CN1355173A - 醋酸奥曲肽的液相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备醋酸奥曲肽的新方法,该方法详细描述请见说明书。
Description
本发明涉及醋酸奥曲肽的新制备方法及由该方法制备得到的醋酸奥曲肽。
醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)在临床上主要应用于下列疾病的治疗：上消化道出血(包括肝硬变食管静脉曲张出血、消化性溃疡出血、应激性溃疡出血等)、胰腺疾病(包括重型急性胰腺炎、胰损伤或手术后胰瘘、预防胰手术后并发症等)、胃肠道瘘管、消化系统内分泌肿瘤、肢端肥大症、突眼性甲亢症及爱滋病相关性腹泻等疾病。醋酸奥曲肽的结构是一含有7个氨基酸残基和1个苏氨醇的多肽。
在有关醋酸奥曲肽极其类似物的合成专利文献[Bauer W，Pless J.Novel polypeptides，processes for theirproduction，pharmaceutical compositions comprising saidpolypeptides and their use.US Pat 4,395,403(1983)]中，主要采用液相片段缩合法，其片段分为N-端二肽和C-端六肽两个片段，保护策略为BOC(叔丁氧羰基)/Bzl(苄基)策略，其中D-Trp-OH用BOC保护α-氨基，Thr-OH、Thr-ol的羟基没有保护，接肽方法主要采用叠氮法；化合物的转盐过程采用凝胶层析法，在一些文献中，采用凝胶层析法进行脱盐和转盐。但先有技术中的方法存在着一些不足，主要表现为：1、在用酸脱BOC保护时，D-Trp易发生氧化、烷基化等副反应；2、叠氮化法接肽，反应条件苛刻，易发生爆炸；3、凝胶层析转盐，时间长，耗溶剂，收率低。因此开发新的制备醋酸奥曲肽的方法是必要的。
本发明的目的是寻找新的制备醋酸奥曲肽的方法。
本发明经研究现已发现一种制备醋酸奥曲肽的新方法，该方法克服了前述先有技术中制备醋酸奥曲肽的不足。
本发明第一方面涉及制备醋酸奥曲肽的方法，其包括：
a).将下式三肽
R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH
与下式五肽R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-NH-CH(CH2-OR6)-CH(OR5)-CH3
反应生成下式八肽R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-NH-CH(CH2-OR6)-CH(OR5)-CH3
在上述三肽、五肽及八肽中，R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl；R3＝Fmoc；R4＝Z或2-Cl-Z；R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2-，
b).用无水氟化氢脱除a)中所得八肽上所有侧链保护基，得到下式还原型奥曲肽，
D-Phe-Cys-Phe-D-Try-Lys-Thr-Cys-Thr-Ol，
c)将b)中所得八肽的水溶液在空气中搅拌自然氧化，得到奥曲肽，经过纯化后，奥曲肽水溶液用碱性水溶液调pH值至7.0-8.0；
d)将c)中pH值为7.0-8.0的奥曲肽溶液注入非极性柱中，用乙腈水溶液洗脱，合并洗脱液，加入适量冰醋酸，得醋酸奥曲肽，如需要，所得醋酸奥曲肽经冷冻干燥，得醋酸奥曲肽干粉。
本发明另一方面涉及由本发明方法制备的醋酸奥曲肽。
本发明再一方面涉及下式三肽，
R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH
其中R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl
本发明另一方面涉及下式五肽，
其中，R3＝Fmoc；R4＝Z或2-Cl-Z；R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2-。
根据本发明在本发明中使用的缩写具有下面含义：
Phe：苯丙氨酸，
Cys：半胱氨酸，
Trp：色氨酸，
Lys：赖氨酸，
Thr：苏氨酸，
Thr-ol：苏氨醇，
DCM：二氯甲烷，
DMF：N，N-二甲基甲酰胺，
NMM：N-甲基吗啡啉，
DCC：二环己基碳二亚胺，
HOBt：1-羟基苯并三唑，
BOC：叔丁氧羰基，
Fmoc：芴甲氧羰基，
Z：苄氧羰基，
2-Cl-Z：2-氯-苄氧羰基，
Bzl：苄基，
4-Me-Bzl：4-甲基-苄基，
4-MeO-Bzl：4-甲氧基-苄基
根据本发明，本发明方法a)中所用五肽的D-Trp用Fmoc保护。
根据本发明，本发明方法d)中所述非极性柱选自C8柱、C16柱、C18柱、C20柱、C22柱、苄基C4柱或苯基C1柱。
根据本发明，本发明方法b)中脱保护在-20℃至室温下进行。
根据本发明，本发明方法c)中所用碱性溶液为NaHCO3水溶液。
更具体讲，本发明方法中的三肽和五肽可用下面反应路线1和2合成，还原型奥曲肽可用下面反应路线3合成。反应路线1：N-端三肽的合成
R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzli.DCM，NMM，DCC，HOBt；ii.4N HCl/二氧六环；iii.吡啶，2N氢氧
化钠溶液；iiii.10％柠檬酸溶液
在反应路线1中，HCl.Phe-OCH3与R1-Cys(R2)-OH(其中，R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl)在DCM，NMM，DCC，HOBt中反应，生成R1-Cys(R2)-Phe-OCH3(其中R1，R2如上定义)。将R1-Cys(R2)-Phe-OCH3溶解于4N HCl/二氧六环中，得到HCl.Cys(R2)-Phe-OCH3(其中R1，R2如上定义)。将式HCl.Cys(R2)-Phe-OCH3化合物于DCM，NMM，DCC，HOBt中与R1-D-Phe-OH(其中，R1＝BOC)反应生成R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OCH3(其中R1，R2如上定义)，然后将R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OCH3溶于吡啶中，加入碱溶液如氢氧化钠溶液皂化，之后用10％柠檬酸溶液酸化，生成三肽R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH(其中R1，R2如上定义)。
反应路线2：C-端五肽的合成
R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl；R3＝Fmoc；R4＝Z，2-Cl-Z；R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、CH3CH2CH2CH2-i.DCM，NMM，DCC，HOBt；ii.4N HCl/二氧六环；iii.25％哌啶/DMF
在反应路线2中，R1-Cys(R2)-OH(其中R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl)与HCl.Thr(R5)-OR6(其中R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、CH3CH2CH2CH2-)在DCM，NMM，DCC，HOBt中反应生成R1-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R5，R6如上定义)。将R1-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6溶于4NHCl/二氧六环中，得到HCl.Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R5，R6如上定义)。将HCl.Cys(R2)-Thr(R5)-OR6与R1-Thr(R5)-OH在DCM，NMM，DCC，HOBt中反应生成R1-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R5，R6如上定义)。将R1-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6溶于4N HCl/二氧六环中，得到HCl.Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R5，R6如上定义)。将HCl.Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6与R1-Lys(R4)-OH(其中R1＝-BOC；R4＝Z，2-Cl-Z)在DCM，NMM，DCC，HOBt中反应生成R1-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R4，R5，R6如上定义)。将R1-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6溶于4N HCl/二氧六环中，得到HCl.Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R4，R5，R6如上定义)。将HCl.Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6与R3-D-Trp-OH(其中R3＝Fmoc)在DCM，NMM，DCC，HOBt中反应生成R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上定义)。将R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6溶于有机碱溶液如哌啶/DMF溶液中，得到NH2-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上定义)，即为N-端五肽。
在该反应路线中，脱R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(R3＝Fmoc-)采用有机碱溶液如哌啶/DMF溶液，避免了肽链中的D-Trp与酸的接触，因此避免了氧化、烷基化等副反应。反应路线3：还原型奥曲肽的合成
R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl；R3＝Fmoc；R4＝Z，2-Cl-Z；R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、CH3CH2CH2CH2-i.DMF，DCC，HOBt；ii.吡啶，碱如氢氧化钠溶液；iii.4N HCl/二氧六环；
iiii.无水氟化氢
在反应路线3中，N-端三肽R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH与C-端五肽NH2-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上定义)在DMF，DCC，HOBt中反应得到R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6(其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上定义)。将R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-OR6在吡啶，碱如氢氧化钠中皂化得到R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-ol(其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上定义)。将R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-ol溶于4N HCl/二氧六环中，得到HCl.D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-ol(其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上定义)。将HCl.D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-Thr(R5)-ol在无水氟化氢存在下于-20℃至室温反应，得到直链八肽D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol。进一步讲，氧化型奥曲肽的合成如下进行：直链八肽水溶液迅速溶于醋酸水溶液中，稀释为稀溶液，用氨水调pH值为7.5～8.0，室温搅拌直至无游离巯基存在，经过HPLC制备纯化。进一步讲，转盐为醋酸奥曲肽的制备如下进行：上述HPLC纯化得到的溶液，用碱如NaHCO3调pH值为7.0-8.0后，快速注入非极性柱中，用有机溶剂如乙腈水溶液洗脱，洗脱液中加入适量冰醋酸，冻干，得到醋酸奥曲肽干粉。
在上述转盐过程中，用非极性柱转盐，简单，快速，成本低，收率高。
本发明醋酸奥曲肽的制备方法中，全部采用DCC-HOBt进行接肽反应，该方法简便，副反应少；此方法达到最小保护策略，可以放大量合成。
下面实施例进一步说明本发明制备醋酸奥曲肽的方法，但这并不意味对本发明的任何限制。实施例1 保护苏氨醇的合成1.Boc-Thr(Bzl)-ol的制备 将Boc-Thr(Bzl)-OH(6.18克，20mmol)溶于100毫升无水THF中，加入NMM(2.2毫升，20mmol)，冰盐浴-10℃条件下加入氯甲酸乙酯(1.9毫升，20mmol)，10分钟后加入NaBH4(2.26克，60mmol)，保持0℃下，滴加入甲醇200毫升，反应1小时，去冰浴后室温反应2小时，旋转蒸发(低于40℃)浓缩去溶剂，加水100毫升，用乙酸乙酯提取(100毫升×3次)，合并乙酸乙酯层，分别用饱和氯化钠溶液、1M盐酸、饱和氯化钠溶液各洗三次。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥。过滤，减压除去溶剂，得粘稠物5.5克，收率93.1％。产物Rf＝0.45(石油醚∶二氯甲烷∶甲醇/8∶1.5∶1)；FAB-MS(M++1)：296.3(实际分子量：295.4)。2.Boc-Thr(Bzl)-OAc的制备 将Boc-Thr(Bzl)-ol(5.5克，18.6mmol)溶于15毫升吡啶中，加入醋酐(8毫升，75mmol)，25℃反应，TLC监测反应过程，60小时将反应物后倒入300毫升冰水中，用乙酸乙酯提取(120毫升×3次)，合并乙酸乙酯层，用1M盐酸洗至pH约4.0，饱和氯化钠溶液洗至中性，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥过夜。过滤后，减压浓缩，得5.0克无色油状物，收率80.0％。产物Rf＝0.87(氯仿)；FAB-MS(M++1)：338.3(实际分子量：337.4)。实施例2 N-端三肽的制备1.Boc-Cys(4-MeOBzl)-Phe-OCH3的制备 将30毫升二氯甲烷置于茄形瓶中，冰浴下加入NMM(1.34毫升，12.2mmol)，10分钟后加入HCl.Phe-OCH3(2.16克，10mmol)，10分钟后加入Boc-Cys(4-MeOBzl)(3.42克，10mmol)、HOBt(1.68克，11mmol，溶于4毫升DMF中)和DCC(2.4克，11.5mmol)，10分钟后析出大量固体，补加20毫升二氯甲烷。冰浴条件下搅拌反应2小时，室温反应过夜，TLC监测。反应完毕后，滤出固体，减压浓缩(40℃以下)，用乙酸乙酯150毫升溶解，分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯，加入无水乙醚，放入冰浴中，滤集固体，干燥得5.0克固体，收率99.0％。产物Rf＝0.85(氯仿∶乙酸乙酯/2∶1.5)；熔点：122-124℃；2.Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-OCH3的制备 Boc-Cys(4-MeOBzl)-Phe-OCH3(5.0克，9.9mmol)用50毫升4M HCl/二氧六环溶解，室温下搅拌1小时，减压蒸干，反复加二氯甲烷浓缩抽干4次，得固体。用40毫升二氯甲烷溶解该固体，加入NMM(1.1毫升，10mmol)，冰浴条件下搅拌10分钟，加入Boc-D-Phe(2.64克，10mmol)、HOBt(1.6克，10.5mmol，预先溶于4毫升DMF)和DCC(2.1克，10.2mmol)，10分钟后析出大量固体，补加20毫升二氯甲烷，冰浴中反应2小时，室温反应过夜，TLC监测反应过程。反应完毕后，滤除固体，减压下除去二氯甲烷，残留物用乙酸乙酯溶解。乙酸乙酯溶液分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯，加入石油醚50毫升，冰浴中冷却，滤集固体，干燥得6.0克，收率93.3％。产物Rf＝0.7(氯仿∶乙酸乙酯/2∶1.5)；熔点：134-138℃。3.Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe的制备 将Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-OCH3(6.0克，9.24mmol)悬浮于50毫升甲醇中，加入5毫升吡啶，全部溶解，搅拌条件下滴加2M氢氧化钠溶液(9毫升，18mmol)，TLC监测，Rf＝0(氯仿∶乙酸乙酯/2∶1.5)，皂化完全后，用10％柠檬酸溶液酸化至pH7.0，减压蒸发去甲醇，加入100毫升水，用10％柠檬酸溶液酸化至pH3.0，滤集固体，水洗至中性，干燥得5.5克固体，收率93.6％。产物Rf＝0.36(氯仿∶乙酸乙酯∶醋酸/2∶1.5∶0.5)；FAB-MS(M++1)：636.0(实际分子量：635.78)。实施例3 C-端五肽的制备1.Boc-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc的制备 将Boc-Thr(Bzl)-OAc(5.0克，15mmol)溶于30毫升4M HCl/二氧六环中，室温下反应1小时，减压除去溶剂，加二氯甲烷反复抽干4次，残留物用40毫升二氯甲烷溶解，冰浴条件下加入NMM(1.63毫升，15mmol)，10分钟后加入Boc-Cys(4-MeOBzl)(5.06克，15mmol)，再加入HOBt(2.38克，15.5mmol，预先溶于4毫升DMF中)和DCC(3.12克，15.1mmol)。10分钟后析出大量固体，冰浴维持2小时，室温反应过夜。用TLC监测反应过程，反应完毕后，滤出固体，减压蒸去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解。乙酸乙酯溶液分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯，得到粘稠物7.4克，收率90％。产物Rf＝0.65(氯仿∶甲醇/30∶1)。2.Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc的制备 将Boc-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc(5.6克，10mmol)溶于40毫升4M HCl/二氧六环中，室温搅拌1小时，减压抽干，加二氯甲烷反复抽干4次，得泡状物。用40毫升二氯甲烷溶解该泡状物，加入NMM(1.22毫升，11mmol)，冰浴条件下加入Boc-Thr(Bzl)(3.1克，10mmol)、HOBt(1.68克，11mmol，预先溶于DMF中)和DCC(2.1克，10.1mmol)，维持冰浴2小时，室温反应过夜。用TLC监测整个反应过程，反应完毕后，滤出固体，浓缩滤液，残留物用乙酸乙酯溶解。乙酸乙酯溶液分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯，得粘稠物7.0克，收率93％。产物Rf＝0.8(二氯甲烷∶乙酸乙酯/5∶1)。3.Boc-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc的制备 将Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc(6.77克，9mmol)溶于40毫升4M HCl/二氧六环中，室温搅拌1小时，减压抽去溶剂，加二氯甲烷反复抽干4次，残留物用50毫升二氯甲烷溶解，加入NMM(1毫升，9mmol)，冰浴条件下加入Boc-Lys(2-Cl-Z)(3.7克，9mmol)、HOBt(1.45克，9.5mmol，预先溶于DMF中)和DCC(1.9克，9.2mmol)，维持冰浴2小时，室温反应过夜。用TLC监测整个反应过程，反应完毕后，滤出固体，减压浓缩滤液，残留物用乙酸乙酯溶解。乙酸乙酯溶液分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯，析出固体，加入石油醚，置于冰浴中，滤集固体，干燥得8.5克，收率90％。产物Rf＝0.5(二氯甲烷∶乙酸乙酯/1∶1)；熔点：128-131℃。4.Fmoc-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc的制备 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc(4.8克，4.5mmol)溶于50毫升4M HCl/二氧六环中，室温搅拌1小时，减压抽去溶剂，加二氯甲烷反复抽干4次，残留物用50毫升DMF溶解，加入NMM(0.56毫升，5mmol)，冰浴条件下加入Fmoc-D-Trp(1.95克，4.5mmol)、HOBt(0.77克，5mmol)和DCC(1.1克，5.3mmol)，维持冰浴2小时，室温反应过夜。用TLC监测整个反应过程，产物Rf＝0.3(二氯甲烷∶乙酸乙酯/1∶3)，反应完毕后，滤出固体，减压浓缩滤液，残留物用氯仿溶解。氯仿溶液分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，氯仿层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去氯仿，析出固体，加入乙酸乙酯，置于冰浴中，滤集固体，乙酸乙酯、乙醚各洗二次，干燥得5.6克，收率90％。产物Rf＝0.54(二氯甲烷∶甲醇/8∶0.5)；熔点：165(软化)-170℃(熔解)；FAB-MS(M+-1)：1356.5(实际分子量：1357.6)。5.D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc的制备 将Fmoc-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc(5.6克，4.12mmol)溶于50毫升25％哌啶/DMF溶液中，室温搅拌30分钟，减压蒸去DMF，得到固体，固体用石油醚倾洗三次，用氯仿溶解。用水洗氯仿溶液三次，氯仿层用无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去溶剂，得固体，滤集固体，用石油醚洗两遍，干燥固体，得4.5克，收率96.2％。产物Rf＝0.32(二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺/8∶0.5∶0.5)；FAB-MS(M+-1)：1134.6(实际分子量：1135.6)。实施例4 侧链链保护直八肽的制备1.Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc的制备 将D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc(2.29克，2mmol)溶于40毫升二氯甲烷中，冰浴条件下，搅拌加入Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe(1.28克，2mmol)、HOBt(0.32克，2.1mmol，预先溶于DMF中)和DCC(0.42克，2.03mmol)，有固体析出，维持冰浴2小时，室温反应过夜，用TLC监测整个反应过程，反应完毕后，滤去固体，减压蒸去溶剂，残留物用氯仿溶解。氯仿溶液分别用饱和氯化钠溶液、10％柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液各洗三次，氯仿层用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，减压浓缩除去氯仿，析出固体，加入乙酸乙酯，置于冰浴中，滤集固体，乙酸乙酯、乙醚各洗二次，干燥得3.4克，收率96％。产物Rf＝0.7(氯仿∶甲醇/50∶1.5)。2.Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-ol的制备 将Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-OAc(3.4克，1.94mmol)溶于20毫升吡啶中，加入60毫升甲醇，搅拌条件下滴加2M氢氧化钠(3毫升，6mmol)，滴加过程中有白色固体析出，随后消失。20℃搅拌1.5小时，有固体析出，用1M HCl调pH至7.0，减压蒸去甲醇，加水50毫升，滤集固体，干燥得3.2克，收率94.9％。产物Rf＝0.5(氯仿∶甲醇/50∶2)。3.HCl.D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-ol的制备 将Boc-D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-ol(3.2克，1.87mmol)溶于30毫升4M HCl/二氧六环，室温搅拌1小时，减压蒸去溶剂，加入二氯甲烷反复抽干4次，得固体3.0克，收率97.4％。实施例5氟化氢裂解为xHF·D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol
将HCl.D-Phe-Cys(4-MeOBzl)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys(4-MeOBzl)-Thr(Bzl)-ol(3.0克)置于裂解瓶中，加入苯甲醚3毫升，液氮冷却条件下转移液态氟化氢120毫升，冰浴下反应90分钟。抽去氟化氢，用乙醚沉淀，滤集固体，用乙醚洗涤固体三次，用100毫升水溶解固体，冻干，得黄色干粉1.4克。FAB-MS：1021.3(实际分子量：1021.16)。实施例6 氧化形成二硫键
根据空气氧化的一般方法，将直链八肽用水稀释为约10-4M，即将裂解后实施例5得到的干粉200毫克溶解在3000毫升水中，容器为5000毫升烧杯，最终浓度为6.5×10-5M，用1M氨水调pH至8.0，室温缓慢搅拌三天。用HPLC监测二硫键的形成，直至反应液中没有还原型奥曲肽存在。实施例7 奥曲肽的纯化1.Bio-Rex 70弱酸型离子交换柱 将空气氧化完毕后的反应液用1M醋酸调pH至4.5，过滤后经Bio-Rex 70弱酸型离子交换柱，流速为4毫升/分钟。上样完毕后，用去离子水洗两倍柱体积，随后用50％醋酸洗脱，紫外监测(210nm)，收集产物部分，冰冻干燥，得干粉，200毫克裂解产物可得干粉为120毫克左右。2.Sephadex-G25葡聚糖凝胶柱 将经Bio-Rex 70弱酸型离子交换柱后所得120毫克干粉用去离子水溶解为10毫升，离心后上清液上Sephadex-G25葡聚糖凝胶柱，用0.5M醋酸洗脱，紫外210nm监测，流速为2毫升/分钟，收集第二个流出峰，冰冻干燥，一般可得粗品100毫克左右。3.RP-HPLC纯化制备柱：Waters C18(19×300mm)柱流动相A：0.1％三氟醋酸/水流动相B：0.1％三氟醋酸/70％乙腈/水洗脱程序：15毫升/分钟，线性梯度
时间 A B
0 100 0
1 100 0
5 60 40
15 60 40
25 20 80
28 100 0
保留时间为13分钟左右。实施例8醋酸奥曲肽的制备
奥曲肽经过HPLC制备后，得到的是三氟醋酸盐，为了得到醋酸盐，我们尝试了用不同的非极性柱脱盐，其中C18柱能较好地达到此目的，全过程用紫外扫描(200～400nm)监测。
将HPLC制备后收集的流动相(含主峰)浓缩去乙腈，水溶液用饱和碳酸氢钠溶液调pH值至7.0～8.0，通过电子微量泵控制上样速度为2.5-3毫升/分钟。上样完毕后，用去离子水冲洗，用80％乙腈/水洗脱，用茄形瓶接收，直至洗脱液中无所需成分。
收集组分后，减压浓缩至溶液中无乙腈，加入冰醋酸至pH4，经水性滤膜过滤后，冰冻干燥，得白色干粉，约40毫克，全程收率为6～10％左右，该工艺可放大。
经鉴定：
FAB-MS(M+)：1019.4(理论分子量为1019.3)；
氨基酸组分分析：
Thr：1.08(1)，Cys：1.72(2)，Phe：1.90(2)，
Trp：0.89(1)，Lys：1.10(1)，Thr-ol：0.98(1)
比旋度：[α]D 20-57°～-63°(C 0.2，100％CH3COOH)
氨基酸序列分析：从N-端至C-端7个氨基酸残基分别为Phe、Cys、Phe、Trp、Lys、Thr、Cys。
Claims (8)
1.制备醋酸奥曲肽的方法，其包括：
a).将下式三肽
R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH
与下式五肽R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-NH-CH(CH2-OR6)-CH(OR5)-CH3
反应生成下式八肽R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-NH-CH(CH2-OR6)-CH(OR5)-CH3
在上述三肽、五肽及八肽中，R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl；R3＝Fmoc；R4＝Z或2-Cl-Z；R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2-。
b).用无水氟化氢脱除a)中所得八肽上所有侧链保护基，得到下式还原型奥曲肽，
D-Phe-Cys-Phe-D-Try-Lys-Thr-Cys-Thr-Ol
c)将b)中所得八肽的水溶液在空气中搅拌自然氧化，得到奥曲肽，经过纯化后，奥曲肽水溶液用碱性水溶液调pH值至7.0-8.0；
d)将c)中pH值为7.0-8.0的奥曲肽溶液注入非极性柱中，用乙腈水溶液洗脱，合并洗脱液，加入适量冰醋酸，得醋酸奥曲肽，如需要，所得醋酸奥曲肽经冷冻干燥，得醋酸奥曲肽干粉。
2.权利要求1的方法，其中a)中所用五肽的D-Trp用Fmoc保护。
3.权利要求1的方法，其中d)中所述非极性柱选自C8柱、C16柱、C18柱、C20柱、C22柱、苄基C4柱或苯基C1柱。
4.权利要求1的方法，其中b)中脱保护在-20℃至室温下进行。
5.权利要求1的方法，其中c)中所用碱性溶液为NaHCO3水溶液。
6.下式的三肽
R1-D-Phe-Cys(R2)-Phe-OH
其中R1＝BOC；R2＝Bzl、4-Me-Bzl或4-MeO-Bzl。
7.下式五肽
R3-D-Trp-Lys(R4)-Thr(R5)-Cys(R2)-NH-CH(CH2-OR6)-CH(OR5)-CH3
其中，R3＝Fmoc；R4＝Z或2-Cl-Z；R5＝Bzl；R6＝CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2-。
8.由权利要求1-5任一方法制备得到的醋酸奥曲肽。
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