JPS6366198A - 鎖の結合法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
帆系上省(l明り1L
本発明は、ヒトリラキシンのAおよびB鎖、またはヒト
リラキシンのAおよびB鎖類似体を結合させて、生物学
的に活性なヒトリラキシンまたはヒトリラキシン類似体
を有用な収率で製造するための方法、さらに詳しくは、
pHが約7.0以上であり、かつヒトリラキシンのl(
鎖を(、りやかに21’1させる条件下で、還元型のヒ
トリラキシンAおよびB鎖、またはそれらの類仰体を結
合ざUろことからなる方法に関する。反応1υ1間中、
混合物を空気中の酸素に徐々にさらしながら温度を約1
5〜30℃に維持ずろことにより、これらの条(1は、
生物学的に活性なヒトリラキシンまたはその類IU体を
生成させるための環境を提供ずろものであろ1゜また、
本発明は生物学的に活性なヒトリフギノン類似体に関す
る。さらに、本発明はヒトリラキシンまたはその類似体
を1+11°−の活性薬物と4′ろ分娩用医薬組成物に
関オろ。
リラキシンのAおよびB鎖類似体を結合させて、生物学
的に活性なヒトリラキシンまたはヒトリラキシン類似体
を有用な収率で製造するための方法、さらに詳しくは、
pHが約7.0以上であり、かつヒトリラキシンのl(
鎖を(、りやかに21’1させる条件下で、還元型のヒ
トリラキシンAおよびB鎖、またはそれらの類仰体を結
合ざUろことからなる方法に関する。反応1υ1間中、
混合物を空気中の酸素に徐々にさらしながら温度を約1
5〜30℃に維持ずろことにより、これらの条(1は、
生物学的に活性なヒトリラキシンまたはその類IU体を
生成させるための環境を提供ずろものであろ1゜また、
本発明は生物学的に活性なヒトリフギノン類似体に関す
る。さらに、本発明はヒトリラキシンまたはその類似体
を1+11°−の活性薬物と4′ろ分娩用医薬組成物に
関オろ。
人行巷」
ヒトリラキシンは、分娩前の圧路変形に関+J・1−る
卵巣ペプチドであり、従って出産の過程を容易にする[
ハイソウ(llisaw、P、L、 、Pros、So
c、14xp、1liol。
卵巣ペプチドであり、従って出産の過程を容易にする[
ハイソウ(llisaw、P、L、 、Pros、So
c、14xp、1liol。
Med、、23,661−663(1926))、シ、
ワーへ等(Scl+wab+:。
ワーへ等(Scl+wab+:。
C,et al、Biocham、Biophys、I
マOs、comm、 、 75.503570(197
7))、およびノエイムス等(Jano+s、li、
aL at、Nature、267.544−546(
1977))]。リラキノン(」妊振巾のホルモンとし
て多く見られるが、妊娠していない女性ならびに男性に
おいても検出されろ[ブリアント−グリーンウッド(B
ryant−Greenwood、G。
マOs、comm、 、 75.503570(197
7))、およびノエイムス等(Jano+s、li、
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1977))]。リラキノン(」妊振巾のホルモンとし
て多く見られるが、妊娠していない女性ならびに男性に
おいても検出されろ[ブリアント−グリーンウッド(B
ryant−Greenwood、G。
D、、EndocrineIicviews、3.62
−90(1982))およびバイス(Wciss、G、
、Ann、Rev、Physiol、、46.43−5
2(1984))]。
−90(1982))およびバイス(Wciss、G、
、Ann、Rev、Physiol、、46.43−5
2(1984))]。
ブタ、ラット、トラ、サメ、ツノサメおよびヒト由来の
りラキノンのアミノ酸配列が確かめられている。このホ
ルモンは、ジスルフィド結合で結合した2本のペプチド
I(Aお上びBと称せられろ)からなり、Δ鎖に鎖内ジ
スルフィド環(インスリンの乙のと類似している)を有
している。しかし、リラギシンとその他のほとんどのペ
プチドホルモン(インスリンを含む)との間の、驚くべ
き、そして重要な差異は、種間でその構造がかなり異な
っているということである。たとえば、ブタ、ラットお
よびヒI・リラキンンは、アミノ酸位置が5()%以−
1−異なっている。異なる種のりクキシン間で免疫学的
な交差反応性が乏しいこと、およびそれらの特5υ的な
生物学的活性において多数の相違が観察されることは、
このような/C5’l!に、jll、て説明される。
りラキノンのアミノ酸配列が確かめられている。このホ
ルモンは、ジスルフィド結合で結合した2本のペプチド
I(Aお上びBと称せられろ)からなり、Δ鎖に鎖内ジ
スルフィド環(インスリンの乙のと類似している)を有
している。しかし、リラギシンとその他のほとんどのペ
プチドホルモン(インスリンを含む)との間の、驚くべ
き、そして重要な差異は、種間でその構造がかなり異な
っているということである。たとえば、ブタ、ラットお
よびヒI・リラキンンは、アミノ酸位置が5()%以−
1−異なっている。異なる種のりクキシン間で免疫学的
な交差反応性が乏しいこと、およびそれらの特5υ的な
生物学的活性において多数の相違が観察されることは、
このような/C5’l!に、jll、て説明される。
組換えDNA法の適用により、ヒトリラ;1−シンをコ
ードしている遺伝子が111離され、その特徴か調べら
れるようになった[ハドソン等(lludson。1)
et al、、Naturo、3(14,,62g−6
31(1984))才j、1:びハドソン等(llud
son、P、 eL al、、The 11Ml1(I
Journal、:(,23:(3−2339(19
84))]。cDNAおよびゲラムク1ノーンからのヌ
クレオヂド配列の分析により、ヒトリフキソン構造の構
成が、25残基のツクナルペプチド、次いで約32〜3
3アミノ酸θ月3鎖、約105アミノ酸のCペプチド、
および24アミノ酸のA鎖からなることがわかる。ヒト
リラギノノの場合、イントロンがCペプチドの二ノード
化領域を連断している。このCペプチド(インスリンの
(ユペプチドj;りかなり長い)の生理学的な役割、な
らびにAおよび13鎖の末端からのCペプチドの除去に
応答しうる酵素の性質について(J未解決の問題である
。
ードしている遺伝子が111離され、その特徴か調べら
れるようになった[ハドソン等(lludson。1)
et al、、Naturo、3(14,,62g−6
31(1984))才j、1:びハドソン等(llud
son、P、 eL al、、The 11Ml1(I
Journal、:(,23:(3−2339(19
84))]。cDNAおよびゲラムク1ノーンからのヌ
クレオヂド配列の分析により、ヒトリフキソン構造の構
成が、25残基のツクナルペプチド、次いで約32〜3
3アミノ酸θ月3鎖、約105アミノ酸のCペプチド、
および24アミノ酸のA鎖からなることがわかる。ヒト
リラギノノの場合、イントロンがCペプチドの二ノード
化領域を連断している。このCペプチド(インスリンの
(ユペプチドj;りかなり長い)の生理学的な役割、な
らびにAおよび13鎖の末端からのCペプチドの除去に
応答しうる酵素の性質について(J未解決の問題である
。
ヒトリラキシンの場合、2f117類の別個の遺伝r−
配列が同定されている(同」―)。これら遺伝子のうち
の1つ(+−12)た(Jが妊娠中に卵巣で発現され、
他の遺伝子が別の組織部位で発現されるのがどうか、あ
るいはそれか偽遺伝子を表すのかどうかについてはイつ
かっていない。この2種類のヒトリラキシンの遺伝子は
互いに、かなりのヌクレオチドお、1びアミノ酸相同性
を、特にBおよびCペプチドにおいて示す。しかし、配
列が相違するやや顕署な領域が、特にAおよびB両鎖の
アミノ末端領域において存在している(第1図参照)。
配列が同定されている(同」―)。これら遺伝子のうち
の1つ(+−12)た(Jが妊娠中に卵巣で発現され、
他の遺伝子が別の組織部位で発現されるのがどうか、あ
るいはそれか偽遺伝子を表すのかどうかについてはイつ
かっていない。この2種類のヒトリラキシンの遺伝子は
互いに、かなりのヌクレオチドお、1びアミノ酸相同性
を、特にBおよびCペプチドにおいて示す。しかし、配
列が相違するやや顕署な領域が、特にAおよびB両鎖の
アミノ末端領域において存在している(第1図参照)。
H2リラキシンが卵巣で合成され、発現されるという事
実(J、これが妊娠生理に包含される配列であることを
示唆する3、最近の報告では、ジョンストン等[Joh
nston、P、I)eL al、、ベプヂド、構造と
機能、Pr。
実(J、これが妊娠生理に包含される配列であることを
示唆する3、最近の報告では、ジョンストン等[Joh
nston、P、I)eL al、、ベプヂド、構造と
機能、Pr。
c、N1nLh Am(!rican Peptide
Symposium、 Deber、CM、、 l1
ruby、V、 lおよびKopple、F、D編(P
ierce Chem社、p+85)]が、合成ヒトリ
ラキシン(H2)およびある種のヒトリラギンン類似体
について生物学的な活性を試験し、生物学的な活性に必
要なりラキシンの核、ならびに生物学的な活性に影響す
ることのない、メチオニンのある種のアミノ酸への置換
を明らかにした。
Symposium、 Deber、CM、、 l1
ruby、V、 lおよびKopple、F、D編(P
ierce Chem社、p+85)]が、合成ヒトリ
ラキシン(H2)およびある種のヒトリラギンン類似体
について生物学的な活性を試験し、生物学的な活性に必
要なりラキシンの核、ならびに生物学的な活性に影響す
ることのない、メチオニンのある種のアミノ酸への置換
を明らかにした。
第1図は、種々の種由来のりラキンンの既知のアミノ酸
配列を比較したものである。6個のノステイン残基およ
びこれに接4−ろグリノン残」1(に加えて、B鎖中7
位のイソロイノン、12お3」−び16位のアルギニン
、および32位のtフィシンだ(」が保存されている。
配列を比較したものである。6個のノステイン残基およ
びこれに接4−ろグリノン残」1(に加えて、B鎖中7
位のイソロイノン、12お3」−び16位のアルギニン
、および32位のtフィシンだ(」が保存されている。
ノスティン残JIkは、明らかに、全体のジスルフィド
結合の立体配置を随行4゛るのに必須である[ブルンデ
ル等(旧旧1市+lI、T、 eL al、): Bi
ology of Re1axin and its
Role in Lhe lluman、 Bigaz
zi、MXGreenwood、P、CおよびGa5p
ari。
結合の立体配置を随行4゛るのに必須である[ブルンデ
ル等(旧旧1市+lI、T、 eL al、): Bi
ology of Re1axin and its
Role in Lhe lluman、 Bigaz
zi、MXGreenwood、P、CおよびGa5p
ari。
F1編、14−21頁(1シxccrpta Medi
ca、Am5t++rdam、 1983)]。リシラ
キン9−r(すなわら、リラキンンタンパク質の活性部
分を含有しているΔお」;び■3鎖)中の大部分の位置
における、アミノ酸配列の種間の相違はかなりのもので
ある。このことは、インスリンを含む実際にその他すべ
てのペブヂトホルモン類の状況と際たって対照的である
。、このリフキンン構造の別の特徴は、I3鎖の)′ミ
ノお、l;びカル−7= ポキン末端領域、ならびにその程度は少ないがA鎖のア
ミノ末端で見られる長さの違いである。
ca、Am5t++rdam、 1983)]。リシラ
キン9−r(すなわら、リラキンンタンパク質の活性部
分を含有しているΔお」;び■3鎖)中の大部分の位置
における、アミノ酸配列の種間の相違はかなりのもので
ある。このことは、インスリンを含む実際にその他すべ
てのペブヂトホルモン類の状況と際たって対照的である
。、このリフキンン構造の別の特徴は、I3鎖の)′ミ
ノお、l;びカル−7= ポキン末端領域、ならびにその程度は少ないがA鎖のア
ミノ末端で見られる長さの違いである。
リラギンンの化学的な合成は、主として単離した13鎖
の構造的特徴および異常な溶解性の結果から、特に困難
であった[トレジャー等(Tregear 、 G。
の構造的特徴および異常な溶解性の結果から、特に困難
であった[トレジャー等(Tregear 、 G。
WcL at、): rliology of Re1
axin and its Rolein the l
lumans BigazzilM、、Greenwo
od、F、C,およびGa5pari、P編、42−5
5頁(Excerpta Medica、Amster
dam、 1983)−18 」−記のように、ヒトリラキシンおよび事実上哺乳動物
リラキシンは、一般的に言ってインスリンとある構造」
−の類似性を有している。インスリンおよびリラキシン
の両者は、2本の鎖の間に鎖内および鎖間ジスルフィド
結合を有している[ジエイムス等(James、R,e
t al、、Nature、267.544(1977
))、ならびにンユワーベおよびマクドナルト(Sch
wabc、c、 and McDonald、J、R,
,5cience、+97,914(1977))j、
インスリンに対して用いてうまくいった合成法[ブツセ
お3にびカーペンタ−(Busse、W、D、 and
Carponter 、 P、Il、 、 Bioch
emistry 、 1−5 、1649 、 (19
76))、カツォヤニス等(Katsoyannis、
P、G、 (!t al、、1liocl+emist
ry、6.2656(1967))、ならびにクン等(
Kung、YT、 et al、、5cientia
5inica、15.5+1l(1966)]が、リラ
キシンに対しても適用できるものと推定された。トレジ
ャー等[1’regear、G、 at al、+ R
a1axin。
axin and its Rolein the l
lumans BigazzilM、、Greenwo
od、F、C,およびGa5pari、P編、42−5
5頁(Excerpta Medica、Amster
dam、 1983)−18 」−記のように、ヒトリラキシンおよび事実上哺乳動物
リラキシンは、一般的に言ってインスリンとある構造」
−の類似性を有している。インスリンおよびリラキシン
の両者は、2本の鎖の間に鎖内および鎖間ジスルフィド
結合を有している[ジエイムス等(James、R,e
t al、、Nature、267.544(1977
))、ならびにンユワーベおよびマクドナルト(Sch
wabc、c、 and McDonald、J、R,
,5cience、+97,914(1977))j、
インスリンに対して用いてうまくいった合成法[ブツセ
お3にびカーペンタ−(Busse、W、D、 and
Carponter 、 P、Il、 、 Bioch
emistry 、 1−5 、1649 、 (19
76))、カツォヤニス等(Katsoyannis、
P、G、 (!t al、、1liocl+emist
ry、6.2656(1967))、ならびにクン等(
Kung、YT、 et al、、5cientia
5inica、15.5+1l(1966)]が、リラ
キシンに対しても適用できるものと推定された。トレジ
ャー等[1’regear、G、 at al、+ R
a1axin。
BryanL−Greenwood、G、I)、、N1
a11,11.1)l’;よびGr(1(1nwood
、P、C,編、Elsavier、New York、
1981 lid:、ンスティン・スルヒドリル類の
選択保1穫を利用4−る個別鎖(セパレートヂエイン)
アブローヂを用いζリラキシンを合成しようとしノこ1
.このインスリン法によって調製された合成ペプチド(
J検出i−+f能なりラキシン様の生物学的反応性をr
T するが、その特異的な活性および結合の収率は極め
てイ氏が・た(同上)。ブタリラキシンにおいて111
3合収率が賎いことの理由の1つは、完全な長さのブタ
1(鎖が1)1−110 、5の溶液において溶解しな
いというごとによっていた。トレジャー等(−に記)け
、先(+技術であるインスリン結合法を、2つの点で、
・トなイ)ち混合したブタリラキンンペブヂド鎖をアセ
トンで沈澱させて還元剤を除去すること、わ、l、ひ酸
化上程中に0,5M NaCf!を加えることで変更を
加えた。この結果、ブタリフキノンの収率が改善された
(欧州特許出願No、83.304662.6および欧
州特許出願No、83307553.4をも参照)。
a11,11.1)l’;よびGr(1(1nwood
、P、C,編、Elsavier、New York、
1981 lid:、ンスティン・スルヒドリル類の
選択保1穫を利用4−る個別鎖(セパレートヂエイン)
アブローヂを用いζリラキシンを合成しようとしノこ1
.このインスリン法によって調製された合成ペプチド(
J検出i−+f能なりラキシン様の生物学的反応性をr
T するが、その特異的な活性および結合の収率は極め
てイ氏が・た(同上)。ブタリラキシンにおいて111
3合収率が賎いことの理由の1つは、完全な長さのブタ
1(鎖が1)1−110 、5の溶液において溶解しな
いというごとによっていた。トレジャー等(−に記)け
、先(+技術であるインスリン結合法を、2つの点で、
・トなイ)ち混合したブタリラキンンペブヂド鎖をアセ
トンで沈澱させて還元剤を除去すること、わ、l、ひ酸
化上程中に0,5M NaCf!を加えることで変更を
加えた。この結果、ブタリフキノンの収率が改善された
(欧州特許出願No、83.304662.6および欧
州特許出願No、83307553.4をも参照)。
ヂャンス等[Chanceet al 米国特許No
、4,421.685(1983年12月20日発行)
]は、還元および酸化反応を1−1−程で行うべく、イ
ンスリンのΔおよびIλ鎖のS−スルボネート化形を、
水性溶媒中、コントロールされたp I−Tおよび温度
下で、チオール還元剤と混合することによってインスリ
ンまたはその類似体を製造する方法を開示している。こ
の方法は、前記のインスリン合成法に優る改良法として
提供されたものであるが、ヒトリフキシンの合成には適
用できないことがわかった。
、4,421.685(1983年12月20日発行)
]は、還元および酸化反応を1−1−程で行うべく、イ
ンスリンのΔおよびIλ鎖のS−スルボネート化形を、
水性溶媒中、コントロールされたp I−Tおよび温度
下で、チオール還元剤と混合することによってインスリ
ンまたはその類似体を製造する方法を開示している。こ
の方法は、前記のインスリン合成法に優る改良法として
提供されたものであるが、ヒトリフキシンの合成には適
用できないことがわかった。
発明の概要
ここに本出願人等は、特定の反応条件下、ヒトリフキシ
ンの還元鎖を=1ントロールされた条件下で結合させる
ことによって、有用なレベルのヒトリフキシンよたはそ
の類仰体を製造ずろことができろことを見い出した。す
なわち、本発明の目的は、ヒトリフキシンのAおよびB
鎖(その出所、たとえば化学合成によるものであるか、
また(」相換えDNA法(こよるものであるかを間イ)
ない)を結合させて有用な収率の生物学的に活(11な
ヒトリフキシンを製造するための方法を提供するごとで
ある。
ンの還元鎖を=1ントロールされた条件下で結合させる
ことによって、有用なレベルのヒトリフキシンよたはそ
の類仰体を製造ずろことができろことを見い出した。す
なわち、本発明の目的は、ヒトリフキシンのAおよびB
鎖(その出所、たとえば化学合成によるものであるか、
また(」相換えDNA法(こよるものであるかを間イ)
ない)を結合させて有用な収率の生物学的に活(11な
ヒトリフキシンを製造するための方法を提供するごとで
ある。
本発明の別の態様は、生物学的に活P1なヒトリラキシ
ン類似体を製造することである3゜本発明のさらに別の
態様は、分娩用にヒトリフキシンまたはその類似体を用
いることである1゜本発明は、ヒトリラキシンのA鎖」
二たはその類似体とヒトリラキシンのB鎖また(」その
類貝陣を結合させて生物学的に活性なヒトリラキシン」
・たはヒトリフキシン類(口体を製造セるための方t]
、に関ずろ。特に本方法は、還元型のヒトリフキシンA
鎖またはその類似体と還元型のヒトリシギノンB鎖また
はその類似体を、pLIが約7.()以1−であること
を含む、ヒトリラギソンの11鎖を穏やかに変性させる
条件下で混合し、反応期間中、空気中の酸素に少しずつ
さらしながら反応を?1うことからなる。
ン類似体を製造することである3゜本発明のさらに別の
態様は、分娩用にヒトリフキシンまたはその類似体を用
いることである1゜本発明は、ヒトリラキシンのA鎖」
二たはその類似体とヒトリラキシンのB鎖また(」その
類貝陣を結合させて生物学的に活性なヒトリラキシン」
・たはヒトリフキシン類(口体を製造セるための方t]
、に関ずろ。特に本方法は、還元型のヒトリフキシンA
鎖またはその類似体と還元型のヒトリシギノンB鎖また
はその類似体を、pLIが約7.()以1−であること
を含む、ヒトリラギソンの11鎖を穏やかに変性させる
条件下で混合し、反応期間中、空気中の酸素に少しずつ
さらしながら反応を?1うことからなる。
回部−の]免剰]。
第1図(J1ヒトリラキシンHIおよびB2と、ヒトイ
ンスリンならびにブタ(P)およびラット(R)リラギ
シンの相同性の欠如を示すものである。
ンスリンならびにブタ(P)およびラット(R)リラギ
シンの相同性の欠如を示すものである。
数字は112リラキノンに基づいて付されている。
リラギンン類のジスルフィドは、Al0−A15、A
I 1−、 +111およびA24−223である。
I 1−、 +111およびA24−223である。
第2(a)図および第2(b)図は、インビトロでの錯
結合反応のそれぞれ+12(B33 A24)eLy
s’ BAIa2′および[2(+333 A24)
のプロファイルについてのf−r I) L C経時変
化を示している。
結合反応のそれぞれ+12(B33 A24)eLy
s’ BAIa2′および[2(+333 A24)
のプロファイルについてのf−r I) L C経時変
化を示している。
潜在的にポラなΔ鎖の分子内酸化された中間体、お、J
:びヒトリフキシン類似体またはヒトリフキシンの生成
を示す結合反応の経時変化が描かれている。遺伝子2の
AおよびB鎖ペプヂドの、ト【2ヒトリフキシン類似体
またはI−12ヒトリラキシンへの変換か描かれている
。シンクロパック(Synchr。
:びヒトリフキシン類似体またはヒトリフキシンの生成
を示す結合反応の経時変化が描かれている。遺伝子2の
AおよびB鎖ペプヂドの、ト【2ヒトリフキシン類似体
またはI−12ヒトリラキシンへの変換か描かれている
。シンクロパック(Synchr。
pakMt P −C4クロマトグラフイーを用いた(
4゜6x250xx ;300A”)。0.05%TF
A。
4゜6x250xx ;300A”)。0.05%TF
A。
■]20緩衝液中、アセトニトリルの直線勾配(500
分で15 → 60%)として、これをl7IIL’分
で流した。
分で15 → 60%)として、これをl7IIL’分
で流した。
第3図は、錯結合したヒト遺伝r2のワラ;1−ソンH
2(B2−33 A24)BLys’ [3Δ)a2
1+および天然のヒトリフキシンの生物学的活性(M1
)ε;)を示している。
2(B2−33 A24)BLys’ [3Δ)a2
1+および天然のヒトリフキシンの生物学的活性(M1
)ε;)を示している。
第4図は、種々用量のヒトリフキシン類似体、すなわち
B2(132−33A24)oLys’eΔ1a25お
よびll2(B33 A24 ) BLys’ BΔ
Ia2′′を投与した後の、霊長類にお(−する改良型
ビンヨブ・スコアー(Bishop 5core)を示
している(1詳細な説明 本明細書で用いる「ヒトリフキシン−1または(ヒトリ
フキシン類似体」なる語句は、産路を変形させて出産の
過程を容易にすることが知られている機能的なタンパク
質を指す。産路の変形に(j、頚部の熟成、妊娠子宮の
内膜を厚くすることおよびこの領域への血管新生の増加
、ならびにコラーゲン合成に及ぼず影響、などの生理学
的な作用も含まれているしのと解する。ヒトリラキシン
は女性の胸部にム見い出されるが、これは乳汁分泌と関
係しているのであろう。また、ヒトリラキシンはヒト精
液にら見い出されるが、これはヒト精子の移動度を高め
るのであろう。頚部にリラキンンの効果がイ・I’ ”
j、されると、ヒトリラキノンはヒト頚部に入り込む精
r・の能力を増大させるのであろう。
B2(132−33A24)oLys’eΔ1a25お
よびll2(B33 A24 ) BLys’ BΔ
Ia2′′を投与した後の、霊長類にお(−する改良型
ビンヨブ・スコアー(Bishop 5core)を示
している(1詳細な説明 本明細書で用いる「ヒトリフキシン−1または(ヒトリ
フキシン類似体」なる語句は、産路を変形させて出産の
過程を容易にすることが知られている機能的なタンパク
質を指す。産路の変形に(j、頚部の熟成、妊娠子宮の
内膜を厚くすることおよびこの領域への血管新生の増加
、ならびにコラーゲン合成に及ぼず影響、などの生理学
的な作用も含まれているしのと解する。ヒトリラキシン
は女性の胸部にム見い出されるが、これは乳汁分泌と関
係しているのであろう。また、ヒトリラキシンはヒト精
液にら見い出されるが、これはヒト精子の移動度を高め
るのであろう。頚部にリラキンンの効果がイ・I’ ”
j、されると、ヒトリラキノンはヒト頚部に入り込む精
r・の能力を増大させるのであろう。
ヒトリラキシンが結合組織に作用すると、皮膚の弾性を
改善することもある。
改善することもある。
1−記の機能的な定義に加えて、ヒトリラキシン類仰体
に(」、構造的に、AおよびB鎖を含むヒトリラキシン
の基本的な構造を有している多数のタンパク質が含まれ
る。このヒトリラキノン類似体は、生物学的なりラギシ
ン様の活性が保持されるように注意しなから、ヒトリラ
キシンのAおよび/またはB鎖中の1またはそれ以」二
のアミノ酸残基を置換、削除、イ」加あるいは修飾する
ことによって、天然のヒトリラキシンと異なったものと
なっている。このようなヒトリラキシン類似体の例には
、完全な長さのA鎖およびカルボキシ末端を短くしたB
鎖を有する、II I (r(227A24)eA I
a”、I(2(112−25A24)、II 2 (1
(33A24)、I−+2(1333A2 /I)eL
ys’ DΔ1a25、R2(R2−33A24)eL
ys’ eAl a 2”、R2(R2−33A24)
A ピ〔) Glu’ Bl 、yS’ BA I
a25、およびII 2 (+’333 A24)A
ピclGlu’ BLys’ BAla”’が含まれる
が、これらに限定はされない。ここで用いる用語は以ド
のようである。
に(」、構造的に、AおよびB鎖を含むヒトリラキシン
の基本的な構造を有している多数のタンパク質が含まれ
る。このヒトリラキノン類似体は、生物学的なりラギシ
ン様の活性が保持されるように注意しなから、ヒトリラ
キシンのAおよび/またはB鎖中の1またはそれ以」二
のアミノ酸残基を置換、削除、イ」加あるいは修飾する
ことによって、天然のヒトリラキシンと異なったものと
なっている。このようなヒトリラキシン類似体の例には
、完全な長さのA鎖およびカルボキシ末端を短くしたB
鎖を有する、II I (r(227A24)eA I
a”、I(2(112−25A24)、II 2 (1
(33A24)、I−+2(1333A2 /I)eL
ys’ DΔ1a25、R2(R2−33A24)eL
ys’ eAl a 2”、R2(R2−33A24)
A ピ〔) Glu’ Bl 、yS’ BA I
a25、およびII 2 (+’333 A24)A
ピclGlu’ BLys’ BAla”’が含まれる
が、これらに限定はされない。ここで用いる用語は以ド
のようである。
HI、I−12はヒトリラキシンをコードしている2種
類のヒト遺伝子を指゛、1oII 2 +Jヒト卵卵巣
−0現現れろことがイつかっているが、Ifl+、、i
ゲノノ、り11−ンとしてだけ見い出されろ。Δお上び
1〜はヒトリラキシンのそれぞれの鎖を表す3.ΔJξ
たiJ:llに続く数字は鎖の長さ、すなわ1′)Δ−
また(月1鎖を構成しているアミノ酸の数を表4−1.
アミノ酸(J通常の3文字表示で表す。アミノ酸の萌の
ド文字(1アミノ酸が位置しているΔ−また(」13鎖
を表し、アミノ酸の後のに一1文字は鎖」−の位置を表
4−31リラキンンのA−およびB−鎖また(Jその類
似鎖は、液相あるいは固相法を含む古典的なタンパク質
合成法によって、または組換えDNA法を用いて、また
は天然のヒトリラキシンからの調製によって、または−
に記の組合わせによって、たとえば鎖の1本を化学合成
で、他方を組換えDNA法で調製することによって得る
ことができる。個々のペプチド鎖を固相法によって合成
した[バラニーおよびメリーフィールド(Barany
、G、 and Merrifield、R,B、)、
The Peptides、 2 、Gross、E、
およびMeianhorcr、J 編、Academ
ic Press、ニューヨーク、1−284(+9+
’to)]。保護されたN−t−プチルオキン力ルポニ
ルアミノ酸は、ペニンスラ・ラボラトリーズ社(Pen
insula Laboratories Inc、)
から購入した。以下に挙げる側鎖保護、すなわちArg
)シル、Δsnキザンチル、Aspベンジルエステル、
Cysメトキンベンジル、Ginキザンチル、Gluベ
ンジルJ、ステル、His トンル、Lyso−クロロ
ベンノルオギン力ルボニル、Serベンジル、1’hr
ベンジル、Tyr2,6−ジクロロベンジルを用いた。
類のヒト遺伝子を指゛、1oII 2 +Jヒト卵卵巣
−0現現れろことがイつかっているが、Ifl+、、i
ゲノノ、り11−ンとしてだけ見い出されろ。Δお上び
1〜はヒトリラキシンのそれぞれの鎖を表す3.ΔJξ
たiJ:llに続く数字は鎖の長さ、すなわ1′)Δ−
また(月1鎖を構成しているアミノ酸の数を表4−1.
アミノ酸(J通常の3文字表示で表す。アミノ酸の萌の
ド文字(1アミノ酸が位置しているΔ−また(」13鎖
を表し、アミノ酸の後のに一1文字は鎖」−の位置を表
4−31リラキンンのA−およびB−鎖また(Jその類
似鎖は、液相あるいは固相法を含む古典的なタンパク質
合成法によって、または組換えDNA法を用いて、また
は天然のヒトリラキシンからの調製によって、または−
に記の組合わせによって、たとえば鎖の1本を化学合成
で、他方を組換えDNA法で調製することによって得る
ことができる。個々のペプチド鎖を固相法によって合成
した[バラニーおよびメリーフィールド(Barany
、G、 and Merrifield、R,B、)、
The Peptides、 2 、Gross、E、
およびMeianhorcr、J 編、Academ
ic Press、ニューヨーク、1−284(+9+
’to)]。保護されたN−t−プチルオキン力ルポニ
ルアミノ酸は、ペニンスラ・ラボラトリーズ社(Pen
insula Laboratories Inc、)
から購入した。以下に挙げる側鎖保護、すなわちArg
)シル、Δsnキザンチル、Aspベンジルエステル、
Cysメトキンベンジル、Ginキザンチル、Gluベ
ンジルJ、ステル、His トンル、Lyso−クロロ
ベンノルオギン力ルボニル、Serベンジル、1’hr
ベンジル、Tyr2,6−ジクロロベンジルを用いた。
最初のアミノ酸を、ジメチルホルムアミド中、フッ化カ
リウl\を用いてクロロメチルポリメチレン(1%ノビ
ニルベンゼン)−1−に」−スアル化した。置換レベル
は0.6m内当119とした。、7ミノ酸を、塩化メチ
レン中、蒸留ジシク【!へギンル力ルポジイミドでカッ
プリングさUた、3アルギニン、アスパラギン、グルタ
ミン、〔フィシン、およびシスティン残基を、5015
0 塩化メヂレン/ジメヂルホルムアミド中でカップリ
ングさlた。
リウl\を用いてクロロメチルポリメチレン(1%ノビ
ニルベンゼン)−1−に」−スアル化した。置換レベル
は0.6m内当119とした。、7ミノ酸を、塩化メチ
レン中、蒸留ジシク【!へギンル力ルポジイミドでカッ
プリングさUた、3アルギニン、アスパラギン、グルタ
ミン、〔フィシン、およびシスティン残基を、5015
0 塩化メヂレン/ジメヂルホルムアミド中でカップリ
ングさlた。
t−ブヂルオキシ力ルボニル基の除去は、45%トリフ
ルオロ酢酸、5%アニソール、5%J、タンジチオール
および45%塩化メチレンを用いて行った。カップリン
グさせる前の中和は、塩化メチレン中、IO%トリエヂ
ルアミンを用いて行うた3゜樹脂からの切り出し、およ
び4−べての保護」1(の除去は、無水の液体フッ化水
素を用い、)′ニソールおよびメヂルエヂルスルフィド
の存在l’(2fl+:(: 1 v/ v/ v)
、0°Cて1時間処理4′ることに、1: =。
ルオロ酢酸、5%アニソール、5%J、タンジチオール
および45%塩化メチレンを用いて行った。カップリン
グさせる前の中和は、塩化メチレン中、IO%トリエヂ
ルアミンを用いて行うた3゜樹脂からの切り出し、およ
び4−べての保護」1(の除去は、無水の液体フッ化水
素を用い、)′ニソールおよびメヂルエヂルスルフィド
の存在l’(2fl+:(: 1 v/ v/ v)
、0°Cて1時間処理4′ることに、1: =。
て行った。10%酢酸水溶液を用いてIIツυ)△鎖を
樹脂から取り出し、これを凍結乾燥1刀コ、、粗製のB
−鎖は、始めに80%アセトニトリル水溶液で、次に3
0%酢酸水溶液で洗浄4るごとに、1−・て樹脂から取
り出し、次いで水で希釈し、凍結乾燥した。これらの粗
製ペプチドを100mモルのジヂオトレイトールに溶解
し、次いて多量のlO%アセトニトリルおよび01%ト
リフルオロ酢酸の水溶液中に希釈した。これらの溶液を
、ビダックCl8(Vydac C10; 300A°
15−20ミクロン)を詰めた5X55czのカラム
にかけ、01%トリフルオロ酢酸水溶液で洗浄した後、
アセトニトリルの勾配溶液で溶離した。ペプチドのフラ
クン=lンを集め、凍結乾燥し、アミノ酸組成配列決定
および分析用逆相I(P L Oによって分析し)こ。
樹脂から取り出し、これを凍結乾燥1刀コ、、粗製のB
−鎖は、始めに80%アセトニトリル水溶液で、次に3
0%酢酸水溶液で洗浄4るごとに、1−・て樹脂から取
り出し、次いで水で希釈し、凍結乾燥した。これらの粗
製ペプチドを100mモルのジヂオトレイトールに溶解
し、次いて多量のlO%アセトニトリルおよび01%ト
リフルオロ酢酸の水溶液中に希釈した。これらの溶液を
、ビダックCl8(Vydac C10; 300A°
15−20ミクロン)を詰めた5X55czのカラム
にかけ、01%トリフルオロ酢酸水溶液で洗浄した後、
アセトニトリルの勾配溶液で溶離した。ペプチドのフラ
クン=lンを集め、凍結乾燥し、アミノ酸組成配列決定
および分析用逆相I(P L Oによって分析し)こ。
インスリンまたはブタリラキシン用の先行技術で用いら
れていたような、スルポン化またはその他の誘導体化[
ミーンズおよびフィーニー(Mcans、G、I:、
and Peeney、R,E、、Chemical
Modification of Proteins(
1971))]によってはノステイン残基を保護しtJ
′かった。本発明方法に従って、ヒトリラギンンのA−
およびB−鎖をその還元型に保つことによって、改善さ
れた収率およびペプチドの溶解性が得られろ。この還元
型の、凍結乾燥されたA−および13−鎖を、スルホン
化誘導体に変換することまたは他のンスヂンチ1−ルの
ブtJツタ剤を用いることなく、直接すべての111結
合反応に用いた。
れていたような、スルポン化またはその他の誘導体化[
ミーンズおよびフィーニー(Mcans、G、I:、
and Peeney、R,E、、Chemical
Modification of Proteins(
1971))]によってはノステイン残基を保護しtJ
′かった。本発明方法に従って、ヒトリラギンンのA−
およびB−鎖をその還元型に保つことによって、改善さ
れた収率およびペプチドの溶解性が得られろ。この還元
型の、凍結乾燥されたA−および13−鎖を、スルホン
化誘導体に変換することまたは他のンスヂンチ1−ルの
ブtJツタ剤を用いることなく、直接すべての111結
合反応に用いた。
本発明方法を実施ずろに際し、ヒ]・リフキノンのA−
およびI(−鎖、または類似の△わよびIN lil’
1を結合させてヒトリラギンンま)こはヒトリシキノン
類似体を形成させるには、−・方の鎖と他方の鎖の比率
を広範囲に変化させてこれを行うごとかできる。らちる
んこの結合は、八である)か]吃であろうが、量の少な
い方の鎖によ−・て本質的に制限される。過剰の13−
鎖は鎖の結合を抑制し、13鎖と等しいか、またはわず
かに過剰のΔ鎖1tt (モル)であることが好ましい
。必須ではないか、L)4゛れの場合においても、通常
Δ−鎖の13鎖に対4°る比は約1:0.5〜約3.0
:I(市m比)である。Δ鎖の13−鎖に対する比率、
約III〜約2.5:I(市重圧)を用いて本発明を実
施するのかさらに好よしい。また、この好ましい範囲内
の、ある範囲か特定のりラキソン類似体の製造に特にf
r利であろことを見いだした。すなわち、ヒトリラキソ
ンのAおよびI(−鎖を結合させて脱メチオニンリラキ
ンンを製造する際には、A−鎖のB−鎖に対する比(」
約!、21〜約2.1の範囲内であることが好ましい、
。
およびI(−鎖、または類似の△わよびIN lil’
1を結合させてヒトリラギンンま)こはヒトリシキノン
類似体を形成させるには、−・方の鎖と他方の鎖の比率
を広範囲に変化させてこれを行うごとかできる。らちる
んこの結合は、八である)か]吃であろうが、量の少な
い方の鎖によ−・て本質的に制限される。過剰の13−
鎖は鎖の結合を抑制し、13鎖と等しいか、またはわず
かに過剰のΔ鎖1tt (モル)であることが好ましい
。必須ではないか、L)4゛れの場合においても、通常
Δ−鎖の13鎖に対4°る比は約1:0.5〜約3.0
:I(市m比)である。Δ鎖の13−鎖に対する比率、
約III〜約2.5:I(市重圧)を用いて本発明を実
施するのかさらに好よしい。また、この好ましい範囲内
の、ある範囲か特定のりラキソン類似体の製造に特にf
r利であろことを見いだした。すなわち、ヒトリラキソ
ンのAおよびI(−鎖を結合させて脱メチオニンリラキ
ンンを製造する際には、A−鎖のB−鎖に対する比(」
約!、21〜約2.1の範囲内であることが好ましい、
。
最適レベルで本発明方法を実施するのに重要な別のパラ
メーターは反応溶媒中のタンパク質濃度である。広範囲
のタンパク質濃度を用いて本方法をうまく行うことがで
きる。しかし一般的には、タンパク質濃度は反応溶媒I
Mρあたり約0.1〜約10M9の範囲であろう。好ま
しくは、タンパク質濃度は約0.5〜約5m177m(
lの範囲内であろう。
メーターは反応溶媒中のタンパク質濃度である。広範囲
のタンパク質濃度を用いて本方法をうまく行うことがで
きる。しかし一般的には、タンパク質濃度は反応溶媒I
Mρあたり約0.1〜約10M9の範囲であろう。好ま
しくは、タンパク質濃度は約0.5〜約5m177m(
lの範囲内であろう。
また、この後者の範囲内において、最適タンパク質濃度
が製造されるヒトリラキシンに依存して変イつろことを
ここでも見い出した。
が製造されるヒトリラキシンに依存して変イつろことを
ここでも見い出した。
本発明の方法は水性溶媒中で行なイっれる。溶媒のpH
(室温で測定)は、通常的7.0〜約12の範囲である
。約7.5〜約11.0であることが好ましく、約8.
0〜約10.6の範囲内に保つのが最適である。適当な
緩衝剤を加えることによって溶媒のpHを所望の範囲内
に保つことができる11代表的な緩衝剤は、たとえばグ
リンネ−1・、カーホネート、トリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン、ピロポスフェートおよび叶■を上記
の範囲内にコントロールしうるその伸開様の試薬である
。 ・般的かっ好ましい緩衝剤は、トリス(ヒト「1ギ
ソメチル)アミノメタン(pH8〜9)およびグリシネ
ート(pH9、5〜11.0)である。
(室温で測定)は、通常的7.0〜約12の範囲である
。約7.5〜約11.0であることが好ましく、約8.
0〜約10.6の範囲内に保つのが最適である。適当な
緩衝剤を加えることによって溶媒のpHを所望の範囲内
に保つことができる11代表的な緩衝剤は、たとえばグ
リンネ−1・、カーホネート、トリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン、ピロポスフェートおよび叶■を上記
の範囲内にコントロールしうるその伸開様の試薬である
。 ・般的かっ好ましい緩衝剤は、トリス(ヒト「1ギ
ソメチル)アミノメタン(pH8〜9)およびグリシネ
ート(pH9、5〜11.0)である。
混合反応は、約15〜約30℃の温度で、好ましくは約
20〜約25℃で、最ム好ましく(」室温で行なわれる
。
20〜約25℃で、最ム好ましく(」室温で行なわれる
。
緩衝剤の濃度は、一般的には約0.025M〜約0.2
Mの範囲である。好ましくは約(05M〜約0.15M
であり、最も好ましくは約0 、 l tvlである。
Mの範囲である。好ましくは約(05M〜約0.15M
であり、最も好ましくは約0 、 l tvlである。
本方法の条件の1つは、空気中の酸素に暴νに4〜るこ
とをコントロールしうる環境下で行うことである。始め
にすべての溶液をN、置換12、反応の開始時に密閉し
た容器中で反応液をN、置換し、密閉した容器中で反応
液を直接空気(ごの容器を開くことによって)に、また
は酸素(溶媒中にバブリングすることによって)に暴露
することによってコントロールされた酸化が達成される
ことを見い出した5゜ 本方法の別の条件は、ヒトリラキシンB−鎖が穏やかに
変性される条件下で反応を行うことである。当分野で知
られている変性剤、たとえば尿素、グアニノン塩酸塩、
およびその他のカオトロピック試薬類、塩類、清浄剤類
、および有機溶媒(アセトニトリル、アルコール類、ジ
メチルホルムアミド等)を用いることができる。尿素お
よびアセトニトリルか好ましく、数%(体積比:10%
以下)のf1機溶媒は、ヒトリラキシンB−鎖を穏やか
に変性°4゛る条件にする。
とをコントロールしうる環境下で行うことである。始め
にすべての溶液をN、置換12、反応の開始時に密閉し
た容器中で反応液をN、置換し、密閉した容器中で反応
液を直接空気(ごの容器を開くことによって)に、また
は酸素(溶媒中にバブリングすることによって)に暴露
することによってコントロールされた酸化が達成される
ことを見い出した5゜ 本方法の別の条件は、ヒトリラキシンB−鎖が穏やかに
変性される条件下で反応を行うことである。当分野で知
られている変性剤、たとえば尿素、グアニノン塩酸塩、
およびその他のカオトロピック試薬類、塩類、清浄剤類
、および有機溶媒(アセトニトリル、アルコール類、ジ
メチルホルムアミド等)を用いることができる。尿素お
よびアセトニトリルか好ましく、数%(体積比:10%
以下)のf1機溶媒は、ヒトリラキシンB−鎖を穏やか
に変性°4゛る条件にする。
ヒトリラキシンの八−およびB−鎖を、遊離システィン
還元型で、適当な水性溶媒中でいっしょにする。始めに
八−鎖を、次いでB−鎖(p)(2の新鮮な5yy/m
Q水中貯蔵品から)を加えろことによって反応を開始し
た。NaOHでpHを調節して適当な値にずろ。再結合
クラキシンの生成を最大にするため、各反応をRP −
4逆相分Di用It 1) L Cl5nyder、L
、R,およびKirkland、J、J、、l n t
ro市+cLionto Modern Liqui
d Chromatography(1979)1でモ
ニターし、氷酢酸を加えてpF14とすることに、);
って停止させる。次いでこの混合物を16,3189で
30分間遠心し、−ト清をプレパラティゾ逆相IIPL
C(同上)で精製する。有用な収率のヒトクラキシンを
製造するためには室温で結合反応を行うことが重要であ
ることかわかった。高速液体クロマトグラフィーによる
分析は、ノンクロパック1tP−4(Synchrop
ak;4.6 X 250mm、 30 (l A”)
逆相カラムを用いて行った。ブレパラγイブ$111L
Cによる精製は、シンクロパックIIP−4(lX50
cm、300 Ao)またはハントパックのビダックR
P〜4あるいはrjP−18(5X50GM、 、io
0 A”)逆相方ラムのいずれかを用いて行うた、。
還元型で、適当な水性溶媒中でいっしょにする。始めに
八−鎖を、次いでB−鎖(p)(2の新鮮な5yy/m
Q水中貯蔵品から)を加えろことによって反応を開始し
た。NaOHでpHを調節して適当な値にずろ。再結合
クラキシンの生成を最大にするため、各反応をRP −
4逆相分Di用It 1) L Cl5nyder、L
、R,およびKirkland、J、J、、l n t
ro市+cLionto Modern Liqui
d Chromatography(1979)1でモ
ニターし、氷酢酸を加えてpF14とすることに、);
って停止させる。次いでこの混合物を16,3189で
30分間遠心し、−ト清をプレパラティゾ逆相IIPL
C(同上)で精製する。有用な収率のヒトクラキシンを
製造するためには室温で結合反応を行うことが重要であ
ることかわかった。高速液体クロマトグラフィーによる
分析は、ノンクロパック1tP−4(Synchrop
ak;4.6 X 250mm、 30 (l A”)
逆相カラムを用いて行った。ブレパラγイブ$111L
Cによる精製は、シンクロパックIIP−4(lX50
cm、300 Ao)またはハントパックのビダックR
P〜4あるいはrjP−18(5X50GM、 、io
0 A”)逆相方ラムのいずれかを用いて行うた、。
分析HPLCはウォーターズンステム(WaL(!r’
s System)を用いて、プレパラティブI+
11Cはつ]−ターズシステムあるいはプレツブ500
(1’rcp500)を用いて行った。
s System)を用いて、プレパラティブI+
11Cはつ]−ターズシステムあるいはプレツブ500
(1’rcp500)を用いて行った。
反応が終了したら、ヒトクラキシンまたはりラキンン類
仰体産物を、タンパク質単離の分野で認められている多
種多様の方法のうちのいずれかによって単離オろことが
できる。最も普通に用いられるクラキシンの精製法はク
ロマトグラフィー法である。この方法を、本発明方法に
よって得られるヒトリラキソンの回収に、容易に適用す
ることができる。この方法には、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィーあるいは逆相HPLCが含まれうる
。
仰体産物を、タンパク質単離の分野で認められている多
種多様の方法のうちのいずれかによって単離オろことが
できる。最も普通に用いられるクラキシンの精製法はク
ロマトグラフィー法である。この方法を、本発明方法に
よって得られるヒトリラキソンの回収に、容易に適用す
ることができる。この方法には、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィーあるいは逆相HPLCが含まれうる
。
精製法の例を挙げると以下のようである。すなわら、合
計0.5〜lのクラキシンペプチドを含む反応液−にt
nを15〜20ミクロンのビダックC4300A°(5
x50cg)カラムにかけた。0゜1%i’ F A
水中の、20〜40%アセトニトリル勾配(1分毎に0
5%変える)を用いて精製を行った3、流速は2011
ρ/分であり、1.0分毎のフラクションを集めた。こ
れらを、分析用5ミクロンのビダックC430OA”(
4,6x250mm)カラムでモニターした(0.1%
TFA水中の25%=24− アセトニトリルでイソクラティックに溶1i11F)、
、 L産物を含むフラクションを集め、ごれを後の分
IJi用に凍結乾燥した。
計0.5〜lのクラキシンペプチドを含む反応液−にt
nを15〜20ミクロンのビダックC4300A°(5
x50cg)カラムにかけた。0゜1%i’ F A
水中の、20〜40%アセトニトリル勾配(1分毎に0
5%変える)を用いて精製を行った3、流速は2011
ρ/分であり、1.0分毎のフラクションを集めた。こ
れらを、分析用5ミクロンのビダックC430OA”(
4,6x250mm)カラムでモニターした(0.1%
TFA水中の25%=24− アセトニトリルでイソクラティックに溶1i11F)、
、 L産物を含むフラクションを集め、ごれを後の分
IJi用に凍結乾燥した。
ヒトリラキシンおよびヒトクラキシン類似体を生物検定
で試験した。ネズミの恥骨結合検定(MPS)には、体
重18〜201i+のチャールズ・リバー(Charl
es River)白CFW雌マウスを用いるIルイス
(J、St、Louis、Can、J、Physiol
、r’harmacol 、 、 59゜507−51
2(1981))]。エストラジオールプライミンダ液
は、ピーナツ油0 、 I n(lにエストラノオール
17β−シクロペンチルプロピオネ−t・5 B yを
加えたものである。ヒトリラキシン投り[fJi、 /
\ンゾプルプリン4Bの1%水溶液中、2 、5.5
。
で試験した。ネズミの恥骨結合検定(MPS)には、体
重18〜201i+のチャールズ・リバー(Charl
es River)白CFW雌マウスを用いるIルイス
(J、St、Louis、Can、J、Physiol
、r’harmacol 、 、 59゜507−51
2(1981))]。エストラジオールプライミンダ液
は、ピーナツ油0 、 I n(lにエストラノオール
17β−シクロペンチルプロピオネ−t・5 B yを
加えたものである。ヒトリラキシン投り[fJi、 /
\ンゾプルプリン4Bの1%水溶液中、2 、5.5
。
0.1O10,20,0,40,0および8 (] 、
Ott9/R(lの濃度とする。マウスを少なくとも
(i l l li’+1隔離室に入れ、18〜20g
になったときに、各マウスにエストラジオールプライミ
ング液を皮1ぐ注射する。正確に711後、マウスに適
当なヒトリラキシン投与液0.2順を皮下注射する。ヒ
トリラキシン注射の後、18〜20時間の間に頚部を脱
F」させてマウスを殺した。恥骨間の靭帯を露出さl−
、マイクロメーターで測定した。
Ott9/R(lの濃度とする。マウスを少なくとも
(i l l li’+1隔離室に入れ、18〜20g
になったときに、各マウスにエストラジオールプライミ
ング液を皮1ぐ注射する。正確に711後、マウスに適
当なヒトリラキシン投与液0.2順を皮下注射する。ヒ
トリラキシン注射の後、18〜20時間の間に頚部を脱
F」させてマウスを殺した。恥骨間の靭帯を露出さl−
、マイクロメーターで測定した。
体重200〜3009の、チャールズ・リバー白スプラ
ーグ・1・−レイ(Sprague−Dawley)由
来の雌ラットを、ラットの子宮収縮検定(RUC)に用
いる。エストラノオールプライミング液は、ピーナツ油
0 、 I mQにエストラジオール 17β−シクロ
ペンデルプロピオネート200μgを加えたものである
。ヒトクラキシン貯蔵液は、滅菌注射用水(lnven
ex)中、0 、1 mg/rtrQの濃度とする。ラ
ットを少なくとも6日間隔離室に入れ、各ラットにエス
トラジオールプライミンダ液を皮下注射する。
ーグ・1・−レイ(Sprague−Dawley)由
来の雌ラットを、ラットの子宮収縮検定(RUC)に用
いる。エストラノオールプライミング液は、ピーナツ油
0 、 I mQにエストラジオール 17β−シクロ
ペンデルプロピオネート200μgを加えたものである
。ヒトクラキシン貯蔵液は、滅菌注射用水(lnven
ex)中、0 、1 mg/rtrQの濃度とする。ラ
ットを少なくとも6日間隔離室に入れ、各ラットにエス
トラジオールプライミンダ液を皮下注射する。
エストラジオール注射の後、16〜20時間の間に、−
酸化炭素で窒息させてラットを殺す。子宮を解剖して取
り出し、先端を裂き、子宮を横から動物あたり4つの片
に分ける。各組織を、通気ホルマンズ・リンガ−(Il
olmans Ringer)溶液3511gを入れた
、37℃に維持した、カバー付き水浴中に浮遊さUる。
酸化炭素で窒息させてラットを殺す。子宮を解剖して取
り出し、先端を裂き、子宮を横から動物あたり4つの片
に分ける。各組織を、通気ホルマンズ・リンガ−(Il
olmans Ringer)溶液3511gを入れた
、37℃に維持した、カバー付き水浴中に浮遊さUる。
このリンガ−溶液を、塩化ナトリウムの20%を等モル
量の塩化カリウムに置換した溶液に置き換えると、この
組織は収縮を起ご4′、。
量の塩化カリウムに置換した溶液に置き換えると、この
組織は収縮を起ご4′、。
安定なプラト−に到達した後、この水浴にある濃度のり
ラキシンを加える。標窄曲線用に水浴に加えたブタクラ
キノンの量は、水浴中の3511θあたりクラキシン0
.2.0.4.0.8.1.6.32.6.4および1
2.87Bである。
ラキシンを加える。標窄曲線用に水浴に加えたブタクラ
キノンの量は、水浴中の3511θあたりクラキシン0
.2.0.4.0.8.1.6.32.6.4および1
2.87Bである。
非ヒト霊長類の妊娠において、ヒトクラギノンが誘導す
る頚部熟成について試験した妊娠齢130〜160日の
、期間を合わせたアカゲザル(1?hesus mon
key)でヒトクラキシンを試験した3、この群の妊娠
期間は+68±611である。この動物に、つなぎ用の
綱を付けたジャケットを着lた1゜この綱を付けたジャ
ケットは、大腿血管、または頚動脈および内部頚静脈血
管中に入れた内(1′、カテーテルに常時接近すること
を可能にした。大部分の動物においては、羊膜嚢内に圧
力変換器を入れ、子宮表面に電極を接続して、子宮収縮
活性の測定を可能にした。連続静脈内注入で1時間にイ
・)だ−1てクラキシンを投与し、注入に続く15分か
ら最初の1時間はときどき、次いで24”’l1iil
LJ規則的に、注入前、注入中、および注入後の血液試
料を採取した。クラキシンの投与量はIO〜100μ2
の範囲とし、頚部に関する構造、不順化、位置、拡張お
よび胎児位置、ならびに子宮工区の特性について評価し
た。はとんどの場合、2人の観察者が別々にそれぞれの
頚部を調べ、評価した。対照群は、同様の方法で処置し
、食塩水を注入したサルであるか、または群中に保たれ
ているh月週間間隔で行なわれる頚部試験を施されてい
ないサルであった。
る頚部熟成について試験した妊娠齢130〜160日の
、期間を合わせたアカゲザル(1?hesus mon
key)でヒトクラキシンを試験した3、この群の妊娠
期間は+68±611である。この動物に、つなぎ用の
綱を付けたジャケットを着lた1゜この綱を付けたジャ
ケットは、大腿血管、または頚動脈および内部頚静脈血
管中に入れた内(1′、カテーテルに常時接近すること
を可能にした。大部分の動物においては、羊膜嚢内に圧
力変換器を入れ、子宮表面に電極を接続して、子宮収縮
活性の測定を可能にした。連続静脈内注入で1時間にイ
・)だ−1てクラキシンを投与し、注入に続く15分か
ら最初の1時間はときどき、次いで24”’l1iil
LJ規則的に、注入前、注入中、および注入後の血液試
料を採取した。クラキシンの投与量はIO〜100μ2
の範囲とし、頚部に関する構造、不順化、位置、拡張お
よび胎児位置、ならびに子宮工区の特性について評価し
た。はとんどの場合、2人の観察者が別々にそれぞれの
頚部を調べ、評価した。対照群は、同様の方法で処置し
、食塩水を注入したサルであるか、または群中に保たれ
ているh月週間間隔で行なわれる頚部試験を施されてい
ないサルであった。
タンパク質を学離するためウェスタンプロットおj;び
尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。低分子
用15%ポリアクリルアミドゲル、尿素、スラブケルは
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethes
da Re5earch Laboratories)
の分子量標桑用のパンフレットに従って行った。この方
法にいくつかの修飾を施した。このゲルを、4℃の冷却
室中、100V(一定)で15時間泳動させる。試料は
、l0mMリン酸ナトリウム(pH7゜2)、7M尿素
、001%プロモフェノールブルー、および還元試料に
対しては新たに調製1刀こ50mMDTT中で調製する
。充填の前に、I〜lOμ9の全ペプチドを90℃で2
〜3分間インキュベートする。充填する前に、ゲルを9
(1”Cて2〜3分間分間インベコベート。0.2%
ホルノ、アルデヒド、20%エタノールお、及び62%
酢酸(すべてv/v)の溶液中で15〜30分間脱染色
し、固定した後、このゲルを、クーマツシーブル−[C
oomasgie Blue : 25%エタノール中
のクーマツシーブルーIN −250(90ii7:0
.25%W/V)および酢酸(10d)中にゲルを1.
5時間浸漬する]で見えるようにし、銀染色Iオークレ
イ等(Oakley、B、R,et al、、^nal
ytical 1+iochcm、、j05.:(61
−363(1980))] L、ウェスタン分析1トウ
ビン等(I゛owbin、H,et al、、PNAS
、76.4350−4:(54(1979)]する。
尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。低分子
用15%ポリアクリルアミドゲル、尿素、スラブケルは
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethes
da Re5earch Laboratories)
の分子量標桑用のパンフレットに従って行った。この方
法にいくつかの修飾を施した。このゲルを、4℃の冷却
室中、100V(一定)で15時間泳動させる。試料は
、l0mMリン酸ナトリウム(pH7゜2)、7M尿素
、001%プロモフェノールブルー、および還元試料に
対しては新たに調製1刀こ50mMDTT中で調製する
。充填の前に、I〜lOμ9の全ペプチドを90℃で2
〜3分間インキュベートする。充填する前に、ゲルを9
(1”Cて2〜3分間分間インベコベート。0.2%
ホルノ、アルデヒド、20%エタノールお、及び62%
酢酸(すべてv/v)の溶液中で15〜30分間脱染色
し、固定した後、このゲルを、クーマツシーブル−[C
oomasgie Blue : 25%エタノール中
のクーマツシーブルーIN −250(90ii7:0
.25%W/V)および酢酸(10d)中にゲルを1.
5時間浸漬する]で見えるようにし、銀染色Iオークレ
イ等(Oakley、B、R,et al、、^nal
ytical 1+iochcm、、j05.:(61
−363(1980))] L、ウェスタン分析1トウ
ビン等(I゛owbin、H,et al、、PNAS
、76.4350−4:(54(1979)]する。
エディ−等[Eddie、L、W、 et al、、1
゛h++ Lancet、l。
゛h++ Lancet、l。
1344−1346(1986)]の記載のよう(こし
て、アルミニ―ウム(alumn)沈澱させた遊離ペプ
チドか、よたはフロインドアジコバシト中の遊離ペプチ
ドで−コ−ジ−ラン1ζ白ウザギを免疫化ずろことによ
って、△−およびl(−鎖に特異的な抗体を、生成させ
た。
て、アルミニ―ウム(alumn)沈澱させた遊離ペプ
チドか、よたはフロインドアジコバシト中の遊離ペプチ
ドで−コ−ジ−ラン1ζ白ウザギを免疫化ずろことによ
って、△−およびl(−鎖に特異的な抗体を、生成させ
た。
力価は実質的に同一であり、それぞれの免疫化からの抗
血清を、A−鎖についてはbb力価で、B−鎖に−)い
てはCCC力価で集めた。ニトロセルロースフィルター
に対する2時間〜−晩インンキ、ベーソヨンにおいて、
ごれらを500倍に希釈して用いた。次いで、洗浄した
フィルターを、+251−タンパク質へに対して2時間
インキュベートし、乾燥し、X−線フィルムに感光させ
た。
血清を、A−鎖についてはbb力価で、B−鎖に−)い
てはCCC力価で集めた。ニトロセルロースフィルター
に対する2時間〜−晩インンキ、ベーソヨンにおいて、
ごれらを500倍に希釈して用いた。次いで、洗浄した
フィルターを、+251−タンパク質へに対して2時間
インキュベートし、乾燥し、X−線フィルムに感光させ
た。
以ドに実施例を挙げて本発明方法をさらに詳しく説明4
−るが、これらは説明のためにだけ挙げるものてあ−)
で、本発明の範囲を限定しようとするしのではない。
−るが、これらは説明のためにだけ挙げるものてあ−)
で、本発明の範囲を限定しようとするしのではない。
宋施fりj−1−入熱のヒトクラキシンI(2(B33
Δ24) 還元型のりラキシンΔ−鎖(107!g)を、還元型の
固体凍結乾燥粉体として反応混合物に加えた。
Δ24) 還元型のりラキシンΔ−鎖(107!g)を、還元型の
固体凍結乾燥粉体として反応混合物に加えた。
還元型のりラキシンB−鎖(5,63xg)も固体凍結
乾燥粉体として加えた。
乾燥粉体として加えた。
始めにクラギンンA鎖を、次いでクラギノンB−鎖を、
上記からの固体凍結乾燥粉体上して加え、Ion(lの
バイアル中、室温(〜25℃)でAおよびI3リラギシ
ン鎖の溶液を混合した。N!tol+を用いてpHを1
0.5に調節した。再結合クラギシンの生成を最大にす
るため、この反応をIt P −4逆相分析用1−I
P L Cでモニターしノこ。天然型のH2のB−鎖が
不溶性であることから、そのΔ−鎖との再結合には本発
明による次の条イ/すなわら最終反応液0.1Mグリシ
ン(pHIO,5)、ImMEDTΔ、2.5mM D
TT、3% l−プじ1パノール、3%アセトニトリル
、および1M尿素を必要とした。この反応液を空気にさ
らし、室温で28時間撹拌した。前記のようにして、リ
ッギシンの生成を分析用逆相HP L Cでモニターし
、停止させた。高速液体クロマトクラフィー(1+1)
LC)による分析は、クラキシンの収晴カ月、87mg
(すなわち、B−鎖の19.5%導入)であることを示
した。
上記からの固体凍結乾燥粉体上して加え、Ion(lの
バイアル中、室温(〜25℃)でAおよびI3リラギシ
ン鎖の溶液を混合した。N!tol+を用いてpHを1
0.5に調節した。再結合クラギシンの生成を最大にす
るため、この反応をIt P −4逆相分析用1−I
P L Cでモニターしノこ。天然型のH2のB−鎖が
不溶性であることから、そのΔ−鎖との再結合には本発
明による次の条イ/すなわら最終反応液0.1Mグリシ
ン(pHIO,5)、ImMEDTΔ、2.5mM D
TT、3% l−プじ1パノール、3%アセトニトリル
、および1M尿素を必要とした。この反応液を空気にさ
らし、室温で28時間撹拌した。前記のようにして、リ
ッギシンの生成を分析用逆相HP L Cでモニターし
、停止させた。高速液体クロマトクラフィー(1+1)
LC)による分析は、クラキシンの収晴カ月、87mg
(すなわち、B−鎖の19.5%導入)であることを示
した。
この混合物を、プレバラティブTI I)−4逆相11
3l− PLO(I x25cm)RP 〜4シンクロパック3
00Aで精製しノこ。このピークを集め、HPLC溶媒
から直接用いた。このヒトクラキンンは、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動、アミノ酸分析HPC、アミノ末端
間lす決定および生物検定により、完全に純粋であるこ
とがわかった。
3l− PLO(I x25cm)RP 〜4シンクロパック3
00Aで精製しノこ。このピークを集め、HPLC溶媒
から直接用いた。このヒトクラキンンは、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動、アミノ酸分析HPC、アミノ末端
間lす決定および生物検定により、完全に純粋であるこ
とがわかった。
実施例2 ヒトクラキシン類似体H2(B33Δ24
) BLys’ BAIa25還元型のヒトクラキシン
A−鎖(200o)を水(p112.0)40*l!に
溶解した。還元型のヒトクラキンンB−鎖CF333
BT、ys’ Ala25)(100mg)を水(pt
r 2 ) 20 mQに溶解した。
) BLys’ BAIa25還元型のヒトクラキシン
A−鎖(200o)を水(p112.0)40*l!に
溶解した。還元型のヒトクラキンンB−鎖CF333
BT、ys’ Ala25)(100mg)を水(pt
r 2 ) 20 mQに溶解した。
上記の新鮮な水(pH2)中貯蔵品から、A−鎖を始め
に、修飾型のB−鎖を次いで加えることによって、+6
5+0のバイアル中、室温(〜25℃)でA−お」;び
■3−鎖類似体の溶液を混合した。NaOHでpHを約
8.0に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生成を
最大にするため、この反応をRP−4逆相HP L C
でモニターした。このヒトクラキシン類似体用に、本発
明による次の条件、ずなわち反応B O,1Mトリス
(pH8、0)、l mM l・:DTA、2mM D
TT、24℃を用いた。この反応液を空気にさらして激
しく撹拌しノコ。氷酢酸を加えてpH4とすることによ
ってこの結合反応を停止させた。
に、修飾型のB−鎖を次いで加えることによって、+6
5+0のバイアル中、室温(〜25℃)でA−お」;び
■3−鎖類似体の溶液を混合した。NaOHでpHを約
8.0に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生成を
最大にするため、この反応をRP−4逆相HP L C
でモニターした。このヒトクラキシン類似体用に、本発
明による次の条件、ずなわち反応B O,1Mトリス
(pH8、0)、l mM l・:DTA、2mM D
TT、24℃を用いた。この反応液を空気にさらして激
しく撹拌しノコ。氷酢酸を加えてpH4とすることによ
ってこの結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブII P T、 Cピダ
ック04 300 ’A(5X 50cm)で精製した
。ヒトクラキシン類似体のピーク(溶出体積:約140
11g)を集め、凍結乾燥して35Rgのりラキンン(
4′なわち、B−鎖、20,3%)を回収した。このヒ
トクラキシン類似体は、ポリアクリル)′ミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、HP L
C(第2a図参照)および生物検定により、完全に純粋
であることがわか−、ノこ3、寒寒敗+ヒトクラキソン
類似体II 2 (13233A 24 ) 8f、y
s’ BAla”還元型のヒトクラキシンA−鎖(41
,5〜)を水(pH2,0)8好に溶解した。)2ミノ
末y1°1.:から114初のアミノ酸を削除した還元
型のヒトクラギンン1(−鎖(B 2−33 BLys
’ 5AIa”X23yng)を水(pH2)4好に溶
解した。
ック04 300 ’A(5X 50cm)で精製した
。ヒトクラキシン類似体のピーク(溶出体積:約140
11g)を集め、凍結乾燥して35Rgのりラキンン(
4′なわち、B−鎖、20,3%)を回収した。このヒ
トクラキシン類似体は、ポリアクリル)′ミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、HP L
C(第2a図参照)および生物検定により、完全に純粋
であることがわか−、ノこ3、寒寒敗+ヒトクラキソン
類似体II 2 (13233A 24 ) 8f、y
s’ BAla”還元型のヒトクラキシンA−鎖(41
,5〜)を水(pH2,0)8好に溶解した。)2ミノ
末y1°1.:から114初のアミノ酸を削除した還元
型のヒトクラギンン1(−鎖(B 2−33 BLys
’ 5AIa”X23yng)を水(pH2)4好に溶
解した。
−に記の新鮮な水(pH2)中貯蔵品から、八−鎖を始
めに、修飾型のB−鎖を次いで加えることによって、3
3xQ、のバイアル中、室温(〜25°C)でA−およ
び1:3−鎖類似体の溶液を混合した。NaOHでpo
を8.0に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生成
を最大にするため、この反応をRP−4逆相I−I P
L Cでモニターした。このクラキシン類似体用に、
本発明による次の条件、すなわち反応1)0.1Mトリ
ス(pH8)、25℃:初めの1〜2時間はN、を通し
、N、雰囲気下で撹拌する、を用いた。次いで、この反
応液を空気にさらして激しく撹拌した。氷酢酸を加えて
pH4とすることによってこの結合反応を停止させた。
めに、修飾型のB−鎖を次いで加えることによって、3
3xQ、のバイアル中、室温(〜25°C)でA−およ
び1:3−鎖類似体の溶液を混合した。NaOHでpo
を8.0に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生成
を最大にするため、この反応をRP−4逆相I−I P
L Cでモニターした。このクラキシン類似体用に、
本発明による次の条件、すなわち反応1)0.1Mトリ
ス(pH8)、25℃:初めの1〜2時間はN、を通し
、N、雰囲気下で撹拌する、を用いた。次いで、この反
応液を空気にさらして激しく撹拌した。氷酢酸を加えて
pH4とすることによってこの結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブHP L CビダックC
4300°A(5X 80c肩)で精製した。クラキシ
ン類似体のピーク(溶出体積:約140mff)を集め
、凍結乾燥して16119のヒトクラキシン類似体(ず
なわら、B−鎖、40.3%)を回収した。
4300°A(5X 80c肩)で精製した。クラキシ
ン類似体のピーク(溶出体積:約140mff)を集め
、凍結乾燥して16119のヒトクラキシン類似体(ず
なわら、B−鎖、40.3%)を回収した。
このクラキソン類似体は、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、HPLC(
第2a図参照)および生物検定に、l−リ、完全に純粋
であることがわかった。
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、HPLC(
第2a図参照)および生物検定に、l−リ、完全に純粋
であることがわかった。
”111MI4 ヒトワラキシン類(V体I+ 2
(11233A24)Aピロ−Glu’ BLys’
BAl a2 +1還元型のヒトクラキシンへ−鎖(4
1,5111y)を水(pH2,0)8mgに溶解した
。アミノ末端から最初のアミノ酸を削除した還元型のヒ
トクラキンン13−鎖(R2−33BLys’ BA
la2′)(23my)を水(1)H2)411Ll!
に溶解した。
(11233A24)Aピロ−Glu’ BLys’
BAl a2 +1還元型のヒトクラキシンへ−鎖(4
1,5111y)を水(pH2,0)8mgに溶解した
。アミノ末端から最初のアミノ酸を削除した還元型のヒ
トクラキンン13−鎖(R2−33BLys’ BA
la2′)(23my)を水(1)H2)411Ll!
に溶解した。
上記の新鮮な水(pH2)中貯蔵品から、Δ−鎖を始め
に、修飾型のB−鎖を次いで加えることに3に一・て、
33m(lのバイアル中、室1lk(〜25℃)テΔ−
およびB−鎖類仰体の溶液を混合した。Na01lでp
Hを8.0に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生
成を最大にするため、この反応をIt 1)−4逆相1
−! P L Cでモニターした。このクラギソン類似
体用に、本発明に7Lる次の条件、ケなわ1′)反応D
O,1Mトリス(pH(8)、25℃;初めの1〜
2時間はN、を通し、N、雰囲気下で撹拌4゛る、をI
IIいた。次いで、この反応液を空気にさらして激しく
撹拌した。氷酢酸を加えてp)+4とすることによって
この結合反応を停止させた。
に、修飾型のB−鎖を次いで加えることに3に一・て、
33m(lのバイアル中、室1lk(〜25℃)テΔ−
およびB−鎖類仰体の溶液を混合した。Na01lでp
Hを8.0に調節した。結合ヒトクラキシン類似体の生
成を最大にするため、この反応をIt 1)−4逆相1
−! P L Cでモニターした。このクラギソン類似
体用に、本発明に7Lる次の条件、ケなわ1′)反応D
O,1Mトリス(pH(8)、25℃;初めの1〜
2時間はN、を通し、N、雰囲気下で撹拌4゛る、をI
IIいた。次いで、この反応液を空気にさらして激しく
撹拌した。氷酢酸を加えてp)+4とすることによって
この結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブHP L CビダッタC
4300°Δ(5X80cm)で精製した。クラキノン
類似体のピーク(溶出体積:約1401112)を集め
、凍結乾燥して7 、56のヒトクラキシン類似体(す
なわち、B−鎖、18.9%)を回収した。
4300°Δ(5X80cm)で精製した。クラキノン
類似体のピーク(溶出体積:約1401112)を集め
、凍結乾燥して7 、56のヒトクラキシン類似体(す
なわち、B−鎖、18.9%)を回収した。
このクラキシン類似体は、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、1−11)
L C(第2a図参照)および生物検定により、完全
に純粋であることがわかった。
泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、1−11)
L C(第2a図参照)および生物検定により、完全
に純粋であることがわかった。
実施例5 ヒトクラキシン類似体H2(833Δ24)
Aピo−Glu’ BLys’ BAla”還元型のヒ
トクラキシンA−鎖(200mg)を水(pl−12,
0)40yf2に溶解した。還元型のヒトクラキノン1
3−鎖(I(33BLys’ BAla25)(100
rsg)を水(pH−12) 2 (l m(lに溶解
した。
Aピo−Glu’ BLys’ BAla”還元型のヒ
トクラキシンA−鎖(200mg)を水(pl−12,
0)40yf2に溶解した。還元型のヒトクラキノン1
3−鎖(I(33BLys’ BAla25)(100
rsg)を水(pH−12) 2 (l m(lに溶解
した。
」−記の新鮮な水(pH2)中貯蔵品から、A−鎖を始
めに、修飾型のB−鎖を次いて加えることによつて、1
65i12のバイアル中、室温(〜25℃)で八−お上
びB−鎖類似体の溶液を混合しノこ、、Na011でp
Hを約8.0に調節した。結合ヒトクラキンン類似体の
生成を最大にするため、この反応を1口)=4逆相HP
LCでモニターした。このヒトクラキシン類似体用に、
本発明に」こる次の条件、すなわち反応B O,1M
グリンン酸すトリウム(pH8。
めに、修飾型のB−鎖を次いて加えることによつて、1
65i12のバイアル中、室温(〜25℃)で八−お上
びB−鎖類似体の溶液を混合しノこ、、Na011でp
Hを約8.0に調節した。結合ヒトクラキンン類似体の
生成を最大にするため、この反応を1口)=4逆相HP
LCでモニターした。このヒトクラキシン類似体用に、
本発明に」こる次の条件、すなわち反応B O,1M
グリンン酸すトリウム(pH8。
0)、ImMEDTA、2 mM 1) i”l’、2
4℃、を用いた。この反応液を空気にさらして激(、<
撹拌した。氷酢酸を加えてpl−14と′4′ろごとに
よ−1てこの結合反応を停止させた。
4℃、を用いた。この反応液を空気にさらして激(、<
撹拌した。氷酢酸を加えてpl−14と′4′ろごとに
よ−1てこの結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブII 1) L Cピダ
ツクC4300°A(5X50cz)で精製したヒトク
ラキシン類似体のピーク(溶出体積約1イOd)を集め
、凍結乾燥して1611yのりラギンン(すなわち、B
−鎖、9.3%)を回収した。、このヒトクラキシン類
似体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分
析、アミノ末端配列決定、IIP L C(第2a図参
照)および生物検定により、5゛1−全に純粋であるこ
とがわかった。
ツクC4300°A(5X50cz)で精製したヒトク
ラキシン類似体のピーク(溶出体積約1イOd)を集め
、凍結乾燥して1611yのりラギンン(すなわち、B
−鎖、9.3%)を回収した。、このヒトクラキシン類
似体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分
析、アミノ末端配列決定、IIP L C(第2a図参
照)および生物検定により、5゛1−全に純粋であるこ
とがわかった。
実i綻倒則生物学的検定
ラットの子宮収縮インビトロ生物検定は、電気的な刺激
による収縮の存在下で平滑筋を弛緩さ什るヒトクラキン
ンの能力を測定するものである[ルイス(J、SL、L
ouis、Can、J、Physiol、Pharma
col、 、59゜507−512(+981))]。
による収縮の存在下で平滑筋を弛緩さ什るヒトクラキン
ンの能力を測定するものである[ルイス(J、SL、L
ouis、Can、J、Physiol、Pharma
col、 、59゜507−512(+981))]。
ネズミの恥骨結合帯インピ゛ト〔1生物検定は、結合組
織に及ぼすクラキシンの変形効果を測定4−るものであ
る[ンコ、タイネ・ソツ等(SLeincLz、+3.
G、 et al、、Endocrinology、6
7.102(+960))’]o+42 (B2−33
A24)、B2(B32Δ24 ) BLys’
BA la”、I−r2(B33 A24)Br、y
s’ BAla25、および−ト記H2(Bl−33A
24 ) eLys’ BA la”’ Aピロ−G
lu’およびl−12(B33 A24 ) eLys
’ BA1 a 26 Aピロ−G lu’のピロ−G
lu型の生物学的な版型反応を比較したところ、MPS
およびRUCの両検定において生物学的な11η性が示
された。ヒトクラキンン類似体およびヒトクラギシンに
ついてのこのMPSのデータを第3図に示ケ。
織に及ぼすクラキシンの変形効果を測定4−るものであ
る[ンコ、タイネ・ソツ等(SLeincLz、+3.
G、 et al、、Endocrinology、6
7.102(+960))’]o+42 (B2−33
A24)、B2(B32Δ24 ) BLys’
BA la”、I−r2(B33 A24)Br、y
s’ BAla25、および−ト記H2(Bl−33A
24 ) eLys’ BA la”’ Aピロ−G
lu’およびl−12(B33 A24 ) eLys
’ BA1 a 26 Aピロ−G lu’のピロ−G
lu型の生物学的な版型反応を比較したところ、MPS
およびRUCの両検定において生物学的な11η性が示
された。ヒトクラキンン類似体およびヒトクラギシンに
ついてのこのMPSのデータを第3図に示ケ。
このM1)S版型反応は、天然のヒトクラキシンとB2
(B2−33 A24)elLys” BA182°
゛が等価であることを示している(第3図)。1.かじ
、ブタクラキノンは他のクラキンンと比較したとき、そ
の反応は類偏していないようである。3ヒト類仰体およ
び天然配列のヒトクラギシンの4゛へては、MPS生物
検定において実質的に区別i〜ろごとかできない。
(B2−33 A24)elLys” BA182°
゛が等価であることを示している(第3図)。1.かじ
、ブタクラキノンは他のクラキンンと比較したとき、そ
の反応は類偏していないようである。3ヒト類仰体およ
び天然配列のヒトクラギシンの4゛へては、MPS生物
検定において実質的に区別i〜ろごとかできない。
用いうる精製H2(B33 A24)量の故に、投与
範囲の高い方で比較することらできノこ1.ごの結果は
、天然のヒトクラキシンとヒトクラギノン類似型の活性
が同等であることを、1辷4〜0ヒトリッキソンの版型
反応曲線の傾き(J、類似体のそれとは異なることもあ
る。
範囲の高い方で比較することらできノこ1.ごの結果は
、天然のヒトクラキシンとヒトクラギノン類似型の活性
が同等であることを、1辷4〜0ヒトリッキソンの版型
反応曲線の傾き(J、類似体のそれとは異なることもあ
る。
RUC生物検定においては、ヒトクラキンンとヒトクラ
キンン類似体の傾きは同じである1゜実施例7霊長類の
妊娠にお1)るヒトクラキノン 前記の方法を用い、妊娠齢130〜1(i(Illの、
期間を合イつせたアカケザルにおいて、2種類のヒトク
ラキシン類似体、I−r 2 (B 33 A24)
B!Jys4 eΔ1a25およびl−12(B2−3
3 A24)eLys’ BAla”を試験した。
キンン類似体の傾きは同じである1゜実施例7霊長類の
妊娠にお1)るヒトクラキノン 前記の方法を用い、妊娠齢130〜1(i(Illの、
期間を合イつせたアカケザルにおいて、2種類のヒトク
ラキシン類似体、I−r 2 (B 33 A24)
B!Jys4 eΔ1a25およびl−12(B2−3
3 A24)eLys’ BAla”を試験した。
観察されたパラメーターに改良型ビノヨップ・スコアー
を用いると、投与型の異なる7種の別個の注入による平
均の頚部変化は3.7単位であった。これらのデータを
第5図に示すが、ここには!00.50および10μ2
用量の個々の注入、ならびに他のすべてのIOttg注
入の平均および2種類の対照が示されている。非注入の
対照サルはポイントあたり2〜15測定(それぞれが少
なくとt)4匹のサルを表す2つのポイントを除いて)
であり、その平均がプロットされていることに注、位。
を用いると、投与型の異なる7種の別個の注入による平
均の頚部変化は3.7単位であった。これらのデータを
第5図に示すが、ここには!00.50および10μ2
用量の個々の注入、ならびに他のすべてのIOttg注
入の平均および2種類の対照が示されている。非注入の
対照サルはポイントあたり2〜15測定(それぞれが少
なくとt)4匹のサルを表す2つのポイントを除いて)
であり、その平均がプロットされていることに注、位。
通常、頚部は、妊娠期間が進行するに従って比較的低用
1■のりラギシンに対して、またはこの期間の初期にク
ラキソンを繰り返し投与することに対して、より感受性
となった。高用量のりラキンン(10(]または550
9gは、妊娠期間の比較的初期(+3(]〜140d)
であっても、頚部熟成にa意の変化(スコアーで1〜1
0の変化を誘起する)をりえろことができた。この頚部
の変化は、子宮の筋電図活性または子宮内圧におIJる
矛盾のないすべての変化とは独立して起ごろようであ−
、た。これらの結果は、妊娠期間の最後の第3期の霊長
類において頚部熟成を引き起ご市のに、結合ヒトクラキ
シンが極めて効果的であることを小(2ている。
1■のりラギシンに対して、またはこの期間の初期にク
ラキソンを繰り返し投与することに対して、より感受性
となった。高用量のりラキンン(10(]または550
9gは、妊娠期間の比較的初期(+3(]〜140d)
であっても、頚部熟成にa意の変化(スコアーで1〜1
0の変化を誘起する)をりえろことができた。この頚部
の変化は、子宮の筋電図活性または子宮内圧におIJる
矛盾のないすべての変化とは独立して起ごろようであ−
、た。これらの結果は、妊娠期間の最後の第3期の霊長
類において頚部熟成を引き起ご市のに、結合ヒトクラキ
シンが極めて効果的であることを小(2ている。
既知の方法を用いて本発明のヒトクラキノンおよびヒト
クラキシン類似体を配合し、ヒトクラギシンまたはその
類似体を薬学的に許容しうる担体と混合した薬学的に有
用な組成物を調製することができる。その他の必要なヒ
トタンパク質(〕ことえば、ヒト血清アルブミン)を含
む適当な担体およびその配合については、通常の製剤に
関する専門書[たとえば、マーヂン(lE、W、Mar
Lin)によるトmington’s Pharmac
eutical 5ciencOs]に記載されている
。
クラキシン類似体を配合し、ヒトクラギシンまたはその
類似体を薬学的に許容しうる担体と混合した薬学的に有
用な組成物を調製することができる。その他の必要なヒ
トタンパク質(〕ことえば、ヒト血清アルブミン)を含
む適当な担体およびその配合については、通常の製剤に
関する専門書[たとえば、マーヂン(lE、W、Mar
Lin)によるトmington’s Pharmac
eutical 5ciencOs]に記載されている
。
第1図は、ヒi・クラギシンおよびその他のりラキシン
、ならびにヒトインスリンのΔわよびl(鎖のアミノ酸
配列を示す配列図であり、第2a図および第2h図は、
それぞれ+42(B33 Δ24)BLys’BΔ1
a25およびH2(1333A 24 )についての鎖
結合反応の経時変化(HPLC測定)を示すグラフであ
り、第3図は、ヒトクラキシン、ヒトクラギンン類似体
おJ:びブタクラキシンについて測定したMI)S服里
反応曲線を示すグラフであり、第4図は、ヒトクラキノ
ン類似体を妊娠齢の異なるアカゲザルに投与した後に測
定した改良型ビショプ・スコアーを示すグラフである。 特許出願人 ノエネンテク、インコーポレイテッド代理
人 弁理士 青 山 葆 外1名手続補正書動剣 特許庁長官殿 昭和62年 9月21日26 発
明の名称 鎖の結合法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国カリフォ゛L・ニア94080、
サウス・サン・フランンスコ、ポイント・サン・ブルー
ノ・ブールバード460番 名称 ノエネンテクフイ′ンコーポしイテソド4代理人 住所 〒540 大阪府大阪市東区域見2丁目1番61
号6、補正の対象 図 面
、ならびにヒトインスリンのΔわよびl(鎖のアミノ酸
配列を示す配列図であり、第2a図および第2h図は、
それぞれ+42(B33 Δ24)BLys’BΔ1
a25およびH2(1333A 24 )についての鎖
結合反応の経時変化(HPLC測定)を示すグラフであ
り、第3図は、ヒトクラキシン、ヒトクラギンン類似体
おJ:びブタクラキシンについて測定したMI)S服里
反応曲線を示すグラフであり、第4図は、ヒトクラキノ
ン類似体を妊娠齢の異なるアカゲザルに投与した後に測
定した改良型ビショプ・スコアーを示すグラフである。 特許出願人 ノエネンテク、インコーポレイテッド代理
人 弁理士 青 山 葆 外1名手続補正書動剣 特許庁長官殿 昭和62年 9月21日26 発
明の名称 鎖の結合法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国カリフォ゛L・ニア94080、
サウス・サン・フランンスコ、ポイント・サン・ブルー
ノ・ブールバード460番 名称 ノエネンテクフイ′ンコーポしイテソド4代理人 住所 〒540 大阪府大阪市東区域見2丁目1番61
号6、補正の対象 図 面
Claims (16)
- (1)還元型のヒトリラキシンA鎖またはその類似体と
還元型のヒトリラキシンB鎖またはその類似体を、pH
約7.0〜約12の水性溶媒中、該ヒトリラキシンのB
鎖を穏やかに変性してヒトリラキシンまたはヒトリラキ
シン類似体を生成させる条件下で混合することを特徴と
する、ヒトリラキシンのA鎖またはその類似体とヒトリ
ラキシンのB鎖またはその類似体を結合させてヒトリラ
キシンまたはヒトリラキシン類似体を製造する方法。 - (2)還元型のヒトリラキシンA鎖および還元型のヒト
リラキシンB鎖のそれぞれが、天然のヒトリラキシン(
H2)のアミノ酸配列を有するものである第(1)項記
載の方法。 - (3)還元型のヒトリラキシンA鎖および還元型のヒト
リラキシンB鎖のそれぞれが、天然のヒトリラキシン(
H1)のアミノ酸配列を有するものである第(1)項記
載の方法。 - (4)還元型のヒトリラキシンA鎖が該A鎖の類似体で
ある第(1)項記載の方法。 - (5)還元型のヒトリラキシンB鎖が該B鎖の類似体で
ある第(1)項記載の方法。 - (6)還元型のヒトリラキシンB鎖が、少なくとも25
から33個のアミノ酸を有するものであり、該鎖中の少
なくとも1個のメチオニンが置換されている第(1)項
記載の方法。 - (7)還元型のヒトリラキシンB鎖が、32個のアミノ
酸まで短くしたものであり、該鎖の4位にリジンおよび
25位にアラニンを有している第(1)項記載の方法。 - (8)該混合を約15〜約30℃の温度で行う第(1)
項記載の方法。 - (9)該混合を室温で行う第(1)項記載の方法。
- (10)還元型のヒトリラキシンA鎖が、該鎖の1位に
ピロ−Gluを有するものである第(1)項記載の方法
。 - (11)ヒトリラキシン類似体H2(B33 A24)
_BLys^4_BAla^2^5。 - (12)ヒトリラキシン類似体H2(B2−33A24
)_BLys^4_BAla^2^5。 - (13)ヒトリラキシン類似体H2(B2−33A24
)_BLys^4_BAla^2^5_Aピロ−Glu
^1。 - (14)ヒトリラキシン類似体H2(B33 A24)
_BLys^4_BAla^2^5_Aピロ−Glu^
1。 - (15)薬学的に許容しうる担体および唯一の活性薬物
としてヒトリラキシンを含有している分娩促進用医薬組
成物。 - (16)薬学的に許容しうる担体および唯一の活性薬物
としてヒトリラキシン類似体を含有している分娩促進用
医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/877,819 US4835251A (en) | 1986-06-23 | 1986-06-23 | Method of chain combination |
US877819 | 1986-06-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6366198A true JPS6366198A (ja) | 1988-03-24 |
JP2529693B2 JP2529693B2 (ja) | 1996-08-28 |
Family
ID=25370787
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62156391A Expired - Lifetime JP2529693B2 (ja) | 1986-06-23 | 1987-06-23 | 鎖の結合法 |
Country Status (15)
Country | Link |
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US (1) | US4835251A (ja) |
EP (1) | EP0251615B1 (ja) |
JP (1) | JP2529693B2 (ja) |
KR (1) | KR960007604B1 (ja) |
CN (1) | CN1029784C (ja) |
AU (1) | AU617291B2 (ja) |
CA (1) | CA1336223C (ja) |
DE (1) | DE3783273T2 (ja) |
DK (1) | DK173649B1 (ja) |
HU (1) | HU205948B (ja) |
IE (1) | IE59683B1 (ja) |
IL (1) | IL82921A (ja) |
PH (1) | PH23407A (ja) |
PT (1) | PT85134B (ja) |
ZA (1) | ZA874482B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007534613A (ja) * | 2003-06-20 | 2007-11-29 | ハワード・フローレイ・インスティテュート・オブ・イクスペリメンタル・フィジオロジー・アンド・メディスン | レラキシンスーパーファミリーペプチド類似体 |
JP2015160825A (ja) * | 2014-02-27 | 2015-09-07 | 学校法人東海大学 | リラキシンの製造方法 |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5191063A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
AU623518B2 (en) * | 1989-05-04 | 1992-05-14 | Genentech Inc. | Processes and compositions for the isolation of human relaxin |
US5478807A (en) * | 1991-08-19 | 1995-12-26 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in the treatment of bradycardia |
US5166191A (en) * | 1991-08-19 | 1992-11-24 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in cardiovascular therapy |
US5911997A (en) * | 1995-06-07 | 1999-06-15 | Connetics Corporation | Relaxin-like factor and methods and uses thereof |
US5612051A (en) * | 1995-11-17 | 1997-03-18 | Yue; Samuel K. | Method of treating involuntary muscle dysfunction with relaxin hormone |
US6709659B1 (en) * | 1996-08-02 | 2004-03-23 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind testis-specific insulin homolog polypeptides |
US5994148A (en) | 1997-06-23 | 1999-11-30 | The Regents Of University Of California | Method of predicting and enhancing success of IVF/ET pregnancy |
US6251863B1 (en) | 1998-09-08 | 2001-06-26 | Samuel K. Yue | Method of preventing and treating symptoms of aging and neurodegenerative dysfunctions with relaxin |
US20050032683A1 (en) * | 2000-10-04 | 2005-02-10 | Amento Edward P. | Methods of modulating apoptosis by administration of relaxin agonists or antagonists |
US20050186526A1 (en) * | 2002-11-01 | 2005-08-25 | Bas Medical, Inc. | Methods and systems for enabling and stabilizing tooth movement |
AU2005247332A1 (en) * | 2004-04-30 | 2005-12-08 | Corthera, Inc. | Methods and compositions for control of fetal growth via modulation of relaxin |
US20060052304A1 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Bas Medical, Inc. | Method for remodeling bone and related sutures |
US8445635B2 (en) * | 2006-04-11 | 2013-05-21 | Armour Therapeutics Inc. | Modified H2 relaxin for tumor suppression |
GR1006759B (el) * | 2008-12-22 | 2010-04-20 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras) | Εξελιγμενη χημικη μεθοδος συνθεσης της ανθρωπινης ρηλαξινης |
GR1006941B (el) * | 2009-06-01 | 2010-08-27 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), | Πεπτιδικη συνθεση (peptide synthesis) |
GR1007010B (el) * | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), | Ινσουλινοειδη πεπτιδια |
HRP20240267T1 (hr) | 2010-08-17 | 2024-05-10 | Ambrx, Inc. | Modificirani relaksin polipeptidi i njihove uporabe |
US20160152679A1 (en) * | 2012-05-24 | 2016-06-02 | Angion Biomedica Corp. | Relaxin-like compounds and uses thereof |
US9381231B2 (en) | 2012-10-09 | 2016-07-05 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of relaxin to restore maternal physiology in pregnancies conceived by assisted reproductive technologies |
EP2946788A1 (en) | 2014-05-23 | 2015-11-25 | Immundiagnostik AG | Method and composition for treating heart failure with preserved ejection fraction |
JP2018532810A (ja) | 2015-11-07 | 2018-11-08 | マルチビア インコーポレイテッド | がんの処置のための腫瘍抑制因子遺伝子治療および免疫チェックポイント治療を含む組成物 |
JP2020510624A (ja) | 2016-12-12 | 2020-04-09 | マルチビア インコーポレイテッド | がんおよび感染性疾患の治療および予防のための、ウイルス遺伝子治療および免疫チェックポイント阻害剤を含む方法および組成物 |
WO2020036635A2 (en) | 2018-03-19 | 2020-02-20 | Multivir Inc. | Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer |
TWI844709B (zh) | 2019-07-31 | 2024-06-11 | 美商美國禮來大藥廠 | 鬆弛素(relaxin)類似物及其使用方法 |
WO2021113644A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Multivir Inc. | Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer |
CA3180662A1 (en) * | 2020-05-08 | 2021-11-11 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered relaxins and methods of use thereof |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4421685A (en) * | 1980-03-27 | 1983-12-20 | Eli Lilly And Company | Process for producing an insulin |
YU76981A (en) * | 1980-03-27 | 1983-09-30 | Lilly Co Eli | Process for bonding the a-chain of insulin or insulin analogues and the b-chain of insulin or insulin analogues in order to obtain insulin or insulin analogues |
US4656249A (en) * | 1982-06-10 | 1987-04-07 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Peptides with relaxin activity |
DE3382117D1 (de) * | 1982-08-12 | 1991-02-21 | Florey Howard Inst | Molekulare klonierung und charakterisierung der das menschliche relaxin kodierenden gen-sequenz. |
AU562962B2 (en) * | 1982-08-12 | 1987-06-25 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Molecular cloning and characterisation of the gene sequence coding for human relaxin |
NZ206534A (en) * | 1982-12-13 | 1988-05-30 | Florey Howard Inst | Molecular cloning and characterisation of gene sequence coding for human relaxin |
AU562713B2 (en) * | 1982-12-13 | 1987-06-18 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Cloning for human relaxin |
-
1986
- 1986-06-23 US US06/877,819 patent/US4835251A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-19 HU HU872804A patent/HU205948B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 DK DK198703130A patent/DK173649B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 PH PH35432A patent/PH23407A/en unknown
- 1987-06-19 IL IL82921A patent/IL82921A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 DE DE8787305508T patent/DE3783273T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 ZA ZA874482A patent/ZA874482B/xx unknown
- 1987-06-22 EP EP87305508A patent/EP0251615B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 IE IE165587A patent/IE59683B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 PT PT85134A patent/PT85134B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 KR KR1019870006320A patent/KR960007604B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-23 CA CA000540413A patent/CA1336223C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-23 CN CN87104447A patent/CN1029784C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-23 JP JP62156391A patent/JP2529693B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-23 AU AU74620/87A patent/AU617291B2/en not_active Expired
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP0251615B1 (en) | 1992-12-30 |
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ZA874482B (en) | 1989-02-22 |
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CN87104447A (zh) | 1988-02-10 |
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