JPS6366198A

JPS6366198A - 鎖の結合法

Info

Publication number: JPS6366198A
Application number: JP62156391A
Authority: JP
Inventors: ジョン・ペリー・バーニエル; ポール・ダグラス・ジョンストン
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-06-23
Filing date: 1987-06-23
Publication date: 1988-03-24
Anticipated expiration: 2011-08-28
Also published as: HUT44045A; IL82921A; PH23407A; EP0251615B1; CN1029784C; CN87104447A; PT85134A; PT85134B; DE3783273T2; CA1336223C; DK173649B1; ZA874482B; AU7462087A; DK313087A; JP2529693B2; DK313087D0; DE3783273D1; EP0251615A3; KR880000463A; US4835251A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】帆系上省（ｌ明り１Ｌ本発明は、ヒトリラキシンのＡおよびＢ鎖、またはヒト
リラキシンのＡおよびＢ鎖類似体を結合させて、生物学
的に活性なヒトリラキシンまたはヒトリラキシン類似体
を有用な収率で製造するための方法、さらに詳しくは、
ｐＨが約７．０以上であり、かつヒトリラキシンのｌ（
鎖を（、りやかに２１’１させる条件下で、還元型のヒ
トリラキシンＡおよびＢ鎖、またはそれらの類仰体を結
合ざＵろことからなる方法に関する。反応１υ１間中、
混合物を空気中の酸素に徐々にさらしながら温度を約１
５〜３０℃に維持ずろことにより、これらの条（１は、
生物学的に活性なヒトリラキシンまたはその類ＩＵ体を
生成させるための環境を提供ずろものであろ１゜また、
本発明は生物学的に活性なヒトリフギノン類似体に関す
る。さらに、本発明はヒトリラキシンまたはその類似体
を１＋１１°−の活性薬物と４′ろ分娩用医薬組成物に
関オろ。

人行巷」ヒトリラキシンは、分娩前の圧路変形に関＋Ｊ・１−る
卵巣ペプチドであり、従って出産の過程を容易にする［
ハイソウ（ｌｌｉｓａｗ、Ｐ、Ｌ、　、Ｐｒｏｓ、Ｓｏ
ｃ、１４ｘｐ、１ｌｉｏｌ。

Ｍｅｄ、、２３，６６１−６６３（１９２６））、シ、
ワーへ等（Ｓｃｌ＋ｗａｂ＋：。

Ｃ，ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｉ
マＯｓ、ｃｏｍｍ、　、　７５．５０３５７０（１９７
７））、およびノエイムス等（Ｊａｎｏ＋ｓ、ｌｉ、　
ａＬ　ａｔ、Ｎａｔｕｒｅ、２６７．５４４−５４６（
１９７７））］。リラキノン（」妊振巾のホルモンとし
て多く見られるが、妊娠していない女性ならびに男性に
おいても検出されろ［ブリアント−グリーンウッド（Ｂ
ｒｙａｎｔ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｇ。

Ｄ、、ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＩｉｃｖｉｅｗｓ、３．６２
−９０（１９８２））およびバイス（Ｗｃｉｓｓ、Ｇ、
、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、４６．４３−５
２（１９８４））］。

ブタ、ラット、トラ、サメ、ツノサメおよびヒト由来の
りラキノンのアミノ酸配列が確かめられている。このホ
ルモンは、ジスルフィド結合で結合した２本のペプチド
Ｉ（Ａお上びＢと称せられろ）からなり、Δ鎖に鎖内ジ
スルフィド環（インスリンの乙のと類似している）を有
している。しかし、リラギシンとその他のほとんどのペ
プチドホルモン（インスリンを含む）との間の、驚くべ
き、そして重要な差異は、種間でその構造がかなり異な
っているということである。たとえば、ブタ、ラットお
よびヒＩ・リラキンンは、アミノ酸位置が５（）％以−
１−異なっている。異なる種のりクキシン間で免疫学的
な交差反応性が乏しいこと、およびそれらの特５υ的な
生物学的活性において多数の相違が観察されることは、
このような／Ｃ５’ｌ！に、ｊｌｌ、て説明される。

組換えＤＮＡ法の適用により、ヒトリラ；１−シンをコ
ードしている遺伝子が１１１離され、その特徴か調べら
れるようになった［ハドソン等（ｌｌｕｄｓｏｎ。１）
ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｏ、３（１４，，６２ｇ−６
３１（１９８４））才ｊ、１：びハドソン等（ｌｌｕｄ
ｓｏｎ、Ｐ、　ｅＬ　ａｌ、、Ｔｈｅ　１１Ｍｌ１（Ｉ
　Ｊｏｕｒｎａｌ、：（，２３：（３−２３３９（１９
８４））］。ｃＤＮＡおよびゲラムク１ノーンからのヌ
クレオヂド配列の分析により、ヒトリフキソン構造の構
成が、２５残基のツクナルペプチド、次いで約３２〜３
３アミノ酸θ月３鎖、約１０５アミノ酸のＣペプチド、
および２４アミノ酸のＡ鎖からなることがわかる。ヒト
リラギノノの場合、イントロンがＣペプチドの二ノード
化領域を連断している。このＣペプチド（インスリンの
（ユペプチドｊ；りかなり長い）の生理学的な役割、な
らびにＡおよび１３鎖の末端からのＣペプチドの除去に
応答しうる酵素の性質について（Ｊ未解決の問題である
。

ヒトリラキシンの場合、２ｆ１１７類の別個の遺伝ｒ−
配列が同定されている（同」―）。これら遺伝子のうち
の１つ（＋−１２）た（Ｊが妊娠中に卵巣で発現され、
他の遺伝子が別の組織部位で発現されるのがどうか、あ
るいはそれか偽遺伝子を表すのかどうかについてはイつ
かっていない。この２種類のヒトリラキシンの遺伝子は
互いに、かなりのヌクレオチドお、１びアミノ酸相同性
を、特にＢおよびＣペプチドにおいて示す。しかし、配
列が相違するやや顕署な領域が、特にＡおよびＢ両鎖の
アミノ末端領域において存在している（第１図参照）。

Ｈ２リラキシンが卵巣で合成され、発現されるという事
実（Ｊ、これが妊娠生理に包含される配列であることを
示唆する３、最近の報告では、ジョンストン等［Ｊｏｈ
ｎｓｔｏｎ、Ｐ、Ｉ）ｅＬ　ａｌ、、ベプヂド、構造と
機能、Ｐｒ。

ｃ、Ｎ１ｎＬｈ　Ａｍ（！ｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ
　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　Ｄｅｂｅｒ、ＣＭ、、　ｌ１
ｒｕｂｙ、Ｖ、　ｌおよびＫｏｐｐｌｅ、Ｆ、Ｄ編（Ｐ
ｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ社、ｐ＋８５）］が、合成ヒトリ
ラキシン（Ｈ２）およびある種のヒトリラギンン類似体
について生物学的な活性を試験し、生物学的な活性に必
要なりラキシンの核、ならびに生物学的な活性に影響す
ることのない、メチオニンのある種のアミノ酸への置換
を明らかにした。

第１図は、種々の種由来のりラキンンの既知のアミノ酸
配列を比較したものである。６個のノステイン残基およ
びこれに接４−ろグリノン残」１（に加えて、Ｂ鎖中７
位のイソロイノン、１２お３」−び１６位のアルギニン
、および３２位のｔフィシンだ（」が保存されている。

ノスティン残ＪＩｋは、明らかに、全体のジスルフィド
結合の立体配置を随行４゛るのに必須である［ブルンデ
ル等（旧旧１市＋ｌＩ、Ｔ、　ｅＬ　ａｌ、）：　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅ１ａｘｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　
Ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ｌｈｅ　ｌｌｕｍａｎ、　Ｂｉｇａｚ
ｚｉ、ＭＸＧｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｐ、ＣおよびＧａ５ｐ
ａｒｉ。

Ｆ１編、１４−２１頁（１シｘｃｃｒｐｔａ　Ｍｅｄｉ
ｃａ、Ａｍ５ｔ＋＋ｒｄａｍ、　１９８３）］。リシラ
キン９−ｒ（すなわら、リラキンンタンパク質の活性部
分を含有しているΔお」；び■３鎖）中の大部分の位置
における、アミノ酸配列の種間の相違はかなりのもので
ある。このことは、インスリンを含む実際にその他すべ
てのペブヂトホルモン類の状況と際たって対照的である
。、このリフキンン構造の別の特徴は、Ｉ３鎖の）′ミ
ノお、ｌ；びカル−７＝ポキン末端領域、ならびにその程度は少ないがＡ鎖のア
ミノ末端で見られる長さの違いである。

リラギンンの化学的な合成は、主として単離した１３鎖
の構造的特徴および異常な溶解性の結果から、特に困難
であった［トレジャー等（Ｔｒｅｇｅａｒ　、　Ｇ。

ＷｃＬ　ａｔ、）：　ｒｌｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅ１
ａｘｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｒｏｌｅｉｎ　ｔｈｅ　ｌ
ｌｕｍａｎｓ　ＢｉｇａｚｚｉｌＭ、、Ｇｒｅｅｎｗｏ
ｏｄ、Ｆ、Ｃ，およびＧａ５ｐａｒｉ、Ｐ編、４２−５
５頁（Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ、　１９８３）−１８」−記のように、ヒトリラキシンおよび事実上哺乳動物
リラキシンは、一般的に言ってインスリンとある構造」
−の類似性を有している。インスリンおよびリラキシン
の両者は、２本の鎖の間に鎖内および鎖間ジスルフィド
結合を有している［ジエイムス等（Ｊａｍｅｓ、Ｒ，ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２６７．５４４（１９７７
））、ならびにンユワーベおよびマクドナルト（Ｓｃｈ
ｗａｂｃ、ｃ、　ａｎｄ　ＭｃＤｏｎａｌｄ、Ｊ、Ｒ，
，５ｃｉｅｎｃｅ、＋９７，９１４（１９７７））ｊ、
インスリンに対して用いてうまくいった合成法［ブツセ
お３にびカーペンタ−（Ｂｕｓｓｅ、Ｗ、Ｄ、　ａｎｄ
Ｃａｒｐｏｎｔｅｒ　、　Ｐ、Ｉｌ、　、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　、　１−５　、１６４９　、　（１９
７６））、カツォヤニス等（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ、
Ｐ、Ｇ、　（！ｔ　ａｌ、、１ｌｉｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔ
ｒｙ、６．２６５６（１９６７））、ならびにクン等（
Ｋｕｎｇ、ＹＴ、　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｔｉａ　
５ｉｎｉｃａ、１５．５＋１ｌ（１９６６）］が、リラ
キシンに対しても適用できるものと推定された。トレジ
ャー等［１’ｒｅｇｅａｒ、Ｇ、　ａｔ　ａｌ、＋　Ｒ
ａ１ａｘｉｎ。

ＢｒｙａｎＬ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｇ、Ｉ）、、Ｎ１
ａ１１，１１．１）ｌ’；よびＧｒ（１（１ｎｗｏｏｄ
、Ｐ、Ｃ，編、Ｅｌｓａｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
　１９８１　ｌｉｄ：、ンスティン・スルヒドリル類の
選択保１穫を利用４−る個別鎖（セパレートヂエイン）
アブローヂを用いζリラキシンを合成しようとしノこ１
．このインスリン法によって調製された合成ペプチド（
Ｊ検出ｉ−＋ｆ能なりラキシン様の生物学的反応性をｒ
Ｔ　するが、その特異的な活性および結合の収率は極め
てイ氏が・た（同上）。ブタリラキシンにおいて１１１
３合収率が賎いことの理由の１つは、完全な長さのブタ
１（鎖が１）１−１１０　、５の溶液において溶解しな
いというごとによっていた。トレジャー等（−に記）け
、先（＋技術であるインスリン結合法を、２つの点で、
・トなイ）ち混合したブタリラキンンペブヂド鎖をアセ
トンで沈澱させて還元剤を除去すること、わ、ｌ、ひ酸
化上程中に０，５Ｍ　ＮａＣｆ！を加えることで変更を
加えた。この結果、ブタリフキノンの収率が改善された
（欧州特許出願Ｎｏ、８３．３０４６６２．６および欧
州特許出願Ｎｏ、８３３０７５５３．４をも参照）。

ヂャンス等［Ｃｈａｎｃｅｅｔ　ａｌ　　米国特許Ｎｏ
、４，４２１．６８５（１９８３年１２月２０日発行）
］は、還元および酸化反応を１−１−程で行うべく、イ
ンスリンのΔおよびＩλ鎖のＳ−スルボネート化形を、
水性溶媒中、コントロールされたｐ　Ｉ−Ｔおよび温度
下で、チオール還元剤と混合することによってインスリ
ンまたはその類似体を製造する方法を開示している。こ
の方法は、前記のインスリン合成法に優る改良法として
提供されたものであるが、ヒトリフキシンの合成には適
用できないことがわかった。

発明の概要ここに本出願人等は、特定の反応条件下、ヒトリフキシ
ンの還元鎖を＝１ントロールされた条件下で結合させる
ことによって、有用なレベルのヒトリフキシンよたはそ
の類仰体を製造ずろことができろことを見い出した。す
なわち、本発明の目的は、ヒトリフキシンのＡおよびＢ
鎖（その出所、たとえば化学合成によるものであるか、
また（」相換えＤＮＡ法（こよるものであるかを間イ）
ない）を結合させて有用な収率の生物学的に活（１１な
ヒトリフキシンを製造するための方法を提供するごとで
ある。

本発明の別の態様は、生物学的に活Ｐ１なヒトリラキシ
ン類似体を製造することである３゜本発明のさらに別の
態様は、分娩用にヒトリフキシンまたはその類似体を用
いることである１゜本発明は、ヒトリラキシンのＡ鎖」
二たはその類似体とヒトリラキシンのＢ鎖また（」その
類貝陣を結合させて生物学的に活性なヒトリラキシン」
・たはヒトリフキシン類（口体を製造セるための方ｔ］
、に関ずろ。特に本方法は、還元型のヒトリフキシンＡ
鎖またはその類似体と還元型のヒトリシギノンＢ鎖また
はその類似体を、ｐＬＩが約７．（）以１−であること
を含む、ヒトリラギソンの１１鎖を穏やかに変性させる
条件下で混合し、反応期間中、空気中の酸素に少しずつ
さらしながら反応を？１うことからなる。

回部−の］免剰］。

第１図（Ｊ１ヒトリラキシンＨＩおよびＢ２と、ヒトイ
ンスリンならびにブタ（Ｐ）およびラット（Ｒ）リラギ
シンの相同性の欠如を示すものである。

数字は１１２リラキノンに基づいて付されている。

リラギンン類のジスルフィドは、Ａｌ０−Ａ１５、Ａ　
Ｉ　１−、　＋１１１およびＡ２４−２２３である。

第２（ａ）図および第２（ｂ）図は、インビトロでの錯
結合反応のそれぞれ＋１２（Ｂ３３　　Ａ２４）ｅＬｙ
ｓ’　ＢＡＩａ２′および［２（＋３３３　　Ａ２４）
のプロファイルについてのｆ−ｒ　Ｉ）　Ｌ　Ｃ経時変
化を示している。

潜在的にポラなΔ鎖の分子内酸化された中間体、お、Ｊ
：びヒトリフキシン類似体またはヒトリフキシンの生成
を示す結合反応の経時変化が描かれている。遺伝子２の
ＡおよびＢ鎖ペプヂドの、ト【２ヒトリフキシン類似体
またはＩ−１２ヒトリラキシンへの変換か描かれている
。シンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒ。

ｐａｋＭｔ　Ｐ　−Ｃ４クロマトグラフイーを用いた（
４゜６ｘ２５０ｘｘ　；３００Ａ”）。０．０５％ＴＦ
Ａ。

■］２０緩衝液中、アセトニトリルの直線勾配（５００
分で１５　→　６０％）として、これをｌ７ＩＩＬ’分
で流した。

第３図は、錯結合したヒト遺伝ｒ２のワラ；１−ソンＨ
２（Ｂ２−３３　　Ａ２４）ＢＬｙｓ’　［３Δ）ａ２
１＋および天然のヒトリフキシンの生物学的活性（Ｍ１
）ε；）を示している。

第４図は、種々用量のヒトリフキシン類似体、すなわち
Ｂ２（１３２−３３Ａ２４）ｏＬｙｓ’ｅΔ１ａ２５お
よびｌｌ２（Ｂ３３　　Ａ２４　）　ＢＬｙｓ’　ＢΔ
Ｉａ２′′を投与した後の、霊長類にお（−する改良型
ビンヨブ・スコアー（Ｂｉｓｈｏｐ　５ｃｏｒｅ）を示
している（１詳細な説明本明細書で用いる「ヒトリフキシン−１または（ヒトリ
フキシン類似体」なる語句は、産路を変形させて出産の
過程を容易にすることが知られている機能的なタンパク
質を指す。産路の変形に（ｊ、頚部の熟成、妊娠子宮の
内膜を厚くすることおよびこの領域への血管新生の増加
、ならびにコラーゲン合成に及ぼず影響、などの生理学
的な作用も含まれているしのと解する。ヒトリラキシン
は女性の胸部にム見い出されるが、これは乳汁分泌と関
係しているのであろう。また、ヒトリラキシンはヒト精
液にら見い出されるが、これはヒト精子の移動度を高め
るのであろう。頚部にリラキンンの効果がイ・Ｉ’　”
ｊ、されると、ヒトリラキノンはヒト頚部に入り込む精
ｒ・の能力を増大させるのであろう。

ヒトリラキシンが結合組織に作用すると、皮膚の弾性を
改善することもある。

１−記の機能的な定義に加えて、ヒトリラキシン類仰体
に（」、構造的に、ＡおよびＢ鎖を含むヒトリラキシン
の基本的な構造を有している多数のタンパク質が含まれ
る。このヒトリラキノン類似体は、生物学的なりラギシ
ン様の活性が保持されるように注意しなから、ヒトリラ
キシンのＡおよび／またはＢ鎖中の１またはそれ以」二
のアミノ酸残基を置換、削除、イ」加あるいは修飾する
ことによって、天然のヒトリラキシンと異なったものと
なっている。このようなヒトリラキシン類似体の例には
、完全な長さのＡ鎖およびカルボキシ末端を短くしたＢ
鎖を有する、ＩＩ　Ｉ　（ｒ（２２７Ａ２４）ｅＡ　Ｉ
ａ”、Ｉ（２（１１２−２５Ａ２４）、ＩＩ　２　（１
（３３Ａ２４）、Ｉ−＋２（１３３３Ａ２　／Ｉ）ｅＬ
ｙｓ’　ＤΔ１ａ２５、Ｒ２（Ｒ２−３３Ａ２４）ｅＬ
ｙｓ’　ｅＡｌ　ａ　２”、Ｒ２（Ｒ２−３３Ａ２４）
Ａ　ピ〔）　Ｇｌｕ’　　Ｂｌ　、ｙＳ’　　ＢＡ　Ｉ
ａ２５、およびＩＩ　２　（＋’３３３　　Ａ２４）Ａ
ピｃｌＧｌｕ’　ＢＬｙｓ’　ＢＡｌａ”’が含まれる
が、これらに限定はされない。ここで用いる用語は以ド
のようである。

ＨＩ、Ｉ−１２はヒトリラキシンをコードしている２種
類のヒト遺伝子を指゛、１ｏＩＩ　２　＋Ｊヒト卵卵巣
−０現現れろことがイつかっているが、Ｉｆｌ＋、、ｉ
ゲノノ、り１１−ンとしてだけ見い出されろ。Δお上び
１〜はヒトリラキシンのそれぞれの鎖を表す３．ΔＪξ
たｉＪ：ｌｌに続く数字は鎖の長さ、すなわ１′）Δ−
また（月１鎖を構成しているアミノ酸の数を表４−１．
アミノ酸（Ｊ通常の３文字表示で表す。アミノ酸の萌の
ド文字（１アミノ酸が位置しているΔ−また（」１３鎖
を表し、アミノ酸の後のに一１文字は鎖」−の位置を表
４−３１リラキンンのＡ−およびＢ−鎖また（Ｊその類
似鎖は、液相あるいは固相法を含む古典的なタンパク質
合成法によって、または組換えＤＮＡ法を用いて、また
は天然のヒトリラキシンからの調製によって、または−
に記の組合わせによって、たとえば鎖の１本を化学合成
で、他方を組換えＤＮＡ法で調製することによって得る
ことができる。個々のペプチド鎖を固相法によって合成
した［バラニーおよびメリーフィールド（Ｂａｒａｎｙ
、Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、）、
Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　２　、Ｇｒｏｓｓ、Ｅ、
およびＭｅｉａｎｈｏｒｃｒ、Ｊ　　編、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１−２８４（＋９＋
’ｔｏ）］。保護されたＮ−ｔ−プチルオキン力ルポニ
ルアミノ酸は、ペニンスラ・ラボラトリーズ社（Ｐｅｎ
ｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）
から購入した。以下に挙げる側鎖保護、すなわちＡｒｇ
）シル、Δｓｎキザンチル、Ａｓｐベンジルエステル、
Ｃｙｓメトキンベンジル、Ｇｉｎキザンチル、Ｇｌｕベ
ンジルＪ、ステル、Ｈｉｓ　トンル、Ｌｙｓｏ−クロロ
ベンノルオギン力ルボニル、Ｓｅｒベンジル、１’ｈｒ
ベンジル、Ｔｙｒ２，６−ジクロロベンジルを用いた。

最初のアミノ酸を、ジメチルホルムアミド中、フッ化カ
リウｌ＼を用いてクロロメチルポリメチレン（１％ノビ
ニルベンゼン）−１−に」−スアル化した。置換レベル
は０．６ｍ内当１１９とした。、７ミノ酸を、塩化メチ
レン中、蒸留ジシク【！へギンル力ルポジイミドでカッ
プリングさＵた、３アルギニン、アスパラギン、グルタ
ミン、〔フィシン、およびシスティン残基を、５０１５
０　塩化メヂレン／ジメヂルホルムアミド中でカップリ
ングさｌた。

ｔ−ブヂルオキシ力ルボニル基の除去は、４５％トリフ
ルオロ酢酸、５％アニソール、５％Ｊ、タンジチオール
および４５％塩化メチレンを用いて行った。カップリン
グさせる前の中和は、塩化メチレン中、ＩＯ％トリエヂ
ルアミンを用いて行うた３゜樹脂からの切り出し、およ
び４−べての保護」１（の除去は、無水の液体フッ化水
素を用い、）′ニソールおよびメヂルエヂルスルフィド
の存在ｌ’（２ｆｌ＋：（：　１　　ｖ／　ｖ／　ｖ）
、０°Ｃて１時間処理４′ることに、１：　＝。

て行った。１０％酢酸水溶液を用いてＩＩツυ）△鎖を
樹脂から取り出し、これを凍結乾燥１刀コ、、粗製のＢ
−鎖は、始めに８０％アセトニトリル水溶液で、次に３
０％酢酸水溶液で洗浄４るごとに、１−・て樹脂から取
り出し、次いで水で希釈し、凍結乾燥した。これらの粗
製ペプチドを１００ｍモルのジヂオトレイトールに溶解
し、次いて多量のｌＯ％アセトニトリルおよび０１％ト
リフルオロ酢酸の水溶液中に希釈した。これらの溶液を
、ビダックＣｌ８（Ｖｙｄａｃ　Ｃ１０；　３００Ａ°
　１５−２０ミクロン）を詰めた５Ｘ５５ｃｚのカラム
にかけ、０１％トリフルオロ酢酸水溶液で洗浄した後、
アセトニトリルの勾配溶液で溶離した。ペプチドのフラ
クン＝ｌンを集め、凍結乾燥し、アミノ酸組成配列決定
および分析用逆相Ｉ（Ｐ　Ｌ　Ｏによって分析し）こ。

インスリンまたはブタリラキシン用の先行技術で用いら
れていたような、スルポン化またはその他の誘導体化［
ミーンズおよびフィーニー（Ｍｃａｎｓ、Ｇ、Ｉ：、　
ａｎｄ　Ｐｅｅｎｅｙ、Ｒ，Ｅ、、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（
１９７１））］によってはノステイン残基を保護しｔＪ
′かった。本発明方法に従って、ヒトリラギンンのＡ−
およびＢ−鎖をその還元型に保つことによって、改善さ
れた収率およびペプチドの溶解性が得られろ。この還元
型の、凍結乾燥されたＡ−および１３−鎖を、スルホン
化誘導体に変換することまたは他のンスヂンチ１−ルの
ブｔＪツタ剤を用いることなく、直接すべての１１１結
合反応に用いた。

本発明方法を実施ずろに際し、ヒ］・リフキノンのＡ−
およびＩ（−鎖、または類似の△わよびＩＮ　ｌｉｌ’
１を結合させてヒトリラギンンま）こはヒトリシキノン
類似体を形成させるには、−・方の鎖と他方の鎖の比率
を広範囲に変化させてこれを行うごとかできる。らちる
んこの結合は、八である）か］吃であろうが、量の少な
い方の鎖によ−・て本質的に制限される。過剰の１３−
鎖は鎖の結合を抑制し、１３鎖と等しいか、またはわず
かに過剰のΔ鎖１ｔｔ　（モル）であることが好ましい
。必須ではないか、Ｌ）４゛れの場合においても、通常
Δ−鎖の１３鎖に対４°る比は約１：０．５〜約３．０
：Ｉ（市ｍ比）である。Δ鎖の１３−鎖に対する比率、
約ＩＩＩ〜約２．５：Ｉ（市重圧）を用いて本発明を実
施するのかさらに好よしい。また、この好ましい範囲内
の、ある範囲か特定のりラキソン類似体の製造に特にｆ
ｒ利であろことを見いだした。すなわち、ヒトリラキソ
ンのＡおよびＩ（−鎖を結合させて脱メチオニンリラキ
ンンを製造する際には、Ａ−鎖のＢ−鎖に対する比（」
約！、２１〜約２．１の範囲内であることが好ましい、
。

最適レベルで本発明方法を実施するのに重要な別のパラ
メーターは反応溶媒中のタンパク質濃度である。広範囲
のタンパク質濃度を用いて本方法をうまく行うことがで
きる。しかし一般的には、タンパク質濃度は反応溶媒Ｉ
Ｍρあたり約０．１〜約１０Ｍ９の範囲であろう。好ま
しくは、タンパク質濃度は約０．５〜約５ｍ１７７ｍ（
ｌの範囲内であろう。

また、この後者の範囲内において、最適タンパク質濃度
が製造されるヒトリラキシンに依存して変イつろことを
ここでも見い出した。

本発明の方法は水性溶媒中で行なイっれる。溶媒のｐＨ
（室温で測定）は、通常的７．０〜約１２の範囲である
。約７．５〜約１１．０であることが好ましく、約８．
０〜約１０．６の範囲内に保つのが最適である。適当な
緩衝剤を加えることによって溶媒のｐＨを所望の範囲内
に保つことができる１１代表的な緩衝剤は、たとえばグ
リンネ−１・、カーホネート、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、ピロポスフェートおよび叶■を上記
の範囲内にコントロールしうるその伸開様の試薬である
。　・般的かっ好ましい緩衝剤は、トリス（ヒト「１ギ
ソメチル）アミノメタン（ｐＨ８〜９）およびグリシネ
ート（ｐＨ９、５〜１１．０）である。

混合反応は、約１５〜約３０℃の温度で、好ましくは約
２０〜約２５℃で、最ム好ましく（」室温で行なわれる
。

緩衝剤の濃度は、一般的には約０．０２５Ｍ〜約０．２
Ｍの範囲である。好ましくは約（０５Ｍ〜約０．１５Ｍ
であり、最も好ましくは約０　、　ｌ　ｔｖｌである。

本方法の条件の１つは、空気中の酸素に暴νに４〜るこ
とをコントロールしうる環境下で行うことである。始め
にすべての溶液をＮ、置換１２、反応の開始時に密閉し
た容器中で反応液をＮ、置換し、密閉した容器中で反応
液を直接空気（ごの容器を開くことによって）に、また
は酸素（溶媒中にバブリングすることによって）に暴露
することによってコントロールされた酸化が達成される
ことを見い出した５゜本方法の別の条件は、ヒトリラキシンＢ−鎖が穏やかに
変性される条件下で反応を行うことである。当分野で知
られている変性剤、たとえば尿素、グアニノン塩酸塩、
およびその他のカオトロピック試薬類、塩類、清浄剤類
、および有機溶媒（アセトニトリル、アルコール類、ジ
メチルホルムアミド等）を用いることができる。尿素お
よびアセトニトリルか好ましく、数％（体積比：１０％
以下）のｆ１機溶媒は、ヒトリラキシンＢ−鎖を穏やか
に変性°４゛る条件にする。

ヒトリラキシンの八−およびＢ−鎖を、遊離システィン
還元型で、適当な水性溶媒中でいっしょにする。始めに
八−鎖を、次いでＢ−鎖（ｐ）（２の新鮮な５ｙｙ／ｍ
Ｑ水中貯蔵品から）を加えろことによって反応を開始し
た。ＮａＯＨでｐＨを調節して適当な値にずろ。再結合
クラキシンの生成を最大にするため、各反応をＲＰ　−
４逆相分Ｄｉ用Ｉｔ　１）　Ｌ　Ｃｌ５ｎｙｄｅｒ、Ｌ
、Ｒ，およびＫｉｒｋｌａｎｄ、Ｊ、Ｊ、、ｌ　ｎ　ｔ
　ｒｏ市＋ｃＬｉｏｎｔｏ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｌｉｑｕｉ
ｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１９７９）１でモ
ニターし、氷酢酸を加えてｐＦ１４とすることに、）；
って停止させる。次いでこの混合物を１６，３１８９で
３０分間遠心し、−ト清をプレパラティゾ逆相ＩＩＰＬ
Ｃ（同上）で精製する。有用な収率のヒトクラキシンを
製造するためには室温で結合反応を行うことが重要であ
ることかわかった。高速液体クロマトグラフィーによる
分析は、ノンクロパック１ｔＰ−４（Ｓｙｎｃｈｒｏｐ
ａｋ；４．６　Ｘ　２５０ｍｍ、　３０　（ｌ　Ａ”）
逆相カラムを用いて行った。ブレパラγイブ＄１１１Ｌ
Ｃによる精製は、シンクロパックＩＩＰ−４（ｌＸ５０
ｃｍ、３００　Ａｏ）またはハントパックのビダックＲ
Ｐ〜４あるいはｒｊＰ−１８（５Ｘ５０ＧＭ、　、ｉｏ
　０　Ａ”）逆相方ラムのいずれかを用いて行うた、。

分析ＨＰＬＣはウォーターズンステム（ＷａＬ（！ｒ’
　ｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、プレパラティブＩ＋　
１１Ｃはつ］−ターズシステムあるいはプレツブ５００
　（１’ｒｃｐ５００）を用いて行った。

反応が終了したら、ヒトクラキシンまたはりラキンン類
仰体産物を、タンパク質単離の分野で認められている多
種多様の方法のうちのいずれかによって単離オろことが
できる。最も普通に用いられるクラキシンの精製法はク
ロマトグラフィー法である。この方法を、本発明方法に
よって得られるヒトリラキソンの回収に、容易に適用す
ることができる。この方法には、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィーあるいは逆相ＨＰＬＣが含まれうる
。

精製法の例を挙げると以下のようである。すなわら、合
計０．５〜ｌのクラキシンペプチドを含む反応液−にｔ
ｎを１５〜２０ミクロンのビダックＣ４３００Ａ°（５
ｘ５０ｃｇ）カラムにかけた。０゜１％ｉ’　Ｆ　Ａ　
水中の、２０〜４０％アセトニトリル勾配（１分毎に０
５％変える）を用いて精製を行った３、流速は２０１１
ρ／分であり、１．０分毎のフラクションを集めた。こ
れらを、分析用５ミクロンのビダックＣ４３０ＯＡ”（
４，６ｘ２５０ｍｍ）カラムでモニターした（０．１％
ＴＦＡ水中の２５％＝２４− アセトニトリルでイソクラティックに溶１ｉ１１Ｆ）、
、　　Ｌ産物を含むフラクションを集め、ごれを後の分
ＩＪｉ用に凍結乾燥した。

ヒトリラキシンおよびヒトクラキシン類似体を生物検定
で試験した。ネズミの恥骨結合検定（ＭＰＳ）には、体
重１８〜２０１ｉ＋のチャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌ
ｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）白ＣＦＷ雌マウスを用いるＩルイス
（Ｊ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｃａｎ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ
、ｒ’ｈａｒｍａｃｏｌ　、　、　５９゜５０７−５１
２（１９８１））］。エストラジオールプライミンダ液
は、ピーナツ油０　、　Ｉ　ｎ（ｌにエストラノオール
１７β−シクロペンチルプロピオネ−ｔ・５　Ｂ　ｙを
加えたものである。ヒトリラキシン投り［ｆＪｉ、　／
＼ンゾプルプリン４Ｂの１％水溶液中、２　、５．５　
。

０．１Ｏ１０，２０，０，４０，０および８　（］　、
　Ｏｔｔ９／Ｒ（ｌの濃度とする。マウスを少なくとも
（ｉ　ｌ　ｌ　ｌｉ’＋１隔離室に入れ、１８〜２０ｇ
になったときに、各マウスにエストラジオールプライミ
ング液を皮１ぐ注射する。正確に７１１後、マウスに適
当なヒトリラキシン投与液０．２順を皮下注射する。ヒ
トリラキシン注射の後、１８〜２０時間の間に頚部を脱
Ｆ」させてマウスを殺した。恥骨間の靭帯を露出さｌ−
、マイクロメーターで測定した。

体重２００〜３００９の、チャールズ・リバー白スプラ
ーグ・１・−レイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）由
来の雌ラットを、ラットの子宮収縮検定（ＲＵＣ）に用
いる。エストラノオールプライミング液は、ピーナツ油
０　、　Ｉ　ｍＱにエストラジオール　１７β−シクロ
ペンデルプロピオネート２００μｇを加えたものである
。ヒトクラキシン貯蔵液は、滅菌注射用水（ｌｎｖｅｎ
ｅｘ）中、０　、１　ｍｇ／ｒｔｒＱの濃度とする。ラ
ットを少なくとも６日間隔離室に入れ、各ラットにエス
トラジオールプライミンダ液を皮下注射する。

エストラジオール注射の後、１６〜２０時間の間に、−
酸化炭素で窒息させてラットを殺す。子宮を解剖して取
り出し、先端を裂き、子宮を横から動物あたり４つの片
に分ける。各組織を、通気ホルマンズ・リンガ−（Ｉｌ
ｏｌｍａｎｓ　Ｒｉｎｇｅｒ）溶液３５１１ｇを入れた
、３７℃に維持した、カバー付き水浴中に浮遊さＵる。

このリンガ−溶液を、塩化ナトリウムの２０％を等モル
量の塩化カリウムに置換した溶液に置き換えると、この
組織は収縮を起ご４′、。

安定なプラト−に到達した後、この水浴にある濃度のり
ラキシンを加える。標窄曲線用に水浴に加えたブタクラ
キノンの量は、水浴中の３５１１θあたりクラキシン０
．２．０．４．０．８．１．６．３２．６．４および１
２．８７Ｂである。

非ヒト霊長類の妊娠において、ヒトクラギノンが誘導す
る頚部熟成について試験した妊娠齢１３０〜１６０日の
、期間を合わせたアカゲザル（１？ｈｅｓｕｓ　ｍｏｎ
ｋｅｙ）でヒトクラキシンを試験した３、この群の妊娠
期間は＋６８±６１１である。この動物に、つなぎ用の
綱を付けたジャケットを着ｌた１゜この綱を付けたジャ
ケットは、大腿血管、または頚動脈および内部頚静脈血
管中に入れた内（１′、カテーテルに常時接近すること
を可能にした。大部分の動物においては、羊膜嚢内に圧
力変換器を入れ、子宮表面に電極を接続して、子宮収縮
活性の測定を可能にした。連続静脈内注入で１時間にイ
・）だ−１てクラキシンを投与し、注入に続く１５分か
ら最初の１時間はときどき、次いで２４”’ｌ１ｉｉｌ
ＬＪ規則的に、注入前、注入中、および注入後の血液試
料を採取した。クラキシンの投与量はＩＯ〜１００μ２
の範囲とし、頚部に関する構造、不順化、位置、拡張お
よび胎児位置、ならびに子宮工区の特性について評価し
た。はとんどの場合、２人の観察者が別々にそれぞれの
頚部を調べ、評価した。対照群は、同様の方法で処置し
、食塩水を注入したサルであるか、または群中に保たれ
ているｈ月週間間隔で行なわれる頚部試験を施されてい
ないサルであった。

タンパク質を学離するためウェスタンプロットおｊ；び
尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。低分子
用１５％ポリアクリルアミドゲル、尿素、スラブケルは
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
の分子量標桑用のパンフレットに従って行った。この方
法にいくつかの修飾を施した。このゲルを、４℃の冷却
室中、１００Ｖ（一定）で１５時間泳動させる。試料は
、ｌ０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７゜２）、７Ｍ尿素
、００１％プロモフェノールブルー、および還元試料に
対しては新たに調製１刀こ５０ｍＭＤＴＴ中で調製する
。充填の前に、Ｉ〜ｌＯμ９の全ペプチドを９０℃で２
〜３分間インキュベートする。充填する前に、ゲルを９
　（１”Ｃて２〜３分間分間インベコベート。０．２％
ホルノ、アルデヒド、２０％エタノールお、及び６２％
酢酸（すべてｖ／ｖ）の溶液中で１５〜３０分間脱染色
し、固定した後、このゲルを、クーマツシーブル−［Ｃ
ｏｏｍａｓｇｉｅ　Ｂｌｕｅ　：　２５％エタノール中
のクーマツシーブルーＩＮ　−２５０（９０ｉｉ７：０
．２５％Ｗ／Ｖ）および酢酸（１０ｄ）中にゲルを１．
５時間浸漬する］で見えるようにし、銀染色Ｉオークレ
イ等（Ｏａｋｌｅｙ、Ｂ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、＾ｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ　１＋ｉｏｃｈｃｍ、、ｊ０５．：（６１
−３６３（１９８０））］　Ｌ、ウェスタン分析１トウ
ビン等（Ｉ゛ｏｗｂｉｎ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ
、７６．４３５０−４：（５４（１９７９）］する。

エディ−等［Ｅｄｄｉｅ、Ｌ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、１
゛ｈ＋＋　Ｌａｎｃｅｔ、ｌ。

１３４４−１３４６（１９８６）］の記載のよう（こし
て、アルミニ―ウム（ａｌｕｍｎ）沈澱させた遊離ペプ
チドか、よたはフロインドアジコバシト中の遊離ペプチ
ドで−コ−ジ−ラン１ζ白ウザギを免疫化ずろことによ
って、△−およびｌ（−鎖に特異的な抗体を、生成させ
た。

力価は実質的に同一であり、それぞれの免疫化からの抗
血清を、Ａ−鎖についてはｂｂ力価で、Ｂ−鎖に−）い
てはＣＣＣ力価で集めた。ニトロセルロースフィルター
に対する２時間〜−晩インンキ、ベーソヨンにおいて、
ごれらを５００倍に希釈して用いた。次いで、洗浄した
フィルターを、＋２５１−タンパク質へに対して２時間
インキュベートし、乾燥し、Ｘ−線フィルムに感光させ
た。

以ドに実施例を挙げて本発明方法をさらに詳しく説明４
−るが、これらは説明のためにだけ挙げるものてあ−）
で、本発明の範囲を限定しようとするしのではない。

宋施ｆりｊ−１−入熱のヒトクラキシンＩ（２（Ｂ３３
Δ２４）還元型のりラキシンΔ−鎖（１０７！ｇ）を、還元型の
固体凍結乾燥粉体として反応混合物に加えた。

還元型のりラキシンＢ−鎖（５，６３ｘｇ）も固体凍結
乾燥粉体として加えた。

始めにクラギンンＡ鎖を、次いでクラギノンＢ−鎖を、
上記からの固体凍結乾燥粉体上して加え、Ｉｏｎ（ｌの
バイアル中、室温（〜２５℃）でＡおよびＩ３リラギシ
ン鎖の溶液を混合した。Ｎ！ｔｏｌ＋を用いてｐＨを１
０．５に調節した。再結合クラギシンの生成を最大にす
るため、この反応をＩｔ　Ｐ　−４逆相分析用１−Ｉ　
Ｐ　Ｌ　Ｃでモニターしノこ。天然型のＨ２のＢ−鎖が
不溶性であることから、そのΔ−鎖との再結合には本発
明による次の条イ／すなわら最終反応液０．１Ｍグリシ
ン（ｐＨＩＯ，５）、ＩｍＭＥＤＴΔ、２．５ｍＭ　Ｄ
ＴＴ、３％　ｌ−プじ１パノール、３％アセトニトリル
、および１Ｍ尿素を必要とした。この反応液を空気にさ
らし、室温で２８時間撹拌した。前記のようにして、リ
ッギシンの生成を分析用逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃでモニターし
、停止させた。高速液体クロマトクラフィー（１＋１）
ＬＣ）による分析は、クラキシンの収晴カ月、８７ｍｇ
（すなわち、Ｂ−鎖の１９．５％導入）であることを示
した。

この混合物を、プレバラティブＴＩ　Ｉ）−４逆相１１
３ｌ− ＰＬＯ（Ｉ　ｘ２５ｃｍ）ＲＰ　〜４シンクロパック３
００Ａで精製しノこ。このピークを集め、ＨＰＬＣ溶媒
から直接用いた。このヒトクラキンンは、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動、アミノ酸分析ＨＰＣ、アミノ末端
間ｌす決定および生物検定により、完全に純粋であるこ
とがわかった。

実施例２　ヒトクラキシン類似体Ｈ２（Ｂ３３Δ２４　
）　ＢＬｙｓ’　ＢＡＩａ２５還元型のヒトクラキシン
Ａ−鎖（２００ｏ）を水（ｐ１１２．０）４０＊ｌ！に
溶解した。還元型のヒトクラキンンＢ−鎖ＣＦ３３３　
ＢＴ、ｙｓ’　Ａｌａ２５）（１００ｍｇ）を水（ｐｔ
ｒ　２　）　２０　ｍＱに溶解した。

上記の新鮮な水（ｐＨ２）中貯蔵品から、Ａ−鎖を始め
に、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることによって、＋６
５＋０のバイアル中、室温（〜２５℃）でＡ−お」；び
■３−鎖類似体の溶液を混合した。ＮａＯＨでｐＨを約
８．０に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生成を
最大にするため、この反応をＲＰ−４逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ
でモニターした。このヒトクラキシン類似体用に、本発
明による次の条件、ずなわち反応Ｂ　　Ｏ，１Ｍトリス
（ｐＨ８、０）、ｌ　ｍＭ　ｌ・：ＤＴＡ、２ｍＭ　Ｄ
ＴＴ、２４℃を用いた。この反応液を空気にさらして激
しく撹拌しノコ。氷酢酸を加えてｐＨ４とすることによ
ってこの結合反応を停止させた。

この混合物を、プレパラティブＩＩ　Ｐ　Ｔ、　Ｃピダ
ック０４　３００　’Ａ（５Ｘ　５０ｃｍ）で精製した
。ヒトクラキシン類似体のピーク（溶出体積：約１４０
１１ｇ）を集め、凍結乾燥して３５Ｒｇのりラキンン（
４′なわち、Ｂ−鎖、２０，３％）を回収した。このヒ
トクラキシン類似体は、ポリアクリル）′ミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、ＨＰ　Ｌ　
Ｃ（第２ａ図参照）および生物検定により、完全に純粋
であることがわか−、ノこ３、寒寒敗＋ヒトクラキソン
類似体ＩＩ　２　（１３２３３Ａ　２４　）　８ｆ、ｙ
ｓ’　ＢＡｌａ”還元型のヒトクラキシンＡ−鎖（４１
，５〜）を水（ｐＨ２，０）８好に溶解した。）２ミノ
末ｙ１°１．：から１１４初のアミノ酸を削除した還元
型のヒトクラギンン１（−鎖（Ｂ　２−３３　ＢＬｙｓ
’　５ＡＩａ”Ｘ２３ｙｎｇ）を水（ｐＨ２）４好に溶
解した。

−に記の新鮮な水（ｐＨ２）中貯蔵品から、八−鎖を始
めに、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることによって、３
３ｘＱ、のバイアル中、室温（〜２５°Ｃ）でＡ−およ
び１：３−鎖類似体の溶液を混合した。ＮａＯＨでｐｏ
を８．０に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生成
を最大にするため、この反応をＲＰ−４逆相Ｉ−Ｉ　Ｐ
　Ｌ　Ｃでモニターした。このクラキシン類似体用に、
本発明による次の条件、すなわち反応１）０．１Ｍトリ
ス（ｐＨ８）、２５℃：初めの１〜２時間はＮ、を通し
、Ｎ、雰囲気下で撹拌する、を用いた。次いで、この反
応液を空気にさらして激しく撹拌した。氷酢酸を加えて
ｐＨ４とすることによってこの結合反応を停止させた。

この混合物を、プレパラティブＨＰ　Ｌ　ＣビダックＣ
４３００°Ａ（５Ｘ　８０ｃ肩）で精製した。クラキシ
ン類似体のピーク（溶出体積：約１４０ｍｆｆ）を集め
、凍結乾燥して１６１１９のヒトクラキシン類似体（ず
なわら、Ｂ−鎖、４０．３％）を回収した。

このクラキソン類似体は、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、ＨＰＬＣ（
第２ａ図参照）および生物検定に、ｌ−リ、完全に純粋
であることがわかった。

”１１１ＭＩ４　　ヒトワラキシン類（Ｖ体Ｉ＋　２　
（１１２３３Ａ２４）Ａピロ−Ｇｌｕ’　ＢＬｙｓ’　
ＢＡｌ　ａ２　＋１還元型のヒトクラキシンへ−鎖（４
１，５１１１ｙ）を水（ｐＨ２，０）８ｍｇに溶解した
。アミノ末端から最初のアミノ酸を削除した還元型のヒ
トクラキンン１３−鎖（Ｒ２−３３ＢＬｙｓ’　ＢＡ　
ｌａ２′）（２３ｍｙ）を水（１）Ｈ２）４１１Ｌｌ！
に溶解した。

上記の新鮮な水（ｐＨ２）中貯蔵品から、Δ−鎖を始め
に、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることに３に一・て、
３３ｍ（ｌのバイアル中、室１ｌｋ（〜２５℃）テΔ−
およびＢ−鎖類仰体の溶液を混合した。Ｎａ０１ｌでｐ
Ｈを８．０に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生
成を最大にするため、この反応をＩｔ　１）−４逆相１
−！　Ｐ　Ｌ　Ｃでモニターした。このクラギソン類似
体用に、本発明に７Ｌる次の条件、ケなわ１′）反応Ｄ
　　Ｏ，１Ｍトリス（ｐＨ（８）、２５℃；初めの１〜
２時間はＮ、を通し、Ｎ、雰囲気下で撹拌４゛る、をＩ
ＩＩいた。次いで、この反応液を空気にさらして激しく
撹拌した。氷酢酸を加えてｐ）＋４とすることによって
この結合反応を停止させた。

この混合物を、プレパラティブＨＰ　Ｌ　ＣビダッタＣ
４３００°Δ（５Ｘ８０ｃｍ）で精製した。クラキノン
類似体のピーク（溶出体積：約１４０１１１２）を集め
、凍結乾燥して７　、５６のヒトクラキシン類似体（す
なわち、Ｂ−鎖、１８．９％）を回収した。

このクラキシン類似体は、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、１−１１）
　Ｌ　Ｃ（第２ａ図参照）および生物検定により、完全
に純粋であることがわかった。

実施例５　ヒトクラキシン類似体Ｈ２（８３３Δ２４）
Ａピｏ−Ｇｌｕ’　ＢＬｙｓ’　ＢＡｌａ”還元型のヒ
トクラキシンＡ−鎖（２００ｍｇ）を水（ｐｌ−１２，
０）４０ｙｆ２に溶解した。還元型のヒトクラキノン１
３−鎖（Ｉ（３３ＢＬｙｓ’　ＢＡｌａ２５）（１００
ｒｓｇ）を水（ｐＨ−１２）　２　（ｌ　ｍ（ｌに溶解
した。

」−記の新鮮な水（ｐＨ２）中貯蔵品から、Ａ−鎖を始
めに、修飾型のＢ−鎖を次いて加えることによつて、１
６５ｉ１２のバイアル中、室温（〜２５℃）で八−お上
びＢ−鎖類似体の溶液を混合しノこ、、Ｎａ０１１でｐ
Ｈを約８．０に調節した。結合ヒトクラキンン類似体の
生成を最大にするため、この反応を１口）＝４逆相ＨＰ
ＬＣでモニターした。このヒトクラキシン類似体用に、
本発明に」こる次の条件、すなわち反応Ｂ　　Ｏ，１Ｍ
グリンン酸すトリウム（ｐＨ８。

０）、ＩｍＭＥＤＴＡ、２　ｍＭ　１）　ｉ”ｌ’、２
４℃、を用いた。この反応液を空気にさらして激（、＜
撹拌した。氷酢酸を加えてｐｌ−１４と′４′ろごとに
よ−１てこの結合反応を停止させた。

この混合物を、プレパラティブＩＩ　１）　Ｌ　Ｃピダ
ツクＣ４３００°Ａ（５Ｘ５０ｃｚ）で精製したヒトク
ラキシン類似体のピーク（溶出体積約１イＯｄ）を集め
、凍結乾燥して１６１１ｙのりラギンン（すなわち、Ｂ
−鎖、９．３％）を回収した。、このヒトクラキシン類
似体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分
析、アミノ末端配列決定、ＩＩＰ　Ｌ　Ｃ（第２ａ図参
照）および生物検定により、５゛１−全に純粋であるこ
とがわかった。

実ｉ綻倒則生物学的検定ラットの子宮収縮インビトロ生物検定は、電気的な刺激
による収縮の存在下で平滑筋を弛緩さ什るヒトクラキン
ンの能力を測定するものである［ルイス（Ｊ、ＳＬ、Ｌ
ｏｕｉｓ、Ｃａｎ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ、　、５９゜５０７−５１２（＋９８１））］。

ネズミの恥骨結合帯インピ゛ト〔１生物検定は、結合組
織に及ぼすクラキシンの変形効果を測定４−るものであ
る［ンコ、タイネ・ソツ等（ＳＬｅｉｎｃＬｚ、＋３．
Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、６
７．１０２（＋９６０））’］ｏ＋４２　（Ｂ２−３３
　　Ａ２４）、Ｂ２（Ｂ３２Δ２４　）　ＢＬｙｓ’　
ＢＡ　ｌａ”、Ｉ−ｒ２（Ｂ３３　　Ａ２４）Ｂｒ、ｙ
ｓ’　ＢＡｌａ２５、および−ト記Ｈ２（Ｂｌ−３３Ａ
２４　）　ｅＬｙｓ’　ＢＡ　ｌａ”’　Ａピロ−Ｇ　
ｌｕ’およびｌ−１２（Ｂ３３　Ａ２４　）　ｅＬｙｓ
’　ＢＡ１　ａ　２６　Ａピロ−Ｇ　ｌｕ’のピロ−Ｇ
ｌｕ型の生物学的な版型反応を比較したところ、ＭＰＳ
およびＲＵＣの両検定において生物学的な１１η性が示
された。ヒトクラキンン類似体およびヒトクラギシンに
ついてのこのＭＰＳのデータを第３図に示ケ。

このＭ１）Ｓ版型反応は、天然のヒトクラキシンとＢ２
（Ｂ２−３３　　Ａ２４）ｅｌＬｙｓ”　ＢＡ１８２°
゛が等価であることを示している（第３図）。１．かじ
、ブタクラキノンは他のクラキンンと比較したとき、そ
の反応は類偏していないようである。３ヒト類仰体およ
び天然配列のヒトクラギシンの４゛へては、ＭＰＳ生物
検定において実質的に区別ｉ〜ろごとかできない。

用いうる精製Ｈ２（Ｂ３３　　Ａ２４）量の故に、投与
範囲の高い方で比較することらできノこ１．ごの結果は
、天然のヒトクラキシンとヒトクラギノン類似型の活性
が同等であることを、１辷４〜０ヒトリッキソンの版型
反応曲線の傾き（Ｊ、類似体のそれとは異なることもあ
る。

ＲＵＣ生物検定においては、ヒトクラキンンとヒトクラ
キンン類似体の傾きは同じである１゜実施例７霊長類の
妊娠にお１）るヒトクラキノン前記の方法を用い、妊娠齢１３０〜１（ｉ（Ｉｌｌの、
期間を合イつせたアカケザルにおいて、２種類のヒトク
ラキシン類似体、Ｉ−ｒ　２　（Ｂ　３３　　Ａ２４）
Ｂ！Ｊｙｓ４　ｅΔ１ａ２５およびｌ−１２（Ｂ２−３
３　　Ａ２４）ｅＬｙｓ’　ＢＡｌａ”を試験した。

観察されたパラメーターに改良型ビノヨップ・スコアー
を用いると、投与型の異なる７種の別個の注入による平
均の頚部変化は３．７単位であった。これらのデータを
第５図に示すが、ここには！００．５０および１０μ２
用量の個々の注入、ならびに他のすべてのＩＯｔｔｇ注
入の平均および２種類の対照が示されている。非注入の
対照サルはポイントあたり２〜１５測定（それぞれが少
なくとｔ）４匹のサルを表す２つのポイントを除いて）
であり、その平均がプロットされていることに注、位。

通常、頚部は、妊娠期間が進行するに従って比較的低用
１■のりラギシンに対して、またはこの期間の初期にク
ラキソンを繰り返し投与することに対して、より感受性
となった。高用量のりラキンン（１０（］または５５０
９ｇは、妊娠期間の比較的初期（＋３（］〜１４０ｄ）
であっても、頚部熟成にａ意の変化（スコアーで１〜１
０の変化を誘起する）をりえろことができた。この頚部
の変化は、子宮の筋電図活性または子宮内圧におＩＪる
矛盾のないすべての変化とは独立して起ごろようであ−
、た。これらの結果は、妊娠期間の最後の第３期の霊長
類において頚部熟成を引き起ご市のに、結合ヒトクラキ
シンが極めて効果的であることを小（２ている。

既知の方法を用いて本発明のヒトクラキノンおよびヒト
クラキシン類似体を配合し、ヒトクラギシンまたはその
類似体を薬学的に許容しうる担体と混合した薬学的に有
用な組成物を調製することができる。その他の必要なヒ
トタンパク質（〕ことえば、ヒト血清アルブミン）を含
む適当な担体およびその配合については、通常の製剤に
関する専門書［たとえば、マーヂン（ｌＥ、Ｗ、Ｍａｒ
Ｌｉｎ）によるトｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃＯｓ］に記載されている
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒｉ・クラギシンおよびその他のりラキシン
、ならびにヒトインスリンのΔわよびｌ（鎖のアミノ酸
配列を示す配列図であり、第２ａ図および第２ｈ図は、
それぞれ＋４２（Ｂ３３　　Δ２４）ＢＬｙｓ’ＢΔ１
ａ２５およびＨ２（１３３３Ａ　２４　）についての鎖
結合反応の経時変化（ＨＰＬＣ測定）を示すグラフであ
り、第３図は、ヒトクラキシン、ヒトクラギンン類似体
おＪ：びブタクラキシンについて測定したＭＩ）Ｓ服里
反応曲線を示すグラフであり、第４図は、ヒトクラキノ
ン類似体を妊娠齢の異なるアカゲザルに投与した後に測
定した改良型ビショプ・スコアーを示すグラフである。特許出願人　ノエネンテク、インコーポレイテッド代理
　人　弁理士　青　山　葆　外１名手続補正書動剣特許庁長官殿　　　昭和６２年　９月２１日２６　　発
明の名称鎖の結合法３、　補正をする者事件との関係　特許出願人住所　アメリカ合衆国カリフォ゛Ｌ・ニア９４０８０、
サウス・サン・フランンスコ、ポイント・サン・ブルー
ノ・ブールバード４６０番名称　ノエネンテクフイ′ンコーポしイテソド４代理人住所　〒５４０　大阪府大阪市東区域見２丁目１番６１
号６、補正の対象　図　面

Claims

【特許請求の範囲】

（１）還元型のヒトリラキシンＡ鎖またはその類似体と
還元型のヒトリラキシンＢ鎖またはその類似体を、ｐＨ
約７．０〜約１２の水性溶媒中、該ヒトリラキシンのＢ
鎖を穏やかに変性してヒトリラキシンまたはヒトリラキ
シン類似体を生成させる条件下で混合することを特徴と
する、ヒトリラキシンのＡ鎖またはその類似体とヒトリ
ラキシンのＢ鎖またはその類似体を結合させてヒトリラ
キシンまたはヒトリラキシン類似体を製造する方法。
（２）還元型のヒトリラキシンＡ鎖および還元型のヒト
リラキシンＢ鎖のそれぞれが、天然のヒトリラキシン（
Ｈ２）のアミノ酸配列を有するものである第（１）項記
載の方法。
（３）還元型のヒトリラキシンＡ鎖および還元型のヒト
リラキシンＢ鎖のそれぞれが、天然のヒトリラキシン（
Ｈ１）のアミノ酸配列を有するものである第（１）項記
載の方法。
（４）還元型のヒトリラキシンＡ鎖が該Ａ鎖の類似体で
ある第（１）項記載の方法。
（５）還元型のヒトリラキシンＢ鎖が該Ｂ鎖の類似体で
ある第（１）項記載の方法。
（６）還元型のヒトリラキシンＢ鎖が、少なくとも２５
から３３個のアミノ酸を有するものであり、該鎖中の少
なくとも１個のメチオニンが置換されている第（１）項
記載の方法。
（７）還元型のヒトリラキシンＢ鎖が、３２個のアミノ
酸まで短くしたものであり、該鎖の４位にリジンおよび
２５位にアラニンを有している第（１）項記載の方法。
（８）該混合を約１５〜約３０℃の温度で行う第（１）
項記載の方法。
（９）該混合を室温で行う第（１）項記載の方法。
（１０）還元型のヒトリラキシンＡ鎖が、該鎖の１位に
ピロ−Ｇｌｕを有するものである第（１）項記載の方法
。
（１１）ヒトリラキシン類似体Ｈ２（Ｂ３３　Ａ２４）
＿ＢＬｙｓ＾４＿ＢＡｌａ＾２＾５。
（１２）ヒトリラキシン類似体Ｈ２（Ｂ２−３３Ａ２４
）＿ＢＬｙｓ＾４＿ＢＡｌａ＾２＾５。
（１３）ヒトリラキシン類似体Ｈ２（Ｂ２−３３Ａ２４
）＿ＢＬｙｓ＾４＿ＢＡｌａ＾２＾５＿Ａピロ−Ｇｌｕ
＾１。
（１４）ヒトリラキシン類似体Ｈ２（Ｂ３３　Ａ２４）
＿ＢＬｙｓ＾４＿ＢＡｌａ＾２＾５＿Ａピロ−Ｇｌｕ＾
１。
（１５）薬学的に許容しうる担体および唯一の活性薬物
としてヒトリラキシンを含有している分娩促進用医薬組
成物。
（１６）薬学的に許容しうる担体および唯一の活性薬物
としてヒトリラキシン類似体を含有している分娩促進用
医薬組成物。