CN1029784C - 链结合的方法 - Google Patents

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Abstract

一种结合人类松弛素A链及B链以生产人类松弛素或新颖的人类松弛素类似物的方法，包括将还原态的人类松弛素A链及还原态人类松弛素B链在pH值自大约7.0至大约12的水介质中，在室温及使松弛素B链温和变性的条件下，结合以形成人类松弛素或新颖的人类松弛素类似物。

Description

本发明提供一种将人类松弛素的A链和B链或者人类松弛素的A链类似物和B链类似物进行结合，以有效的产率产生具有生物活性的人类松弛素或人类松弛素类似物产物的方法。具体地说，本发明包括在PH值大于7.0，并且在使人类松弛素B链温和变性的条件下，将还原的人类松弛素A链及B链或它们的类似物发生结合的方法。通过将混和物维持在自15℃至30℃左右的温度下，并在反应过程中逐渐地暴露于空气氧中，为此该条件提供了一个形成具有生物学活性的人类松弛素或其类似物的环境。本发明也提供具有生物学活性的人类松弛素的类似物。本发明还进一步提供一种以人类松弛素或其类似物作为唯一活性剂用以引产的方法。
人类松弛素是一种卵巢肽可在分娩前使产道发生变化，从而促进分娩出生过程。Hisaw，F.L.，Pros.Soc.Exp.Biol.Med.23，661-663（1926）;Schwabe，C.etal.Biochem.Biophys.Res.Comm.75，503-570（1977）;James，R.etal;Nature267，544-546（1977）。松弛素在怀孕期女性激素中占支配地位，但在非孕期女性及男性中也检测出它的存在。Bryant-Greenwood，GD.，Endocrine    Reviews3，62-90（1982）and    Weiss，G.，Ann.Rev.Physiol.46，43-52（1984）。
取自于猪、鼠、虎鲨（Tiger    shark）角鲨及人类的松弛素的氨基酸顺序已经被建立。该激素由二条肽链组成，称为A链及B链，并以双硫键相连接，A链上有一链内双硫键因而以此方式与胰岛素A链相似。然而，松弛素与其它肽类激素，包括胰岛素在内的惊奇而又 重要的区别在于它的令人注意的由于种源的不同造成化学结构的变异。例如，猪、鼠及人类松弛素有50%以上的氨基酸位置是不同的。这些区别解释了不同种的松弛素之间低的免疫交叉反应性和许多其它观察到的专一性生物活性上的区别。
DNA重组技术的应用已经使得人们能对编码人类松弛素的基因进行分离并确定其特性。Hudson，P.et    al.，Nature301，628-631（1984）and    Hudson，P.et    al.，The    EMBO    Journal    3，2333-2339（1984）.对c    DNA及基因组克隆核苷酸顺序的分析揭示了人类松弛素的结构组织包括一个信号肽，具有25个残基，随后有一个大约32至33个氨基酸的B链、一个大约有105个氨基酸的C肽及一个24氨基酸的A链。对于人类松弛素，有一个基因内区扰乱了C肽的编码区域。比胰岛素C肽长得多的松弛素C肽的生理作用及负责从A链及B链端除去C肽的酶的性质尚未弄清楚。
对于人类的松弛素而言，有两个独立的基因顺序已经被确定了。Id.在怀孕期这些基因中仅有一个基因（H2）在卵巢中获得表达，然而究竟其另一个的基因在其它组织位点被表达呢，或是它代表了一个假基因呢，这一点还不清楚。人类的这两个松弛素基因在核苷酸及氨基酸上显示了互相间的相当多的同系性，尤其是对于B肽及C肽而言。然而，也存在着一些值得注意的顺序上的歧异，特别是在A链及B链的末端氨基区域。参见图1。从H2松弛素在卵巢中被合成及得到表达的这一事实，可推测该顺序参与了孕期生理变化。最近的论文中，报导了约翰斯通等（Johnston    et    al.，）曾对合成的人类松弛素（H2）及某些人类松弛素类似物的生物学活性进行了测定。Johnston，P.D.et    al.，In    Peptides：Structure    and    Function，Proc.Ninth    American    Peptide    Symposium，Deber，C.M.，Hruby，V.I.and    Kopple，F.D.（eds.） （Pierce    Chem.Co.，1985）他们确定了对于生物学活性所必需的松弛素核心及可替代甲硫氨酸而不影响其生物活性的某些氨基酸。Id。
表1对已知的不同种的松弛素氨基酸的顺序作了比较。除了六个半胱氨酸残基及位于侧翼的甘氨酸残基外，仅有B-链上的位于7位上的异亮氨酸、12位及16位上的精氨酸及32位上的亮氨酸被保留。半胱氨酸残基无疑对维持整个双硫键构型是必需的。Blundell，T.et    al.In：Bigazzi，M.，Greenwood，F.C.，Gaspari，F.（eds.）Biology    of    Relaxin    and    its    Role    in    the    Human，（Excerpta    Medica，Amsterdam，1983）pp.14-21.值得注意的是，在松弛素分子中，即含有松弛素蛋白质的活性部位的A链及B链中的绝大多数位置上的氨基酸是随种源而变化的。这一点事实上与所有的包括胰岛素在内的其它肽激素族形成了鲜明的差别。松弛素结构的另一特点为B链的氨基及羧基末端区域长度的变化及A链具有一个较短的氨基末端。
松弛素的化学合成特别困难，其原因极大地是因被分离的B链的不寻常的溶解性及其结构特点。Tregear，G.W.et    al.，In：Bigazzi，M.，Greenwood，F.C.and    Gaspari，F.（eds.）Biology    of    Relaxin    and    its    Role    in    the    Human，（Excerpta    Medica，Amsterdam，1983），pp.42-55。
如上所述，人类松弛素，事实上是哺乳动物松弛素普遍地与胰岛素有某些结构上的相似点。胰岛素与松弛素都在两条链的链间及链内具有双硫键。James，R.et    al.Nature267;544（1977）and    Schwabe，C.and    Mc    Donald，J.R.Science    197，914（1977）.因而，足以推断曾成功地运用于胰岛素的合成方法也同样可用于松弛素。Busse，W.D.and    Carpenter，F.H.， Biochemistry    15    1649（1976），Katsoyannis，P.G.et    al.，Biochemistry6，2656（1967）andKung，Y.T.et    al.，Scientia    Sinica    15    544（1966），采格·G等人及格林沃特·F.C.，爱勒斯维亚等人企图利用半胱氨酸巯基的选择性保护单独链方法合成松弛素。Tregear，G.et    al.In：Relaxin，G.D.Bryant-Greenwood，Niall，H.D.and    Greenwood，F.C.（eds.）Elsevier，New    York，1981，他们发现通过胰岛素法制备的合成肽检测出与松弛素相似的生物反应活力，但专一性活力及结合产率非常低。在151是同样的（Id    at    151）。猪的松弛素的结合产率低的一个原因为全长的猪的松弛素B-链在PH10.5溶液中的不溶性造成的。采格及休泊等人（Tregear    et    al.，Supra.）在两个方面对现有的胰岛素的化合方法作了改进：用丙酮沉淀混和的猪巢松弛素链以除去还原剂;以及在氧化步骤中加入0.5MNa    Cl。结果提高了猪松弛素的产率。同时请参见欧洲专利申请第83.304662.6号及欧洲专利申请第83307553.4号。
张斯等人（chance    et    al.，）在1983年12月20日发行的美国专利第4，421，685号揭示了用硫醇还原剂在水介质中于控制的PH及温度下，在同一个单一步骤中完成还原和氧化反应，使S-磺化形式的胰岛素A和胰岛素B链结合以生产胰岛素或其类似物的方法。这一用于改进上述胰岛素合成的方法被发现不能运用于人类松弛素的合成。
人们已经发现在特定的反应条件下，并对条件进行控制，可将人类松弛素还原链结合起来以产生达到有用水平的人类松弛素或其类似物。因而，本发明的一个目的是提供一种人类松弛素的A链及B链结合的方法，至于这些链的来源则与本发明无关，例如，可以用化学合成或通过重组DNA技术，以可被利用的得率产生具生物活性的人类松弛素。
本发明的另一方面是生产具有生物学活性的人类松弛素的类似物。
本发明的再一方面是以人类松弛素或其类似物来作为引产的用途。
本发明是针对使人类松弛素A链或其类似物与人类松弛素B链或其类似物的结合，以生产具有生物学活性的人类松弛素或其类似物的方法。具体地说，该方法包括在PH值大于7.0而使人类松弛素B链在温和变性的条件下，将还原的人类松弛素A链或其类似物与人类松弛素B链或其类似物发生结合反应，并在反应的过程中使之逐渐地暴露于空气氧中的方法。
附图简要说明
图1显示了人类松弛素H1及H2与人类胰岛素及猪（P）及鼠（R）松弛素之间缺乏同系性。数码系统是以H2松弛素为基准的。松弛素的双硫键为：A10-A15，A11-B11及A24-B23。
图2（a）及图2（b）分别显示H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG1
与H2（B33 A24）的体外链结合反应的高压液相色谱法时程曲线（HPLC time course）。图中对显于人类松弛素类似物或人类松弛素及一个可能的重要分子内A链氧化中间物的形成的体外结合反应时程进行了描绘。描绘了基因2A及B链肽转化至H2人类松弛素类似物及H2人类松弛素。层析采用一个Synchropak R P-C4（4.6×250mm，300
Figure 871044471_IMG2
）。在0.05%（TFA）三氟乙酸、H20缓冲液中的乙腈液线性梯度（在500分钟内梯度浓度15→60%）流速为1ml/min。
图3显示结合了人类基因-2松弛素H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG4
的链与天然人类松弛素结合的链生物活性（MPS）。
图4显示了将各种不同剂量的人类松弛素的类似物，H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG5
及H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG6
用于灵长目动物的改进的毕晓普氏计分法计分（Bishop score）。
此处所称之“人类松弛素”或“人类松弛素类似物”是指可改变产道以加快生育过程的一类功能蛋白。据了解改变产道包括诸如子宫颈的成熟、孕期子宫之子宫内膜的变厚及增进该区域的血管形成作用，以及对胶原蛋白合成的影响等生理作用。人类松弛素同样可存在于女性乳房中并且可能与乳汁生成有关。人类松弛素同样被发现也存在于人类之精液中并可能促进人类精子的泳动能力。人类松弛素对子宫颈产生的作用可以增加精子穿过子宫颈的能力。人类松弛素可以提高皮肤弹性，对结缔组织产生影响。
人类松弛素类似物除了功能上的定义外，在结构上是指一类具有包括人类松弛素A链及B链的基本结构的蛋白质。人类松弛素之类似物通过与人类松弛素A链和/或B链上的一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、增加或修饰而与天然产生之人类松弛素不同，但须补充说明的是人类松弛素类似物却保留了类似松弛素的生物学活性。这些人类松弛素之类似物的例子如下，但不尽于此：一条全长的A链及一条羧基末端缩短的B链;H1（B2-27 A24）
Figure 871044471_IMG7
;H2（B2-25 A24）;H2（B33 A24）;H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG9
;H2（B2-33A24）
Figure 871044471_IMG10
;H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG11
;及H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG12
命名法如下：H1、H2是指编码人类松弛素的两条人类基因。H2已明确为在人类卵巢中表达，而H1仅为一基因组克隆。A及B分别指人类松弛素的两条链。A或B后的数字是指链的长度，即A或B链包含的氨基酸数目。氨基酸以惯用的三字母符号来表示。氨基酸符号之前的下标是指明该氨基酸位于A链或B链，而氨基酸符号之后的上标则是标明该氨基酸在链中的位置。
松弛素A链及B链或其类似物的链可以用经典的蛋白合成方法来获得，包括用在溶液中或用固相技术或用DNA重组技术或从人 类松弛素来制取或合用上述的方法，例如，用化学合成制一条链而用DNA重组制另一条链。单独的肽链通过固相合成方法来合成，Barany，G.and Merrifield，R.B.（1980）in The Peptides2，1-284.Gross，E.and Meienhofer，J.Eds.Academ
Figure 871044471_IMG13
c Press，New York.被保护的N-叔丁基氧碳羰氨基酸系购自Peninsula实验室公司（Peninsula Laboratories Inc.）采用了以下的侧链保护作用：精氨酸，甲苯磺酰基、天冬酰胺，呫吨基;天冬氨酸，苄基酯;半胱氨酸，甲氧苄基;谷氨酰胺，呫吨基、谷氨酸，苄基酯;组氨酸，甲苯磺酰基;赖氨酸，邻-氯苄基氧羰基;丝氨酸，苄基;苏氨酸，苄基;酪氨酸，2，6-二氯苄基。首位氨基酸用在二甲基甲酰胺中的氟化钾与氯甲基聚苯乙烯（1%二乙烯基苯）成酯。取代水平为0.6毫克当量/克。用存在于二氯甲烷中的二环己基碳二亚胺（蒸馏的）使和氨基酸偶合。精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸及半胱氨酸残基在二氯甲烷/二甲基甲酰胺为50/50的介质中偶合。用45%三氟乙酸、5%苯甲醚、5%乙二硫醇及45%二氯甲烷除去叔丁基氧羰基团。在偶合之前先用10%的三乙胺的二氯甲烷溶液进行中和。用苯甲醚及甲基乙硫醚的液态无水氟化氢（3∶1∶20V/V/V）溶液，于0℃作用一小时以使之从树脂上裂解并去除所有的保护基因。用10%含水乙酸从树脂上洗出A链粗品并通过冷冻干燥。B链粗产物首先用80%含水乙腈洗涤然后用30%含水乙酸洗下，最后用水稀释并冷冻干燥而使之从树脂上除去。肽的粗品被溶解于100毫摩尔的二硫苏糖醇，然后用含0.1%三氟乙酸的10%乙腈水液进行稀释至大体积。该溶液注入5×55cm的用多孔层实心球C18（300A 15-20微米）填充的柱中，用0.1%三氟乙酸水液洗涤，并用乙腈进行梯度洗脱。含肽的组份被收集并冷冻干燥，然后分析氨基酸组成、氨基酸序列并进行反相HPLC分析。当采用先前的胰岛素或猪松弛素方法时，半胱氨酸 残基不由磺化作用或其它衍生作用进行保护。Means，G.E.and    Feeney，R.E.，Chemical    Modification    of    Proteins（1971）本发明通过将人类松弛素A链及B链处于还原态的方法提高了产率及肽的溶解性。还原的并被冷冻干燥的A链及B链被直接地用于所有重组合反应，而不转化为其磺酸化衍生物，也不使用其它的半胱氨酸巯基保护基。
在执行本发明之方法时，人类松弛素A链和B链或其类似物的A链及B链结合以形成人类松弛素或其类似物的作用可以发生在两种链的比例变化十分大的范围内。当然结合作用固然受到存在较少量A链或B链的限制。过量的B链抑制链的结合，而A链的摩尔数略微大于或等于B链则较佳。尽管并非是必要的，但一般地惯用的A链与B链的重量比例在大约1∶0.5至大约3.0∶1的范围内。实行本发明采用的最佳的A链与B链的重量比在大约自1∶1至大约2.5∶1的范围内。还经发现，在这较佳范围之内的某些比例对于生产某种特殊的松弛素类似物特别有利。因而，对于结合人类松弛素A链及B链以生产去甲硫氨酸 desmethionine）的松弛素，A链与B链优先采用比例在大约1.2∶1至大约2∶1的范围。
另一个可使本发明的方法在最佳水平实行的重要的参数为反应介质中的蛋白质浓度。本方法可在一个非常广泛的蛋白质浓度范围内执行。但是，一般地，蛋白质的浓度是在大约每毫升反应介质中含0.1至大约10毫克的范围内。蛋白质的浓度最好是在大约每毫升0.5至大约5毫克的范围内。进一步还发现，在较后的这个范围内，蛋白质的最佳浓度取决于欲生产的人类松弛素。
本发明的方法是在一个含水介质中进行的。在室温下所测的介质PH值一般在大约7.0至大约12的范围内。优先采用自大约7.5至大约11.0的范围内，并最好是维持在大约自8.0至大约10.6的范围内。 可以加入合适的缓冲剂以使介质PH值维持在需要的范围内。典型的缓冲剂有，例如，甘氨酸盐（glycinate）、碳酸盐（carbonate）、三羟基甲基甲胺、焦磷酸盐及其它可以将PH值控制在上述范围内的缓冲剂。普通且较好的缓冲剂为三羟基甲基甲胺（PH8至9）及甘氨酸盐（glycinate）（PH9.5至11.0）。
混合反应在大约15℃至大约30℃的温度下进行，而且在大约自20℃至大约25℃的温度较好，且最好是在室温下。
缓冲剂的浓度一般在自大约0.025M至大约0.2M的范围内。浓度在自大约0.05M至大约0.15M范围内较好，且最好是大约0.1M。
本发明方法的条件之一是使该反应发生在对暴露于空气氧进行控制的环境。据发现，控制氧化可以通过首先将所有溶液用氮吹气来实现，使反应开始时发生在一个封闭氮吹气容器，然后在封闭容器中，可以通过敞开空气而直接与空气接触，也可将氧气通入介质而使之与氧气接触。
本发明的方法的另一个条件是，该反应发生在一个使人类松弛素B链温和变性的条件下。变性剂有尿素、胍盐酸盐及其它的高离液序列剂（chaotropic    agent）、盐类、洗涤剂及有机溶剂（乙腈、乙醇、二甲基甲酰胺等等），这些一般的熟练操作人员所知的变性剂均可使用。较好地采用一定体积百分比（低于10%）的尿素及乙腈等有机溶剂来获得使人类松弛素B链温和变性的条件。
人类松弛素A链及B链以游离的半胱氨酸还原态形式被引入合适的含水介质中。从PH2水溶液中，先加入新鲜原料5mg/mlA链，继而加新鲜原料5mg/mlB链以开始反应。用Na    OH来调节的PH值。每步反应均用RP-4反相分析HPLC来监测以期最大程度形成结合的松弛素，然后加入冰醋酸使PH值至4以终止反应。Snyder，L.R.and    Kirkland，J.J.in    Introduction    to Modern Liquid Chromatography（1979）混合物继而在16，318g′s下离心30分钟，上清液用制备型反相HPLC来纯化。Id.据观察，在室温之下进行结合反应对于产生有效产率的人类松弛素至关重要。用Synchropak RP-4（4.6×250mm，300
Figure 871044471_IMG15
）反相柱进行高性能液相色谱分析工作。用Synchropak RP-4（1×50cm，300
Figure 871044471_IMG16
）或手填的多孔层实心球RP-4或RP-18（5×50cm）300 反相柱来进行准备工作。分析型的HPLC用一个沃特系统（water′s system）来进行。制备型的HPLC用一个沃特系统或Prep500来进行。
一旦反应完成之后，可用蛋白质分离技术领域内的多种方法的任何一种，将人类松弛素或松弛素类似物进行分离。提纯松弛素的最为常见的方法是层析技术。这些技术可容易地应用于本发明方法以分离人类松弛素。这些技术包括凝胶过滤、离子交换层析或反相HPLC。
分离方案的一例为将含总量为0.5至1克松弛素肽的反应上清液负载于一个（15-20微米）的多孔层实心球C4 300 （5×50cm）柱上进行。采用含0.1%TFA的20%至40%乙腈水溶液的梯度（每分钟变化0.5%）洗脱来完成纯化。流速为20毫升/分钟，每隔1.0分钟收集组份。用一个多孔层实心球（5微米）C4 300
Figure 871044471_IMG19
（4.6×250mm）层析柱及含0.1%TFA的25%乙腈水溶液同溶剂洗脱来监测纯化过程。含主要产物的组份收集后进行冷冻干燥以用作进一步的分析。用生物测定对人类松弛素及人类松弛素类似物进行测试。用重量在18至20g的Charles River albino c FW雌鼠进行鼠耻骨联合测试（murine pubic symphysis assay MPS）J.St.Louis，Can.J.Physiol.Pharmacol.59 507-512（1981）.雌二醇药引液（Primingsolution）是含有5μg雌二醇17β-丙酸环戊酯（cyclopentylpropionate）的0.1ml花生油。人类松弛素的剂量溶液分别为含有松弛素2.5、5.0、10.0、20.0、40.0及80.0μg/ml的含 1%苯并红紫素的水溶液。当鼠被隔离至少6天，体重为18-20g时，分别给于雌二醇药引液皮下注射。整整七天之后，对鼠进行0.2ml相应剂量人类松弛素的皮下注射。注射人类松弛素之后18至20小时后，用颈部脱臼法杀死小鼠并暴露出耻骨间韧带。用测微计对其进行测量。
Charles    River    albino    Sprague-Dawley种衍生的体重为200～300克的雌性鼠作子宫收缩测试（RUC）。雌二醇的药引液（Priming）为含200μg雌二醇17β-丙酸环戊酯（cyclopentylpropionate）的0.1ml花生油。人类松弛素原液（stock    solution）的浓度为0.1毫克/毫升消毒注射水（Invenex）。当鼠被隔离至少六天之后，对之分别进行雌二醇药引液（Priming）皮下注射。注射之后16至20小时内用二氧化碳窒息杀死鼠。每只鼠子宫解剖出来并分成四片，去掉角并从侧面分割。将组织悬浮于夹套水浴温床保持37℃的含35ml充气霍姆斯林格溶液（Holmans    Ringer    Solution）的水浴中。用以等摩尔数的氯化钾代替百分之二十的氯化钠的Ringer溶液使组织引起收缩。当达到稳定期后，水浴中加入一定浓度的松弛素。对于标准曲线，水浴内每35ml中的猪松弛素的剂量为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4及12.8微克松弛素。
对人类松弛素引起非人类灵长目动物怀孕期子宫颈成熟进行了测定。人类松弛素对交配后怀孕期为130天至160天的猕猴进行测定，群体的怀孕期为168±6天。动物被穿上有链条的外衣。该有链条的外衣能使导液管连续地进入并放在股动脉管或颈动脉及内部颈静脉管等。对大多数动物，在羊膜囊内放置一压力传感器及与子宫表面相连的电极以测定子宫的收缩活力。松弛素和以前获得的血样一起通过连续静脉输注一小时，输注期间及输注之后，从第一个小时中的间隔15分钟至有规律的间隔24小时。松弛素剂量在10μg至100μg的范围内，通过结构、失色情况、位置、膨胀及胎儿相对于子宫颈的位置和 子宫下段的质量来对子宫颈进行打分。在大多数的情形下，由二个人独立地对子宫颈进行测定及打分。作为对照的猴子系采用同样的方式输注盐水（one）或将猴子维持于群体中但不对之进行输注，每隔一周进行子宫颈检查。
用Western吸印法（Western    blots）及尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。随后用Bethesda研究实验室小册子上提供的低分子量15%的聚丙烯酰胺、尿素、板胶（slab    gels）对分子量进行检定。对该方法作了一些改进。凝胶电泳系在4℃的冷房中，在100V恒压下持续运转15小时。样品被置于100mM磷酸钠、PH7.2，7M尿素0.01%溴酚蓝中，及用于还原样品为50mM新配的DTT。上样前，将1至10μg所有肽在90℃下保温2～3分钟。凝胶在放样品前在90℃下保温2～3分钟。在0.2%甲醛、20%乙醇及6.2%乙酸（均为V/V）溶液中定影及脱色15～30分钟及作Western分析（Towbin，H.et    al.PNAS（1979）76;4350-4354）.之后，凝胶用考马斯（Coomassie）蓝染色（凝胶在10ml乙酸加上90ml    25%乙醇中的（0.25%重量/体积）考马斯蓝R-250的溶液浸泡1.5小时），银着色（silver    stain）（Oakley，B.R.et    al.Analytical    Biochem.（1980）105，361-363），使凝胶显现。
对A链及B链的专一的抗体，通过用有明矾沉淀的佛罗因德佐剂参与的游离肽按Eddie，L.W.et    al.（1986）The    Lancet    1，1344-1346.所述之方法对新西兰白免进行免疫以增进免疫性。测定同样是必需的，由每一免疫性所获之抗血清对A链用bb测定，对B链用ccc测定。稀释500倍，保温并用硝化纤维素滤纸过滤2小时，至过夜。滤纸洗过后与125    I-蛋白质A一起保温2时，干后置于X射线胶片前。
以下的例子用作对本发明的方法进行描述。所举之例仅用于说明 而不是对本发明之范围进行限定。
例1
天然人类松弛素
H2（B33    A24）
以固态冻干粉形式将还原之松弛素A链（10mg）加入反应混和物。还原之松弛素B链（5.63mg）亦以固态冻干粉形式加入。在室温下（25℃左右）如上将冻干粉形式的松弛素A链加入，继而加入松弛素B链（用NaOH将PH调至10.5）。在10ml小瓶中进行结合。反应用RP-4反相分析HPLC进行监测以期最大限度地形成重组合的松弛素。由于天然形式的H2B链的不溶性，根据本发明它和A链的重组合须在以下条件：最终反应条件为0.1M甘氨酸，PH10.5，1mMEDTA，2.5mMDTT，3%1-丙醇，3%乙腈及1M尿素。在室温下，对反应液在敞开于空气中的情况下搅拌28小时。用分析反相HPLC对松弛素的形成进行监测，并用上述方式终止反应。高性能液相色谱分析（HPLC）表明松弛素的产量为1.87mg，即19.5%    B-链结合。
混和物用制备型RP-4反相HPLC（1×25cm）RP-4    Synchropak    300    A进行纯化。对出峰流份进行收集并脱去HPLC溶剂后直接应用。据聚丙烯凝胶电泳，氨基酸分析HPLC，氨基末端顺序测定及生物测试判断，该人类松弛素是十分纯的。
例2
人类松弛素类似物
H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG20
还原的人类松弛素A链（200mg）被溶于40ml水（PH2.0）中。还原的人类松弛素B链（B33
Figure 871044471_IMG21
）（100mg）被溶于20ml水（PH2）中。将取自PH2水中的预备的新鲜原料的A链首先加入一 个165ml小瓶继而加入修饰的B链在室温（～25℃）用（Na    OH将PH调整至大约8.0）。进行A及B链类似物溶液结合。用RP-4反相HPLC对反应进行监测以求最大限度地形成结合的人类松弛素类似物。根据本发明，对于这个人类松弛素类似物采用以下条件：反应B0.1M三羟甲基甲胺（Tris）PH8.0，1mMEDTA，2m    MDTT，24℃。反应时敞开于空气中并剧烈搅拌。加入冰醋酸使PH值至4以终止该结合反应。
混和物用制备型多孔层实心球C4柱300
Figure 871044471_IMG22
（5×50cm）HPLC进行纯化。收集人类松弛素类似物的出峰部份（洗脱体积大约140ml）再冻干，回收35mg松弛素即20.3%B链结合。用聚丙烯凝胶电泳，氨基酸分析，氨基末端顺序测定，HPLC（参见图2a）及生物测试判断，该人类松弛素类似物相当纯。
例3
人类松弛素类似物
H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG23
将还原状人类松弛素A链（41.5mg）溶于8ml H2O（PH2.0）。氨基末端第一个氨基酸被删去的还原状人类松弛素B链（B2-33
Figure 871044471_IMG24
）（23mg被溶于4ml水（PH2）中。首先加入A链，继而加入修饰的B链都是用上述PH2水中的新鲜原料在室温（～25℃）下于33ml小瓶中（并用Na OH调PH至8.0）进行A链及B链类似物溶液的结合。用RP-4反相HPLC对反应进行监测以期最大限度地使人类松弛素类似物结合。根据本发明，对于该松弛素类似物采用如下条件：反应D0.1 M三羟甲基甲胺（Tris），PH8，25℃;通N2并与开始1-2小时在氮气氛下进行搅拌。然后，反应在与空气敞开情况下进行并进行剧烈搅拌。加入冰醋酸调PH到4以终止结合反应。
用制备型多孔层实心球HPLC    C4    300A（5×80cm）对混 和物进行纯化。收集松弛素类似物的出峰部分（洗脱体积大约为140ml），然后冻干，回收得到人类松弛素类似物16mg，即40.3%的B链结合。用聚丙烯凝胶电泳，氨基酸分析、氨基末端顺序分析、HPLC（参见图2a）及生物测试，判断出该人类松弛素类似物是十分纯的。
例4
人类松弛素类似物
H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG25
还原的人类松弛素A链（41.5mg）溶于8ml水（PH2.0）。还原的氨基末端第一氨基酸被删去的）人类松弛素B链（B2-33
Figure 871044471_IMG26
Figure 871044471_IMG27
）（23mg）溶于4ml水（PH2）中。取上述PH2的水中的新鲜原料，首先加入A链继而加入经修饰的B链，用NaOH调PH至8.0，在室温下（～25℃）于一个33ml小瓶中进行A及B链类似物的结合。用RP-4反相HPLC对反应进行监测以期最大限度地形成结合的人类松弛素类似物。根据本发明，该松弛素类似物采用如下条件：反应D0.1M三羟甲基甲胺（Tris）PH8，25℃;通入N并于开始之1～2小时于氮的气氛下搅拌。然后反应在向空气敞开并剧烈搅拌的情况下进行。加入冰醋酸至PH为4以终止联合反应。
用制备型多孔层实心球柱C4 300 （5×80cm）HPLC提纯混和物。收集松弛素富含区组份（洗脱体积大约为140ml），并冷冻干燥，回收得到7.5mg人类松弛素类似物，即18.9%B链结合。用聚丙烯凝胶电泳，氨基酸分析，氨基末端顺序测定，HPLC（参见图2a）及生物学测试，判断出该松弛素类似物相当纯。
例5
人类松弛素类似物
H2（B33 A24）
还原的人类松弛素A链（200mg）溶于40ml水（PH2.0）。还原的人类松弛素B链（B33 ）（100mg）溶于20ml水（PH2）。
取自上述新鲜原料的PH2的水溶液，在165ml小瓶中首先加入A链，继而加入修饰了的B链在室温（～25℃）（用NaOH将PH值调至大约8.0）下使A链及B链类似物进行结合。用RP-4反相HPLC对反应进监测，以期使人类松弛素类似物发生最大限度的结合。根据本发明，该人类松弛素类似物采用的下条件：反应B0.1M甘氨酸钠，PH8.0，1mMEDTA，2mMDTT，24℃。反应在敞开于空气情况下，进行剧烈搅拌条件下进行。加入冰醋酸调PH值至4以终止联合反应。
用制备型多孔层实心球柱C4 300
Figure 871044471_IMG31
（5×50cm）HPLC提纯混和物。收集富含人类松弛素类似物的组份（洗脱体积大约为140ml），然后冻干，回收16mg松弛素，即9.3%B链发生联合。用聚丙烯酰胺凝胶电泳，氨基酸分析，氨基末端顺序测定、HPLC（参见图2a）及生物测试，判断该人类松弛素类似物相当纯。
例6
生物测试
在电刺激收缩存在的情况下，用鼠子宫收缩性体内生物测试来测定人类松弛素对平滑肌的松弛作用。J.St.Louis，（1981）Can.J.Physiol.Pharmacol.59.507-512.用鼠耻骨间联合韧带体内生物测试来测定松弛素对结缔组织的改变作用，Steinetz，B.G.et al.（1960）Endocrinology67，102.以H2（B2-33 A24）H2（B32 A24） ，H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG33
以及以下的H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG34
的pyro-Glu形式及H2（B33 A24） 的生物学剂量效应对比表明了在MPS及RUC测试中的生物学活性。 人类松弛素类似物及人类松弛素的MPS数据示于图3。如图3，MPS剂量效应表明天然人类松弛素与H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG37
之间的等效性。然而，猪松弛素显出与其它松弛素的不平行响应。所有的人类松弛素的类似物与天然顺序人类松弛素在MPS生物测试上基本上不可分辨。
由于可获得的提纯的H2（B33    A24）的数量限制，仅能在剂量范围的高端进行比较。结果表明天然人类松弛素与其类似物之间活性的相同性。人类松弛素剂量响应曲线斜率可能和它的类似物的响应曲线斜率有所差别。
在RUC生物测试中人类松弛素与其类似物的斜率是相同的。
例7
人类松弛素对怀孕期灵长目动物的作用
用上述的方法，对交配后怀孕期为130至160天中的猕猴进行H2（B33 A24）
Figure 871044471_IMG38
及H2（B2-33 A24）
Figure 871044471_IMG39
Figure 871044471_IMG40
两种人类松弛素类似物的测定。用改进的毕晓普Bishop打分法对观察到的参数打分，7个独立的不同剂量的输注引起子宫颈平均变化值为3.7单位。该数据如图4所示，其中还显示了100、50及10μg剂量的个别输注，及所有其它10μg输注的平均值及两种对照。（除两点而每点至少代表4只猴子外）非输注对照猴每点为2至15次测验，并标出了平均值。一般，随着孕期的发展，子宫颈对较少剂量的松弛素，或在此阶段早期的反复施用松弛素更为敏感。高剂量松弛素（100或50μg）即使在孕期的较早阶段（130-140天）可以对子宫颈的成熟产生显著的变化（包括1至10分的变化）。子宫颈的变化似乎与子宫电肌动活性或子宫内压力等任何连贯变化无关。该结果表明，结合的人类松弛素对于在怀孕期最后第三阶段引成灵长目动物子宫颈成熟具有高度的效力。
本发明的人类松弛素及其类似物可用现知方法制成药用配方，诸如人类松弛素或其类似物配以药物上可接受的载体。如标准配方论文，例如Remington′s    Pharmaceutical    Sciences    by    E.W.Martin.所述，可采用合适的赋形剂及其配方，包括其它必要的人类蛋白，例如人类血清白蛋白。

Claims (14)

1、一种将人类松弛素A链或其一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、增加或修饰后所得的衍生物与人类松弛素B链或其一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、增加或修饰后所得的衍生物结合以生产松弛素或具有包括人类驰素A链或B链的基本结构并保留了类似松弛素的生物活性的类似人类松弛素的蛋白质的方法，其特征在于：包括将游离半胱氨酸的还原态A链与游离半胱氨酸的还原态B链在pH7.0-12的水性介质中混合，同时有变性剂存在并使其逐渐地暴露于空气氧中，以形成人类松弛素或具有包括人类松弛素A链或B链的基本结构并保留了类似松弛素的生物活性的类似人类松弛素的蛋白质。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中变性剂是高离液序列剂（chaotropic  agent）或有机溶剂或两者混合物。
3、如权利要求2所述的方法，其特征在于：其中高离液序列剂是尿素或胍盐酸盐，有机溶剂是乙腈，一种醇，或二甲基甲酰胺。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于：其中高离液序列剂是尿素，有机溶剂是乙腈或1-丙醇或两者，其量不超过体积的10%。
5、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中还原态的人类松弛素A链和还原态的人类松弛素B链分别具有由天然存在人类松弛素（H2）所代表的氨基酸顺序。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中，还原态的人类松弛素B链被缩短至三十二个氨基酸，在其链的4位上有一个赖氨酸，在25位上有一个丙氨酸。
7、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中，还原态的人类松弛素A链在其链上的1位有一个pyro-Glu。
8、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中，所述的混合在15-30℃进行。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于：其中，所述的混合在室温进行。
10、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中，松弛素A链的摩尔数等于或大于松弛素B链的摩尔数。
11、如权利要求10所述的方法，其特征在于：其中，松弛素A链对松弛素B链的重量比例是1∶0.5至3.0∶1。
12、如权利要求10所述的方法，其特征在于：其中，松弛素A链对松弛素B链的重量比例是1∶1至2.5∶1。
13、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中，松弛素的浓度在每毫升反应介质0.1-10毫克的范围内。
14、如权利要求13所述的方法，其特征在于：其中，松弛素的浓度在每毫升反应介质0.5-5毫克的范围内。
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