Beispiel Mutationen) zwischen einem PB-TRE-Promoter und einem PB-TRE-Enhancer umfassen (einschließlich Deletionen, Substitutionen und Additionen); eine Kombination aus einem nicht-prostataspezifischen Promoter und einem PB-TRE-Enhancer; eine Kombination aus einem nicht-prostataspezifischen Promoter und einem PSA-TRE-Enhancer; die Umordnung von Segmenten des Enhancers und Promoters eines prostataspezifischen TREs; oder jede andere Variante eines PB-TRE.
Kurz, das mutmaßliche prostataspezifische TRE oder die TRE-Variante wie zum Beispiel ein mutmaßliches PB-TRE wird stromaufwärts eines Reportergens (veranschaulicht zum Beispiel durch, aber nicht beschränkt auf Glühwürmchenluciferase, luc) inseriert. Reportergene wurden oben offenbart und Verfahren für eine solche Konstruktion sind in der Technik bekannt oder sind hierin offenbart.
Ein Vergleich der Reportergenaktivität in Prostatazellen (oder Zellen, die Prostatagenprodukte exprimieren) und Nicht-Prostatazellen, unter Verwendung eines Adenovirus mit einem zellunspezifischen Promoter (z. B. CMV), der die Reportergenexpression kontrolliert, als eine Kontrolle, kann die Effizienz eines mutmaßlichen PB-TREs beim Vermitteln prostatazellspezifischer Genexpression anzeigen.
Beispiel 3
Testen der cytotoxischen Fähigkeit von Adenovirusvektoren auf Prostatacarcinomzellen und Tumorxenotransplantaten
3.A. Experimentelle Strategie
Ein besonders nützliches Ziel bei der Entwicklung von prostataspezifischen adenoviralen Vektoren ist, Patienten mit Prostatacarcinom zu behandeln. Die Strategie liegt darin, ein für Prostatagewebe spezifisches Targetingarzneimittel zu entwickeln, welches einen bestimmten Typ an Tumorzellen (wie zum Beispiel prostatische Neoplasie) selektiv abtöten könnte, während ihre uncancerösen Nachbarn unbeschädigt bleiben. Ein „Smart Bomb"-Virus, in welchem Schlüsselgenexpression durch ein gewebespezifisches Regulationselement, das in sein Chromosom integriert ist, beschränkt ist, erfüllt diese Anforderung. Wie zuvor festgestellt, findet PB-Genexpression ausschließlich in der Prostata statt und wird transkriptional durch Androgene reguliert. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die 454 Mindestnukleotide eines PB-TRE ausreichend sind, um Genexpression auf Prostatazellen zu richten und sie darauf zu beschränken. Diese Anordnung beschränkte Expression von wichtigen frühen viralen Genen auf Prostatazellen. Das E1-Kodierungssegment zum Beispiel kann unter die Kontrolle von PB-TRE gestellt werden; das TRE wird in Nicht-Prostatazelltypen stumm bleiben und folglich eine frühe Genexpression, virale Replikation und Zelllyse verhindern. Etliche Experimente trugen zu dem Verständnis von PB-TRE enthaltenden Adenoviren CN737, CN738 und CN740, oben beschrieben, bei.
Ein anfänglicher Indikator der Machbarkeit ist, die Vektoren unter Verwendung einer in der Technik bekannten Technik zu testen, wie zum Beispiel das Testen der Vektoren für Cytotoxizität gegen Prostata- und Nicht-Prostatazellen in vitro (cytopathische Wirkungen), Plaquetests und Tests gegen Carcinomzellen wie zum Beispiel Prostataxenotransplantate, die in Balb/c-nu/nu-Mäusen sukutan wachsen.
3.B. Cytopathische In-vitro-Wirkungen auf Adenovirus mit adenoviralen frühen Genen) unter der Kontrolle von prostataspezifischem/n TRE(s)
Die erste auf der Hand liegende Aufgabe war, die differentielle virale Replikation und die cytopathischen Wirkungen (CPE) zu charakterisieren.
Das verwendete Adenovirus schloss CN702 (Ad5 voller Länge mit ungeänderter E1-Region); CN737 (Ad5 voller Länge mit E1A unter der Kontrolle von PB-TRE; siehe Beispiel 1) und CN740 (Ad5 voller Länge mit sowohl E1A als auch E1B unter der Kontrolle von Kopien von PB-TRE; siehe Beispiel 1) ein.
CPE-Tests wurden wie folgt durchgeführt: Zellen wurden mit Virus mit steigenden Multiplizitäten der Infektion (MOI) infiziert und für cytopathische Wirkung überwacht. Eierstockcarcinomzellen (OVCAR-3) und humane Prostatakrebszellen (LNCaP) machten jeweils eine vollständige Monoschichtcytolyse mit Wildtypadenovirus CN702 bei einer so geringen MOI wie 0,01 innerhalb von 7 bis 10 Tagen durch. Dies zeigte, dass Wildtypadenovirus sowohl Prostata- als auch Nicht-Prostatazellen infiziert. Im Gegensatz dazu, zeigten mit CN737 (PB-TRE – E1A) oder CN740 (PB-TRE – E1A, PB-TRE – E1B) infizierte LNCaP-Zellen signifikante cytopathische Wirkungen zu denselben Zeitpunkten mit MOI von 0,1 oder 0,01. Mit CN737 oder CN740 infizierte OVCAR-3-Zell-Monoschichten zeigten keine sichtbaren cytopathischen Wirkungen mit demselben MOI.
Folglich waren Adenoviren, in welchen sich ein oder zwei frühe Ad5-Gene unter der Kontrolle von Probasin-TREs befanden, in der Lage, Replikation und cytopathische Wirkungen besonders in Prostatazellen, aber nicht in Nicht-Prostatazellen, zu vermitteln.
3.C. Plaquetest von Adenovirus mit Adenovirusgen(en) unter der Kontrolle von prostataspezifischen TRE(s)
Prostatazellspezifität von Adenovirusviren mit Adenovirus unter der Kontrolle von prostataspezifischen TRE(s) wurde quantifiziert. Ein Verfahren, das verwendet worden ist, um dieses zu testen, war ein Plaquetest. Ein Plaquetest ist ein infektiöser Test, welcher quantifiziert, wie effizient ein bestimmtes Virus eine produktive Infektion in einer Zelllinie erzeugt. Die Plaquebildungseffizienz wurde in den folgenden Zelltypen beurteilt: Prostatazellen (LNCaP) und Nicht-Prostatazellen (MCF-7, BHL-100, OVCAR-3 und 293).
Der Plaquetest wurde wie folgt durchgeführt: Konfluente Zellmonoschichten, in 6-Well-Schalen 18 Stunden vor der Infektion ausgesät, wurden mit 10-fachen Reihenverdünnungen von CN737, CN738, CN740 und CN702 infiziert. Nach dem Infizieren von Monoschichten für vier Stunden in serumfreien Medien (MEM), wurde das Medium entfernt und mit einer Lösung aus 0,75 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Gewebekulturmedium ersetzt. Plaques wurden zwei Wochen nach der Infektion bewertet.
Tabelle 1 Plaquetest mit PB-TRE verändertem Adenovirus
Tabelle 1 zeigt die durchschnittlichen Titer von Doppelproben für die getesteten Viren. Der Titer für ein bestimmtes Virus in sämtlichen Zelllinien wurde auf seinen Titer auf 293-Zellen normalisiert. Dies erlaubt Vergleiche zwischen Viren in einem bestimmten Zelltyp. Wenn die Titer auf einem Zelltyp erst einmal auf 293-Zellen normalisiert worden sind, wurden die normalisierten Zahlen der rekombinanten Viren mit CN702 verglichen. Ein Verhältnis von weniger als 1 legt nahe, dass das getestete Virus Plaques weniger effizient als CN702 bildet. Umgekehrt legt ein Verhältnis von mehr als 1 nahe, dass das Virus Plaques effizienter als CN702 bildet.
Etliche interessante Beobachtungen können aus dem Plaquetest gemacht werden. Die erste und wichtigste, mit PB-TRE veränderte Adenoviren zeigten im Vergleich mit Nicht-Prostatazellen eine bevorzugte Replikation in der Prostatatumorzelllinie LNCaP. Da dieses Carcinom Androgenrezeptor und PSA exprimiert, sollte die in den Adenovirusvektoren errichtete PB-Regulationsregion beim Fördern der Transkription von frühen adenoviralen Genen aktiv sein. Die Daten legen nahe, dass dies der Fall ist und dass das ein PB-TRE umfassende Adenovirus cytocytopathische Wirkungen mit einer Effizienz induzierte, die vergleichbar ist mit jener des Wildtypadenovirus in Prostatatumorzellen. Zweitens zeigen PB-TRE-gelenkte Adenoviren eine sehr geringe virusvermittelte Cytolyse von Nicht-Prostatatumorzellen. Die Plaquebildungseffizienz von drei der Adenovirusvektoren, umfassend ein PB-TRE, nimmt dramatisch in den Nicht-Prostatazelllinien, die in das Experiment eingeschlossen waren, ab. Folglich ist durch PB-TRE verändertes Virus vermittelte Cytolyse signifikant im Verhältnis zu Wildtypadenovirus in Nicht-Prostatazellen reduziert.
Drittens, der Vektor CN740, in welchem zwei Adenovirusreplikationsgene (E1A und E1B) durch gesonderte PB-TREs kontrolliert sind, zeigte unerwarteterweise eine bessere Spezifität als Adenoviren, in welchen nur ein Adenovirusgen durch ein PB-TRE kontrolliert wurde. Zum Beispiel zeigte CN737, in welchem ein PB-TRE die Expression von E1A kontrolliert, in der AR-Mangelzelllinie PC-3 eine vierfache Zunahme in der Replikationsspezifität im Vergleich mit CN702 (wt). CN738, worin PB-TRE die Expression von E1B kontrolliert, zeigte eine geringe Zunahme in der Spezifität. CN740 jedoch, in welchen PB-TREs die Transkription von sowohl E1A als auch E1B kontrollieren, zeigte eine 13-fache Zunahme in der Replikationsspezifität, was mehr als additiv ist. Eine ähnliche Synergie wurde mit der AR-Mangelzelllinie HBL-100 gezeigt. In dieser Linie zeigte CN737 eine 370-fache Zunahme in der Spezifität und CN737 eine 10-fache. CN740 zeigte jedoch eine 14.000-fache Zunahme in der Replikationsspezifität. Deshalb resultiert das Hinzufügen eines zweiten prostataspezifischen TREs, das ein Adenovirusreplikationsgen kontrolliert, in mehr als einem additiven Effekt und unerwarteterweise in einer besseren Zunahme in der zellspezifischen Replikation.
Während alle drei ein PB-TRE umfassende Vektoren, CN737, CN738 und CN740, eine prostataspezifische Replikation im Vergleich mit wt-CN702 zeigten, zeigten CN737 und CN740 eine höhere Spezifität als CN738 (PB-TRE – E1B).
Zusätzlich replizierten die PB-TRE enthaltenden Adenoviren in der Prostatazelllinie etwas weniger gut als wt-CN702. Zum Beispiel produzierte CN737 einen Titer von 0,56 im Verhältnis zu jenem von CN702. Dies spiegelt jedoch einen kleinen Abfall (bis zu 2- oder 3-fach) in der Replikation in Prostatazellen wider, der gleichzeitig mit einer sehr starken Zunahme (bis zu 1.200-fach) in der Spezifität erhalten wurde.
Kurz, die oben beschriebenen PB-TRE-Adenoviren zeigten eine Fähigkeit, spezifisch auf Prostatazellen, die Androgenrezeptor exprimieren, zu replizieren.
3.D. Testen der Wirksamkeit gegen Xenotransplantate von Adenovirus, umfassend ein Adenovirusgen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TRE
Mäuse werden Subkutaninjektionen mit 1 × 10⁷ Prostatacarcinomzellen, wie zum Beispiel LNCaP, in PBS verabreicht. Tumorzellen können für Probasinaktivität durch Testen für Probasin in Serum unter Verwendung von Standardtests (zum Beispiel ELISA) getestet werden.
Für dieses Experiment werden Testvirusvektoren in die Mäuse entweder durch direkte intratumorale, intravenöse oder intraperitoneale Injektion von annähernd 10⁸ pfu Virus (falls sie als ein verpacktes Virus verabreicht werden) in 0,1 ml PBS + 10 % Glycerol oder intravenös über die Schwanzvene eingeführt. Falls sie als ein Polynukleotidkonstrukt verabreicht werden (d. h. nicht in Virus verpackt), können 0,1 μg bis 100 μg oder mehr verabreicht werden. Tumorgrößen werden gemessen und in gewissen Experimenten werden Blutproben wöchentlich entommen. Die Wirkung von intratumoraler Injektion eines Adenovirusvektors der vorliegenden Erfindung auf die Tumorgröße und Serumandrogenrezeptorspiegel wird mit der Scheinbehandlung verglichen.
Während es wahrscheinlich ist, dass ein auf den hier beschriebenen Viren basiertes Therapeutikum intraläsional (d. h. durch direkte Injektion) gegeben würde, wäre es auch wünschenswert, zu bestimmen, ob die intravenöse (IV) Applikation des Virus das Tumorwachstum beeinflussen kann. Falls dies so ist, dann ist es denkbar, dass das Virus verwendet werden könnte, um metastatische Tumorablagerungen, die für die direkte Injektion unzugänglich sind, zu behandeln. Für dieses Experiment werden Gruppen aus fünf Mäusen, die Prostatakrebstumoren tragen, mit 10⁸ pfu eines adenoviralen Vektors der vorliegenden Erfindung durch Schwanzveneninjektion oder 10⁸ pfu eines replikationsdefekten Adenovirus (CMV-LacZ), um für unspezifische toxische Wirkungen des Virus zu kontrollieren, oder mit Puffer, der verwendet wird, um das Virus zu tragen, inoculiert. Die Wirkung der IV-Injektion des adenoviralen Vektors auf die Tumorgröße wird mit der Scheinbehandlung verglichen. Wie in Beispiel 5.F. gezeigt, war das modifizierte Adenovirus der vorliegenden Erfindung in der Lage, spezifisch in gegenständlichen Mäusen induziertes Prostatazellcarcinom auszulöschen.
Beispiel 4
Konstruktion eines adenoviralen Vektors, enthaltend die kodierende Region für das Adenovirus Death Protein (ADP) unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TRE
Ein Adenovirusvektor, in welchem das Adenovirus Death Protein (ADP) unter die Kontrolle eines PB-TRE gestellt wurde, kann wie unten beschrieben konstruiert sein. ADP ist in der E3-Region kodiert und befindet sich natürlicherweise unter der Kontrolle des starken späten Promoters (MLP). Das Gen scheint für ein Protein (ADP) zu kodieren, das beim Beschleunigen von Wirtszelllyse wichtig ist. Tollefson et al. (1996) J. Virol. 70 (4): 2296; Tollefson et al. (1992) J. Virol. 66 (6): 3633. Folglich können die das ADP-Gen enthaltenden adenoviralen Vektoren den adenoviralen Vektor potenter machen, was eine effektivere Behandlung und/oder die Erfordernisse einer niedrigeren Dosierung möglich macht.
In einem AR-spezifischen viralen Vektor (wie jene in Beispiel 1 oben beschriebenen) kann eine Deletion in der E3-Region geschaffen werden, um ein PB-TRE zu beherbergen. Die ADP-kodierende Sequenz von Ad2 kann in die E3-Region von Adenovirus Ad5 wie folgt erneut eingeführt werden:
Eine ADP-Kassette wird unter Verwendung von überlappender PCR konstruiert. Die Y-Leitsequenz, eine wichtige Sequenz für die korrekte Expression von gewissen späten Genen, wird unter Verwendung von den folgenden Primern PCR-amplifiziert:
5'GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG...Ad2 28287 bp (37.124.1) (Sequenz ID Nr. 15); und
5'GTGGAACAAAAGGTGATTAAAAAATCCCAG...Ad2 28622 bp (37.146.1) (Sequenz ID Nr. 16).
Die ADP-Kodierungsregion wird unter Verwendung der folgenden Primer PCR-amplifiziert:
5'CACCTTTTGTTCCACCGCTCTGCTTATTAC...Ad2 29195 bp (37.124.3) (Sequenz ID Nr. 17) und
5'GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGAGC...Ad2 29872 bp (37.124.4) (Sequenz ID Nr. 18).
Die beiden Fragmente wurden der Doppelstrangbildung unterzogen und das Überlappungsprodukt wurde unter Verwendung der Primer 37.124.1 und 37.124.4 PCR-amplifiziert. Die Enden des Produktes wurden mit Klenow-Fragment geglättet und an mit BamHI geschnittenes pGEM-72(+) (CN241; Promega, Madison, WI) ligiert. Die ADP-Kassette wurde durch Verdauen von CN241 mit PacI-Restriktionsendonuklease ausgeschnitten und mit zwei Vektoren, CN247 und CN248, ligiert, wodurch die Plasmide CN252 bzw. CN270 erzeugt wurden. CN247 enthält eine einzige PacI-Stelle in der E3-Region und wurde wie folgt konstruiert. Ein das Ad5-Genom voller Länge enthaltendes Plasmid, TG3602 (Transgene, France), wurde mit BamHI verdaut und religiert, um CN221 zu ergeben. Das Gerüst dieses Plasmids (außerhalb der Adenovirussequenz) enthielt eine PacI-Stelle, die entfernt werden musste, um weitere Manipulationen zu erlauben. Dies wurde bewirkt durch Verdauen von CN221 mit PacI und Glätten der Enden mit T4-DNA-Polymerase, was in CN246 resultierte. CN246 wurde mit AscI und AvrII verdaut (um die intakte E3-Region zu entfernen). Dieses Fragment wurde durch ein ähnlich geschnittenes Fragment, abgeleitet von BHG11, ersetzt. Dem resultierenden Plasmid, CN247, fehlt die E3-Region und eine für die Insertion des ADP-Kassettenfragments (oben beschrieben) geeignete PacI-Stelle. Ligation von CN247 mit der ADP-Kassette erzeugte CN252.
CN248 (ein Konstrukt, das die Einführung einer ADP-Kassette in ein AD, das auch eine Deletion/Substitution in der E4-Region enthält, erlauben würde) wurde wie folgt gemacht. Die E4-Region wurde durch Verdauen von CN108, ein Konstrukt, welches das rechte Ende der Ad5-Sequenz von der einzigen EcoRI-Stelle in der E3-Region enthält, mit AvrII und AfIII deletiert. Das einzige für die virale Replikation notwendige E4-ORF, ORF 6, wurde durch PCR-Amplifizieren des ORF mit den folgenden Primern erneut eingeführt:
33.81.1 (Ad5 33096):
GCAGCTCACTTAAGTTCATGTCG (Sequenz ID Nr. 19)
33.81.2 (Ad5 34084):
TCAGCCTAGGAAATATGACTACGTCCG (Sequenz ID Nr. 20).
Das resultierende Plasmid ist CN203. CN203 wurde mit EcoRI verdaut und an CN209, ein Shuttleplasmid, ligiert, um CN208 zu erzeugen. In dem abschließenden Klonierungsschritt wurde CN208 mit AscI und AvrII verdaut und an eine ähnlich geschnittene E4-Deletion/Substitution mit der ADP-Kassette ligiert.
Folglich sind sowohl CN252 als auch CN270 adenovirale Vektoren, die das ADP-Gen enthalten und denen das E3-Gen fehlt. Zusätzlich fehlt CN270 eine gewisse Sequenz in der E4-Region, wie hierin kürzlich beschrieben. Adenovirale Vektoren voller Länge werden über In-vitro-Ligation von (1) geeignet zubereiteter viraler DNA, die mit BamHI verdaut ist, und (2) CN252 oder CN257, die auch mit BamHI verdaut sind, erhalten. Das Ligationsprodukt wird verwendet, um 293-Zellen zu transfizieren. Plaquetests werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
CN252 und CN270 können ebenfalls durch Insertion eines PB-TRE modifiziert sein, um das ADP-Gen unter die Transkriptionskontrolle von PB-TRE zu stellen.
Beispiel 5
Zusätzliche Analyse von Adenoviren in welchen sich Adenovirusgene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs befinden
5.A. Adenovirale Vektoren
In jedem der Adenoviren CN739 und CN753 waren zwei virale Gene unter der Kontrolle von zwei gesonderten prostataspezifischen TREs. Von diesen Viren wurde gezeigt, wie unten beschrieben, dass sie ein stabiles Genom besitzen, ein höheres Maß an Spezifität zeigen als Adenoviren, in welchen sich nur ein Gen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs befindet, und zellspezifische adenovirale Replikation in cytopathischen Tests, Plaquetests und in In-vivo-Tests an Prostataxenotransplantaten in athymischen Mäusen vermitteln.
Ein wie in Beispiel 1.F. beschriebenes Adenovirus CN739 umfasst ein ganzes Adenovirus, in welchem ein PB-TRE die Expression von E1A kontrolliert und PSA-TRE die Expression von E1B kontrolliert.
Im Adenovirus CN753, im Detail unten beschrieben, kontrolliert ein PB-TRE die Expression von E1B und ein PSA-TRE kontrolliert E1A. In anderen Adenovirusvektoren wurde E1A unter die Kontrolle eines PB-TRE oder PSA-TRE durch Inserieren eines PB-TRE oder PSA-TREs zwischen den nativen (wt) E1A-Promoter und das E1A-Kodierungssegment gestellt, wodurch folglich die folgende Sequenz geschaffen wurde: nativer E1A-Promoter/PB-TRE (oder PSA-TRE)/E1A-Kodierungssegment. In CN753 wurde der native E1A-Promoter deletiert, was das E1A-Kodierungssegment unter der einzigen Kontrolle eines prostataspezifischen Enhancers ergab.
CN753 wurde in etlichen Schritten erzeugt. Der native E1A-Promoter wurde deletiert (als ein 64 bp-Fragment) von CN124 (linkes Wildtypende von Ad5), um CN306 zu erzeugen. Das PSA-TRE-Fragment (vom Plasmid CN143, oben beschrieben) wurde dann stromaufwärts des promoterlosen E1A-Kodierungssegmentes von CN306 inseriert, um CN321 zu erzeugen. Ein PB-TRE-Fragment (oben beschrieben) wurde dann in die EagI-Stelle zwischen den E1B-Promoter und das E1B-Kodierungssegment inseriert, um CN326 zu erzeugen. CN326 hat folglich E1A unter der einzigen Kontrolle von PSA-TRE und E1B unter der Kontrolle von PB-TRE. CN326 wurde dann homolog mit BHG11 rekombiniert, welches die rechte Seite von Ad5 enthält, um CN753 zu erzeugen. Die Rekombination wurde unter einem ähnlichen Protokoll durchgeführt, wie in 1.F. umrissen.
5.B. Prostatazellspezifität zeigender Plaquetest von Adenovirus, in welchem sich mehrere adenovirale Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs befinden
Plaquetests wurden durchgeführt, um die Zellspezifität von Adenoviren zu bestimmen, in welchen sich mehrere adenovirale Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs befinden. Ein Plaquetest ist ein infektiöser Test, der quantifiziert, wie effizient ein bestimmtes Virus eine Infektion in einer Zelllinie erzeugt. Plaqubildungseffizienz wurde in den folgenden Zelltypen beurteilt: Prostatatumorzelllinien (LNCaP, PC-3), normale Brustzelllinie (HBL-100), Eierstocktumorzelllinie (OVCAR-3) und humane embryonale Nierenzellen (293).
Die getesteten Adenoviren waren:
CN702, wt, in welchem E1A und E1B unter der Kontrolle ihrer nativen Promotoren stehen.
CN706, in welchem ein PSA-TRE die E1A-Expression kontrolliert.
CN739, in welchem ein PB-TRE die E1A-Expression kontrolliert und ein PSA-TRE E1B kontrolliert.
CN753, in welchem ein PSA-TRE E1A kontrolliert und ein PB-TRE E1B kontrolliert.
Der Plaquetest wurde wie folgt durchgeführt: konfluente Zellmonoschichten wurden in 6-Well-Schalen 18 Stunden vor der Infektion ausgesät. Die Monoschichten wurden mit 10-fachen Reihenverdünnungen jedes Virus infiziert. Nach dem Infizieren von Monoschichten für 4 Stunden in serumfreien Medien (MEM), wurde das Medium entfernt und mit einer Lösung aus 0,75 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Gewebekulturmedien ersetzt. Plaques wurden zwei Wochen nach der Infektion bewertet. CN702 hat keine Modifikationen in seiner E1-Region und wird als eine Wildtypkontrolle verwendet.
Tabelle 2 Plaguetestdaten von PSA-TRE- und PB-TRE-verändertem Adenovirus Prozent Wildtypadenovirus (PFU/ml)
Tabelle 2 zeigt die durchschnittlichen Titer an Doppelproben für die getesteten Viren. Der Titer für ein bestimmtes Virus in sämtlichen Zelllinien wurde auf seinen Titer auf 293-Zellen normalisiert. Dies erlaubt es, dass Vergleiche zwischen Viren in einem bestimmten Zelltyp gemacht werden. Wenn die Titer auf einem Zelltyp erst einmal auf 293-Zellen normalisiert worden waren, wurden die normalisierten Zahlen der rekombinanten Viren mit CN702 verglichen. Ein Verhältnis von weniger als 100 legt nahe, dass das getestete Virus weniger effizient Plaques bildet als CN702. Umgekehrt legt ein Verhältnis von mehr als 100 nahe, dass das Virus effizienter Plaques bildet als CN702.
Aus diesem Plaquetest können etliche interessante Beobachtungen gemacht werden. Erstens zeigten Adenoviren, in welchen zwei adenovirale Replikationsgene durch ein PSA-TRE und ein PB-TRE kontrolliert worden sind, Replikation in Prostatatumorzellen, obwohl diese Replikation eine leicht niedrigere Effizienz als Wildtypadenovirus zeigt.
Zweitens, Adenoviren, in welchen zwei adenovirale Replikationsgene durch PSA-TRE und PB-TRE kontrolliert werden, zeigten eine unerwarteterweise höhere bevorzugte Replikation von Prostatatumorzellen. Das Virus CN706, in welchem ein PSA-TRE E1A kontrolliert, zeigte eine 29-fache Zunahme in der Replikationsspezifität. Wenn zwei prostataspezifische Promotoren, ein PSA-TRE und ein PB-TRE, Transkription von E1A und E1B kontrollierten, stieg die Spezifität 800-fach (für CN753) oder über 40.000-fach in OVCAR-3-Zellen an. Ähnlich zeigten die zwei prostataspezifische TREs umfassenden Adenoviren eine signifikant bessere Spezifität der Replikation in HBL-100-Zellen. Diese Zunahme in der Spezifität ist mehr als ein additiver Effekt des Inserierens eines zweiten prostataspezifischen TREs.
Ein in Tabelle 2 gezeigtes signifikantes Ergebnis war, dass sich virale Replikation von CN739 als spezifischer herausstellte, als jene von CN753. In diesen beiden Viren werden zwei Adenovirusreplikationsgene, E1A und E1B, durch prostataspezifische TREs kontrolliert, ein PB-TRE oder ein PSA-TRE. E1A ist vertretbarerweise wichtiger für die virale Replikation als E1B, da E1A vor irgendwelchen anderen viralen Genen, einschließlich E1B, exprimiert wird und für die E1B-Expression erforderlich ist. Flint (1982); Flint (1986); Grand (1987). CN753, in welchem ein PSA-TRE die Expression von E1A kontrolliert, zeigte eine 800-fache Zunahme in der zellspezifischen Replikation in OVCAR-3-Zellen. CN739, in welchem PB-TRE die Expression von E1A kontrolliert, zeigte eine mehr als 40.000-fache Zunahme. Dieses Ergebnis legt nahe, dass zumindest unter gewissen Bedingungen, PB-TRE eine viel höhere Fähigkeit hat, zellspezifische Replikation zu regulieren, als ein von dem prostataspezifischen Antigengen abgeleitetes TRE.
Drittens ergaben PSA-TRE- und PB-THE-Viren 10- bis 100-mal weniger Plaques in HBL-100- und OVCAR-3-Zellen als CN706, aber ihre Titer waren ähnlich wie CN706 in LNCaP-Zellen. Mit PSA-TRE und PB-TRE veränderte Viren waren signifikant abgeschwächt im Verhältnis zum Wildtypadenovirus und CN706 in Nicht-Prostatazellen, aber sie zeigten eine ähnliche Aktivität wie CN706 in LNCaPs. Während die prostataspezifische TREs enthaltenden Adenoviren eine Fähigkeit zeigten, in Prostatazellen zu replizieren, was um bis zu das 3-Fache abnahm, geschah dies gleichzeitig mit dem Erzielen einer stark gesteigerten Spezifität (bis zu 1.000-fach).
Folglich zeigte ein Adenovirus, in welchem ein adenovirales Gen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs war, eine starke Spezifität für Prostatazellen, aber Adenoviren, in welchen zwei adenovirale Gene unter der Kontrolle von zwei gesonderten prostataspezifischen Promotoren waren, zeigten sogar eine noch größere Spezifität im Plaquetest.
5.C. Test cytopathischer Wirkungen, der Prostatazellspezifität von Adenovirus, in welchem mehrere adenovirale Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs sind, zeigt
Der Test des cytopathischen Effekts (CPE) wurde ebenfalls verwendet, um die Zellspezifität der Replikation von Adenoviren zu bestimmen, in welchen mehrere adenovirale Gene unter die Kontrolle von prostataspezifischen TREs gestellt worden sind.
Die getesteten Adenoviren waren:
CN702, in welchem E1A und E1B unter der Kontrolle ihrer natürlichen Promotoren sind; und
CN739, in welchem PB-TRE E1A-Expression kontrolliert und PSA-TRE E1B kontrolliert.
CPE-Tests wurden wie folgt durchgeführt: Zellen wurden mit Virus mit steigenden Multiplizitäten der Infektion (MOI) infiziert und für cytopathischen Effekt überwacht. Tests wurden beendet, wenn vollständige Cytolyse der Monoschichten bei einer MOI von 0,01 mit Wildtypadenovirus beobachtet wurde. Es wurde eine primäre, nicht immortalisierte humane mikrovaskuläre Endothelzelllinie ausgewählt, um ihre Sensitivität für CN739- und Wildtypadenovirus-(CN702) Infektion in vitro zu testen. CN702 bewirkte eine vollständige Monoschichtcytolyse von hMVECs (primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen) bei so niedrigen MOIs wie 0,01 innerhalb von 10 Tagen. Im Gegensatz dazu zeigten mit CN739 infizierte hMVEC-Monoschichten keinen signifikanten cytopathischen Effekt zu denselben Zeitpunkten mit MOIs von 10, 1, 0, 0,1 und 0,01. Cytolyse von hMVECs, äquivalent zu jener, die mit Wildtypadenovirus gesehen worden ist, war nur bei MOIs, die zwischen 100- und 1000-mal so hoch waren (MOI > 10), ersichtlich.
Folglich ist CN739-vermittelte Cytolyse in primären normalen humanen Zellen signifikant abgeschwächt im Verhältnis zu Wildtypadenovirus.
5.D. Differenzielle virale Replikation
Um zu bestimmen, ob Virusreplikationspiegel mit den cytopathischen Wirkungen von CN739 in Prostatatumorzellen oder humanen normalen Zellen korrelieren, führten wir Virusreplikationstitration an PSA-produzierenden Prostatatumorzellen (LNCaP) und Nicht-Prostatazellen, primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hMVECs) durch. Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 70–90 % wachsen gelassen und wurden mit entweder Wildtypadenovirus (CN702) oder CN739 für 90 Minuten bei einer MOI von 10 infiziert. 55 Stunden nach der Infektion wurde das Virus aus den Zellen durch Gefrier/Auftau-Zyklen freigesetzt und der resultierende Überstand wurde auf 293-Zellen titriert. Die Menge an produziertem CN739 wurde gegen die Menge an in derselben Zelllinie während derselben Zeitdauer produziertem Wildtypvirus normalisiert. Die in 6 gezeigten Daten zeigen an, dass CN739-Titer 30 % der CN702-Titer in LNCaPs waren, aber auf weniger als 1/100 stel von jenem des Wildtypvirus in normalen (hMVEC-) Zellen reduziert waren. Dies legt nahe, dass CN739 in primären normalen humanen Zellen schlecht repliziert und nur leicht in Prostatakrebszellen abgeschwächt ist.
Kurz, ein Adenovirus, in welchem mehrere adenovirale Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs standen, zeigte Replikation in Prostatazellen und nur eine sehr schlechte Replikation in Nicht-Prostata-Endothelzellen.
5.E. Ein-Schritt-Wachstumskurve
Es wurde ein Ein-Schritt-Wachstumskurven-Test verwendet, um die Effizienz und Kinetiken der Replikation verschiedener Adenoviren in Prostata- und Nicht-Prostata-Endothelzellen zu bestimmen. Die verwendeten Viren waren CN702 (wt), CN706 (PSA-TRE kontrolliert die E1A-Expression) und CN739 (PB-TRE kontrolliert E1A und PSA-TRE kontrolliert E1B). Die verwendeten Zellen waren LNCaPs (Prostatatumorzellen) und hMVECs (primäre humane mikrovaskuläre Endothelzellen). Reproduzierte Monoschichten aus LNCaPs und hMVECs wurden mit einer MOI von 10 infiziert, um eine synchrone Infektion sämtlicher Zellen zu erzielen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden doppelte Kulturen geerntet. Die Anzahl an infektiösem Virus wurde durch Plaquetest an 293-Zellen bestimmt (7). CN739 und CN706 wuchsen in LNCaPs mit einer ähnlichen Effizienz. Unter identischen Bedingungen wuchs CN739 jedoch in hMVECs schlecht, wobei ein ungefähr 10.000-fach bis 80.000-fach weniger infektiöses Virus als CN706 bzw. Wildtypadenovirus produziert wurde.
Folglich zeigte die Ein-Schritt-Wachstumskurve, dass Viren, in welchen sich mehrere Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs befanden, in Prostatatumorzellen gut wuchsen, aber sehr schlecht in Nicht-Prostata-Endothelzellen wuchsen, was eine signifikant gesteigerte Spezifität zeigt.
5.F. Studien der therapeutischen Wirkung
Die Effizienz der Behandlung von Prostatatumoren in vivo wurde mit einem Adenovirus getestet, in welchem sich mehrere Gene unter der Kontrolle von zwei gesonderten prostataspezifischen TRES, ein PB-TRE und ein PSA-TRE (CN739), befanden. Um die therapeutische Wirksamkeit von CN739 in vivo zu untersuchen, wurden LNCaP-(Prostatatumor-) Xenotransplantate in athymischen Mäusen wachsen gelassen. Die Tumorzellen wurden subkutan in jede Flanke jeder Maus injiziert und nach Etablieren von tastbaren Tumoren (mittleres Tumorvolumen 300 mm³) wurden die Tumoren direkt mit CsCI-gereinigtem CN739 mit 2,5 × 10⁸ Partikel pro mm³ injiziert, oder mit PBS, enthaltend 10 % Glycerol (Vehikel) als eine Kontrolle. Das Tumorwachstum wurde dann über sechs Wochen verfolgt, zu welchem Zeitpunkt das mittlere Tumorvolumen in jeder Gruppe bestimmt wurde, und Serumproben wurden für die PSA-Analyse am Tage 0 und danach wöchentlich gesammelt.
Die in 9 abgebildeten Daten zeigen, dass die Behandlung von LNCaP-Tumoren mit CN739 in einer 80 %igen Reduktion im durchschnittlichen Tumorvolumen reduzierte, wohingegen das durchschnittliche Tumorvolumen in der vehikelbehandelten Gruppe I am Tag 28 of 400 % des Ausgangsvolumens angestiegen war. Vier von sieben (57 %) Tieren in der CN739 behandelten Gruppe II waren frei von tastbaren Tumoren am Tag 42. Diese Studie zeigt, dass eine festgelegte einzelne Dosis eines Adenovirus, in welchem sich mehrere Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs befinden (CN739), pro Tumor gegen LNCaP-Xenotransplantate in vivo wirksam ist.
5.G. Wirkungen auf Serum-PSA-Spiegel
Der Serum-PSA-Spiegel ist ein weit verwendeter Marker für die Diagnose und Handhabung von Prostatacarcinom. LNCaP-Zellen exprimieren und sezernieren hohe Spiegel an PSA in Kulturmedien und in die Zirkulation. Es wurde ein Experiment gestaltet, um die Wirkungen der Behandlung mit CN739 (ein Adenovirus, in welchem mehrere Gene unter der Kontrolle von prostataspezifischen TREs, PB-TRE und PSA-TRE, waren) auf Serum-PSA-Konzentration in Mäusen mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten zu untersuchen.
Nach der Behandlung stieg mit dem Tag 28 der durchschnittliche Serum-PSA-Spiegel in der Kontrollgruppe I (nur Vehikel) auf annähernd 800 % des Ausgangswertes, wohingegen der durchschnittliche PSA-Spiegel in der Gruppe II (CN706-Behandlung) und Gruppe III (CN739-Behandlung) im Wesentlichen konstant bis zum Tag 21 blieb und auf 10 % des Ausgangswertes mit dem Tag 35 abnahm (8). Es gab einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,001; T-Test) zwischen Gruppe I und Gruppe II am Tag 14 und danach.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die CN739-Behandlung in dem LNCaP-Xenotransplantatmodell wirksam ist, wenn das Ergebnis entweder durch Reduktion im Tumorwachstum oder Serum-PSA-Konzentration gemessen wird. Mit den In-vitro-Daten zusammengenommen, legt es nahe, dass Adenoviren mit einem einzelnen adenoviralen Gen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TRE wie PB-TRE in der Lage sind, prostatazellspezifische virale Replikation zu vermitteln. Das Stellen eines zweiten adenoviralen Gens unter die Kontrolle eines gesonderten prostataspezifischen TRE steigert die Zellspezifität weiter.
Beispiel 6
Charakterisierung eines E3-deletierten Adenovirus, CN751, das das Adenovirus Death Protein-Gen enthält
Ein Adenovirus, umfassend ein Adenovirus Death Protein, CN751, wurde konstruiert, um zu testen, ob solch ein Konstrukt für Cytotoxizität wirksamer sein könnte. Das Adenovirus Death Protein (ADP), ein 11,6 kDa großes, Asn-glykosyliertes, integriertes Membranpeptid exprimiert in hohen Spiegeln spät bei der Infektion, migriert zu der Kernmembran von infizierten Zellen und beeinträchtigt effizient die Lyse des Wirts. Die E3-Region von Adenovirus 5 (Ad5) exprimiert das adp-Gen.
Konstruktion von CN751
CN751 wurde in zwei Teilen konstruiert. Erstens wurde ein E3-deletiertes Plattformplasmid, das Ad5-Sequenz 3' von der BamHI-Stelle bei 21562 bp enthält, erzeugt. Das Ad2-adp wurde in den Rest der E3-Region dieses Plasmids eingebaut, um CN252 zu ergeben (dieses Klonieren wurde kürzlich beschrieben). Um den zweiten Teil zu konstruieren, wurde die für CN751 notwendige 5' Ad5-Sequenz durch Verdauen von gereinigter CN702-DNA mit EcoRI und Isolieren des linken Fragmentes durch Gelextraktion erhalten. Nach dem Verdauen von CN252 mit EcoRI wurden das linke Fragment von CN702 und CN252 ligiert. 293-Zellen wurden mit dieser Ligationsmischung durch Lipofektionstransfektion transfiziert und bei 37 °C inkubiert. 10 Tage später wurden die Zellen geerntet,. dreimal eingefroren und wieder aufgetaut und der Überstand wurde auf 293-Monoschichten ausplattiert. Einzelne Plaques wurden gepickt und verwendet, um Monoschichten aus 293-Zellen zu infizieren, um genügend Virus für das Testen wachsen zu lassen. Nach etlichen Tagen wurden Plattenlysate unter Verwendung eines auf Polymerasekettenreaktion (PCR) basierten Tests gescreent, um Kandidatenviren zu detektieren. Einer der Plaques, die positiv bewertet wurden, wurde CN751 genannt.
Strukturelle Charakterisierung von CN751
Die Struktur von CN751 wurde durch zwei Verfahren bestätigt. Erstens wurden die Primer 37.124.1 (5' gccttaattaaaagcaaacctcacctccg Ad2 28287 bp) und 37.124.4 (5' ggcttaattaactgtgaaaggtgggctgc Ad2 29872 bp) verwendet, um Kandidatenviren durch PCR zu screenen, um die Anwesenheit der adp-Kassette zu detektieren. CN751 erzeugte ein Extensionsfragment in Übereinstimmung mit dem erwarteten Produkt (1065 bp). Zweitens wurde CN751 durch Southern Blot analysiert. Virale DNA wurde gereinigt, mit PacI, SacI und AccI/XhoI verdaut und mit einer Sequenz, die zu der ADP-Kodierungsregion homolog war, sondiert. Die Struktur von CN751 stimmte mit dem erwarteten Muster überein.
In-Vitro-Charakterisierung von CN751
Es wurden zwei Experimente durchgeführt, um die Cytotoxizität und Virusausbeute von CN752 zu untersuchen. In der ersten Studie wurde die Cytotoxizität von CN751 in LNCaP-Zellen durch Messen der Akkumulation eines Enzyms des Cytosols, Lactatdehydrogenase (LDH), in dem Überstand über etliche Tage beurteilt. Der Spiegel an extrazellulärem LDH korreliert mit dem Ausmaß an Zelllyse. Gesunde Zellen setzen sehr wenig, falls überhaupt Enzym frei, wohingegen tote Zellen große Mengen freisetzen. LDH wurde als ein Marker ausgewählt, da es ein stabiles Protein ist, das durch ein simples Protokoll leicht detektiert werden kann. Die Fähigkeit von CN751, Zelltod zu bewirken, wurde mit jener von CN702 verglichen, ein Vektor, dem das ADP-Gen fehlt, und Rec700, ein Vektor, der das ADP-Gen enthält.
Monoschichten aus LNCaP-Zellen wurden mit einer MOI von 1 mit entweder CN702, Rec700 (adp+-Kontrolle) oder CN751 infiziert und dann in 96-Well-Schalen ausgesät. Proben wurden einmal am Tag von einem Tag nach der Infektion bis fünf Tage nach der Infektion geerntet und unter Verwendung des Cytotox-96-Kits von Promega bewertet. Dieser Test verwendet eine gekoppelte enzymatische Reaktion, welches ein Tetrazoliumsalz zu einem roten Formazanprodukt umwandelt, das in einem Plattenlesegerät bei 490 nm bestimmt werden kann.
Da die Extinktion einer Probe mit dem aus infizierten Zellen freigesetzten LDH korrespondiert, beschreibt eine Darstellung, wie sich die Extinktion einer Probe mit der Zeit ändert, wie effizient die untersuchten Viren Zelllyse induzieren (10). Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt von sechzehn gesonderten Proben dar. Die Ergebnisse legen nahe, dass CN751 Zellen effizienter abtötet als die adp–Kontrolle (CN702) und ähnlich wie die adp+-Kontrolle, Rec.700. Die Konzentration von LDH in dem Überstand steigt schnell innerhalb von zwei Tagen an und erreicht ein Maximum bei vier Tagen in mit CN751 infizierten Vertiefungen. Im Gegensatz dazu beginnt die LDH-Konzentration in dem Überstand von mit CN702 infizierten Zellen langsam nach zwei Tagen zu steigen und dauert bis zum Abschluss des Experimentes an. Ähnlich ist die aus mit CN751 infizierten Zellen freigesetzte LDH-Menge nach drei Tagen das Doppelte, wie jene, welche aus mit CN702 infizierten Zellen freigesetzt worden ist. Zusammenfassend zeigen die Virusausbeutedaten, dass adenovirale Vektoren mit dem ADP-Gen mehr Virus freisetzen.
Es ist nicht nur wichtig für Ad-Vektoren, Zellen effizient abzutöten, sie müssen auch in der Lage sein, Nachfahren, welche andere Krebszellen infizieren können, auszuwerfen. Virale Vektoren, die große Virusmengen auswerfen können, könnten bessere Therapeutika sein als jene, die nur sehr geringe Mengen auswerfen. Es wurde ein Virusausbeutetest unternommen, um zu beurteilen, ob CN751 die effiziente Freisetzung seiner Nachfahren aus der infizierten Zelle induzieren kann. A549-Zellen wurden mit einer MOI von 5 infiziert. Überstand wurde zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion geerntet und an 293-Zellen titriert, um die Virusausbeute zu bestimmen (11). Die Daten legen nahe, dass mit CN751 infizierte Zellen Viren effizienter auswerfen als jene, die mit CN702 infiziert worden sind. 48 Stunden nach der Infektion setzten CN751 infizierte Zellen zehnmal mehr Virus frei als mit CN702 infizierte. Rund 70 Stunden nach der Infektion setzten CN751 infizierte Zellen vierzigmal mehr Virus frei. Die Daten zeigen, dass adenovirale Vektoren mit dem ADP-Gen Zellen effizienter abtöten als adenovirale Vektoren, denen das ADP-Gen fehlt.
In-vivo-Charakterisierung von CN751
LNCaP-Nacktmausxenotransplantate wurden mit einer einzelnen intratumoralen Dosis (1 × 10⁴ Partikel/mm³ Tumor) von entweder CN751, ein Vektor, der das ADP-Gen enthält, oder CN702, ein Vektor, dem das Gen fehlt, immunisiert. Eine dritte Tumorgruppe wurde mit Puffer alleine behandelt. Die Tumoren wurden wöchentlich für sechs Wochen überwacht und ihr relatives Volumen wurde gegen die Zeit graphisch aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Fehlerbalken stellen den Standarfehler für jede Probengruppe dar. Das durchschnittliche Ausgangstumorvolumen für mit CN751 behandelte Tiere (n = 14) war 320 mm³ für mit CN702 behandelte (n = 14) und 343 mm3 für mit Puffer behandelte (n = 8). Die Daten legen nahe, dass CN751 Tumorzellen effektiver abtötet als CN702. Im Durchschnitt behielten mit CN751 immunisierte Tumoren dieselbe Größe während dem Verlauf der Experimente, während neun von vierzehn Tumoren (64 %) zurückgingen. Jene mit CN702 behandelten verdoppelten sich in der Größe. Pufferbehandelte Tumoren wuchsen auf annährend das Fünffache ihres Ausgangsvolumens. Der Students T-Test zeigt, dass der Unterschied in der Tumorgröße zwischen CN701- und CN702-behandelten Tumoren vom Tag 7 (p = 0,016) an bis zum Ende des Experimentes (p = 0,003) statistisch signifikant war.
Beispiel 7
Ein PB-TRE zeit eine höhere Zellspezifität der Replikation als ein humanes glanduläres Kallikrein-1-TRE
6. A. Bei diesem Beispiel verwendete adenovirale Vektoren schließen ein:

CN702 (wt);
CN706, in welchem ein PSA-TRE E1A-Expression kontrolliert;
CN753, in welchem ein PSA-TRE E1A-Expression kontrolliert und ein PB-TRE E1B kontrolliert; und
CN755, in welchem ein PSA-TRE E1A-Expression kontrolliert und ein hKLK2-TRE (aus dem humanen glandulären Kallikrein-1-Gen) E1B-Expression kontrolliert.

Plaquetests wurden durchgeführt, um die Zellspezifität dieser Adenoviren zu bestimmen. Plaquebildungseffizienzen wurden an den folgenden Zelltypen beurteilt: humane embryonale Nierenzelllinie (293), Prostatatumorzelllinie (LNCaP), normale Brustzelllinie (HBL-100) und Eierstocktumorzelllinie (OVCAR-3). Die Plaquetests wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Tabelle 3 Plaquetestdaten von mit PSA-TRE, PB-TRE und hKLK2 verändertem Prozent vom Wildtypadenovirus (PFU/ml) Adenovirus.
Tabelle 3 zeigt die Durchschnittstiter von Proben für die getesteten Viren. Der Titer für ein bestimmtes Virus in sämtlichen Zelllinien wurde auf seinen Titer an 293-Zellen normalisiert. Dies erlaubt es, dass Vergleiche zwischen Viren in einem bestimmten Zelltyp gemacht werden. Wenn die Titer von einem Zelltyp erst einmal auf 293-Zellen normalisiert worden sind, wurden die normalisierten Zahlen der rekombinanten Vektoren mit CN702 verglichen. Ein Verhältnis von weniger als 100 legt nahe, dass das getestete Virus weniger effizient Plaques bildet als CN702. Umgekehrt legt ein Verhältnis von mehr als 100 nahe, dass das Virus effizienter Plaques bildet als CN702.
Es können etliche interessante Beobachtungen aus diesem Plaquetest gemacht werden. Erstens wiederholt dieser Test die oben beschriebene unerwartete Feststellung, dass ein Adenovirus, in welchem sich mehr als ein Adenovirusgen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs befindet, eine viel mehr als additive Zellspezifität zeigt, als ein Adenovirus, in welchem sich nur ein Adenovirusgen unter der Kontrolle eines prostataspezifischen TREs befindet.
Zweitens zeigt CN753 eine signifikant höhere Zellspezifität als CN755. In beiden, CN753 und CN755, kontrolliert ein PSA-TRE die Expression von E1A. In CN753 kontrolliert jedoch ein PB-TRE die Expression von E1B während in CN755 ein hKLK2-TRE E1B kontrolliert. CN753 zeigt eine fünfmal höhere Zellspezifität in Eierstockzellen und eine achtmal höhere Spezifität in Brustzellen. Folglich scheint es, dass, während sowohl von einem PB-TRE als auch einem hKLK2-TRE gedacht wird, dass es für Prostatazellen spezifisch ist, ein PB-TRE zumindest unter gewissen Bedingungen eine signifikant höhere Spezifität für Prostatazellen hat als ein hKLK2-TRE.
Beispiel 8
Zubereitung von kovalent pegyliertem Adenovirus
Es wurde eine Reihe an Experimenten durchgeführt, um die Oberflächencapside von Adenovirus durch Komplexieren von Adenovirus mit PEG zu verändern. Gegenstand der PEG-Komplexierungsmaskierung der Adenovirusoberfläche ist der Folgende: 1) Adenovirus neutralisierende Antikörper oder Opsinine, die sich im Kreislauf befinden, und 2) Erhöhen der systemischen Zirkulationszeit von Adenoviruspartikeln durch Reduktion von unspezifischen Clearance-Mechanismen im Körper (d. h. Makrophagen, etc.).
Oberflächencapside von Wildtypadenovirus CN706 wurden durch kovalentes Anheften von PEG an Hexon und Faserproteinen unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimidylsuccinamid (NHS) modifiziert. Die PEGs (Shearwater Polymers, Inc.) hatten ein nominales Molekulargewicht von 5000 Da. Das aktivierte PEG (annähernd 2 mM) wurde mit 5 × 10⁹ Partikeln/ml Adenovirus in einem Tris-HCl-Puffer zur Reaktion gebracht (das ungefähre molare Verhältnis von Viruspartikel zu PEG war 1: 4 × 10⁶). Verschiedene Kombinationen von pH-Wert, Temperatur und Reaktionszeit wurden verwendet. Nach der Reaktion wurden nicht umgesetztes aktiviertes PEG, nicht umgesetztes Adenovirus und pegyliertes Adenovirus durch anionische Ionenaustauschchromatographie auf Q Sepharose XL (Pharmacia), die auf einem 0 bis 1,5 M NaCl-Gradienten in 50 mM Tris, pH 8,0 laufen gelassen wurde, aufgetrennt. Der Gradient wurde über 10 Säulenvolumina laufen gelassen.
Charakterisierung von PEG-CN706
Pegylierung von CN706 wurde durch SDS-Page verifiziert. 14 bildet die Pegylierung von CN706 und die Mobilitätsverschiebung von pegylierten Proteinen ab. Die Spuren 1 und 2 sind nicht pegyliertes CN706 (Kontrolle), die Spuren 3 bis 6 sind pegyliertes CN706 unter etlichen pH- und Temperaturbedingungen. Die Spuren 3 bis 6 zeigen das Auftreten einer zweiten Bande oberhalb der Hexonproteine von CN706, am wahrscheinlichsten pegyliertes Hexon, und den Verlust der Faserproteinbande. Da keine zusätzlichen Banden mit dem Virus im Zusammenhang standen, mit der Ausnahme von jener, die dem PEG-Hexonprotein entspricht, wird von dem pegylierten Faserprotein angenommen, dass es sich unter einem der unpegylierten Proteine auf dem SDS-Gel befindet.
15 ist ein Ionenaustauschchromatogramm, das die Änderung in den Oberflächeneigenschaften von CN706 zeigt. Pegylierung von CN706 resultiert in seiner früheren Elution von dem Q Sepharose-Harz, das verwendet worden ist, um das Virus einzufangen. Dieses Resultat liegt am wahrscheinlichsten daran, dass PEG das Virus als neutraler geladen erscheinen lässt und folglich sein Bindungspotential auf der Ionenaustauschmatrix reduziert. Es wird eine Verbreiterung des Viruschromatogramms erwartet, da die Pegylierung von CN706 zu unterschiedlichen Prozentsätzen geschieht.
Die Infektiösität von pegyliertem CN706 wurde in einem In-vitro-Plaquetest auf 293-Zellen beurteilt. Tabelle 4 bildet eine 5- bis 10-fache Reduktion in der Plaquebildungseffizienz von PEG-CN706 im Vergleich mit CN706 ab. Dies liegt am wahrscheinlichsten daran, dass Pegylierung die Viruszellen maskiert, die Erkennung reduziert und an Endocytose der viralen Partikel.
Tabelle 4: Vergleich der Plaquebildungseffizienz von CN706 und PEG-CN706
Obwohl die vorangegangene Erfindung in einem gewissen Detail im Wege der Erläuterung und des Beispiels für Zwecke der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, wird es für Fachleute ersichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen in die Praxis umgesetzt werden können. Deshalb sollten die Beschreibung und die Beispiele nicht als den Schutzumfang der Erfindung beschränkend aufgefasst werden, welcher durch die angehängten Ansprüche dargestellt ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Replikationskompetenter Advenovirusvektor, umfassend ein Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle eines Probasin-Transkriptionsregulationselements (PB-TRE), worin dieses PB-TRE einen Promoter und/oder Enhancer aus einem Probasingen umfasst und in der Lage ist, Genexpression in Zellen, die den Androgenrezeptor exprimiren, zu vermitteln, und worin der Andenovirusvektor einer Zielzelle selektive Toxizität verleiht.
Adenovirusvektor nach Anspruch 1, worin das Adenovirusgen für die Virusreplikation essentiell ist.
Adenovirusvektor nach Anspruch 2, worin das Adenovirusgen ein frühes Gen oder ein spätes Gen ist.
Adenovirusvektor nach Anspruch 1, worin das Adenovirusgen ausgewählt wird aus E1A, E1B oder dem Adenovirus-Death-Protein-Gen (Adenovirustodesprotein ADP).
Adenovirusvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche, worin das PB-TRE einen Enhancer aus einem Probasingen, einen Promoter aus einem Probasingen oder sowohl einen Promoter aus einem Probasingen als auch einen Enhancer aus einem Probasingen umfasst.
Adenovirusvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche, worin das PB-TRE wenigstens ein androgenresponsives Element (ARE) umfasst oder die androgenresponsiven Elemente 1 und 2 (ARE-1 und ARE-2) eines Probasingens umfasst.
Adenovirusvektor nach Anspruch 1, worin das PB-TRE die Nukleotide von ungefähr 141 bis 454, ungefähr 191 bis 204 oder ungefähr 286 bis 310 der Sequenz-ID-Nr. 1 umfasst.
Adenovirusvektor nach Anspruch 1, worin das PB-TRE die Sequenz der Sequenz-ID-Nr. 1 umfasst.
Adenovirusvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche, weiterhin umfassend wenigstens ein zusätzliches Adenovirusgen unter der Transkriptionkontrolle von wenigstens einem zusätzlichen prostataspezifschen Transkriptionsregulationselement.
Adenovirusvektor nach Anspruch 9, worin das sich unter der Kontrolle eines PB-TRE befindliche Adenovirusgen und das wenigstens eine zusätzliche, sich unter der Transkriptionskontrolle von wenigstens einem zusätzlichen prostataspezifischen Transkriptionsregulationselement befindliche Adenovirusgen, notwendig sind für die Virusreplikation.
Adenovirusvektor nach Anspruch 9 oder 10, worin das wenigstens eine zusätzliche Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle von wenigstens einem zusätzlichen prostataspezifischen Transkriptionsregulationselement ein frühes Gen oder ein spätes Gen ist.
Adenovirusvektor nach Anspruch 9 oder 10, worin das wenigstens eine zusätzliche Adenovirusgen unter der Transkriptionskontrolle von wenigstens einem zusätzlichen prostataspezifischen Transkriptionsregulationselement ausgewählt wird aus E1A, E1B oder dem Andovirus-Death-Protein-Gen (ADP).
Adenovirusvektor nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, worin das wenigstens eine zusätzliche prostataspezifische Transkriptionsregulationselement ein PB-TRE oder ein Transkriptionsregulationselement für das prostataspezifische Antigen (PSA) umfasst.
Zusammensetzung, umfassend einen Adenovirusvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, weiterhin umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
Adenovirusvektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, weiterhin umfassend ein heterologes Gen unter der Transkriptionskontrolle eines Probasin-Transkriptionsregulationselementes (PB-TRE).
Vektor nach Anspruch 16, worin das heterologe Gen ein Reportergen ist oder für das Zellüberleben konditionell erforderlich ist.
Wirtszelle, die mit einem Adenovirusvektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, 16 oder 17 transformiert worden ist.
Verfahren zum Detektieren von Zellen, welche einem PB-TRE in einer biologischen Probe zu funktionieren ermöglichen, umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren einer biologischen Probe mit einem Adenovirusvektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, 16 oder 17 unter Bedingungen, die für die PB-TRE-vermittelte Genexpression in Zellen, welche einem PB-TRE ermöglichen, zu funktionieren, geeignet sind; Bestimmen, ob PB-TRE Genexpression in der biologischen Probe vermittelt, worin die PB-TRE-vermittelte Genexpression für die Anwesenheit von Zellen, welche einem PB-TRE ermöglichen, zu funktionieren, anzeigend ist.
Verfahren nach Anspruch 19, in welchem Zellen, welche einem PB-TRE ermöglichen, zu funktionieren, Androgenrezeptor exprimieren.
Verfahren zur Vermehrung eines Adenovirus, der für Zellen spezifisch ist, welche einem PB-TRE ermöglichen, zu funktionieren, wobei dieses Verfahren umfasst: das Kombinieren eines Adenovirusvektors nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, 16 oder 17 mit Zellen, welche einem PB-TRE ermöglichen, zu funktionieren, worin dieser Adenovirusvektor vermehrt wird.
Verwendung eines Adenovirusvektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, 16 oder 17 für die Herstellung eines Medikamentes, um Tumorzellwachstum zu unterdrücken oder um Prostatakrebs zu behandeln.
Adenovirusvektorzusammensetzung, umfassend einen Adenovirusvektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, 16 oder 17, worin der Adenovirusvektor mit einem Maskierungsmittel komplexiert ist.
Adenovirusvektorzusammensetzung nach Anspruch 23, worin das Maskierungsmittel ein Polyethylenglykol (PEG) ist, das kovalent oder nicht kovalent an den Adenovirusvektor angeheftet ist.
Adenovirusvektorzusammensetzung nach Anspruch 24, worin das PEG ein Molekulargewicht von zwischen ungefähr 2500 bis 30000, ungefähr 3000 bis 20000 oder 5000 bis ungefähr 10000 hat.
Adenovirusvektorzusammensetzung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, worin das PEG kovalent angeheftet ist unter Verwendung eines N-Hydroxysuccinimidyl-(NHS) aktiven Esters, wie Succinimidylsuccinat, Succinimidylsuccinamid und Succinimidylpropionat.